EA027069B1 - Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а - Google Patents

Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а Download PDF

Info

Publication number
EA027069B1
EA027069B1 EA201071087A EA201071087A EA027069B1 EA 027069 B1 EA027069 B1 EA 027069B1 EA 201071087 A EA201071087 A EA 201071087A EA 201071087 A EA201071087 A EA 201071087A EA 027069 B1 EA027069 B1 EA 027069B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
virus
influenza
zeg
monoclonal antibody
variable domain
Prior art date
Application number
EA201071087A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201071087A1 (ru
Inventor
Роберто Буриони
Массимо Клементи
Original Assignee
Помона Ричерка С.Р.Л.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40293277&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA027069(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Помона Ричерка С.Р.Л. filed Critical Помона Ричерка С.Р.Л.
Publication of EA201071087A1 publication Critical patent/EA201071087A1/ru
Publication of EA027069B1 publication Critical patent/EA027069B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A61K47/6841—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses the antibody targeting a RNA virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4216—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-viral Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

Описываются моноклональные антитела, направленные против вируса гриппа А, которые обладают свойством связываться с множеством подтипов вируса гриппа А. Один предпочтительный вариант осуществления представляет собой антитело, обозначенное Fab28, которое демонстрирует нейтрализующую активность против множества продтипов вируса гриппа А. Также описываются антиидиотипические антитела, направленные против моноклональных антител по изобретению, иммуногенные или вакцинные композиции, содержащие моноклональные антитела по изобретению, а также терапевтические, профилактические и диагностические применения моноклональных антител по изобретению. Моноклональные антитела по изобретению также могут быть использованы для тестирования препаратов антител, используемых в качестве вакцин.

Description

Изобретение в основном относится к области иммунологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, направленным против НА (гемагглютинина) антигена вируса гриппа А.
Предпосылки к созданию изобретения
Ежегодные эпидемии вируса гриппа являются важной причиной заболеваемости и смертности по всему миру. В Соединенных Штатах Америки по оценкам более 200000 людей госпитализируют каждый год в связи с синдромами, связанными с вирусами гриппа, примерно с 40000 смертельных случаев более или менее непосредственно связанных с этим (Тйотркоп е! а1., ΙΑΜΑ, 2003, 289:179-186). Помимо этих цифр, следует также рассматривать случаи, в экспоненциально более высоких числах, инфицированных пациентов, которые остаются дома в течение более или менее длительных периодов, с неизбежными экономическими последствиями вследствие потери рабочих дней. В недавней работе (Мойпап е! а1. Уасеше, 2007, 25: 5086-5096) была оценена медицинская стоимость непосредственно относящаяся к ежегодным эпидемиям в 10,4 миллиардов долларов США в год, к которым 16,3 миллиарда долларов США следует добавить за потерю трудовых доходов вследствие отсутствия на работе. Если в расчетах также учитывать другие группы данных, такие как монетизацию экономических потерь, связанных со смертью инфицированных пациентов, количество вырастает до невероятной цифры 87,1 миллиардов долларов США. Эти экономические данные связанные с ежегодными эпидемиями, вместе со страшной пандемией, которая могла бы произойти в любой момент в ближайшем будущем вследствие появления вирусов гриппа, новых для человека, объясняют большой интерес к поиску эффективных стратегий для сдерживания распространения этих вирусов.
В настоящее время единственным доступным инструментом для встречи ежегодных эпидемий гриппа в какой-то мере является инактивированная трехвалентная вакцина, содержащая выделенные вирусные антигены, которые предположительно будут ответственны за эпидемию следующего сезона гриппа. Этот тип прогнозирования, основанный на эпидемиологических данных, связанных с ранним выделением в некоторых часовых географических областях, не всегда получается правильным. Таким образом, существует совсем не малый риск, который имеет место год за годом, что трехвалентная вакцина, разработанная для определенного сезона гриппа, может оказаться, по существу, неэффективной.
В этом случае, а также в случае новой пандемии, единственной доступной профилактической/терапевтической помощью было бы прибегнуть к двум доступным классам противовирусных средств: ингибиторам белка М2 (амантадин и ремантадин), и ингибиторам нейраминидазы (оселтамивир и занамивир). Однако и в этой ситуации тоже уже можно ожидать ряд проблем, касающихся как необходимости принимать противовирусные средства на очень ранней стадии инфекции, так и быстрому появлению, которое уже, однако, произошло, резистентных изолятов вируса.
Альтернативная эффективная стратегия могла бы быть основана на препаратах нейтрализующих антител, направленных против важнейших вирусных белков, способных распознавать части таких белков, которые являются общими среди различных изолятов вирусов гриппа.
Для лучшего понимания возможностей подхода, основанного на пассивном введении антител, полезно коротко упомянуть об основных структурных особенностях вирусов гриппа. Вирусы гриппа принадлежат семейству Оййотухоутйае, и характеризуются наличием оболочки, происходящей из мембран инфицированных клеток, на которой присутствует приблизительно 500 шипов, также называемых выростами. Такие выросты состоят из тримеров и тетрамеров из двух важных поверхностных вирусных белков: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (ΝΑ). Интегральный мембранный белок (М2) также обнаружен на поверхности оболочки, который присутствует в гораздо меньших количествах по сравнению с гемагглютинином и нейраминидазой, и также организован в тетрамеры.
Вирус гриппа дополнительно характеризуется наличием, в пределах сердцевины, сегментированного генома, состоящего из 8 односпиральных фрагментов РНК. Исходя из особенностей некоторых белков в вирионе (ΝΡ и М1), можно распознать три типа вируса гриппа: тип А, тип В и тип С.
Вирусы типа А и типа В ответственны за ежегодные эпидемии. Зато вирусы типа С ответственны за менее тяжелые синдромы.
Различные подтипы вирусов в пределах типа А (только те, которые ответственны за пандемии и способны вызывать наиболее тяжелые синдромы, даже во время ежегодных эпидемий), также распознаются на основе антигенных особенностей гемагглютинина и нейраминидазы. Подтипы, которые поражали людей в течение последнего времени, представляют собой подтипы Η1Ν1 и Η3Ν2 (все еще циркулирующие в настоящее время и содержащиеся в вакцинных препаратах), а также подтип Η2Ν2, более не циркулирующий с 1968 и ответственный за так называемый азиатский грипп в 1957. Другие подтипы спорадически поражали людей (Η9Ν2, Η7Ν7, и такой страшный в последнее время подтип Η5Ν1), но их эффективного распространения не произошло, и они не вытеснили циркулирующие подтипы.
Роль поверхностных белков является важнейшей в репликационном цикле вирусов. В частности, гемагглютинин представляет собой белок, который позволяет вирусу распознавать сиаловую кислоту, находящуюся на поверхности некоторых клеток, и инфицировать их. Зато, нейраминидаза действует в конце репликационного цикла вирусов, то есть во время высвобождения новых вирусных частиц из инфицированных клеток. Ее функцией является содействие высвобождению гемагглютинина вновь образо- 1 027069 ванных вирионов из сиаловой кислоты, находящейся на поверхности клетки, которая продуцировала их. Ключевая роль, которую играют эти два белка, а также их проявление на поверхности вируса, объясняет, почему они представляют основную мишень для иммунного ответа, и почему они подвержены высокой скорости мутации. В действительности, ежегодные эпидемии вызваны вирусами, которые более или менее отличаются от таковых предыдущих лет, и, следовательно, более или менее эффективно способны ускользать от иммунного ответа, который они стимулировали. Иными словами, прогрессивное накопление точковых мутаций в гемагглютинине (главным образом) и нейраминидазе (вторично) делает защитные антитела, продуцированные в течение предыдущей эпидемии, в конечном счете все более неэффективными.
Основную защитную роль в иммунном ответе против гриппа, играет гуморальный компонент. Антитела проявляют свою защитную роль главным образом, нарушая связывание гемагглютинина с сиаловой кислотой, тем самым, предотвращая инфицирование клеток. Такое селективное давление определяет высокую скорость мутации гемагглютинина. Исследования последовательности, выполненные на подтипе гемагглютинина Н3 с 1968 по 1999 показали всего 101 аминокислотную мутацию (приблизительно всего на 560 аминокислотах), в среднем примерно с 3,5 мутаций в год. 60% мутаций, которые происходили в изучаемый период, сохранялись в циркулирующих вирусах в последующий год тоже, указывая на персистентность иммунологически опосредованного селективного давления. 95% этих мутаций обнаружено в НА1 субъединице гемагглютинина, то есть той, которая непосредственно вовлечена в связывание с сиаловой кислотой. В пределах такой высокой вариабельности, однако, были обнаружены некоторые неизмененные аминокислотные остатки, указывающие на их важнейшую роль в функционировании белка. Части гемагглютинина представляют потенциальную мишень для перекрестно-нейтрализующего ответа в отношении различных подтипов вируса гриппа. Однако, ожидается, что такие области не будут способны индуцировать эффективный антительный ответ у большинства пациентов, поскольку то обстоятельство, что такие мишени скрыты в иммунологически молчащих областях, представляло, безусловно, очень благоприятный эволюционный этап для вируса.
Действительно, обращаясь к иммунитету против гриппа, следует принимать во внимание три различных типа иммунитета, которые могут быть более понятны в свете данных, представленных выше:
Гомологичный иммунитет: относится к индивидуальному изоляту. Этот тип иммунитета всегда виден после инфекции или вакцинации, но он обеспечивает очень ограниченную защиту против других изолятов.
Гомоподтипный иммунитет: относится к изолятам, принадлежащим тому же подтипу. Этот тип иммунитета зачастую виден после инфекции или вакцинации, но теряется, когда скорость мутации гемагглютинина и/или нейраминидазы значительно повышается.
Гетероподтипный иммунинтет: относится к изолятам, принадлежащим различным подтипам. Такой тип иммунитета является чрезвычайно редким как в случае природной инфекции, так и в случае вакцинации. Со стратегической точки зрения, это наиболее важный иммунитет, поскольку его наличие и стимуляция были бы эквивалентны резистентности к инфицированию любым вирусом гриппа типа А.
Еще несколько лет назад, считалось, что гетероподтипный иммунитет мог достигаться только путем эффективной стимуляции компонентов клеточного иммунитета, направленного против менее мутированных вирусных белков, таких как, например, белок ΝΡ, который составляет его сердцевину. Однако недавние исследования показали, что мыши, с истощенными лимфоцитами СЭ8 все же способны проявлять гетероподтипный иммунитет, в отличие от мышей, с истощенным лимфоцитарным компонентом В типа (Νβΐινοη НН, 1 Ιηί. Όίδ. 2001, 183: 368-376). Еще более недавнее исследование подтвердило эти данные, особо отмечая важнейшую роль антител, даже если они не являются нейтрализующими, направленных в точности против эпитопов, которые являются консервативными среди различных подтипов (Кап§е1-Могепо е! а1. ТЬе 1 οί 1ттипо1, 2008, 180: 454-463).
Задача изобретения
На основании данных, представленных выше, одной из задач настоящего изобретения является получение моноклонального антитела, предпочтительно антитела человека или гуманизированного антитела, реакционно-способного в отношении различных подтипов вируса гриппа А.
Другой задачей настоящего изобретения является получение моноклонального антитела, предпочтительно антитела человека или гуманизированного антитела, с нейтрализующей активностью в отношении многочисленных подтипов вируса гриппа А.
Такое антитело было бы эффективным средством профилактики при введении пациентам, подверженным риску. Более того, применение моноклонального антитела человека или гуманизированного антитела у пациентов людей дало бы дополнительное преимущество, поскольку это антитело, несомненно, хорошо бы переносилось.
Во-вторых, путем формирования компонента антительного ответа человека на этот вирус, моноклональное антитело с указанными выше характеристиками, могло представлять ключевой фактор для создания инновационных вакцин, способных индуцировать гораздо более эффективный, защитный иммунитет с широким спектром, по сравнению с таковым, индуцированными вакцинами, которые применяются в настоящее время.
- 2 027069
Однако получение моноклональных антител с такими свойствами оказалось на настоящий момент чрезвычайно трудным.
В международной патентной заявке νΟ 2007/134327, опубликованной 22 ноября 2007, описываются фрагменты РаЬ, способные, в анализах ЕЬ1§Л, связываться с антигеном НА из различных изолятов вируса гриппа А, подтипа Н5. Однако в этой патентной заявке не представлено обеспечивающее возможность описание антител, способных распознавать изоляты, принадлежащие различным подтипам вируса гриппа А, ни описания возможности получения антител с фактическими нейтрализующими способностями в отношении вируса гриппа А, принадлежащего разным подтипам.
Следовательно, несмотря на то, что поиски моноклонального антитела, обладающего способностью распознавать и нейтрализовать различные подтипы вируса гриппа А велись в течение длительного времени, такая необходимость на настоящий момент осталась нереализованной.
Описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно добились успеха в получении моноклональных антител с указанными выше желаемыми характеристиками.
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело, направленное против антигена гемагглютинин вируса гриппа А, характеризующееся способностью связываться с многочисленными подтипами вируса гриппа А.
Вторым объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело, направленное против вируса гриппа А, характеризующееся наличием нейтрализующей активности в отношении многочисленных подтипов вируса гриппа А. Предпочтительно такое моноклональное антитело распознает гемагглютинин (НА) вируса гриппа А в качестве антигена.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой антитела человека или гуманизированные антитела.
Получение моноклональных антител человека в соответствии с настоящим изобретением, и их связывающие свойства подробно описаны в экспериментальном разделе, который следует далее.
Получение гуманизированных антител проводят с использованием любой по существу известной методики, как, например, описано у Васа е! а1, 1997 1. ΒίοΙ. Сйеш 272:10678-84 или Сайет е! а1, 1992, Ргос.ШЙ. Асай. δοί 89:4285. Такие библиографические ссылки представлены исключительно для иллюстрации, а не для ограничения. В действительности, другие методики получения гуманизированных антител известны из уровня техники и могут быть использованы в настоящем изобретении.
Получение 6 клонов (обозначенных как ΙΝΡ4, ΙΝΕ16, ΙΝΕ28, ΙΝΕ39, ΙΝΕ43 и ΙΝΕ47) способных продуцировать моноклональные антитела в форме фрагментов РаЬ, обладающих ίη νίίτο способностью связываться с многочисленными подтипами вируса гриппа А, особым образом описано в следующем далее экспериментальном разделе.
Моноклональное антитело, продуцируемое клоном ΙΝΡ28 (обозначенное РаЬ28) представляет один из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, поскольку авторы изобретения экспериментально доказали, что это антитело демонстрирует нейтрализующую активность в отношении многочисленных подтипов вируса гриппа А. Ради краткости, такое иммунологическое свойство иногда будет называться в настоящем описании перекрестно-нейтрализующей активностью в отношении гетероподтипа .
Антитело РаЬ28 характеризуется вариабельным доменом тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1 и вариабельным доменом легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО ΝΟ:2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ:3, а нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ:4.
В частности, в экспериментальном разделе описывается получение моноклональных антител по настоящему изобретению в виде фрагментов РаЬ. Однако другие формы антител тоже и их получение и применение являются частью объема настоящего изобретения. Неограничивающие примеры представляют собой целые иммуноглобулины, или другие типы фрагментов антител, такие как, например, фрагменты Р(аЬ')2, или фрагменты антитела меньшего размера, чем РаЬ, или пептиды, которые обладают теми же иммунологическими свойствами, как те, которые экспериментально показаны для РаЬ по изобретению.
Одноцепочечные антитела могут быть сконструированы в соответствии со способом, описанным в патенте США 4946778, Ьайпет е! а1., включенным в качестве ссылки. Одноцепочечные антитела содержат вариабельные области легкой и тяжелой цепи, соединенные гибким линкером. Фрагмент антитела, обозначенный как однодоменное антитело, по размеру даже меньше, чем одноцепочечное антитело, поскольку содержит только один выделенный домен УН. Способы получения однодоменных антител, обладающих, по меньшей мере частично, такой же связывающей способностью, что и целое антитело, описаны в уровне техники. \ν;πΤ е! а1., в Вшйшд АсШзОех οί а РерегЮпе οί 8ш§1е Ιιηιηιιηοβίοόιιΐίη УапаЬ1е Эотаиъ §есге!ей Ггот Ексйепа ^1ί. №Пиге 341:644-646, описывает способ скрининга для получения вариабельной области тяжелой цепи антитела (УН однодоменное антитело) с достаточной аффинностью в отношении эпитопа-мишени для связывания с ним в выделенной форме.
- 3 027069
В описании, которое следует далее, термин антитело затем будет использовано в отношении всех вариантов осуществления, упомянутых выше, в том числе целых иммуноглобулинов, фрагментов РаЬ или других типов фрагментов антител, одноцепочечных антител, однодоменных антител и так далее.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть получены и использованы в свободной форме или в форме, конъюгированной с носителем. Носитель представляет собой любую молекулу или химическую или биологическую структуру, способную к конъюгированию с антителом и способствующую его иммуногенности или повышающую его иммуногенность.
Неограничивающими примерами носителей являются белки, такие как КЬН (гемоцианин лимфы улитки), эдестин, тироглобулин, альбумины, такие как бычий сывороточный альбумин (ΒδΑ) или сывороточный альбумин человека (ΗδΑ), эритроциты, например, эритроциты барана (8КВС), столбнячный анатоксин, холерный анатоксин, полиаминокислоты, такие как, например, поли (Ό-лизин : Όглутаминовая кислота) и подобные. Для облегчения связывания антитела с носителем, С-конец или Νконец антитела может быть модифицирован, например, путем вставки дополнительных аминокислотных остатков, например, одного или нескольких остатков цистеина, которые способны образовывать дисульфидные мостики.
Благодаря их свойствам, которые будут показаны подробно в экспериментальном разделе, который следует далее, моноклональные антитела по изобретению (в особенности антитело РаЬ28), особенно подходят для применения в медицинских целях, в частности, для производства лекарственного средства для широкого спектра профилактического или терапевтического действия в отношении инфекций вируса гриппа А.
Таким образом, применение моноклонального антитела по изобретению, предпочтительно антитела РаЬ28, для производства лекарственного средства для профилактического или терапевтического действия в отношении патологических состояний, вызванных вирусом гриппа А, таких как, например, гриппозный синдром, входит в объем настоящего изобретения.
В этом контексте также выражение антитело РаЬ28 включает не только фрагменты РаЬ, а также любую другую форму, в которой может быть получено антитело, например, целые иммуноглобулины, другие типы фрагментов антител, одноцепочечные антитела, и так далее.
Как подробно описано в экспериментальном разделе, моноклональные антитела были получены с помощью технологий молекулярной биологии, начиная с ЕВУ-трансформированного лимфоцита, способного продуцировать перекрестно-реагирующие моноклональные антитела, следовательно, способные распознавать лизаты клеток МЭСК, инфицированных двумя эталонными изолятами, упомянутыми ниже в настоящем описании, которые принадлежат различным подтипам вируса гриппа Α: Η1Ν1, штамм Α/ΡΚ/8/34 и Η3Ν2, штамм А/РС/1/73. Специальные методики, применяемые для получения трансформированных линий В-клеток из периферической крови пациентов, описаны в экспериментальном разделе.
Кроме того, способы, используемые для клонирования генов, кодирующих вариабельные части тяжелой и легкой цепи антитела РаЬ28 по настоящему изобретению, описаны в экспериментальном разделе, а также способы их рекомбинантного получения, как в виде единичных пептидов, так и фрагментов РаЬ.
Способность моноклональных антител по настоящему изобретению взаимодействовать с лизатами клеток, инфицированных различными подтипами вируса гриппа А, была проверена с помощью ЕЬ1§А иммунофлуоресценции. Кроме того, анализ нейтрализации проводили для проверки биологической активности антител ίη νίίτο. В этом анализе, антитело РаЬ28 показало перекрестно-нейтрализующую активность в отношении гетероподтипа относительно эталонных изолятов вируса типа А, как указано выше.
Полученные данные позволяют предположить, что антитела по настоящему изобретению, в особенности антитело РаЬ28, являются чрезвычайно эффективными в придании пассивного иммунитета к вирусу гриппа А лицам, которым их вводят, и что, соответственно, эти антитела особенно применимы в широком спектре профилактического или терапевтического действия в отношении вирусных инфекций гриппа А или патологических состояний, непосредственно или опосредованно вызванных вирусной инфекцией гриппа А. Одним примером таких патологических состояний является гриппозный синдром.
Кроме того, идентификация конформационного эпитопа гемагглютинина, с которым связывается РаЬ28, описана в экспериментальном разделе. Такой конформационный эпитоп лежит между областью НА1 и областью НА2 гемагглютинина, и включает остатки \У357 и Т358 в области НА2 и остатки N336, 1337 и Р338 в области НА1. Нумерация остатков основана на последовательности гемагглютинина из изолята Η1Ν1/Α/ΡΚ/8/34 в базе данных ВЬА§Т (δΕΟ ГО N0: 5).
Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество моноклонального антитела по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Эффективным количеством является то количество, которое способно индуцировать благоприятный эффект у пациента, которому вводят эту композицию, например, для нейтрализации вируса гриппа А или нарушения репликации вируса.
В этом контексте, термин пациент означает любого животного-хозяина, которому может быть введена эта композиция, в том числе людей.
- 4 027069
Неограничивающие примеры применимых фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей для фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают стабилизаторы, такие как 8РОЛ, углеводы (например, сорбитол, маннитол, крахмал, сахарозу, глюкозу, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, белок-содержащие вещества, такие как сыворотка быка или обезжиренное молоко, и буферы (например, фосфатный буфер).
Моноклональные антитела по настоящему изобретению также могут быть преимущественно использованы в качестве диагностических реагентов, в ίη νίίτο способе обнаружения в биологическом образце, предварительно полученном от пациента (например, таком как сыворотка, плазма, образец крови или любом другом подходящем биологическом материале), антител против вируса гриппа А с идентичными или сходными нейтрализующими свойствами.
Антитела против вируса гриппа А с идентичными или сходными нейтрализующими свойствами представляют собой антитела, которые демонстрируют гетероподтипную перекрестно-нейтрализующую активность в отношении вируса гриппа А. Эти антитела могут быть обнаружены в биологическом образце от пациента, как результат более раннего воздействия вируса гриппа А, или вследствие предварительного введения пациенту моноклонального антитела по изобретению для терапевтических или профилактических или исследовательских целей.
Способ анализа для обнаружения в биологическом образце пациента наличия антител против вируса гриппа А, обладающих гетероподтипной перекрестно-нейтрализующей активностью, предусматривающий контактирование указанного биологического образца с моноклональным антителом по изобретению, в качестве специфического аналитического реагента, таким образом, включен в объем настоящего изобретения.
Анализ может быть качественным или количественным. Обнаружение или количественный анализ антител против вируса гриппа А, обладающих гетероподтипной перекрестно-нейтрализующей активностью, может быть выполнен, например, с помощью конкурентного анализа ЕЬ1§А. Таким образом, диагностический набор, содержащий моноклональное антитело в соответствии с настоящим изобретением в качестве специфического реагента, также входит в объем настоящего изобретения, указанный набор в частности предназначен для обнаружения или количественного анализа антител против вируса гриппа А, обладающих гетероподтипной перекрестно-нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа А в биологическом образце, полученном от пациента.
Аналогично, моноклональные антитела по настоящему изобретению (в особенности антитело РаЬ28) могут быть использованы в качестве специфических реагентов в аналитическом способе обнаружения или количественном анализе, в ранее полученной иммуногенной или вакцинной композиции, эпитопов, способных индуцировать, у пациента, которому была введена эта композиция, антитела против вируса гриппа А, обладающие нейтрализующими свойствами, идентичными или сходными с таковыми моноклонального антитела по настоящему изобретению, то есть гетероподтипной перекрестнонейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа А.
Ожидается, что такой способ применим для оценки любого препарата, используемого в качестве вакцины или иммуногенного препарата, поскольку распознавание моноклональным антителом по настоящему изобретению могло указывать на присутствие в имуногенном препарате и/или вакцине, одного или более эпитопов, способных стимулировать продукцию антительных клонов, способных распознавать предпочтительный эпитоп, такой как, например, эпитоп, способный индуцировать гетероподтипный иммунитет против вируса гриппа А.
Наконец, моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для производства анти-идиотипических антител в соответствии со способами, известными по существу. Анти-идиотипические антитела представляют собой антитела, специфически направленные против идиотипа широкого спектра нейтрализующих антител, используемых для получения их, и как таковые способны имитировать ключевые эпитопы, которые они распознают.
Следовательно, антиидиотипические антитела, направленные против моноклонального антитела по настоящему изобретению, также включены в объем настоящего изобретения.
Следующий экспериментальный раздел представлен только для иллюстрации, а не для ограничения, и не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения. Формула изобретения является неотъемлемой составной частью описания.
Экспериментальный раздел
1. Отбор пациентов.
Пациентов, включенных в исследование, отбирали таким образом, чтобы увеличить возможности клонирования перекрестно-реактивных антител против гриппа, то есть антител, способных распознавать и потенциально нейтрализовать изоляты вируса гриппа, принадлежащие различным подтипам. В частности, описано, что некоторые индивидуумы, несмотря на длительное воздействие на них вируса гриппа (иногда по профессиональным причинам, как терапевты, педиатры, люди, работающие в детских садах и школах), не заражаются этим заболеванием. Считается, что эти редкие индивидуумы менее подвержены инфицированию вирусом гриппа вследствие развития по еще неизвестным причинам, эффективного гетероподтипного иммунитета. По этой причине их считают наилучшими кандидатами для получения мо- 5 027069 ноклональных антител человека. В частности, были выполнены следующие критерии включения:
возраст от 25 до 55 лет;
недавняя патологическая история болезни, в течение десяти лет, предшествующих исследованию, отрицательная для клинических синдромов гриппа;
титр антител выше 1:1000 против изолятов вируса, подтипов Η1Ν1 и Η3Ν2, ответственных за ежегодные эпидемии в течение пяти лет, предшествующих исследованию;
высокий нейтрализующий титр (1С50>=1:400) против изолятов вируса, подтипов Η1Ν1 и Η3Ν2, ответственных за ежегодные эпидемии в течение пяти лет, предшествующих исследованию;
детектируемый нейтрализующий титр (1С50>=1:20) против двух эталонных изолятов вируса подтипа А (А/РК/8/34 подтип Η1Ν1; А/РС/1/73 подтип Η3Ν2);
отсутствие предшествующей вакцинации против гриппа; согласие на вакцинацию против гриппа.
При вакцинации и примерно через 3 недели после вакцинации у каждого пациента брали приблизительно 20 мл крови в гепаринизированные тест-пробирки.
2. Культивирование эталонных изолятов вируса.
В качестве клеточной линии использовали клетки МЭСК (клетки Мадин-Дарби почек собак) (АТСС® по. ССЬ-34ТМ), размноженные в модифицированной среде Игла (МЕМ) (О1ВСО), дополненной 10% инактивированной эмбриональной сывороткой теленка (РВ8) (обработка при 56°С в течение 30 мин) (ЕигоС1опе), 50 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (О1ВСО) и 2 мМ Ь-глутамина (ЕигоС1опе). Эти клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 и пересевали в соотношении 1:3 дважды в неделю. Для экспериментов, описанных в настоящей патентной заявке, использовали следующие изоляты вируса гриппа: Η1Ν1, штамм А/РК/8/34 (АТСС® по. УК-1469ТМ); Η3Ν2, штамм А/РС/1/73 (АТСС® по. УК-810), и штамм В/Ьее/40 (АТСС® по. УК-101). В качестве культуральной среды для выращивания вируса использовали МЕМ, дополненную 1 мкг/мл бессывороточного трипсина (8ЮМА). Исходные штаммы вируса получали из культурального супернатанта в виде внеклеточных вирусов. Вкратце, после инфицирования клеток, монослой наблюдали ежедневно для мониторинга появления цитопатического эффекта. В основном, через 4 дня после инфицирования, супернатант собирали, центрифугировали при 1000 КСР (относительная центробежная сила) в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса, и фильтровали с использованием фильтров 0,22 мкм (М1РЫРОКЕ). Затем супернатант разливали аликвотами и хранили при -80°С как бесклеточные вирусы.
3. Отбор моноклональных антител против вируса гриппа из В-лимфоцитов периферической крови.
Получение моноклональных антител от пациентов проводили, используя способ трансформации посредством заражения В-лимфоцитов вирусом Эпштейн-Барр (ЕВУ), ранее описанный Со1е е1 а1, 1984 Сапсег Кекеагсй 22:2750-2753. Полученный супернатант от различных клонов, оценивали на присутствие антител с помощью ЕЬ18А. Клоны, способные продуцировать 1дО антитела в супернатант, которые способны реагировать в ЕЬ18А против клеточных лизатов, инфицированных двумя эталонными изолятами, подтипами Η1Ν1 и Η3Ν2, затем отбирали для последующей характеристики. В частности, клетки МЭСК были инфицированы указанными выше изолятами с высокой множественностью заражения.
Примерно через 48 ч после заражения, клетки снимали с флакона и промывали дважды в РВ8. Клеточный осадок затем суспендировали в 300 мкл лизирующего раствора (100 мМ №С1, 100 мМ Тпк ρΗ 8 и 0,5% Тритон-Х) и хранили на льду в течение 20 мин. Клеточные дебрисы центрифугировали при 10000 д в течение 5 мин, и супернатант хранили при -20°С в виде белкового экстракта. Что касается получения контрольного антигена, неинфицированные клетки обрабатывали тем же способом. Концентрацию белка в супернатанте определяли в двух повторах, используя набор ВСА™ Рто1еш Аккау Кй (Р1егсе). Вкратце, количество белка в образце определяли по калибровочной кривой, полученной серией разведений бычьего сывороточного альбумина (В8А) известной концентрации. Поглощение каждого образца измеряли с помощью спектрофотометра при длине волны 540 нм. Полученные таким образом лизаты затем использовали (300 нг на лунку) для покрытия планшета для ЕЬ18А (СО8ТАК), который инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день, планшет промывали дистиллированной водой и блокировали РВ8/1% В8А (81дша) в течение 45 мин при 37°С. Затем, 40 мкл супернатанта от каждого клона добавляли в каждую лунку, которые инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После 5 промываний (^А8ИЕК ЕТ18У8ТЕМ, Э|а8ог1п) с использованием РВ8/0,5% Т\уееп-20 (81дша), 40 мкл конъюгированных с пероксидазой антител против Рс человека (1:4000 в РВ8/1% В8А, 81дша) добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После еще 5 промываний с использованием РВ8/0,5% Т\уееп-20. в каждую лунку добавляли 40 мкл ТМВ пероксидазного субстрата (Р1егсе). Приблизительно 15 мин спустя ферментативную активность блокировали добавлением 40 мкл Щ8О4 и сигнал измеряли с помощью спектрофотометрического прибора при 450 нм. Особое внимание было уделено супернатанту шести предполагаемых клонов способных продуцировать перекрестно-реагирующие антитела (обозначенные как сЮТТ, сЮТТ6, с1ИР28, сЮТ39, с1ИР43 и с1ИР47, соответственно), т.е. способных распознавать как клеточные лизаты, инфицированные штаммом, принадлежащим подтипу Η1Ν1, так и те, которые инфицированы штаммом, принадлежащим подтипу Η3Ν2.
- 6 027069
4. Получение фрагментов РаЬ из перекрестно-реагирующих клонов.
Гены, кодирующие моновалентные цепи РаЬ, способные взаимодействовать с вирусом гриппа, клонировали в прокариотический вектор экспрессии. Это позволяет избежать проблем, связанных с нестабильностью антитело-продуцирующих клеточных клонов, для того, чтобы лучше охарактеризовать кодирующие гены с молекулярной точки зрения, чтобы иметь в распоряжении молекулы, которые являются безусловно моноклональными, а также повышенные количества каждого отдельного антитела.
Матричную РНК (мРНК) экстрагировали из культивированных клонов и обратно транскрибировали, используя олиго-йТ в соответствии со способами, известными по существу. кДНК, кодирующие легкую цепь и фрагмент Рй (т.е. часть тяжелой цепи, присутствующей в РаЬ фрагменте) затем амплифицировали с помощью описанных способов (С8Н рге55, РЬаде Й15р1ау тапиа1, ей. Э.Р.ВиПоп. ρ. А1.6). Полученные таким образом кДНК затем клонировали в вектор экспрессии, по существу известный, обозначенный рСЬЗ/САР (Вштот е1 а1, 1. 1тт. Ме!й, 1988). Вкратце, ген (амплифицированную ДНК), кодирующий часть тяжелой цепи Рй каждого РаЬ, расщепляли рестриктазами ХЬо1 и §ре1 (КосЬе) в течение 1,5 часов при 37°С, и впоследствии встраивали в клонирующий сайт вектора для тяжелых цепей, в свою очередь расщепленный теми же ферментами. Альтернативно, легкие цепи (амплифицированную ДНК) расщепляли ферментами §ае1 и ХЬа1 (КоеЬе) и клонировали в вектор, расщепленный аналогичным образом.
Полученные таким образом рекомбинантные конструкции для каждого клона использовали для электро-трансформации Е. сой штамм ХЬ1В1ие (ставший компетентным под действием холодных промываний в глицерине), в соответствии со стандартизованными протоколами для применения кювет 0,2 см (Напряжение: 2500 В; Емкость: 25 мкФ; Сопротивление: 200 Ом). Параллельно, анализировали последовательности ДНК вариабельной части легкой цепи и вариабельной части тяжелой цепи выбранных клонов.
Последовательности представлены в перечне последовательностей. Молекулярный анализ профиля мутации показал картину, приписываемую антиген-индуцированным соматическим процессам мутации для каждого из клонов.
5. ЕЬРЗА оценка моноклональных РаЬ, полученных путем клонирования в рСЬЗ/САР.
По завершении клонирования, 40 рекомбинантных бактериальных клонов для каждого моноклонального антитела анализировали с помощью ЕЬРЗА, используя неочищенные лизаты из бактериальных культур, полученных путем теплового шока. В частности, клоны бактерий, трансформированных конструкцией рСЬЗ/САР инокулировали в 10 мл среды §В, содержащей ампициллин и тетрациклин в концентрации 50 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно, и выращивали при встряхивании при 37°С до достижения О.Э.600=1. Впоследствии добавляли специфический индуктор (1РТО - изопропил β-Όтиогалактопиранозид) в конечной концентрации 1 мМ, и культуру оставляли при встряхивании при 30°С в течение ночи. Клетки лизировали с помощью теплового шока (3 цикла замораживания/оттаивания, при -80°С и 37°С, соответственно), а затем центрифугировали для отделения клеточного дебриса от РаЬсодержащего супернатанта. Полученные растворимые РаЬ оценивали с помощью ЕЬРЗА. 96-луночные микротитровальные планшеты (№тс) покрывали лизатами из клеток, инфицированных указанными выше вирусными изолятами. Лизаты, полученные из неинфицированных клеток, использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты для ЕЬРЗА, покрытые 300 нг лизатов, полученных как описано, затем оставляли при 4°С в течение ночи. На следующий день, после удаления несвязанного антигена, планшеты промывали 5 раз РВ§, и сайты неспецифического связывания блокировали 3% альбумином в РВ§ в течение 1 ч при 37°С. После удаления блокирующего раствора, супернатанты клеточных культур обрабатывали, как описано выше, и туда добавляли содержащие растворимые РаЬ, с последующей стадией инкубирования при 37°С в течение 2 ч. После 10 циклов промывания с использованием РВ§/0,05% Т\\ееп 20, туда добавляли 40 мкл 1:700 разведения поликлонального препарата конъюгированных с пероксидазой хрена иммуноглобулинов козы против РаЬ человека (81дта) в РВ§/1% В8А. После 1часового инкубирования при 37°С и дополнительных серий 10 промываний, в лунки добавляли субстрат (ОРЭ-о-фенилендиамин). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Реакцию гасили 1н. серной кислотой, и оптическую плотность оценивали спектрофотометрически при 450 нм. Все исследуемые клоны демонстрировали реакционную способность в отношении лизатов, полученных из инфицированных клеток. Один бактериальный клон, трансформированный вектором экспрессии, содержащим генную пару, кодирующую легкую цепь антитела человека и фрагмент Рй тяжелой цепи, таким образом был отобран для каждого из перекрестно-реагирующих моноклональных антител. Такие бактериальные клоны способны продуцировать РаЬ человека, способные связываться как с изолятом А/РК/8/34 (Η1Ν1), так и изолятом А/РС/1/73 (Η3Ν2). Эти клоны (с соответствующими генными парами) были названы ΙΝΕ4, ΙΝΕ16, ΙΝΕ28, ΙΝΕ39, ΙΝΕ43 и ΙΝΕ47.
6. Очистка РаЬ.
РаЬ, продуцированные из перечисленных выше перекрестно-реагирующих клонов (с этого момента без различия называемые клонами или РаЬ) были, таким образом, получены с использованием бактерий, трансформированных описанным вектором экспрессии, а затем иммунноаффинно очищены с использованием колонок, состоящих из сефарозной смолы, содержащей белок О (~ 2 мг/мл), с которыми
- 7 027069 был ковалентно соединен препарат поликлональных антител козы, способных связываться с РаЬ человека (Р1ЕКСЕ, ΙΙΙίηοίδ). Вкратце, единичную колонию каждого клона инокулировали в 10 мл среды 8В, содержащей ампициллин и тетрациклин в концентрации 50 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно. Культура, которую выращивали в течение ночи при 37°С, была субинокулирована во флакон с 500 мл 8В, дополненного той же концентрацией антибиотиков, как и ранее. Клетки, в дальнейшем индуцированные под действием 1 мМ ΙΡΤΟ, оставляли при встряхивании в течение ночи при 30°С. Культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 25 мин, и осадок ресуспендированный в РВ8, подвергали воздействию ультразвука. Дополнительное центрифугирование при 18000 об/мин в течение 25 мин было необходимо для удаления клеточного дебриса. Супернатант фильтровали, а затем медленно пропускали через описанную выше сефарозную колонку. После этого, смолу промывали 10 объемами РВ8, и, наконец, связанные РаЬ элюировали кислым раствором (буфер для элюции - Н2О/НС1 рН 2,2). Собранные различные фракции нейтрализовали соответствующим раствором (1М Тпз рН 9) и концентрировали ультрацентрифугированием (Сеп1г1соп, МИНроге). Чистоту очищенных РаЬ оценивали разделением одной аликвоты на 12% полиакриламидном/додецилсульфатнатриевом геле (8Э8-РАОЕ).
Наконец, последовательные разведения очищенных РаЬ анализировали с помощью ЕЫ8Л, как описано. В каждый планшет, препараты моноклональных РаЬ, направленных против гликопротеина Е2 НСУ были включены в качестве отрицательных контролей. Результаты этого эксперимента подтвердили данные, полученные ранее с бактериальными лизатами.
7. Иммунофлуоресцентная оценка моноклональных РаЬ, полученных путем клонирования в рСЬ3/САР.
Для подтверждения данных, полученных с помощью ЕЫ8А, перекрестно-реагирующие РаЬ против гриппа также анализировали с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Вкратце, клетки из зараженных культур трипсинизировали и после двух промываний в РВ8, подсчитывали под микроскопом с помощью гемоцитометра. Полученную таким образом клеточную суспензию использовали для получения микроскопических препаратов путем центрифугирования в цитоцентрифуге (Су1озрт4, 8Напс1оп 8ои4Ъегп Ргобис1з) при 90 д в течение 3 мин. Полученные таким образом микроскопические препараты содержали в сумме 2х105 клеток. Контрольные препараты получали аналогичным образом с неинфицированными клетками. Клетки затем фиксировали и нарушали их проницаемость при комнатной температуре, используя раствор метанола-ацетона (используемый при температуре -20°С) в течение 10 мин. После 3 промываний в РВ8, клетки инкубировали с различными клонами (100 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С в увлажненной камере, и после этого промывали три раза в РВ8. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С в увлажненной камере в темноте с конъюгированными с изотиоцианатом флуоресцеина РаЬ козы (81дта) разведенными 1:200 в Эвансе голубом. Микроскопические препараты изучали под флуоресцентным микроскопом (О1утриз). Коммерческие моноклональные антитела мыши (Агдепе) специфичные в отношении белка М1 вируса гриппа использовали в качестве положительного контроля. Антитело, направленное против гликопротеина Е2 вируса гепатита С (е509; Вилош е! а1, Нера!о1оду, 1998) использовали в качестве отрицательного контроля. Все рекомбинантные РаЬ показали, посредством иммунофлуоресценции, реакционную способность, которая была специфична как в отношении клеток, инфицированных штаммом А/РК/8/34 (Η1Ν1), так и тех, которые инфицированы штаммом А/РС/1/73 (Η3Ν2). Зато флуоресценция не наблюдалась в неинфицированных клетках, клетках, инфицированных штаммом В типа или клетках, на которые действовали антитела отрицательного контроля.
8. Исследование нейтрализации.
Для характеристики биологической активности ίη уйто выбранных клонов, исследования нейтрализации были разработаны для трех эталонных вирусных изолятов, используемых в исследовании. Вкратце, клетки МЭСК высевали в МЕМ-10% РВ8 в 96-луночный планшет (2х104 клеток/лунку). Серийные разведения (от 10-1 до 108) исходных вирусных культур, полученных как описано выше, были получены в поддерживающей среде (МЕМ с 2% РВ8). Каждое разведение повторяли шесть раз. Когда культивированные клетки достигали конфлюэнтности, ростовую среду удаляли, и 100 мкл каждого разведения вируса добавляли в каждую лунку. Через 1 ч при 37°С, инокулят удаляли и 200 мкл среды МЕМ добавляли с 1 мкг/мл трипсина помещали в каждую лунку. Титр вируса, выражали как ТСГО50 (доза, которая заражает 50% клеточной культуры), вычисляли с применением формулы Рида-Мюнча:
инфекционностъ)50% - 50% , ч
СПд50 =-х фактор разведения инфекционностъ)5<УУо - инфекционностъ(5<УУо
В свете полученных данных, исходные вирусные культуры разбавляли так, чтобы применять множественность заражения (М.О.1.) приблизительно 0,01 (1 вирусная частица на 100 клеток) в эксперименте нейтрализации. В данном исследовании нейтрализации клетки МЭСК высевали в 24-луночный планшет, каждая лунка содержала стерильный микропрепарат. Эксперимент по нейтрализации проводили на 80-90% конфлюэнтных клетках, т.е. примерно 48 ч после их высевания. Затем готовили разведения очищенных фрагментов РаЬ, так, чтобы получить конечные концентрации 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и 20 мкг/мл для каждого антитела. Соответствующие разведения е509 анти-НСУ антитела готовили в качестве отрицательного контроля. Различные концентрации РаЬ затем инкубировали с таким же объемом
- 8 027069 разведенной исходной вирусной культуры (Μ.Ο.Ι.: 0,01) в течение 1 ч при 37°С. 250 мкл смеси вирус-РаЬ впоследствии добавляли в лунки, содержащие клетки. Положительный контроль для инфицирования получали добавлением только культуральной среды к исходной вирусной культуре. Планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С, чтобы дать возможность адсорбироваться не-нейтрализованному вирусу. Затем инокулят удаляли, и клетки промывали дважды в РВ§. 1,5 мл бессывороточной среды с 1 мкг/мл трипсина добавляли в каждую лунку. После инкубирования в течение 6 ч при 37°С, клеточный монослой промывали РВ§ и фиксировали холодным раствором метанол-ацетон (соотношение 1:2, хранение при 20°С) в течение 10 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывали и инкубировали с 250 мкл коммерческого моноклонального анти-М1 антитела (Агдепе) в течение 30 мин при 37°С в увлажненной камере. Клетки промывали РВ§ и окончательно инкубировали с конъюгированным с флуоресцеином козьим антимышиным антителом, разведенным в Эвансе голубом, в течение 30 мин при 37°С в увлажненной камере в темноте. После трех промываний в РВ§, микропрепараты окончательно изучали под флуоресцентным микроскопом.
Нейтрализующую активность РаЬ определяли подсчетом одиночных позитивных клеток, и рассчитывая процент снижения количества инфицированных клеток, по сравнению с положительным контролем, инфицированным только вирусом. Исследования нейтрализации проводили в трех отдельных частях для каждого РаЬ. В частности, каждый клон оценивали в сравнении с двумя различными эталонными штаммами вируса типа А и эталонным штаммом типа В, упомянутыми ранее. В каждом эксперименте, различные разведения РаЬ повторяли три раза, аналогично проводимым для отрицательных (РаЬ е509 анти-Е2/НСУ) и положительных (вирус и среда без РаЬ) контролей инфекции.
Среди шести исследованных перекрестно-реагирующих РаЬ, РаЬ, продуцированный клоном ΙΝΕ28 показал гетеротипную перекрестно-нейтрализующую активность в отношении изолятов вируса типа А. Наоборот, не было обнаружено снижения относительно инфицирующей способности вируса типа В, использованного в исследовании, подтверждая специфичность наблюдаемой нейтрализующей активности. В частности, РаЬ, продуцированный клоном ΙΝΕ28 (названный РаЬ 28) показал 1С50 (концентрация РаЬ, которая ингибирует 50% инфекции вызванной исследуемым вирусным изолятом) ниже 5 мкг/мл в случае подтипа Η1Ν1 и приблизительно 10 мкг/мл в случае подтипа Η3Ν2, т.е. концентрации, которые легко достигаются путем введения ίη νίνο рассматриваемых молекул, даже не принимая во внимание значительное увеличение нейтрализующей биологической активности, обычно наблюдаемой, когда РаЬ, преобразуются в форму целого иммуноглобулина, одну из возможных фармацевтических композиций, входящих в объем настоящего изобретения.
На фиг. 1-3 суммированы результаты, полученные с РаЬ 28, продуцированным клоном ΙΝΕ28, в различных режимах нейтрализации проводимых на различных изолятах вируса гриппа, которые использовали в этом исследовании. В частности, на фиг. 1 представлен график, который иллюстрирует процент нейтрализации вируса А/РР/8/34 (Η1Ν1) под действием различных концентраций РаЬ 28. Результаты, полученные с е509 анти-НСУ РаЬ человека представлены как отрицательный контроль. На фиг. 2 представлен график, который иллюстрирует процент нейтрализации вируса А/РС/1/73 (Η3Ν2) различными концентрациями РаЬ 28. Результаты, полученные с е509 анти-НСУ РаЬ человека представлены как отрицательный контроль. На фиг. 3 представлен график, который иллюстрирует процент нейтрализации вируса В/Ьее/40 под действием различных концентраций РаЬ 28. Результаты, полученные с е509 анти-НСУ РаЬ человека представлены как отрицательный контроль.
9. Характеристика антигена, который распознается РаЬ 28: Вестерн блот на лизате из инфицированных клеток.
мкг клеточного лизата, инфицированного штаммом А/РР/8/34 (НШ1), полученного как указано ранее, разделяли в естественных условиях на 10% полиакриламидном геле. С этой целью образцы разделяли при 100 В в течение 1 ч в соответствующем резервуаре с системой охлаждения (ВЮРАИ). После этого гель снимали с аппарата для электрофореза и инкубировали в течение 10 мин в гибридизационном буфере (основание Тп8 3 г; глицин 14,41 г, 6Н2О 800 мл, метанол 200 мл) для удаления каких-либо остатков детергента. Затем проводили перенос на нитроцеллюлозную мембрану (НуЬопб-ЕСЬ; АшегкЬаш Вю8шепсе8) в течение ночи при 30 В и 90 мА. Затем мембрану блокировали в течение 1 часа 5% сухим молоком, растворенным в 1Х РВ§, а затем промывали три раза в 1Х РВ§ -0,1% Т\уееп. Во время каждого промывания мембрану оставляли для встряхивания на качающейся платформе в течение 10 мин. После чего различные РаЬ, разведенные в РВ§ с 5% сухим молоком добавляли в концентрации 5 мкг/мл. Помимо РаЬ 28, добавляли следующие контроли: е509 в качестве отрицательного контроля; коммерческие цельные 1дС1 мыши против НА (СΟУАNСЕ); коммерческие цельные 1дС1 мыши против Μ1 (ΑΡΟΕΝΕ); цельные 1§С1 мыши против М2 (АВСАМ); сыворотка человека, разведенная 1:200. Каждое антитело оставляли встряхиваться в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого мембрану снова промывали в РВ§, как описано ранее. Затем добавляли те же вторичные антитела мыши (1:1000) или человека (1:2000), как описано для анализа ЕЬ1§А, в зависимости от источника детектируемого антитела. Для обнаружения сигнала готовили рабочий раствор путем смешивания двух субстратов (§ирег§1§па1® ^Уе81 Рюо Сйетйит1пе8сеп1 §иЬ81га1е Р1егсе) в соотношении 1:1, соблюдая особую осторожность, чтобы не подвергать его воздействию источников света. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в течение 5
- 9 027069 мин с рабочим раствором, а затем удаляли и помещали в НурегСаккебе (ΆΜΕΚδΗΛΜ). Проявляли на пленке Кобак для рентгенографии в темной комнате после необходимого времени экспозиции. Описанное исследование проводили в двух различных сессиях, и в каждой из них мембранная часть, инкубированная с РаЬ 28, демонстрировала наличие полосы с массой чуть меньше 80 кДа, соответствующей массе незрелой формы вирусного гемагглютинина (НАО). Это подтверждалось той же полосой, которая также была показана на полоске, инкубированной с контрольным антителом против гемагглютинина. Аналогичная полоса, более интенсивная, чем другие, также была обнаружена в мембранной части, инкубированной с сывороткой человека. Результат этого эксперимента показывает, что антитело направлено против гемагглютинина вируса гриппа, что полностью согласуется с данными по нейтрализации, поскольку известно, что гемагглютинин является мишенью иммунной реакции нейтрализующих антител.
10. Исследование нейтрализации с помощью реакции подавления бляшкообразования.
Исследования нейтрализации проводили путем использования методики реакции бляшкообразования для более точной оценки нейтрализующей активности РаЬ 28. Сначала препараты вирусных изолятов, подтипы Η1Ν1 и Η3Ν2, количественно анализировали с помощью анализа бляшкообразования по следующему протоколу. Клетки МЭСК культивировали в шести-луночных планшетах (Сок(ат) в среде ΜΕΜ дополненной пенициллином и стрептомицином (пен/стреп), и обогащенной 10% эмбриональной сывороткой теленка (РВ§). После достижения клеточным монослоем 100% конфлюэнтности, лунки промывали РВ§ и свежей культуральной средой ΜΕΜ, дополненной теми же антибиотиками (пен/стреп), и добавляли трипсин (1 мкг/мл). Серийные разведения исходных вирусных культур осуществляли в тех же лунках, и вирус оставляли адсорбироваться в течение 1 ч при 34°С в атмосфере 5% СО2. Затем среду аспирировали и дважды промывали ΡΒδ. Осторожно добавляли еще ΜΕΜ, дополненную антибиотиками, трипсином (1 мкг/мл) и осторожно добавляли 0,8% агарозу при температуре не выше 42°С. После инфицирования, проверяли состояние клеточного монослоя под фазово-контрастным световым микроскопом, и планшеты инкубировали при 34°С в атмосфере 5% СО2. Через 48 ч после заражения, слой агарозы удаляли, с большой осторожностью, чтобы не повредить клеточный монослой. После этого, в лунки добавляли 70% метанол в воде с добавлением кристаллического фиолетового (1 мас.%/об.). Планшет инкубировали с веществом, изменяющим проницаемость/красителем при комнатной температуре в течение 5 минут. После инкубирования, планшет промывали дистиллированной водой при комнатной температуре и оставляли сушиться под ламинарным потоком в течение 5 мин. Наконец, оценивали количество РРИ (бляшкообразующих единиц) под фазово-контрастным микроскопом с увеличением 4Х. После вычисления титра вируса в виде РРИ, вычисляли соответствующее значение ТСГО50, и тот же самый титр сравнивали с титром аналогичных исходных вирусных культур с помощью методики конечной точки предельных разведений.
Приведенное выше титрование позволило провести количественный анализ вирусов для точного определения активности РаЬ 28. Некоторые планшеты были подготовлены аналогично указанной выше процедуре для титрования с использованием реакции бляшкообразования. Таким образом, была получена нейтрализационная смесь, которая содержала вирус (100 ТСГО50 на лунку) и различные концентрации РаЬ, которые были использованы (РаЬ 28 и контрольный РаЬ). В частности, исследование проводили путем тестирования различных концентраций РаЬ (20, 10, 5 и 2,5 мкг/мл) относительно 100 ТСГО50 различных штаммов вируса гриппа. Смеси вирус/РаЬ затем инкубировали в течение 1 ч при 34°С в атмосфере 5% СО2. После промывания клеток МЭСК с использованием ΡΒδ, предварительно инкубированные препараты переносили в лунки с клеточным монослоем 100% конфлюэнтности, затем инкубировали в течение 1 ч при 34°С в атмосфере 5% СО2. Это исследование проводили и интерпретировали, как описано ранее, путем сравнения числа бляшек, полученных в присутствии РаЬ 28, с полученным в присутствии той же концентрации контрольных РаЬ.
Исследования проводили, используя следующие изоляты гриппа, принадлежащие подтипам Η1Ν1 и Η3Ν2:
Η1Ν1:
А/Ма1ауа/302/54,
А/РР/8/34.
Η3Ν2:
А/АюЫ/68,
А/Ую1оба/3/75,
А/Роб СЬа1тетк/1/73.
Результаты подтвердили нейтрализующую активность РаЬ 28 против вирусов Η1Ν1 А/Ма1ауа/ 302/54 и А/РР/8/34, подтверждая также значения 1С50 ниже 2,5 мкг/мл. Гетероподтипная нейтрализующая активность также была подтверждена в отношении вирусов гриппа Η3Ν2 Λ/Λίε1ιί/68. А/Ую1оба/3/75 и А/Рой СЬа1тетк/1/73 (1С50 приблизительно 20 мкг/мл).
11. Идентификация эпитопа, распознаваемого РаЬ 28.
Было предпринято несколько подходов для идентификации области гемагглютинина, которую распознают РаЬ 28, способность которых распознавать эпитоп, хотя бы конформационно, уже была показана предыдущими экспериментами. Действительно, РаЬ 28 в результате оказались способными распознавать
- 10 027069 белок только в Вестерн блот анализах, проводимых в полу-естественных условиях (0,1% 8Ό8). Те же эксперименты также указали на способность РаЬ распознавать только незрелую форму белка (НА0), но не отдельные субъединицы (НА1 и НА2). Исследования ингибирования гемагглютинина (ΗΑΙ) проводили параллельно как с эритроцитами цыпленка, так и эритроцитами человека. Несмотря на заметную нейтрализующую активность, было установлено, что РаЬ 28 не обладают ΗΑΙ активностью, что дает возможность предположить, что он не связывается с остатками, вовлеченными в связывание между гемагглютинином и сиаловой кислотой.
Для лучшей характеристики эпитопа, были предприняты две дополнительные стратегии: выбор случайных пептидных последовательностей, находящихся в библиотеке фагового дисплея, которые способны связываться с РаЬ 28 моноклональных антител; и индукция ίη νίίτο, путем селективного давления посредством РаЬ 28, вирусных вариантов (ускользнувшие мутанты) способные ускользать от нейтрализующей активности антител.
Селекция из пептидной библиотеки с помощью пэннинг метода позволяет идентифицировать ряд пептидов, способных специфически связываться с идиотипом РаЬ 28. Все идентифицированные пептиды анализировали для получения консенсусной последовательности. Такую консенсусную последовательность затем использовали для анализа ίη δίίίοο кристалла гемагглютинина, принадлежащего подтипу Η1Ν1. С помощью этого анализа можно обнаружить области, потенциально распознаваемые РаЬ 28. Один эпитоп в частности подвергали дополнительному анализу, учитывая его совместимость с результатами, полученными ранее, и с теми, которые получены одновременно с этим подходом путем использования ускользнувших мутантов. Эпитоп расположен в стволовой области гемагглютинина, то есть в части между областями НА1 и НА2 (данные полностью совпадают с результатами, полученными в Вестерн блоте и анализе ΗΑΙ). Остатки, особо важные для связывания, которые были идентифицированы, представляют собой следующие: ^357 и Т358 в области НА2; N336; Ι337; Р338 в области НА1 (нумерация остатков относится к последовательности гемагглютинина из изолята Η1Ν1/Α/ΡΡ/8/34 находящегося в базе данных ВЬА8Т) (8ЕЦ ГО N0:5).
Исследование ускользнувших мутантов проводили путем серийного заражения клеток МЭСК с использованием 100 ТСГО50 вируса Η1Ν1/Α/ΡΚ/8/34 в присутствии 10 мкг/мл РаЬ 28, т.е. концентрации РаЬ, эквивалентной его концентрации 1С90 в отношении рассматриваемого изолята. Только после многочисленных пассажей можно обнаружить заражение клеток в присутствии РаЬ, указывающее на мутацию, происходящую в вирусном геноме. Действительно, были выбраны, ускользнувшие мутанты, мутировавшие в двух остатках областей НА2, Ι361 и Ό362, которые смежны с областью, идентифицированной с помощью подхода ίη δίίίοο, подтверждая гипотезу, что это является областью, распознаваемой РаЬ 28.
- 11 027069
Список последовательностей <110> ΡΟΜΟΝΑ В1ОТЕСНЫОЬОС1ЕЗ ЬЬС <120> Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа А <130> РС895ЕС <160> 5 <170> РаЬепЫп νβΓβίοη 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 1
Ьеи 1 С1и С1и Зег С1у 5 С1у С1у Уа1 Уа1 С1п 10 Рго С1у Агд Зег Ьеи 15 Агд
Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Рго РЬе Зег Зег Туг С1у МеЬ Нгз
20 25 30
Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 АЬа С1у Уа1
35 40 45
Зег Туг Азр С1у Зег Туг Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд
50 55 60
РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п МеЬ
65 70 75 80
Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз АЬа Агд Рго
85 90 95
Зег А1а 11е РЬе С1у 11е Туг 11е 11е Ьеи Азп С1у Ьеи Азр Уа1 Тгр
100 105 110
С1у СТп С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 2
<211> 105
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 2
С1и Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Уа1 Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд
1 5 10 15
Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а ТЬг С1п С1у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а
20 25 30
Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е РЬе С1у
35 40 45
АТа Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у
50 55 60
Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр
65 70 75 80
РЬе А1а ТЬг Туг РЬе 85 Суз О1п О1п А1а Нтз Зег 90 РЬе Рго Ьеи ТЬг РЬе 95
О1у О1у О1у ТЬг Ьуз 100 Уа1 О1и 11е Ьуз 105
<210> 3 <211> 366 <212> ДНК <213> Ното зартепз
<400> 3
сЬсдаддадЬ сЬдддддадд сдЬддЬссад ссЬдддаддЬ сссЬдадасЬ сЬссЬдЬдса 60
дссЬсЬддаЬ ЬссссЬЬсад ЬадЬЬаЬддс аЬдсасЬддд Ьссдссаддс Ьссаддсаад 120
дддсЬддадЬ дддЬддсадд ЬдЬЬЬсаЬаЬ даЬддаадЬЬ аЬаааЬасЬа ЬдсддасЬсс 180
дЬсаадддсс даЬЬсассаЬ сЬссададас адЬЬссаада дсасЬсЬаЬа ЬсЬдсаааЬд 240
аасадссЬда дассЬдадда сасддсЬдЬд ЬаЬЬасЬдЬд сдадассЬЬс сдсдаЬЬЬЬЬ 300
ддааЬаЬаса ЬЬаЬЬсЬааа сддЬЬЬддас дЬсЬддддсс аадддассас ддЬсассдЬс 360
ЬсЬЬса 366
<210> 4
<211> 315 <212> ДНК <213> Ното зартепз
<400> 4
дадсЬсасдс адЬсЬссаЬс ЬЬссдЬдЬсЬ дсаЬсЬдЬад дадасададЬ сасЬаЬсасЬ 60
ЬдЬсдддсда сЬсадддЬаЬ ЬадЬадЬЬдд ЬЬадссЬддЬ аЬсадсадаа ассадддааа 120
ссассЬааас ЬссЬдаЬЬЬЬ ЬддЬдсаЬсЬ адЬЬЬдсааа дЬддддЬссс аЬсааддЬЬс 180
адсддсадЬд даЬсЬдддас адаЬЬЬсасЬ сЬсассаЬса дсадЬсЬаса дссЬдаадаЬ 240
ЬЬЬдсаасЬЬ асЬЬЬЬдЬса асаддсЬсас адЬЬЬсссдс ЬсасЬЬЬсдд сддсдддасс 300
ааддЬддада Ьсааа 315
<210> 5 <211> 565 <212> РКТ <213> Ното зартепз
<400> 5
МеЬ Ьуз А1а Азп Ьеи 1 5 Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи Суз А1а 10 Ьеи А1а А1а А1а Азр 15
А1а Азр ТЬг 11е Суз 20 11е С1у Туг Нтз А1а Азп 25 Азп Зег ТЬг 30 Азр ТЬг
Да1 Азр ТЬг Да1 Ьеи 35 С1и Ьуз Азп Да1 ТЬг Да1 40 ТЬг Нтз Зег 45 Да1 Азп
Ьеи Ьеи С1и Азр Зег 50 Нтз Азп С1у Ьуз Ьеи Суз 55 Агд Ьеи Ьуз 60 С1у 11е
- 13 027069
А1а Рго Ьеи О1п Ьеи О1у Ьуз Суз Азп Не А1а О1у Тгр Ьеи Ьеи О1у
70 75 80
Азп Рго О1и Суз Азр Рго Ьеи Ьеи Рго Уа1 Агд Зег Тгр Зег Туг 11е
90 95
Уа1 О1и ТЬг Рго Азп Зег О1и Азп О1у 11е Суз Туг Рго О1у Азр РЬе 100 105 110
11е Азр Туг О1и О1и Ьеи Агд О1и О1п Ьеи Зег Зег Уа1 Зег Зег РЬе 115 120 125
О1и Агд РЬе О1и 11е РЬе Рго Ьуз О1и Зег Зег Тгр Рго Азп Нпз Азп 130 135 140
ТЬг Азп О1у Уа1 ТЬг А1а А1а Суз Зег Нпз О1и О1у Ьуз Зег Зег РЬе
145 150 155 160
Туг Агд Азп Ьеи Ьеи Тгр Ьеи ТЬг С1и Ьуз С1и С1у Зег Туг Рго Ьуз
165 170 175
Ьеи Ьуз Азп Зег Туг Уа1 Азп Ьуз Ьуз О1у Ьуз О1и Уа1 Ьеи Уа1 Ьеи 180 185 190
Тгр О1у 11е Нпз Нпз Рго Рго Азп Зег Ьуз О1и О1п О1п Азп Ьеи Туг 195 200 205
С1п Азп С1и Азп А1а Туг Уа1 Зег Уа1 Уа1 ТЬг Зег Азп Туг Азп Агд 210 215 220
Агд РЬе ТЬг Рго О1и 11е А1а О1и Агд Рго Ьуз Уа1 Агд Азр О1п А1а
225 230 235 240
С1у Агд МеЬ Азп Туг Туг Тгр ТЬг Ьеи Ьеи Ьуз Рго С1у Азр ТЬг 11е
245 250 255
11е РЬе О1и А1а Азп О1у Азп Ьеи 11е А1а Рго МеЬ Туг А1а РЬе А1а 260 265 270
Ьеи Зег Агд О1у РЬе О1у Зег О1у 11е 11е ТЬг Зег Азп А1а Зег МеЬ 275 280 285
Ыз О1и Суз Азп ТЬг Ьуз Суз О1п ТЬг Рго Ьеи О1у А1а 11е Азп Зег 290 295 300
Зег Ьеи Рго Туг О1п Азп 11е Нпз Рго Уа1 ТЬг 11е О1у О1и Суз Рго
305 310 315 320
Ьуз Туг Уа1 Агд Зег А1а Ьуз Ьеи Агд МеЬ Уа1 ТЬг О1у Ьеи Агд Азп
325 330 335
Азп Рго Зег 11е О1п Зег Агд О1у Ьеи РЬе О1у А1а 11е А1а О1у РЬе 340 345 350
11е С1и С1у С1у Тгр ТЬг С1у МеЬ 11е Азр С1у Тгр Туг С1у Туг Нпз 355 360 365
Нпз О1п Азп О1и О1п О1у Зег О1у Туг А1а А1а Азр О1п Ьуз Зег ТЬг 370 375 380
О1п Азп А1а 11е Азп О1у 11е ТЬг Азп Ьуз Уа1 Азп ТЬг Уа1 11е О1и 385 390 395 400
- 14 027069
Ьуз МеЬ Азп 11е С1п 405 РЬе ТЬг А1а Да1 С1у 410 Ьуз С1и РЬе Азп Ьуз 415 Ьеи
С1и Ьуз Агд МеЬ С1и Азп Ьеи Азп Ьуз Ьуз Да1 Азр Азр С1у РЬе Ьеи
420 425 430
Азр 11е Тгр ТЬг Туг Азп А1а С1и Ьеи Ьеи Да1 Ьеи Ьеи С1и Азп С1и
435 440 445
Агд ТЬг Ьеи Азр РЬе Ыз Азр Зег Азп Да1 Ьуз Азп Ьеи Туг С1и Ьуз
450 455 4 60
Да1 Ьуз Зег С1п Ьеи Ьуз Азп Азп А1а Ьуз С1и 11е С1у Азп С1у Суз
465 470 475 480
РЬе С1и РЬе Туг Ыз Ьуз Суз Азр Азп С1и Суз МеЬ С1и Зег Да1 Агд
485 490 495
Азп С1у ТЬг Туг Азр Туг Рго Ьуз Туг Зег С1и С1и Зег Ьуз Ьеи Азп
500 505 510
Агд С1и Ьуз ДаЬ Азр С1у Да1 Ьуз Ьеи С1и Зег МеЬ С1у 11е Туг С1п
515 520 525
11е Ьеи А1а 11е Туг Зег ТЬг Да1 А1а Зег Зег Ьеи Да1 Ьеи Ьеи Да1
530 535 540
Зег Ьеи С1у А1а 11е Зег РЬе Тгр МеЬ Суз Зег Азп С1у Зег Ьеи С1п
545 550 555 560
Суз Агд Не Суз 11е

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело, направленное против антигена гемагглютинина вируса гриппа А, отличающееся тем, что указанное антитело способно связываться с множеством подтипов вируса гриппа А и нейтрализовать их, где указанное множество подтипов вируса гриппа А содержит по меньшей мере один подтип вируса гриппа А, содержащий гемагглютинин Η1, и один подтип вируса гриппа А, содержащий гемагглютинин Н3, причем указанное моноклональное антитело содержит по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность 5ЕЦ ГО ΝΟ:1 и вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность 5ЕЦ ГО ΝΟ:2.
  2. 2. Моноклональное антитело по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью 5ЕЦ ГО ΝΟ:3 и вариабельный домен легкой цепи кодируется нуклеотидной последовательностью 5ЕЦ ГО ΝΟ:4.
  3. 3. Моноклональное антитело по п. 1 или 2, выбранное из группы, состоящей из целых иммуноглобулинов и фрагментов иммуноглобулинов, содержащих по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи.
  4. 4. Моноклональное антитело по п.3, где указанные фрагменты иммуноглобулина выбраны из группы, состоящей из фрагментов РаЪ, фрагментов РаЪ', фрагментов Р(аЪ')2, фрагментов Ρν, одноцепочечных антител (δεΡν).
  5. 5. Моноклональное антитело по любому из пп.1-4, которое представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.
  6. 6. Антиидиотипическое антитело, которое специфически направлено против идиотипа моноклонального антитела по любому из пп. 1-5.
  7. 7. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим нуклеотидные последовательности 5ЕЦ ГО ΝΟ:3 и 5ЕЦ ГО ΝΟ:4, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи по антитела по п.1, соответственно.
  8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
  9. 9. Применение антитела по любому из пп.1-6 для получения профилактического или терапевтического средства в отношении инфекции вирусом гриппа А или патологического состояния, прямо или опосредованно вызванного инфекцией вирусом гриппа А.
  10. 10. Применение по п.9, где патологическое состояние, вызванное инфекцией вирусом гриппа А, представляет собой гриппозный синдром.
  11. 11. Аналитический способ обнаружения в биологическом образце, полученном от пациента, присутствия антител против вируса гриппа А, обладающих гетероподтипным перекрестно-нейтрализующим свойством, предусматривающий проведение конкурентного анализа ЕЫ5А с использованием в качестве специфического реагента моноклонального антитела по любому из пп. 1-5.
    - 15 027069
  12. 12. Диагностический набор, содержащий моноклональное антитело по любому из пп.1-5 в качестве специфического реагента, где указанный набор предназначен для применения в способе обнаружения или количественного анализа антител против вируса гриппа А, обладающих гетероподтипным перекрестно-нейтрализующим свойством, в биологическом образце, полученном от пациента.
  13. 13. Аналитический способ обнаружения в иммуногенной или вакцинной композиции присутствия эпитопов вируса гриппа А, способных индуцировать антитела против вируса гриппа А, обладающие гетеротипным перекрестно-нейтрализующим свойством против вируса гриппа А, у пациента, которому вводят указанную композицию, предусматривающий приведение указанной композиции в контакт с моноклональным антителом по любому из пп.1-5 в качестве специфического аналитического реагента, причем обнаружение образования комплекса между указанным моноклональным антителом по любому из пп.1-5 и эпитопами вируса гриппа А указывает на присутствие указанных выше эпитопов.
EA201071087A 2008-03-17 2009-03-16 Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а EA027069B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000204A ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2008-03-17 Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
PCT/IB2009/051068 WO2009115972A1 (en) 2008-03-17 2009-03-16 Monoclonal antibodies capable of reacting with a plurality of influenza virus a subtypes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201071087A1 EA201071087A1 (ru) 2011-04-29
EA027069B1 true EA027069B1 (ru) 2017-06-30

Family

ID=40293277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201071087A EA027069B1 (ru) 2008-03-17 2009-03-16 Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а

Country Status (22)

Country Link
US (3) US9200063B2 (ru)
EP (1) EP2274335B2 (ru)
JP (1) JP5542118B2 (ru)
KR (1) KR101605573B1 (ru)
CN (1) CN102037013B (ru)
AU (1) AU2009227567B2 (ru)
BR (1) BRPI0909123B8 (ru)
CA (1) CA2718923C (ru)
DK (1) DK2274335T3 (ru)
EA (1) EA027069B1 (ru)
ES (1) ES2544968T5 (ru)
HU (1) HUE025329T2 (ru)
IL (1) IL208210A0 (ru)
IT (1) ITTO20080204A1 (ru)
MX (1) MX2010010120A (ru)
MY (1) MY157359A (ru)
NZ (1) NZ588238A (ru)
PL (1) PL2274335T3 (ru)
PT (1) PT2274335E (ru)
SG (1) SG188890A1 (ru)
WO (1) WO2009115972A1 (ru)
ZA (1) ZA201006934B (ru)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITTO20070066A1 (it) 2007-01-30 2008-07-31 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di hiv
EP3524619A1 (en) 2007-12-06 2019-08-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against influenza virus and methods of use thereof
ITTO20080204A1 (it) * 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
CA2731686C (en) 2008-07-25 2020-04-07 Institute For Research In Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2010-06-23 Natimab Therapeutics S R L Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
JP2012521786A (ja) 2009-03-30 2012-09-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
CN102448986B (zh) 2009-05-11 2015-11-25 克鲁塞尔荷兰公司 能中和流感病毒h3n2的人结合分子及其应用
IT1395961B1 (it) * 2009-06-01 2012-11-02 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv)
US9458226B2 (en) 2009-10-09 2016-10-04 Emory University Recombinant antibodies against H1N1 influenza
WO2011103453A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Mount Sinai School Of Medicine Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease
ITTO20100237A1 (it) * 2010-03-26 2011-09-27 Pomona Biotechnologies Llc Immunoglobuline intere della classe delle igg per l'uso come medicamento antinfluenzale
ITTO20110067A1 (it) * 2011-01-26 2012-07-27 Pomona Ricerca Srl Immunoglobuline intere di isotipo igg atte a riconoscere un epitopo di neutralizzazione eterosubtipica sulla regione stelo (stem region) dell'emoagglutinina e loro uso come medicamento antinfluenzale
WO2011117848A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Pomona Ricerca S.R.L. Full-length immunoglobulins of the igg isotvpe capable of recognizing a heterosubtvpe neutralizing epitope on the hemagglutinin stem region and their use as anti-influenza medicament
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US9534042B2 (en) 2010-09-03 2017-01-03 Fujita Health University Influenza virus-neutralizing antibody and screening method therefor
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
CN102775469B (zh) * 2011-05-12 2018-02-09 厦门大学 甲型流感病毒核衣壳蛋白的抗原表位及其用途
EP3812397A1 (en) 2011-07-18 2021-04-28 Institute for Research in Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
CN108164602A (zh) 2011-09-20 2018-06-15 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
EP2768858B1 (en) 2011-10-18 2018-08-01 Emory University Antibodies directed against influenza
US9718874B2 (en) 2011-12-02 2017-08-01 Aimm Therapeutics B.V. Influenza A virus specific antibodies
US9969794B2 (en) 2012-05-10 2018-05-15 Visterra, Inc. HA binding agents
EP3461501A1 (en) 2012-11-13 2019-04-03 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
NZ627796A (en) 2012-12-18 2017-07-28 Icahn School Med Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
CN118005782A (zh) 2013-10-02 2024-05-10 免疫医疗有限责任公司 中和抗甲型流感抗体及其用途
MY186389A (en) 2014-05-13 2021-07-22 Univ Pennsylvania Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof
CN106573154B (zh) 2014-07-15 2021-06-15 免疫医疗有限责任公司 中和抗乙型流感抗体及其用途
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
US11535665B2 (en) 2015-05-13 2022-12-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
PT3303384T (pt) 2015-06-01 2021-10-14 Medimmune Llc Moléculas de ligação neutralizantes anti-influenza e suas utilizações
WO2017083627A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
CN108697789A (zh) 2016-01-13 2018-10-23 免疫医疗有限责任公司 治疗甲型流感的方法
US11266734B2 (en) 2016-06-15 2022-03-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
PT3589730T (pt) 2017-02-28 2024-02-28 Univ Pennsylvania Vetor de vírus adenoassociado (aav) de clado f e suas utilizações
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
SG11201907611WA (en) 2017-02-28 2019-09-27 Univ Pennsylvania Influenza vaccines based on aav vectors
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
EP3802571A4 (en) * 2018-06-11 2022-03-02 GlaxoSmithKline Consumer Healthcare Holdings (US) LLC PAIRS OF ANTIBODY FOR USE IN A RAPID INFLUENZA A DIAGNOSTIC TEST
KR20200060969A (ko) * 2018-11-23 2020-06-02 (주)셀트리온 인플루엔자 바이러스 질환을 치료하기 위한 투여 요법
CN113924147A (zh) 2019-03-25 2022-01-11 威特拉公司 用于治疗和预防流感的组合物和方法
CN116670152A (zh) 2020-12-01 2023-08-29 宾夕法尼亚州大学信托人 具有组织特异性靶向基序的新型组合物和含有其的组合物
WO2022232289A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
CN115724952B (zh) * 2022-07-13 2023-10-31 扬州大学 一种靶向甲型流感病毒保守线性b细胞表位的广谱单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0675199A2 (en) * 1994-03-30 1995-10-04 Takara Shuzo Co. Ltd. A DNA which codes for the variable region of the anti-human influenza A type virus antibody recognizing the H,N, and H2N2 subtypes of haemagglutinin
WO2002046235A1 (fr) * 2000-12-07 2002-06-13 Technopharm Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci
WO2007134327A2 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Sea Lane Biotechnologies, Llc. Neutralizing antibodies to influenza viruses

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA836080B (en) 1982-08-23 1984-04-25 Scripps Clinic Res Broad spectrum influenza antisera
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US6812024B2 (en) * 1987-03-16 2004-11-02 Mcgready Roland Keith Anti-paratopic antibody as an immunogen
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
AU1538392A (en) 1991-03-11 1992-10-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods for selecting antibody reagents; anti-idiotype antibodies; and aids vaccine formulations
ATE255902T1 (de) * 1992-03-09 2003-12-15 San Diego Regional Cancer Ct Ein anti-idiotypischer antikörper und seine verwendung in der diagnose und therapie von hiv- verwandten krankheiten
EP0621339B1 (en) 1992-09-17 2001-10-24 Takara Shuzo Co. Ltd. Immunogenic human influenza A virus haemagglutinin polypeptides
GB9221654D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant human anti-cytomegalovirus antibodies
US6057421A (en) * 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
AU5285899A (en) 1998-07-21 2000-02-14 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Anti hepatitis c virus antibody and uses thereof
CA2429946A1 (en) 2000-12-01 2002-07-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for the e2 glycoprotein of hepatitis c virus and their use in the diagnosis, treatment, and prevention of hepatitis c
US6768004B2 (en) * 2001-01-11 2004-07-27 Mueller Sybille Nucleotide sequences encoding variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibody 1F7, an anti-idiotypic antibody reactive with anti-HIV antibodies
US6964199B2 (en) * 2001-11-02 2005-11-15 Cantocor, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and/or growth of cultured cells using co-transcription of a Bcl2 encoding nucleic acid
EP1465928B1 (en) * 2002-01-17 2009-09-30 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Anti-idiotypic antibody inducing hiv-1 neutralizing antibodies
ITRM20020049A1 (it) 2002-01-30 2003-07-30 Biostrands S R L Frammenti fab di anticorpi monoclonali umani diretti contro la glicoproteina e2 di hcv e dotati di potere neutralizzante in vitro.
MX2009002174A (es) 2006-09-07 2009-03-12 Crucell Holland Bv Moleculas de union humanas capaces de neutralizar el virus de la influenza h5n1 y usos de las mismas.
CA2642147A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antibodies, compositions, and related methods
ITTO20070066A1 (it) 2007-01-30 2008-07-31 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di hiv
WO2009037297A2 (en) 2007-09-20 2009-03-26 Bracco Imaging Spa Method for the preparation of new oligoclonal antibodies
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
ITTO20080398A1 (it) 2008-05-27 2009-11-28 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1
ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2010-06-23 Natimab Therapeutics S R L Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
IT1395961B1 (it) 2009-06-01 2012-11-02 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv)
WO2011117848A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Pomona Ricerca S.R.L. Full-length immunoglobulins of the igg isotvpe capable of recognizing a heterosubtvpe neutralizing epitope on the hemagglutinin stem region and their use as anti-influenza medicament

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0675199A2 (en) * 1994-03-30 1995-10-04 Takara Shuzo Co. Ltd. A DNA which codes for the variable region of the anti-human influenza A type virus antibody recognizing the H,N, and H2N2 subtypes of haemagglutinin
WO2002046235A1 (fr) * 2000-12-07 2002-06-13 Technopharm Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci
WO2007134327A2 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Sea Lane Biotechnologies, Llc. Neutralizing antibodies to influenza viruses

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. THROSBY, ET AL.: "Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, vol. 3, no. 12(e3942), 16 December 2008 (2008-12-16), pages 1 - 15, XP002541925, ISSN: 1932-6203 *
SMIRNOV Y A, ET AL: "Prevention and treatment of bronchopneumonia in mice caused by mouse-adapted variant of avian H5N2 influenza A virus using monoclonal antibody against conserved epitope in the HA stem region", ARCHIVES OF VIROLOGY, SPRINGER WIEN, AT, vol. 145, no. 8, 1 January 2000 (2000-01-01), AT, pages 1733 - 1741, XP002473326, ISSN: 0304-8608, DOI: 10.1007/s007050070088 *
SMIRNOV Y A; LIPATOV A S; GITELMAN A K; OKUNO Y; VAN BEEK R; OSTERHAUS A D ME; CLAAS E C J: "An epitope shared by the hemagglutinins of H1, H2, H5, and H6 subtypes of influenza A virus", ACTA VIROLOGICA., ACADEMIA PRAGUE, PRAGUE., CS, vol. 43, no. 4, 1 August 1999 (1999-08-01), CS, pages 237 - 244, XP009095964, ISSN: 0001-723X *
T. ZIEGLER, ET AL.: "Type- and subtype-specific detection of influenza viruses in clinical specimens by rapid culture assay.", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 33, no. 2, 1 February 1995 (1995-02-01), US, pages 318 - 321, XP002541924, ISSN: 0095-1137 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2274335B2 (en) 2022-07-27
US20160060325A1 (en) 2016-03-03
PL2274335T3 (pl) 2015-10-30
CN102037013B (zh) 2015-01-28
EP2274335A1 (en) 2011-01-19
JP2011517403A (ja) 2011-06-09
IL208210A0 (en) 2010-12-30
KR101605573B1 (ko) 2016-03-22
US20160200801A1 (en) 2016-07-14
US9200063B2 (en) 2015-12-01
BRPI0909123B8 (pt) 2021-06-01
MY157359A (en) 2016-05-31
BRPI0909123B1 (pt) 2020-12-01
CA2718923A1 (en) 2009-09-24
ES2544968T5 (es) 2022-11-22
US9587011B2 (en) 2017-03-07
NZ588238A (en) 2012-08-31
PT2274335E (pt) 2015-09-18
DK2274335T3 (en) 2015-08-17
ZA201006934B (en) 2011-12-28
CA2718923C (en) 2020-07-07
EP2274335B8 (en) 2015-06-17
HUE025329T2 (en) 2016-02-29
AU2009227567A1 (en) 2009-09-24
US9598482B2 (en) 2017-03-21
EP2274335B1 (en) 2015-05-13
JP5542118B2 (ja) 2014-07-09
WO2009115972A1 (en) 2009-09-24
AU2009227567B2 (en) 2014-06-26
BRPI0909123A2 (pt) 2019-02-26
US20110014187A1 (en) 2011-01-20
KR20100126810A (ko) 2010-12-02
EA201071087A1 (ru) 2011-04-29
SG188890A1 (en) 2013-04-30
ES2544968T3 (es) 2015-09-07
MX2010010120A (es) 2010-12-02
ITTO20080204A1 (it) 2009-09-18
CN102037013A (zh) 2011-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027069B1 (ru) Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а
KR101665146B1 (ko) 인플루엔자 ａ 바이러스 서브타입 ｈ1에 대항하는 호모서브타입 교차 중화 특성을 갖는 모노클로날 항체
WO2022216223A1 (en) Vaccine and/or antibody for viral infection
WO2023009028A1 (ru) Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2
RU2181379C2 (ru) Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства
TW201922778A (zh) 中和性抗體的高通量篩選方法、由該方法製備之中和性抗體，以及其用途
JP2010509340A (ja) バイナリエピトープ抗体およびｂ細胞スーパー抗原免疫刺激物質
CN110294802B (zh) 一种单克隆抗体10g12及其应用
CN114057850A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
RU2765731C1 (ru) Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
RU2769223C1 (ru) Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела
CN116444665A (zh) 针对新冠病毒SARS-CoV-2糖蛋白RBD区域的单克隆抗体及其应用
CN114057842A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057853A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057843A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057851A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途
CN114057846A (zh) 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM