CN107488218A

CN107488218A - 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗

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Publication number: CN107488218A
Application number: CN201710824733.0A
Authority: CN
Inventors: 梁雪爽; 刘晓刚; 安文琪; 张静静; 郝楠; 郝一楠; 王满满; 师方园
Original assignee: Gene Engineering Co Ltd; Hua Lan Biological Engineering Technology (beijing) Co Ltd; Hualan Bio-Engineering Co Ltd; HUALAN BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Current assignee: Hualan Biological Vaccine Co ltd
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2037-09-13
Also published as: CN107488218B

Abstract

本发明公开了一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗，涉及生物技术领域。该多肽为如下a)、b)或c)中的任一种：a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽。其可用于预防或治疗流感病毒，可作为活性成分用于制备预防或治疗流感病毒的药品。本发明公开的免疫原性偶联物，其能够提高免疫原性以及其对构象依赖性位点的抗原的免疫效果。

Description

一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，具体而言，涉及一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗。

背景技术

甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异，甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽流感”，禽流感(Bird Flu)是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。

目前，针对甲型流感病毒的疫苗主要为合成肽疫苗(Synthetic peptidevaccine)，即用化学方法合成的病毒保护性抗原多肽疫苗，其安全性好，不会受到病原微生物的污染，且易保存和控制质量。但是合成肽疫苗一般分子量较小且只针对单一抗原位点，免疫原性较差，对序列依赖性的抗原位点免疫效果较好，对构象依赖性位点则较差。鉴于此，研发对甲型流感病毒具有较好免疫效果的疫苗具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽，其可用于预防或治疗流感病毒，此多肽是基于流感病毒M2e蛋白的高度保守性设计得到的，可作为活性成分用于制备预防或治疗流感病毒的药品。

本发明的另一目的在于提供一种免疫原性组合物，其包括上述多肽，可用于制备对流感免疫效果较佳的药品。

本发明的另一目的在于提供一种免疫原性偶联物，其采用交联剂将上述多肽偶联到载体蛋白上，增大其分子量，提高免疫原性以及其对构象依赖性位点的抗原的免疫效果。

本发明的另一目的在于提供一种流感疫苗，用于预防或治疗流感病毒。

本发明的另一目的在于提供上述多肽、免疫原性组合物、以及免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用。

本发明是这样实现的：

一种多肽，该多肽为如下a)、b)或c)中的任一种：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽。

一种免疫原性组合物，其包括上述多肽和至少一种药物载体或赋形剂。

一种免疫原性偶联物，其包括上述多肽，免疫原性偶联物是通过采用交联剂将载体蛋白与多肽交联后制得。

一种流感疫苗，其活性成分包括：上述多肽、免疫原性组合物、或免疫原性偶联物。

一种上述多肽、免疫原性组合物、或免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

甲型流感病毒保守的M2抗原，特别是M2e，在各种甲型流感病毒中具有极高的保守性，且可诱导特异性保护抗体产生。动物模型显示，针对M2e产生的IgG抗体能够降低动物模型中流感的发病率，有效地防止流感病毒引发的死亡。

鉴于此，本发明提供的多肽是基于流感病毒M2e蛋白的高度保守性设计得到的，可作为活性成分用于制备预防或治疗流感病毒的药品比如流感疫苗；

本发明提供的免疫原性偶联物，其采用交联剂将上述多肽偶联到载体蛋白上，能够增大分子量，提高免疫原性，提高其对构象依赖性位点的抗原的免疫效果；

此外，本发明提供的流感疫苗以上述免疫原性偶联物作为活性成分，其能够有效地抵抗流感病毒例如(A/FM/1/47(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Victoria/3/75(H3N2)以及A/Aichi/2/68(H3N2)等)的感染，保护个体，提高个体的生存率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的多肽M2A6的纯度检测结果；

图2为本发明实施例1中的多肽M2A6的分子量检测结果；

图3为本发明实施例2中的多肽M2A6与载体蛋白CRM197结合的SDS-PAGE检测结果图；图中，1：载体蛋白CRM197标品；2：载体蛋白CRM197与多肽M2A6结合前样品；3：免疫原CRM197-M2A6；

图4A为变性毛细管电泳Marker标准图；

图4B为载体蛋白CRM197的检测图谱线是典型的毛细管电泳图谱；

图4C为CRM197-M2A6免疫原的检测图谱；

图5为本发明实施例3中的多肽M2A6、CRM197包板检测CRM197-M2A6结合疫苗免疫血清ELISA抗体效价检测结果；

图6为本发明实施例3中的感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图；

图7为本发明实施例3中的感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化图；

图8为本发明实施例3中的感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图；

图9为本发明实施例3中的感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化图；

图10为本发明实施例3中的感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图；

图11为本发明实施例3中的感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重变化图；

图12为本发明实施例3中的感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图；

图13为本发明实施例3中的感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗进行具体说明。

甲型流感病毒为分节段的单股负链RNA病毒，基因组含8个节段，第7个节段RNA编码M1和M2蛋白。其中M2蛋白是除HA和NA以外的第3个外膜蛋白，从N端到C端依次为：含23个氨基酸的胞外区(M2e)、含19个氨基酸的疏水性跨膜区和含54个氨基酸的胞内区。天然状态下M2以同源四聚体的形式存在于流感病毒表面，每个病毒粒子仅含14～68个M2分子，但感染流感病毒的细胞表面分布着大量M2分子，具有质子通道的作用，在病毒侵染时能降低病毒颗粒内部的pH值，帮助病毒释放RNA。

多年的研究证实，甲型流感病毒保守的M2抗原，特别是M2e，在各种甲型流感病毒中具有极高的保守性，且可诱导特异性保护抗体产生。动物模型显示，针对M2e产生的IgG抗体能够降低动物模型中流感的发病率，有效地防止流感病毒引发的死亡。目前基于M2e疫苗的临床研究结果为早日研制成功防控流感大流行的广谱流感疫苗提供了大量的实验资料。

本发明的发明人通过从NCBI中共比对约13000条流感毒株的序列，设计了一条多肽M2A6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将其命名为多肽M2A6，该多肽可作为流感疫苗等药品的有效成分，对流感病毒具有广谱的免疫效果，或者将其与其他载体蛋白偶联，形成免疫原偶联组合物，提高其免疫原性。

基于此，一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽为如下a)、b)或c)中的任一种：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

该多肽M2A6可通过人工合成得到，合成方法简单、易于实现。可选的，采用多肽固相合成法合成多肽M2A6，基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，由C端向N端合成，即可得到多肽M2A6。该合成方法简单、易于实现。

另一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包括上述的多肽和至少一种药物载体或赋形剂。

该免疫原性组合物以多肽M2A6为活性成分，可用于制备对流感免疫效果较佳的药品。

另一方面，本发明提供了一种免疫原性偶联物，其包括上述多肽，该免疫原性偶联物是通过采用交联剂将载体蛋白与多肽交联后制得。

将载体蛋白与多肽M2A6偶联后得到的免疫原性偶联物，相比于单独的多肽M2A6，免疫原性提高，且其对构象依赖性位点的抗原的免疫效果较高。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述载体蛋白为白喉类毒素或白喉毒素无毒突变体CRM197；

该白喉类毒素或白喉毒素无毒突变体CRM197是如下d)或e)或f)的蛋白质：

d)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

e)在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

f)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

CRM197(cross-reacting materials 197)是一种丧失了毒性的白喉毒素突变体，与野生型白喉毒素相比，其碱基序列中由于一个碱基的替换(G→A)，从而导致了第52位氨基酸由GLY突变为GLU。由于CRM197不具有野生型白喉毒素的毒性，但具有与之相同的免疫原性。因此，CRM197可被用作免疫蛋白载体交联多肽M2A6一起得到偶联物，以提高多肽M2A6的免疫效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述多肽与所述载体蛋白的结合率为(4～6):1。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述多肽与所述载体蛋白的结合率为5:1。

其中，结合率是指每一个载体蛋白(例如CRM197)上所结合的多肽M2A6分子的个数，是通过毛细管电泳(CE)来分析计算得到的。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述交联剂选自SMCC、sulfo-SMCC、AMAS或BMPA中的至少一种。

其中，SMCC为4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；sulfo-SMCC为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；AMAS为马来酰亚胺基乙酸琥珀酰亚胺酯；BMPA为3-马来酰亚胺基丙酸。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述交联剂为SMCC。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述多肽、所述载体蛋白和所述交联剂的摩尔比为：(5～10):1:(50～80)。

当然，所述多肽、所述载体蛋白和所述交联剂的摩尔比也可以是为(7～10):1:(60～80)，或者为(8～10):1:(70～80)，或者为(9～10):1:(75～80)。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述多肽、所述载体蛋白和所述交联剂的摩尔比为：10：1：80。

本发明提供的免疫原性偶联物以白喉类毒素或白喉毒素无毒突变体CRM197为载体蛋白，通过SMCC(4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)与本发明设计合成的多肽M2A6相交联，得到免疫原CRM197-M2A6。通过实验证明：将制备的免疫原CRM197-M2A6作为流感疫苗的有效成分，并以适宜的免疫佐剂作为辅料制成的药物有很好的免疫效果。且本发明所使用的载体蛋白适合于大规模工业化生产的优点，同时交联率高，制备时间短，降低了生产成本。

另一方面，本发明提供了一种流感疫苗，其活性成分包括：上述的多肽、上述的免疫原性组合物、或上述的免疫原性偶联物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该流感疫苗还包括医药学上可接受的佐剂，活性成分与佐剂的质量比为1：10～25，或者为1：15～25；或者为1：20～25；或者为1：25。较为优选的，该佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或者CpG(即胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-寡脱氧核苷酸)中的至少一种，可选的，该佐剂为氢氧化铝，或者该佐剂为氢氧化铝和CpG。

再一方面，本发明还提供了上述多肽、免疫原性组合物、或免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用。

例如将上述免疫原性偶联物免疫动物，获得具有预防或治疗流感病毒功效的抗体，再将该抗体与医药学上可接受的辅料制成可直接供患者使用的药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

多肽M2A6的设计及合成：

一、多肽M2A6的设计

由于流感病毒M2e蛋白的高度保守性而成为通用型流感疫苗的研究靶点。本发明通过从NCBI中共比对约13000条流感毒株的序列，设计了一条多肽M2A6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将其命名为多肽M2A6。

二、多肽M2A6的合成

本发明采用多肽固相合成法合成多肽M2A6，基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，由C端向N端合成，即可得到多肽。具体步骤如下：

1、树脂选择：使用Rink-Amide MBHA树脂，取代度为0.58mmol/g，树脂用量为86mg。

2、氨基酸连接：每轮氨基酸连接的步骤和条件如下：

①脱保护：向反应器中加入3mL体积分数为20％哌啶溶液(哌啶溶液为将哌啶溶于DMF中得到的溶液)，氮气鼓泡搅拌反应2min，然后排干哌啶溶液；再次向反应器中加入3mL体积分数为20％哌啶溶液，氮气鼓泡搅拌反应2min，然后排干哌啶溶液。

②DMF洗涤：向反应器中加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min，然后排干DMF；再次加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min，然后排干DMF，重复5次。

③先加入2mL浓度为100mM Fmoc氨基酸溶液(Fmoc氨基酸溶于DMF中得到的溶液)，然后再加入2mL 100mM HCTU溶液(HCTU和N-甲基吗啉溶于DMF中得到的溶液，N-甲基吗啉浓度为200mM)，氮气鼓泡搅拌反应10min，然后排干溶液。

④DMF洗涤：向反应器中加入5mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min，然后排干DMF。

⑤先加入2mL浓度为100mM Fmoc氨基酸溶液，然后再加入2mL100mM HCTU溶液，氮气鼓泡搅拌反应10min，然后排干溶液。

⑥DMF洗涤：向反应器中加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min，然后排干DMF；再次加入3mL DMF，氮气鼓泡搅拌反应1min，然后排干DMF，重复5次。

3、切割多肽条件：多肽序列中的所有氨基酸连接完成后，按1mL/10mg树脂的比例加入切割液。切割液组成：三氟乙酸：水：苯甲醚：乙二硫醇＝95:2:2:1(体积比)，氮气鼓泡搅拌反应2h。

4、收集粗肽：切割反应结束后，收集切割液，按5毫升无水乙醚/毫升切割液的比例加入经过预冷的无水乙醚，加入无水乙醚后，摇匀，-20℃冰箱中静置8h。然后5000rpm，离心10min，倒去上清液；向沉淀中加入40mL无水乙醚，摇床上震荡洗涤2h；然后5000rpm，离心10min，倒去上清液，下层沉淀使用氮气吹干，然后37℃烘箱中干燥12h，即可获得粗肽。

5、粗肽纯化与冻干：使用安捷伦1260制备色谱仪纯化粗肽，柱子为AgilentC18column(21.2×150mm)；流动相A：含0.1％TFA的水，流动相B：含0.1％TFA的乙腈；流速10mL/min，梯度洗脱条件为乙腈浓度30min内由16％升至72％，检测器波长为214nm，280nm；收集目标多肽(保留时间约12min时的组分)。收集的目标多肽50℃减压除去乙腈后立刻-80℃冷冻，然后冷冻干燥，干燥后多肽贮存于-80℃备用。

6、多肽纯度和分子量检测：使用电喷雾质谱仪(Waters ZQ2000质谱仪)检测步骤5纯化获得的多肽的分子量，并使用Waters HPLC检测纯化后的多肽的纯度，柱子SunfireTMC18column(5μm，250×4.6mm)，流速0.5mL/min，梯度洗脱条件为乙腈浓度20min内由30％升至60％。

多肽的纯度的检测结果如图1所示。根据图1可以看出：合成的多肽M2A6的纯度为99％。

多肽分子量的检测结果如图2所示。根据图2可以看出：合成的多肽M2A6的分子量为2723。

实施例2

免疫原CRM197-M2A6的制备及其免疫效果

一、免疫原CRM197-M2A6的制备

1、溶液的制备：

(1)载体蛋白溶液的制备：以CRM197蛋白(CRM197蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示)作为载体蛋白，PBS缓冲液(20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)作为溶剂，制备载体蛋白溶液，得到浓度为5g/mL的载体蛋白溶液。

(2)SMCC溶液的制备：按80×过量计算，称取6.69mg的异型双功能交联剂SMCC溶于334μL的DMF溶液中，得到浓度为20mg/mL的SMCC溶液；

(3)目的肽溶液的制备：按10×计算，称取6.81mg的上述实施例1制备的多肽M2A6溶于2.27mL的PBS缓冲液，得到浓度为3mg/mL的目的肽溶液。

2、分别取载体蛋白溶液1mL至编号为1、2、3的2mL EP管中，再取500μL样品作为对照；

3、向编号为1、2、3的2mL EP管中分别加入50μL SMCC溶液，常温反应2h或4℃过夜；

4、利用G25一次性脱盐柱除去过量SMCC溶液，按照0.5mL/管收集洗脱液，并使用紫外分光光度计检测样品蛋白浓度，收集合并目标产物；

5收集后的样品同样对应编号为1、2、3，浓度约为1mg/mL，分别加入目的肽溶液50μL，常温反应3h或4℃过夜，得到反应液。其中，多肽M2A6、载体蛋白CRM197和SMCC的摩尔比为10:1:80。

6、将步骤5的反应液于12000rpm、4℃离心10min去除沉淀。

7、使用10kDa超滤管除去杂肽，得到免疫原CRM197-M2A6。

8、利用SDS-PAGE检测免疫原CRM197-M2A6，结果如图3所示。其中M：marker；1：载体蛋白CRM197标品，上样量1.5mg/mL×5μL＝7.5μg；2：载体蛋白CRM197与多肽M2A6结合前样品，上样量1.0mg/ml×7μL＝7μg；3：免疫原CRM197-M2A6，上样量1.5mg/mL×5μL＝7.5μg。从图中可以看出：免疫原CRM197-M2A6的大小为70-75kDa。

二、结合率的测定

通过毛细管电泳(CE)来分析计算CRM197蛋白与多肽M2A6的结合率，本发明所指的结合率是指每一个载体蛋白CRM197上所结合的M2A6分子的个数。具体检测的条件如下：30.2cm×50μm裸毛细管；进样条件为60s，5.0kV；分离条件为30min，15.0kV；检测波长为：220nm，检测温度为25℃。处理好的样品含有蛋白的最终浓度应为0.2-2mg/mL。

以载体蛋白CRM197、CRM197-M2A6免疫原和marker的电泳图谱结果如图4所示。以载体蛋白CRM197、CRM197-M2A6免疫原和marker的变性毛细管电泳(CE)图谱结果如图4所示。其中图4A峰值分别为：10kDa(a)、20kDa(b)、35kDa(c)、50kDa(d)、100kDa(e)、150kDa(f)、225kDa(f)。

从图4中可以看出：载体蛋白CRM197的检测图谱线是典型的毛细管电泳图谱(图4B)，有单体吸收峰59kDa；当CRM197作为一个载体与M2A6多肽结合形成一个新的结合蛋白即CRM197-M2A6免疫原的检测图谱如图4C所示，与单纯的载体蛋白CRM197图谱相比较，CRM197-M2A6免疫原出现了新吸收峰，CRM197-M2A6免疫原(CRM197蛋白与多肽M2A6形成的结合蛋白)比单纯一个CRM197蛋白分子其分子量增加了约13kDa，这说明一个CRM197蛋白结合了大约5个M2A6多肽分子。

实施例3

CRM197-M2A6结合疫苗的制备及其免疫效果

一、CRM197-M2A6结合疫苗的制备

用PBS缓冲液(20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)将实施例2制备得到的免疫原CRM197-M2A6进行稀释，使其浓度为250μg/mL，然后再缓慢加入氢氧化铝佐剂，确保氢氧化铝佐剂终浓度为2.5mg/mL，滴加过程中同时缓慢摇晃样品。加完氢氧化铝后，密封好样品，置于2～8℃缓慢摇晃吸附15～18h后，15～18h(16h最佳，通过对吸附时间摸索，16h免疫效果最好)。后将其稀释至抗原终浓度为100μg/mL，得到CRM197-M2A6结合疫苗。

二、抗体滴度的检测

采用腹腔注射的免疫方式注射步骤1制备的CRM197-M2A6结合疫苗。免疫剂量50μg/0.5mL/只/次。实验动物信息如表1所示。

表1、实验动物信息表

动物品系	性别	体重	周龄	数量(只)
					Balb/c小鼠	雌性	18～22g	6～8周	10

(2)免疫程序

A动物数量：使用CRM197-M2A6结合疫苗免疫Balb/c小鼠，共10只；

B免疫方式及剂量：腹腔注射，50μg/0.5mL/只/次；

C免疫程序：0d、14d两针免疫，21d采血。

(3)检测

采用酶联免疫吸附法ELISA法分别使用多肽M2A6和载体蛋白CRM197包板检测CRM197-M2A6结合疫苗免疫小鼠血清ELISA抗体效价(IgG)。

具体为：取96孔酶标板，用0.05M Tris-NaCl(pH8.5)缓冲液将抗原(CRM197/M2A6分别包板进行检测)稀释至2.5μg/mL，100μL/孔，2～8℃过夜包被。洗板2次。加封闭液200μL/孔、37℃封闭2.5h。洗板2次。加入一抗：一抗为检测用Balb/c小鼠血清，从300倍开始梯度稀释，方法如下：血清样品各150μL加入包被板的第1行中，其余所有孔均加入100μL样品稀释液，之后从第1行吸取50μL各样品从上到下进行3倍倍比梯度稀释，至最后一行混匀后吸取50μL弃去。共稀释8个梯度，37℃反应1h。洗板5次。加入二抗：HRP-IgG鼠二抗：1:10K稀释，37℃反应1h。洗板5次。显色，终止。使用酶标仪在OD450处读数并计算Cutoff值＝2.1×OD450值。结果判定：ELISA效价的计算方法：大于Cutoff值判为阳性。使用Excel及GraphPadPrism 5软件对实验结果进行分析。

(5)结果分析

结果如图5所示：从图中可以看出，使用多肽M2A6包板检测CRM197-M2A6结合疫苗免疫小鼠血清ELISA抗体效价(IgG)，其GMT为72900；使用载体蛋白CRM197包板检测CRM197-M2A6结合疫苗免疫小鼠血清ELISA抗体效价(IgG)，其GMT为16849。

结果表明：使用本发明所制备的CRM197-M2A6结合疫苗以100μg蛋白/只的剂量经腹腔免疫接种Balb/c小鼠后产生了高滴度的IgG抗体。说明本发明所制备的疫苗能够刺激机体产生较强的免疫原性。

三、攻毒保护检测

1、攻击毒株

攻击毒株1为流感毒株A/FM/1/47(H1N1)(血凝滴度1:1280)，批号：W-A1201301，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株对Balb/c小鼠的毒力：4.0lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。

攻击毒株2为流感毒株A/PR/8/34(H1N1)(血凝滴度1:16)，批号：PR/8-3，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株对Balb/c小鼠的毒力：3.0lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。

攻击毒株3为流感毒株A/Victoria/3/75(H3N2)(血凝滴度1:640)，批号：W-A3201401，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株对Balb/c小鼠的毒力：2.6lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。

攻击毒株4为流感毒株A/Aichi/2/68(H3N2)鼠肺适应株(滴度：3.8×106PFU/ml)，批号：20141222，公众可从华兰生物疫苗有限公司获得。该毒株对Balb/c小鼠的毒力：2.6lgMLD50/mL；攻毒剂量：100μL/只。

2、实验方法

①动物分组：根据免疫样品及攻击毒株不同将小鼠随机分为8组(动物分组如表3所示)，10只/组，雌性各半，实验动物信息如表2所示。免疫样品分别为CRM197-M2A6结合疫苗组和PBS溶剂组(PBS溶剂的配方：20mM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.4)；攻击毒株为上述4株病毒：攻击毒株1、攻击毒株2、攻击毒株3和攻击毒株4。

表2实验动物信息表

动物品系	性别	体重	周龄	数量(只)
					Balb/c小鼠	雌性	18～22g	6～8周	80

表3实验分组表

②疫苗免疫方式及剂量：腹腔注射，50μg/0.5mL/只/次；

③实验操作：0天、14天两针免疫，首次免疫后21天，小鼠经乙醚麻醉后鼻腔攻毒，逐日观察并记录攻毒后14天内小鼠的体重变化和死亡情况。

3、结果分析

图6和图7分别为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图6、图7可知，攻毒后，CRM197-M2A6结合疫苗组小鼠体重基本不变，且100％存活；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第9天小鼠全部死亡。

图8和图9分别为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图8、图9可知，攻毒后，CRM197-M2A6结合疫苗组小鼠体重先降低后升高，且小鼠100％存活；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第12天小鼠全部死亡。

图10和图11分别为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图10、图11可知，攻毒后，CRM197-M2A6结合疫苗组小鼠体重下降，且部分小鼠无法抵抗病毒的攻击而死亡，至攻毒后第7天，小鼠体重开始上升，攻毒观察期结束，小鼠存活率为70％；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第9天全部死亡。

图12和图13分别为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图和体重变化图。由图12、图13可知，攻毒后，CRM197-M2A6结合疫苗苗组小鼠体重稍有下降后上升，且小鼠100％存活；PBS溶剂组小鼠体重持续下降，于攻毒后第10天小鼠全部死亡。

上述结果表明，CRM197-M2A6结合疫苗以100μg蛋白/只的剂量经腹腔免疫接种Balb/c小鼠，首免后21天分别滴鼻感染A/FM/1/47(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Victoria/3/75(H3N2)和A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒，生存率分别为100％、100％、70％、100％。说明CRM197-M2A6结合疫苗可以100％保护小鼠抵抗致死量A/FM/1/47(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)三种流感病毒的感染，可以保护70％小鼠抵抗A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒的感染。

综上，本发明以白喉毒素无毒突变体CRM197为载体蛋白(SEQ ID NO.2)，通过SMCC(4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)与本发明设计合成的多肽M2A6(SEQID NO.1)相交联，得到免疫原CRM197-M2A6。通过实验证明：将制备的免疫原CRM197-M2A6作为流感疫苗的有效成分，并以适宜的免疫佐剂作为辅料制成的药物有很好的免疫效果。且本发明所使用的载体蛋白适合于大规模工业化生产的优点，同时交联率高，制备时间短，降低了生产成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华兰生物疫苗有限公司，华兰基因工程有限公司，华兰生物工程股份有限公司，华兰生物工程技术（北京）有限公司

<120> 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

1 5 10 15

Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp

20

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His

405 410 415

Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val

420 425 430

Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr

435 440 445

His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly

465 470 475 480

Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser

485 490 495

Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu

500 505 510

Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser

515 520 525

Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为如下a)、b)或c)中的任一种：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

2.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的多肽和至少一种药物载体或赋形剂。

3.一种免疫原性偶联物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的多肽，所述免疫原性偶联物是通过采用交联剂将载体蛋白与所述多肽交联后制得。

4.根据权利要求3所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述载体蛋白为白喉类毒素或白喉毒素无毒突变体CRM197；

所述白喉类毒素或所述白喉毒素无毒突变体CRM197是如下d)或e)或f)的蛋白质：

d)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

5.根据权利要求3或4所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述多肽与所述载体蛋白的结合率为(4～6):1。

6.根据权利要求3或4所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述交联剂选自SMCC、sulfo-SMCC、AMAS或BMPA中的至少一种。

7.根据权利权要求6所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述多肽、所述载体蛋白和所述交联剂的摩尔比为：(5～10):1:(50～80)。

8.一种流感疫苗，其特征在于，其活性成分包括：如权利要求1所述的多肽、如权利要求2所述的免疫原性组合物、或如权利要求3～7中任一项所述的免疫原性偶联物。

9.根据权利要求8所述的流感疫苗，其特征在于，所述流感疫苗还包括医药学上可接受的佐剂，所述活性成分与所述佐剂的质量比为1:(10～25)。

10.一种如权利要求1所述的多肽、如权利要求2所述的免疫原性组合物、或如权利要求3～7中任一项所述的免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗流感病毒的药品中的应用。