CN102397559A - 广谱型流感疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了广谱型流感疫苗及其制备方法。该疫苗包含由流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段M2e或HA2_18-72与载体蛋白化学偶联而成的偶联物。由该偶联物制备的广谱型疫苗易于大规模生产制备，且有效周期长，可以大量储备。克服了传统流感疫苗研制、生产技术路线的不足，从而实现对各种流感病毒引发的疫情及时、有效地控制。

Description

广谱型流感疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及广谱型流感疫苗及其制备方法。

背景技术

流感是由流感病毒引发的呼吸道传染性疾病，是到目前为止仍然对人类公共安全带来巨大威胁的疾病之一，人类历史上曾出现三次世界性大流感，导致5000万至1亿人死亡，超过两次世界大战死亡人数的总和。

流感病毒的主要特点是病毒株变异快、疫情传播速度快，危害性大。在自然界中，人和其它动物均是流感病毒的宿主，而发生于不同宿主的病毒株重组现象使新的流感病毒株不断地出现，给人类预防和控制流感疫情带来严峻的挑战。

到目前为止，预防性流感疫苗是控制流感病毒引发疫情的最佳方式，针对流感病毒变异快、会发生抗原漂移或抗原突变等特点，世界卫生组织在全球建立了流感疫情监控网络，应用现代流行病学和生物技术手段，分析在下一个流感季节流行的病毒株，并以此为基础，确定在全球的不同区域的疫苗生产用毒株，用于预防性疫苗的生产。

流感病毒株具有高度变异性，在不同的时间或不同的地点流行的流感病毒株血清型也存在较大的差异，因此，世界卫生组织根据流感病毒流行学调查和预测，不断更新病毒疫苗株，以预防流感的流行和蔓延。但是流感流行病学调查和预测具有不确定性，而且相对于流感的快速爆发和流行，用流行的病毒株研制生产疫苗有滞后效应等不利因素，因而不能有效地实现对流感的预防和控制。

传统流感疫苗生产技术路线采用鸡胚培养法，而要在短时间内提供大量鸡胚、生产出满足健康人群大规模免疫接种的流感疫苗客观上存在很大的困难，这种矛盾在大流感爆发期间特别明显。因此，传统流感疫苗生产技术不利于在短时间内生产出大量流感疫苗，不能及时的在健康人群中建立有效的免疫屏障，控制流感的大规模流行和蔓延。

因此，研制对不同血清型的流感病毒均有预防保护效果的疫苗——广谱型流感疫苗成为全球疫苗研究领域的热点。

在甲型流感病毒粒子和病毒感染的膜上表达了三种类型的跨膜蛋白(Krystyna Mozdzanowska et al，Vaccine.2003(21)：2616-2627)：红细胞凝集素和神经氨酸酶是分别具有大约510个和420个氨基酸的糖蛋白，相比之下，第三个跨膜蛋白为基质蛋白2(M2)，它包含的胞外结构域(M2e)在人类的流感病毒株中是高度保守的。利用M2对甲型流感病毒感染的广泛的保护性免疫已有相关研究(Frace et al，(1999)Vaccine 17：2237-44；Okuda et al，(2001)Vaccine19：3681-91)。

M2是97个氨基酸的非糖基化跨膜蛋白(Lamb et al，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：4170-4；Lamb et al，(1985)Cell 40：627-33)。它形成同型四聚体，在病毒颗粒的膜上以低密度表达，但在被感染的细胞的质膜上以高密度表达。M2四聚体表现出pH诱导的质子运输活性，这似乎利于RNP复合物融合后从病毒膜上的释放，防止红细胞凝集素在成熟前受酸诱导的构象变化(Steinhauer etal，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11525-9；Pinto et al，(1992)Cell 69：517-28)。在23个氨基酸序列的M2e中，N-端的9个氨基酸是完全保守的，在它靠近膜的15个氨基酸的部分中仅显示出相对低程度的结构多样性。在人类分离株H1N1，H2N2，H3N2和H5N1亚型中，在7个位置出现了两个可以相互替换的氨基酸，但这些分离株的大部分实际上具有同样的序列。

M2e特异性单克隆抗体14C2在体外不能防止病毒感染，但在掺入培养基或琼脂覆盖层中时能降低病毒的产量，减小噬菌斑的大小。表明抗体介导的病毒生长限制在体内和体外是通过不同机制进行的。

使用不同类型的疫苗结构和接种形式已经测试了主动诱导的M2特异性免疫的保护效力，原因是能够导致病毒生长和死亡率的减少。

Merck公司开发出预防流感的化学偶联物，如US2004/0223976A1和CN1756562A利用流感病毒中高度保守的，具有预防保护效果的抗原片段M2e和HA0蛋白质与载体蛋白OMP偶联，目前该药物处于I期临床阶段。

Acambis公司开发出M2e-HBc VLPs，如US 7361352B2和CN1913920A，同样利用流感病毒的M2e片段，与乙肝核心抗原通过化学偶联形成抗流感病毒的嵌合体分子颗粒，目前该药物也处于I期临床阶段。

HA在病毒成熟的过程中，裂解为HA₁(冠状部分)和A2(茎状部分)。在生理状态下，冠状的A₁暴露在病毒粒子表面，能被宿主的免疫系统识别并产生抗体，但其氨基酸变异程度很高，不同血清型病毒诱导产生的抗体没有交叉保护效果，这也就是传统流感病毒疫苗的缺点。A₂部分被A₁包裹，在正常的生理状态下不被机体免疫系统所识别，其只在病毒粒子和细胞融合的过程中暴露，由包裹状态转变为伸展状态，对病毒核酸最终进入宿主细胞起到关键的作用。经过基因序列比对分析，在A2部分中介导病毒和细胞融合的肽段(1-56aa)保守程度高，在甲型流感(H1N1)、季节性流感和禽流感中该序列同源性高达90％。因此，HA2序列的保守肽段是研制广谱型流感疫苗的热点(SuiJ，Hwang WC，Perez S，et al：Nat Struct Mol Biol.2009Mar；16(3)：265-73；Ekiert DC，Bhabha G，Elsliger MA et al：Science.2009Apr 10；324(5924)：246-51)。

目前全球流感形势严峻，新的流感病毒株如禽流感病毒(H5N1)和甲型流感病毒(H1N1)不断出现，而且存在病毒重组产生新的、高致病性二代病毒的危险，已有的疫苗对新出现的病毒没有预防保护效果。因此，急需采用全新技术路线，研制广谱型的、对甲型(H1N1)流感、禽流感(H5N1)、该两种病毒重组产生的二代病毒和季节性流感病毒都具有预防保护效果的流感疫苗，彻底控制、消除流感的危害。

发明内容

本发明的目的在于提供一种广谱型流感疫苗及其制备方法。根据流感病毒最新研究结果，利用流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段M2e或HA2_18-72与载体蛋白P64K化学偶联，开发出广谱型的流感疫苗，能够有效的应对各型流感病毒，由该偶联物制备的广谱型疫苗易于大规模生产制备，且有效周期长，可以大量储备。克服了传统流感疫苗研制、生产技术路线的不足，从而实现对各种流感病毒引发的疫情及时、有效地控制。

本发明的技术方案如下：

本发明的目的是提供一种预防流感的偶联物，所述的偶联物是由流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段M2e及其衍生的多肽或HA2_18-72蛋白质与载体蛋白共价连接而成。

本发明一方面提供了一种M2e-载体蛋白偶联物，该偶联物是由甲型流感H1N1病毒M2蛋白质的胞外结构域(M2e)或其衍生的多肽与载体蛋白化学偶联而成。

其中，所述的M2e或其衍生的多肽序列如SEQ ID NO：2所示：

SLLTEVETPTRX₁EWEX₂RX₃SDSSDC[SEQ ID NO：2]

其中，

X₁为苏氨酸、异亮氨酸或丝氨酸；

X₂为丝氨酸、天冬氨酸或半胱氨酸；

X₃为半胱氨酸、丙氨酸或丝氨酸。

其中，所述的M2e或其衍生的多肽序列优选为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：

SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDC[SEQ ID NO：1]。

其中，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白的任意一种，优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K；

所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示；

编码P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

本发明一方面提供了一种HA2_18-72-载体蛋白偶联物，该偶联物是由禽流感H5N1病毒的HA2_18-72多肽与载体蛋白化学偶联而成。

其中，所述的HA2_18-72多肽具有SEQ ID NO：3所述的序列：

MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFC

[SEQ ID NO：3]。

其中，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白的任意一种；

所述的载体蛋白优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K；

所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示；

编码P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

本发明所述的M2e及其衍生的多肽或HA2_18-72多肽与载体蛋白是通过硫醚键共价连接的。

本发明所述的M2e是通过固相合成方法制备的。

本发明所述的HA2_18-72是将经基因工程菌表达而来；

所述HA2_18-72编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；

所述基因工程菌优选为大肠杆菌Ecoli.BL21。

本发明一方面提供了M2e-载体蛋白偶联物的制备方法，先将载体蛋白用活化剂活化，再与适当比例的M2e或其衍生的多肽混合，反应得到偶联物；

所述的M2e与载体蛋白的比例为(10-20)∶1，优选为(12-18)∶1，更优选为15∶1；

所述偶联反应的pH值为6.5-7.5，优选为6.8-7.2；

所述偶联反应的时间为18-36小时，优选为24小时；

所述的活化剂为SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)，MB S(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，sulfo-MBC(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)的任意一种，优选为SMCC。

本发明一方面提供了HA2_18-72-载体蛋白偶联物的制备方法，先将载体蛋白用活化剂活化，再与适当比例的HA2_18-72混合，反应得到偶联物；

所述的HA2_18-72与载体蛋白的比例为(10-20)∶1，优选为(12-16)∶1，更优选为15∶1；

所述偶联反应的pH值为为6.5-7.5，优选为6.8-7.2；

所述偶联反应的时间为18-36小时，优选为24小时；

所述的活化剂为SMCC，MBS，sulfo-MBS的任意一种，优选为SMCC。

本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有任意一种M2e或其衍生的多肽与载体蛋白的偶联物及相应的佐剂。

本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有所HA2_18-72-载体蛋白偶联物及相应的佐剂。

本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有M2e或其衍生的多肽与载体蛋白偶联物的任意一种和HA2_18-72-载体蛋白偶联物及相应的佐剂。

本发明的广谱型流感疫苗的毒副作用小，安全性高，耐受性好，能够有效预防甲型H1N1，禽流感H5N1流感病毒和其他病毒亚型的感染。用本发明的疫苗免疫小鼠，能够诱导小鼠产生高水平的抗体，并能保护免疫小鼠对病毒的致死剂量攻击。

附图说明

图1为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

图2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的反相色谱图谱

图3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的肽谱(胰蛋白酶)

图4为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的电泳图谱

图5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的质谱分析图谱

图6为M2e的反相高效液相色谱图谱

图7为M2e的质谱分析图谱

图8为M2e-P64K偶联物的SDS凝胶电泳图

图9为M2e-P64K偶联物的凝胶色谱图

图10为HA2_(18-72)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图11为HA2_(18-72)的载体构建

图12为HA2_18-72的Mono Q纯化过程图谱

图13为HA2_18-72的SOURCE纯化过程图谱

图14为HA2_18-72的SDS-PAGE图谱

图15为HA2_18-72的反相高效液相色谱图

图16为HA2_18-72-P64K的SDS-PAGE图谱

图17为HA2_18-72-P64K的凝胶色谱图

图18为M2e-P64K偶联物的免疫原性分析：抗体效价图

图19为M2e-P64K偶联物的免疫原性分析：抗体亚型鉴定图

图20为M2e-P64K偶联物的免疫原性分析：血清交叉反应

图21为HA2_18-72-P64K偶联物的免疫原性分析：抗体效价图

实施例

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的制备

1、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)编码基因的克隆

根据GenBank Accession No.X77920.1的脑膜炎奈瑟氏菌的序列，采用Primer5.0软件设计引物，上游引物：5-CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA-3，下游引物：5-CCGGAATTCTTATTTTTTCTTTTGCGGAG-3，其中下划线部分分别为NcoI和EcoRI的酶切位点。将脑膜炎奈瑟氏菌CMCC 29336(购自中国医学细菌保藏中心，简称CMCC)于100℃条件下煮沸10min，吸取3μl作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：3μl模板，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP1μl，Pyrobest高保真DNA聚合酶(上海生工产品)1μl，终浓度为0.5μmol/L的上下游引物各0.5μl，加超纯水至50μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸2min；共30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。其中，泳道1为DL2000DNA分子量标准，泳道2为P64K编码基因的PCR扩增产物。结果表明，扩增得到1800bp左右的P64K的编码基因。对上述获得的P64K的编码基因进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

2、载体和工程菌的构建

回收上述目的片段，将回收的PCR产物和pET28a载体分别用NcoI和EcoRI进行双酶切，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收酶切片段，将酶切产物与载体pET28a的酶切产物以1∶3的摩尔比进行混合，经T4DNA连接酶室温过夜连接，连接产物用CaCl₂法转化JM109感受态细胞，12小时后，挑取单克隆，用菌落PCR法筛选阳性克隆，得到表达P64K的大肠杆菌工程菌。

3、工程菌株大规模培养、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的纯化和检测

将上述步骤2获得的表达P64K的大肠杆菌工程菌经三级培养放大，最后转至500L的肉汤培养基中，发酵罐参数设置为：搅拌速度350-400rpm，温度35-37℃，溶氧控制在30-40％，培养36-48小时后，终止培养。

将培养液经连续高速离心进行固液分离以收集菌体，将收集到的菌体经高压匀浆后，离心去除菌体碎片，在上清液中加入固体硫酸铵，依次进行疏水层析、阴离子交换层析(Q-sepharose FF GE)和凝胶过滤(sephadex s200GE)，得到P64K的原液。

按照《中国人民共和国药典》2005年版第三部要求和质量标准对上述获得的P64K原液进行纯度、残留杂质和结构鉴别，具体的检测结果如图1-5所示。其中，图2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的反相高效液相色谱图，检测波长为280nm，结果如图中所示只有一个峰，其色谱保留时间为7.71分钟，色谱纯度为100％；图3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)肽谱(胰蛋白酶)，结果显示，上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)与P64K标准品(古巴分子免疫中心提供)的谱图完全一致；图4为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的电泳图谱，P64K表示上述获得的由大肠杆菌工程菌表达的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)，LMWP表示低分子量蛋白标准品(GE公司提供)，在电泳谱图上，上述获得的P64K只有一条带，纯度为100％；图5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的质谱分析图，分子量为61923.7Da，与氨基酸序列推算的理论分子量一致。

实施例2、M2e肽的制备

1、M2e肽的固相合成：

以M2e肽序列SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDC[SEQ ID NO：1]C末端的氨基酸Cys为起始反应物，将其上的NH₂用Fmoc保护，与载体Trityl chloride resin(也可为Rink Amide resin或Wang resin)反应，摩尔比为1∶1.5，以DCM或DMF为反应溶剂，碱性条件下混合，反应2小时左右；用碱性溶剂哌啶脱去连接在载体上第一个氨基酸氨基上的保护基Fmoc，用DMF冲洗，去除过量的氨基酸，Fmoc等小分子物质；再加入活化剂DIC/HOBT混合物，以活化Cys N端的自由氨基，15分钟活化完毕后，加入第二个氨基酸(见SEQ ID NO：1)，依次循环，完成M2e肽上所有氨基酸的连接。合成完毕后，利用三氟乙酸切除载体Trityl chloride resin，以及M2e肽侧链上的保护基团，以得到完整的无保护基的M2e肽链。

2、M2e肽的纯化和结构确证：

合成完毕后，利用制备高效液相色谱法纯化M2e肽，固定相为0.1％的CF₃COOH/H₂O，流动相为0.1％的CF₃COOH/CH₃CN，具体的检测结果如图6-7所示。图6为M2e肽的反相高效液相色谱图，检测波长为280nm，结果显示，色谱保留时间为22.532min，色谱纯度为96.52％。图7为M2e肽的质谱分析图，质谱分子量为2670.7Da，与氨基酸序列推算的理论分子量一致。

实施例3、M2e肽-P64K偶联物的制备

1、P64K的活化：

以SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)为活化剂，将摩尔比为1∶20的P64K∶SMCC在pH 7.2的磷酸盐缓冲液里混合，室温搅拌2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯(MW：30KDa)超滤活化的P64K，以除去未反应的SMCC和过量的甘氨酸。

2、偶联物的制备与纯化

活化的P64K在已知浓度的情况下与M2e以摩尔比1∶15的比例在pH6.5，4℃的条件下反应24h，用巯基乙醇终止反应。用超滤杯(MW：30KDa)纯化制得的偶联物，除去未参加反应的M2e和巯基乙醇等。

实施例4、M2e-P64K偶联物的结构分析

SDS-PAGE检测载体蛋白P64K与M2e的偶联度，如图8所示，泳道4为标准Marker，泳道3为M2e-P64K偶联物。

利用凝胶色谱Superdex200，根据被检测分子的大小差异分离不同组分，分离条件：流速：0.5ml/min；时间：55min；检测波长：280nm；温度：室温；流动相：磷酸盐缓冲液pH6.5。得到M2e-P64K的凝胶色谱图如图9所示，红色曲线为P64K，蓝色曲线为P64K-M2e偶联物。

根据如下表的方法计算分子量P64K与M2e的偶联比例：

	分子量(KDa)	P64k(KDa)	M2(KDa)	M2偶联数量
					P64k	69.25
P64k-M2(条带1)	93.375	69.25	24.125	9.0
					P64k-M2(条带2)	189.03	138.5	50.53	9.4

由上表可以得出，P64K与M2e的偶联比例为1∶9，即1个P64K分子可以偶联9个M2e分子。

实施例5、HA2_18-72多肽的制备

1、HA2_18-72表达载体的构建

根据大肠杆菌的密码子偏性，人工合成编码成熟的HA2_18-72多肽的全长DNA序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

以上述合成的重组序列为模板，采用Primer 5.0软件设计引物，上游引物：5’GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGGTGGACGGCTGGTACGGC3’下游引物：5’GCACGATCCGCTCGAGGCAGTTGTTAAACTCGCGGCCCACGGCC3’，下划线分别为BamHI和XhoI酶切位点。采用PCR的方法，扩增HA2_18-72基因。PCR反应体系为：5μL10×PCR缓冲液，4μL 2.5mmol/L dNTP，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.5μL，两条引物终浓度为0.5μmol/L，模板0.5μL，超纯水H₂O补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min后进入PCR循环。PCR反应参数为：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；30个循环后，72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。

将PCR回收产物与pET28a载体分别进行BamHI/XhoI双酶切，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。其中，泳道1为上述步骤1的PCR产物经BamHI/XhoI双酶切的酶切产物，切胶回收酶切片段。PCR酶切产物与pET28a酶切产物按1∶3比例经T4DNA连接酶连接过夜，CaCl₂法转化Top10感受态。37℃培养12小时后，挑选单克隆，用菌落PCR法筛选阳性克隆。

2、HA2_18-72小量表达

将测序结果正确的表达载体pet28a-HA2_18-72用CaCl₂法转化Ecoli.BL21感受态细胞。如图11所示。挑选单菌落接种于5ml LB培养基中(卡那霉素60μg/ml)，37℃培养过夜。将过夜菌按1∶100接种至10ml LB培养基中(卡那霉素60μg/ml)，37℃摇菌至OD₆₀₀＝0.4-1.0，留取1ml培养物后，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导过夜。取1ml样品，离心，收集菌体，超声破碎，然后4℃，12000rpm，离心10min。10％SDS-PAGE检测上清和沉淀中HA2_18-72的表达状况。

3、HA2_18-72的纯化和检测

挑取高表达菌株单菌落至5mL LLB培养基中培养过夜作为种子。将种子按1∶100接种到2×YT培养基中培养3h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达6h后离心收集菌体。每克湿重的菌体加入5mL缓冲液A(20m mmol/L Tris，pH 6.5)重悬，超声破碎20min后离心取上清液经0.22μm过滤后进行Mono Q离子交换层析。使用缓冲液B(20mmol/L Tris，500mmol/L NaCl，pH 6.5)进行阶段洗脱，先用20％的缓冲液B洗杂蛋白，再用30％的缓冲液B洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，见图12。通过Sephadex G25将上一步纯化产物更换缓冲液至缓冲液C(5％乙腈，0.05％三氟乙酸)中进行SOURCE反相层析，使用缓冲液D(80％乙腈，0.05％三氟乙酸)进行阶段洗脱，首先用25％的缓冲液D洗杂蛋白，接着用35％的缓冲液D洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，见图13。将收集到的目的蛋白冷冻干燥后置-20℃保存。纯化产物的SDS-PAGE结果如图14所示。

使用HPLC检测目的蛋白的纯度，色谱柱为ZORBAX 300SB-C8，溶液A为含0.1％三氟乙酸的超纯水，溶液B为含0.1％三氟乙酸和90％乙腈的超纯水，洗脱的梯度过程为0至100％的溶液B用时30min。检测结果显示目的蛋白的纯度在95.7％(图15)。

实施例6、HA2_18-72-P64K偶联物的制备

1、P64K的活化：

以SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)为活化剂，将摩尔比为1∶20的P64K∶SMCC在pH 7.2的磷酸盐缓冲液里混合，室温搅拌2小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯(MW：30KDa)超滤活化的P64K，以除去未反应的SMCC和过量的甘氨酸。

2、偶联物的制备与纯化

活化的P64K在已知浓度的情况下与M2e以摩尔比1∶15的比例在pH 6.5，4℃的条件下反应过夜，用巯基乙醇终止反应。用超滤杯(MW：30KDa)纯化制得的偶联物，除去未参加反应的M2e和巯基乙醇等。

实施例7、HA2_18-72-P64K偶联物的结构表征

SDS-PAGE检测载体蛋白P64K与HA2_18-72的偶联程度，如图16所示，泳道1为分子量标准Marker，泳道4为HA2_18-72-P64K偶联物。

利用凝胶色谱Superdex200，根据被检测分子的大小差异分离不同组分。分离条件为：流速：0.5ml/min；时间：55min；检测波长：280nm；温度：室温；流动相：磷酸盐缓冲液pH6.5。检测结果如图17所示，蓝色曲线为P64K；红色曲线为HA2_18-72-P64K偶联物。

根据如下表的方法计算分子量P64K与HA2_18-72的偶联比例：

由上表可以得出，P64K与HA2_18-72的偶联比例为1∶4，即1个P64K分子可以偶联4个HA2_18-72分子。

实施例8、M2e-P64K偶联物在小鼠中的免疫原性分析

1、M2e-P64K偶联物与佐剂混合

(1)M2e-P64K偶联物与弗氏不完全佐剂混合、乳化

用一次性无菌无热原注射器取1.0mL弗氏不完全佐剂，分别与等体积的上述实施例3制备的偶联物M2e-P64K混合于样品瓶中，反复吹打20次，使之形成油包水的混合物，将反复吹打的混合物滴加到双蒸水中，乳化物呈白色液滴，且不分散。

(2)M2e-P64K偶联物与铝佐剂的混合、吸附

分别取1.0mg/mL上述实施例3制备的偶联物M2e-P64K于无菌无热原容器中，加入等体积的铝佐剂，室温搅拌1小时，即得。

2、免疫程序

取40只10周龄的BALB/C小鼠随机分为四组，分别为，免疫组1：弗氏不完全佐剂偶联物组；免疫组2：铝佐剂偶联物组；免疫组3：M2e组；免疫组4：阴性对照组(生理盐水组)。分别取50μg上述四组供试物，皮下注射免疫BALB/C小鼠，每14天免疫一次，共免疫3次。最后一次免疫14天后采集血液样本，分离血清用于抗体滴度检测。

3、抗体滴度检测

采用ELISA方法测定上述步骤2中获得的血清中特异性抗流感病毒的抗体的滴度。多孔板先用M2e包被，加入按一定比例稀释的上述步骤2获得的免疫血清，孵育2h，然后再加入酶标抗体，最后加入底物液显色，测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。见图18。

结果表明，偶联组第三次免疫后的血清滴度达到1∶128000。

表1抗体滴度测定结果

结果表明，所有佐剂组中，偶联物M2e-P64K都能诱导小鼠体内高水平的抗体，弗氏佐剂和铝佐剂在小鼠体内有明显的佐剂效应差异，而单独的M2e在小鼠体内仅有较低的免疫原性。

4、抗体亚型鉴定

多孔板先用抗原M2e包被，将免疫血清按比例稀释，加入上述已封闭的反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔同步稀释)。加入山羊抗鼠IgA\IgM\IgG、IgG1、IgG2、IgG3，反应2h，洗涤。于各反应孔中加入酶标抗体兔抗山羊IgG，37℃孵育1h，加底物液显色。在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。见图19所示。

结果表明，M2e-P64k偶联物主要诱导产生IgG1亚型抗体。

5、抗甲型H1N1流感M2抗血清与禽流感H1N1、季节性流感(H1N1、H3N2)交叉反应

用包被液将H1N1、H3N2、H5N1合成序列分别稀释至2μg/ml。分别在三列孔中加入100ul，4℃过夜；封闭1h；将免疫血清按比例稀释后，加入上述已封闭的反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤；加酶标抗体，37℃孵育1.5h，洗涤；加底物液显色，室温放置10～20min；终止反应；在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。(见图20)

结果表明，抗甲型H1N1流感M2e的抗血清与禽流感H5N1、季节性流感(H1N1、H3N2)的M2产生显著的交叉反应。

实施例10、M2e-P64K偶联物对小鼠攻击保护效果研究

将实验小鼠分为模型组、受试疫苗组、受试疫苗+弗氏佐剂组，每组10只。各实验组肌肉注射50μL/只(免疫剂量)，模型组肌肉注射生理盐水50μL/只。0，14，28天免疫。末次免疫后14天攻毒，将BALB/C小鼠麻醉后滴鼻感染10倍LD50的H1N1流感病毒，攻毒后观察14天，流感疫苗对小鼠攻击保护的效果如下表所示

表1攻击保护效果

*与模型组比较p＜0.05

疫苗+弗氏佐剂组保护率为100％，表明偶联疫苗有良好的预防效果，为广谱型流感疫苗研究奠定了基础。

实施例11、HA2_18-72-P64K偶联物的免疫原性分析

(1)HA2_18-72-P64K偶联物与弗氏不完全佐剂混合、乳化

用一次性无菌无热原注射器取1.0mL弗氏完不全佐剂，分别与等体积的上述实施例3制备的偶联物HA2_18-72-P64K混合于样品瓶中，反复吹打20次，使之形成油包水的混合物，将反复吹打的混合物滴加到双蒸水中，乳化物呈白色液滴，且不分散。

(2)HA2_18-72-P64K偶联物与铝佐剂的混合、吸附

分别取1.0mg/mL上述实施例3制备的偶联物HA2_18-72-P64K于无菌无热原容器中，加入等体积的铝佐剂，室温搅拌1小时，即得。

2、免疫程序

取40只10周龄的BALB/C小鼠随机分为四组，分别为，免疫组1：弗氏佐剂偶联物组；免疫组2：铝佐剂偶联物组；免疫组3：HA2_18-72；免疫组4：阴性对照组(生理盐水组)。分别取50μg上述四组供试物，皮下注射免疫BALB/C小鼠，每14天免疫一次，共免疫3次。最后一次免疫14天后采集血液样本，分离血清用于抗体滴度检测。

3、抗体滴度检测

采用ELISA方法测定上述步骤2中获得的血清中特异性抗流感病毒的抗体的滴度。多孔板先用HA2_18-72包被，加入按一定比例稀释的上述步骤2获得的血清，孵育2h，然后再加入酶标抗体，最后加入底物液显色，测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，见图21。

表4抗体滴度测定结果

结果表明，偶联组第三次免疫后的血清滴度达到1∶256000。佐剂组中，偶联物HA2_18-72-P64K均能诱导小鼠体内产生高水平的抗体，与铝佐剂相比，弗氏佐剂具有更明显的免疫效果；单独免疫HA2_18-72的小鼠体内仅产生极低的抗体。

Claims (8)

1.一种HA2_18-72-载体蛋白偶联物，是由禽流感H5N1病毒HA2_18-72多肽与载体蛋白化学偶联而成。

2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的HA2_18-72多肽具有SEQ ID NO：3所述的序列。

3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白的任意一种；

优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的HA2_18-72多肽与载体蛋白通过硫醚键共价连接。

5.根据权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的HA2_18-72多肽是经基因工程菌表达而来；

所述HA2_18-72多肽编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；

所述基因工程菌优选为大肠杆菌Ecoli.BL21。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的偶联物的制备方法，是先将载体蛋白用活化剂活化，再与适当比例的HA2_18-72多肽混合，反应得到偶联物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的HA2_18-72多肽与载体蛋白的比例为(10-20)∶1，优选为(12-16)∶1，更优选为15∶1；

所述偶联反应的pH值为为6.5-7.5，优选为6.8-7.2；

所述偶联反应的时间为18-36小时，优选为24小时；

所述的活化剂为SMCC，MBS，sulfo-MBS的任意一种，优选为SMCC。

8.一种广谱型流感疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1中所述的偶联物和相应的佐剂。

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