KR20190026403A

KR20190026403A - 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190026403A
Application number: KR1020170113282A
Authority: KR
Inventors: 문형준; 정경진; 김성재; 강보규; 박경윤; 한상윤
Original assignee: 녹십자수의약품(주)
Priority date: 2017-09-05
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2019-03-13

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형(Genotype) 분석용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 PEDV 유전자형 분석용 프라이머 세트, PEDV 유전자형 분석용 조성물, PEDV 유전자형 분석용 키트 및 유전자형 분석용 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 유전자형(genotype) 간의 유전학적 차이를 이용하므로, PEDV 자체의 검출 뿐만 아니라 상기 PEDV의 유전자형을 우수한 특이도로 정확하게 판별할 수 있어, 백신 제조시 필요한 바이러스 동정(identification)에 적용할 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도{Primers for Analyzing Porcine Epidemic Diarrhea Virus Genotype and Uses Thereof}

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.

돼지유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PED virus)는 자돈에서 급성 장염과 수양성 설사를 유발하며 특히 어린 자돈에 있어서는 폐사율이 100%에 달하는 돼지 바이러스성 원인체이다(Debouck et al.,(1980), J. Vet. Res, 41, 219-223; Saif et al.,(2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524; Pijpers et al.,(1993), Vet. Rec. 132, 129-131). 상기 돼지 유행성 설사병은 1971년 영국에서 초기에 확인됐으나(Oldham, (1972), Letter to the editor. Pig Farming. Oct. suppl. 72-73), 감염 인자(causative agent)인 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)는 1978년에 확인되었다(Pensaert and Debouck, (1978), Arch. Virol. 58, 243-247). PED는 아시아에서는 1982년에 처음 보고되었고, 아시아 양돈 산업에서 상당한 경제적 손실을 일으키며 돼지의 건강을 위협하고 있다(Chen et al.,(2008), Virus Genes. 36, 355-364; Puranaveja et al.,(2009), Emerg. Infect. Dis. 15, 1112-1115; Li et al., (2012), Emerg. Infect. Dis, 18, 1350-1353; Takahashi et al., (1983), J. Vet. Sci. 45, 829-832).

한국에서는 1992년에 처음 PEDV가 발생하였으나(Kweon et al.,(1993), J. Vet. Rec. 33, 249-254), 종래 연구를 통해 상기 바이러스가 이미 1987년 이전에 존재했다는 것이 보고되었다(Park and Lee, (1997), Korean J. Vet. Res. 37, 809-816). 한국 돼지에서 PED를 제어하기 위해 전국적으로 정기적인 백신 접종을 하고 있음에도, PEDV는 한국 돼지농장의 생산성에 막대한 피해를 일으키며 지속적으로 발생하고 있다.

PEDV는 니도바이러스 목(order Nidovirales), 코로나바이러스 과(family Coronaviridae)의 알파코로나 바이러스(Alphacoronavirus)속에 속하며, 단일가닥이고, 5' 캡 및 3' 폴리아데닐화된 꼬리(polyadenylated tail)를 포함하는 약 28 kb RNA 게놈의 양성-센스 RNA 게놈 바이러스이다(Pensaert and Debouck, (1978), Arch. Virol. 58, 243-247; Saif et al., (2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524). 상기 PEDV 게놈은 5' UTR(untranslated region), 적어도 7개의 ORF(open reading frames)(ORF1a, ORF1b, ORF2 내지 6) 및 3' UTR(Kocherhans et al.,(2001), Virus Genes. 23, 137-144)로 구성된다. ORF1a 및 1b는 게놈의 5'의 3분의 2를 구성하고 비-구조 레플리카아제(replicase) 유전자를 암호화한다. 3' 말단 영역에 존재하는 ORFs는 4개의 주요 구조 단백질인, 150-220 kDa의 당화된 스파이크(S) 단백질(glycosylated spike (S) protein); 20-30 kDa의 막(M) 단백질(membrane (M) protein); 7 kDa의 외막(E) 단백질(envelope (E) protein); 및 58 kDa의 뉴클레오캡시드 (N) 단백질(nucleocapsid (N) protein)을 암호화한다(Duarte et al.,(1994), Virology. 198, 466-476; Saif, (2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524).

이러한 PEDV를 진단하는 방법은 개체의 신선한 장이나 분변재료로부터 세포배양법을 이용하여 바이러스를 분리 동정하는 방법이나, 전자현미경을 통한 형태학적 증명, 동결절편 장조직을 이용한 형광항체검사법이 널리 사용되고 있다.

그러나 상기의 방법들은 검사에 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 시료를 처리하고 결과를 판독하는데 있어서는 정밀기기와 함께 전문기술을 요하는 단점이 있다.

따라서, 바이러스 검출 결과에 따라 대량의 살처분과 같은 후속 작업이 수반된다는 점을 고려할 때 이는 결코 간과되어서는 안 될 문제이고, 조기에 효과적인 방역조치를 취함으로써 바이러스성 질병의 전파를 차단하여 양돈농가의 피해를 최소화하면서 이러한 문제를 해결해 줄 수 있는 새로운 기술적 방법이 필요하다.

한편, 생명체의 유전자형 분석은 질병에 대한 위험도, 진단, 예진 또는 치료방법의 제시 등과 관련하여 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들어, PEDV의 특정 유전자에 대한 아형 또는 변이 분석을 통하여 PEDV에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 질병을 사전에 예방하도록 유도할 수 있다.

즉, PEDV의 분자 생물학적 특징을 고려할 때, PEDV의 유전자형(Genotype)은 PEDV에 대한 효과적인 진단을 위한 적절한 표적이 될 수 있다.

이에 본 발명자는 PEDV의 유전자형(Genotype)을 신속 정확하게 검출 및 동시 진단하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, PEDV의 유전자형(Genotype) 2 종을 각각 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 이용하여 다중튜브(multi-tube) 형태의 방식으로 검출을 실시하여 우수한 민감도로 위음성 문제없이 신속하고 간편하게 각 유전자형을 동시에 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 PEDV 유전자형 분석용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 PEDV 유전자형 분석용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PEDV 유전자형 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 PEDV 유전자형 분석 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석용 프라이머 세트를 제공한다:

(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된, PEDV 유전자형 G1(genogroup 1, classical) 검출용 프라이머 세트; 및

(b)서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된, PEDV 유전자형 G2(genogroup 2, field epidemic) 검출용 프라이머 세트.

본 발명자들은 PEDV의 S(Spike) 유전자 지역을 유전자형(genotype)별로 구분하여 RT-PCR을 실시할 경우, 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 저하 및 위음성 발생없이, 검체로부터 PEDV 유전자형을 동시에 진단 및 구분할 수 있으며, 특정 PEDV의 감염 여부를 보다 확정적으로 진단할 수 있다는 점에 착안하여 PEDV에 대한 S(Spike) 유전자 및 ORF1b 유전자의 염기서열을 종합적으로 분석하여, 이의 염기서열로부터 상응되는 프라이머를 제작하였다.

즉, G1 프라이머 세트의 경우 PEDV의 S 유전자 영역 내에서 달성이 되었으며, G2 프라이머 셋트의 경우 G1 유전자형과 확실히 구분하기 위하여 PEDV 유전자 중 S 유전자의 5'부위에 선행하는 ORF1b 지역으로 확대하여 프라이머를 디자인하였다.

이에 따라, 상기 (a)의 프라이머 세트는 S(Spike) 유전자 부위를 증폭시키고, 상기 (b)의 프라이머 세트는 ORF1b(open reading frame 1b) 및 S(Spike) 유전자 부위를 증폭시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프라이머가 구분하여 검출하는 PEDV의 유전자형은 G1(genogroup 1, classical) 및 G2(genogroup 2, field epidemic)이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "PEDV 유전자형 분석"은, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물의 존재 여부로 상술한 두 가지 유전자형을 구별하는 것이므로, PEDV 유전자형의 검출 또는 판별과 혼용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4 가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다.

PEDV 유전자형의 검출에 사용될 수 있도록 하기 위한 본 발명의 목적상 상기 프라이머 세트 중 하나인, G1 형 검출용 프라이머 세트는, 바람직하게는 PEDV G1 유전자형 바이러스의 전체 유전자(GenBank: JQ023162.1) 중 S 유전자 부위를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 JQ023162.1 유전자의 5' 말단으로부터 20763번째에서 20790번째까지의 정방향 프라이머(G1-F) 및 JQ023162.1 유전자의 5' 말단으로부터 21071번째에서 21091번째까지의 역방향 프라이머(G1-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.

또한, PEDV 유전자형의 검출에 사용될 수 있도록 하기 위한 본 발명의 목적상 상기 프라이머 세트 중 나머지 하나인, G2형 검출용 프라이머 세트는, 바람직하게는 PEDV G2 유전자형 바이러스의 전체 유전자(GenBank: KJ623926.1) 중 ORF1b 유전자 부위 및 S 유전자 구역을 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 KJ623926.1유전자의 5' 말단으로부터 20471번째에서 20494번째까지의 정방향 프라이머(G2-F) 및 KJ623926.1 유전자의 5' 말단으로부터 20806번째에서 20826번째까지의 역방향 프라이머(G2-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.

본 명세서에는 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용했다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데 있어 동일하게 적용하였다.

본 발명의 프라이머 세트는 PEDV 자체의 검출에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, G1(genotype 1) 및 G2(genotype 2)로 명명된 PEDV의 유전자형을 판별하는 데도 활용될 수 있다.

본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기 서열의 일부가 변경될 수 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 구성염기 서열의 일부 변경은 특이 프라이머들의 주형(cDNA 또는 PCR 증폭산물들)과의 특이적 결합을 훼손할 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 특이 프라이머들의 구성염기 서열의 일부 변경이 불가피한 경우에는 반드시 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적으로 조사되어 변경되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하기 위한 프라이머 세트이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 프라이머 세트를 포함하는 PEDV 유전자형 분석용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 PEDV 유전자형 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 PEDV 유전자형 분석용 키트는 PEDV 검출 및 이의 유전자형 판별용 키트로서, 상술한 특이 프라이머 세트가 사용되었을 뿐만 아니라 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있게 다중튜브 방식이 적용된다.

즉, 본 발명의 키트는 하나의 키트에 이러한 다중튜브 방식이 적용되어 사용자는 하나의 키트를 사용하여 한 번의 반응을 통하여 PEDV 자체의 검출과 임상적으로 주요한 PEDV 유전자형의 동시감별검출을 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 다중튜브 방식은 특이 프라이머 쌍이 구분하여 적용된 2 개의 튜브로 구성되는 스트립(strip) 형태를 지칭한다.

본 발명에 따르면 상기 각 튜브에는 특이 프라이머가 구분되어 수용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 튜브 1에는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 2에는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용된다.

상술한 바와 같이 특이 프라이머 쌍을 튜브별로 구분하여 수용함으로써 기존 PEDV 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 다수의 프라이머들의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 및 특이도 저하 문제나 위음성 결과 초래 문제가 해소된다.

또한, 단일 종의 증폭산물만이 있는 상태에서 증폭산물을 회수하면 되기 때문에 상대적으로 매우 단순한 과정을 통하여 증폭산물을 확보할 수 있어 결과적으로 용이하게 증폭산물의 유전자 형을 판정하고, 분석 및 감별을 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 분석용 조성물 및 분석용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 분석용 조성물 및 분석용 키트는 역전사 반응 및 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다.

본 발명의 분석용 조성물 및 분석용 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 PEDV의 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 각 튜브에 포함되는 성분들로는 이에 국한되지 않지만, 역전사 효소, DNA 중합효소, Tris-HCl, MgCl2, KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase Inhibitor, DTT, 8-MOP 등을 제시할 수 있다. 이들은 적절한 농도 범위에서 포함되어야 하는데, 0.1-10 unit의 역전사 효소, 1-10 unit의 DNA 중합효소, 10-300 mM의 Tris-HCl, 1-50 mM의 MgCl2, 1-100 mM의 KCl, 1-5 mM의 dATP, 1-5 mM의 dTTP, 1-5 mM의 dGTP, 1-5 mM의 dCTP, 1-10 unit의 RNase Inhibitor, 0.001-0.1 M의 DTT, 0.5-5 ㎍의 8-MOP을 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 각 튜브에 첨가된 성분들은 액상 형태로 제조할 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성(stability)을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이에 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는, 이들의 복합 공정도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 카트는 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석 방법을 제공한다:

(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 RNA로부터 역전사된 cDNA를 주형으로 하고, 상술한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및

(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.

상기 검체는 생물학적 시료로서 목적의 대상 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미하며, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 RT-PCR은 다중튜브(multitube) 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명에 따르면, 당업계에 공지의 방법에 따라 검체로부터 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA로부터 역전사된 cDNA를 합성하고, 이를 포함하는 조성물에 본 발명의 프라이머 세트, 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 조성물 또는 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 키트를 이용하여 다중튜브 RT-PCR을 실시한다. 다중튜브 RT-PCR을 실시한 후에 얻어진 산물(반응액)에 대하여 통상적인 방법으로 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하여 증폭산물의 생성 여부 및 그 크기에 근거하여 PEDV 검출 및 이의 유전자형 G1 및 G2의 유전자형을 동시 검출하여 판정한다.

예를 들어, 1 번 튜브에서 이에 해당하는 340 bp 크기의 증폭산물이 관찰되면 이는 검체 내에 PEDV G1형 자체가 존재한다는 것을 의미한다.

이와 같이 결과를 종합적으로 검토함으로써 검체 내의 PEDV 존재 유무와 더불어 PEDV의 유전자형까지 감별검출할 수 있다.

본 발명에서는 PEDV 유전자형에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 세트를 설계하고, 상기 프라이머 세트가 PEDV 유전자형에 대해 선택적으로 결합함을 확인함으로써, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PEDV 유전자형을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 기존 다중유전자 검출 방법에 비해 본 발명의 다중튜브 검출 방법으로 적용된 동시 진단 키트의 현저한 효과를 확인하였으므로, PEDV 검출 및 이의 유전자형을 동시에 진단하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 키트는 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 유전자형(genotype) 간의 유전학적 차이를 이용하므로, PEDV 자체의 검출 뿐만 아니라 상기 PEDV의 유전자형을 우수한 특이도로 정확하게 판별할 수 있어, 백신 제조시 필요한 바이러스 동정(identification)에 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 특이 프라이머로 증폭되는 PEDV 유전자형에 대한 유전자 부위를 표시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 PEDV 유전자형 분석용 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 반응 결과로서 단편 밴드의 크기를 보여준다.
도 3은 기존 프라이머와 본 발명의 PEDV 유전자형 분석용 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 비교 결과를 보여준다.
(com: 기존의 PEDV S 유전자 검출용 프라이머, G1: 본 발명의 G1 프라이머 세트, G2: 본 발명의 G2 프라이머 세트)

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)에 특이적인 프라이머 세트의 제작

본 발명자들은 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 백신 제조시 필요한 바이러스 동정(identification)에 적용할 수 있는 PEDV의 유전자형 분석을 위하여, PEDV 유전자형(genotype) 간의 유전학적 차이를 이용하여 감별진단할 수 있는 RT-PCR에 적합한 프라이머를 제작하였다.

통상적으로 S(Spike) 유전자 부분은, 상이한 PEDV 유전자형 간의 유전적 관련성을 분석하기에 적절한 부위로 공지되어 있고, 상기 유전자-기반 계통수에 따라 PEDV는 2 개의 클러스터로 명확하게 구분되며, 이는 G1(genotype 1) 및 G2(genotype 2) 유전자형으로 명명된다.

현재 야외에서 유행하고 있는 PEDV G2 유전자형(genotype)과 기존 생독백신 등에 백신주로 사용되고 있는 PEDV G1 유전자형 간 S 유전자의 염기서열 차이를 이용하여 프라이머를 설계하였다(도 1).

보다 상세하게는, GenBank에서 확보된 유전자 정보를 이용하여 각 PEDV 유전자형 G1(genogroup 1, classical) 및 G2(genogroup 2, field epidemic)을 구분할 수 있는 유전자 특이 영역으로서 S 유전자 및/또는 ORF1b 유전자를 선정하였고, G1 프라이머 세트는 PEDV의 PEDV G1 유전자형의 Spike 유전자 부위를 타겟으로 하여 PEDV G1 유전자형을 특이적으로 검출할 수 있으며, G2 프라이머 세트는 PEDV의 PEDV G2 유전자형의 ORF1b 및 Spike 유전자 부위를 타겟으로 하여 PEDV G2 유전자형을 특이적으로 검출할 수 있다.

PEDV 유전자형 G1 검출용 프라이머 세트는 PEDV G1 유전자형 바이러스의 전체 유전자(JQ023162.1)의 5' 말단으로부터 20763번째에서 20790번째까지의 정방향 프라이머(G1-F) 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 21071번째에서 21091번째까지의 역방향 프라이머(G1-R)를 포함하도록 하였다.

PEDV 유전자형 G2 검출용 프라이머 세트는 PEDV G2 유전자형 바이러스의 전체 유전자(KJ623926.1)의 5' 말단으로부터 20471번째에서 20494번째까지의 정방향 프라이머(G2-F) 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 20806번째에서 20826번째까지의 역방향 프라이머(G2-R)를 포함하도록 하였다.

이에 따라, 본 발명의 G1 프라이머 세트는 PEDV 유전자형 G1을 검출할 수 있으며, G2 프라이머 세트는 PEDV 유전자형 G2를 특이적으로 검출할 수 있다.

상기 프라이머 서열들은 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	이름	서열(5' → 3')	산물 크기
1	G1-F	TATCTACCTAGTATGAACTCTTCTAGCT	340 bp
2	G1-R	CCGACAACAATATTTTTTCCA	340 bp
3	G2-F	GATTTAAGCAAGTTCAATTGTAAGC	380 bp
4	G2-R	AAGTTGAATTGACACCCTGGT	380 bp

실시예 2. RNA 추출 및 역전사

본 발명자들은 PEDV 유전자형 분석을 위하여, 총 RNA를 PEDV들(PEDV DR13 및 PEDV QIAP1401)로부터 추출하였다. TRIzol (750㎕) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 250㎕의 바이러스와 혼합하고, 실온에서 15 분간 반응시켰다. 클로로포름 200㎕을 첨가 후, 4℃에서 12,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하였다. RNA 침전을 위해 채취한 상층액과 동일 부피의 이소프로판올과 혼합하고, 실온에서 15 분 동안 반응시킨 후, 4℃, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. RNA 펠렛을 1 ml의 75% 에탄올로 세정하고, 4℃, 12,000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 공기중 건조 후에 30 ㎕의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 증류수에서 재부유하였다. 제조된 RNA의 역전사를 랜덤 프라이머 (헥사머, TaKaRa, Otsu, Shiga, Japan) 및 M-MLV 역전사효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 랜덤 프라이머 (100 pmol) 및 10ul의 RNA를 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, 얼음에 급냉시켰다. 5X First Strand 완충액 (50 mM Tris HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl), 10 mM DTT, 각각 0.3 mM dNTP, 및 100 유닛의 역전사효소를 포함하는 나머지 시약을 20㎕의 총 부피에 첨가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

실시예 3. PEDV 유전자형 분석 결과

본 발명자들은 PEDV들(PEDV DR13 및 PEDV QIAP1401)의 유전자형을 확인하기 위하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하였다.

먼저, 실시예 2에서 제작된 cDNA를 G1 프라이머 세트, G2 프라이머 세트가 들어있는 각각의 PCR 튜브에 넣었다. 하기 조건을 PCR에 적용하였다: 95℃, 30초 변성, 58℃, 30초 어닐링 및 72℃, 30초 연장으로 이루어진 35 사이클. 사이클의 완료시, 냉각 전에 시료를 72℃에서 5분 동안 유지하였다. PCR 산물을 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.0% 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 G1은 G1 유전자형으로 공지된 PEDV DR13에서만 밴드가 확인되었고, 본 발명의 프라이머 세트 G2는 G2 유전자형으로 공지된 PEDV QIAP1401에서만 밴드가 확인되었다.

또한, PEDV G1 스트레인 및 G2 스트레인에 대한 본 발명의 각 프라이머 세트와 공지된 프라이머(com)(J Vet Diagn Invest 13:516-520(2001)의 표 1에 기재된 P1 및 P2 프라이머)에 의한 구분 효과를 비교하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각각의 PEDV G1, G2 바이러스 샘플에 대하여 RT-PCR을 실시했을 때, 공지된 프라이머인 기존의 프라이머(com)는 PEDV G1 및 G2를 구분하지 못한 반면, 본 발명의 각 G1, G2 프라이머 세트는 각 유전자형을 정확하게 구분하여 검출하였다.

따라서, 본 발명의 프라이머 세트들은 각 유전자형에 대하여 현저한 특이도를 나타낸다는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 프라이머가 PEDV 자체의 검출뿐만 아니라 이의 유전자형인 G1 및 G2를 특이적으로 판별하는 데 유효하다는 것을 보여준다.

<110> GREEN CORSS VETERINARY PORDUCTS CO., LTD <120> Primers for Analyzing Porcine Epidemic Diarrhea Virus Genotype and Uses Thereof <130> GCVP1-16p <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1 primer F <400> 1 tatctaccta gtatgaactc ttctagct 28 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1 primer R <400> 2 ccgacaacaa tattttttcc a 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G2 primer F <400> 3 gatttaagca agttcaattg taagc 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G2 primer R <400> 4 aagttgaatt gacaccctgg t 21

Claims

다음을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석용 프라이머 세트:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된, PEDV 유전자형 G1(genogroup 1, classical) 검출용 프라이머 세트; 및
(b)서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된, PEDV 유전자형 G2(genogroup 2, field epidemic) 검출용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 프라이머 세트는 S(Spike) 유전자를 증폭시키고, 상기 (b)의 프라이머 세트는 ORF1b(open reading frame 1b) 및 S(Spike) 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석용 조성물.
제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석용 키트.
다음 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 유전자형 분석 방법:
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 RNA로부터 역전사된 cDNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.