CN111118226B - 一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒 - Google Patents
一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种超灵敏度新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒，本发明需少量RNA便可方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，可直接对接二代测序建库试剂和三代测序平台，获得新型冠状病毒全基因组序列。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及到一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，长度从2.6万到3.2万个碱基不等，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ四个属。SARS-CoV-2属于β属，全长29847bp。
自2020年1月26日以来，已有7个新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品陆续通过国家药品监督管理局应急审批，获得上市批件。SARS-CoV-2鉴定试剂盒以荧光定量PCR方法为主，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便。但是，该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估，而且应用荧光定量PCR方法鉴定SARS-CoV-2假阴性情况经常发生，甚至出现过6次检测才有1次阳性的情况。
此外，基于宏基因组测序（metagenomics Next Generation Sequencing，简称“mNGS”，又称“宏基因组学”）的检测试剂盒也已获批，能够鉴别诊断包括新型冠状病毒在内的其他冠状病毒和呼吸道病原的感染，实现病毒序列的快速检测。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS) 不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。随着mNGS 技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS在临床上的运用将越来越广泛。2016年美国FDA认可用二代测序技术进行微生物鉴定及耐药毒力分析；2019年病原宏基因组学被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南。
测序指的是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。第二代测序（NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。目前测序技术已发展到第三代，第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。近年，新一代测序技术（NGS）（也称之为二代测序）和纳米孔测序技术（Nanopore)(也称之为三代测序）越来越多的应用于未知病原体的诊断。中国的科学家能够在SARS-CoV-2爆发后的较短时间内，获得病毒基因组全序列，也都是得益于测序技术。
通常，测序技术在疫情爆发中有三个作用：1、鉴定未知病原体，只有获得病原全基因组才能确定新病原的身份；2、疫情发展阶段可用于直接对临床样品开展检测，实时动态监测病毒基因组的突变情况以及辅助假阴性样本确诊；3、疫情常规检测阶段，可以用于耐药位点筛选，也可以用于日常的呼吸道感染鉴别，提升呼吸道疾病的检测准确度。
目前测序技术鉴定SARS-CoV-2方法有：病原宏基因组测序以及探针捕获测序病原宏基因组测序（mNGS）是目前临床上针对病原最常用的基因测序方法，是一种基于二代测序技术的无需培养、无偏好性的病原检测技术，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。探针捕获的原理是人为设计探针（DNA或者RNA形式），探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性（一般是调节PH值到碱性）将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。然而，应用情景的差异诸多复杂因素共同影响了病原全基因组获得的成功率，同时还面临在检测一线人员在任务重压下的时间、人力、高企的测序成本等问题。因此，病原宏基因组测序（mNGS）可用于阴性样本确诊，但是不容易拿到全基因组信息，并且存在操作复杂、检测时间相对较长（需要24-72小时）等原因，在新型冠状病毒的检测上无法实现大范围推广、快速诊断的目的。作为一种技术性补充，基于扩增的基因组捕获方法，是一种“Culture-free”的病毒基因组特异富集测序方案，操作简便、成本较低，适于疫情防控的当前需求，然而现有的探针捕获测序方法操作步骤复杂，主要有7大部分不同的技术操作，每一部分的操作都需要5个步骤以上，多的甚至能达到33步，并且一旦进行操作，为满足检测的要求，每一部分内的操作不能暂停，必须持续完成。这样就给实际操作带来了很多不可控性和操作复杂性。
发明内容
本发明的目的在于给疾控及科研人员提供一种快速、方便、经济的获取SARS-CoV-2全基因组的方法，该方法通过SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计多对叠瓦式PCR扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系，仅需少量RNA便可方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，可完美对接二代测序建库试剂和三代测序平台，可快速方便地获得新型冠状病毒全基因组序列，实现新冠病毒的检测。
具体的，本发明涉及一种新型冠状病毒检测的序列组合，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQ ID No.1-196。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含新型冠状病毒检测的序列组合，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQ ID No.1-196。
另一方面，本发明涉及一种新型冠状病毒检测的测序片段捕获方法，具体步骤包括：
（1）RNA提取：将标本中的冠状病毒进行病毒 RNA 提取；
（2）引物设计与PCR扩增：使用针对SARS-CoV-2保守区域设计的98对扩增引物，所述引物序列依次为SEQ ID No.1-196，应用RT-PCR扩增体系，取步骤（1）提取的病毒RNA，进行快速扩增；
（3）测序：扩增反应结束后，将PCR反应中得到大小不同的冠状病毒基因片段，直接上机进行测序。
其中所述步骤（1）的标本类型为：鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液或肺组织活检标本。
其中所述步骤（1）的RNA 提取的最终体积为 20-50 ul。
其中所述步骤（1）的RNA 提取后获得的病毒RNA为Ct值低于27的核酸样品。
另一方面，本发明还涉及前述的序列组合在制备检测新型冠状病毒试剂盒中的用途。
此外，本发明还涉及一种新型冠状病毒的检测方法，使用前述的序列组合或试剂盒或测序片段捕获方法，获得冠状病毒全基因组序列，使用测序技术对新型冠状病毒进行检测。
具体的，本发明还涉及一种新型冠状病毒检测的测序片段捕获方法，具体步骤包括：
（1）标本类型为：鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本等，以上标本经核酸提取后用于全基因组捕获；
（2）冠状病毒按照病毒 RNA 提取试剂盒中相应的要求和步骤进行提取，其最终的体积建议为 20-50 ul ；提取的病毒RNA需进行冠状病毒qPCR检测，Ct值低于27的核酸样品可以继续进行以下的操作，用于测序检测;如果病毒提取后不直接进行检测，也可储 存-70°C备 用，但要避免反复冻融；
（3）使用针对SARS-CoV-2保守区域设计的98对扩增引物，所述引物序列依次为SEQID No.1-196，应用RT-PCR扩增体系，取少量RNA，快速扩增冠状病毒的全基因组，扩增反应结束后， PCR 反应中将得到大小不同的冠状病毒基因片段，可直接上机进行二代测序建库实验和三代测序平台。
本发明的测序片段捕获方法，属于测序过程的前一阶段，未对检测结果进行判断，属于非疾病的诊断方法。
本发明涉及的捕获方法以及试剂盒把反转录过程和PCR过程放在一个体系中完成，操作方便，时间短，对样本质量要求低。只用一次RCR反应，4h就可以完成病毒的反转录和扩增过程,对接illumina的建库试剂从核酸到广为制备完成只需要10h，使用nanopore快速建库方法从提取的盒核酸到得到测序数据只需要5h。现在其它通过捕获方法的试剂盒从核酸到文库一般要20h以上，而且操作复杂，需要配套设备多。
本发明既可以扩增毒株等病毒含量高的样本，也可以扩增咽拭子，痰液等病毒含量相对较低的样本，只要样本做新冠病毒qPCR的定量的CT值在27以下，基本上都可以扩增出全基因组序列。
将本发明的技术效果及优点总结如下：
（1）操作简便，核酸转录和扩增单管操作，消减繁琐降低交叉污染风险；
（2）扩增效率高，基因组覆盖均匀；
（3）直接对样品进行检测，无需毒株分离；
（4）对病原序列进行特异性富集，提高检测信噪比，检测深度可用于变异、 耐药、传播与进化的病原学精细化分析；
（5）测序经济、所需数据量少，单样本<1M reads，适用于所有illumina和Nanopore等测序平台。
附图说明
图1. 本发明超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获方法进行测序的结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 基于超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获方法进行建库测序
本发明具体使用基于多重PCR技术，针对SARS-CoV-2的基因序列进行靶向扩增,提高了测序深度,有效的降低了后续测序成本且缩短研究时间。多重PCR技术的一个关键点,是设计合理的多重PCR引物对组合、确保引物组合中没有重叠扩增子,以及减少引物之间的相互作用。本方法设计了98对引物，并使用应用Invitrogen SurSprit III ONE- STEP RT-PCR扩增体系，取少量RNA，快速的扩增出冠状病毒的全基因组，扩增反应结束后， PCR 反应中将得到大小不同的冠状病毒基因片段，可直接上机进行二代测序建库实验和三代测序平台。
超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获建库检测方法具体操作如下：
一、材料与试剂：
新冠肺炎分离毒株；标本类型为：鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、肺组织活 检标本等，以上标本经核酸提取后用于全基因组捕获。
反应体系配制:
(1)取出各试剂，混匀后放入离心机，短暂离心。
(2)每个样本需要分别按照 Primer A和 Primer B配制2管 50μl的 反应体系，
Primer A 体系：
Primer B 体系：
二、方法：
（1）RNA提取流程：采用试剂盒为QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen,Valencia, CA, USA) 冠状病毒按照病毒 RNA 提取试剂盒中相应的要求和步骤进行提取，本操作流程所使用的试剂盒是 QIAGEN 公司生产的 QIAamp Viral RNA Mini Kit。该试剂盒首先在高变性条件下裂解样本，使 RNA 酶失活并保证完整病毒 RNA 的释放，缓冲环境的调整 提供 RNA 与硅胶基质生物膜的最佳结合状态，接着样本被载入 QIAamp 离心柱上，RNA 被结合在生物膜上，经过两次不同洗液的清洗有效去除污染物。最终使用无RNA酶的缓冲液将其最终的体积为 20-50 ul。提取的病毒RNA经qPCR检测，Ct值低于27的核酸样品均可以继续进行以下的操作，用于测序检测；如果病毒提取后不直接进行检测，也可储存-70°C备用，但要避免反复冻融。
（2）引物设计
本发明使用叠瓦式PCR扩增技术，该技术属于一种多重PCR技术，是目标序列富集的一种手段，用于捕获多个序列片段，这些序列像叠瓦片一样排列，覆盖基因组全长，具有数据量少，深度高的优点。
使用针对SARS-CoV-2保守区域设计的多对扩增引物（见表1），应用InvitrogenSurSprit III ONE- STEP RT-PCR扩增体系，取少量RNA，快速的扩增出冠状病毒的全基因组，扩增反应结束后，PCR 反应中将得到大小不同的冠状病毒基因片段，可直接上机进行二代测序建库实验和三代测序平台。
PCR 扩增程序如下：
测序循环参数设定:
表1.引物序列信息
（3）测序过程
扩增反应结束后，一管 PCR 反应中将得到大小不同的冠状病毒基因片段，试验完成后把2管扩增产物集中在一个管中。对扩增产物进行纯化，纯化后qubit定量在10ng/ul以上的样本可直接进行后续的建库实验，然后测序平台上进行，如Illumina 的Miseq测序仪，或Thermo Fisher公司的Ion GeneStudio S5测序系统等二代或三代测序平台。
测序结果通过新型冠状病毒全基因组分析软件分析，测序结果覆盖了基因组100%的区域，所有位置的测序深度都达了100 X 以上。示例性测序结果如图1所示。
实施例2 本发明超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获方法与其他方法比较
本发明的捕获方法既可以扩增毒株等病毒含量高的样本，也可以扩增咽拭子，痰液等病毒含量相对较低的样本，只要样本做新冠病毒qPCR定量CT值在27以下，均可以扩增出全基因组序列。
对本发明超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获方法与现有其他方法进行比较，如表2所示。结果显示，使用RNA直接建库方法和反转录后直接建库等现有方法均不能很好的得到全基因组序列，且建库后捕获方法，以及RNA直接建库方法操作时间均相对本发明较长，反转录建库方法虽然操作时间短，但在测序覆盖程度等方面均无法实现检测。因此，使用本发明的超灵敏建库检测方法以及试剂盒的扩增和使用捕获方法，可测出全基因组，且无论从建库时长还是捕获效率上都有非常大的优势，在大规模人群检测时能够准确且高效地获得病毒的全基因组。
表2本发明超灵敏新型冠状病毒全基因组捕获方法与现有其他方法比较
注：（“—— ”代表未检测到）
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。
序列表
<110> 北京微未来科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒
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<213> Artificial Sequence
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acattctaac gatagctgaa atcggg 26
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<213> Artificial Sequence
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gcaattcttt ttcagctatt ttgcagt 27
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
actgtagtca caagtctctc gca 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttgtgataga ttctgtgctg gtagt 25
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<213> Artificial Sequence
<400> 52
tccgcactat cagcaacatc ag 22
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<213> Artificial Sequence
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actacactca gcttatgtgt caacc 25
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<213> Artificial Sequence
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aatacaagca gcaaggtcac gg 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tgtttagaca tcacatgaac aggtgt 26
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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agtgtactgt ataagttttg atggtgtgt 29
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<213> Artificial Sequence
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gcacaactaa tcgtgacttt ttgca 25
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accactacta gatacacaaa caccag 26
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<213> Artificial Sequence
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ttctgagtag tgtaggcacg gc 22
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acagaataaa gaccaggtaa gaatgagt 28
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agcacatcag tacgcaactt taga 24
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<213> Artificial Sequence
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acttttgaac aagctgcgct gt 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tcccatctgc taaagttgag ggt 23
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<213> Artificial Sequence
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tgttcgcatt gaaccaggac ag 22
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<213> Artificial Sequence
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ttagcttgct tgtacgctgc tg 22
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<213> Artificial Sequence
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acacacgact ggttgttact cac 23
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tgtaactgca cacattgagc cc 22
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<213> Artificial Sequence
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tgcacatgag tagtcttact ctcagt 26
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<213> Artificial Sequence
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catggctgca tgacggtcaa at 22
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<213> Artificial Sequence
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gttcccttcc atcatatgca gct 23
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<213> Artificial Sequence
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tggtatgaga accattagtt tggct 25
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<213> Artificial Sequence
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tgcaagagat ggttgtgttc cc 22
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cctacctccg tttgttgtgt tgt 23
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<213> Artificial Sequence
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tacgacacat gtcttgtgct gc 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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aacctttgca cataccgcag ac 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tgtcgcttgc aagaaaagga cg 22
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<213> Artificial Sequence
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cacgttgacc taagttggcg ta 22
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aggactgcta tgattttgta gaaaaccc 28
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<213> Artificial Sequence
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aataacgctc aaagagtttt aacctctc 28
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tagattagca gaagcagcgt gc 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tcaatagtcg ccactagagg ag 22
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agtgcattga cattggccgt ga 22
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<213> Artificial Sequence
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catcagcaga tgccacaact gc 22
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<213> Artificial Sequence
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gttgagagca aaagtcatga ggtcc 25
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<213> Artificial Sequence
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agcaaaatgt tggactgaga ctga 24
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<213> Artificial Sequence
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agcctgataa aactcaggtt ccc 23
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<213> Artificial Sequence
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tgagttaaca cgacacatgt tagaca 26
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<213> Artificial Sequence
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aaccaaaaac ttgtcgatta gcaca 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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actcaagttt acttaggagg tatgagct 28
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<213> Artificial Sequence
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ggtgtactcg cctatttgta ctttactgt 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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acctagacga ccacttaacc ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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acactatgcg atcagaaggg ta 22
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 113
attctacact gcagggacca cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 114
gtaatcgagc agggtcgcca at 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 115
tgatttgact gttgtcaatg ccaga 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cttttctgca agcagggtta cgt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tcacgcatca tgtttcatct gca 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aagagtcctg ttagattttc agcttg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
tgatagacac ctttatgaca agttgca 27
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 120
ggtaccaaca gcttgtctag tagc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 121
tgtttatcag ccgcgaagaa gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 122
atcacataca caacaggtgc gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
ggcacatgcc tttgagttga ca 22
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 124
gttgaacgtt tctacaagcc gc 22
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 125
tgttaagcgt cttgactgga ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 126
acaaactgcc agcatcacaa cc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 127
tcgatagata tgctgctaat tccattgt 28
<210> 128
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 128
agtcttgtaa aactgttcca gaggt 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gctggcttta gcatgtgggt tt 22
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 130
tgtcagtcat acaacaaaca ccaatagt 28
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 131
gggtgtggac actgctgcta at 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 132
tcaatttcga tttgactcct gggt 24
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 133
gttgtccaac agttacctga aacttact 28
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 134
caaccttaga atctacagat aaatcttggg 30
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 135
acaggttcat gtaagtgtgt gtgt 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 136
ctcctttatg agaaccagca cca 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 137
tgtcgcaaaa tatagtcaac tgtgtca 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 138
tctttatagc gacggaacct cca 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 139
acaaaagaaa acgactctaa agagggttt 29
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 140
tgaccttctt ttaaacacat aacagcag 28
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 141
acaaatcgaa ttcagttgtc ttcctattc 29
<210> 142
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 142
tggaaaagaa acgtaagaac aagtcct 27
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 143
acacgtggtc tttattaccc tgac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 144
actctgaact gactttccat ccaac 25
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 145
caattttgta atcatccatt tttgggtgt 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 146
caccagctgt gcaacctgaa ga 22
<210> 147
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 147
acatcactag ctttcaaact ttacttgc 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 148
gcaacacact tgctgattct cttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 149
agagtccaac gaacagaatc tattgt 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 150
accaccaacc ttacaatcaa gattgt 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 151
agggcaaact gcaaagattg ct 22
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 152
acacctgtgc ctcttaaacc at 22
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 153
ccagcaactg tttctggacc ta 22
<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 154
cagcccgtat taaacagcct gc 22
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 155
caacttagtc ctacttggcg tgt 23
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 156
tgtgtagaaa aactgccata ttgca 25
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 157
gtggtgattg aactgaatgc agc 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 158
catttgatct gtgagcaaag gtgg 24
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 159
ttgccttcgt gatattgctg ct 22
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 160
tggagctaac ttgtttaaca agcg 24
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 161
gcacttgcaa aacttcaaga tgtgg 25
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 162
gtgaagttct tttgttgtgc aggg 24
<210> 163
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gggctatcat gttatgtcct tccct 25
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgccagagat ctcacctaaa tcaa 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tcctttgcaa gctgaattag actca 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tttgactcgt ttgagcactg gc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgctgtagtt ctctcaaggg ct 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aggtgtgact aaactgttac aaacaac 27
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<213> Artificial Sequence
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actagcactg tccaagggtg tt 22
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<213> Artificial Sequence
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acacagtctt ttagtccaga ttccc 25
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<213> Artificial Sequence
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tcaggtgatc gcacaacaag tc 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgactagtag cgtgcctttg ta 22
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<213> Artificial Sequence
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actaggttgc attgttcaag gagc 24
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Claims (6)
1.一种新型冠状病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对叠瓦式PCR扩增引物序列依次为SEQ ID No.1-196。
2.一种试剂盒，其包含新型冠状病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对叠瓦式PCR扩增引物序列依次为SEQ ID No.1-196。
3.一种新型冠状病毒检测的测序片段捕获方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)RNA提取：将标本中的冠状病毒进行病毒RNA提取；
(2)引物设计与PCR扩增：使用针对SARS-CoV-2保守区域设计的98对扩增引物，所述引物序列依次为SEQ ID No.1-196，应用RT-PCR扩增体系，取步骤(1)提取的病毒RNA，进行快速扩增；
(3)测序：扩增反应结束后，将PCR反应中得到大小不同的冠状病毒基因片段，直接上机进行测序，所述的测序片段捕获方法为非疾病的诊断方法。
4.根据权利要求3所述的测序片段捕获方法，其特征在于，所述步骤(1)的RNA提取的最终体积为20-50ul。
5.根据权利要求3或4所述的测序片段捕获方法，其特征在于，所述步骤(1)的RNA提取后获得的病毒RNA为Ct值低于27的核酸样品。
6.权利要求1所述的序列组合在制备检测新型冠状病毒试剂盒中的用途。
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