CN111560478B - 一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒 - Google Patents

一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒。本发明提供了能够特异性扩增新型冠状病毒COVID‑19的ORF1a、ORF1ab和3种结构蛋白（S蛋白、E蛋白、N蛋白）基因的引物组合，利用该引物组合，结合一步法反转录PCR和Sanger测序构建得到了检测新型冠状病毒COVID‑19的试剂盒，该试剂盒实现了RNA反转录和PCR扩增一步完成，简化了操作步骤、缩短了检测时间；另外，该试剂盒的检测准确度、灵敏度和特异性均高达100%，最低检出量和检测重复性均验证通过；因此，将该试剂盒应用于新型冠状病毒COVID‑19的检测具有重要的临床意义。

Description

一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的 试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域。更具体地，涉及一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。某些冠状病毒会感染人类并引起疾病，比如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)，其症状可从普通感冒到重症肺部感染。新型冠状病毒COVID-19基因组为一条完整的单股正链RNA，长约30Kb。利用NCBI上的ORFfinder工具进行该病毒的基因组注释分析，发现COVID-19基因组中共有14个开放阅读框(具有编码基因的能力)，ORF1a、ORF1ab和4种结构蛋白：S蛋白(Spikeprotein，刺突蛋白)，M蛋白(membrane protein膜蛋白)，E蛋白(envelope protein，包膜蛋白)，N蛋白(nucleocapsid，核壳蛋白)基因。
目前，COVID-19的传染源主要是新型冠状病毒感染的肺炎患者，经呼吸道飞沫传播是其主要的传播途径，亦可通过接触传播。流行病学观察显示人群普遍易感，老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。COVID-19引起的肺炎以发热、乏力、干咳为主要症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重型病例多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是，重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。另外，新型冠状病毒感染的肺炎发病早期外周血白细胞总数正常或减低，淋巴细胞减少，部分患者出现肝酶和肌红蛋白增高；多数患者C反应蛋白(CRP)和血沉升高，降钙素原正常；严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。胸部影像学显示，其早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见。
由于COVID-19疫情的突发性，相关抗原抗体标记物的开发需要比较长时间。COVID-19的准确确定依赖于分子生物学技术，形态学以及临床观察仅仅对于COVID-19的存在提供一些推断性支持。目前，最精确、最快速的对于疑似病例的确诊方法为对呼吸道标本或血液标本进行逆转录+实时荧光定量PCR检测或进行基因测序；其中，实时荧光定量PCR检测技术简单，快速，灵敏；但是，该方法需要先将样本RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增，实验操作繁琐，所需时间长；且由于COVID-19发现时间较短，科学认知不足，用于鉴别诊断的基因位点未经大规模临床验证，可能存在假阴性或假阳性、准确性和分析特异性风险。基于此，需要有另一种解决方案供临床检验COVID-19，形成比对和验证。使用Sanger测序法获得标本病毒核酸序列，是最直接的、可检测已知和未知基因序列的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括新的、罕见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失等。因此，建立一种基于Sanger测序法检测COVID-19的技术具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有检测COVID-19的方法的缺陷和不足，提供一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒。
本发明的目的是提供一种检测新型冠状病毒COVID-19的引物组合。
本发明另一目的是提供所述引物组合在制备检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒中的应用。
本发明另一目的是提供一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种检测新型冠状病毒COVID-19的引物组合，包括引物B2M-1-F/R、1-2-F/R、2-4-F/R、3-2-F/R、4-1-F/R、5-3-F/R、6-2-F/R、7-4-F/R、8-3-F/R和9-4-F/R，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:1～20所示。
本发明以新型冠状病毒COVID-19的ORF1a、ORF1ab和3种结构蛋白（S蛋白、E蛋白、N蛋白）基因特定区域为靶序列设计特异性引物组合，所述引物组合能够特异性的检测出新型冠状病毒COVID-19；因此，所述引物组合在制备检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述试剂盒为一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒。
本发明设计特异性引物组合，利用一步法反转录PCR对新型冠状病毒COVID-19的ORF1a、ORF1ab和3种结构蛋白（S蛋白、E蛋白、N蛋白）基因特定区域进行特异性扩增（扩增所用的PCR反应的试剂采用独特的配方及比例，使不同基因位点的PCR扩增条件一致，结果无非特异性扩增）；然后以该扩增产物为模板，采用单端引物进行Sanger测序，扩增出带有双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)标记的单链DNA，然后通过毛细管电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后小片段跑得快，先经过检测窗口，大片段随后经过检测窗口；荧光标记的DNA片段在检测窗口被检测，激发的不同波长荧光各自代表“A、T、C、G”四个不同的碱基，这些信号按照分子量大小顺序通过CCD检测窗口进行信号收集，并转化为DNA序列。
本发明还提供了一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒，包括所述的引物组合。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应的试剂、所述引物组合的扩增产物的Sanger测序引物和Sanger测序的试剂。
优选地，所述Sanger测序引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19所示。
优选地，所述PCR反应的试剂包括逆转录Mix、混合酶和H2O。
优选地，所述PCR反应的体系为：逆转录Mix 7.5μL、所述的引物组合各1.25μL、混合酶1.5μL、待测样本RNA 5μL、H2O补足至30μL。
优选地，所述PCR反应的程序为：55℃ 15min；95℃ 30s；95℃ 10s，60℃ 60s，45个循环；38℃ 30s。
优选地，所述Sanger测序的试剂包括BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing Kit、5×seq Buffer。
优选地，所述Sanger测序的反应体系为：BigDye 0.5μL、5×seq Buffer 1.75μL、Sanger测序引物各1μL、PCR回收产物1μL、H2O补足至10μL。
优选地，所述Sanger测序的反应程序为：96℃ 1min；96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环；4℃ ∞。
优选地，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1. 采集鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液样本；
S2. 采用磁珠法提取样本的DNA；
S3. 使用上述PCR扩增引物组合进行PCR扩增反应；
S4. 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及回收；
S5. 将回收产物利用上述Sanger测序引物进行Sanger测序，序列比对分析。
本发明具有以下有益效果：
本发明以新型冠状病毒COVID-19的ORF1a、ORF1ab和3种结构蛋白（S蛋白、E蛋白、N蛋白）基因特定区域为靶序列设计特异性引物组合，并利用该引物组合，结合一步法反转录PCR和Sanger测序构建得到了检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒，该试剂盒能够实现RNA反转录和PCR扩增一步完成，不仅简化了操作步骤、提高了检测效率，还能够降低检测成本；
该试剂盒的检测准确度高达100%、灵敏度高达100%、特异性高达100%，最低检出量实验结果与预期结果的符合率为90%以上，验证通过，检测重复性实验结果与预期结果的符合率为90%以上，重复性实验结果临界阳性样本通过，且该试剂盒与现有基于实时荧光定量PCR法的试剂盒对新型冠状病毒COVID-19的检测结果完全一致；因此，将该试剂盒应用于新型冠状病毒COVID-19的检测具有重要的临床意义，值得大力推广应用。
附图说明
图1是8种冠状病毒的进化树分析结果图。
图2是8种冠状病毒的序列相似性分析结果图；其中，图中刻度表示比对序列基因排序；序列名称由上至下分别为：COVID-19、SARS-CoV、蝙蝠bat-SL-CoV、HKU1、OC43、NL63、229E、MERS-CoV病毒；以COVID-19为基准序列进行比对，比对位置碱基相同者，使用“.”表示，若不相同者，使用原有碱基表示，其余序列间不做此设置。
图3是ORF1a区域-1、ORF1a区域-2、ORF1a区域-3、ORF1a区域-4和ORF1ab区域的PCR扩增结果图；其中，左数第1孔位为DNA marker(条带大小由上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp(亮带)，300bp，200bp和100bp)，左数第2-5孔位分别为ORF1a区域-1引物的PCR扩增产物，左数第7-10孔位分别为ORF1a区域-2引物的PCR扩增产物，左数第12-15孔位分别为ORF1a区域-3引物的PCR扩增产物，左数第17-20孔位分别为ORF1a区域-4引物的PCR扩增产物，左数第22-25孔位分别为ORF1ab区域引物的PCR扩增产物。
图4是S基因区域、E基因区域、N基因区域-1、N基因区域-2和人类B2M基因区域的PCR扩增结果图；其中，左数第1孔位为DNA marker(条带大小由上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp(亮带)，300bp，200bp和100bp)，左数第2-5孔位分别为S基因区域引物的PCR扩增产物，左数第7-10孔位分别为E基因区域引物的PCR扩增产物，左数第12-15孔位分别为N基因区域-1引物的PCR扩增产物，左数第17-20孔位分别为N基因区域-2引物的PCR扩增产物，左数第22-25孔位分别为人类B2M基因引物的PCR扩增产物。
图5是一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒对实际样本的检测结果；其中，左数第1孔位为DNA marker(条带大小由上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp(亮带)，300bp，200bp和100bp)，左数第2-10孔位依次分别为引物1-2-F/R、2-4-F/R、3-2-F/R、4-1-F/R、5-3-F/R、6-2-F/R、7-4-F/R、8-3-F/R、9-4-F/R、B2M-1-F/R的PCR扩增产物，左数第11孔位为引物B2M-1-F/R（内参）的PCR扩增产物。
图6是1.seq的序列比对分析图。
图7是2.seq的序列比对分析图。
图8是3.seq的序列比对分析图。
图9是4.seq的序列比对分析图。
图10是5.seq的序列比对分析图。
图11是6.seq的序列比对分析图。
图12是7.seq的序列比对分析图。
图13是8.seq的序列比对分析图。
图14是9.seq的序列比对分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所用的混合酶为HiScript II U+ One Step qRT-PCR Probe Kit，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
实施例1 引物设计与筛选
1、序列分析
（1）实验方法
根据公开发布的新型肺炎冠状病毒COVID-19的全基因组序列，并搜集SARS-CoV、冠状病毒OC43、HKU1、MERS-CoV、NL63和229E冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)可以感染人类的冠状病毒的的全基因组序列信息，以及蝙蝠中采集到的蝙蝠sars样冠状病毒bat-SL-CoVZC45的全基因组序列信息（8种冠状病毒的基因组信息如表1所示），将基因组信息进行Clustal比对，分析序列的相似性和亲缘关系。
表1 8种冠状病毒的基因组信息
Figure 780190DEST_PATH_IMAGE001
（2）实验结果
8种冠状病毒的进化树分析结果如图1所示，可以看出，与COVID-19亲缘最近的为蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒，其次为SARS-CoV病毒，其余同科病毒亲缘关系较远。
8种冠状病毒的序列相似性分析结果如图2所示，可以看出，与COVID-19的序列最为相似的为蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒基因组序列，相似性为88%，其次为SARS-CoV病毒，相似性为80%。
因此，设计引物时，主要考量COVID-19与蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒和SARS-CoV病毒的特异性。
2、引物的设计
（1）实验方法
本发明针对COVID-19的检测引物的设计，除了遵循普通PCR扩增引物设计原则外，更进一步需要考虑：
1）反转录产物片段长度普遍较短，扩增区间不宜过长；
2）重点考虑与蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒和SARS-CoV病毒序列之间的非保守区域；
3）扩增产物序列中与蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒和SARS-CoV病毒序列序列有5%以上的碱基存在差异，便于判读；
4）引物结合区域与其他几种比对基因组有明显区别；
5）设计引物经过Blast比对，确保与人类基因组、常见人体或环境微生物之间无交叉反应。
根据上述原则，针对新型冠状病毒（2019-nCoV）的ORF1a、ORF1ab和4种结构蛋白：S蛋白，M蛋白，E蛋白，N蛋白基因的9个特异区域和人类B2M基因特异性区域（作为内参监控提取与反转录过程）设计出40对引物（40对引物及其检测区域如表2所示），40对引物的序列如表3-表5所示。
表2 40对引物及其检测区域
Figure 837008DEST_PATH_IMAGE002
表3 14对引物的序列
Figure 712560DEST_PATH_IMAGE003
表4 14对引物的序列
Figure 804013DEST_PATH_IMAGE004
表5 12对引物的序列
Figure 310080DEST_PATH_IMAGE005
3、PCR扩增
（1）实验方法
采集鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液样本，采用磁珠法提取RNA作为模板，使用表3中的40对引物，按照以下PCR扩增体系（表6）和PCR扩增程序（表7）分别进行PCR扩增反应，验证40对引物的扩增效率。
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及回收：用2%（w/w）的琼脂糖凝胶进行电泳；电泳条件为100V、20min。
表6 PCR扩增体系
Figure 355659DEST_PATH_IMAGE006
表7 PCR扩增程序
Figure 238164DEST_PATH_IMAGE007
（2）实验结果
ORF1a区域-1、ORF1a区域-2、ORF1a区域-3、ORF1a区域-4和ORF1ab区域的PCR扩增结果如图3所示，S基因区域、E基因区域、N基因区域-1、N基因区域-2和人类B2M基因区域的PCR扩增结果如图4所示。
同时对10个靶点的引物对任意选择一对进行组合（10个靶点各选一组引物对，共10个引物对），在同一管中进行检测反应。经过大量的实验结果显示，如表8所示的10个引物对的组合检测效果最佳：B2M-1-F/R、1-2-F/R、2-4-F/R、3-2-F/R、4-1-F/R、5-3-F/R、6-2-F/R、7-4-F/R、8-3-F/R和9-4-F/R。10个引物对的组合及其序列如表8所示。
表8 10个引物对的组合及其序列
Figure 387386DEST_PATH_IMAGE008
Sanger测序引物的设计方法与上述PCR扩增引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，得到Sanger测序引物的核苷酸序列依次如表8中的SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19所示。
实施例2 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的构建
本发明构建了一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒，包括以下组分：
PCR扩增引物组合、PCR反应的试剂、Sanger测序引物、Sanger测序的试剂。
其中，PCR扩增引物组合包括引物B2M-1-F/R、1-2-F/R、2-4-F/R、3-2-F/R、4-1-F/R、5-3-F/R、6-2-F/R、7-4-F/R、8-3-F/R和9-4-F/R，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:1～20所示；Sanger测序引物的核苷酸序列依次如表8中的SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19所示；PCR反应的试剂包括：逆转录Mix、混合酶和H2O；Sanger测序的试剂包括：BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、5×seq Buffer。
该试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1. 采集鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液样本；
S2. 采用磁珠法提取样本的DNA；
S3. 使用上述PCR扩增引物组合进行PCR扩增反应；
S4. 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及回收；
S5. 将回收产物利用上述Sanger测序引物进行Sanger测序，序列比对分析。
其中，步骤S3中PCR扩增体系如表6所示，PCR扩增程序如表7所示；PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及回收的方法为：电泳条件为100V、20min，采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段；
Sanger测序的方法为：采用BigDye Terminator试剂盒，以回收产物为模板，利用上述Sanger测序引物进行Sanger测序，按照表9所示的Sanger测序PCR反应体系和表10所示的Sanger测序PCR反应程序进行Sanger测序；然后将Sanger测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后对Sanger测序结果进行序列比对分析。
表9 Sanger测序PCR反应体系
Figure 64355DEST_PATH_IMAGE009
表10 Sanger测序PCR反应程序
Figure 502290DEST_PATH_IMAGE010
实施例3 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒对实际样本的检测
1、实验方法
利用本发明实施例2构建得到的一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒，对实际样本1-10（已知样本结果为阳性）进行检测；具体步骤如下：
（1）试剂配制
提前将试剂盒中的试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。确定PCR反应数N，N=待检样本数（n）×10。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下：
组分 PCR反应预混液 混合酶
体积（μL） 21 1.5
取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按13.6μL/管分装至PCR反应管中。
（2）加样
分别取5μL样本RNA加入到上述PCR反应管中，再将相应的PCR扩增引物组合分别加入到对应的PCR反应管中，每个样本各加1.25μL PCR扩增引物（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。
（3）PCR扩增
配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行PCR扩增反应，PCR扩增程序如表7所示。
（4）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
由于PCR扩增产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶，电泳条件为100V、20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR扩增产物电泳结果良好，采用商品化的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。
（5）Sanger测序
采用BigDye Terminator试剂盒，以回收产物为模板，利用上述Sanger测序引物进行Sanger测序，按照表9所示的Sanger测序PCR反应体系和表10所示的Sanger测序PCR反应程序进行Sanger测序；然后将Sanger测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后依次得到Sanger测序结果序列1.seq-9.seq，与已公开的新型冠状病毒COVID-19的序列（MN908947.3）进行序列比对分析。
2、实验结果
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒对实际样本的检测结果如图5所示，可以看出，该试剂盒对阳性样本的检测结果显示为阳性，检测结果准确度高。
Sanger测序结果序列比对分析图依次分别如图6-14所示，可以看出，一致率大于90%，与已公开的新型冠状病毒COVID-19的序列（MN908947.3）高度同源。
实施例4 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的检测性能验证
1、实验方法
利用与实施例3相同的方法对已知样本结果（阳性或阴性）的样本进行检测，以验证该试剂盒的准确度、灵敏度、特异性、最低检出量和重复性。
2、实验结果
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的准确度验证结果如表11所示，可以看出，该试剂盒的检测准确度高达100%。
表11 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的准确度验证
Figure 516382DEST_PATH_IMAGE011
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的灵敏度验证结果如表12所示，可以看出，该试剂盒的检测灵敏度高达100%。
表12 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的灵敏度验证结果
Figure 988952DEST_PATH_IMAGE012
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的特异性验证结果如表13所示，可以看出，该试剂盒的检测特异性高达100%。
表13 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的特异性验证结果
Figure 899139DEST_PATH_IMAGE013
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的最低检出量验证结果如表14所示，可以看出，该试剂盒的最低检出量实验结果与预期结果的符合率为90%以上，验证通过。
表14 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的最低检出量验证结果
Figure 824369DEST_PATH_IMAGE014
一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的重复性验证结果如表15所示，可以看出，该试剂盒的检测重复性实验结果与预期结果的符合率为90%以上，重复性实验结果临界阳性样本通过。
表15 一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的重复性验证结果
Figure 48677DEST_PATH_IMAGE015
实施例5 基于Sanger测序法与实时荧光定量PCR法的检测新型冠状病毒COVID-19的一致性验证
1、实验方法
分别利用本发明实施例2构建得到的一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒、现有基于实时荧光定量PCR法的试剂盒对30例实际样本进行检测，验证检测结果的一致性。
2、实验结果
基于Sanger测序法与实时荧光定量PCR法的检测新型冠状病毒COVID-19的一致性验证结果如表16-表17所示，可以看出，本发明构建得到的试剂盒与现有基于实时荧光定量PCR法的试剂盒对新型冠状病毒COVID-19的检测结果完全一致。
表16 基于Sanger测序法与实时荧光定量PCR法的检测新型冠状病毒COVID-19的一致性验证结果（样本1-15）
Figure 579016DEST_PATH_IMAGE016
表17 基于Sanger测序法与实时荧光定量PCR法的检测新型冠状病毒COVID-19的一致性验证结果（样本16-30）
Figure 863367DEST_PATH_IMAGE017
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州凯普医药科技有限公司
广州凯普医学检验所有限公司
广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院）
<120> 一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatgaggag tatgcagact ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccacatctg tggattcagc a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagccctat gtgttcatca aa 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatgcactc aagagggtag cca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtggagct aaacttaaag cct 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtattgttt gttaccatca tat 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctcagaat acaaaggtcc tatt 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggttttaga tcttcgcagg caaga 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcagcatcta tagtagctgg tggt 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctagttgtat ccattgctcc act 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccctatttt cttcataact ggt 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cattgagccc acaatttaga tga 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggttaccaa ccatacagag tagt 24
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acactggtag aatttctgtg gt 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacactggtt tgtaacacaa agga 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctcagagtc gtcttcatca a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taggaactgg gccagaagct 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagagcagca tcaccgccat t 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgctgaggct tctaagaagc ct 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgagtttcat cagccttctt ct 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggcgttttg cctcaacttg a 21
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tagcgagtgt atgcccctcc gtt 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acagccctat gtgttcatca aa 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
taatgcactc aagagggtag cca 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgttcatcaa acgttcggat gct 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgctagaagg tctttaatgc act 23
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agccctatgt gttcatcaaa cgttcgga 28
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgtgctaga aggtctttaa tgca 24
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcattattgg tggagctaaa ct 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgtctttgat ttcgagcaac ata 23
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
taaagccttg aatttaggtg aaaca 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agcaacataa gcccgttaat aca 23
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtggagctaa acttaaagcc t 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaggtattgt ttgttaccat ca 22
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tggtggagct aaacttaaag cct 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggtattgttt gttaccatca tat 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agacggtgct ttacttacaa agt 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acaatttagc tcctttctta a 21
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcctcagaat acaaaggtcc tatt 24
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tggttttaga tcttcgcagg caaga 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acggtgcttt acttacaaag t 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agttgcattg ttaacatgcc aa 22
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acaaagtcct cagaatacaa aggt 24
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtggctttat tagttgcatt gt 22
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcagcatcta tagtagctgg tggt 24
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctagttgtat ccattgctcc act 23
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
catatcagca tctatagtag ct 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ttactgaagt cattgagagc ct 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
agctatcgta gtaacatgcc tt 22
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agatgacaac aagcagcttc tct 23
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tcgtagtaac atgccttgcc t 21
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cttgtactta ttataaagag ct 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcttcataac tggtaataca ct 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
actgagagta agactactga tgt 23
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgtgtgttga gtattgccct at 22
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acacattgag cccacaattt aga 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gccctatttt cttcataact ggt 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cattgagccc acaatttaga tga 23
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
actggtaata cacttcagtg tata 24
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgatgattct actctgagtt gtt 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aatggtgttg gttaccaacc ata 23
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tgtaggcaat gatggattga ct 22
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tggttaccaa ccatacagag tagt 24
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acactggtag aatttctgtg gt 22
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atcatatggt ttccaaccca ctaatggt 28
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tagcgcatat acctgcacca at 22
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
attgtttagg aagtctaatc tcaa 24
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tggattgact agctacacta cgt 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atggcacaca ctggtttgta aca 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
atgtgtaatg taatttgact cct 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tcaaatggca cacactggtt tgt 23
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
actggctcag agtcgtcttc a 21
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tttgtcatga tggaaaagca ca 22
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
agattctcat aaacaaatcc ataagt 26
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cacactggtt tgtaacacaa agga 24
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gctcagagtc gtcttcatca a 21
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tggacttccc tatggtgcta aca 23
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
agcagcaaag caagagcagc a 21
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
agctggactt ccctatggtg ct 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tgctctcaag ctggttcaat ct 22
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
taggaactgg gccagaagct 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
aagagcagca tcaccgccat t 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ctactaccta ggaactgggc ca 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
agctggttca atctgtcaag ca 22
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aatctgctgc tgaggcttct aaga 24
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agagtcacag tttgctgttt ct 22
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
acaaggccaa actgtcacta aga 23
<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
tcttctgtct ctgcggtaag gcttgagt 28
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
agaaatctgc tgctgaggct tctaaga 27
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tgctgtttct tctgtctctg cggta 25
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tgctgaggct tctaagaagc ct 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tgagtttcat cagccttctt ct 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tcatgaggag tatgcagact ct 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
tccacatctg tggattcagc a 21
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
accccttgta tatagagttt ggct 24
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
attcaaagta cagcgggcct t 21
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tgatgtatct gagcaggttg ct 22
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gaacttgaag actgtttccc tgt 23
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
actttatgca caaaatgtag ggtta 25
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tccaataatc ctgtcaatta tatttct 27

Claims (5)

1.一种检测新型冠状病毒COVID-19的引物组合，其特征在于，包括引物B2M-1-F/R、1-2-F/R、2-4-F/R、3-2-F/R、4-1-F/R、5-3-F/R、6-2-F/R、7-4-F/R、8-3-F/R和9-4-F/R，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:1～20所示。
2.权利要求1所述引物组合在制备检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒中的应用；所述试剂盒为一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒；
包括权利要求1所述的引物组合；
还包括PCR反应的试剂、权利要求1所述引物组合的扩增产物的Sanger测序引物和Sanger测序的试剂；
所述Sanger测序引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的试剂包括逆转录Mix、混合酶和H2O。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的体系为：逆转录Mix 7.5μL、权利要求1所述的引物组合各1.25μL、混合酶1.5μL、待测样本RNA 5μL、H2O补足至30μL。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的程序为：55℃ 15min；95℃ 30s；95℃ 10s，60℃ 60s，45个循环；38℃ 30s。
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