CN114057842A - 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 - Google Patents

一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114057842A
CN114057842A CN202010788915.9A CN202010788915A CN114057842A CN 114057842 A CN114057842 A CN 114057842A CN 202010788915 A CN202010788915 A CN 202010788915A CN 114057842 A CN114057842 A CN 114057842A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
vaccine
immunogenic conjugate
adjuvant
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010788915.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘刚
于文俊
张庶民
高军
周荔葆
毛昱
孙韦强
孙述学
车兴华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Original Assignee
Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd, Tsinghua University filed Critical Liaoning Chengda Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010788915.9A priority Critical patent/CN114057842A/zh
Publication of CN114057842A publication Critical patent/CN114057842A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫学技术、生物技术及生物医药领域，具体涉及一种预防新型冠状病毒肺炎COVID‑19的多肽、免疫原性偶联物及其用途。一种免疫原性偶联物，包含氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的多肽，用于制备预防COVID‑19的疫苗。所述免疫原性偶联物是基于病原体抗原基因中已知或者预测的某段抗原表位氨基酸序列合成目标多肽，将合成的目标多肽通过与载体蛋白结合制成多肽偶联物，再加入佐剂制备成合成肽疫苗。该疫苗相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，能够快速应对病毒变异；降低疫苗生产所需的场地要求，易于大规模批量生产；减少研发成本及研发周期；安全、无毒、稳定；由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。

Description

一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽、免疫原性偶联 物及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学技术、生物技术及生物医药领域，具体涉及一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途。
背景技术
冠状病毒是一种带有RNA的正向包膜病毒，其基因组大小约为26～32kb，是已知基因组最大的RNA病毒。基因组RNA和磷酸化核衣壳(N)蛋白被埋在磷脂双层中并被刺突糖蛋白三聚体(S)覆盖，膜(M)蛋白(III型跨膜糖蛋白)和包膜(E)蛋白位于病毒包膜的S蛋白之间。冠状病毒具有多种宿主，包括禽类和哺乳动物，特别是蝙蝠。冠状病毒是在自然界中广泛存在的一类病毒，可引起包括呼吸道、消化道及神经系统在内的多系统疾病，高致病性冠状病毒感染已成为近10年来广受关注的公共卫生问题。2002年11月，首例严重急性呼吸系统综合症(SARS)发生在中国佛山。2012年，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)是21世纪发现的第二种高致病性冠状病毒。MERS-CoV的死亡率很高，多达40％的患者死亡。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)于2019年12月首次发现，其感染导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在影响全球上百万的患者。
COVID-19患者会出现不同程度的症状，从发烧或轻度咳嗽到肺炎，更严重者甚至死亡。目前COVID-19的致死率约为2％至4％，尽管死亡率低于SARS和MERS，但新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有潜伏期长、传染性强和重症率较高的特点，与引发非典型肺炎的SARS病毒不同，部分病例潜伏期具有传染性，另有一些病毒携带者没有表现出任何明显症状，这增加了疫情的防控难度。因此，快速研制出能够提升群体免疫水平并阻断病毒传播的预防疫苗已成为全球当前最为迫切的重大需求。
自18世纪末期人类首次应用生物制品牛痘疫苗以来，疫苗已在消除多种传染病中发挥了不可替代的作用。在COVID-19被确认后，国内外多家机构开展了COVID-19疫苗的研究，目前有至少5条技术路线在同步开展，包括核酸疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗等，但鉴于疫苗的自身特点，疫苗要严格按照国家规定的研发生产流程进行，在动物实验通过后，还必须完成中试研究、临床申报及I～III期的临床试验研究，获得批准后才有可能正式进入生产阶段。SARS疫苗被搁置至今，正是因为 II期临床试验后，疫情已完全控制，无法再进行Ⅲ期试验。目前对COVID-19疫苗的后期临床实试验设计还不明确，需要制定其多国参与方案，以确定候选疫苗的安全有效。因此，全部在研疫苗尚未得到上市许可。
SARS-CoV-2的核衣壳由核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)包裹单股正链RNA形成；外有包膜，嵌有三种糖蛋白：刺突蛋白(spikeprotein，S)、包膜蛋白(envelopeprotein，E)和膜蛋白(membrane protein，M)。S蛋白位于病毒最外层，在膜上规则排列成冠状结构，参与病毒与宿主细胞表面的病毒受体结合并介导病毒通过膜融合进入细胞的过程，在诱导宿主产生中和抗体过程中起重要作用。目前国内外COVID-19疫苗的研发均是以S蛋白作为首要目标抗原，但有报道称同属冠状病毒的SARS-CoV的S蛋白也可能诱发抗体依赖性免疫增强反应(ADE)，因此筛选S蛋白中特异性片段(即多肽)作为抗原，可以有效的预防COVID-19同时避免潜在ADE的发生。
采用组合化学技术对蛋白抗原决定簇谱进行了研究(“交叉重叠”多肽化合物)，快速发现了最小的抗原决定簇，并构建了决定簇谱。该方法的特点是以一定数目的氨基酸残基肽(比如1到50个氨基酸残基)合成“交叉重叠”片段，将蛋白序列通过逐个错位(或者间隔错位，包括从2到合成肽片段的氨基酸总位数)的方式全部合成出来，然后进行抗原- 抗体反应(或者其它生物学目的的筛选反应等，如筛选发现T-细胞免疫抗原决定簇，以及 SARS-CoV的受体配基等)，一次便可以得到所有最短的多肽抗原决定簇，进而绘成抗原决定簇谱。再将这些活性短肽经过适当延长、或者有序线性连接后进行抗SARS-CoV人阳性血清筛选反应，从而确认了可用于制备SARS-CoV诊断试剂、药物以及疫苗的B-细胞多肽化合物以及它们的图谱。SARS-CoV-2与SARS-CoV有很高的同源性。采用构建SARS-CoV 的“交叉重叠”化学库筛选得到抗原决定簇，将其置换为同位置的SARS-CoV-2序列是快速发现新型冠状病毒抗原的有效途径。
传统疫苗是将病原体灭活或减毒制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。相对于传统的弱毒苗和灭活苗及其他几种新型的疫苗，合成肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。合成肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或者预测的某段抗原表位氨基酸序列，通过化学技术合成具有抗原性的短肽，与载体结合后加入佐剂所制成的疫苗，是最为理想和安全的新型疫苗，也是目前在研的用于预防、控制感染性疾病和治疗恶性肿瘤的新型疫苗。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途。本发明基于病原体抗原基因中已知或者预测的某段抗原表位氨基酸序列合成目标多肽，将合成的目标多肽通过与载体蛋白结合制备成多肽偶联物，再加入佐剂制备成合成肽疫苗，用于COVID-19病毒的预防，相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，本发明提供的合成肽类疫苗能够快速应对病毒变异；降低疫苗生产所需的场地要求，易于大规模批量生产；减少研发成本及研发周期；安全、无毒、稳定；由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽，该多肽的氨基酸序列选自以下任意一种。
1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的多肽。
2)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有85％以上相同氨基酸序列的多肽。
3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到具有相同功能的多肽。
一种免疫原性组合物，包含上述所述的多肽和至少一种药物载体或赋形剂。
一种免疫原性偶联物，包含上述所述的多肽，所述免疫原性偶联物是通过多肽偶联的方法将多肽与载体蛋白交联制得。
进一步地，所述的载体蛋白为白喉无毒突变体CRM197、破伤风类毒素TT、白喉类毒素DT或脑膜炎球菌外膜蛋白M-OMP中的任意一种。
进一步地，所述多肽与所述载体蛋白的摩尔比为：1：1-1：30。
进一步地，所述多肽与所述载体蛋白的结合率为40％以上。
一种用于预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的疫苗，其活性成分包括上述所述的多肽、所述的免疫原性组合物、或任意一项所述的免疫原性偶联物。
进一步地，所述疫苗还包含药学上可接受的佐剂。
进一步地，所述佐剂为氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、单磷酰脂质A (MPL)或寡核苷酸(CpG)的一种或多种组合。
进一步地，为给予人类，佐剂含量为每剂量1μg-1000μg，优选每剂量10μg-500μ g，更优选每剂量10μg-200μg，更优选每剂量10-100μg，最优选每剂量10-50μg。
进一步地，所述疫苗为任何药学上可接受的剂型，包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、微针注射的给药方式。
进一步地，所述疫苗为任何药学上可接受的剂量。
所述疫苗的制备方法，具体包括以下步骤。
步骤1、使用全自动微波多肽合成仪，采用Fmoc固相合成法，添加固相载体、不同的氨基酸、脱除剂和多肽缩合试剂等，进行目标多肽的全自动合成。
步骤2、将步骤1合成的多肽通过Linker分别与药学上可接受的载体蛋白(包括白喉无毒突变体CRM197、破伤风类毒素TT、白喉类毒素DT或脑膜炎球菌外膜蛋白中的任意一种)进行共缀结合，形成免疫原性偶联物。
步骤3、将步骤2制备免疫原性偶联物与药学上可接受的佐剂混合制备成疫苗。
进一步地，所述步骤3具体方法是取免疫原性偶联物与佐剂、PBS溶液混合，室温摇床1小时，30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、佐剂0.5mg/ml，即为最终样品；或者首先将免疫原性偶联物吸附到铝佐剂上，室温摇床1小时，30RPM，随后加入MPL或者CpG佐剂，室温摇床1小时，30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、铝佐剂 0.5mg/ml、MPL或者CpG含量为0.5mg/ml，即为最终样品。
一种如上述所述的多肽、上述所述的免疫原性组合物、或如上述中任一项所述的免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗新型冠状病毒肺炎COVID-19的药物中的应用。
所述药物为任何药学上可接受的剂型。
所述药物为任何药学上可接受的剂量。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明提供的合成多肽是基于COVID-19病毒S蛋白序列中筛选出具有特异性抗原性的序列，将其合成目标多肽，降低疫苗生产所需的场地要求，易于大规模批量生产；将合成目标多肽通过与载体蛋白结合制备成多肽偶联物，加入佐剂制备成为合成肽疫苗，用于COVID-19病毒的预防，相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，合成肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。
本发明提供的多肽基于COVID-19病毒S蛋白序列中筛选出具有特异性抗原性的序列，并在体外合成短肽，将多种短肽组合，与全序列相比可以降低副作用发生风险；现有报道表明COVID-19病毒已发生变异，与本发明提供的多肽序列对比，未发生所有序列同时变异现象，有效的降低变异导致的抗原性损失，同时可以快速筛选出序列变异部分，增加新的短肽，合成制备新疫苗，能够快速应对病毒变异，减少研发成本及研发周期。
本发明提供预防COVID-19的疫苗，采用多肽与蛋白载体结合技术，增强了人体免疫反应，放大多肽抗原性，增加中和抗体产生，增强疫苗效力，同时采用不同佐剂及不同给药方式，具有普遍适用性，适应多年龄段人群使用。
附图说明
图1是多肽与不同载体和不同佐剂组合后抗体水平对比。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1目标多肽(氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的多肽)的合成方法。
1、采用常规的固相合成多肽的方法，制备了氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的多肽，具体步骤如下。
(1)脱Fmoc保护。
将市售的Rink Amide AM resin装入一个有过滤器且耐有机溶剂的反应管中，并用一个耐有机溶剂的盖子盖紧。用DMF(二甲基甲酰胺)洗涤1分钟后，加入过量的20％哌啶/DMF(体积比)溶液，盖紧后轻轻摇晃反应管，使之混合均匀并保持脱除Fmoc保护15分钟。抽干后再用DMF洗涤三次。
(2)肽键缩合。
将经过预活化(预活化2-3分钟后)的3倍树脂氨基摩尔量的Fmoc保护的氨基酸、 3倍树脂氨基摩尔等量的活化剂HBTU、以及6倍树脂氨基摩尔等量的DIPEA(N，N-二异丙基乙基胺)加入反应管中，使用DMF作为溶剂，并保证以上的试剂完全溶解，可完全覆盖树脂。每隔2-3分钟摇晃混匀树脂一次，反应20-30分钟。
然后，室温下加入50倍摩尔过量的乙酸酐DMF溶液后10分钟抽干，再在室温下加入过量的20％哌啶/DMF(体积比)溶液反应30分钟。过滤掉溶液，树脂用DMF洗涤5 次。
以上步骤循环反复执行，直到拟合成多肽的全部Fmoc保护氨基酸按线性方式连接到树脂上。
(3)多肽裂解。
多肽裂解液选用强酸处理，比如TFA(三氟乙酸)。室温下用TFA\水\EDT二巯基乙醇\苯酚(体积比：92.5：2.5：2.5：2.5)处理树脂2小时。然后仔细收集裂解液到一个玻璃收集器中，并加入用冰预冷的乙醚，收集沉淀多肽，并继续用冷乙醚洗涤5-6次，得到粗品肽。
(4)多肽纯化。
粗品肽经过HPLC(高效液相色谱)纯化，收集，冻干，最终再经HPLC检验纯度(214nm波长)大于85％及质谱检验正确的分子量。
2.鉴定结果。
SEQ ID NO.1所示的合成肽的纯度为90％，及分子量为852.96。该多肽经特异性抗原性实验测定具有较强的抗原性强，可在人体内诱导出中和抗体。
实施例2SEQ ID NO.1所示的合成肽免疫原性偶联物的制备方法。
实施例1制备的合成肽通过Linker分别与CRM197，TT，DT，细菌外膜蛋白形成共缀多肽的结合方法。
TT破伤风毒素蛋白、破伤风毒素载体蛋白TT，可以通过破伤风杆菌，经过发酵，裂解，离心，层析纯化获得。
DT白喉毒素蛋白、白喉毒素载体蛋白DT，可以通过白喉杆菌，经过发酵，裂解，离心，层析纯化获得。
CRM197重组白喉毒素蛋白，CRM197是基因序列重新构建的白喉杆菌，经过发酵，裂解，离心，层析纯化获得。
脑膜炎球菌外膜蛋白：采用脑膜炎球菌经过发酵，裂解，离心，层析纯化获得。
1.合成肽通过SMCC Linker或DSAP Linker与CRM197结合成共缀多肽。
CRM197蛋白用含有2mM的EDTA的PBS溶液配制成浓度为1mg/ml溶液。取需要量的CRM197溶液，按照摩尔比1:2-1:40加入Sulfo-SMCC(10mg/ml)，室温反应1小时，反应液用超滤浓缩管于4℃，3500rpm离心浓缩。体积浓缩至反应液的1/10后加入PBS至原反应液体积，继续离心浓缩，连续离心浓缩5次以去除游离Sulfo-SMCC。最终获得的 CRM197-SMCC储液浓度为10mg/ml。称取需要量的合成肽(实施例1)，用PBS或含有 10％DMSO PBS溶液溶解，按照摩尔比15:1-1:1加入CRM197-SMCC储液，可添加PBS至适宜的反应体积，室温反应1h，SDS-PAGE检测共缀情况，蛋白上样量2μg，SDS-PAGE 检测电泳图。
称取需要量的合成肽(实施例1)，用DMSO溶解，按照摩尔比1:2-1:30加入DSAP(10mg/ml DMSO溶液)混合，加入三乙胺(30倍摩尔比)，室温反应过夜，加入500μl NaPi(PH7.4，0.1M)，用1ml氯仿提取三次，离心后将水相加入到CRM197(2mg/ml NaPi(PH7.4，0.1M))溶液中，合成肽与CRM197蛋白的摩尔比为10:1-1:1，室温反应24小时，SDS-PAGE检测共缀情况。
2.合成肽通过SMCC Linker或DSAP Linker与TT蛋白结合成共缀多肽。
TT蛋白用含有2mM的EDTA的PBS溶液配制成浓度为1mg/ml溶液。取需要量的 TT溶液，按照摩尔比1:2-1:40加入Sulfo-SMCC(10mg/ml)，室温反应1小时，反应液用超滤浓缩管于4℃，3500rpm离心浓缩。体积浓缩至反应液的1/10后加入PBS至原反应液体积，继续离心浓缩，连续离心浓缩5次以去除游离Sulfo-SMCC。最终获得的TT-SMCC储液浓度为10mg/ml。称取需要量的合成肽(实施例1)，用PBS或含有10％DMSO PBS溶液溶解，按照摩尔比15:1-1:1加入TT-SMCC储液，可添加PBS至适宜的反应体积，室温反应 1h，SDS-PAGE检测共缀情况。
称取需要量的合成肽(实施例1)，用DMSO溶解，按照摩尔比1:2-1:30加入DSAP(10mg/ml DMSO溶液)混合，加入三乙胺(30倍摩尔比)，室温反应过夜，加入500μl NaPi(PH7.4，0.1M)，用1ml氯仿提取三次，离心后将水相加入到TT(2mg/ml NaPi(PH7.4， 0.1M))溶液中，合成肽与TT蛋白的摩尔比为10:1-1:1，室温反应24小时，SDS-PAGE检测共缀情况。
3.合成肽通过SMCC Linker或DSAP Linker与DT结合成共缀多肽。
DT蛋白用含有2mM的EDTA的PBS溶液配制成浓度为1mg/ml溶液。取需要量的 DT溶液，按照摩尔比1:2-1:40加入Sulfo-SMCC(10mg/ml)，室温反应1小时，反应液用超滤浓缩管于4℃，3500rpm离心浓缩。体积浓缩至反应液的1/10后加入PBS至原反应液体积，继续离心浓缩，连续离心浓缩5次以去除游离Sulfo-SMCC。最终获得的DT-SMCC储液浓度为10mg/ml。称取需要量的合成肽(实施例1)，用PBS或含有10％DMSO PBS溶液溶解，按照摩尔比15:1-1:1加入DT-SMCC储液，可添加PBS至适宜的反应体积，室温反应 1h，SDS-PAGE检测共缀情况。
称取需要量的合成肽(实施例1)，用DMSO溶解，按照摩尔比1:2-1:30加入DSAP(10mg/ml DMSO溶液)混合，加入三乙胺(30倍摩尔比)，室温反应过夜，加入500μl NaPi(PH7.4，0.1M)，用1ml氯仿提取三次，离心后将水相加入到DT(2mg/ml NaPi(PH7.4，0.1M))溶液中，合成肽与DT蛋白的摩尔比为10:1-1:1，室温反应24小时， SDS-PAGE检测共缀情况。
4.合成肽通过SMCC Linker或DSAP Linker与M-OMP结合成共缀多肽。
M-OMP蛋白用含有2mM的EDTA的PBS溶液配制成浓度为1mg/ml溶液。取需要量的M-OMP溶液，按照摩尔比1:2-1:40加入Sulfo-SMCC(10mg/ml)，室温反应1小时，反应液用超滤浓缩管于4℃，3500rpm离心浓缩。体积浓缩至反应液的1/10后加入PBS至原反应液体积，继续离心浓缩，连续离心浓缩5次以去除游离Sulfo-SMCC。最终获得的M- OMP-SMCC储液浓度为10mg/ml。称取需要量的合成肽(实施例1)，用PBS或含有 10％DMSO PBS溶液溶解，按照摩尔比15:1-1:1加入M-OMP-SMCC储液，可添加PBS至适宜的反应体积，室温反应1h，SDS-PAGE检测共缀情况。
称取需要量的合成肽(实施例1)，用DMSO溶解，按照摩尔比1:2-1:30加入DSAP(10mg/ml DMSO溶液)混合，加入三乙胺(30倍摩尔比)，室温反应过夜，加入500μl NaPi(PH7.4，0.1M)，用1ml氯仿提取三次，离心后将水相加入到M-OMP(2mg/ml NaPi(PH7.4，0.1M))溶液中，合成肽与M-OMP蛋白的摩尔比为10:1-1:1，室温反应24小时，SDS-PAGE检测共缀情况。
实施例3疫苗的制备及免疫效果。
一、疫苗制备。
1、材料。
多肽蛋白：氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的多肽。
载体蛋白：白喉毒素无突变体(CRM197)、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、脑膜炎球菌外膜蛋白(Meningococcus OMP)。
佐剂：氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、MPL、CpG。
2、制备方法。
取免疫原性偶联物与佐剂、PBS溶液混合，室温摇床1小时，30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、佐剂0.5mg/ml，即为最终样品；或者首先将免疫原性偶联物吸附到铝佐剂上，室温摇床1小时，30RPM，随后加入MPL或者CpG佐剂，室温摇床1小时， 30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、铝佐剂0.5mg/ml、MPL或者CpG含量为 0.5mg/ml，即为最终样品。
表1.多肽偶联物与佐剂交叉组合方案。
Figure RE-RE-GDA0002700791410000091
注：组合序号命名规则：“载体首字母”+“佐剂编号”。
二、免疫效果实验。
将表1中的疫苗免疫小鼠进行免疫原性的研究，将体重为16-18g的健康BALB/c小鼠随机分组，每组8-10只小鼠；将表1中的待测样品对小鼠后肢进行肌肉注射，于第0 天、第14天、第21天各肌肉注射1次，每次给药体积为100uL/只，分别于第0天、第21 天注射前及第28天各采血1次，分离血清，将血清20倍稀释后，采用酶联免疫吸附 (ELISA)方法，测定第0天、第21天和第28天血清抗体水平，具体操作为。
(1)包被液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)将多肽储备液稀释为终浓度为5μ g/ml的工作液(DMSO含量不高于0.05％)，充分混匀后按100μl/孔加入酶标板，贴上封片纸，2～8℃过夜包被。
(2)吸掉上清，PBST洗5遍，加入100ul含1％BSA的PBS室温封闭1h。
(3)PBST洗5次。
(4)加样：加入100ul稀释后的血清样品，室温孵育2h，用PBST洗5次。
(5)加酶标抗体：加入100ul稀释后山羊抗小鼠IgG HRP酶标二抗，室温孵育1h。
(6)PBST洗5次。
(7)加底物液显色：加入100ul TMB显色。
(8)终止反应：加入50ul 1N硫酸终止反应。
(9)结果判定：测OD450值，结果见表2。
表2.多肽与不同载体和不同佐剂组合后抗体水平对比。
Figure RE-RE-GDA0002700791410000101
由表2所示，载体蛋白可以显著增加多肽的抗体滴度；多肽结合载体蛋白后，抗体滴度均能达到0.8以上，随着剂量增加，抗体滴度随之增加。无载体组在加入佐剂后抗体滴度均不大于0.2，显著低于有载体组，说明多肽与佐剂结合不能产生预期免疫原性；相同的剂量，相同的载体蛋白，添加佐剂能显著增加抗体滴度，不同佐剂之间没有显著差异。
序列表
<110> 清华大学、辽宁成大生物股份有限公司
<120> 一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys
1 5

Claims (17)

1.一种预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列选自以下任意一种：
1）氨基酸序列是SEQ ID NO .1所示的多肽；
2）与SEQ ID NO .1所示氨基酸序列具有85%以上相同氨基酸序列的多肽；
3）将SEQ ID NO .1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的多肽。
2.一种免疫原性组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的多肽和至少一种药物载体或赋形剂。
3.一种免疫原性偶联物，其特征在于，包含如权利要求1所述的多肽，所述免疫原性偶联物是通过多肽偶联的方法将权利要求1所述的多肽与载体蛋白交联制得。
4.如权利要求3所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白为白喉无毒突变体CRM197、破伤风类毒素TT、白喉类毒素DT或脑膜炎球菌外膜蛋白中的任意一种。
5.如权利要求3所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述多肽与所述载体蛋白的摩尔比为：1：1-1：30。
6.如权利要求3所述的免疫原性偶联物，其特征在于，所述多肽与所述载体蛋白的结合率为40%以上。
7.一种用于预防新型冠状病毒肺炎COVID-19的疫苗，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的免疫原性组合物、或权利要求3-6任意一项所述的免疫原性偶联物。
8.如权利7所述的疫苗，其特征在于，还包含药学上可接受的佐剂。
9.如权利7所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝Al(OH)3、磷酸铝AlPO4、单磷酰脂质A MPL或寡核苷酸CpG的一种或多种组合。
10.如权利7所述的疫苗，其特征在于，佐剂为给予人类，其含量为每剂量1μg-1000μg，优选每剂量10μg-500μg，更优选每剂量10μg-200μg，更优选每剂量10-100μg，最优选每剂量10-50μg。
11.如权利7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为任何药学上可接受的的剂型，包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、微针注射的给药方式。
12.如权利7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为任何药学上可接受的的剂量。
13.如权利要求7-12任一项所述疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、使用全自动微波多肽合成仪，采用Fmoc固相合成法，添加固相载体、不同的氨基酸、脱除剂和多肽缩合试剂进行目标多肽的全自动合成，
步骤2、将步骤1合成的多肽通过Linker分别与药学上可接受的载体蛋白进行共缀结合，形成免疫原性偶联物；
步骤3、将步骤2制备免疫原性偶联物与药学上可接受的佐剂混合制备成疫苗。
14.如权利要求13所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体方法是取免疫原性偶联物与佐剂、PBS溶液混合，室温摇床1小时，30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、佐剂0.5mg/ml，即为最终样品；或者首先将免疫原性偶联物吸附到铝佐剂上，室温摇床1小时，30RPM，随后加入MPL或者CpG佐剂，室温摇床1小时，30RPM，所得终浓度含多肽抗原100μg/ml、铝佐剂0.5mg/ml、MPL或者CpG含量为0.5mg/ml，即为最终样品。
15.一种如权利要求1所述的多肽、如权利要求2所述的免疫原性组合物、或如权利要求3-6任一项所述的免疫原性偶联物在制备用于预防或治疗新型冠状病毒肺炎COVID-19的药物中的应用。
16.如权利要求15所述的药物，其特征在于，所述药物为任何药学上可接受的剂型。
17.如权利要求15所述的药物，其特征在于，所述药物为任何药学上可接受的剂量。
CN202010788915.9A 2020-08-07 2020-08-07 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 Pending CN114057842A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010788915.9A CN114057842A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010788915.9A CN114057842A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114057842A true CN114057842A (zh) 2022-02-18

Family

ID=80232614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010788915.9A Pending CN114057842A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114057842A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010034A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
CN103724406A (zh) * 2013-11-20 2014-04-16 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种具有中和活性的MERS-CoV合成肽疫苗及其应用
CN107488218A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010034A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
CN103724406A (zh) * 2013-11-20 2014-04-16 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种具有中和活性的MERS-CoV合成肽疫苗及其应用
CN107488218A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIDI WANG等: "Immunodominant SARS Coronavirus Epitopes in Humans Elicited both Enhancing and Neutralizing Effects on Infection in Non-human Primates", 《ACS INFECT DIS. 》, vol. 2, no. 5, pages 361 - 376, XP055814678, DOI: 10.1021/acsinfecdis.6b00006 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8715695B2 (en) Polypeptide fragments of the hepatitis E virus, the vaccine composition comprising said fragments and the diagnostic kits
EA027069B1 (ru) Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а
HU211548A9 (en) Expression of specific immunogens using viral antigens
JP2003529319A (ja) ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法
CN113769080B (zh) 多肽免疫偶联物及其应用
CN104507496B (zh) 包含与crm197载体蛋白偶联的hiv gp41肽的免疫原性化合物
CN114057850B (zh) 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
RU2181379C2 (ru) Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства
EP0120906B1 (en) Polypeptides useful in vaccination against enteroviruses
CN114057847B (zh) 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057846B (zh) 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
Ogrina et al. Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens
CN114057848B (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057851B (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057843B (zh) 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057842A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114053400B (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的疫苗及其制备方法
CN114057853A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057844A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
WO2023060483A1 (zh) 多肽-rbd免疫偶联物及其用途
JPH07503133A (ja) 風疹ワクチン用合成ペプチド
CN114057845A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057849A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057852B (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽及其用途
Rojo Dendritic compounds as immune response modulators. New approaches for vaccine development

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination