CN116103447A - 一种检测牛呼吸系统五种病原体的lamp引物组合、分型和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。该引物组合包括外引物对、内引物对以及环形引物对，主要是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因、牛副流感病毒3型c基因型的N基因、牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因/A型hyaC‑hyaD基因/B型bcbD基因的8个特异基因，设计特异性的实时荧光环介导等温扩增引物组，借助实时荧光信号及溶解曲线判定结果，特异性强，灵敏度高，可同时用于上述五种病原体及不同血清型和基因亚型的检测，方便快捷，实用性强。
Description
技术领域
本发明属于病原检测生物技术领域，涉及一种检测牛呼吸系统五种病原体的LAMP引物组合、分型和应用。
背景技术
环境因素的改变、自身免疫力的下降或病原体的感染等多种原因均可能导致疾病的发生。随着我国进出口贸易和养牛业的快速发展，牛繁育规模化程度的显著提高，加上牛不断被调入转出，牛系统性疾病发生的危害性不仅日益严重，且更加复杂，以多种病毒、细菌混合感染为常见，而牛呼吸系统疾病是养牛业常见的疾病之一。呼吸系统疾病在世界范围内严重流行，病死率平均在10％左右，高达40％。引发牛呼吸系统疾病的病原主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型基因a和c型(BPIV-3aand BPIV-3c)、牛支原体(Mycoplasma bovis，M.b)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)等。
IBR呈世界性流行，在我国奶牛平均阳性率35.8％，甚至高达70％。BPIV多见于集约化饲养的奶牛和肉牛，呈亚临床感染；支原体、IBRV混合感染可加剧病情。支原体感染形成的牛呼吸道疾病死亡率高达50％以上，病情多发生于犊牛长途运输过程中。美国成牛的BRSV感染总发生率高达67％；加拿大牛养殖中BRSV感染的总发生率约为36％；瑞典牛奶中BRSV抗体出率最高可达到89％，而犊牛感染呼吸道合胞体病毒的概率相对较高，超过90％。牛多杀性巴氏杆菌感染，在流行期达98％以上，尤其犊牛在长途运输、突换饲料、气候骤变等情况下极易感染多杀性巴氏杆菌而发病。
鉴于牛呼吸系统疾病通常是多病原混合感染，多种病原的同时检测有利于快速获得诊断结果，以便于及早制定有效的预防与治疗措施。
病原分离是鉴定的金标准，但操作繁琐、耗时长、技术要求高和分离率低，对人员和实验条件要求高，同时还需要借助于血清学、生化鉴定，甚至分子生物学技术才能确定，是其缺点；血清学诊断方法虽然已被普遍使用，但是由于抗体产生速度较为缓慢，不适于在病原急性感染或早期感染阶段的使用。常规PCR方法的扩增结果需要借助于凝胶电泳的目的片段大小及序列测定分析来判断，灵敏度较低，耗时较长，较繁琐。多重实时荧光定量PCR虽然可实现同时检测多病原，也体现高特异性与高敏感性，快速、检测效率高的特点，但存在升温、变温等过程，耗时相对较长，对仪器多通道要求较高。荧光环介导恒温扩增LAMP具有灵敏度高、特异性好、反应时间短，各被检测病原的引物之间没有相互干扰，又集合荧光定量PCR的优点，通过溶解曲线和Tm值实现结果的判定，更有利于推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测牛呼吸系统疾病五种主要病毒和细菌荧光环介导恒温扩增技术的引物组合，用于检测源于牛呼吸系统疾病临床或亚临床样本中的牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型和c基因型、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A型和B型，及早发现病原，并对相关病原进行分型，有助于临床治疗、疫苗使用等防控措施的有效制定。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
用于检测牛呼吸系统疾病的五种病原的LAMP引物组合，可特异地扩增牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型，BPIV-3a与BPIV-3c)N基因、牛支原体(M.b)的oppD/F、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)的ompH基因，以及对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行区分检测的hyaC-hyaD和bcbD基因，因此，该引物组合不仅可用于上述五种病原体的检测，也可对BPIV 3型和牛多杀性巴氏杆菌进行基因型和血清亚型的区分。
所述引物组合包括以上每种病原的外引物F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，具体引物核苷酸序列如下：
⑴IBRV的gB基因
表1
| 引物序列编号 | 序列 |
| F3SEQ ID No.1 | TGGGCATGGGCGAGAT |
| B3SEQ ID No.2 | GTGCCCGTGCGGTAGA |
| FIPSEQ ID No.3 | AAGGCCACCACCTTGCGCCCACGGACCTGGTGGACA |
| BIPSEQ ID No.4 | CTGAAGCCTGCGCGGCTGAGCGCCGTGTACACATCGTC |
| LFSEQ ID No.5 | GCGCAGGTACTCGGCTTTCG |
⑵BRSV的N基因
表2
⑶BPIV-3a和BPIV-3c N基因
表3
表4
⑷M.b的oppD/F
表5
⑸Pm.b的引物组合信息
①ompH基因
表6
②A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC-hyaD引物组
表7
③B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域引物组
表8
经优选，所述的引物组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。
本发明的目的之二在于提供上述用于检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型的N基因(BPIV-3a、BPIV-3c)、牛支原体(M.b)的oppD/F、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)的ompH/A型的hyaC-hyaD/B型的bcbD区域的引物组合物及应用，用荧光环介导恒温扩增方法以扩增上述几种病原微生物的特异基因，不仅可鉴别检测五种病原。
经优选，所述的引物组合物在荧光环介导恒温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-10：4-10：4-8：4-8。
经优选，所述的环介导恒温扩增反应条件为62-65℃，50-60min。
经优选，在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒基因、牛合胞体病毒基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)基因、牛支原体基因、牛多杀性巴氏杆菌基因的试剂盒和基因芯片中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种用于牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B分型检测的试剂盒，包含上述的引物组合物。
优选地，所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括：
①提取待测病原或其他类型待检样品中基因组DNA或RNA。
②以步骤①提取的基因为模版，采用上述引物组合物对牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B的基因进行荧光环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B的基因。
应用上述引物组合物可以对样品中基因DNA模板特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B的基因；如果不可以对样品中基因DNA模板特异性扩增，则待测样品中不含有或不疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B的基因。
本发明对所述牛呼吸系统疾病五种病原体的标准质粒的检测灵敏度为：牛传染性鼻气管炎病毒101copies/μL，牛合胞体病毒101copies/μL，牛副流感病毒3型a基因型101copies/μL，牛副流感病毒3型c基因型102copies/μL，牛支原体102copies/μL，牛多杀性巴氏杆菌A、B的101copies/μL。
本发明提供的用于检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型)、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A、B的引物组合物，不仅可简单、快速、准确地检测五种不同病原，同时针对基因型或血清亚型也可以进行区分，通过扩增曲线和Tm值，在1小时内可完成牛呼吸系统疾病病因的临床诊断，此外，也可用于非诊断目的的病原体实验室筛查鉴定。
附图说明
图1：牛支原体、A型牛多杀性巴氏杆菌、B型牛多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型特异性检测示意图；
图2：检测牛支原体、A型牛多杀性巴氏杆菌、B型牛多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型敏感性试验示意图。
具体实施方式
实施例1：引物序列的设计和优化
根据NCBI公布的牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因和牛副流感病毒3型c基因型的N基因、牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因、牛多杀性巴氏杆菌荚膜特异基因hyaC-hyaD区域、牛多杀性巴氏杆菌B型荚膜基因bcbD较高保守性基因序列设计引物，参考相关文献，使用LAMP引物设计软件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)PrimerExplorer v5)，所涉及引物组合序列如表1-8所示，产物序列如SEQ ID No.1-36所示。引物合成由生工完成，质粒合成由北京擎科生物科技有限公司合成，使用ddH2O稀释至浓度为10μmol/L，4℃保存备用。
引物组合见表1-8.
实施例2：检测条件的优化
浓度为1×103copies/μL-1×104copies/μL的牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型、牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌A型和B型的重组质粒作为标准品，采用20μL反应体系，10×Thermopol反应缓冲液2μL，dNTP mix(10mmol/L每样)2.8μL、MgSO4(100mmol/L)1-1.5μL、Bst 2.0DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL、20×Eva Green荧光染料1μL、样本模板1μL、内引物(40-50μmol/L)FIP/BIP 1μL、外引物(5-10μmol/L)F3/B31μL、环引物(20-25μmol/L)LF/LB1μL，补足ddH2O至20μL。每个病原根据特异基因序列，按照软件设计1-3套引物组合，以最早出现扩增曲线Tm值及典型扩增曲线，确定最佳引物组合。反应条件：荧光PCR65℃恒温反应60min，每1min采集荧光信号。PCR仪实时监测反应结果。
优化后的引物组合见表1-8.
实施例3：检测方法的灵敏性、特异性
灵敏性：本方法可检测到、牛传染性鼻气管炎病毒101copies/μL、牛合胞体病毒101copies/μL，牛副流感病毒3型a基因型101copies/μL，牛副流感病毒3型c基因型102copies/μL牛支原体102copies/μL、牛多杀性巴氏杆菌102copies/μL、A型牛多杀性巴氏杆菌101copies/μL、B型牛多杀性巴氏杆菌101copies/μL，具有较高的分析灵敏度。敏感性实验结果见示意图2。
特异性和交叉：针对一种病原基因检测的引物组合，除对其他几种同时检测的病原基因组模板进行检测外，也检测了乳房链球菌、停乳链球菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒的阳性核酸，均未出现扩增曲线，呈现阴性结果，见示意图1，表明本申请建立的环介导恒温扩增的引物组合及试剂盒具有良好的特异性。
附序列信息
牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(a基因型和c基因型的N基因，BPIV-3a and BPIV-3c)、牛支原体(M.b)的oppD/F、牛多杀性巴氏杆菌(Pm.b)的ompH/A型的hyaC-hyaD/B型的bcbD区。
1、牛副流感病毒a基因型N基因，genbank：KJ647289。
2、牛副流感病毒c基因型N基因保守序列，genbank：KJ647287。
3、A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC-hycD区域基因(SEQ ID NO.37)：
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TAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATGACAGCCTATTCGTTAAAAATGACAGCTAT
GCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTTCTCAGCATTAACACATGATTGGATCGAGAAAA
TCAATGCGCATCCACCATTTAAAAAGCTCATTAAAACTTATTTTAATGACAATGACTTAAAAAGTAT
GAATGTGAAAGGGGCATCACAAGGTATGTTTATGACGTATGCGCTAGCGCATGAGCTTCTGACGAT
TATTAAAGAAGTCATCACATCCTGCCAGTCAATTGATAGTGTGCCAGAATATAACACTGAGGATATT
TGGTTCCAATTTGCACTTTTAATCTTAGAAAAGAAAACCGGCCATGTATTTAATAAAACATCGACCC
TGACTTATATGCCTTGGGAACGAAAATTACAATGGACAAATGAACAAATTGAAAGTGCAAAAAGA
GGAGAAAATATACCTGTTAACAAGTTCATTATTAATAGTATAACTCTATAAAACACTTGCATTTTATT
AAAAATAAAATCCTATAATATTTGCAGTTTAAATAAAGGATAAAAAATGAAGAAAATTACAATTGCT
GGGGCTGGCTATGTTGGTTTATCCAATGCAGTATTATTAGCTCAACACCACAATGTGATCTTATTAGA
TATTGATCAAAATAAAGTTGATTTAATTAATAATAAAAAATCGCCCATCACAGATAAAGAAATCGAAGATTTCTTACAAAATAAATCACTGACAATGATGGCA。
4、B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域基因(SEQ ID NO.38)：
>AF169324.1:Pasteurellamultocida capsulebiosynthesis gene cluster,complete sequence【12863-13621】GCGATATCAATCTGCTTAAGATAATTGCTATCTTTAATGAATAACGCAAATAAATAATTAACGATTTCTAGTTTTACCAAAATAAAGTTCAACTGTGTTTGAGAACACTTTTTTAAAATGAGTAGTATTTCCTCTGGTGGAGCTTGGATAAATGAGGAGGGGGCAAAATAAGCTACATTAACATTAAAAGTCAGATCTCTAGGCTCAAACTTCCAATCATTTTTCACGAGAAATTCATCCAAGGCAGCTGCAACATTCTTCCAGCTACCCCACGGTAAACCAGCAGAGTCGTTATAACGAGTAACGCTAATCAAATCACTACGTTGAAACTGTTCAAGTAACGCATCCACACTCAGTTGCTTCTCTGCAATGAGTTTTTCAATATTTGTTTGTGAGAAAATAATTTTATGCATTATTTACGCCTTTACTATTATATTTTGTGTTCAACAGAGAGTTAACAGCCTCCAAAATCTCATCTAACTGGTGCATATCTGCTTTGAGTAAACGATCGTTTTCAATGTGACTCATCGGACTGTCTTGCTCGGTCAGTGCTAAAATTAAAGAAGCGGATCCTAAGTAATCGCTCAATTTTGATGGTAAGTAAGGATTATTCATTTTTAGTTCTTTGGTTTGCGTGTCCATCACAATCAGACCATCAAATTGATCCGCTAATGCTAGAAAATCAAAGTAAGCTACATATTTTTGGATAACAATCTGTGCTCTAATTTCCTCCGGTACTTCAGTCAAGATAGAATCCTC。
5、牛传染性鼻气管炎病毒(SEQ ID NO.39)：
>KJ652519.1Bovine herpesvirus 1isolate BHV1.1/Abu-Hammad/1/2013/Egyptglycoprotein B(gB)gene,partial cds
CGACCTGGGCGGGCAGCACGTACGCGGCCATTACAAACCAGTACACGGACCGCGTGCCCGTGGG
CATGGGCGAGATCACGGACCTGGTGGACAAGAAGTGGCGCTGCCTTTCGAAAGCCGAGTACCTG
CGCAGCGGGCGCAAGGTGGTGGCCTTTGACCGCGACGACGACCCCTGGGAGGCGCCGCTGAAGC
CTGCGCGGCTGAGCGCGCCCGGGGTGCGGGGCTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCT
GGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGTGGAAGAAGTGGAGGCG
CGCTCGGTGTACCCGTACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTT
TACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGAGCACACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGA
TCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGTCTCGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCT。
6、牛支原体(SEQ ID NO.40)：
CP058514.1:125229-127236Mycoplasmopsisbovis strainPG45.1 chromosome\AAGCTTCAGTTTTAGCTCTTTTTGAACAAATACGTCAAGAGTACAATATATCAATAATTTTAATTTCGCATAACATTAGTGTTGTCGCTAAGTTTTGTGAATATATTTATGTTATGTATGCTGGCAAAATTGTTGAAAGAGGAACTAGAAAAGATATTTTTACTAATCCAGCTCACCCTTATACATGAGCGCTTATCTCGGCTATACCTGAAAATGATGATGAGAGATTATTCTCAATTCAAGGAACCCCACCAGATATGGCAAACTTACCTATCGGTGACCCTTTTGCACCTAGAAATGACTTTGCCTTAGAAATTGACTATGAAAAAGAACCACCATTAATTGAAATTAATAGTCATCATAAAGCAAGACAACGTGACTACTTCACCCTGATGCACCAAAAATACAAAGACCAAAAGAATTAGAACATAGACTAAAAAGTTTTAGAAAGGTATTTAAAGACGATGAAGAATAACGACAATAAAAAAGTCATTTTAGAAATTCAAGATCTTAAAAAGTACTTTTTAAATAACGGTAAGGTCAACAAAGCTGTTGATGGTGTGTCATTTAAATTACATGAAGGTGAAATAGTCGGTCTAATTGGTGAGTCAGGAAGTGGAAAAACCACTGTTGGACGTTCAATTCTAAGGCTTTATGACGATTTTAATGGTTTTGTTACTTTAGATGATCAAATCATTAGCGGAGAAAGCATTTCTAAAAAACGCGAAAAGTTTTTGCGTAAAAGAGTGCAAATGATCTTTCAAGATCCACACGCGTCTTTAAACGGCCAAAAAACTATCTATAGCATTCTTAAAGAACCTTTAGTTGTCAATAACATAATTAAGCAAAAAACTGATGATTCTATTTAGTGACTGAAAAAAAGTTACTGAGAACTTTCAATTTACATTTTTGCTTTATGCTAAAAAGTTAAAAATTAAAAACCTTAAGGCAATTAATGAGCCATCTAAGCACATTTTTTCCTAAATGATCAGATAGACTAATTGACTTTAAGTTTGACTGGGAAAACTTATCTATTGATGAAAATTTTGTTTCTTATTTTAACTACTTAGAAGAAAAACAAACAATGGAAAGCTCAATTATTAATGAGATGTACTCAAACACAGATCAATTAATGGCTTTCTATTACGAAAAGCAAGCGCAGTTTAGAAATAATGATGTCACTTTTGACGAATTAGACTATATAAATGCTACAAAGGAACTAGAATTAACTAAAAAATTATGTAAGTATTCACAAAAGCAATATGATGCATTAAACAAATTAAGTGAATTAGACAAAGAATTGAAAGAGTTAAAAAGTAATCAAAATGATTATTTATTAACTAACAAAAACGCTTTTAATAATTTTCTTTCGGAATATAAGAACGAGATCAAAATTTGCCGTTATGCAAGATTAAATACTTACGACATAGATTTTTACTTTTTTAACTATAAAAAAGAGCTAACCAACAAAATAAGGTTAGATGTAATCAAAAAATATAAGTCTAAGTTAAGTTATTTATCAATAGATCAAATTCGTAAATTTATTGCTGAATTAAACAAATATACTAATAGTTTTTACATTGAACACTTAGAATCACTCCCAATTTCTAAAGACTTTAAAGCAGTTGCTAAGTTAATAATTGAATCTGATTATAACTTTGATGTTAATGAATATCTAAAGTTAAACCATTCTAATGAATTAGAATTTAATTCAGCACTTAGGAATATTGAAGATTCAATCAAGGCTCAAAAGGAAATTATTCATTCAAAAGATGAAAAACCAGCTTTTGGCAAGAAAGAATTAGAAGCTGCTGAGCAAAAATTGGCTAATGCTGAGAAA。
7、牛合胞体病毒GenBank:AF188552.1。
Claims (8)
1.一种用于检测牛呼吸系统疾病的五种病原体牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因、牛合胞体病毒(BRSV)的N基因、牛副流感病毒3型(BPIV 3a和BPIV 3c)的N基因、牛支原体(M.b)的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌(P.m)的ompH、A型的hyaC-hyaD、B型的bcbD基因的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括内引物对F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，其中
⑴IBRV的gB基因
表1
⑵BRSV的N基因
表2
⑶BPIV-3a和BPIV-3c N基因表3
表4
⑷M.b的oppD/F
表5
⑸Pm.b的引物组合
①ompH基因
表6
②A型牛多杀性巴氏杆菌hyaC-hyaD引物组表7
③B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域引物组
表8
2.如权利要求1所述用于检测牛呼吸系统五种病原体IBRV、BRSV、BPIV 3a、BPIV3c、M.b、P.m特异基因的LAMP引物组合，其特征在于，
IBRV：所述引物组合是针对牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因保守区设计；
BRSV：所述引物组合是针对牛合胞体病毒的N基因保守区设计；
BPIV 3a和BPIV3c：所述引物组合是针对牛副流感病毒3型的N基因保守区设计；
M.b：所述引物组合是针对牛支原体的oppD/F基因保守区设计；
P.m(A、B血清型)：所述引物组合是针对牛多杀性巴氏杆菌ompH基因保守区设计，可判断是否是P.m；针对A型的荚膜hyaC-hyaD，B型的荚膜bcbD基因的引物组合，可对P.m进行亚型的区别。
3.一种用于环介导等温扩增检测牛呼吸系统疾病五种病原体8个基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1或2所示的引物组合。
4.根据权利要求1所述用于检测牛呼吸系统五种病原体IBRV、BRSV、BPIV 3a、BPIV3c、M.b、P.m特异基因的LAMP，其特征在于，除同时检测牛呼吸系统五种病原外，具有牛副流感病毒、牛多杀性巴氏杆菌的分型引物组，分别见表3与表4、表7与表8。
5.根据权利要求3所述一种用于检测牛呼吸系统疾病五种病原体基因的试剂盒，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-8：4-8：2-3：2-3。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测牛呼吸系统五种疾病五种病原体基因的试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为62-65℃，时间50min。
7.权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，源于发病或亚临床感染呼吸系统的同一临床样本六种病原微生物的基因检测试剂盒或芯片中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒或芯片的检测步骤如下：
⑴提取待测细菌或源于呼吸系统的待检样品中基因组DNA；
⑵以步骤(1)提取的基因为模板，采用上述引物组合物分别对IBRV的gB基因、BRSV的N基因、BPIV 3a和BPIV 3c的N基因、M.b的oppD/F基因、P.m的ompH、A型P.m的hyaC-hyaD、B型P.m的bcbD基因进行荧光环介导等温扩增。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101736085A (zh) * | 2009-11-18 | 2010-06-16 | 华中农业大学 | 牛支原体环介导等温扩增检测方法 |
| CN107447056A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-08 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 用于鉴别牛支原体和传染性鼻气管炎的成套引物及其应用 |
| CN108411014A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-08-17 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法 |
| CN113136455A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-07-20 | 河北农业大学 | 一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒 |
| CN113136459A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-07-20 | 华中农业大学 | 用于检测ibrv病毒的lamp引物及其方法 |
| CN115044686A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-09-13 | 华中农业大学 | 一种同时检测brdc七种病原体的实时荧光定量pcr引物对和探针组合 |
-
2023
- 2023-03-02 CN CN202310191356.7A patent/CN116103447A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101736085A (zh) * | 2009-11-18 | 2010-06-16 | 华中农业大学 | 牛支原体环介导等温扩增检测方法 |
| CN107447056A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-08 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 用于鉴别牛支原体和传染性鼻气管炎的成套引物及其应用 |
| CN108411014A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-08-17 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法 |
| CN113136455A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-07-20 | 河北农业大学 | 一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒 |
| CN113136459A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-07-20 | 华中农业大学 | 用于检测ibrv病毒的lamp引物及其方法 |
| CN115044686A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-09-13 | 华中农业大学 | 一种同时检测brdc七种病原体的实时荧光定量pcr引物对和探针组合 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李健友，等: "牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用", 中国畜牧兽医, vol. 44, no. 10, 20 October 2017 (2017-10-20), pages 2837 - 2844 * |
| 范晴，等: "可视化牛支原体和传染性鼻气管炎二重荧光LAMP诊断方法的建立", 基因组学与应用生物学, vol. 40, no. 01, 25 January 2021 (2021-01-25), pages 448 - 456 * |
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