CN117512225B - 一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组合、冻干小球及其应用 - Google Patents

一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组合、冻干小球及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒并对猪流行性腹泻病毒进行GⅠ、GⅡ分型检测的实时荧光定量qPCR冻干小球检测试剂盒及其应用。针对这两种病原的检测特异性强，灵敏度高，重复性好，能够准确诊断猪群常见冠状腹泻病毒的感染情况。此外，冻干小球形式的诊断试剂较液体诊断试剂稳定性好，可常温保存和运输，大大降低了运输成本，复溶操作简单。

Description

一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组 合、冻干小球及其应用
技术领域
本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒的引物探针组合、冻干小球及其应用。
背景技术
猪病毒性腹泻相关疾病是困扰国内外养猪业的难题之一，病原主要以猪冠状病毒为主。猪感染冠状病毒后通常表现为胃肠道、呼吸道和神经系统症状，主要为仔猪腹泻和呕吐。常见能导致猪腹泻的冠状病毒有PEDV和PDCoV。猪流行性腹泻（Porcine epidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的猪肠道传染病；猪德尔塔冠状病毒（PDCoV） 感染后主要临床症状与其他猪冠状病毒相似且临床上难以区别，均能引起腹泻、脱水、昏睡、呕吐，最终导致感染猪死亡。 因此，急需建立一种快速、灵敏及特异的检测方法以区分各型冠状病毒和其他病毒的感染。
病毒的分离与鉴定作为病原学检测中最经典的技术，该检测方法通过将病毒接种于细胞观察细胞是否出现经典病变并结合免疫荧光、RT-PCR等方法能够准确地诊断PEDV，但检测周期长且操作复杂，不适合病原的快速诊断；血清学诊断技术如酶联免疫吸附实验、胶体金免疫层析技术等在检测病毒时具有简便、快速、灵敏等特点，但由于猪腹泻冠状病毒之间会发生交叉反应，容易造成实验结果假阳性；分子诊断技术如实时荧光RT-PCR技术，该方法具有高敏感性和特异性，可以检测组织、环境等样品，既能定性又能定量，广泛应用于PED暴发期间、检疫或屠宰猪的检测。
然而，现有的实时荧光RT-PCR技术使用的试剂均为液体试剂，且需要在低温下运输和保存，传统核酸诊断试剂盒的存储和运输一直都是难题，因含有生物活性成分（DNA酶、反转录酶等），核酸检测试剂一般需要在-20℃左右的环境中储运，以确保试剂有效成分的生物活性。 环境温度的多次变化以及多次进行实验时造成试剂反复冻融，对试剂盒的检测性能受到影响。冻干小球诊断试剂盒可以很好的解决上述问题，将液体试剂与冻干保护剂按比例混合制成冻干小球形状，可在常温下运输和保存，稳定性也大大增加，此外冻干小球形式的诊断试剂体积更加灵活，为试剂盒的运输和保存提供了更有利的条件。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是是提供了一种能检测PEDV和PDCoV的引物探针组合。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种可以用于鉴别诊断PEDV和PDCoV的冻干小球。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的引物探针组合或所述的冻干小球在制备检测猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒试剂盒中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测PEDV和PDCoV的引物探针组合，包括以下三组：
（1）检测PEDV所有基因型的引物对1和探针1，其上、下游引物序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针1序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）检测PEDV G2基因型的引物对2和探针2，其上、下游引物序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示，探针2序列如SEQ ID NO.6所示；
（3）检测PDCoV M基因的引物对3和探针3，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针3序列如SEQ ID NO.9所示。
其中，对探针的两端分别进行修饰，SEQ ID NO.3的5’端用FAM修饰，3’端BHQ1修饰；SEQ ID NO.6的5’端用Texas修饰，3’端用BHQ2修饰；SEQ ID NO.9的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰。
本发明内容还包括一种可以用于鉴别诊断PEDV和PDCoV的冻干小球，包括所述的引物探针组合、荧光定量qPCR溶液和冻干保护溶液。
其中，所述荧光定量qPCR溶液包括商品化的Hiscript III ReverseTranscriptase、Fapon Anstart TaqDNA 聚合酶和qPCR buffer。
其中，所述引物探针组合中正向引物和反向引物的添加量为各0.4 μL，探针的添加量为0.4μL，Hiscript III Reverse Transcriptase添加量为0.1μL，Fapon AnstartTaqDNA 聚合酶DNA 聚合酶添加量为0.2μL，qPCR buffer添加量为2.5μL。
其中，所述冻干保护溶液包括Tris 10-75mM、PVP 1%~5% W/V、牛血清白蛋白0.01%~0.1%W/V、Tween-20 0.01%~0.05% W/V。
其中，所述冻干小球的直径为3.6-3.8 mm。
本发明内容还包括所述的冻干小球的制备方法，包括以下步骤：
（1）取Tris、PVP、牛血清白蛋白、Tween-20混合配置得到冻干保护液；
（2）取3组引物探针组合（包括引物对1、2、3和探针1、2、3）各0.4 μL、Hiscript IIIReverse Transcriptase0.1 μL、Fapon Anstart TaqDNA 聚合酶0.2 μL、qPCR buffer2.5μL混合配置得到荧光定量PCR溶液，总体积为6.4 μL。
（3）取6.4μL荧光定量PCR溶液和10μL 冻干保护液混合制成冻干小球。
其中，步骤（3）中的冻干小球的制备步骤是：取6.4μL荧光定量PCR溶液和10μL 2×冻干保护液混合，用移液器吸取20μL，一次性滴入装有液氮的容器内，完成冻干小球的初步赋形步骤，然后将液氮内的小球置于真空冷冻干燥机内进行后续的冷冻干燥过即得。
其中，所述冷冻干燥条件为先在-50℃冻干1～2 h，然后真空干燥2-3 h，再逐渐升温至25℃，每升高10℃保持1-1.5 h。
本发明内容还包括一种所述的引物探针组合或所述的冻干小球在制备检测猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒试剂盒中的应用。
本发明内容还包括一种冻干小球实时荧光定量qPCR的检测试剂盒，包括所述的引物探针组合或所述的冻干小球。
其中，所述引物和探针的浓度均为10μmol/L。
其中，所述试剂盒中的检测体系总量为20μL，包括PEDV-M-F 0.4μL、PEDV-M-R 0.4μL，PEDV-A-F 0.4μL，PEDV-A-R 0.4μL，PDCoV-F 0.4μL，PDCoV-R 0.4μL，Hiscript IIIReverse Transcriptase 0.1μL，Fapon Anstart Taq DNA 聚合酶0.2μL，qPCR Buffer 2.5μL、超纯水13.6μL制成的冻干小球。
其中，所述试剂盒的检测反应程序为：逆转录过程：50℃，15min；预变性过程：95℃，1min循环过程：95℃，5s；60℃，20min，循环40次。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明可以实现同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）并对猪流行性腹泻病毒进行GⅠ、GⅡ分型检测。针对这两种病原的检测特异性强，灵敏度高，重复性好，能够准确诊断猪群常见冠状腹泻病毒的感染情况。此外，冻干小球形式的诊断试剂较液体诊断试剂稳定性好，可常温保存和运输，大大降低了运输成本，复溶操作简单。
附图说明
图1为制备的冻干小球检测待检验RNA样品的PCR扩增反应结果图。
图2为不同酶组合对阳性样品的Taqman荧光定量qPCR检测的扩增曲线。
图3为不同引物添加量对阳性样品的Taqman荧光定量qPCR的扩增曲线。
图4为不同浓度重组p-PEDV-N质粒标准品扩增N基因的扩增曲线；P-PEDV-N质粒扩增曲线，从左到右浓度依次为3.72×107、3.72×106、3.72×105、3.72×104、3.72×103、3.72×102、3.72×101、3.72×100copies/μL；
图5为不同浓度重组p-PEDV-N质粒标准品扩增N基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。
图6为不同浓度重组p-PEDV-S质粒标准品扩增S基因的扩增曲线；P-PEDV-S质粒扩增曲线，从左到右浓度依次为3.69×107、3.69×106、3.69×105、3.69×104、3.69×103、3.69×102、3.69×101、3.69×100copies/μL；
图7为不同浓度重组p-PEDV-S质粒标准品扩增S基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。
图8为不同浓度重组p-PEDV-M质粒标准品扩增M基因的扩增曲线；P-PDCoV-M质粒扩增曲线，从左到右浓度依次为2.83×107、2.83×106、2.83×105、2.83×104、2.83×103、2.83×102、2.83×101、2.83×100copies/μL；
图9为不同浓度重组p-PEDV-M质粒标准品扩增M基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。
图10为检测3种病毒基因的Taqman荧光定量qPCR方法的特异性扩增曲线；1：PEDV阳性样品；2：PEDV GⅡ阳性样品；3：PDCoV阳性样品；4：TGEV病毒液；5：PoRV病毒液；6：PRRSV病毒液；7：PEAV病毒液；8：无酶水阴性对照；
图11为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对N基因的敏感性扩增曲线；p-PEDV-N：从左到右浓度依次为3.72×105、3.72×104、3.72×103、3.72×102、3.72×101、3.72×100copies/μL；
图12为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对S基因的敏感性扩增曲线；p-PEDV-S：从左到右浓度依次为3.69×105、3.69×104、3.69×103、3.69×102、3.69×101、3.69×100copies/μL；
图13为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对M基因的敏感性扩增曲线；p-PEDV-M：从左到右浓度依次为2.83×105、2.83×104、2.83×103、2.83×102、2.83×101、2.83×100copies/μL;
图14为相同成分的PCR反应液与其制成的冻干小球对6个样本进行扩增的结果Ct值的比较。
图15为冻干小球检测临床样品的Taqman实时荧光PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
一种冻干小球荧光法检测PEDV和PDCoV的试剂盒，包括以下引物探针组合。
在NCBI Virus中查阅比对大量PEDV、PEDV GⅡ型和PDCoV的代表性毒株的全基因组序列，采用Snapgene软件提取病毒基因组，然后，经MEGA 11软件分别对提取到的基因序列进行对比分析，选出高度保守且特异性强的序列。其中，PEDV选取的是高度保守的N基因（genbank ID: 935179）和GⅡ基因型高度保守的S基因(genbank ID: 935184)，PDCoV选取的是高度保守的M基因（genbank ID: 100153927）序列。针对PEDV、PEDV GⅡ型和PDCoV的特异性保守序列分别设计引物和探针序列，经比对筛选，最终确定了相应的引物和探针序列，引物和探针由通用生物（安徽）股份有限公司合成。
具体地，用于检测PEDV所有基因型的引物和探针的核苷酸序列为：
上游引物PEDV-A-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’-TTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTA-3’；
下游引物PEDV-A-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-TTTTCGACAAATTCCGCATCTCC-3’；
探针PEDV-A-P的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5’-AAGCCTCCCCTGGGTCCGAAGC-3’；该PEDV-A-P的5’端结合有荧光发生基团CY5，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ3。
用于检测PEDV GⅡ基因型的引物和探针的核苷酸序列为：
上游引物PEDV- GⅡ-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.4：5’-AAACCAGGGTGTCAATTCAAC-3’；
下游引物PEDV- GⅡ-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.5：5’-ATGCCAATCTCAAAGCCATG-3’；
探针PEDV- GⅡ-P的核苷酸序列为SEQ ID NO.6：5’-ACTGTGCTGGCCAACATCCAACTGC-3’；该PEDV- GⅡ-P的5’端结合有荧光发生基团Texas Red，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ2。
用于检测PDCoV的引物和探针的核苷酸序列为：
上游引物PDCoV-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7：5’-ATCGACCACATGGCTCCAA-3’；
下游引物PDCoV-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8：5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’；
探针PDCoV-P的核苷酸序列为SEQ ID NO.9：5’-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-3’；该PDCoV-P的5’端结合有荧光发生基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ1。
实施例2
一种荧光定量冻干小球试剂盒检测PEDV、PEDV GⅡ和PDCoV的方法，包括以下步骤：
1、样品RNA提取：采用Vazyme FastPure Cell/Tissue Total RNA提取试剂盒对待检样品(如猪的粪便和拭子）按照RNA提取试剂盒说明书进行总RNA的提取。提取后的RNA样品用于后续检测。
2、冻干小球的制备：冻干小球为常规RT-PCR扩增反应液经过冻干后得到的冻干制品。具体制作步骤如下：
S1、反应体系的优化：
（1）反应体系中酶原料的优化：
反应选取了两种RTase和两种Taq酶，分别为：挪威赞公司的Hiscript IIIReverse Transcriptase(RTase1)（货号：R302-01）和Taq HS DNA Polymerase (Glycerol-free)(Taq1)（货号：QL101-01）、迈迪安公司的55C MMLV-RT(RTase2)（货号：MDX117）、飞鹏公司的 Anstart Taq DNA 聚合酶(Taq2)（货号：MD006）。
将酶组合分为以下四组：
酶组合组1：Taq1+ RTase1：Taq HS DNA Polymerase (Glycerol-free)（5U/μL）和Hiscript III Reverse Transcriptase（200U/ L）；
酶组合组2：Taq1+ RTase2：Taq HS DNA Polymerase (Glycerol-free) （5U/μL）和55C MMLV-RT（200U/ L）；
酶组合组3：Taq2+ RTase1： Anstart TaqDNA 聚合酶（5U/μL）和Hiscript IIIReverse Transcriptase（200U/ L）；
酶组合组4：Taq2+ RTase2： Anstart Taq DNA 聚合酶（5U/μL）和55C MMLV-RT（200U/ L）。
用以上四种酶组合分别建立PEDV的RT-PCR检测体系并对PEDV阳性样品进行扩增RT-PCR检测体系如下：
1组：平行检测三个样本，混合RT-PCR反应体系：模板2μL、引物探针（实施例1的所有引物探针各0.4μL，浓度均为10μM）组合3.6μL、PCR buffer 2.5μL、Taq1 0.2μL、RTase10.1μL、无酶水11.6μL。设置反应过程为50℃，15min；95℃，1min；95℃，5s，60℃，20min，循环40次。读取反应结果并记录Ct值。
2组：平行检测三个样本，混合RT-PCR反应体系：模板2μL、引物探针组合（实施例1的所有引物探针各0.4μL，浓度均为10μM）3.6μL、PCR buffer 2.5μL、Taq1 0.2μL、RTase20.1μL、无酶水11.6μL。设置反应过程为50℃，15min；95℃，1min；95℃，5s，60℃，20min，循环40次。读取反应结果并记录Ct值。
3组：平行检测三个样本，混合RT-PCR反应体系：模板2μL、引物探针组合（实施例1的所有引物探针各0.4μL，浓度均为10μM）3.6μL、PCR buffer 2.5μL、Taq2 0.2μL、RTase10.1μL、无酶水11.6μL。设置反应过程为50℃，15min；95℃，1min；95℃，5s，60℃，20min，循环40次。读取反应结果并记录Ct值。
4组：平行检测三个样本，混合RT-PCR反应体系：模板2μL、引物探针组合（实施例1的所有引物探针各0.4μL，浓度均为10μM）3.6μL、PCR buffer 2.5μL、Taq2 0.2μL、RTase20.1μL、无酶水11.6μL。设置反应过程为50℃，15min；95℃，1min；95℃，5s，60℃，20min，循环40次。读取反应结果并记录Ct值。
根据RT-qPCR反应结果的Ct值并结合扩增曲线（参见图2），选取最优的第三组酶组合作为优化后的酶体系。
（2）反应体系中引物探针添加量的确定：
选择（1）优化后的酶体系的检测体系中，控制引物和探针PEDV-A-F、PEDV-A-R、PEDV-A-P、PEDV- GⅡ-F、PEDV-GⅡ-R、PEDV- GⅡ-P、PDCoV-F、PDCoV-R、PDCoV-P的浓度均为10μM，改变引物探针的添加量为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL，将以上6种添加量的引物探针分别构建检测PEDV N基因的反应体系，并用以上6组反应体系对PEDV N基因进行扩展。结果显示，引物探针添加量为0.4~0.6μL时Ct值较低且变化不大（参见图3），最优地确定该反应体系的引物探针的最优添加量为0.4μL。
通过以上酶的优化和引物探针的添加量的优化，以上述最佳优化条件进行后续实验。
S2、配置2×冻干保护溶液（10ml）：
Tris 0.2μm（终浓度20μM）、PVP 0.1g（终浓度1% W/V）、牛血清白蛋白0.01g（终浓度0.1%W/V）、Tween-20 0.005g（终浓度0.05% W/V）。
S3、取如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9中的上游引物各0.4 μL、下游引物各0.4μL、探针各0.4 μL、Hiscript III Reverse Transcriptase（200U/μL）0.1 μL、FaponAnstart Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μL、qPCR buffer2.5 μL混合配置得到荧光定量qPCR溶液，总体积为6.4 μL。
S4、取荧光定量PCR溶液6.4 μL和10 μL 2×冻干保护液混合，加无酶水3.6μL补足至20μL。将混合后的液体用移液器一次性滴入装有液氮的保温容器内使之冷冻成球形，静置后将小球放置于预冷到 -50℃的冷冻干燥机中，真空冷冻干燥机在-50℃保持1.5h，然后抽真空干燥3 h，之后逐渐升温，每升高10℃保持1 h，直到升到25℃得到冻干小球。冻干程序结束后将冻干小球置于密闭容器， 用水分测定仪测量其湿度，水分含量为2.8655%。
S5、取仔猪粪便拭子提取的RNA溶液与冻干小球混合，用无酶水补至20uL后置于荧光定量PCR仪中依次以下扩增反应程序：
逆转录过程：50℃，15min；
预变性过程：95℃，1min；
循环过程：95℃，5s，60℃，20min，循环40次。
检测结果：通过荧光定量PCR仪相应软件绘制的扩增曲线与Ct值进行结果的判定。当Ct值≤36时，判定为阳性结果；当Ct值＞36时，判定为阴性结果。检测到PEDV N基因的样本为PEDV 阳性，同时检测到PEDV M基因和S基因的为PEDV GⅡ型毒株，只检测到PEDV N基因的为PEDV GⅠ型毒株，检测到PDCoV M基因的为PDCoV阳性。
图1结果显示，FAM通道检测的是PEDV-N，CY5通道检测的是PDCoV-M，Texas通道检测的是PEDV-S，该样本检测PEDV N基因的Ct值为31.57，检测PEDV S基因的Ct值为35.69，未检测到PDCoV的M基因，表明样本呈PEDV阳性，且为PEDV GⅡ型毒株。
实施例3
对实施例1和实施例2中所述的冻干小球荧光法检测PEDV、PEDV GⅡ和PDCoV的试剂盒及检测方法进行特异性、敏感性检测，具体过程如下：
S1、标准质粒的制备：
分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，PEDV阳性样品（Mei Li a , YangyangPan.Insights and progress on epidemic characteristics, genotyping, andpreventive measures of PEDV in China: A review）为模板，扩增得到PEDV的N基因。
分别以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物，PEDV GⅡ阳性样品（Mei Li a ,Yangyang Pan.Insights and progress on epidemic characteristics, genotyping,and preventive measures of PEDV in China: A review）为模板，扩增得到PEDV GⅡ的S基因；
分别以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，PDCoV阳性样品（Zhe Wang a,b,1 ,Kuo Qu.Prevalence and potential risk factors of PDCoV in pigs based onpublications during2015–2021 in China: Comprehensive literature review andmeta-analysis）为模板，扩增得到PDCoV的M基因。
将上述三种扩增产物切胶回收纯化后，分别反转录得到各自的cDNA模板，分别连接到pUC57载体上，然后分别将载体导入感受态细胞，培养，筛选出阳性单菌落，进行酶切、PCR和测序鉴定,验证后提取质粒，并命名为得p-PEDV-N、p-PEDV-S、p-PDCoV-M，分别测定质粒OD260 nm值，换算成拷贝数。p-PEDV-N、p-PEDV-S、p-PDCoV-M标准质粒的初始浓度分别为3.72×107、3.69×107、2.83×107（copies/μL）。
S2、标准质粒的标准曲线的绘制：
将步骤S1所获得的p-PEDV-N、p-PEDV-S、p-PDCoV-M分别然后连续稀释十倍，将上述稀释后的溶液作为模板，按照实施例2的方法进行检测，得到三种标准质粒的扩增曲线（参见图4、6、8），以稀释后质粒浓度的对数为横坐标，相应的CT值为纵坐标，并绘制相应的标准曲线（参见图5、7、9）。p-PEDV-N的标准曲线为y=-3.2729x+39.928，R2=0.9975；p-PEDV-S的标准曲线为y=-3.2592x+41.275，R2=0.9953；p-PDCo-M的标准曲线为y=-3.3174x+40.023，R2=0.9933；
S3、特异性试验：
分别取TGEV毒株（王佳，成伟伟等.猪传染性胃肠炎病毒基因组结构及主要基因功能研究进展）、PoRV毒株（袁生，王聪颖等.猪轮状病毒诊断方法研究进展）、PRRSV毒株（蹇艳银，张佳怡等.PRRSV 经典毒株、高致病毒株、类 NADC30 毒株及类 NADC34 毒株鉴别 RT-PCR 检测方法的建立及应用）、PEAV毒株（赵冉,蔡振鸿等.PDCoV、PEAV、TGEV 及 PEDV“一步法” 多重荧光 RT-PCR 的建立和应用）的病毒液，采用病毒核酸提取试剂盒分别提取RNA，并编号4~7。
将提取的4种病毒RNA以及上述三种标准质粒（p-PEDV-N、p-PEDV-S、p-PDCoV-M，编号1-3）各取2μL分别加入冻干小球，并用无核酸水补足至20μL，并且以无核酸酶水为阴性对照（编号8），按照实施例2中所述方法进行检测，结果见图10。
结果显示，仅有编号1~3的三种标准质粒的样本显示出扩增曲线，其它样本没有检测出扩增曲线，表面本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，具有较强的特异性。
S4、敏感性试验：
步骤S1稀释后所获得的8个浓度的3.72×105、3.72×104、3.72×103、3.72×102、3.72×101、3.72×100p-PEDV-N质粒，取稀释浓度为（copies/μL）的溶液分别作为模板，按照实施例2所述的方法进行RT-qPCR扩增，得到p-PEDV-N标准质粒的扩增曲线（参见图11）。
步骤S1稀释后所获得的8个浓度的p-PEDV-S质粒，取稀释浓度为3.69×105、3.69×104、3.69×103、3.69×102、3.69×101、3.69×100（copies/μL）的溶液分别作为模板，按照实施例2所述的方法进行RT-qPCR扩增，得到p-PEDV-S标准质粒的扩增曲线（参见图12）。
步骤S1稀释后所获得的8个浓度的p-PEDV-M质粒，取稀释浓度为2.83×105、2.83×104、2.83×103、2.83×102、2.83×101、2.83×100（copies/μL）的溶液分别作为模板，按照实施例2所述的方法进行RT-qPCR扩增，得到p-PEDV-M标准质粒的扩增曲线（参见图13）。
结果显示，三种标准质粒的RT-qPCR的检测下限分别为3.72、3.69、2.83（copies/μL），本发明的检测方法具有较高的灵敏度。
S5、冻干体系与液体体系的比较
分别用实施例2制备的冻干小球和相同PCR反应液成分的液体试剂（分为冻干组别和液体组别）检测1-6号6个临床检测结果为PEDV阳性的样品，设置PCR反应程序为：50℃，15min；95℃，1min；95℃，5s ；60℃，20min，循环40次。扩增结果如图14所示。结果显示，冻干试剂和液体试剂均能检测到PEDV，冻干试剂的Ct值略高于液体检测试剂，但表现出良好的均一性，表明冻干后的也具有较好的检测能力。
S6、临床样本的检测
临床样品检测试验：采集临床样本48份，临床样本包括猪的粪便拭子样品。
将48份猪的粪便拭子样品分别在试管中用1.0 mL PBS（pH 7.2）稀释，涡旋30秒，并在 4℃下以10000×g 离心10分钟，然后分别按照实施例2的方法对48个样品的RNA进行qPCR检测。
实验结果分析：由图15可知，表明本申请的可同时检测PEDV N基因、PEDV S基因、PDCoV M基因的三种病毒的引物探针组合，利用该引物和探针组合制作Taqman荧光定量PCR冻干小球检测试剂盒，采用该试剂盒及上述方法能同时检测上述三种病毒，检测结果稳定、可靠、灵敏度高。用于猪场人员、物资、猪肠道样品以及粪便等样品检测时，可极大的降低检测成本，提高检测效率，保证检测覆盖面，提升猪场管理效率。

Claims (7)

1.一种能同时检测PEDV和PDCoV的引物探针组合，其特征在于，具体包括以下三组：
（1）检测PEDV所有基因型的引物对1和探针1，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针1序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）检测PEDV G2基因型的引物对2和探针2，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，探针2序列如SEQ ID NO.6所示；
（3）检测PDCoV M基因的引物对3和探针3，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针3序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的能同时检测PEDV和PDCoV的引物探针组合，其特征在于，对探针的两端分别进行修饰，SEQ ID NO.3的5’端用FAM修饰，3’端BHQ1修饰；SEQ ID NO.6的5’端用Texas修饰，3’端用BHQ2修饰；SEQ ID NO.9的5’端用CY5修饰，3’端用法BHQ3修饰。
3.一种用于鉴别诊断PEDV和PDCoV的冻干小球，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物探针组合、荧光定量qPCR溶液和冻干保护溶液，所述荧光定量qPCR溶液包括HiscriptIII Reverse Transcriptase、Fapon Anstart TaqDNA 聚合酶和qPCR buffer；所述冻干保护溶液包括Tris 10-75mM、PVP 1%~5% W/V、牛血清白蛋白0.01%~0.1%W/V、Tween-20 0.01%~0.05% W/V；
所述的冻干小球的制备方法，包括以下步骤：
（1）取Tris、PVP、牛血清白蛋白、Tween-20混合配置得到冻干保护液；
（2）取所述的引物探针组合、Hiscript III Reverse Transcriptase、Fapon AnstartTaq DNA 聚合酶和qPCR buffer混合配置得到荧光定量PCR溶液；
（3）取荧光定量PCR溶液和冻干保护液混合，用移液器吸取，滴入装有液氮的容器内，完成冻干小球的初步赋形步骤，然后将液氮内的小球置于真空冷冻干燥机内进行后续的冷冻干燥即得；
步骤（3）中的冷冻干燥条件为先在-50℃冻干1～2 h，然后真空干燥2-3 h，再逐渐升温至25℃，每升高10℃保持1-1.5 h。
4.根据权利要求3所述的冻干小球，其特征在于，所述冻干小球的直径为3.6-3.8 mm。
5.权利要求3所述的冻干小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取Tris、PVP、牛血清白蛋白、Tween-20混合配置得到冻干保护液；
（2）取权利要求1所述的引物探针组合、Hiscript III Reverse Transcriptase、FaponAnstart Taq DNA 聚合酶和qPCR buffer混合配置得到荧光定量PCR溶液；
（3）取荧光定量PCR溶液和冻干保护液混合，用移液器吸取，滴入装有液氮的容器内，完成冻干小球的初步赋形步骤，然后将液氮内的小球置于真空冷冻干燥机内进行后续的冷冻干燥即得；
步骤（3）中的冷冻干燥条件为先在-50℃冻干1～2 h，然后真空干燥2-3 h，再逐渐升温至25℃，每升高10℃保持1-1.5 h。
6.一种权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3或4所述的冻干小球在制备检测猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒试剂盒中的应用。
7.一种冻干小球实时荧光定量qPCR的检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的引物探针组合或权利要求3或4所述的冻干小球。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190026403A (ko) * 2017-09-05 2019-03-13 녹십자수의약품(주) 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도
CN109913584A (zh) * 2019-02-18 2019-06-21 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 四种猪肠道病毒多重荧光rt-pcr试剂盒及检测方法
CN110452972A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法
CN115951050A (zh) * 2022-10-12 2023-04-11 中国农业科学院都市农业研究所 快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN116004914A (zh) * 2022-11-09 2023-04-25 深圳市卓润生物科技有限公司 检测猴痘病毒试剂盒及应用
CN116024387A (zh) * 2022-12-13 2023-04-28 江西正邦科技股份有限公司 猪病毒性腹泻病原的四重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN116121464A (zh) * 2023-03-15 2023-05-16 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心(广西壮族自治区屠宰技术中心) 一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法
CN117327838A (zh) * 2023-07-25 2024-01-02 广州市益豚猪业投资有限公司 PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190026403A (ko) * 2017-09-05 2019-03-13 녹십자수의약품(주) 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도
CN110452972A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 北京中科生仪科技有限公司 一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法
CN109913584A (zh) * 2019-02-18 2019-06-21 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 四种猪肠道病毒多重荧光rt-pcr试剂盒及检测方法
CN115951050A (zh) * 2022-10-12 2023-04-11 中国农业科学院都市农业研究所 快速检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN116004914A (zh) * 2022-11-09 2023-04-25 深圳市卓润生物科技有限公司 检测猴痘病毒试剂盒及应用
CN116024387A (zh) * 2022-12-13 2023-04-28 江西正邦科技股份有限公司 猪病毒性腹泻病原的四重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN116121464A (zh) * 2023-03-15 2023-05-16 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心(广西壮族自治区屠宰技术中心) 一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法
CN117327838A (zh) * 2023-07-25 2024-01-02 广州市益豚猪业投资有限公司 PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2017―2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析;王睿敏 等;中国兽医科学;20191204;第50卷(第02期);第189-198页 *
Development of a Multiplex Quantitative PCR for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Transmissible Gastroenteritis Virus, and Porcine Deltacoronavirus Simultaneously in China;Jianpeng Chen 等;Vet. Sci.;20230618;第10卷(第6期);摘要，第2-4页"2.材料和方法"部分，表1 *
鉴别猪流行性腹泻病毒基因型的一步法双重qRT-PCR;何海健 等;农业生物技术学报;20190821;第27卷(第7期);摘要，第1313-1315页"1 材料与方法"，表2 *

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