CN105039323A - 一种人感染h7n9禽流感病毒全基因组序列及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列及其制备方法和用途，属于医学生物检测技术领域。本发明采用鸡胚分离H7N9禽流感病毒，提取标本和毒株病毒RNA，自行设计引物，通过一步法RT-PCR扩增其全基因组片段，纯化PCR产物后测定核苷酸序列，利用生物信息学软件拼接各节段序列并初步分析其特征。本发明的引物能特异地扩增各基因的目的片段，通过序列拼接可以获得H7N9禽流感全基因组序列。经分析8个节段序列与近期国内流行的人感染H7N9禽流感病毒序列高度同源。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是指一种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列及其制备方法和用途。
背景技术
2013年3月首先在我国上海、安徽发现人感染H7N9禽流感病例(GaoRB,CaoB,HuYW,etal.Humaninfectionwithanovelavian-origininfluenzaA(H7N9)virus[J].NEnglJMed,2013,368(20):1888-1897.DOI:10.1056/NEJMoa1304459.)，截止2015年1月31日，在我国16个省(直辖市)的246个县区累计发现552例人感染H7N9禽流感病例，死亡208例，病亡率高达37.7％，给我国农业经济和人民健康带来巨大影响。目前，病例仍呈散发状态，但个别地区呈现地理分布聚集性，且疫情有东南沿海向内陆更多地区发展的趋势。
为何人感染H7N9禽流感疫情在我国持续流行，其内在基因发生怎样的遗传变异和重组，需要我们去揭示更多的相关分子流行病学特征。为了更好的评估H7N9禽流感大流行的风险，有专家甚至联名呼吁应进行H7N9禽流感病毒功能获得性突变试验，进一步研究病毒宿主范围、毒力、传播途径、耐药性等(FouchierRA,KawaokaY,CardonaC,etal.Gain-of-functionExperimentsonH7N9[J].Science,2013,341(6146):612-613.DOI:10.1126/science.341.6146.612.)，然而所有这一切研究的基础就是获得病毒的全基因组序列，本次研究建立了人感染H7N9禽流感病毒8个节段全基因组扩增与测序方法，可为其分子生物学深入研究奠定基础。
人感染H7N9禽流感病毒是首次在人群中发现的新型禽流感病毒，其8个基因重组来源较为复杂，有研究表明其HA基因来源于鸭A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)禽流感病毒、NA基因来源于候鸟A/wildbird/Korea/A14/2011(H7N9)病毒、其余6个内部基因可能起源于2个不同群组的H9N2禽流感病毒(GaoRB,CaoB,HuYW,etal.Humaninfectionwithanovelavian-origininfluenzaA(H7N9)virus[J].NEnglJMed,2013,368(20):1888-1897.DOI:10.1056/NEJMoa1304459.FouchierRA,KawaokaY,CardonaC,etal.Gain-of-functionExperimentsonH7N9[J].Science,2013,341(6146):612-613.DOI:10.1126/science.341.6146.612.WengYH，ZhangYJ，XieJF，etal.ConfirmationoffirstcaseofhumaninfectionwithinfluenzaA(H7N9)virusinFujianProvince:laboratorydiagnosisandviralsequenceanalysis[J].ChinJZoonoses,2013,29(6)：543-546.(inChinese)翁育伟，张拥军，谢剑锋，等.福建省首例人感染H7N9禽流感病例实验室诊断和病毒序列分析[J].中国人兽共患病学报，2013,29(6)：543-546.LiuD,ShiWF,ShiY,etal.OriginanddiversityofnovelavianinfluenzaAH7N9virusescausinghumaninfection:phylogeneticstructural,andcoalescentanalyses[J].Lancet,2013,381(9881):1926-1932.DOI:10.1016/S0140-6736(13)60938-1.)。
目前H7N9禽流感病毒主要的基因突变如下：
(1)HA基因主要发生Q226L变异(以H3位点来计算)，从而使病毒获得与人上呼吸道上皮细胞SAα-2，6Gal受体结合的能力，使病毒更易感染到人。其中，经过本方法分析的H7N9禽流感毒株HA基因的受体位点结合出中还出现A134V的变异，亦是H7N9禽流感突破宿主屏障，感染至人的分子基础，该位点的变异是否在病毒中稳定存在并对流行产生影响，需进一步深入分析。从抗原性分析上来看，2013-2015年H7N9禽流感病毒未见明显改变，但值得注意的是，2014年12月以来的毒株均发生L177I变异，该位点突变的意义以及突变是否与本次新一轮流行有关，需进一步进行分析。本次分析的所有H7N9禽流感毒株的HA裂解位点中氨基酸序列均呈现为PEIPKGRG，即HA裂解位点中只含两个碱性氨基酸赖氨酸K与精氨酸R，未出现多个连续的碱性氨基酸，表现为低致病性。
(2)PB2基因中的相关位点在宿主特异性中也起到重要作用。当PB2含627K时，可在人体中有效进行病毒蛋白合成功能，而含627E会限制其合成。本次分析的毒株大部分均表现出E627K的变异，且有1株还出现D701N变异，这均提高了病毒在宿主中的合成与扩散。
(3)在所有毒株的M2蛋白中均有S31N变异，提示病毒均对离子通道抑制剂类药物(烷胺类药物)不敏感。通过对神经氨酸酶(NA)分析发现所有病毒均未出现E120G、R153K、H276Y、R294K这些重要酶作用位点的变异，且酶活性中心及周围相关位点也未发现变异，故病毒对神经氨酸酶抑制剂是敏感的
(4)通过该方法分析的H7N9毒株中还发现：HA基因的D225G突变、NA基因中缺失69-73位氨基酸、M1基因的N30D突变、PA基因的A36T突变、PB1基因的I368V突变、PB2的L89V突变和NS1的P42S突变，这些均提示了H7N9病毒有毒力增加的表现。
目前，为了探寻H7N9禽流感这一人间新发传染病的来龙去脉，许多学者都致力于基因特征研究，重点对其遗传性、抗原性、致病性、耐药性、毒力、传播力等特征(ZhangH,LiXY,GuoJ,etal.ThePB2E627KmutationcontributestothehighpolymeraseactivityandenhancedreplicationofH7N9influenzavirus[J].JGenVirol,2014(95):779–786.DOI:10.1099/vir.0.061721-0.SleemanK,GuoZ,BarnesJ,etal.R292KsubstitutionanddrugsusceptibilityofinfluenzaA(H7N9)viruses[J].EmergInfectDis,2013,19(9):1521-1524.DOI:10.3201/eid1909.130724.NeumannG,MackenCA,KawaokaY,etal.IdentiflcationofaminoacidchangesthatmayhavebeencriticalforthegenesisofA(H7N9)influenzaviruses[J].JVirol,2014,88(9):4877-4896.DOI:10.1128/JVI.00107-14.)进行深入分析，然而，要获得这些相关基因信息的基础就是需成功完成H7N9禽流感全基因组的扩增和测序。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便捷获得人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，人感染H7N9禽流感病毒全基因组全长包括8个基因节段，共计约13103个核苷酸。
以前已有禽流感H7的疫苗，但与此次流行的H7N9禽流感病毒不匹配，临床上评估H7N9疫苗代表株的安全性和免疫原性是必须的，这需要一个较长的过程。常规的疫苗研发均是用反向遗传技术对病毒重要免疫原性的基因片段进行重组，这势必要求我们首先获得H7N9禽流感病毒的全基因组序列，从而能为重组的疫苗生产奠定基础。
目前，针对人感染H7N9禽流感病毒的治疗主要依赖于神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦或扎那米韦等)，通过全基因组分析能较快的从基因特征中分析病毒的耐药特征，从而能为临床救治病例提供参考依据。
本发明的另一目的在于提供上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列扩增引物，所述扩增引物如SEQIDNO:1至SEQIDNO:44所示，共22个引物对。
其中22个引物对序列如下：
PB2-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCGAAAGCAGGTC(SEQIDNO:1)
PB2-R870CAGGAAACAGCTATGACCTCTCTGTACTATGGC(SEQIDNO:2)
PB2-F620TGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGAGAGAACTGGTTC(SEQIDNO:3)
PB2-R1811CAGGAAACAGCTATGACCCGCATCTGYTGGAATAG(SEQIDNO:4)
PB2-F1619TGTAAAACGACGGCCAGTATGGTCCGGAATCAGTG(SEQIDNO:5)
PB2-R2341CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGTCGTTT(SEQIDNO:6)
PB1-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCGAAAGCAGGCA(SEQIDNO:7)
PB1-R700CAGGAAACAGCTATGACCCTCTTTCAGCATC(SEQIDNO:8)
PB1-F604TGTAAAACGACGGCCAGTCAGAGAACAATAG(SEQIDNO:9)
PB1-R1784CAGGAAACAGCTATGACCCCTCCATCTGAAACCAA(SEQIDNO:10)
PB1-F1569TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCRTTGGTGTTAC(SEQIDNO:11)
PB1-R2340CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQIDNO:12)
PA-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCGAAAGCAGGTAC(SEQIDNO:13)
PA-R730CAGGAAACAGCTATGACCCCTCAATGCAGCC(SEQIDNO:14)
PA-F550TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAGGGGTCTAT(SEQIDNO:15)
PA-R1761CAGGAAACAGCTATGACCTTGRAGAAGGCAGCG(SEQIDNO:16)
PA-F1557TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTGTAAGTATGG(SEQIDNO:17)
PA-R2233CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQIDNO:18)
HA-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGG(SEQIDNO:19)
HA-R754CAGGAAACAGCTATGACCACTGTATCATTGGG(SEQIDNO:20)
HA-F633TGTAAAACGACGGCCAGTGACAGTTGGGAGTTC(SEQIDNO:21)
HA-R1721CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQIDNO:22)
HA-F1091TGTAAAACGACGGCCAGTGACACCAGAATGCAC(SEQIDNO:23)
HA-R1721CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQIDNO:24)
NP-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGTA(SEQIDNO:25)
NP-R619CAGGAAACAGCTATGACCAGAAATTCCGGTC(SEQIDNO:26)
NP-F387TGTAAAACGACGGCCAGTAACTGCTGGTCTTAC(SEQIDNO:27)
NP-R1377CAGGAAACAGCTATGACCCTGGAATGACAC(SEQIDNO:28)
NP-F988TGTAAAACGACGGCCAGTTGGATGGCATGCCAC(SEQIDNO:29)
NP-R1565CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTATTTTT(SEQIDNO:30)
NA-F1TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGAGTGAAAA(SEQIDNO:31)
NA-R480CAGGAAACAGCTATGACCTGATAGTGGCCAGC(SEQIDNO:32)
NA-F257TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTCTGTACTATAAATTC(SEQIDNO:33)
NA-R1286CAGGAAACAGCTATGACCTTGGGTCTTCCACG(SEQIDNO:34)
NA-F902TGTAAAACGACGGCCAGTAGATAGACCCAGTAGC(SEQIDNO:35)
NA-R1431CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT(SEQIDNO:36)
M-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGTAG(SEQIDNO:37)
M-R638CAGGAAACAGCTATGACCACCATTTGCCTAGC(SEQIDNO:38)
M-F365TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTACTCAACTGG(SEQIDNO:39)
M-R1027CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQIDNO:40)
NS-F0TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGTG(SEQIDNO:41)
NS-R607CAGGAAACAGCTATGACCAAGCGAATCTCTG(SEQIDNO:42)
NS-F439TGTAAAACGACGGCCAGTCTTAGAGCTTTTAC(SEQIDNO:43)
NS-R860CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQIDNO:44).
本发明又一目的在于提供一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，引物合成如SEQIDNO:1至SEQIDNO:44所示，针对所示引物将病毒基因组序列分为8个基因节段；利用SEQIDNo.1至SEQIDNo.44所示引物分别对分段基因序列进行目的基因的PCR扩增；目的基因片段的回收，测序；对所测定的序列利用生物软件对各段序列重叠部分的比对作用进行序列拼接，PB2基因对应的为SEQIDNO:1-6引物扩增的片段、PB1基因对应的为SEQIDNO:7-12引物扩增的片段、PA基因对应的为SEQIDNO:13-18引物扩增的片段、HA基因对应的为SEQIDNO:19-24引物扩增的片段、NP基因对应的为SEQIDNO:25-30引物扩增的片段、NA基因对应的为SEQIDNO:31-36引物扩增的片段、M基因对应的为SEQIDNO:37-40引物扩增的片段、NS基因对应的为SEQIDNO:41-44引物扩增的片段，8个基因节段分别扩增了2-3个片段，将8个节段分别扩增的相应片段进行首尾相接，最终得到人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列。
上述病毒基因组序列分段为：根据SEQIDNo.1至SEQIDNo.44所示引物将病毒8个节段通过RT-PCR方法扩增出22个片段，每片段不超过1.3kb。
上述PCR扩增反应体系为：5×RT-PCR缓冲液10μL、dNTPs(10mM)2μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、RT-PCR混合酶2μL、RNase-freeH2O28μL、RNA模板4μL。反应条件为：60℃1min、42℃10min、50℃30min、95℃15min、(94℃30sec、55℃30sec、72℃90sec)30个循环、72℃10min、4℃保温。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳来初步鉴定扩增目的条带。
上述目的基因片段的回收，测序的具体步骤为：用1％琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带扩增产物，具体方法参照QIAGEN胶回收试剂盒，回收后的DNA用去离子水洗脱并测定浓度，各取10ngDNA，参照BigDyeTerminatorv3.1试剂盒说明，用M13正反向测序引物进行双向测序。
上述对测定的序列进行拼接的具体步骤为：用DNAStar和MEGA5.1软件进行序列拼接和分析；打开DNAstar软件中的SeqMan程序，按8个节段扩增的相应片段分别导入序列，运行“Assemble”即可分别获得8个节段的全长基因序列。将完整的8个节段序列和GenBank下载参考序列的整理成文本格式，分别对应地导入MEGA程序中，即可构建基因进化树和进行氨基酸分析。
一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其具体步骤如下：
A.病毒分离与鉴定
在BSL-3实验室采用9-10日龄SPF鸡胚羊膜腔和尿囊腔接种200μL标本，每份标本接种3个鸡胚，35℃培养72小时，4℃过夜，收获羊水和尿液(24小时内死亡的鸡胚弃之)；用1％火鸡红细胞悬液做红细胞凝集试验(HA)来鉴定病毒是否分离成功，阴性标本则再继续盲传一代；毒株于-80℃保存。
B.病毒核酸提取
在BSL-3实验室生物安全柜中进行病毒裂解，病毒RNA提取步骤按QIAampviralRNAminikit说明书进行。
C.病毒全基因组扩增
按照QIAGEN公司一步法试剂盒说明配制RT-PCR反应体系：5×RT-PCR缓冲液10μL、dNTPs(10mM)2μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、RT-PCR混合酶2μL、RNase-freeH2O28μL、RNA模板4μL。反应条件为：60℃1min、42℃10min、50℃30min、95℃15min、(94℃30sec、55℃30sec、72℃90sec)30个循环、72℃10min、4℃保温。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳来初步鉴定扩增目的条带。
D.DNA产物回收与测序
用1％琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带扩增产物，具体方法参照QIAGEN胶回收试剂盒，回收后的DNA用去离子水洗脱并测定浓度，各取10ngDNA，参照BigDyeTerminatorv3.1试剂盒说明，用M13正反向测序引物进行双向测序。
E.全基因序列拼接与确定
用DNAStar和MEGA5.1软件进行序列拼接和分析；(PB2基因对应的为SEQIDNO:1-6引物扩增的片段、PB1基因对应的为SEQIDNO:7-12引物扩增的片段、PA基因对应的为SEQIDNO:13-18引物扩增的片段、HA基因对应的为SEQIDNO:19-24引物扩增的片段、NP基因对应的为SEQIDNO:25-30引物扩增的片段、NA基因对应的为SEQIDNO:31-36引物扩增的片段、M基因对应的为SEQIDNO:37-40引物扩增的片段、NS基因对应的为SEQIDNO:41-44引物扩增的片段)8个基因节段分别扩增了2-3个片段，将对应的片段通过DNAstar软件进行拼接，即可获得8个节段全基因组序列。将拼接好的8个节段全基因组序列在GenBank中做BLAST比对，以确认扩增的H7N9禽流感病毒全基因组序列；从GenBank和GISAID下载相关序列，采用邻位相临法(NJ)初步绘制基因进化树。
采用本发明的引物序列和全基因合成方法，本发明获得了多种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列，具体如下：
A/Fujian/1/2013如SEQIDNO:53所示；
A/Fujian/13/2014如SEQIDNO:62所示；
A/Fujian/28/2015如SEQIDNO:71所示。
本发明的又一目的在于提供上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列在检测人感染H7N9禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用，所述的基因组序列扩增引物如SEQIDNO:1至SEQIDNO:44所示。
所述试剂盒包括RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒和DNA测序试剂盒。
有益效果
本次研究对全基因组扩增引物进行优化，通过统一条件的一步法RT-PCR就实现了对全基因相应片段的扩增，并且在每条正反向引物中分别带入M13正反向测序引物，能立即完成测序和拼接的后续工作，较为省时省力的获得H7N9禽流感病毒全基因组序列。该实验方法可为分析人感染H7N9禽流感病毒基因特征，探讨病毒基因重配进化的途径和规律，溯源人感染禽流感病毒奠定基础，亦可为评估人感染禽流感风险和防控疫情提供科学依据。
附图说明
图1为人感染H7N9禽流感病毒全基因组RT-PCR扩增电泳图谱；
图2为H7N9禽流感病毒测序图谱。
图3为人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因进化树；其中A：血凝素(HA)；B：神经氨酸酶(NA)；●咽拭子标本、▲毒株。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的制备
1材料和方法
1.1材料
1.1.1标本采集病例发病第3天的咽拭子标本，置于4mL标本保存液中(DMEM培养液，含0.5％牛血清白蛋白组分V和50mg/mL庆大霉素)，低温运送至实验室，本次研究所用标本编号为UP1426。
1.1.2毒株各地市送检复核人感染H7N9禽流感标本，经鸡胚分离获得毒株，保存于-80℃，本次实验研究所用毒株编号为A/Fujian/10/2015、A/Fujian/16/2015、A/Fujian/18/2015和A/Fujian/22/2015。
1.1.3主要试剂9-10日龄SPF鸡胚购自福州生物制药厂；1％火鸡红细胞由本科室制备；病毒RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；DNA测序试剂盒购自lifetechnologies公司；DNAmarker购至TAKARA公司。
1.1.4主要仪器Bio-RadPCR仪和电泳仪；ABI3500测序仪。
1.1.5引物从GenBank和GISAID(GlobalInitiativeonSharingAllInfluenzaData)数据库中检索以及国家流感中心提供的H7N9禽流感病毒全基因序列，利用Primer软件设计并优化H7N9禽流感病毒8个节段全基因组扩增引物，并在引物5’端加上M13通用测序引物。扩增引物见表1。
表1H7N9禽流感病毒全基因组扩增引物
1.2方法
1.2.1病毒分离与鉴定在BSL-3实验室采用9-10日龄SPF鸡胚羊膜腔和尿囊腔接种200μL标本，每份标本接种3个鸡胚，35℃培养72小时，4℃过夜，收获羊水和尿液(24小时内死亡的鸡胚弃之)；用1％火鸡红细胞悬液做红细胞凝集试验(HA)来鉴定病毒是否分离成功，阴性标本则再继续盲传一代；毒株于-80℃保存。
1.2.2病毒核酸提取在BSL-3实验室生物安全柜中进行病毒裂解，病毒RNA提取步骤按QIAampviralRNAminikit说明书进行。
1.2.3病毒全基因组扩增按照QIAGEN公司一步法试剂盒说明配制RT-PCR反应体系：5×RT-PCRBuffer10μL、dNTPs(10mMeach)2μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、RT-PCR混合酶2μL、RNase-freeH2O28μL、RNA模板4μL。反应条件为：60℃1min、42℃10min、50℃30min、95℃15min、(94℃30sec、55℃30sec、72℃90sec)30个循环、72℃10min、4℃保温。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳来初步鉴定扩增目的条带。
1.2.4DNA产物回收与测序用1％琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带扩增产物，具体方法参照QIAGEN胶回收试剂盒，回收后的DNA用去离子水洗脱并测定浓度，各取10ngDNA，参照BigDyeTerminatorv3.1试剂盒说明(WengYH，ZhangYJ，XieJF，etal.ConfirmationoffirstcaseofhumaninfectionwithinfluenzaA(H7N9)virusinFujianProvince:laboratorydiagnosisandviralsequenceanalysis[J].ChinJZoonoses,2013,29(6)：543-546.(inChinese)翁育伟，张拥军，谢剑锋，等.福建省首例人感染H7N9禽流感病例实验室诊断和病毒序列分析[J].中国人兽共患病学报，2013,29(6)：543-546.)，用M13正反向测序引物进行双向测序。
1.2.5全基因序列拼接与确定用DNAStar和MEGA5.1软件进行序列拼接和分析；将拼接好的8个节段全基因组序列在GenBank中做BLAST比对，以确认扩增的H7N9禽流感病毒全基因组序列；从GenBank和GISAID下载相关序列，采用邻位相临法(NJ)初步绘制基因进化树。
2结果
2.1全基因组扩增应用本实验室自行设计的22对扩增引物能很好地扩增人感染H7N9禽流感病毒标本和分离毒株的全基因序列，22个DNA扩增产物片段大小与预期片段大小相符(见图1)。
M：100bpMarker；1：PB2-1；2：PB2-2；3：PB2-3；4：PB1-1；5：PB1-2；6：PB1-3；7：PA-1；8：PA-2；9：PA-3；10：HA-1；11：HA-2；12：HA-3；13：NP-1；14：NP-2；15：NP-3；16：NA-1；17：NA-2；18：NA-3；19：M-1；20：M-2；21：NS-2；22：NS-1
2.2全基因组序列测定、拼接与确定通过M13通用测序引物均能很好的对上述各片段进行测序(见图2)；对上述片段序列进行拼接校正后获得8个节段完整的编码序列(PB2：2280bp；PB1：2274bp；PA：2151bp；HA：1683bp；NP：1497bp；NA：1398bp；M：982bp；NS：838bp)，序列经BLAST比对后，均提示为人感染H7N9禽流感病毒基因；采用DNAStar软件进行同源性分析发现，8个节段序列与A/Anhui/1/2015(H7N9)相比，同源性在97.1％以上。
2.3基因进化分析从数据库中下载相关序列，用系统进化树分析表明，所测的HA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)病毒的H7基因高度同源，NA基因与A/wildbird/Korea/A14/2011(H7N9)基因高度同源(见图3)。
上述方法得到的全基因序列如下所述：
A/Fujian/1/2013：
PB2如SEQIDNO:45序列所示；
PB1如SEQIDNO:46序列所示；
PA如SEQIDNO:47序列所示；
HA如SEQIDNO:48序列所示；
NP如SEQIDNO:49序列所示；
NA如SEQIDNO:50序列所示；
M如SEQIDNO:51序列所示；
NS如SEQIDNO:52序列所示；
A/Fujian/1/2013的全基因序列如SEQIDNO:53所示。
A/Fujian/13/2014：
PB2如SEQIDNO:54序列所示；
PB1如SEQIDNO:55序列所示；
PA如SEQIDNO:56序列所示；
HA如SEQIDNO:57序列所示；
NP如SEQIDNO:58序列所示；
NA如SEQIDNO:59序列所示；
M如SEQIDNO:60序列所示；
NS如SEQIDNO:61序列所示
A/Fujian/13/2014的全基因序列如SEQIDNO:62所示。
A/Fujian/28/2015
PB2如SEQIDNO:63序列所示；
PB1如SEQIDNO:64序列所示；
PA如SEQIDNO:65序列所示；
HA如SEQIDNO:66序列所示；
NP如SEQIDNO:67序列所示；
NA如SEQIDNO:68序列所示；
M如SEQIDNO:69序列所示
NS如SEQIDNO:70序列所示；
A/Fujian/28/2015的全基因序列如SEQIDNO:71所示。
通过本方法一共获得49株人感染H7N9禽流感病毒的全基因组序列，其中2013年5株、2014年19株、2015年25株，分别为：A/Fujian/1/2013、A/Fujian/2/2013、A/Fujian/3/2013、A/Fujian/4/2013、A/Fujian/5/2013、A/Fujian/1/2014、A/Fujian/2/2014、A/Fujian/3/2014、A/Fujian/5/2014、A/Fujian/6/2014、A/Fujian/7/2014、A/Fujian/8/2014、A/Fujian/9/2014、A/Fujian/11/2014、A/Fujian/12/2014、A/Fujian/13/2014、A/Fujian/14/2014、A/Fujian/15/2014、A/Fujian/16/2014、A/Fujian/17/2014、A/Fujian/19/2014、A/Fujian/20/2014、A/Fujian/21/2014、A/Fujian/22/2014、A/Fujian/1/2015、A/Fujian/2/2015、A/Fujian/3/2015、A/Fujian/4/2015、A/Fujian/5/2015、A/Fujian/6/2015、A/Fujian/7/2015、A/Fujian/8/2015、A/Fujian/9/2015、A/Fujian/10/2015、A/Fujian/11/2015、A/Fujian/14/2015、A/Fujian/16/2015、A/Fujian/17/2015、A/Fujian/18/2015、A/Fujian/19/2015、A/Fujian/20/2015、A/Fujian/21/2015、A/Fujian/22/2015、A/Fujian/23/2015、A/Fujian/24/2015、A/Fujian/25/2015、A/Fujian/27/2015、A/Fujian/28/2015、A/Fujian/09273/2015。
3讨论
本次研究的病毒标本或毒株均获得22个DNA扩增预期片段，拼接相应片段获得了人感染H7N9禽流感病毒全基因8个节段序列，通过BLAST比对和基因进化树初步分析发现，与上述学者研究结果大致相当，进一步核实了获得的基因序列，故可以确定该方法可以成功地获得H7N9禽流感病毒全基因组序列。
本次研究对全基因组扩增引物进行优化，通过统一条件的一步法RT-PCR就实现了对全基因相应片段的扩增，在测序和拼接后，较为省时省力的获得H7N9禽流感病毒全基因组序列。该实验方法可为分析人感染H7N9禽流感病毒基因特征，探讨病毒基因重配进化的途径和规律，溯源人感染禽流感病毒奠定基础，亦可为评估人感染禽流感风险和防控疫情提供科学依据。
应用前景：人感染H7N9禽流感为何会发生，病毒将何去何从，其传染性、感染性和致病性将发生怎样的变化，是否进一步演变而导致新发或再发，不得而知。病毒进化在新发和再发传染性疾病中是一个非常重要的相关因素，通过依赖型突变改变细胞嗜性和宿主范围，在一个新的宿主细胞群中产生适应性突变，从而导致相关疾病新发或再发。通过动态对H7N9禽流感病毒8个基因组的全基因分析，可以深入了解病毒的遗传性、抗原性、传染性、耐药性、致病性等变化特征，进一步分析内部基因的协同作用，探索H7N9禽流感病毒基因变异、重配和进化的途径和规律，为疾病防控、疫苗筛选和临床诊治病例提供科学依据。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (12)
1.人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列扩增引物，其特征在于，所述扩增引物由SEQIDNO:1至SEQIDNO:44组合而成。
2.一种制备人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的引物对人感染H7N9禽流感病毒进行目的基因的PCR扩增；目的基因片段的回收，测序；对所测定的序列利用生物软件对各段序列重叠部分的比对作用进行序列拼接，将分别扩增的相应片段进行首尾相接，最终得到人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列。
3.根据权利要求2所述的一种制备人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，人感染H7N9禽流感病毒分8个节段合成，8个节段及其所合成的引物如下：PB2基因对应的为SEQIDNO:1-6引物扩增的片段、PB1基因对应的为SEQIDNO:7-12引物扩增的片段、PA基因对应的为SEQIDNO:13-18引物扩增的片段、HA基因对应的为SEQIDNO:19-24引物扩增的片段、NP基因对应的为SEQIDNO:25-30引物扩增的片段、NA基因对应的为SEQIDNO:31-36引物扩增的片段、M基因对应的为SEQIDNO:37-40引物扩增的片段、NS基因对应的为SEQIDNO:41-44引物扩增的片段，8个基因节段分别扩增了2-3个片段。
4.根据权利要求3所述的一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，根据SEQIDNo.1至SEQIDNo.44所示引物将病毒8个节段通过RT-PCR方法扩增出22个片段，每片段不超过1.3kb。
5.根据权利要求2所述的一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：5×RT-PCR缓冲液10μL、10mM的dNTPs2μL、10μM的正向引物2μL、10μM反向引物2μL、RT-PCR混合酶2μL、RNase-freeH2O28μL、RNA模板4μL；反应条件为：60℃1min、42℃10min、50℃30min、95℃15mi，94℃30sec、55℃30sec、72℃90sec，30个循环、72℃10min、4℃保温；取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳来初步鉴定扩增目的条带。
6.据权利要求2所述的一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，目的基因片段的回收，测序的具体步骤为：用1％琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带扩增产物，具体方法参照QIAGEN胶回收试剂盒，回收后的DNA用去离子水洗脱并测定浓度，各取10ngDNA，参照BigDyeTerminatorv3.1试剂盒说明，用M13正反向测序引物进行双向测序。
7.据权利要求2所述的一种制备上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方法，其特征在于，其具体步骤如下：
A.病毒分离与鉴定
在BSL-3实验室采用9-10日龄SPF鸡胚羊膜腔和尿囊腔接种200μL标本，每份标本接种3个鸡胚，35℃培养72小时，4℃过夜，收获羊水和尿液，24小时内死亡的鸡胚弃之；用1％火鸡红细胞悬液做红细胞凝集试验来鉴定病毒是否分离成功，阴性标本则再继续盲传一代；毒株于-80℃保存；
B.病毒核酸提取
在BSL-3实验室生物安全柜中进行病毒裂解，病毒RNA提取步骤按QIAampviralRNAminikit说明书进行；
C.病毒全基因组扩增
按照QIAGEN公司一步法试剂盒说明配制RT-PCR反应体系：5×RT-PCR缓冲液10μL、10mM的dNTPs2μL、10μM的正向引物2μL、10μM的反向引物2μL、RT-PCR混合酶2μL、RNase-freeH2O28μL、RNA模板4μL。反应条件为：60℃1min、42℃10min、50℃30min、95℃15min，94℃30sec、55℃30sec、72℃90sec，30个循环、72℃10min、4℃保温；取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳来初步鉴定扩增目的条带；
D.DNA产物回收与测序
用1％琼脂糖凝胶电泳回收各目的条带扩增产物，具体方法参照QIAGEN胶回收试剂盒，回收后的DNA用去离子水洗脱并测定浓度，各取10ngDNA，参照BigDyeTerminatorv3.1试剂盒说明，用M13正反向测序引物进行双向测序；
E.全基因序列拼接与确定
用DNAStar和MEGA5.1软件进行序列拼接和分析；PB2基因对应的为SEQIDNO:1-6引物扩增的片段、PB1基因对应的为SEQIDNO:7-12引物扩增的片段、PA基因对应的为SEQIDNO:13-18引物扩增的片段、HA基因对应的为SEQIDNO:19-24引物扩增的片段、NP基因对应的为SEQIDNO:25-30引物扩增的片段、NA基因对应的为SEQIDNO:31-36引物扩增的片段、M基因对应的为SEQIDNO:37-40引物扩增的片段、NS基因对应的为SEQIDNO:41-44引物扩增的片段，8个基因节段分别扩增了2-3个片段，将对应的片段通过DNAstar软件进行拼接，即可获得8个节段全基因组序列。将拼接好的8个节段全基因组序列在GenBank中做BLAST比对，以确认扩增的H7N9禽流感病毒全基因组序列；从GenBank和GISAID下载相关序列，采用邻位相临法初步绘制基因进化树。
8.人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列扩增引物在检测人感染H7N9禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用，所述的基因组序列扩增引物如SEQIDNO:1至SEQIDNO:44所示。
9.根据权利要求8所述的人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列扩增引物在检测人感染H7N9禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒和DNA测序试剂盒。
10.一种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO:53所示。
11.一种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO:62所示。
12.一种人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO:71所示。
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