CN104711278A - 含h7n9病毒ha基因的重组序列、重组杆状病毒及该病毒在疫苗制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含H7N9病毒HA基因的重组序列、重组杆状病毒及该病毒在疫苗制备中的应用。重组序列SP-HA-TM包括编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因、gp64信号肽序列及跨膜区序列，其中gp64信号肽序列连接于HA蛋白基因的5’端、gp64跨膜区序列序列连接于HA蛋白基因的3’端。重组杆状病毒Bm-gp64-HA由重组核苷酸序列SP-HA-TM插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该病毒经纯化后去热源制成疫苗用于人体免疫接种，预防禽流感在人群中感染。

Description

含H7N9病毒HA基因的重组序列、重组杆状病毒及该病毒在疫苗制备中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列，该重组核苷酸序列编码的氨基酸序列，利用该重组核苷酸序列构建的家蚕重组杆状病毒，该家蚕重组杆状病毒的制备方法，以及该家蚕重组杆状病毒在H7N9流感疫苗制备中的应用。 

背景技术

H7N9型流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，是全球首次发现的新亚型流感病毒。 

对于病毒性疾病，最好的预防方法是接种疫苗。由于减毒活疫苗研制周期长，目前国际上广泛使用的流感疫苗为纯化的多价灭活疫苗。流感病毒灭活疫苗，共有三种类型，即全毒粒疫苗，裂解疫苗与毒粒亚单位疫苗。全毒粒疫苗使用最早，据Francis.T报导，1943年，美国的临床试验表明，全毒粒灭活疫苗的保护率可达70%，1945年，美国首次批准这种流感灭活疫苗投放市场。这种早期的粗制疫苗，是用含流感病毒粒子的鸡胚尿囊液，经有限的纯化后用甲醛灭活而成的。在本世纪60年代，由于超速离心与层析等技术的发展，使病毒粒子的纯化程度进一步提高。流感病毒粒子的双层脂膜上具有刺状突起，这就是血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA），全毒粒疫苗含有来自病毒包膜上的类脂质，接种后局部反应及高热的发生率较高，儿童在使用时常常会出现不良反应，所以，全病毒粒子疫苗主要用于成人。 

以后，纯化的全毒粒疫苗进一步改良成为裂解的纯化疫苗，它用裂解剂如乙醚，SDS，Triton X-100等将病毒的结构蛋白如基质蛋白等释放出来，並部分溶解表面糖蛋白，所以这类疫苗既含有内部抗原也含有外部抗原，可以全面刺激抗体产生，而且由于去除了类脂质等反应原，不良反应就大大减少了。这种裂解疫苗一直到现在仍在广泛地使用着。目前欧洲,美国，日本等地使用的主要就是裂解疫苗。此外我国使用的法国梅里厄公司的凡而灵疫苗，以及卫生部上海生物制品研究所从日本大阪大学微生物研究所引进，2001年获得生产文号的流感疫苗也均为裂解疫苗。 

20世纪70-80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出毒粒亚单位疫苗，它只含表面抗原，没有内部抗原与类脂质，接种后的不良反应进一步减少，但免疫原性远不如全毒 粒疫苗，也不如裂解疫苗。 

匹兹堡大学医学中心的禽流感疫苗研究小组，在2006年2月出版的《病毒学》杂志发表文章指出，他们研制的一种禽流感疫苗在老鼠和鸡身上进行了动物实验，有效率达百分之百。科学家根据H5N1病毒的基因序列数据，人工生成了一种带有红血球凝聚素的DNA，然后把这些DNA片断附着在能引起人类感冒的病毒上，就制成了禽流感疫苗。实验显示，注射了这种疫苗后，动物体内不仅产生了对流感病毒的抗体，还形成了一种可以抗击多种病毒的免疫细胞，这种免疫细胞会随着外界病毒的变异而变化，从而继续发挥作用。目前，这一研究成果正在等待美国食品药品管理局的批准，一旦获准，疫苗将在8月份进入临床实验阶段。NIH正在和赛诺菲巴斯德和凯龙等疫苗公司合作，赛诺菲巴斯德公司的疫苗研发工作进行得最为深入。最近研究者们在452名健康的成年人中对赛诺菲巴斯德公司生产的H5N1疫苗进行了测试，并得出了结论。该疫苗产生了很强的免疫反应，但需要90μg的疫苗量，而普通的三价流感疫苗则只需要45μg。另外，由于人类从未接触过H5N1病毒，因此在首次免疫一个月后需要进行加强免疫，这样总共需要180μg的量。凯龙公司同样也在研发H5N1的疫苗，对此疫苗初步的测试中添加了公司的专利佐剂MF59。英国牛津PowderMed有限公司开发出一种基于DNA的禽流感疫苗，并声称可以快速、大批量的进行生产。预计直到今年年中，才会对疫苗进行早期临床试验，目前的事实是，尽管有不少公司宣布研制了禽流感疫苗，但它们都还在临床前研究或者最初的临床研究中，还没有真正能向市场推广的禽流感疫苗。 

尽管灭活苗在流感的预防方面取得了较好的效果，但在用鸡胚制备疫苗的过程中存在的安全隐患也是显而易见的。今天，成千上万的重组蛋白已经成功利用昆虫杆状病毒载体得到表达。昆虫杆状病毒载体表达系统，是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统之后建立起来的，始于本世纪80年代初。它采用一个或多个杆状病毒基因启动子，其中最常用的是多角体蛋白基因启动子和P10蛋白基因启动子，将外源目的基因插入到启动子后，获得重组病毒，这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时，使外源基因得到表达。整个系统由转移载体、杆状病毒载体和宿主（细胞或虫体）组成。重组杆状病毒的构建过程大致可分为三步：将目的基因插入到转移载体多克隆位点中，在大肠杆菌中扩增，转移载体带有多角体或者P10蛋白启动子及用于同源重组的杆状病毒多角体或者P10蛋白基因两端的侧翼序列；通过细胞内同源重组将目的基因转移到杆状病毒基因组的多角体或者P10蛋白基因部位，取代多角体或者P10蛋白基因；筛选重组病毒并在昆虫培养细胞或虫体内扩增与表达。 

目前，已经得到广泛应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有两类：AcNPV和BmNPV 载体表达系统。NPV的多角体蛋白（polyhedrin）基因和p10基因是病毒感染晚期高效表达的基因，其缺失对病毒的复制增殖毫无影响，因而可以作为外源基因理想的插入位点。而且多角体蛋白基因被外源基因取代后，不形成多角体，在光学显微镜下很容易与形成多角体的野生病毒相区别，这些特征使得NPV特别适合于表达外源基因。这一构想由Miller于1981年提出，并由Summers和Smith于1983年首次实现。他们利用AcNPV的多角体蛋白基因构建了一个转移载体，并将β-干扰素基因克隆到上面，和野生型AcNPV DNA共转染秋粘虫培养细胞Sf-9，实现了β-干扰素的高效表达。1985年Maeda等用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）作表达载体，在家蚕体内也高水平地表达出人α-干扰素。此后各种来源不同的外源基因在杆状病毒载体表达系统中得到高效表达。 

由于桑蚕是具有我国特色的经济资源，因而本申请人着重研究与之相关的BmNPV。1992年，本申请人首次克隆出了BmNPV P10基因，发现该基因和AcNPV P10具有较高同源性；利用BmNPV P10基因，本申请人第一次成功构建了杆状病毒的非融合通用转移载体，使得同一载体在不同宿主细胞中表达外源基因成为可能；另外，本申请人利用家蚕核多角体病毒镇江株的多角体蛋白启动子首次构建了适应于我国家蚕品种的BmNPV表达系统，并成功表达β-半乳糖甘酶，产量高达580μg/蚕，这些都为构建高质量的BmNPV载体表达系统的打下了的基础。 

现在，通过筛选获得重组病毒的几率已从最初的0.1%～1%提高到现在的100%，并且出现了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体表达系统。我们利用BmNPV解螺旋基因DNA与BacPAK6 DNA在昆虫细胞中同源重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕细胞又可感染秋粘虫细胞Sf-21的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因的转移载体Pvl1393 phy在家蚕细胞中的重组率达90%以上。 

对于昆虫杆状病毒载体系统的改进主要有两个方面：一是亲本病毒的线型化，另一是杆状病毒穿梭载体的构建。亲本病毒的线型化大大提高重组病毒筛选效率，如BacPAK6，Baculo Gold和Bac-N-Blue系统都是线性化后作为亲本病毒，其重组效率可达95％左右。另外，重组拯救可线性化技术的出现大大提高了重组病毒载体的筛出率，Possee等设计的重组-救活可线性化AcNPV病毒载体AcBacPAK6的重组效率较高，高达80%以上；我们利用BmNPV DNA与BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞，通过细胞内同源重组筛选到重组-救活可线性化病毒载体BmBacPAK，该系统将重组病毒筛出率提高到100％，具有重要的应用价值。 

为了提高病毒重组效率，研究者们也开发出原核和真核细胞杆状病毒穿梭载体以及转座子介导的位点特异性重组载体。杆状病毒基因组被改造成一个能在大肠杆菌中增殖 的复制子，如Luckow等构建的杆状病毒基因组像一个巨型质粒一样能在大肠杆菌中复制，被称为Bacmid。Bacmid含可在大肠杆菌中复制的F因子复制子、卡那霉素抗性基因和转座接触位点att Tn7，这种方法可得到100%的阳性重组病毒。 

在昆虫杆状病毒表达系统宿主方面，除昆虫幼虫外，还出现了高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系，如秋粘虫细胞系sf-9和sf-21，家蚕细胞系BmN和来自甘蓝尺蠖的BTITN5 B1-4。本申请人以家蚕细胞系BmN为选育对象，经过多轮选育，获得悬浮性能较好的BmN-ZJ-S细胞株；以蓖麻蚕血细胞为材料,建立了两株细胞系,即Pcr-S1和Pcr-S2。 

现今，除了家蚕外，家蚕蛹也开始作为杆状病毒表达系统的宿主得到利用，虫蛹作为表达宿主具有不用饲养和管理，可进行自动化操作等优点。VanHook等利用幼虫-蛹变态期的甘蓝银纹夜蛾为宿主成功表达了环氧化物酶。本申请人则首次应用家蚕蛹作为宿主利用家蚕杆状病毒表达系统成功的表达了几十种具有生物活性的功能蛋白，并且大规模表达并纯化了人GM-CSF。随着昆虫杆状病毒载体表达系统的发展，以昆虫虫体为表达宿主将会变得越来越有魅力。 

总的来说，昆虫杆状病毒载体表达系统在转移载体、病毒载体和宿主（细胞和虫体）三个方面都得到了极大的发展，已经成为重组蛋白常规表达最广泛使用的系统之一。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有疫苗的不足，提供一种安全、有效的H7N9基因工程疫苗。本发明提供一种含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列，将该重组核苷酸序列重组于杆状病毒基因组中，经表达并展示于杆状病毒表面，获得新型重组病毒，用家蚕生物反应器大规模繁殖表面带有HA蛋白的重组囊膜病毒，经纯化后去热源制成疫苗用于人体免疫接种，预防禽流感在人群中感染。 

本发明所采用的技术方案为： 

本发明通过对H7N9型流感病毒HA蛋白基因的生物信息学分析，获得编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因的全长序列，并在其5’端连接gp64基因的信号肽序列、3’端连接gp64基因的跨膜区序列，得到含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列SP-HA-TM，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

上述含H7N9流感病毒HA蛋白基因编码的重组蛋白，由H7N9流感病毒HA蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP、C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。 

本发明进一步提供利用上述含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列构建 的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA，该病毒由重组核苷酸序列SP-HA-TM插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。 

穿梭载体Bacmid（即Baculovirusplasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。 

作为优选，所述供体质粒为pFastBac 1载体，所述重组核苷酸序列SP-HA-TM插入pFastBac 1的Pph启动子下。 

载体pFastBac 1是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBac 1已经商品化。 

作为优选，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 

上述家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA的制备方法，包括以下步骤： 

（1）通过PCR扩增的方法得到SP-HA-TM基因序列，然后将SP-HA-TM基因序列连接到载体pFastBac 1的Pph启动子下，构建重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA； 

（2）将重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40～48h后挑取白斑，白斑继续培养24～48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定； 

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示H7N9流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA。 

本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA在H7N9流感疫苗制备中的应用。 

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果： 

（1）本发明将H7N9流感病毒HA蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64基因融合，家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64含有两个高度疏水区：N-末端的分泌性信号肽（SP）和C-末端的跨膜结构域(TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿主细胞膜内的糖蛋白连接在一起，从而使本发明实现了目的蛋白在病毒衣壳上的表面展示。 

（2）本发明构建的表面展示H7N9流感病毒HA蛋白的重组杆状病毒，可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应 用价值的H7N9流感病毒HA蛋白，其可以制备疫苗，也可以直接用重组病毒制备疫苗，适用于大规模生产，可降低成本，提高产量，所生产的H7N9疫苗应用价值大。 

（3）目前H7N9流感疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产。家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能。HA蛋白的免疫原性与其正确构型有关，利用真核表达可以具备较好的免疫原性。 

附图说明

图1所示的是SP-HA-TM基因PCR扩增产物的电泳鉴定图，其中M：10kb DNA分子量标准；1：SP-HA-TM基因PCR扩增产物，箭头位置为目的序列，大小为1896 bp。 

图2所示的是载体pFastBac 1的结构示意图。 

图3所示的是含有gp64-HA序列的重组转座质粒pFstBac 1-gp64-HA构建示意图，其中Pph：多角体启动子；SP：gp64基因的信号肽序列；HA蛋白；TM：gp64基因的跨膜区序列；BssH II、Xba I：酶切位点。 

图4所示的是重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA的酶切鉴定电泳图，其中M：10kb DNA分子量标准；1：pFastBac 1-gp64-HA双酶切产物,箭头位置为目的序列，1896 bp。 

图5所示的是构建成功的重组质粒Bacmid-gp64-HA的PCR鉴定结果，其中，M：10kb DNA分子量标准；1-4：PCR扩增目的片段。 

图6所示的是家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA的PCR鉴定电泳图，其中M：10kb DNA分子量标准；1：阴性对照；2-3：PCR扩增目的片段。 

图7所示的是家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA的HA蛋白Western Blot鉴定图，其中M：蛋白分子量标准；1：阴性对照；2-8：不同接毒比例（分别为1:50；1:100；1:200；1:400；1:600；1:800；1:1000）的5万离心沉淀；9：HA蛋白标准品。 

图8所示的是家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA应用于H7N9流感疫苗制备的效果检测结果图，共3个重复，其中A-E是病毒粒子倍比稀释后加样，最后一个为阴性对照。序列表信息： 

SEQ ID NO：1：重组核苷酸序列SP-HA-TM； 

SEQ ID NO：2：上游引物gp64-F； 

SEQ ID NO：3：下游引物gp64-R； 

SEQ ID NO：4：上游引物M13F； 

SEQ ID NO：5：SP-HA-TM序列编码的重组氨基酸序列。 

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本 发明所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。 

本发明通过PCR扩增获得SP-HA-TM编码基因序列，将其插入昆虫细胞表达载体pFastBac 1的Pph启动子下游，获得重组转座质粒（命名为pFastBac 1-gp64-HA），重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA（重组质粒命名为Bacmid-gp64-HA），将其通过脂质体转染家蚕BmN细胞，在细胞内装配形成表面展示H7N9抗原HA蛋白的重组杆状病毒（命名为Bm-gp64-HA），并复制扩增，用第三代Bm-gp64-HA病毒接种家蚕BmN细胞，经3～5天后收集病毒液，离心、分离纯化，制成H7N9流感疫苗。下面详细阐述本发明的具体内容。 

以下结合实施例详细阐述本发明的具体内容。 

1、本实施例涉及的合成产物SP-HA-TM基因及各引物，均根据NCBI数据库获得基因序列信息，使用PremerPrimer5.0软件设计引物，由北京华大基因有限公司合成。 

2、材料： 

载体pFastBac 1、含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞、家蚕BmN细胞购自Invitrogen公司。 

3、主要试剂： 

TaqDNA聚合酶、各类内切酶购自Fermentas公司，HA蛋白标准品购自Sigma公司，脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司，LB培养平板、培养液购自上海生工生物公司，其它使用到的试剂均属于普通市售生物实验试剂。 

实施例1：重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA的构建 

1.gp64-HA的扩增 

由NCBI数据库查得H7N9流感病毒HA蛋白基因的核苷酸序列，在该片段的5’端和3’端分别连接gp64基因的信号肽序列和gp64基因的跨膜区序列，再在gp64基因的信号肽序列的5’端连接一段供BssH II酶切结合的序列（BssH II酶切位点序列）、gp64基因的跨膜区序列的3’端连接一段供Xba I酶切结合的序列（Xba I酶切位点序列），使形成全长为1896bp的SP-HA-TM序列（SEQ ID NO：1所示），然后该SP-HA-TM序列交由北京华大基因有限公司进行合成。以合成产物SP-HA-TM基因为模板，gp64-F（SEQ ID NO：2所示）和gp64-R（SEQ ID NO：3所示）为引物，进行PCR扩增。扩增体系为50μL，成分为：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/mL的dNTPs 5μL，0.01nmol/μL的gp64-F和gp64-R各1μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶2μL，ddH₂O34μL。各组分混匀 后，放入PCR仪中，PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。SP-HA-TM基因PCR扩增产物的电泳鉴定结果如图1所示。 

2.重组转座质粒pFstBac 1-gp64-HA的构建 

将上述PCR扩增获得的gp64-HA（即SP-HA-TM）序列分别通过限制性内切酶BssH II和Xba I进行双酶切，酶切产物插入同时经过双酶切的pFastBac 1载体（如图2所示）的Pph启动子下游多克隆位点上下游两端，构建含有gp64-HA序列的重组转座质粒，命名为pFastBac 1-gp64-HA。含有gp64-HA序列的重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA构建示意图如图3所示。构建完成的重组转座质粒通过酶切、PCR及双向测序鉴定基因序列，证明重组转座质粒构建成功。重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA的酶切鉴定电泳图如图4所示。 

实施例2：家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA的获得 

将鉴定重组成功的重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上培养，通过转座进行同源重组（pFastBac 1-gp64-HA上的gp64-HA序列通过同源转座插入到Bacmid的多克隆位点）后进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，白斑继续在含四环素、卡那霉素、庆大霉素、X-gal和IPTG的LB培养液中摇菌培养48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组DNA，用M13通用引物、gp64-F和gp64-R通过PCR扩增鉴定重组Bacmid中目的基因插入情况，插入成功的质粒命名为Bacmid-gp64-HA。构建成功的Bacmid-gp64-HA的PCR鉴定结果如图5所示。 

鉴定成功的质粒Bacmid-gp64-HA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，转染使用脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent，转染方法参照该转染试剂说明书，转染具体步骤： 

前一天晚上将6μL的质粒Bacmid-gp64-HA和8μL转染试剂加到76μL的无血清培养基中，室温孵育20min，使脂质体充分包裹质粒Bacmid-gp64-HA，然后将其加入到1mL生长良好的家蚕BmN细胞中，置入培养箱培养过夜，第二天早上将无血清培养基吸走，换成有血清培养基培养5～7天，待细胞发病。 

细胞发病后（显微镜观察）获得一代病毒悬液，4℃保存，提取病毒基因组用M13F（SEQ ID NO：4所示）、gp64-R鉴定，鉴定结果见图6，其中阴性对照为野生杆状病毒，结果表明病毒构建成功，获得表面展示H7N9流感病毒HA蛋白的重组杆状病毒，命名 为Bm-gp64-HA。 

实施例3：HA蛋白在家蚕BmN细胞的表达 

将重组杆状病毒Bm-gp64-HA以3×10^-6pfu/cell的剂量感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，感染3～5天后，收集病毒液，经分离纯化，取10μL上清液加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris-HCl，4%SDS，0.15%溴酚蓝，10%甘油)，100℃加热10min，取加热后的混合液10μL进行SDS-PAGE分析，并做了Western Blot检测实验，结果表明，该家蚕重组杆状病毒已表达HA蛋白。 

实施例4：从家蚕BmN细胞中分离纯化Bmgp64-HA重组杆状病毒 

（1）取200mL经Bm-gp64-HA感染的家蚕BmN细胞病毒液； 

（2）将病毒液加入50mL离心管中，8000rpm离心30min，取上清，重复三次以除去细胞残渣； 

（3）将步骤（2）获得的离心上清液倒入50mL离心管，15000rpm离心60min，取上清，重复三次； 

（4）将步骤（3）获得的离心上清液，用截留分子量为100KD的中空纤维膜进行超滤，不断加入无菌水，所用无菌水体积约为样品的10倍，整个超滤过程均在4℃环境下操作，重复5次； 

（5）步骤（4）膜包超滤后的上清，在超净台上分装于灭菌的超滤离心管中，用注射器赶走管内气泡，放入日立CP70MX离心机以转速50000rpm离心40min，所得黑团用超滤液（即磷酸缓冲液PBS）重悬，用0.22μm的滤膜过滤除菌，获得纯化的重组杆状病毒。 

通过Western Blot检测重组杆状病毒HA蛋白的表达情况（用N蛋白的兔抗检测），结果见图7，其中泳道1是阴性对照结果，阴性对照使用的是野生杆状病毒；泳道2-8分别是按不同接毒比例纯化的Bmgp64-HA病毒粒子的沉淀；泳道9为标准品。 

实施例5：家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA应用于H7N9流感疫苗制备的效果检测 

使用实施例2获得的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA感染家蚕BmN细胞系，传代3次后收获病毒，离心、分离纯化，进行活性检测实验。 

鸡红细胞的制备方法：于10ml注射器中先吸入约3ml阿氏液（Alsever's Solution），然后从鸡翅静脉取血，用无菌生理盐水洗涤3次，前2次1600r/min离心4min，最后1次同速度离心6min弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4℃待用。 

血凝试验： 

(1)取24孔细胞培养板； 

(2)在每一排的1到6孔（A1-A6）加250μl生理盐水（0.85%）； 

(3)加入250μlHA蛋白纯化病毒样品于第一孔，做倍比稀释：用枪吹打，使充分混匀，从第1孔转移250μl至下一孔，最后的250μl弃去； 

(4)加入1%鸡红细胞悬液250μl至每一孔内； 

(5)阴性对照孔，没有样品的倍比稀释，直接在250μl生理盐水中加入1%鸡红细胞悬液250μl； 

(6)手工摇匀； 

(7)在37℃孵育12h，与对照对比，判读结果，如图8所示，由图8可以看出，HA具有活性。 

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 

序列表： 

SEQ ID NO：1： 

TTGGCGCGCCAAATGGTAGGCGCTATTGTTTTATACGTGCTTTTGGCGGCGGCGCAT 

TCTGCCTTTGCGGCGATGAACACTCAAATCCTGGTATTCGCTCTGATTGCGATCAT 

TCCAACAAATGCAGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACC 

AAAGTAAACACATTAACTGAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACA 

GTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAGGACAGTTGAC 

CTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAAT 

TCCTAGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTG 

TTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCA 

GGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATAAGAACTAAT 

GGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAAT 

GGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAA 

AAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTATCA 

ACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGG 

AGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTA 

ATGGTATATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATAC 

AGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGA 

GAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAG 

GGGACTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACAT 

AGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCT 

GCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATT 

TGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGG 

TATGGTTTCAGACACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAA 

AGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAAAATTAAACCGGCTTATAGAA 

AAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATCGACAATGAATTCAATGAGGTAGAGAAG 

CAAATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCAT 

ACAATGCTGAACTCTTGGTAGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGA 

TTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGC 

TGAAGAAGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGT 

ATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGATCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCA 

ATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGAT 

GTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAAT 

GGGCCTTGTCTTCATATGTGTAAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATA 

ATGGCTGAAGGCGAATTGGCCGCCAAATTGACTTCGTTCATGTTTGGTCATGTAGC 

CACTTTTGTAATTGTATTTATTGTAATTTTATTTTTGTACTGTATGGTTAGAAACCGTA 

ATAGTAGACAATATTAATGCTCTAGAGCA 

SEQ ID NO：2： 

TTGGCGCGCCAAATGGTAGGCGCTATTG 

SEQ ID NO：3： 

TGCTCTAGAGCATTAATATTGTCTACT 

SEQ ID NO：4： 

TGTAAAACGACGGCCAGT 

SEQ ID NO：5： 

MVGAIVLYVLLAAAHSAFAAMNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLT 

ERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIE 

RREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFY 

AEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLV 

TVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGISGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFL 

RGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLA 

TGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQS 

AIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVA 

MENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTY 

DHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNM 

RCTICIMAEGELAAKLTSFMFGHVATFVIVFIVILFLYCMVRNRNSRQY. 

Claims (7)

1.一种含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列SP-HA-TM，其特征在于：包括编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因、gp64基因的信号肽序列及gp64基因的跨膜区序列，其中gp64基因的信号肽序列连接于编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因的5’端、gp64基因的跨膜区序列连接于编码H7N9流感病毒HA蛋白的基因的3’端，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的含H7N9流感病毒HA蛋白基因编码的重组蛋白，其特征在于：由H7N9流感病毒HA蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP、C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.利用权利要求1所述的含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重组核苷酸序列构建的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA，其特征在于：由重组核苷酸序列SP-HA-TM插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。

4.根据权利要求3所述的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA，其特征在于：所述供体质粒为pFastBac 1载体，所述重组核苷酸序列SP-HA-TM插入pFastBac 1的Pph启动子下。

5.根据权利要求3所述的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA，其特征在于：所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

6.权利要求3-5任一权利要求所述的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）通过PCR扩增的方法得到SP-HA-TM基因序列，然后将SP-HA-TM基因序列连接到载体pFastBac 1的Pph启动子下，构建重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA；

（2）将重组转座质粒pFastBac 1-gp64-HA转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40～48h后挑取白斑，白斑继续培养24～48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示H7N9流感病毒HA蛋白的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA。

7.权利要求3-5任一权利要求所述的家蚕重组杆状病毒Bm-gp64-HA在H7N9流感疫苗制备中的应用。