CN110172452A - 一种高致病性h7n9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫苗的制备方法 - Google Patents

一种高致病性h7n9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，该方法可以提高病毒的免疫原性，包括以下步骤：制备Q226L突变HA基因，制备Q226L突变的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到Q226L突变HA基因；拯救病毒，采用Q226L突变HA基因拯救重组流感病毒。本发明还公开了通过该方法制备的高致病性H7N9禽流感病毒、采用该高致病性H7N9禽流感病毒制备的疫苗及其制备方法、采用该高致病性H7N9禽流感病毒制备的检测试剂。本发明所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法提升了重组病毒的生物安全性、提高免疫原性。

Description

一种高致病性H7N9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫 苗的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及病毒基因工程技术领域，尤其涉及一种高致病性H7N9禽流感病毒及其制备方法，本发明还涉及使用该高致病性H7N9禽流感病毒制备出的疫苗以及该疫苗的制备方法，本发明还涉及使用该高致病性H7N9禽流感病毒制备出的检测试剂。
背景技术
甲(A)型流感病毒(Influenza A virus)属于正黏病毒科，病毒主要呈球形，外有囊膜。甲型流感病毒基因组为8节段单股负链RNA，编码超过12种蛋白，其中囊膜表面的主要糖蛋白分别为血凝素蛋白(HA蛋白)和神经氨酸酶(NA)。根据HA蛋白和NA的不同，甲型流感病毒进一步分为18种HA亚型和11种NA亚型。甲型流感病毒基因组的复制依赖于RNA聚合酶。由于RNA聚合酶缺失校对活性，RNA复制保真性降低，导致流感病毒在复制过程中基因组极易发生突变。这些突变会引起流感病毒抗原性发生改变，即抗原漂变(Antigenic drift)。同时，流感病毒基因组分节段的特性也使得其基因组易发生重排造成抗原转变(Antigenicshift)。当一种新的流感变异株出现，而人群对其普遍缺乏保护性抗体时，就会导致流感大流行。
2013年3月，一种全球首发的新型H7N9亚型流感病毒在我国长江三角洲地区引发疫情并迅速蔓延，至今仍有散发病例。截至2018年11月，人感染H7N9确诊病例1567例，其中死亡612人，病死率高达39％。H7N9流感病毒在流行过程中，不断地进行变异与进化。HA基因进化成为长江三角洲系和珠江三角洲系；并且内部基因进一步与H9N2流感病毒进行重组。2013年至2016年9月的四次H7N9流行中，H7N9人感染病例由且仅由低致病性H7N9禽流感病毒造成，低致病性H7N9禽流感病毒感染禽类表现为无症状或轻微症状。而2016年10月开始第五次H7N9流行季，广东省首次从患者体内分离到了高致病性H7N9禽流感病毒株，该毒株HA蛋白裂解位点为KRKRTAR/G或KGKRIAR/G基序，与低致病性H7N9禽流感病毒毒株HA蛋白裂解位点序列(KGR/G)相比，插入了多个碱性氨基酸。研究显示高致病性H7N9禽流感病毒不仅对鸡具有高致病力，而且对小鼠、雪貂等哺乳动物也均具有高致病力。因此高致病性H7N9禽流感病毒更加具有流感大流行的潜在威胁。
疫苗是流感病毒防控的主要手段。流感病毒疫苗的主要免疫原性蛋白为HA蛋白，主要诱导机体产生针对HA蛋白的中和抗体。虽然季节性流感疫苗能够诱导高水平HA蛋白中和抗体，然而H7亚型流感疫苗HA蛋白在人及其他哺乳动物中具有低免疫原性的缺陷。因此针对高致病性H7N9禽流感病毒的潜在威胁，进一步提高高致病性H7N9禽流感病毒疫苗的免疫原性十分重要。
另外，血凝抑制(HI)试验广泛用于检测针对流感病毒HA蛋白的中和抗体效价，是WHO推荐的流感病毒疫苗免疫原性评估、血清流行病学研究和流感病毒抗原性分析的有效工具。HI试验方法已经有70年历史了，具有操作简便、廉价和高通量的优点。HI试验基于流感病毒HA蛋白能够结合红细胞受体、凝集红细胞，检测血清中阻断流感病毒HA蛋白凝集红细胞的抗体效价。因此，HI试验受到两方面因素影响，一方面为流感病毒HA蛋白与红细胞受体的亲和力，另一方面为抗体与流感病毒HA蛋白的结合能力。许多研究表明，当病毒株具有强受体亲和力时，能够更加有效地黏附红细胞，使HI抗体反应显著下降，从而错误地评价HI抗体效价以及病毒抗原性。然而，目前还没有实验方法能够校正HI试验中受体亲和力的变化对结果的影响。
无论同源还是异源H7N9免疫血清，对高致病性H7N9禽流感病毒均具有HI反应性低的特点。通过红细胞受体结合实验证明高致病性H7N9禽流感病毒具有高受体结合能力，然而通过小鼠免疫实验、微量中和(MN)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等证明高致病性H7N9禽流感病毒具有良好的免疫原性而且抗原性没有发生明显改变。因此，高致病性H7N9禽流感病毒HI结果受到高受体结合亲和力的影响，HI试验无法正确地反映针对高致病性H7N9禽流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，通过使用该病毒制备疫苗，以克服传统高致病性H7N9禽流感病毒疫苗制备过程安全性低、制得的疫苗免疫原性低，无法提供足够的保护作用等问题。
本发明的目的之二在于提供一种高致病性H7N9禽流感病毒，通过使用该病毒制备疫苗，以解决传统疫苗制备过程生物安全和疫苗免疫原性低等问题。
本发明的目的之三在于提供一种高致病性H7N9禽流感疫苗，以解决传统疫苗存在的无法对高致病性H7N9禽流感病毒的感染提供足够的保护作用等问题。
本发明的目的之四在于提供一种高致病性H7N9禽流感疫苗的制备方法，以解决传统疫苗制备过程安全性低、制得的疫苗免疫原性低，无法提供足够的保护作用等问题。
本发明的目的之五在于提供一种H7N9禽流感病毒血凝抑制抗体检测试剂，以解决现有检测试剂存在的HI试验无法正确地反映针对高致病性H7N9禽流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性等问题。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，包括以下步骤：
制备Q226L突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到Q226L突变HA基因；
拯救病毒：采用Q226L突变HA基因拯救重组流感病毒；
其中，所述Q226L突变HA基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，在制备Q226L突变HA基因步骤中，首先合成高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列如SEQ IDNO.1所示；
通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒。
进一步地，在制备Q226L突变HA基因步骤中，设计点突变引物对插入pM质粒的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列进行定点突变，制得pM-H7/GD16/Q226L质粒；
其中，所述点突变引物的序列如SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示。
进一步地，在拯救病毒步骤中，将pM-H7/GD16/Q226L质粒与PB2重组pM质粒、PB1重组pM质粒、PA重组pM质粒、NP重组pM质粒、NA重组pM质粒、M重组pM质粒及NS重组pM质粒混合，共转染至293T和MDCK共培养细胞中，收集细胞转染上清，制得重组流感病毒。
进一步地，所述NA重组pM质粒中的NA基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，共转染12～24h后加入终浓度为0.5～2.5μg/ml的TPCK-胰酶(TPCK-trypsin)，继续培养后收集细胞转染上清；
将上清接种于SPF鸡胚尿囊腔中，孵育、收集鸡胚尿囊液，制得重组流感病毒。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种高致病性H7N9禽流感病毒，采用上述任一项所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法制得。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种高致病性H7N9禽流感疫苗，采用上述高致病性H7N9禽流感病毒制备的灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、VLP疫苗、病毒载体疫苗、HA重组蛋白疫苗或者减毒活疫苗。
本发明的目的之四采用如下技术方案实现：
一种高致病性H7N9禽流感疫苗的制备方法，包括灭活步骤和纯化步骤；
灭活：采用甲醛溶液对上述高致病性H7N9禽流感病毒进行灭活；
纯化：采用密度梯度离心对灭活的高致病性H7N9禽流感病毒进行浓缩、纯化，制得高致病性H7N9禽流感疫苗。
进一步地，在灭活步骤中，所述甲醛溶液的体积分数为0.05％～0.5％，37℃灭活12～24h；
在纯化步骤中，首先通过120000×g超速离心1.5h进行病毒的浓缩，再通过30％～60％的蔗糖密度梯度进行120000×g超速离心2h，对浓缩的病毒进行纯化，最后将纯化后的流感病毒用PBS溶液稀释，并通过120000×g超速离心1.5h进行脱糖和浓缩。
本发明的目的之五采用如下技术方案实现：
一种H7N9禽流感病毒血凝抑制抗体检测试剂，包括上述高致病性H7N9禽流感病毒或者其灭活株。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法制备出的重组高致病性H7N9禽流感病毒删除了HA蛋白裂解位点多个碱性氨基酸，提升了重组病毒的生物安全性，使重组病毒能够在生物安全二级实验室中进行操作，同时不影响HA蛋白的免疫原性。通过使用该重组高致病性H7N9禽流感病毒制备疫苗也能提升疫苗的安全性。
(2)本发明高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法制备出的重组高致病性H7N9禽流感病毒，将位于受体结合位点和临近抗原位点D的226位谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)，使HA蛋白受体结合亲和力降低，进而提高其免疫原性，进而制备出高致病性H7N9禽流感疫苗。制备的疫苗能够诱导更高的抗体效价，提供更好的保护效果。
(3)本发明H7N9禽流感病毒血凝抑制(HI)抗体检测试剂，Q226L突变降低受体结合活性，增加了HI抗体滴度，而没有影响病毒的抗原性，校正了高致病性H7N9禽流感病毒抗原由于高受体结合亲和力所产生的HI滴度偏差。
附图说明
图1为纯化的H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组病毒血凝试验结果；
图2为纯化的H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组病毒考马斯亮蓝染色结果；
图3为纯化的H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组病毒红细胞受体结合实验结果(*：P<0.05)；
图4为H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组流感病毒抗体结合活性ELISA结果(A、小鼠H7N9/AH13血清；B、猕猴H7N9/AH13血清；C、小鼠H7N9/GD16血清；D、猕猴H7N9/GD16血清；E、单抗8852)；
图5为H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L疫苗免疫BALB/c小鼠诱导产生的HI抗体效价(*：P<0.05；****：P<0.0001)；
图6为H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L疫苗免疫BALB/c小鼠诱导产生的MN抗体效价(*：P<0.05；****：P<0.001)；
图7为H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L疫苗免疫BALB/c小鼠5周后进行1000×MLD50剂量H7N9/GD16/WT病毒攻毒的小鼠体重下降(A)和小鼠存活率(B)。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
鉴于上述现有疫苗存在的低免疫原性的缺陷，本发明的主要目的在于提供一种具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感病毒及其制备方法，本发明基于上述制备的具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感病毒进一步开发出一种具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感疫苗，提高高致病性H7N9禽流感病毒疫苗的免疫原性。
HA蛋白与受体结合特性、病毒的生长复制能力等生物学特性息息相关。HA蛋白主要包含5个抗原位点(A-E)，其中抗原位点A、B、D在受体结合位点附近，距离也是主要的抗原位点区域。因此通过改造HA蛋白的受体结合特性的决定氨基酸可能能够提高其免疫原性，进而制备具有高免疫原性的流感疫苗。因此，本发明将位于受体结合位点和临近抗原位点D的226位(按H3亚型HA顺序编码，对应H7编码顺序为235位)谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)，使HA蛋白受体结合亲和力降低，进而提高其免疫原性，从而制备具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感疫苗。
实施例1
具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法
第一步，合成HA基因：
首先根据WHO推荐的高致病性H7N9禽流感病毒疫苗株A/Guangdong/17SF003/2016(H7N9)的HA基因序列，合成裂解位点多个碱性氨基酸删除的HA基因，裂解位点多个碱性氨基酸删除的HA基因(称为H7/GD16/WT)交由金斯瑞公司完成。现有研究表明，具有多个碱性氨基酸的裂解位点是高致病性禽流感病毒的标志，删除多个碱性氨基酸后能够降低其致病性，使重组病毒能够在生物安全二级实验室中进行操作，同时不影响HA蛋白的免疫原性。出于安全性的考虑，将高致病性H7N9禽流感病毒疫苗株的HA基因中具有高致病性禽流感病毒特性的裂解位点改为与低致病性H7N9禽流感病毒HA基因相同的裂解位点。其中，删除多个碱性氨基酸的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白(称为H7/GD16/WT)的基因序列如SEQID NO.1所示。此处选择合成HA基因序列的方式可以是全基因合成手段，也可以是通过DNA扩增或者RNA扩增(即RNA经反转录得到DNA模板后再扩增)手段。
第二步，构建pM-H7/GD16/WT重组质粒：
根据插入片段HA和pM载体的3’、5’末端设计同源重组的上、下游引物，引物序列为：
HA-F：TCCGAAGTTGGGGCCAGCAAAAGCAGGGGATACAAAATG；
HA-R：GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTTC；
分别以合成的HA基因为模板，通过上、下游引物获得对应HA基因的PCR产物。PCR产物经过凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行PCR产物的回收和纯化。分别将纯化的PCR产物与线性化的pM质粒通过ClonExpress II同源重组试剂盒进行同源重组，具体方法参见说明书。获得的pM-H7/GD16/WT重组质粒进过测序验证后可以用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。
第三步，HA基因的定点突变：
为了将HA蛋白226位点谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)，首先设计定点突变引物：
Q226L-F：ACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTGACTTTCATTG，具体突变点为带下划线的核苷酸，对应于序列表中的SEQ ID NO.5；
Q226L-R：TCAATTCTTCCAGATAGACCATTAACTTGTGGTCTTGCTC，具体突变点为带下划线的核苷酸，对应于序列表中的SEQ ID NO.6。
采用QuikChange定点突变试剂盒将pM-H7/GD16/WT突变为pM-H7/GD16/Q226L，具体方法参见说明书。重组质粒pM-H7/GD16/Q226L经测序验证后用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。
第四步，拯救病毒的过程：
将生长状态良好的293T细胞和MDCK细胞分别以4×105个细胞/ml和5×104个细胞/ml密度共培养于6孔板中，37℃培养16-24h后可用于质粒的转染。
分别将实验室保存的来源于PR8株的PB2、PB1、PA、NP、NA、M、NS重组pM质粒按照1μg/每孔混合，并加入1μg/每孔pM-H7/GD16/WT。质粒混合物分别通过Lipofectamine2000转染试剂共转染至293T和MDCK共培养细胞中，转染方法参见说明书。转染后37℃培养16h，之后加入终浓度为1μg/ml的TPCK-胰酶(TPCK-trypsin)。继续培养24h后，收集细胞转染上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔中。鸡胚于37℃培养箱内孵育48h，收集鸡胚尿囊液用1％鸡红细胞进行血凝(HA)试验。根据HA基因的序列差异，重组流感病毒称为H7/GD16/Q226L。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处在于：实施例2中的NA片段选自N9亚型非奥司他韦耐药性突变的NA基因。含有奥司他韦耐药性突变的N9亚型NA基因具有耐奥司他韦耐药的效果，使用这种突变的NA基因制备的高免疫原性的高致病性H7N9禽流感病毒以及对应的疫苗具有导致耐药基因泛滥的风险，通过使用非奥司他韦耐药性突变的NA基因，能够避免奥司他韦耐药性突变的NA基因广泛播散。实施例2中H7/GD16/WT的合成HA基因、构建pM-H7/GD16/WT重组质粒以及HA基因的定点突变均同上述实施例1。
第一步，NA基因合成：
NA基因选用低致病性H7N9禽流感病毒疫苗株A/Anhui/1/2013(H7N9)的NA基因(GISAID ID:EPI439509，称为N9/AH13)，并交由金斯瑞公司完成，N9/AH13的序列如SEQ IDNO.7所示。
第二步，构建pM-N9/GD16/WT重组质粒：
采用PCR扩增的手段扩增NA片段，根据插入片段NA和pM载体的3’、5’末端设计同源重组的上、下游引物，引物序列为：
NA-F：TCCGAAGTTGGGGCCAGCAAAAGCAGGGTCAAGATGAATC(参见SEQ ID NO.8)；
NA-R：GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTCTTTTTCTTC(参见SEQ ID NO.9)。
分别以合成的NA基因为模板，通过上、下游引物获得对应NA基因的PCR产物。PCR产物经过凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行PCR产物的回收和纯化。分别将纯化的PCR产物与线性化的pM质粒通过ClonExpress II同源重组试剂盒进行同源重组，具体方法参见说明书。获得的pM-N9/GD16重组质粒进过测序验证后可以用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。
第三步，HA基因的定点突变，与实施例1相同：
第四步，拯救病毒的过程：
将生长状态良好的293T细胞和MDCK细胞分别以4×105个细胞/ml和5×104个细胞/ml密度共培养于6孔板中，37℃培养16-24h后可用于质粒的转染。
分别将实验室保存的来源于PR8株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS重组pM质粒按照1μg/每孔混合，并向每孔加入1μg/每孔pM-H7/GD16/WT及1μg/每孔pM-N9/GD16。另外，将实验室保存的来源于PR8株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS重组pM质粒按照1μg/每孔混合，并向每孔加入1μg/每孔pM-H7/GD16/Q226L及1μg/每孔pM-N9/GD16，8质粒混合物也按照相同方法混合。质粒混合物分别通过Lipofectamine2000转染试剂共转染至293T和MDCK共培养细胞中，转染方法参见说明书。转染后37℃培养16h，之后加入终浓度为1μg/ml的TPCK-胰酶(TPCK-trypsin)。继续培养24h后，收集细胞转染上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔中。鸡胚于37℃培养箱内孵育48h，收集鸡胚尿囊液用1％鸡红细胞进行血凝(HA)试验。根据HA基因的序列差异，两种重组流感病毒分别称为H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L。HA试验结果如图1所示，H7N9/GD16/WT拯救成功，血凝效价为28，这也表明Q226L突变不影响重组H7N9流感病毒的鸡胚生产。
病毒基因测序验证
通过病毒核酸提取试剂盒提取重组流感病毒RNA，以上述HA和NA基因扩增引物通过一步法反转录试剂盒分别扩增病毒HA基因和NA基因。扩增后的基因插入pMD-18T质粒，并进行测序。测序结果正确的重组病毒作为高致病性H7N9禽流感病毒候选疫苗株。
实施例3
具有高免疫原性的高致病性H7N9禽流感灭活疫苗的制备方法，包括灭活步骤和纯化步骤。
第一步，流感病毒的灭活
对上述实施例2制备出的两种重组流感病毒进行灭活，具体灭活方法如下。采用甲醛溶液进行灭活，向病毒尿囊液中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，37℃灭活16小时。灭活后的流感病毒在鸡胚中连续传代三次，传代后检测不到血凝效价判定为灭活成功。
第二步，流感病毒的纯化
将灭活的流感病毒鸡胚尿囊液于超速离心机120000×g超速离心1.5h，进行病毒的浓缩，浓缩后的病毒沉淀用PBS溶液重新悬浮起来。配制30％-60％的蔗糖密度梯度，将浓缩病毒加入蔗糖密度上层，进行120000×g超速离心2h，对浓缩的病毒进行纯化，纯化后吸取30％和60％蔗糖浓度层之间的病毒带。最后将纯化的流感病毒用PBS溶液稀释，并进一步通过120000×g超速离心1.5h进行脱糖和浓缩。离心沉淀用PBS溶解后分装，-80℃保存。
灭活和纯化后的H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组病毒即为两株高致病性H7N9禽流感病毒疫苗候选株。
效果实施例
(1)HA蛋白定量
对实施例2制备的两株重组流感病毒(H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组流感病毒)进行HA蛋白的定量。
采用考马斯亮蓝方法对纯化的流感病毒进行HA蛋白的定量。首先使用糖苷酶F(NEB，PNGase F)处理纯化的流感病毒，切割HA、NA蛋白的糖链，切割后的HA蛋白HA1亚基和HA2亚基分子量减小，能够与其他蛋白很好的区分开，便于通过灰度扫描进行定量。处理后的病毒进行SDS-PAGE，电泳完成后通过考马斯亮蓝进行染色，结果如图2所示。通过对各个条带进行灰度扫描分析，可以计算得到H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L重组病毒HA蛋白浓度(HA1+HA2)分别为0.74mg/ml和0.73mg/ml。结果表明，两株重组流感病毒的HA蛋白浓度基本无差异，具有可比性。
(2)两株重组流感病毒受体结合亲和力的测定(实施例2制备的两株重组流感病毒)
采用红细胞受体结合实验分析重组流感病毒H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L的对红细胞的受体结合能力。首先将来源于霍乱弧菌的神经氨酸酶进行梯度稀释，分别37℃处理浓度为10％的鸡红细胞1h，处理后的鸡红细胞用PBS溶液洗两遍，并稀释至1％。将待测病毒统一至2个血凝单位，分别将50μl待测病毒与50μl不同浓度神经氨酸酶处理的鸡红细胞在V型板上混合孵育，室温孵育1h，记录待测流感病毒能够凝集红细胞的最大神经氨酸酶浓度。结果如图3所示，H7N9/GD16/WT病毒能够凝集59μg/ml神经氨酸酶处理的红细胞，而H7N9/GD16/Q226L流感病毒仅能够凝集30μg/ml神经氨酸酶处理的红细胞。结果表明H7N9/GD16/Q226L流感病毒受体结合亲和力显著低于H7N9/GD16/WT。
(3)流感病毒与抗体结合活性的测定(实施例2制备的两株重组流感病毒)
分别将H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L流感病毒抗原进行蔗糖密度梯度纯化，纯化后的流感病毒统一至16个血凝单位，并包被于96孔ELISA板底。4℃包被16h后，用PBS溶液洗板3次，并用1％BSA溶液37℃封闭1h。封闭后，用PBS溶液洗板3次，将来源于不同动物的不同H7N9流感病毒免疫血清分别进行梯度稀释，加入ELISA板中，37℃孵育1h。血清孵育后，用PBS溶液洗板3次，加入5000倍-10000倍稀释的HPR标记的物种特异性IgG二抗，37℃孵育1h。二抗孵育结束后，用TMB作为底物进行显色，室温显色10min后用1M H2SO4进行终止，通过酶标仪检测OD450。
ELISA结果如图4所示，8852单抗(E)作为内参照，结合于HA蛋白的茎部区域，H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L流感病毒在该区域具有相同的序列和结构，因此H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L流感病毒与8852单抗的结合能力相同，证明两种病毒抗原上样量相同。与血清的ELISA抗体结合实验证明，无论是H7N9/AH13免疫小鼠(A)、猕猴(B)血清，还是H7N9/GD16免疫小鼠(C)、猕猴(D)血清，H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L流感病毒抗原与血清均有一致的结合能力。
(4)流感病毒抗原的HI试验结果(实施例2制备的两株重组流感病毒)
采用WHO推荐的标准方法对H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L病毒抗原进行HI试验。结果如表1，无论对H7N9/AH13免疫小鼠、猕猴血清还是H7N9/GD16免疫小鼠、猕猴血清，以H7N9/GD16/Q226L作为抗原检测HI抗体滴度高于H7N9/GD16/WT抗原5.3-8倍。
表1.免疫血清与病毒抗原HI试验结果
H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L病毒抗原与血清抗体结合活性相同，因此，HI滴度的增加是由于受体结合亲和力下降所造成的，校正了H7N9/GD16/WT抗原由于高受体结合亲和力所产生的HI滴度偏差。
(5)在小鼠体内评价高致病性H7N9禽流感病毒疫苗效力(实施例2制备的两株重组流感病毒)
分别将高致病性H7N9禽流感病毒疫苗H7N9/GD16/WT和H7N9/GD16/Q226L免疫BALB/c小鼠，每组10只小鼠。免疫剂量为3μg每只小鼠，免疫途径为腿部肌肉注射，PBS免疫组作为阴性对照。免疫后4周采集小鼠血清，进行血清抗体检测。免疫后5周采用H7N9/GD16/WT病毒对小鼠进行滴鼻攻毒，攻毒剂量1000×MLD50。攻毒后连续监测小鼠体重14天，并记录小鼠的死亡率。
分别对高致病性H7N9禽流感病毒疫苗免疫后的小鼠血清进行血凝抑制(HI)抗体和微量中和(MN)抗体检测。HI抗体检测结果如图5所示，PBS组小鼠血清中检测不到HI抗体；无论对H7N9/GD16/WT还是H7N9/AH13病毒抗原，H7N9/GD16/Q226L疫苗均能够诱导更高水平的HI抗体。MN抗体结果如图6所示，无论对H7N9/GD16/WT还是H7N9/AH13病毒抗原，H7N9/GD16/Q226L均能够诱导更高水平的中和抗体。这些结果表明，H7N9/GD16/Q226L疫苗能够刺激产生更高水平的HI和中和抗体，具有更好的免疫原性。
小鼠免疫后5周，以1000×MLD50剂量的H7N9/GD16/WT病毒进行攻毒，结果如图7所示。PBS组小鼠攻毒后体重明显下降，第三天出现小鼠死亡，到第五天全部死亡。H7N9/GD16/WT疫苗免疫组小鼠在攻毒后第四天死亡3只小鼠，存活率为70％。H7N9/GD16/Q226L疫苗免疫组小鼠在攻毒后第五天死亡1只小鼠，存活率为90％，并且在第4-5天，其体重下降明显小于H7N9/GD16/WT疫苗免疫组小鼠。这些结果证明，H7N9/GD16/Q226L疫苗能够对小鼠提供更好H7N9/GD16/WT病毒攻毒保护率。
综上所述，本发明基于HA蛋白Q226L突变的HPAI H7N9流感病毒H7N9/GD16/Q226L，作为血凝抑制检测试剂与H7N9/GD16/WT具有相同的抗原性，然而具有较低的受体结合亲和力，因此校正了H7N9/GD16/WT抗原由于高受体结合亲和力所产生的HI滴度偏差，能够可靠地评价HPAI H7N9流感病毒抗体水平和抗原性。并且，本发明基于HA蛋白Q226L突变的HPAIH7N9全病毒灭活疫苗H7N9/GD16/Q226L与野生型H7N9/GD16/WT疫苗相比，具有更高的免疫原性和更好的疫苗效力。
本发明HA蛋白Q226L突变适用于高致病性H7N9禽流感病毒灭活疫苗，但不限于此种疫苗。HA蛋白Q226L突变提高HPAI H7N9疫苗免疫原性的方法也能够适用于其他能够刺激HA抗体的流感病毒疫苗类型，例如裂解疫苗、亚单位疫苗、VLP疫苗、病毒载体疫苗、HA重组蛋白疫苗以及减毒活疫苗等。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备Q226L突变HA基因：制备突变后的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，得到Q226L突变HA基因；
拯救病毒：采用Q226L突变HA基因拯救重组流感病毒；
其中，所述Q226L突变HA基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，其特征在于，在制备Q226L突变HA基因步骤中，首先合成高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列，所述高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
通过同源重组将高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pM中，制得pM-H7/GD16/WT质粒。
3.根据权利要求2所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，其特征在于，在制备Q226L突变HA基因步骤中，设计点突变引物对插入pM质粒的高致病性H7N9禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列进行定点突变，制得pM-H7/GD16/Q226L质粒；
其中，所述点突变引物的序列如SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，其特征在于，在拯救病毒步骤中，将pM-H7/GD16/Q226L质粒与PB2重组pM质粒、PB1重组pM质粒、PA重组pM质粒、NP重组pM质粒、NA重组pM质粒、M重组pM质粒及NS重组pM质粒混合，共转染至293T和MDCK共培养细胞中，收集细胞转染上清，制得重组流感病毒。
5.根据权利要求4所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法，其特征在于，所述NA重组pM质粒中的NA基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
6.一种高致病性H7N9禽流感病毒，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的高致病性H7N9禽流感病毒的制备方法制得。
7.一种高致病性H7N9禽流感疫苗，其特征在于，采用权利要求6所述的高致病性H7N9禽流感病毒制备的灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、VLP疫苗、病毒载体疫苗、HA重组蛋白疫苗或者减毒活疫苗。
8.一种高致病性H7N9禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，包括灭活步骤和纯化步骤；
灭活：采用甲醛溶液对权利要求6所述的高致病性H7N9禽流感病毒进行灭活；
纯化：采用密度梯度离心对灭活的高致病性H7N9禽流感病毒进行浓缩、纯化，制得高致病性H7N9禽流感疫苗。
9.根据权利要求8所述的高致病性H7N9禽流感疫苗的制备方法，其特征在于，在灭活步骤中，所述甲醛溶液的体积分数为0.05％～0.5％，37℃灭活12～24h；
在纯化步骤中，首先通过120000×g超速离心1.5h进行病毒的浓缩，再通过30％～60％的蔗糖密度梯度进行120000×g超速离心2h，对浓缩的病毒进行纯化，最后将纯化后的流感病毒用PBS溶液稀释，并通过120000×g超速离心1.5h进行脱糖和浓缩。
10.一种H7N9禽流感病毒血凝抑制抗体检测试剂，其特征在于，包括权利要求6所述的高致病性H7N9禽流感病毒或者其灭活株。
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