JPH07503133A - 風疹ワクチン用合成ペプチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 風疹ワクチン用合成ペプチド 技術分野 本発明は、風疹ウィルス感染に対する合成ワクチンの開発に関する。特に本発明 は、ヒトＴ−ヘルパー決定因子（Ｔ　ＨＤ　ｓ　）および５！疹ウィルス構造タ ンパクＥｌ、Ｅ２およびＣからのＢ−ａｌｌ胞ウィルス中和エピトープ（ＢＥｓ ）ならびにこれらと細胞毒性を有するＴ−リンパ球細胞（ＣＴＬ）エピトープを 含み、風疹ウィルスに対して中和抗体および細胞仲介免疫反応を惹起することの できる新規な合成ワクチンを製造することのできるその他の合成リポタンパクと の混合物に関する。

背景技術 通常、風疹は良性の幼児感染症であるが、風疹ウィルス（ＲＶ）は進行性風疹性 汎脳炎と呼ばれる脳の持続性感染症を起こす（参考文献４０．５０−参考文献は 明細書の後に添付）。ＲＶは、若年性関節リュウマチ患者の滑膜細胞から分離さ れている（参考文献８゜１３）、　１９６９年以来、数種類の弱毒化風疹ワクチ ンが導入されている（参考文献２．４１）、風疹ウィルスに対する乳児および出 産齢の感受性の高い婦人の免疫投与は、今や標準的な公衆衛生対策となっている 。

しかし、弱毒化風疹ワクチンを定常的な免疫投与に使用することは、医学的に大 きな問題がある。これらの問題は、糖尿病関連の疾患をもたらす胎児の先天的感 染（参考文献４４）および風疹ワクチン接種後の風疹に関連した関節Ｐ（参考文 献８．４７）ならびに野生型ＲＶとワクチンウィルス株の間の抗原性の差による 野生型ＲＶのワクチン被接種者に対する再感染（参考文献１１．２１）の恐れで ある。さらに、これらの問題に加えて、風疹ウィルスは組織培養しても比較的力 価が低く、その構造タンパクの精製が困難である（参考文献２７）、したがって 、組換えＤＮＡ技術およびペプチド合成等の手段による非感染性風疹ワクチン製 造の要望が高い、最近、ウィルスゲノムおよび宿主の免疫反応の特性に研究の焦 点が置かれている。

ＲＶは、　トガウィルス科、ルビウィルス属の唯一のウィルスである（参考文献 ２９）、ｃＤＮＡクローンから解読した風疹ウィルスの構造タンパクの一次配列 が報告されている（参考文献１０）、ＲＶタウイル粒子は、３３ｋＤａの基本カ プシドタンパクＣの多重複写からなる二十面体カプシド内に包まれたＲＮＡゲノ ムを有する（参考文献３８）。このニュクレオカブシッドは脂質二重層で取り囲 まれており、その脂質二重層中にウィルス糖タンパクＥｌ　（５８ｋＤａ）およ びＥ２（４２〜４７ｋＤａ）が埋もれている（参考文献３８．４３）。糖タンパ クＥ１は赤血球凝集エピトープおよびウィルス中和エピトープを含んでいること が知られている（参考文献５０）。今日まで？ｆｉ積されたデータによると、こ れらのＥ１中和エピトープのいずれも、動物試験でＲＶに対する高い中和抗体反 応を惹起できないので、ＲＶに対するワクチンとして使用するには適当ではない 。Ｅ２特異性抗体は、−Ｌ工ｔｒｏにおいてウィルス感染を中和することができ る（参考文献１７）、Ｌかし、Ｅ２タンパクの中和エピトープは、未だ配列が解 明されていない。

風疹ウィルスに対する抗体反応の特異性を解明するために、研究が行われている 。最近、ＲＶ特特異性１閘 考文献１９．３７）、ＲＶ特異性１ｇＡ抗体の製造は再感染防止にｆｆｉ要であ ることが明らかにされている（参考文献＋９）。ＲＶ特特異性１ｇＭ体のほとん どはＥｌタンパクと反応し、　ＩｇＡ抗体のほとんどはＣタンパクと反応する（ 参考文献４２）。　ＩｇＧ抗体反応は、すべての構造タンパクによって惹起され る（参考文献３０．４２）。

ウィルス感染の過程でＴヘルパー細胞の増殖（参考文献４．　２２〜２４，　２ ８．４９）および細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応（参考文献４９）が検出 されるが、　Ｒｖ溝造タンパクに対する細胞の免疫反応についてはほとんど知ら れていない。上記の研究で、Ｔヘルパー決定因子または風疹構造タンパクのＣＴ Ｌエピトープのいずれも同定されていない。したがって、これらＴ’ｌ胞エピト ープ（′ｒヘルパー及びＣＴＬ）を同定することによって、安全で、効果的な風 疹ワクチンを設計することができる。

疾病に対して免疫を誘導する方法は常に改良されていて、現在抗原として低分子 で、明確に規定された物質を使用する傾向にある。　その目的は、ある種の在来 免疫原による副作用を軽減もしくは排除し、かつ免疫原性および疾病に対する防 御作用を保持させるためで尾領域を代表する合成ペプチドを実験動物に免疫投与 すると、親タンパクに対して特異的な免疫反応が誘導され、それらの生物学的機 能が中和されることが明らかにされている（参考文献３．　１８．　２５．　３ ３〜３６）。このように、感染性疾患に対して安価で、安全なワクチンを製造す る上で、合成ペプチドは有望な抗原である。最近の基礎免疫学の進歩によって、 有効な免疫原は２種類の機能ドメインを持つ必要があることが明らかにされてい る．一方のドメインはＢ細胞認識および抗体の生産に関与し、別のドメインはＴ ヘルパー細胞活性を誘導する。明らかに、風疹特異性細胞毒性Ｔリンパ球細胞（ 　Ｃ　Ｔ　Ｌ　）エピトープは、風疹疾患に対して必要な細胞免疫を提供するた めに、最終合成ワクチン構成物に含まれていなければならない。最近の研究（参 考文献ｌ）で、ペプチドは―　ｖｉｖユでマウスにＣＴＬ反応を起こすことが実 証されている。

したがって、安全で、有効な合成ペプチドワクチンが考えられる。

合成ペプチドに基づく風疹ワクチンを設計するためには、ＲＶ特異性ＣＴＩ、決 定因子、ウィルス中和ＢＪＩＢ胞エピトープ（Ｂ　Ｅ）および各ウィルスタンパ クの機能性Ｔヘルパーエピトープを同定する必要がある０合成構造物が有力であ るためには、機能的ＴヘルパーおよびＢＮ胞エピトープの両方が存在する必要が ある。

そのため、各種のＴ−Ｂタンデム合成ペプチド−ハイブリッドおよびキメラ−を 合成し、合成構造物中のＴヘルパー決定因子（Ｔ　ＨＤ　）と［３−ｍ胞エピト ープの閏の好的空間関係が免疫原性のために必要か否かを決定する。さらに、ア ジュバントまたはりボペプチドを用いて、これらの合成構造物を製剤化し、免疫 反応の増強を試験する。

細胞の免疫反応を誘導するためには、適当なＭ　Ｉ（Ｃコンテキスト中に適切に 加工したＴＪ’ｌＥ胞エピトープが存在し、適当なＴｉ胞のレパートリ−のある ことが必要である。これらの要因は、非近交個体群の各構成員の間で差があり、 サブユニットワクチンに対１−る′ｒ　Ｉｕ胞の反応に差のあることが報告され ている（Ｚｅｖｃｒｉｎｇ　ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：９４５−９５５、 １９９０）。その他、ＲＶ　ｉ：　対”４−６　Ｔ　１１　胞（１’）選択的耐 性等の宿主における要因も、ＴＭ胞による抗原認識に影響を及ぼす、したがって 、有効な合成ワクチンを設計するためには、各種の遺伝的バックグランドを持っ た各ＴＭ胞によって認識されるエピトープの同定およびＲＶ感染または免疫投与 に関する広い免疫学的経験が重要である。

風疹ウィルスタンパクの機能性エピトープの配列を決定するため、Ｅｌ、Ｅ２お よびＣタンパク配列のほとんどをカバーするオーバーラツプ合成ペプチドをそれ ぞれ２８．１５および１１種類合成した（表１．　２および３）０合成ペプチド の長さは、通常のアルゴリズム（参考文献９．　１２．　２０）にしたがって二 次構造推定分析を行い、それらの親木性β回転指数の高さに基づいて決定した（ 図１〜３）、このようなセグメントは表面が暴露され、抗原性を有すると思われ る。

Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ　（参考文献４８）が提案しているように、タ ンパクの在来エピトープに似せるため、ｇｃＪｉｉのペプチドも合成した。抱合 化を目的として、ざらにＮ末端またはＣ末端のいずれかにシスティン残基を付加 した。

発明の目的 本発明は、　１つの側面において、遊離のペプチドとして、または担体分子にリ ンクさせて、または分子凝縮物を形成させるために風合化して投与した場合、哺 乳動物においてＲＶに対する高力価の抗体を惹起することのできる合成ペプチド （または合成ペプチドの混合物）を提供することを目的とする。

別の側面において、本発明は遊離のキメラペプチドとして、または担体分子にリ ンクさせて、または分子凝縮物を形成させるために重合化して投与した場合、哺 乳動物においてＲＶに対する高力価の抗体を惹起することのできるキメラペプチ ド（またはキメラペプチドの混合物）を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、別の側面において、ＲＶに対して哺乳動物における細胞仲介 免疫性を生産することのできる合成リボペプチド（または合成リボペプチドの混 合物）を提供することを目的とする。

さらに別の側面において、本発明は、分子凝縮物を形成したとき、哺乳動物にお いて＋ｔ　Ｖに対する防御抗体および細胞仲介免疫反応を生産することのできる 合成リボペプチド（または合成ペプチドとりボペプチドの混合物）を提供するこ とを目的とする。

本発明は、さらに別の側面において、抗Ｉｔ　Ｖ抗体、例えば中和抗体の存在を 検出するときに使用することのできる合成ペプチド（または合成ペプチドの混合 物）、および生物試料におけるＲ〜゛の存在を検出するためのイミュノアッセイ に使用することのできるＲ　Ｖ特異性ポリクローナル抗体の混合物を提供するこ とを目的とする。

さらに別の側面において、本発明は、風疹に関連した自己免疫疾患用の治療薬と して使用することのできる類縁体を生産させるためのヒトＴ　Ｉ−Ｉ　Ｄ　ｓと して同定されている合成ペプチド（または合成ペプチドの混合物）の提供を目的 とする。

発明の概略 本発明は、ＲＶの構造タンパク（Ｅｌ、Ｅ２およびＣ）の各種抗原決定因子（Ｔ ＨＤｓ、［ＩＥｓおよびＣＴＬｓ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなる免 疫原および候補ワクチンの調製に関する。これらペプチドの少なくとも１つから なり、遊離のペプチドとして、または適当な担体と共有結合させ、または脂質性 部分にリンクさせて使用する合成ワクチンを開示する。

したがって、本発明は、その１つの側面において、風疹ウィルス（ＲＶ）の少な くとも１種類のタンパク、一般には構造タンパクの少なくとも１種類の抗原決定 因子に相当するアミノ酸配列を有し、化学的合成または遺伝子組換えにより製造 することのできる合成ペプチドを提供する。

本発明は、そのｌ実施例において、ＲＶのＥｌｌ造タンパクの少なくとも１種類 の抗原決定因子に相当するアミノ酸配列を有する基本的に純粋な少なくとも１種 類のペプチドからなり、そのペプチドは哺乳動物においてＲＶに対するポリクロ ーナル抗体を誘導することができる。これらのＥｌ特異性ポリクローナル抗体は 、あらゆる生物試料中におけるＲＶの存在を検出するためのテストキットに有ｍ である。このペプチドは、例えば下表１に規定したように、それぞれＲＶのＭ２ Ｓ株のＥ１タンパク（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、１〜２８）アミノ酸配列１−２２、 １９−３８．３８−５７．５４−７４．７１−９１．１０５−１２５、１２２− １４１、　１４０−１５９．１５７−１７６、１７４−１９３、１９０−２０９ ．２０７−２２６，２２４−２４３、２４’０−２５９、２５６−２７５、２７ ２−２９１．２８９−３０８．３０７−３２６．３２４−３４３．３４１−３６ ０，３５８−３７７．３７４−３９０．３９１−４１２．１９６−２１２、１９ ８−２３３．２１９−２３３，１９８−２４０．　および２１２−２４０に相当 するアミノ酸配列または免疫原性を保持しているそのあらゆる部分、変異体また は突然変異体のを有することができる。

本発明は、別の実施例において、ＲＶのＥ２構造タンパクの少なくとも１厖類の 抗原決定因子に相当するアミノ酸配列を有する基本的に純粋な少なくとも１種類 のペプチドからなり、そのペプチドは４市乳動物においてＲＶに対するポリクロ ーナル抗体を誘導することができる。これらＥ２　特異性ポリクローナル抗体は 、あらゆる生物試料中のＲＶの存在を検出するためのテストキットに有用である 。このペプチドは、例えば下表２に規定したように、それぞれＲＶのＭ２Ｓ株の Ｅ２９ン／＜９　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３０．３１，３３．３５および４０） または免疫原性を保持しているそのあらゆる部分、変異体または突然変異体のア ミノ酸配列１５−３５．３３−５７．６９−９１．１０４−１２４、および１９ ５−２２０に相当するアミノ酸配列を有することができる。

本発明は、別の実施例において、ＲＶのｃ＃ｆ造タンパクの少なくともｌｆｌ類 の抗原決定因子に相当するアミノ酸配列を有する基本的に純粋な少なくとも１種 類のペプチドからなり、そのペプチドは哺乳動物においてＲＶに対するポリクロ ーナル抗体を誘導することができる。これらＣ特異性ポリクローナル抗体は、あ らゆる生物試料中のＲＶの存在を検出するためのテストキットに有用である。こ のペプチドは、例えば下表３に規定したように、それぞれＲＶのＭ２Ｓ株のＣタ ンパク（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４４−５４）または免疫原性を保持しているその あらゆる部分、変異体または突然変異体のアミノ酸配列１−３０．２８−５’６ ．５２−７８、７４−１００，９６−１２３、１１９−１５２、　１５２−１７ ９、＋７７−２０４、　２０５−２３３．２３１−２５７および２５５−２８０ に相当するアミノ酸配列を有することができる。

本発明は、別の実施例において、ＲＶタンパクの少なくとも１種類の抗原決定因 子に相当するアミノ酸配列を有する基本的に純粋な少なくとも１種類のペプチド からなり、そのペプチドは酸化体であり、特に硫黄含有アミノ酸の間でジスルフ ィド結合を形成し、哺乳動物においてＲＶに対する抗体を誘導することができる 。これら酸化ペプチドの１つは、ＲＶのＭ２Ｓ株のＥｌタンパク（表１、ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、２７−ＲＶ−ＥＰ２７）のアミノ酸配列１９８−２４０に相当す るアミノ酸配列を有する。また、本発明のペプチドはＭ３３以外のＲＶ単離体の 相同ＲＶ−ＥＰ２７領域に相当する配列を有していてもよい。この配列は”ＲＶ −ＥＰ２７様”と表示した。

さらに、本発明のペプチドは、別のワクチンを生産させるために、脂質で修飾し てリボペプチドとしてもよく、担体分子にリンクさせてもよい（または重合化し て分子ａ組物としてもよい）。ここに提示した合成ペプチドまたは上記の修飾ペ プチドからなるワクチンは、例えば筋肉内または非経口的に哺乳動物に投与した 場合、または微粒子、カプセル、　リポソームおよび毒素または抗体等の標的分 子を用いて表面粘膜の表面に運搬した場合、ＲＶＳ＋染に対して免疫を賦与する ワクチンとして製剤化してもよい。

したがって、本発明の別の側面は、ここに記載した免疫原性合成ペプチドの少な くとも１つと、生理学的に許容される担体とからなる風疹用ワクチンを提供する 。このワクチンは、さらに別の免疫原性または免疫刺激性分子を少なくとも１つ 含んでいてもよい、免疫原性合成ペプチドは多価ワクチン、例えば麻疹、おたふ くかぜおよび風疹（ＭＭＲ）に対する防御を提供できるように１つに製剤化して もよい。また、ワクチンはアジュバントを含んでいてもよい、また、本発明は有 効量のワクチンを宿主に投与することによって、風疹に対する免疫を宿主に賦与 する方法を含む。

本発明の別の実施例は、哺乳動物においてＲＶに対する免疫反応を誘導すること のできる合成リボペプチド（または合成リボペプチドの混合物）からなる、これ らのりボペプチドは、例えば下表１２に規定するアミノ酸配列Ｃ３ＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、５７−７５）または免疫原性を保持しているそのあらゆる部分、変異体ま たは突然変異体を有する。このようなりボペプチドはＴＰＲＶ−Ｃ９と表示し、 例えばＲＶ　Ｍ３３株ノｃタンパクのアミノ酸２０５−２３３に相当する配列ト リバルミチル−ＣＳ　Ｓ　Ｖ　ＲＡ　Ｙ　Ｎ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　Ｖ　ＲＧ　 ＶＷＧＫＧＥＲＴＹＡ［ＥＱＤＦＩ更ＶＣ５ｔ：０　１０　Ｎｏ：５５）または その一部を有していてしよい。

別の実施例において、本発明はＲＶタンパク（Ｅｌ。

Ｅ２またはＣタンパク）のＢ細胞中和エピトープの少なくとも１つにアミノ酸配 列を有する少なくとも１種類のペプチドからなり、抗ＲＶ抗体、例えば中和抗体 の存在を検出するための診断用キットの成分として使用１−ることもできる、こ のペプチドは、例えばＲＶ　Ｍ３３株１７）Ｅｌタンパクのそれぞれ２４０−２ ５９．２５６−２７５，２７２−２９１＋１９８−２３３、および２１２−２４ ０アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列（下表１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：Ｉ４． １５．１６．２５および２８）または生物試料中におけるＲＶＶ異性抗体の存在 を検出できるそのあらゆる部分を有していてもよい。

別の実施例において、本発明はヒトＴＨＤｓ（Ｔｉ胞決定因子）として同定され ている。この上うなＴＭ胞決定因子は、ＨＶのＥｌ、Ｅ２またはＣタンパクのも のであってもよい。この上うなＴ　ＨＤ　ｓの類縁体は、例えば治療剤として、 風疹に関連した自己免疫障害の治療に使用することができる。

ヒトＴ　ＨＤ　ｓとして同定されているペプチドは、例えばＲＶＭ３３株のＥｌ タンパクのそれぞれアミノ酸配列ｌ−２２、＋２２−１４１＋　１４０−１５９ ．１５７−１７５、　＋７／ｌ−１９３、＋９０−２０９．２０７−２２６、　 ２２４−２４３、　２４０−２５９．２５６−２７５、　２７２−２９１．　２ ８９−３０８．３０７−３２６、　３２４−３４３、　３４１−３６０．３５８ −３７７、　３７４−３９０、　１９６−２１２．１９８−２３３、および＋９ ８−２４０に相当するアミノ酸配列（下表１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１．７．８ ．９、　ｌＯｌ　１１＋１２、１３、１４．１５、１６．１７．１８．１９．２ ０．２１，２２．２４．２５および２７）または風疹に関連した自己免疫障害の 治療処置に有用なその類縁体の一部、またはＲＶ　Ｍ３３株のＥ２タンパクのそ れぞれアミノ酸配列１−２０゜５４−７４．１３９−１５９、＋５６−１７７、 　ｌ７６−１９９．２１８−２３９、および２３３−２５９に相当するアミノ酸 配列（下表２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２９．３２．３７．３８．３９．４１およ び４２）または風疹に関連した自己免疫障害の治療処置に有用なその類縁体の一 部、またはＲＶ　Ｍ３３株のＣタンパクのそれぞれアミノ酸配列１−３０．９６ −１２３、＋１９−１５２、１５１−１７９、１７７−２０４．２０５−２３３ 、および２５５−２８０に相当するアミノ酸配列（下表３、Ｓ［シＱ　ＩＱ　Ｎ ｏ：４４．４８．４９．５０．５１，５２および５４）または風疹に関連した自 己免疫障害の治療処置に有用なその類縁体の一部を有することができる。

本発明の別の側面において、ヒトＴ　ＩＩ　Ｄとして同定されたペプチドの合成 類縁体の４１効量を宿主に投り・することによる風疹に関連した自己免疫障害の 治療法が提供されている。別の実施例において、本発明は風疹関連自己免疫障害 に伴うとトＴｍ胞エピトープの同定プロセスを提供する。このようなプロセスは 、ＲＶタンパクに相当するオーバーラツプペプチドを合成し、ＲＶ抗原に暴露し た宿主パネルからＲＶ特特異性側細胞株調製し、ＲＶ抗原特異性ＴＮＡ胞増殖検 定を行うことからなる。このプロセスから得られた結果を、合成ペプチドに基づ ＜ＲＶワクチンの論理的設計に使用する。

本発明の別の実施例において、合成ペプチドは少なくとも１つのヒトＴ細胞決定 因子（Ｔ）と、少なくとも１つのウィルス中和ＩＭＱ胞エピトープ（Ｂ）からな り、ハイブリッドまたはキメラＴ−［３タンデムペプチドである。このようなタ ンデムペプチドはキメラであり、Ｅｌ、Ｅ２またはＣタンパクの少なくとも１つ のヒトＴ細胞決定因子と、Ｅｌ、Ｅ２またはＣタンパクの少なくとも１つのウィ ルス中和Ｂｍ胞エピトープからなっていてもよい０合成ペプチドはキメラペプチ ドの形態が望ましく、特にＥ２またはＣタンパクの少なくとも１つのヒトＴｍ胞 決定因子とＥ＋タンパクの少なくとも１つのウィルス中和１３ｉ胞エピトープか らなるキメラリボペプチドであることが望ましい。

トリバルミチルーＣＳ　Ｓ　Ｖ　ＲＡ　Ｙ　Ｎ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　Ｖ　ＩＩ ＧＶＷＧＫＧＥＲＴＹＡＥＱＤＦＲＶＰＤＰＧＤＬＶＥＹＩＮＮＹＴＧＮＱＱＳ ＲＷＧＬＧＳＰＮＣＫＧＰＤＷＡＳＰＶＣＱＲＸＳＰ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

＝５６）または免疫原性を保持しているその一部１本発明のペプチドは、Ｍ３３ 以外のＲＶＶ離体の相同ＲＶ−ＢＰ２７ｉ域に相当する配列を有していてもよい 。

この配列は”ＲＶ−ＥＰ２７様リボペプチド”と表示する。

前記のように、ここに記載した合成ペプチドは、別のワクチンを生産させるため 、さらに脂質で修飾してリボペプチドとするか、担体分子にリンク（または凝縮 物を形成させるため、重合化）させてもよい、これらのワクチンは、例えば筋肉 内または非経口的に哺乳動物に投与した場合、または微粒子、カプセル、リポソ ームおよび毒素または抗体等の標的分子を用いて表面粘膜の表面に運搬した場合 、ＲＶ感染に対して免疫を賦与するために使用することができる。

本発明の別の側面において、ここに提供したような合成ペプチドのアミノ酸配列 をコード化しているニュクレオチド配列を有する遺伝子からなる抗原運搬用の生 ベクターが提供される。このような生ベクターは、ポックスウィルス、アデノウ ィルス等のウィルス性へフタ−、ボトロウイルスまたはレトロウィルス系のウィ ルスベクターまたはサルモネラ菌またはミニバクテリア等の細菌性ベクターであ ってもよい。生ベクターは、生理学的に許容される担体とともに風疹に対するワ クチンに使用することができる。

図面の簡単な説明 図１．２および３は、それぞれ風疹Ｅ１．Ｅ２およびＣタンパクの構造解析を示 す、いずれの場合も、上のパネルはＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ　（参考文献９ ）にしたがって行った局部平均α−螺旋構造およびβ一回転ポテンシャルの二次 構造解析である。下のパネルは、Ｈｏ　ｏ　ｏおよびＷｏｏｄｓ（参考文献２０ ）にしたがって行った親水性プロットである。値はへブタペプチドウィンドーの 平均からめ、各セグメントの中央点をプロットした。

図４は、Ｍ　Ａ　ｂ　ｓ　２１　［３９Ｈｌ　１６ＡｌＯ［Ｅおよび３　Ｄ　９ 　Ｆ　Ｉ：よるＥ１ペプチドＲＶ　−Ｕ　Ｐ　２４、−ＥＰ２５および−ＥＰ２ ６の識別（パネルＡ）、およびＭ　Ａ　ｂ　ｓ　２１　Ｂ９　Ｈおよび３Ｄ９Ｆ によるＲＶ−ＥＰ２４、−ＥＰ２７および−Ｅ　Ｉ）　２８の識別（パネルＢ） を示す、　１００μｇ　／　ｍ　＋の合成ペプチドを１ｍｍ　ｕ　Ｉ　ｏ　ｎ　 −２プレートに帯状にスポットし、　３Ｉ）９Ｆ以外のＭＡｂｓはいずれらｌ　 ：　２００の腹水でプローブした。ＭＡｂ　３Ｄ９１の抗体源は／Ｓイブリドー マ培養細胞をｌ：５０の希釈率で使用した。陰性対照血ｔｎは風疹に曝さない正 常なＩ（ａｌｂ／Ｃマウス血清を図５は、マウス（パネルＡ）およびウサギ（パ ネルＢ）の抗カプシドペプチドのペプチドＥＬＩＳＡ反応性を示す。

図６は、Ｃペプチドを免疫投与したウサギの抗ペプチド血清の免疫プロット分析 を示す。免疫プロット分析は、非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ）で行 った。Ｃタンパクに対するモノクローナル抗体プローブのプロットにはＭ　ａ　 ｂを用いた。タンパク標準の相対的移動性（ｋＤａ）を左側に示す、Ｅｌ、Ｅ２ およびＣはＲＶの構造タンパクである。抗ペプチド血清は、　１　：　１００の 希釈率で使用した。

１２Ｉ７は、ＲＶ−Ｃ９特異性マウスＴ細胞の合成ペプチド、抗ＣＤ４抗体およ び抗ＣＤ８抗体に対する増殖反応を示す、ＲＶ−Ｃ９のＣ末端トランケート相同 体であるＲＶ−Ｃ９ＢはＣタンパクの２０５−２１６残基に相当するアミノ酸配 列ＶＲＡＹＮＱＰＡＧＤＶを持っている。

発明の詳細な説明 本発明は、ＲＶの免疫原性エピトープに相当するペプチドおよびそれを用いた合 成ワクチンに関する。これら新規な免疫原性組成物は、Ｉ（Ｖのｔに造タンパク と抗原性決定因子を共有するペプチドを化学的に合成することによって調製する 。ペプチドまたはりボペプチドを、それぞれ単独で、または担体分子にリンクさ せて（または重合化して）、ワクチンとして使用する。

これらのワクチンは、例えば筋肉内または非経口的に哺乳動物に投与し、または 微粒子、カプセル、リポソームまたは毒素および抗体等の標的分子を用いて表面 粘膜の表面に運搬させることにより、ＲＶ感染に対する免疫付与に使用すること ができる。

ペプチドの合成 合成ペプチドに基づく風疹ワクチンを設計するためには、各ウィルスタンパクの Ｒ■特異性ＣＴＬ決定因子、ウィルス中和Ｂ＃１８胞エピトープ（ＢＥ）および 機能的Ｔヘルパーエピトープ（ＴＨＤｓ）を同定する必要がある。下記の実施例 ２に記載するように、自動ＡＢｌ　４３０Ａ固相ペプチド合成装置を用い、それ ぞれＥｌ、Ｅ２およびＣタンパク配列のほとんどをカバーする４４種類のオーバ ーラツプ合成ペプチド（下表１．２および３）を化学的に合成した。合成ペプチ ドの長さは、従来のアルゴリズム（参考文献９、１２．２０）にしたがって二次 ？ｇ　Ｗ解析を行い、親木性β回転指数の高さに基づいて選択した（ｌ、！ＩＩ −：ｌ）。このようなセグメントは表面が暴露され、抗原性を有すると思われる 。　Ｖ　ａ　ｎ　Ｒｃ　ｇ　ｃ　ｎ　ｍ　ｏ　ｒ　Ｉ　ｃ　Ｉ　（参考文献４８ ）が提案しているように、タンパクの在来エピトープに似せるため、長鎖のペプ チドも合成した。

場合によっては抱合化を目的として、ざらにＮ末端またはＣ末端のいずれかにシ スティン残基を付加した。

ＲＶ特異性モノクローナル抗体の世代および特性マウスＲＶ特異性ＭＡｂｓの製 造は、以下の実施例３に記載する。抗体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ａｆｆｉゲルタン パクＡＭＡＰＳ　ＩＩシステムを用い、腹水から精製した。　ＩｇＧモノクロー ナル抗体のサブクラスは、ヤギの単−特異性抗マウスＩｇＧサブクラス抗血清（ Ｔａｇｏ、Ｂｕｒ　Ｉ　ｉｎｇｈａｍｓ、ＣＡ）を用い、寒天中の二重免疫拡散 によって測定した。得られた結果を、下表４に要約する。各ＭＡｂの免疫学的特 性は、赤血球凝集阻止（Ｈｌ）およびウィルス中和（ＶＮ）検定により測定した 。２５種類のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）のうち、３Ｄ９Ｆ、３　Ｄ　５　 Ｄ。

１２Ｂ２Ｄおよび１６ＡＩＯＢはそれぞれ１　：　１６３８４．１：８１９２． １：４０９６およびｌ：３２のＨＩ活性を持っていることが明らかとなったＣ表 ４）。

２１　Ｂ　９　Ｈおよび１６ＡＩＯＥは、ＶＮ活性を持っていることが認められ た。２１　［３９Ｈは、補体の存在下でＭ３３およびＲＡ−２７／３株のいずれ をも中和した。各ＭＡｂの特異性は、免疫プロット分析を用いて測定した。表４ に要約した結果から、　Ｉ　６Ａ　Ｉ　ＯＩＥ、、２１　［３９ＩＩおよび３　 Ｄ　９１’等のＥｌ特異性Ｍ　Ａ　ｂ　ｓはε１タンパクのＶＮおよびＩＩ　＋ エピトープの配列決定に使用することができる。

合成直線ペプチドを用いたＩ（ＡおよびＶＮエピトープの同定 Ｅｌの配列のほとんどをカバーするオーバーラツプ合成ペプチドをａ＊Ｌ、ＥＬ 　Ｉ　ＳＡプレート上に塗布し、Ｅｌ特異性ＭＡｂｓでプローブした。ＭＡｂ２ １　Ｂ９ＨはＲＶ−ＣＰ２５、−ＣＰ２７および−ＥＰ２８と強く反応したが、 ペプチド特異性ＥＬＩＳＡｓでＲＶ−ＣＰ２４および−ＥＰ２６を識別すること ができなかった（図４）。この結果から、ＭＡｂ　２１Ｂ　９　Ｈは残基１９８ −２３３に相当するアミノ酸配列ＰＤＰＧＤＬＶＥＹ　Ｉ　ＭＮＹＴＧＩＪＱ、 ＱＳＲＷＧＬＧＳＰＮＣＩＩＧｒ’ＤＷＡＳＰ　（Ｓ［Ｅ（ｊ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　 ：　２５）中に存在するエピトープを識別するものと考えられる。しかし、別の ウィルス中和ＭＡｂ　１６ＡＩＯＢはＣＰ２５およびＣＰ２６のいずれとも反応 する。

このことは、別の少なくとも１つのウィルス中和エピトープがあり、残基２＋９ −２３３に相当するアミノ１’１ｌｌｌｌｄ列ＧＬＧＳＰＮＣＩＩＧＩ）ＤＷＡ ＳＰ　（ＳＥＱ　１１）Ｎｏ：２６）に存在していることを・１ニジている。

ＲＶに対して強いＩＩ　＋活性を有するＭ　Ａ　ｂ　３　Ｌ）　９１’は、残基 ２１２−２４０に相当するペプチドＩＩ　Ｖ　−ＣＰ　２　８　（ＧＮＱＱＳＲ ＷＧＬＧＳ　Ｉ）ＮＣＨＧＩ）ＤＷＡＳＰＶＣＱＲＨ５Ｐ、　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：　２８）　と反応した（図４Ｂ）が、長鎖のペプチドＭＡｂ　３Ｄ９Ｆとは 反応しなかった。ＲＶ−ＣＰ２７がＭＡｂ３Ｄ９Ｆによって識別されない理由は 明らかでない。

さらに、ＲＶに対してＨＩ活性を有１−るその他のＭＡｂｓ　３Ｄ５Ｄｉ６よび １２［１２Ｄは、試験したいずれの合成ペプチドも識別することができなかった 。これら２種類のＭＡｂｓによって識別される赤血球凝集エピトープの構造が一 致し、直線性ペプチドに似せることができなかったためと思われる。

この結果に基づいて、２つの結論が得られる。　（１）それぞれＭＡｂｓ２１Ｂ ９Ｈおよび１６Ａ　１０Ｅとの反応性に基づいて、２種類の明確なウィルス中和 エピトープの配列を残基１９８−２３３　（ＰＤＰＧＤＬＶＥＹ　Ｉ　ＭＮＹＴ ＧＮＱＱＳ　１２ＷＧＬＧＳ　ＰＮＣＨＧＰＤＷＡＳＰ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 　：　２５）および２１９−２３３　（ＧＬＧＳＰＮＣＨＧＰＤＷＡＳＩ’　（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２６）　と決定した。　（２）ＭＡｂ３Ｄ９Ｆによって規 定される赤血球凝集エピトープの配列を、残基２１２−２４０　（ＧＮＱＱＳＲ ＷＧＬＧＳＰ　Ｎ　ＣＨＧ　Ｐ　Ｄ　Ｗ　Ａ　Ｓ　Ｐ　Ｖ　ＣＱ　ＲＨＳ　ｆ） 、Ｓ　Ｅ　Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ：２８）　と決定した。

したがって、これらＥ１エピトープに相当するアミノ酸配列からなるペプチドの ｒＩＡ合物は、Ｉ（Ｖ中和抗体および１１１抗体の存在を検出するための診断キ ットとして使用することができる。また、本発明に係わるペプチドは、ＲＶ抗体 の存在を検出するための標準的免疫検定にも使用することができる。

各ペプチドをＦ　ｒ　ｅ　ｕ　ｎ　ｄのアジュバントに乳化させ、マウス、モル モットおよびウサギに免疫投与して、ＲＶペプチドの哺乳動物におけるペプチド 特異性抗体反応誘導能を測定した。３回注射した（ペプチド５〜１００μｇ／回 ）後、ペプチド特異性Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　ｓおよびＲＶに対する免疫プロット によりＩｇＧ抗体反応を試験した。ウサギの抗Ｅ！および抗Ｃペプチド抗血清は 、いずれも免疫ペプチドと特異的に反応し、また免疫プロットにおいて相当する 親タンパクを識別した（例えば、図５および６を参照）。一方、ウサギの抗Ｅ２ ペプチドは、免疫プロットで一部のものしかＥ２と反応しなかった。これらの抗 血清はＥ２−２、Ｅ２−３、Ｅ２−５、Ｅ２−７およびＥ２−１２を用いて生産 させた。遊離のＲＶペプチドは強いＩｇＧ抗体反応を惹起するので、これらの結 果からし１およびＣタンパクに由来する全ての合成ペプチドならびにＥ２タンパ クニ由宋するＩＥ２２（残基ｒｓ−３６，５ＬＥＱＩＩ）　Ｎｏ：３１）、＋５ ２−３（残！Ｉ；３３−５７、Ｓ　ｒＥ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　ｏ　：　３コｌ）、 １Ｅ２−５（残基６９−９１．５ＬＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３５）、Ｅ２−７（残基 ｌ□＋＝＋２４）およびし２−１２（残基１９５−２２０、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ ：４０）は、′「および［３ＭＡ胞エピトープからなっていると考えられる。さ らに、これらのペプチド中にＴ細胞エピトープが存在することは、以下に記載す るように、ヒトＴＪＩＩ胞増殖試験によって確認された。

したがって、ウサギ抗ＲＶペプチド抗血清がＲＶｌｌｔ造タンパクを識別できる ことは、ＲＶペプチド（またはＲＶ合成ペプチドの混合物）が哺乳動物において ＲＶに対する高力価の抗体を誘導することを暗示している６本発明に係わるペプ チドを用いて生産させたＲＶ特異性ポリクローナル抗体は、あらゆる生物試料に おけるＲＶの存在を検出するための免疫検定に使用することができる。

モルモット抗Ｅ１ペプチド抗血清によるｌり■の中和さらに、赤血球凝集阻止（ ｌ（ｚおよびウィルス中和（ＶＮ）検定を用いて、容体Ｅ＋および抗Ｅ２ペプチ ド抗血清の免疫学的性質を検討した。直線性ペプチドを用いて生産させた抗組清 は、いずれもＲＶを中和することができなかった。しかし、ペプチドＲＶ　−Ｃ Ｐ２７　（ＰＤＰＧＤＬＶＩＥＹ　ＩＭＮＹ］’ＧＮＱＱｓＩ（Ｗ　Ｇ　Ｌ　Ｇ 　Ｓ　Ｐ　Ｎ　ＣＩＩ　Ｇ　Ｉ）　Ｄ　Ｗ　Ａ　Ｓ　１１　Ｖ　ＣＱ　１口１５ ＋１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２７）またはそのＴ末端トランケート相同体Ｉｔ　 Ｖ　−［シ１１２８　（Ｇ　Ｎ　Ｑ　Ｑ　Ｓ　Ｉｔ　Ｗ　Ｇ　１．　ＧＳＩ）Ｎ ＣＨＧＩ’ＤＷＡＳＰＶＣＱＩ＜［ＥＳ＋３．５１４ＱＩＤ　Ｎｏ：２８）の酸 化体を用いて生産させたモルモットの抗血清は、補体の存在しない条件下でＭ３ ３を中和することができた（下表１１）、酸化型ＲＶ　−ＥＰ２８は長鎖のペプ チドＩ（Ｖ　−［Ｅ　Ｐ　２７に比較して免疫原性が高いと思われる。Ｔ　ｃ　 ｒ　ｒ　ｙら（Ａｒｃｈ。

Ｖｉｒｏｌ、　９８：１８９−１９７．　１９８８）はＥｌの２４５−２８５残 基内にある３種類の中和エピトープを同定しているが、これらのエピトープ（Ｒ Ｖ−ＥＰＩ４、残基２４０−２５９、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　１４；−ＥＰ　ｌ 　５、残基２５６−２７５．５ＥＱ１０　Ｎｏ：Ｉ５；−ＥＰＩ６、残基２７２ −２９１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１６）はいずれも、我々の実験では抗体反応を 中和することができなかった（Ｆ表１り、さらに、以下に記載するように、ＲＶ 　−１１ＺＰ　２７ペプチドの範囲内で、３種子１の明瞭なヒト「細胞エピトー プ（ＲＶ−ＥＰｌｌ、残基１９０−２０９、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　Ｉ　ｌ　； ＲＶ−ＥＰＩ２、残基２Ｑ７−２２６、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：Ｉ２；ＲＶ−ＥＰ ＋３、残基２２４−２４３、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ”：１３）を同定した。ＲＶ− ＩＥＩ）２７は、哺乳動物において抗体反応を中和し、：３種類の明瞭なヒトｌ ’　Ｊ’ｌｌｌ胞エピトープを含んでいるので、新規なワクチンとして使用する ことができる。

したがって、本発明に係わるペプチドは、例えばＲ′Ｊ　Ｍ３３株またはその一 部、変異体、または突然変■体のＥｌのアミノ酸１９８−２４０に相当する配列 （ＰＤＰＧＤＬＶＥＹＩＭＮＹＴＧＮＱＱＳＲＷＧＬ、、　Ｓ　Ｐ　Ｎ　ＣＨＧ 　Ｐ　Ｄ　Ｗ　Ａ　Ｓ　Ｐ　Ｖ　ＣＱ　ＲＨＳ　Ｐ、Ｓ　Ｅ　Ｑ１０　Ｎｏ：２ ７）を有する。また、本発明のペプチドは、Ｍ３３以外のＲＶ単離体の相同ＲＶ 　−Ｅ　Ｐ　２７領域に相当する配列を持つこともできる。これらの配列はＲＶ −ＥＰ２７様”と表示する。さらに、本発明に記載したペプチドは、脂質で修飾 してリボペプチドとし、または担体分子にリンクさせて（または重合化させ）、 別のワクチンを生産させることもできる。

これらのワクチンは、例えば筋肉内または非経口的に哺乳動物に投与し、または 微粒子、カプセル、リポソームまたは毒素および抗体等の標的分子を用いて表面 粘膜の表面に運搬させることにより、ＲＶｆｉＡ染に対する免疫付与に使用する ことができる。

ＲＶペプチドに対するヒトＴＭ胞の反応１１　Ｖ感染またはワクチン投与により 免疫経験を有する多くのパネラ−から得たＲ　ＶペプチドおよびＴＪ％Ｉ胞株を 用い、ヒトＲＶ＠異性１゛細胞エピトープを測定した。Ｉｔ　Ｖ特異性Ｔ１ｇＢ 胞株のオーバーラツプＩＥ　ｌペプチド（最初の２３ペプチド）、Ｒ２ペプチド （１５ペプチド）およびＣペプチド（１１ペプチド）に対するリンパ球増殖反応 は、従来の増殖検定を用いて測定した。

その結果から、４試験群の各被試験者はＥｌ、［Ｒ２およびＣペプチドに対して 異なる反応を示すことが明らかとなった（下表５〜１０）。合成ペプチドの全て が増殖反応を誘導するとは限らず、ＴＭＡ胞の識別はＭ　ｌ−ＩＣに限られてい た。Ｅｌタンパクの残基１−２２．３８−５７．５４−７４、＋０６−１２５、 １４０−１５９、１５７−１７６、＋７４−１９３、１９０−２０９．２０７− ２２６．２２４−２４３，２４０−２５９．２５６−２７５．２７２−２９１． ２８９−３０８．３０７−３２６．３２４−３４３．３４１−３６０．３５８− ３７７．３７４−３９０、および３９１−４１２、Ｒ２タンパクの残基１−２０ 、１５−３６．５３−７３、１４０−１６０、　＋５７−１７８．１７７−２０ ０．２１９−２４０、および２３４−２５８、Ｃタンパクの残基１−３０．５２ −７８、７４−１００．９６−１２３、１１９−１５１．　１５１−１７８、１ ７６−２０２．２０５−２３３．２３１−２５７、および２５５−２８０に相当 する合成ペプチドは、適当なヒトＭ　Ｍ　Ｃコンテキストに存在するとＲＶ特異 性Ｔ細胞株に対してきわめて高い刺激性を有することが明らかとなった。■：、 １ペプチド２３種のうち１９種、Ｒ２ペプチド１５Ｔ！のうち８種、およびＣペ プチド１１８１のうち１０種は、増殖検定で活性が認められた。これらの結果は 、優勢なＴ細胞エピトープは主としてＥｌおよびＣタンパク上に存在し、Ｒ２タ ンパクでは少ないことが認められた。

Ｒ２タンパクの残基２０７−２２６，２８９−３０８．３２４−３４３、および ３５８−３７７、Ｒ２タンパクの残基５４−７４、およびＣタンパクの残基１１ ９−１５２．２０５−２３３、および２５５−２８０は、５種類以上のヒトＲＶ 冬季性ＴＮＡ胞株によって識別された。４種類のＥ１特異性ＴＮＡ胞クローン（ ＲｖＥｐ−ｔｏペプチド特異性クローンＲ９およびＲ２０、ＲＶＥＰ−１８特異 性クローンＲ２およびＲ１２）、Ｅ２特異性Ｔｅｌ＋胞クローン２種類（Ｒ２− ４特異性クローンＡ３およびＡ８）およびＣ特異性Ｔ細胞りローン９種類（Ｃ６ ペプチド特異性クローンＲ５、Ｒ８、Ｒ１０，Ｒ１１、およびＲＩ　８　；　Ｃ ９ペプチド特異性クローンＡ２およびＡｌ　冒Ｃ＋　１ペプチド特異性クローン ＡＩＯおよびＡｌ２）が確立されている。３種類のＣ特異性Ｔｍ胞は、ＲＶまた はＣタンパクまたはペプチドＣ６（残基１１９−１５１）の存在下で、ＥＢＶ転 換転換自己由来リン８フ 的に対して細胞溶融活性を示した。このようにして、細胞毒性を有するＴ＋ｍ胞 エピトープをＣタンパクの残基１１９−１５１にマツプした。

ＤｃｌｅｓｉおよびＢｅｒｚｏｆｓｋｙら（参考文献１２）は、Ｔａ１ｌ胞エピ トープの構造として両親媒性のα螺旋構造を提案している。ＲｏＬｈｂａｒｄお よびＴａｙｌｏｒ　（ＥＭＢＯＪ、７：９３−１００゜１９８８）はＴＩＡ胞エ ビトープモチーブの構造として別の構造を提案している。Ｉｌ能的ヒトＴ細胞エ ピトープを含むＲＶペプチドを用いて構造解析を行い、その活性が構造特性と関 連があるか否か検討した。α螺旋セグメントを有する２５種のペプチドのうち５ １１およびＲｏｔｈｂａｒｄのＴＭ胞受容体結合モチーフを有する２９種のペプ チドのうち７種が試験した２０種のＴｍ胞のいずれに対しても刺激しないことが 認められた。それに対して、特異的Ｔｍ胞エピトープ構造を有さない３種のペプ チド（ＲＶ−ＥＰＩ９、−ＥＰ２３およびＲ２−１３）が刺激性を有していた。

これらの結果は、ＴＭ胞エピトープの構造解析アルゴリズムがＴＪＩＩＢ胞決定 因予決定因子絶対的な基準ではないこと、またペプチドが機能性Ｔｉ胞エピトー プを含んでいるか否か決定できるのはｉｎ　ｖｉＬｒｏの増殖試験のみであるこ とを暗示している。したがって、有効な合成ワクチンを設計するためには、いろ いろな遺伝的背景およびＲＶ感染または免疫投与によって多様な免疫経験を持っ ている被験者のＴｍ胞によって識別されるエピトープを同定することが重要であ る。

ヒトＴｉ胞エピトープを含むペプチドは、試験した４試験群のうち、健全な血清 陽性者および風疹ワクチン被接種者のグループで最も頻繁に検出された。特に興 味があったのは、先天性風疹症候（ＣＲ３）を有する５人の患者のうち３人がい ずれのペプチドにも反応しなかったことである。ＣＲ３患者のなかにはＲＶ抗体 のＴｉ１胞識別欠損患者がおり、そのためＲＶ複写が終息しないか、終息が遅れ るものと思われ、したがって、ウィルスの持続性に決定的な働きをしていると思 われる。風疹感染または免疫接種は自己免疫災患の誘発と関連があるという認識 が高まっていることから、あらゆるＲＶワクチンから特定の免疫反応性ＴＪＩ胞 エピトープを除去する必要がある０合成ペプチドに基づ＜ＲＶワクチンは、強力 なとトＴｍ胞エピトープの混合物を含めたり、自己免疫をもたらす想定上のＴｉ 胞エピトープを除外することが可能である。

リボペプチドの免疫原性 細胞仲介免疫（ＣＭＩ）の世代は、ＲＶに対する免疫反応の決定的なコンポーネ ントである。　１９種類のりボベブチド（脂質の結合、Ｎ−バルミトイル−８− ［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−プロピル］−システィンーセリンーセ リン、により修飾した１（■ペプチド）をＲＶの構造タンパクより選抜し、合成 した（下表１２）、これらリボペプチドのいくつかはＣＴＬエピトープ対立遺伝 子特異性モチーフ、ｘ　（Ｙ）ｘｘｘｘｘ　（Ｌ、Ｉ、Ｍ）ｘまたはｘ　（Ｌ、 ［、Ｍ）ｘｘｘｘｘＹｘを含む（Ｆａ＋にら、Ｎ　ａ　（ｕ　ｒ　ｃ。

３５１　：２９０．　＋９９１；Ｒｏｍｅｒｏ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１７４：６０３−６１２．　１９９１）、これらＲＶリボペプチドについて、 ＭＨＣＨ−２、Ｈ−２および■（−２ハブロタイブの３系統のマウスにおけるペ プチド特異性抗体およびＴｍ胞反応の誘導性を検定した１例えば、２系統のマウ ス、Ｂａ１ｂ　／　ｃおよびＡｌ１においては、Ｆｒｅｕｎｄアジエパント中の りボペプチドＴＰＲＶ−Ｃ９が強いＴＭ胞増殖を誘導した。

ＲＶ−Ｃ９はＣ１２Ａの存在下で注射した場合ＲＶ−０９特異性抗体反応のみを 誘導したが、生理食塩水の存在下では抗体反応の誘導がみられなかった。一方、 生理食塩水中のＴ　Ｉ）　ＲＶ　−Ｃ９リボペプチドは強いペプチド特異性１ｇ Ｇ抗体反応を誘導し、最も良好な反応はＣＦＡとともに投与した場合に得られた 。これらの結果は、リボペプチドがＴおよびＢ）Ｑ胞反応誘尋に使用できること を実証するものである。このように、本発明は、　ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＲＶ に対する体液性および細胞仲介免疫反応を誘導することのできる合成リボペプチ ド（または合成リボペプチドの混合物）からなる、リボペプチドは、例えばＲＶ Ｍ３３株のＣタンパクのアミノ酸２０５−２３３に相当する配列トリバルミチル −ＣＳ　Ｓ　Ｖ　ＲＡ　Ｙ　Ｎ　Ｑ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｄ　Ｖ　ＲＧＶＷＧＫＧＥＲ ＴＹＡＥＱＤＦＲＶ　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ：３４）を有することができる。

前記のペプチドの変異体または機能的に同等な変異体はいずれも本発明の範囲に 含まれることは言うまでもない、前記の”変異体”または”機能的に同等な変異 体”とは、アミノ酸残基の１つまたはそれ以上を付加、除去または誘導体化する ことにより、またはいかなる点でペプチドを修飾しても、あらゆる風疹ウィルス 単離体に対してＥｌ、Ｒ２およびＣペプチドと同様に作用することを意味し、こ の場合本発明の範囲に含まれる。

これらペプチド（表１〜３、および１２）およびあらゆる同様なペプチドのアミ ノ酸配列が与えられると、これらのペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ等の市販のペプチド合成装置を用いて容易に合 成することができ、または組換えＤＮＡ技術により製造することができる。

上記の開示は、本発明を一般的に記述したものである。さらに詳細な理解は、以 下の実施例を参照することにより得られる。これらの実施例は説明を目的とした ものであり、本発明を限定する意図はない、状況が手段を暗示または提示してい るため、態様の変更または相当するものを置き換えることは容易である。ここで は特定の川１５を使用したが、このような用語は記述を意図したものであり、限 定のためではない。本明細書では免疫学的およびウィルス学的方法が明確に記載 されていないかも知れないが、当該技術分野の専門家には容易に理解できるもの である。

実施例 実施例１ 本実施例は、風疹ウィルスの調製を説明するものである。

ＲＶ１７）Ｍ３３株（ＡＴＣＣ，ＶＲ−３１５）　ヲ−＜ｇ細胞で培養し、すで に報告されている方法（参考文献１０）にしたがって培地の上清から分屋した。

ウィルスのペレットを少量のＰＢＳに懸澗させ、−７０’Ｃに保存した。Ｆｕｋ ｕｄａ、０ｋｕｎｏおよびＷ　ａ　ｘ　ｈａｍら（参考文献１４．３９．５０） により記載されている方法を改良した免疫細胞化学的焦点検定法を用い、このウ ィルス原液をＲＫ　１３　ｇ胞中で滴定した。

ウィルス原液（５ｘｌＯ’焦点形成単位［ｒ？Ｉ’ＬＪ］／ｍＩ）は、使用前に ＵＶ光（２５４ｎｍ、Ｍｏｄ　ｅ　ＩＬＩＶＧ−５４ＵＶ　ｒ’ｒｏｄｕｃ＋ｓ 　Ｉｎｃ、）を１０分間照射して不活性化した。

実施例２ 本実施例は、ペプチドの合成を説明するものである。

ペプチドは、固相法（参考文献３１）を用い、自動Ａｌ３１　４３０Ａペプチド 合成装置中で合成した。風疹ウィルス構造タンパクの配列のほとんどをカバーす る４４種類のペプチドを合成した。一部のペプチドは、表の脚注（Ｃ）に示した ように、抱合体化を目的としてさらにシスティン残基をＮ末端またはＣ末端に付 加した０合成ペプチドをＨＦにより樹脂から解裂させ、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４カラム を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。いずれのペプチド調 製物も、純度は９５％を超えていた。全てのペプチドについて、Ｗａｔｅｒｓ　 Ｐｉｃｏ−Ｔａｇシステムでアミノ酸分析を行い、理論的組成とよく一致してい ることを確認した。

実施例３ 本実施例は、ＲＶＶ異性モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の世代を説明するもの である。

精製した風疹ウィルスＲＡ−２７７３株（５００赤血球凝集（Ｈり単位／用量／ マウス）を完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦ　Ａ）とともに４週齢のＢａＩ ｂ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与して、免疫賦与を行った。３週間間隔で、２５０ 　ＨＡ単位／マウスを５回投与した。Ｅｔ後に、融合３１Ｊ　ｉｉ＋Ｉに５００ 　ＩＩ　Ａ単位／用量／マウスを生理食塩水とともに投与した。ポリエチレング リコール１５００を用い、免疫牌ＰｉａＮＡ胞をＮ５＝１骨髄謹細胞と融合させ た（参考文献１５）。　Ｉｚ　ｆａｒ中の風疹特異性抗体をＥＬＩＳ八でスクリ ーニングし、陽性ウェルの細胞を単細胞希釈コローユング法で２回クローン化し た。各ハイブリドーマ細胞株を培養し、種株を液体窒素中に保存した。ＲＶ特異 性Ｍ　Ａ　ｂ　ｓを分泌させるためにハイブリドーマ細胞を接種したマウスから 、腹水を採取した。１３　ｊ　ＯＲａ　ｄ　Ａ　ｒ　ｒ　ｉ−ゲル　タンパクＡ 　ＭＡＰＳ　ＩＩＩｚテムを用い、腹水中の抗体を精製した。ヤギのモノクロー ナル抗マウスＩｇＧサブクラス抗血清（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍｅｓ 、　ＣＡ）を用いた寒天二重免疫拡散法で、　ＩｇＧモノクローナル抗体のサブ クラスを測定した。赤血球凝集阻止（ＨＩ）検定は、ヘパリン塩化マンガン法（ 参考文献２６）により測定した。ウィルス中和（Ｖ　Ｎ）活性はペスト検定法（ 参考文献Ｉ４）で行った。

実施例４ 本実施例は、免疫投与の手順を説明するものである。

ペプチド特異性抗血清を調製するため、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントで乳化 させた精製ペプチド５〜１１００ｕをマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）、モルモットまた はＮＺＷｆＭウサギ（Ｍａｐｌｃ　Ｌａｎｃ　Ｆａｒｍ、ｏｎｌａｒｉｏ）の筋 肉内に免疫投ノｊした。　＋４および２８１１後に、Ｆｒｃｕｎｄの完全アジュ バントに乳化させた同じ免疫原で追加抗原投与した。最終追加抗原投与から２週 間後に血清を採取し、５６℃で加熱不活性化し、−２０℃に保存した。

実施例５ 本実施例は、ＲＶ特特異性側細胞株継代を説明するものである。

すでに報告されている方法（参考文献５．６）にしたがって、ＲＶ血清陽性ｍ者 から採取したヘパリン化血液をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、）　グラジェントで遠心分離して 、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。２４ウエルプレート　（Ｇｉｂｃｏ ）中のＰ　ＢＭＣ（２，５ｘ　１０６Ｉｌａ胞／ｍ１）を、　１０％自己由来血 漿追加完全培地（Ｌ−グルタミン２　ｍ　Ｍ、ＩＩ　ｃｐａｓ２５ｍＭ、ペニシ リン５０　ｍ　Ｍ、ストレプトマイシン５０　ｍ　Ｍ、および２−メルカプトエ タノール５ｘ　１０−’Ｍを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｓｉｇｍａ））中で 、ＵＶ不活性化ＲＶ　（５ｘ　Ｉ　Ｏ’　ＰＰ（Ｊ／ｍ　＋　）　とともに培養 した。　３７℃で７日間培養後、細胞を培地で３回洗い、　ＩＯ％仔牛血漿（Ｆ 　ＣＳ　）および１００　Ｕ　／　ｍ　＋のヒト遺伝子組換えＩＬ−２（ＣｅＩ ｕｓ）を追加した完全培地に、　Ｉ　ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／　ｍ　１となるように 懸渇させた。さらに７１」間培養したのち、抗原特異性増殖検定を行なった。

実施例６ 本実施例は、Ｔ細胞増殖検定を説明するものである。

抗体保有者から採取したＴリン３球細胞（２Ｘ　１０’　ＰＢＭＣＸＩ胞／ウェ ル）を、すでに報告されているように（参考文献６．７）、　１０％ＦＣ３およ び各種濃度の抗原（個人ペプチドまたは不活性化ＲＶ）を含む完全培地とともに 、９６ウエル丸底プレート中で３日間培養した。培養終了１５〜２０時間前に、 　ｌμＣｉ／μＣ用（７）［３Ｈ］チミジン（ＤｕＰｏｎｔ）を培地に添加した 。細胞ハーベスタ−（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＰＩＩＤ） を用いて細胞を収穫し、濾過したのち液体シンチレーションカウンタ（Ｂｅｃｋ ｍａｎ　Ｌａ　６８００）で計測した。

結果は、３回測定の１分間あたり平均カウント（ｃｐｍ）および平均値の標準誤 差゛または細胞増殖指数〔Ｃｐｒ）（抗原非存在下（バックグランド）の平均取 込量ｃｐｍに対する抗原存在下の平均取込Ｉｔ　ｃ　ｐ　ｍの比）として表示す る。２またはそれ以上のＣＰＩを統計学的に有意と考えた。

実施例７ 本実施例は、Ｅ［３Ｖ形形質転換側細胞の継代を説明するものである。

抗原運搬細胞（ＡＰＣ）または標的細胞として使用Ｌ　ｔニー　ＩＥ　［３Ｖ形 質転換ＢＳ胞は、　１０７（７）ｌ’１３Ｍｃを１゜’　ＰＦ［ＪのＥＩ３Ｖ１ ｍｌと３７℃で１時間培養して、確立した。細胞を洗ったのち、完全培地中で培 養した。

ＰＨＡ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を５μｇ／ｍ＋の濃度で１回添加し、新鮮培地を２ 日毎に添加して２週間培養した。

実施例８ 本実施例は風疹ウィルス特異性Ｔリンパ球細胞クローンの継代を説明するもので ある。

この試験に使川したＴ！Ｉ胞クマクローン前記の実施例５で記載したように健全 な男性献血者（ＲＭ）に由来するＣＤ４”、ＣＤ８−　ＴＩＩａ胞株から分屋Ｌ り、ＲＭのＨＬ　Ａ表現型は、ＳＬ、Ｖｉｎｃｅｎｔ＃ｆ院（■ａ　ｎ　ｃ　ｏ 　ｕ　ｖ　ｅ　ｒ、Ｂ、Ｃ，、カナダ）のＨＬＡ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｔｙｐｉｎｇ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙによりＨＬ、Ａ−Ａ、２．　１　Ｉ　；　ＨＬＡ−Ｂ、 １３．　６１゜Ｗ４．Ｗ６　；　ＨＬＡ−ＣＷ３　；　ＨＬＡ−ＤＲ，Ｗ９゜Ｗ Ｓ２；ＨＬＡ−ＤＱ、Ｗ３であると決定された。９６ウエル丸底プレート　（Ｎ 　ｕ　ｎ　ｃ　）を用い、ＲＶ反反応ソリ２８球細胞ウェルあたりＩＪＱ胞添加 し、ＵＶ不活性化ＲＶ　（５ｘ　１０’　ＰＦＵ／ｍ　＋）、５％リンスオカル トーＴ−ＬＰ　（［３ｉｏｔｅｓ　ｔ、西ドイツ）、５０μ／　ｍ　ｌのｒ　Ｉ 　Ｌ　−２およびγ−線照射自己山由来　ＯＭＣ（５ｘ　１０’／ウエル）の存 在下で制限希釈を行い、クローン化した。７１］間培養したのち、　５％リンフ ォカルトーＴ−ＬＰ　（ｒ３ｉｏ＋ｃｓｔ、西ドイツ）および５０μ／ｍｌのｒ ｌＬ−２を含む完全培地を各ウェルに添加した。１０−１２１１間培養すると、 低倍率の倒立顕微鏡下で生汀細胞のクローンが容易に検出される。これらのウェ ルのそれぞれがら細胞を９６ウエルの平底プレートの３つのウェルに移し、上記 のようにｒＩＬ−２を含む新鮮な培地を添加した。５〜７日間培養したのち、Ｕ Ｖ不活性化ＲＶおよび照射した自己由来ＰＢＭＣを含む４ウエルのプレート（Ｎ ｕｎＣ）の各ウェルに細胞を移し、同時に増殖検定を用いて細胞の抗原反応性を 検定した。

実施例９ 本実施例は、細胞仲介細胞毒性検定を説明するものである。

自己由来ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ｌχＩＱ４）を、５ｘｌＯフのＵｖ 不活性化ＲＶまたハ５　ｕ　ｇ／ｍｌの合成ペプチドを含む１　ｍ　ｌの完全培 地に接種し、３７℃で一夜培養した。翌日、細胞を１回洗ったのち、＋　００　 ｐ　ＣｉのＮａ”Ｃｒ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１時間標識した０次に、標的細 胞を培地で４回洗い、数の異なるＴＭ胞とともに９６ウエルの丸底プレート（Ｎ ｕｎｃ）中で４時間培養した。式：１００［（ＭＲ−３Ｒ）／　（ＭＲ−５Ｒ） コ、ココテ、ＥＲ（実験よりめた”ＣｒのｔＬ嘔値）＝標的細胞５ｘｌＱ３を用 い、Ｔ細胞の存在下で上清中にｉｓした放射能の試料３点の値、ｃｐｍ；ＳＲ（ 自然発生的”Ｃｒの遊離値）＝試料４点についてめたＴ１１ａ胞非存在下におけ るＣｐ　ｍ＋　Ｍ　Ｒ（最大５１Ｃ「遊離値）＃試料４点についてめた０、５％ ノニデートーＰ４０（Ｓｉｇｍａ）とともに培養したときの標的細胞上清中のｃ ｐｍである。

ＳＲは、常にＭＲの２０％を超えなかった。

実施例１Ｏ この実施例では、ＴＪ１５胞表面抗原の表現型解析を説明する。

短期間培養したＴ＃ｌ胞（２ｘｌＯ’）を、フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウ ス抗ＣＤ３　［１０Ｔ３−ｒ’夏（ＹＣＯ］、抗ＣＤ　４　［１０Ｔ　４−　Ｐ 　ＨＹ　ＣＯコ、抗ＣＤ８　（１０Ｔ８−ＰＨＹＣＯ］　％／クローナル抗体（ ＡＭＡ　ＣＩ　ｎ　ｃ、）または正常なマウス血清とともに氷上で０．５時間培 養した（参考文献５）。５％ＦＣ５を含むＰＩ３５で３回細胞を洗い、蛍光活性 化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）（ＥＰＩＣ３，Ｃｏｕｌ＋ｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｃ　Ｃｏ、）を用いた細胞量分析に供した。陰性対照として、ＢＡ　Ｌ　Ｂ　 ／　ｃ系正常マウスのプールした血清を用いた。

実施例１１ 本実施例では、ペプチド特異性ＥＬ　Ｉ　ＳＡを説明する。

コーティング緩衝液（Ｎａ　２ＣＯ３１５ｍＭ、ＮＨＣＯｘ　３５ｍＭ、ｐＨ９ ，６）に溶解したペプチド（ｌμｇ／ウェル）を用い、すでに報告されてしする （＃考文献１６．４５）ようにミクロ滴定プレート（Ｎｕｎｃ−１ｍｍｕｎｏ、 Ｎｕｎｃ、チンマーク）を室温で一夜コーティングした。希釈液（０，５％Ｂ　 Ｓ　Ａ、帆　５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ）でウェルを１時間ブロック し、血清試料（ヒト、ウサギまたはマウス抗血清）を１：１６から１：２０４８ の希釈率になるように添加し、１時間培養した。ウェルを洗浄緩衝液（０，１％ 　ＢＳＡ、０．５％　Ｔ　ｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。アフ ィニティークロマトグラフィーで精製し、ホスファターゼでヒト■ｇＧ、マウス ＩｇＧまたはウサギＩｇＧに抱合させたヤギ抗体を添加した。　１時間培養した のち、プレートを５回洗浄し、　１６０μＬ／ウエルのリン酸ｐ−ニトロフェノ ール（１０％　ジェタノールアミン。

０．０１％　ＭｇＣｌ２．ｐｌｉ　９．８でｚ、５ｍｇ／ｍ＋としたもの）を添 加して発色させた。０．５時間後に、　［３ｉ　ｏ　−Ｒａ　ｄ　Ｍ　ｉ　ｃ　 ｒ　ｏ　ｏ　ｌ　ａ　ｔ　ｅ　Ｒｅａｄｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　３５５０を用い、４ ０５ｎｍで最大吸光度を測定した。陰性対照として、ヒトＩ（Ｖ陰性ｔｈＬ清お よびプレ免疫ウサギ直情を用いた。ヒト血清の血清陽性は、陰性対照の平均値＋ ３標牛偏差を超える値とした。ヒトペプチドＬ（Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａの陰性対照値は 、各ペプチドを一連の陰性対照血清で測定し、吸光度を平均してめた。陽性は、 血清を１＝６４に希釈して測定した。各標本は、少なくとも３回試験した。

実施例１２ この実施例では、免疫プロットを説明する。

精製した風疹ウィルス粒子を、０．　１％　ＳＤＳ添加１０％ポリアクリルアミ ド　ゲルを囲いた５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動で分離したタンパクをニ トロセルロース　メンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した 。４％粉末スキムミルクを含むＴＢＳ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　ト リスＨＣ１，ｐＨ７，５）でメンプランをブロックし、ヒト抗ＲＶ血清（希釈率 １：８０）またはウサギ抗ペプチド血清（希釈率１：１００）とともに培養した 。パーオキシダーゼ抱合化抗ヒトＩｇＧまたは抗つサギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ　 Ｃｏｒｏｏｒａｔ　１ｏｎ）を用い、タンパクを可視化した。ビデオデンシトメ ータ　６２０　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いて免疫 プロットストリップを走査し、吸収ピークの面積を積分してバンドの相対濃度を めた。

実施例１３ この実施例では、ヒトＭ　１１　ＣクラスｌおよびＩＩ抗原に対するマウスＭＡ ｂによる細胞毒性゛■゛ヘルパー細胞増殖の阻害を説明する。

ＤＲ同形決定囚子特異性ＭＡｂ　Ｌ　２４３は口Ｃｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏ ｎより人手した。　ＭＡｂＧ２ａ、５（抗ＤＲＤＣ−１、ＤＲ４、ＤＲ５）、Ｍ Ａｂ　ＩＶＤ１２（抗ＤＱｗ３）、ＭＡｂ　５ＦＲ−ＤＲ５（抗ＤＲ５）、ＭＡ ｂ　ｗ６／３２（抗ＩＩ　ＬＡＡ％　Ｂ、Ｃ）は、アメリカン　タイプ　カルチ ャー　コレクションから購入した。

実施例１４ 本実施例は、ＨＬ　Ａ組織タイピングについて説明するものである。

献血者２０名のクラス■およびＩＩ（ＤＲおよびＤＱ）抗原のＨＬ　Ａタイピン グは、新鮮なＰＢＭＣについて、ＳＬ、Ｖｉｎｃｅｎｔｉ院（Ｖａｎｃｏｕｖｅ ｒ、Ｂ、Ｃ，カナダ）のＨ＋−Ａ　Ｔ　ｉ　ｓ　ｓ　ｕ　ｃ　Ｔ　ｙｐｉｎｇ　 ＬａｂｏｒａＩｏｒｙでおこなわれた。実施例１５ この実施例は、風疹法原活性の測定法を説明するものである。

ＨＡ検定には、ヘパリン／塩化マンガン法（参考文献２６）を用いた。９６ウエ ルの丸底ミクロタイタープレートの１０ウエルに、ＨＳ　Ａ　Ｇ　ｕｉ衝液液２ ５＃ＬＩｌｅｐａｓ　０．０２５Ｍ、ＮａＣｌ　Ｏ，１４Ｍ。

ＣａＣｌ２　・　２１１２０　０．　０２５Ｍ、　１　％　［３Ｓ　Ａ。

シェラチン０．０２５ｍｇ／Ｌ、ｐｌｉ６．５）を添加したのち、最初のウェル に調製風疹ＩＩ　Ａ抗原２５μｌ。

を添加し、抗原Ｉ：！瓜を２ｆΔに順次希釈した。最後に、抗原を含む全てのウ ェルに２５μＬのＨＳ　Ａ　Ｇ緩衝液を添加し、プレートを４℃に冷却した。Ｈ Ｓ　Ａ　Ｇ　ｕ滴液に懸濁した０、２５重量％日齢のニワトリ赤血球５０μＬを 各ウェルに添加した。プレートを撹拌し、カバーをしたのち、４℃に１．５〜２ 時間静置した。凝集を示す最高希釈率をＩ　ＨＡ単位とした。これ以降の試験に は、４ＨＡ単位の抗原希釈率を使用した。

実施例１６ 本実施例は、非特異性阻止物質を除去するための血清の前処理を説明するもので ある。

風疹ウィルスの赤血球凝集の非特異的血清阻止物質は、ヘパリン処理によって除 去した（参考文献２６）。

血清２０μＬおよびＨＳ　Ａ　Ｇ　Ｈ液液３０μＬをヘバリー　シーＭｎＣＩ　 二Ｉ夜（ＭｎＣｌ　２　１　Ｍ、ヘパリン２５００１　Ｕ　、／　ｍ　＋　）　 ２０　ｐ　Ｌと混合し、４℃で１５分間培養した。その後５０％ニワトリ赤血球 ＨＳ　Ａ　Ｇ懸濁液２０μＬを添加し、撹拌したのち、４℃で１５分間培養した ０次に、Ｈ３ＡＧ緩衝液８０μＬを添加し、　１５ＱＯｒｐｍ（６００ｇ）で１ ５分間遠心して赤血球を沈殿させ、希釈率ｌ：８の上清を得た。

実施例Ｉ７ 本実施例では、血清中の１１１抗原の測定を説明１゛る。

ＩＩ　Ｓ　Ａ　Ｇ　＊液液で２倍に連続希釈して前処理した血清２５μＬを含む 各丸底ウェルおよびＩＩ　Ｓ　Ａ　Ｇ　ａ　１ｉ液のみを２５μＬ含む対照ウェ ル（血清対照）に、２５μＬの風疹抗原（４ＨＡ単位）を添加した。プレートを ４℃で１時間培養した。Ｈ５ＡＧａ衝液のみを含む２個のウェル（細胞対照）を 含む全てのウェルに０゜２５％（Ｗ／Ｖ）日齢ニワトリ赤血球懸濁液５０μＬを 添加し、４℃で１時間培養したのち、さらに室温で１５分間培養した。ａ集が認 められない血清の最高希釈率をＩ　ＨＩ単位とし、希釈率の逆数から血清のＨＩ 力価を算出した。

実施例１８ この実施例では、風疹ウィルスの中和検定（参考文献１４）を説明する。

腹水または対照血清４０μＬを５６℃で２０分間加熱して補体を不活性化し、２ ％のＦｅ２および１％のホスファチジイルセリン（１）　Ｓ　）を含むＭ１９９ で１：５に希釈し、　Ｉ　Ｏ，ＯＯＯｒ　ｏ　ｍで１０分間遠心し、０．２２μ ボアーのＧ　ｅ　ｌ　ｍ　ａ　ｎフィルターで濾過して除菌した。２％ＦＣ５／ １％ｐｓを含むＭｌ　９９培地で血清を２倍に連続希釈し、２．５％ウサギ補体 の存在下および非存在下で、等量のＭ２Ｃまたは１くΔ２７／３風疹ウィルス（ ２％　Ｆ　ＣＳ　／　１％　ｒ’　ｓを含むＭ＋９９培地中で２　１３　Ｉ？　 Ｕ　／μＬ）を添加した。

ウィルス−抗体混合物を３７℃で１時間培養し、５０μＬを９６ウエルのミクロ 滴足プレートの１０齢ＲＫ細胞単層上に採り、３７℃で１時間撹拌培養した。ウ ィルス−抗体混合物を除去し、５％ＦＣ３および！％ＰＳを含むＭ１９９培地に 単層を加え、３５℃で６０〜７２時間培養シタ。ＲＫ　ａａ　ｔｑ単層をＰＢＳ （ｐｔ１７．４）、Ｑ、２ｍｌで２回さ！深く洗浄し、２％中性緩衝ホルマリン ０．２ｍｌを加え、室温で１５分間固定したのち、ＰＢＳ　ＣｐＨ７，４）０． ２ｍｌで２回洗浄した０次に、単層を７０％メタノール、ついで９５％メタノー ルで洗浄し、０．５％Ｈ２Ｏ２１水メタノール［０，２ｍｌを添加し、室温に１ ５分間放置して内在バーオキシザーゼをＸ活性化した。９５％メタノール、つい で７０％メタノールで脱水し、ＰＢＳ（ａｔ（７，４）０．２ｍｌで２回洗浄し た。免疫投与前のウサギ血清（ＰＢＳｌｏ、５％　ＢＳＡで１＝２００に希釈） Ｑ、２ｍｌを添加して、３７℃で１時間培養し、単層の非特異性赤ユ球凝集素結 合部位をブロックし、洗浄緩衝液（１’１３５１０．　１％　［Ｉ　Ｓ　Ａ。

ｐＨ７，４）で２回洗浄した。風疹免疫マウス血清（抗Ｍ３３．ＰＢＳ１０．５ °ｈ　［３ＳＡで１　：　２００に希釈）２００μＬを添加し、３７℃で６０分 間培養したのち、洗浄緩衝液で３回洗った。パーオキシダーゼ抱合化（ＨＲＰ） ウサギ赤１球凝集素抗マウス１ｇＧ（Ｄａｋｏ−免疫グロブリンａ／ｓ、Ｇｕｉ ｄｂ。

ｒｇｖｃｊ　２２．　ＤＫ　−２０００，ＣｏｏｃｎｈａｇｃｎＦ、、デンマー ク、ｐｕｓ７’ｏ、５％１３ＳＡで１　＋　５００に希釈、Ｏ，１ｍｌ／ウェル ）を添加し、３７℃で１時間培養したのち、単層を洗浄緩衝液で３回洗浄した。

０．０２％Ｈ２０，および３．３゜ジアミノベンジディン　テトラヒドロクロリ ド（０゜５ｍｇ／ｍ１．　ｐＨ７，４）を含む冷却Ｐ［３ＳＯ。

１ｍｌを添加し、室温で培養した。褐色の沈着物がみられたとき、ＰＢＳ洗浄に より基質を除き、１０％中性緩衝ホルマリンを添加して反応を止めた。各抗体希 釈率について３ウエルのプラグ数を数え、平均した。

中和力価（Ｎ＋）は、対照ウェル（５０〜１００ｒ’ＦＵ／ウエル）に比較して プラク形成が少なくとも５０％減少する希釈率の逆数とした。

この実施例では、リボペプチドの合成を説明する。

固相ペプチド合成法を用い、１９種類のＲＶのＣＴしエピトープ（下表１２参照 ）と、Ｎ末端にセリン残基を有するそれらのエピトープ２種類を合成した。リボ ペプチドは、Ｍ　ｅ　Ｌ　ｚ　ｇ　ｃ　ｒら（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ ｅｓ、３８：５４５　５５７１．　＋９９１）にしたがって合成したＮ−バルミ トイル−Ｓ　−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−プロピル］−システイ ン（Ｐ３Ｃ）とＣＴＬエピトープのＮ末端を抱合化させて合成した。合成ペプチ ドはｏ　ｐにより樹脂から解裂させ、ＴＳＫカラムとＰＬ３Ｓ緩衝液を用いたゲ ル濾過高速液体クロマトグラフィーで精製した。

全てのりボペプチドについて、Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ−Ｔａｇシステムでアミ ノ酸分析を行なったところ、理論組成値とよく一致した。リボペプチド中のバル ミチン酸の量は、リボペプチドの酸加水分解物をガスクロマトグラフィーで分析 して測定した。

実施例２０ 本実施例では、リボペプチド免疫投与によるマウスＴｍ胞増殖反応の誘導につい て説明１−る。

６〜８週齢のマウス（［３ａ　ｌ　ｂ／Ｃ，Ｃ５７Ｉ３Ｌ／６およびＡ／Ｊ系〕 をＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂから購入した。各ペプチド、例えばＰＩ３５　１００ μｌで調製したＴＰＲＶ−Ｃ９２０〜２００μｇ、ＣＦＡ１００ｕ　ｌ’ｔ’乳 化したＴ　Ｐ　ｉｔ　Ｖ　−Ｃ９２０〜２００回ｇ、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジ ュバント（ｔＦＡ）１００ｕｌで乳化したＴＰＲＶ−Ｃ９２０〜２００μｇまた は対照としてＰ［３Ｓ　：　ＣＦＡ　（５０：　５０゜ｖ／ｖ）１００μＩを各 系統３匹のマウスの足底に皮肉投与して免疫賦与した。リンパ球細胞の懸濁液は 、免疫投与９０後に摘出したリンパ節から調製した。リンパ球細胞（２，５ｘｌ Ｏ’ＮＩＩ胞／ウエル）を、量の異なる免疫ペプチド（例えば、ＲＶ−Ｃ９）と ３０間培養したのち、さらにｌμＣｉの［３１１チミジン存在下で２０時間培養 した。ウサギ補体（１：１０）の存在下および非存在下で、リンパｆｆ１ｌａ胞 を抗ＣＤ４　（ＧＫｌ、５）および抗ＣＤ８　（５３−６，７２）とともに４℃ で６０分間前培養して、ＴＪＱ胞の増殖に対する抗ＣＤ４　（ＧＫｌ、５）およ び抗ＣＤ　８　（５３−６，７２）ＭＡｂｓの影響を測定した。リンパ球細胞の 増殖率は、３回測定したときの平均カウント／分±１標準偏差（ＳＤ）として表 示する。

実施例２１ この実施例は、ペプチドＲＶ−ＥＰ２７の酸化体の調製について説明するもので ある。

ＨＰＬＣ精製ＲＶ−ＥＰ２７　（ｒ’ＢｓＩｏｍ＋あたり５　ｍ　ｇ　）を、Ｔ ａｍら（第１２回　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、 ＥＳＣＯＭ、Ｌ　ａ　ｉ　ｄ　ｅ　ｎ、＋　９９２．　要旨４９９−５０１頁） の手順にしたがって、　１０〜２０％（Ｖ　／　Ｖ　）のジメチルスルホキシド の存在下、室温で１時間酸化した。

分子内にジスルフィド結合（Ｃｙ　ｓ　２２５−　（ｙ　ｓ　２３５　）を有す る酸化ＲＶ　−Ｅ　Ｐ　２７を、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４半精製川カラム（Ｉｘ３０ｃ ｍ）を装着した逆相ＩＩ　Ｉ）　ＬＣで精製した。溶媒は１５〜５５％アセトニ トリル１０．１％Ｔ　Ｆ　Ａのグラジェントを用い、２ｍ１７分の流速で４０分 間展開した。酸化ＲＶ−ＩＥＰ２７ベブチドは質量スペクロル分析により確認し 、分子質量の測定値は理論値とよく一致した。

開示の要約 以上の開示の内容を要約すると、本発明は風疹に対するワクチンに有用な免疫原 性合成ペプチドを提供する０本発明の範囲内で改良が可能である。

１・　入１ｃｈａｌａ、Ｐ、、Ｈ，Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ、Ｒ，Ｍ、Ｚｉｎｋａ ｒｎａｇａｌ　ａｎｄ　Ｍ。

５ｃｈｕｌｚ、　１９９０．　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　 ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｉｍｉｎｇ 　ｗｉｔｈ　ｆｒｅｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、エフ１：：１８１５−１８２０゜２−　Ａｓ５ａｄ、　Ｆ 、、　Ｋ、　Ｌｊｕｎｇａｒｓ−Ｅｓｔｅｖａｓ、　１９８５．　Ｒｕｂｅｌｌ ａ−ｗｏｒｌｄｉｍｐａｃｔ、　Ｒｅｖ、　ｏｆ　Ｉｎｆａｃｔ−Ｄｉｇ、　７ ：５２９−３６゜コ、　Ｂａｒｎ＠ｔｔ、Ｂ、ｃ、、Ｄ−Ｓ−Ｂｕｒｔ、Ｃ，Ｍ 、ＧｒａｈＪｕｎ、Ａ、Ｐ。

Ｗａｒｒａｎ、Ｊ、Ｊ、５ｋａｈ＠１ａｎｄＤ、Ｂ、Ｔｈｏｍａｓ、１９８９． Ｘ−Ａ’ｏｆ　Ｈ）Ｕ　５ｕｂｕｎｉｔ、Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ−１４３＝２６６ ：ｌ−２６７１゜４、　Ｂｕｉｍｏｖｉｃｉ−Ｋｌｅｉｎ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｌ 、　Ｚ、　Ｃｏｏｐａｒ、　１９１３５．　Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔａｄ　ｉｍ ｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓａ　ｉｎ　ｒｕｂａｌｌａ　１ｎｆａｃｔｉｏｎ、Ｒ ｅｖ。

ｏｆ　１ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、フコＳ１２コー１２８゜５、　Ｃａ１ｉｓ、Ｅ− 、Ｐ、Ｃ，ＩＣｕｒＩｑ　ａｎｄ　Ｔ、Ｗ、Ｃｈａｎｇ、１９ａ４゜Ｈｅｐａｔ ｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ−ｒａａｃｔｉｖａ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏ ｃｙｔａ　ａｌｏｎｅ：入ｎｔｉｇａｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｈ ａｌｐｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　。

ｓｙｎ廿＋ａｓｉｓ−Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１３２＝１５１１−１５１６゜６、 　Ｃａ１ｉｓ、　ｒ：＋、　ｏ−Ｏｕ　ａｎｄ　Ｌ、　０ｔｖｏａ、　Ｊｒ、　 ｘ９８ｇ、　Ｒａｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆ ａｃｅ　ａｎｔｉｇａｎ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　Ｔｌｙｍｐｈｏｅｙｔ＠ｓ：　Ｐ ｒｏ！ｉｆ＠ｒａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ　ｍａｊｏｒ　ａｎｔｉｇｔｎｉｃ　ｄ＠ｔａｒｍｉｎａｎｔ　ｄｅｆｉｎ ｅｄ　ｂｙ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄａｓ、コ−ｉｍ、ｕｎｏＬ　！４ ０：１８０８−１８１５゜７、　Ｃａ１ｉｓ、　ｚ、、　Ｄ−Ｏｕ、　Ｂ、　Ｄ ｉａｔｚｓｃｈｏｌｄ　ａｎｄ　Ｈ，Ｘｏｐｒｏｗｓｋｉ。

１９８８、Ｒａｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｉｅｓ　ａｎｄ　ｒａｂｉｅ ｓ−ｒａｌａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓｂｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｄｅｒｉｖａｄ　ｆｒｏ ｍ　ｈｕ＋＋＋ａｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ、　Ｊ。

ＶｉｒｏＬ　６２：コ１２Ｂ−３１３４゜ｓ、　Ｃｈａｒｔｌａｒ、　Ｊ＋　ｘ 、、　Ｄ、　Ｋ、　Ｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ａ、　Ｊ、　Ｔｉｎｇｌｅ、　１９８２ ゜Ｐｅｒｓｉｓｔａｎｔ　ｒｕｂｅｌｌａ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｕ ｂｅｌｌａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ、　Ｌａｎｃｅｔ、ｌ： Ｌ３２コー１３２５゜９、　Ｃｈｏｕ、　Ｐ、Ｙ、ａｎｄ　Ｇ、Ｄ、　Ｆａｓｍ ｎ、　１９７Ｂ−ＦＪ！Ｉｐｉｒｉｃａｌｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、＋７：２５１−２７６；１０、Ｃ１ａｒｋ＠、　Ｄ、　Ｍ−、 Ｔ、　Ｗ、　Ｌｏｏ、工、　Ｈｕｉ、　Ｐ、　Ｃｈｏｎｇ　ａｎｄ　Ｓ。

Ｇ支１１ａｍ、１９８フ＋　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ 　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｅｘｐｒａｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　２４５　ｓｕｂｇ ａｎｏｍｉｃ　ｍａｓｓａｎｇｅｒＲＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｅｌ、Ｅ２　ａｎｄ　Ｃ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠５ｅａｒｃｈ、ｉｓ：３０４１−３０５７゜ １１、Ｃｕ５ｉ、　Ｍ、　Ｇ、、　Ｇ、　Ｍ、　Ｒｏｓｓｏｌｉｍｉ、Ｃ，Ｃａ １ｌｅｓｉ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｅ。

ｖａｌａｎｓｉｎ、１９８Ｂ、　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　 ｗｉｌｄ　ｒｕｂｅｌｌａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔａｉｎｓ　ｆｏｌｌ ｏｗｉｎｇ　ｉｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈＲＡ２７／コ　１ｉｖｅ　ａｔ ｔａｎｕａｔａｄ　ｖｉｒｕｓ、　入ｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、工０Ｌ＝２５−ココ 。

１２、Ｄａｌｉｓｉ、Ｃ，ａｎｄ　Ｊ、Ａ、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　１９８５． 　Ｔ−ｃａｌｌａｎｔｉｇ＠ｎｉｃ　５ｉｔｅｓ　ｔａｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｍ ｐｈｉｐａｔｈｉｃ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ。

ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１１２：フ０４８−７０５２ ゜１コ−ＦｒａｌＡ＠ｒｅ　Ｊ−Ｒ−Ｅ、＃　Ａ−Ｌ−Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｊ！ １．　ｘ、Ｈｏｖｅｔｉｔ　Ｒ−Ｌｃ＆ｃｈａｎｄ　Ｒ，Ｌｕｎｔ、１９８コ、 Ｒｕｂｅｌｌａ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔｓ。

ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ、　ｃｙｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｏｔｈ ｅｒ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆｓｙｎｏｖｉａｌ　ｒａａｃｔｉｏｎ、Ｃ１１ｎ、 Ｅｘｐ、Ｒｈａｕｍａｔｏｌ、工：２＋１７−２９３゜ｘ４．　Ｆｕｋｕｄａ、 　Ａ、、　Ｍ、　Ｈｌｓｓｈｉｙａｍａ、　Ｙ、υｍ１ｎｏ　ａｎｄ　Ａ、　Ｓ ｕｇｉｕｒａ。

ｖａｃｃｉｎ＠、Ｊ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ、　ｉ！＝ ２７９−２８４゜１５、Ｇａｌｇｒａ、　Ｇ、、　５．　Ｈｏｖｅ、　Ｃ，Ｍｉ ｌｓｔａｉｎ、　Ｇ、　Ｗ、　Ｂｕｔｃｈｅｒ　ａｎｄＪ、　Ｃ，Ｈｏｖａｒｄ −１９７７、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｅｏｍｐａｔ ｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｔｉｇａｎｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｂｒｉｄ　 ｃｅｌｌｌｌｎａｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　２６＠：５５０−５５４゜ｘ６．　Ｇｎ ａｎｎ　、ｒｒ、　Ｊ、　’ｋｉ、、　Ｐ、　Ｌ、　Ｓｃｈｖｉｍｍｂｅｃｋ、 　Ｊ、　Ａ、　Ｎａ１ｓｏｎ、　Ａ。

Ｂ、Ｔｒｕａｘ　ａｎｄ　Ｍ、Ｂ、Ａ、０１ｄｓｔａｎａ、１９８フ、　Ｄｉａ ｇｎｏｓｉｓ　ｏｆＡｉｄｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　１２−ａｍｉｎｏ　ａｃ ｉｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｒｅｓａｎｔｉｎｇａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉ ｎａｎｔ　ａｐｉｔｏｐａ　ｏｆ　ｔｈａ　ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ ｉａｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ、Ｊ　ｏｆ工ｎｆａｃｔ、　Ｄｉｓ−１５＋！：２６１ −２６７゜ １７、Ｇｒｅｅｎ、　Ｋ、　Ｙ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｐ、　Ｄｏｒｓｅｔｔ、　１９ ８６＋Ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓａｎｔｉｇａｎｓ：　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ１８、Ｇｒｅｅｎ、Ｎ 、、Ｈ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、入、０１ｓｏｎ、Ｓ、Ａｌａｘａｎｄａｒ、Ｔ。

Ｍ、５ｈｉｎｎｉｃｋ、Ｊ、Ｇ、５ｕｔｃｌｉｆｆａ　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、Ｌｅｒ ｎｅｒ、１９８２゜工ｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｃｅ１１． ２＠；４７７−４８７゜１９、Ｈａｒｃｏｕｒｔ、Ｇ、Ｃ−、Ｊ、Ｍ、Ｂｅ５ｔ 　ａｎｄ　Ｊ、Ｅ、Ｂａｎａｔｖｏｌａ。

１９８０、Ｒｕｂｅｌｌａ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ａｒｕ＋＋＋　ａｎｄ　ｎａ ｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｖｏｔｕｎｔｅａｒｓ 　ｗｉｔｈ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ａｃｑｕｉｒｅｄａｎｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　 １ｎｄｕｃａｄ　ｉｍ＋ｎｕｎｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｒａｎａｓａｃｈａ ｌｌｅｎｇｅ、Ｊ、工ｎｆａｃｔ、Ｄｉｓ、１４２：１４５−１５５゜２０、Ｈ ｏｐｐ、Ｔ、Ｐ、ａｎｄ　Ｋ、Ｒ，Ｗｏｏｄｓ、１９８１　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏ ｎ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔａｒｍｉｎａｎｔｓ　ｆ ｒｏｍ　ａｚａｉｎｏ　ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃａ、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、フ８：３８２４−３８２８゜２１＋ＨＯ−Ｔｅ１：ｒｙ 、　Ｌ＋、　Ａ、　Ｃｏｈｅｎ、　ａｎｄ　ｐ、　Ｌｏｎｄｅｓｂｏｒｏｕｇｈ 、　１９８２゜Ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　ａｎｄ　Ｒ Ａ２Ａ２フッ　ｓｔｒａｉＭ：　ａｃｏｍｐａｒｓｉｏｎ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｅ ｒｙｌａｍｉｄｅ−ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄｒａｄｉ ｏｉｍＩ！Ｉｕｎａ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、Ｊ、Ｍａｄ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ＋ｌｓ：３９コ−３９８゜ ２２、工１ｏｎａｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｓａｌｍｉ、　１９８６　Ｃｏ＋ ｎｐａｒｉｐｐｎ　ｏｆ　ＨＬＡ−Ｄ％４１ａｎｄ　ＤＷ２　ｐｏｓｉｔｉｖｅ 　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃａｌｌ　ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏ ｎ　ｔｏ　ｈａｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　Ｔ　ｃ＠ｌｌ　１ｉｎｅｓ：　Ａ　ｌｏ ｗｒｕｂｅｌｌａ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａ ｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ）ＬＡ−Ｄ％４２＋１９８６．　Ｈｕｍａｎ工ｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：９４−１０１゜２〕・　工５ｈｉｉ、に、、Ｎ、Ｎａ ｋａｚｏｎｏ、Ｈ，Ｓａｗａｄａ、Ｋ、Ｆｕｋｕｄａ、Ａ。

Ｗａｋｉｓａｋａ、、Ｔ、Ｍｏｒｉｕｃｈｉ、Ｙ、Ｎａｋａｉ、’ｒ、Ｋａｎｏ 　ａｎｄ　Ｍ。

Ａｉｚａｗａ、１９８Ｌ　Ｈｏ５ｔ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　５ｕｓｃｅｐｔｉ ｂｉｌｉｔｙ　ｔ。

ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ：　Ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＬＡａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、フ：２８ １−２９７゜２４、Ｋａｔｏ、　Ｓ−、Ｓ、　Ｍｕｒａｎａｋａ、工＋Ｔａｋａ ｋｕｒａ、　Ｍ、　Ｋｉｍｕｒａ　ａｎｄ　Ｋ。

Ｔｓｕｎ、１９ｓ２＋　ＨＬＡ−ＤＲａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｕｂ ｅｌｌａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓ＠ｉｎ　ｍａｎ、Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ、　１９：１４０−１４５゜２５、Ｌｅｒｎａｒ、 　Ｒ，Ａ、、　Ｎ、　Ｇｒａａｎ、　）Ｉ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ｆ、　−Ｔ 、　Ｌｉｕ。

Ｊ、　Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｍ、　５ｈｉｎｎｉｃｋ、　 １９８１　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｓｙｎｔｈｅｇｉｚａｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　 ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃ ｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｌ ｉｃｉｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎａｔ ｉｖｅ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｏｆ　Ｄａｎｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓ−Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、゛　Ｓｃｉ、ＵＳ入２６＋　Ｌｉｅｂｈ ａｂｅｒ、Ｈ，１９フＯ，Ｍｅａｓｕｒｅｍａｎｔ　ｏｆ　ｒｕｂｅｌｌａ　ａ ｎｔｉｂｏｄｙｂｙ　ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ、　Ｘ＋Ｖａｒｉａ ｂｌｅｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｒｕｂｅｌｌａｈａａ＋ｎａｇｇｌｕｔｉｎａ ｔｉｏｎ、Ｊ、工！ＩＩ！ＩＩｕｎｏ１．１０４：８１Ｂ−８２５゜２７、Ｌｏ ｏ、　Ｔ−Ｗ、、工、　ＭａｅＭｏｎａｌｄ、　ＤｏＭ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｍ、 　Ｔｒｕｄａｌ、　Ａ。

Ｔｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　Ｓ、　ＧＬＩＩａｌｌ、　１９８６−　Ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　１ｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ　ｏｆ　ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

Ｍａｔｈ、　Ａ３：１４９−１５９゜ ２１１、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｒ，、Ｐ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、　５．０’５ｈａａ 、　Ｍ、　Ｂｏｒｋａｎｓｔｅｉｎａｎｄ　Ｈ，Ｗ、Ｋｒｅｔｈ、１９８９．　 Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄａｕｔｏｒａａｅｔｉｖ＠Ｔ　ｃａｌｌ 　１ｉｎｅｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍｃａｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｆｌ ｕｉｄ　ｏｆ　ａ　ｐａｔｉａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｃｈｒｏｎｉｃｒｕｂｅｌｌａ 　ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｇ、Ｊ、　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｉｍ＋ｎｕｎｏ１ ．２３＝１−２９、Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｒ，Ｅ、Ｆ、１９８２．　Ｃ１ａｓｓｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ、 工ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　ｌフ：ｌ−１９９゜コＯ，Ｍａｚａｎｃｏｕｒｔ 、Ａ、ｄｅ、Ｍ＋　Ｎ、Ｗａｘｈａｍ、Ｊ、Ｃ，Ｎ１ｃｏｌａｓａｎｄ。

Ｊ、Ｓ、Ｗｏｌｉｎｓｋｙ、１９８６．　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ 　ｔｏ　ｔｈａｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔ ａｉｎｓ　ｉｎ　１ｎｆａｎｔｓ　ｗｉｔｈｔｈｅ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｒ ｕｂｅｌｌａ　ｇｙｎｄｒｏｍａ、Ｊ、Ｗｅｄ、Ｖｉｒｏｌ。

１９：Ｌｕ−１２２゜ コ１．　Ｍｅｒｒｉｆｉａｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　１９６９．　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａ ｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３ ２＝２２１−２９６゜コ２．　Ｍｅｙｅｒ、Ｈ，Ｍ、、Ｐ、Ｄ、Ｐａｒｋ＋ｎａ ｎ　ａｎｄ　Ｈ，Ｅ、Ｈｏｐｐｓ、　１９６９゜Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｃｈａｒａ ｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｒｕｂｅｌ ｌａ　ｖａｃｃｉｎｅｓ。

工ｎｔｅｒｎａｌ　ｓｙｍｐｏｓｉｔｕｎ　ｏｎ　Ｒｕｂｅｌｌａ　Ｖａｃｃｉ ｎｅｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　１９６Ｂ。

ＳＹ”Ｐ　５ｅｒｉｅｓ工＋＋ｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｄａｒ ｄ　１１＝２７７−２８４゜３３、　Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ、Ｒ，、Ｄ、Ｌ、Ｐｅｔ ｅｒｓｏｎ、Ｇ、Ｇ−Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｇ、。

Ｒ，Ａ、Ｌａｒｎａｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｖ、Ｃｈｉｇａｒｉ、１９８５．　Ｇｅｎ ａｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓ ｅ　ｔｏ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　（ＨＢｓ Ａｇｌ：　Ｖ工、　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｆｉｎ＠５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、Ｊ、工ｍ ＋＋＋ｕｎｏ１．　Ｌコ４：４２０コー４２１１゜コ４．　Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ、 　Ｒ，、Ａ、ＭｃＬａｃｈｌａｎ、Ｇ、Ｂ、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｌ、Ｈｕｇｈｅｓ、１９８７．　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔ ｏ　ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ａｎｄ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓｐｒｉｍａｄ　ｂｙ　ａ　ｓｉｎｇｌ ｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔ　ｃｅｌｌ　５ｉｔｅ、　Ｎａｔｕｒｅ。

３２９：５４１−５４９゜ コ５．　Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ、Ｒ，、Ｊ、Ｌ、Ｈｕｇｈａｓ、Ａ、ＭｃＬａｃｈｌ ａｎ、Ｇ、Ｂ。

Ｔｈｏｒｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ａ、Ｍｏｒｉａｒｔｙ、１９８Ｂ、Ｈｅｐａｔｉｔ ｉｓ　Ｂｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ　ｏｆ 　ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　Ｔ−ｃａｌｌｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　ａｎ　ｅｎｖ ｅｌｏｐｅ　Ｂ−ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ａｓ：工６１０−１６１４゜３６、Ｍｉｌｉｃｈ、 Ｄ、Ｒ，１９８８，５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔ　ａｎｄ　Ｂ　ｃｅｌｌｒｅｃｏｇ ｎｉｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ：　工ｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｖａｃｃｉ ｎｅｄｅｖｅｌｏｐ＋ｎａｎｔ＋　入ｄｖ＋　工ｍｍｕｎｏ１．　４５：１９５ −２８１゜コア、　Ｎａｔａｓ、Ｓ、Ｖ、、Ｓ、Ｅ、Ｍｅｒｓｉｃｈ、Σ−Ｂ、 Ｄａｍｏｎｔｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｔ。

ＺａｐａｔＪＩ−１９８９，ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ｏｆ　ｉｍｍｕｎｕｅ　ｒ ｅｓｐｏｎｓｅ　ｔ。

ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ　ａｎｄ　 １ａｔｅ　ｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉ ｃａ、Ａ２：３３５−３コ８゜コａ、　ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｔａ、Ｃ，、Ｎ、Ｋａ ｌｋ）ｃｉｎｅｎ、Ｌ、Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｆ。

Ｐａｔｔａｒｇｓｏｎ、　１９８３．　Ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｔ ａｉｎ　ｏｎｅ　ｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｅｎｖｅ ｌｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、　Ｅｌ、　Ｅ２ａ　ａｎｄＥ２ｂ、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、４６：９６４−９７３゜コ９．　０ｋｕｎｏ、Ｙ、、Ｋ、Ｙａｍａ ｎｉｓｋｉ、Ｓ、Ｌｗｉｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｔａｋａｈａｓｋｉ。

１９８５、Ｍｉｃｒｏ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔａｓｔ　ｆｏｒ　ｍ ｕｍｐｓ　ｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　９６−ｗａｌｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃ ｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ　ａｎｄ　ＰＡＰ（ｐａｒｏｘｉｄａｓａ−ａｎｔｉ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：コ２７−３３５゜４０、　０ｘｆ ｏｒｄ、　、Ｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｏｂｅｒｇ−１９８５，工ｎｆｅｃｔ ｉｏｎｓ　ｃａｕｓｅｄｂｙ　ｒｕｂｅｌｌａ、ｒａｏｖｉｒａｄａａ　ｒｅｔ ｒｏ、ｎｏｒｗａｌｋ、ａｎｄｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ−ｉｎ　Ｃｏｎｑｕ ｅｓｔ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｐ、　４０５−４Ｌ　Ｐｅｒｆ ｉｎｓ、Ｆ、Ｔ−，１９８５，Ｌｉｃｅｎｓｅｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｒｅｖ、 ’　ｏｆ工ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ＋　７：５７３−７６゜４２、Ｐｅｔｔａｒｓｓ ｏｎ、Ｒ＋Ｆ、、　Ｃ，Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｗ、Ｎ、Ｋａｌｋｋｉｎｅｎ、　Ａ。

Ｋａｌｌｉｏ、工、　ｕｌｍａｎｅｎ、　Ｌ、　Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ、　Ｐ、 　ｐａｒｔａｎｅｎ　ａｎｄＡ、Ｖａｈｅｒｉ、１９８５０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　ａｎｄ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　５ｙ ｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｕｂｅｌｌａ　ｖｉｒｕｓＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒｅｖ、ｏｆ　工ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、７：５１４０−１４９ ゜ ４コ、　Ｐｒａｓｔｏｎ、Ｈ＋　Ｄ、、Ｄ、Ｃ，Ｍｉｌｉａｒ、に、Ｙ、Ｇｒｅ ｅｎ　ａｎｄ　Ｆ、Ｘ。

Ｂｙｒｄ、　１９８５．　５ｔｒｕＣ：ｔｕｒ＠ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｔｈａ　ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓｓ　ｐｒｏｔａｉｎｓ、Ｒ＠ｙ、ｏｆ　 工ｎｆａｃｔ、Ｄｉｓ、フ：５１５０−１５６−４４−　５ａｎｄｒａ、　Ｌ　 Ｂ、、　Ｈ，Ｃ，５ｔｅｔｌｅｒ、　Ｓ、　Ｒ，Ｐｒａｂｌｕｄ、　Ｎ、　Ｍ。

賀１１１１ａｍｇ、Ｗ、入、Ｏｒｅｎｇｔｅｉｎ、Ｌ　Ｊ、ａａｒｔ、＾、　Ｒ ，Ｈｌｒｕａａｎａｎｄ　Ｋ、　Ｌ、　Ｈｅｒｒｍｎｎ、　１９ＢＳ−Ｆｅｔａ ｌ　ｒｉｓｋ　ａｓｓｏｃｉａｔａｄ　ｗｉｔｈｒｕｂａｌｌａ　ｖａｃｃｉｎ ｅ：　Ａｎ　ｕｐｄａｔａ、Ｒｅｖ、ｏｆ　工ｎｆａｃｔ、Ｄｉｓ−７＝５９５ −４０２゜ ４５、　５ｃｈｒｉｅｒ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｊ、　Ｗ、　Ｇｎａｎｎ　Ｊｒ、　Ａ 、　Ｊ、　Ｌａｎｇｌｏａｓ、　Ｋ。

５ｈｒｉｖｅｒ、Ｊ、入＋　Ｎａ１ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｂ、Ａ、０１ｄａｔｏ ｎ＠、１９８８゜８−　ａｎｄ　丁−１ｙｍｐｈｏｃｙｔａ　ｒａｓｐｏｎｓｅ 　ｔｏ　ａｎ　ｉｍｍｕｎｏａｏｍｉｎ＆ｎｔａｐｉｔｏｐａ　ｏｆ　ｈｕｍａ ｎ　ｉｍｍｕｎｏｄａｆｉｃｉａｎｅｙ　ｖｉｒｕｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ＋６ ２：２５コ１−２５３６゜ ４６、Ｓｔ＠ａｌｅ、Ｒ，Ｗ、、Ａ、Ｓ、Ｈａｎｓａｎ、Ｍ６Ｍ、Ｖｉｎｃａｎ ｔ　ａｎｄ　Ｊ、入。

Ｂａ１ｌａｎｔｉ、１９フコ、Ａ　”Ｃｒ　ｍ１ｃｒｏａｓｓａｙ　ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｅ＠ｌｌ−ｍａｄｉａｔａｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｔｏ　ｖ ｉｒｕｓｅｓ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、工１０：１５０２−１５１０＋ ａ７．　Ｔｉｎｇｌｅ、　Ａ、Ｊ、、　Ｍ、　Ａ１１ｅｎ、　Ｒ＋Ｅ、　Ｐｅｔ ｔｙ、　Ｇ＋Ｄ、　Ｋａｔｔｙｌｓａｎｄａｎｄ　Ｓ、に、　Ｃｈａｎｔｌａｒ −１９８６，Ｒｕｂｅｌｌａ−ａｓｓｓｏｃｉａｔｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｉ、 　工、　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｊｏｉｎｔｍａｎｉｆａ ｓｔａｔｉｏｎｓ　ａｇｓｏｃｉａｔａｄ　ｗｉｔｈ　ｎａｔｕｒａｌ　ｒｕｂ ｅｌｌａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＲＡ　２フ／３　ｒｕｂｅｌｌａ　ｉｍ ｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、　入１’ｔｎ。

Ｒｈａｕｍ、Ｄｉｓ＋　４５＝ｌｌＯ−１１４゜４８、Ｖａｎ　Ｒａｇ＠ｒｕｏ ｏｒｔａｌ、Ｍ、Ｈ，Ｖ、、ＭｕＬｌａｒ、Ｓ、、Ｑｕｅｓｎｉａｕｘ。

Ｖ、Ｆ、、Ａｌｔｃｈｕｈ、Ｄ＋、ａｎｄ　、７−Ｐ−Ｂｒ１ａｎｄ、　Ｌ９Ｂ ８゜０ｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｐｉｔｏｐａ　１ｄａ ｎｔｉｆｉｅａｔｉｏｎ：５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｚａｄ　ｂｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　工ｎ　 Ｖａｃｃｉｎｅｓ：　Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔｓ、　ｐｐ、１１：１４２２．　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｈ，Ｋｏｈｌｅｒ　ａ ｎｄＰ＋Ｔ、ＬａＶｅｒｄｅ、Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｌｏｎｇｍａｎ。

４９、Ｖｅｓｋａｒｉ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｂｕｉｍｏｖｉｃｉ−Ｋｌｅｉ ｎ、　１９７５゜Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｒｕｂｅ ｌｌａ　ａｎｔλｇｅｎｓ　ａｎｄｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ａ ｆｔｅｒ　ａｄｎ＋１ｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈａＲＡ２フｌコ　５ｔ ｒａｉｎ　ｏｆ　１ｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｒｕｂｅｌｌａ　ｖａｃｃ ｉｎ＠。

工ｎｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｌｍｍ−Ｌ工：７４８−７５３＋５０、　Ｓｌａｘｈａ ｍ、Ｍ、Ｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｓ、貰ｏ１１ｎｓｋｙ、１９８５．　Ｄａｔａｉｌａ ｄＶｉｒｏｌｏｇｙ　１４ｍ：１５コー１６５゜５１、％４ｏ１ｉｎｓｋｙ、　 Ｊ、　Ｓ−１９１１（１，Ｒｕｂａｌｌａ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆ ｆｅｃｔＯｎ　ｔｈａ　ｄ・Ｖ・ｌａｐｉｎｇ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ 、　工ｎ　Ｖｉｒｕｓｉｎｆａｃｔｉｏｎｓ　ａｒｙｉ廿ｈａ　ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｇ　ｎａｒｏｕｓ　ｓｙｇｔａｍ、　ｐｐｉ２５−１４２、Ｅｄｉｔ・ｄ　 ｂｙ　Ｒ，？、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｉ、ｙｏｎ、ＫｌｕｗａｒＡｃａ ｄｅ＋ｍｉｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｄｏｒｄｒ＠ｃｈｔ。

表４ Ｒ＾２７１３ワクチンおよび風疹ウィルスＭ３３野生株用モノクローナル抗体で 得られた免疫化学的結果の要約 ３Ｄ５Ｄ　会合　会費　１ｎ９２　２ｂ　＜　＜　＜　＜コＤ９Ｆ　ＥＩ　Ｅｌ ＞１６３８４　２ｂ　＜　＜　＜　＜　’１６ＢＢＤ　會＊　−会　＞１６］８ ４　２ｂ　＜　＜　＜　＜２１０１０Ｂ　＜８　２ａ　＜　＜　＜　＜”補体　 ”　ＥｌおよびＥ２糖タンパク沈澱表１Ｉ ＲＶペプチドに対する動物血清の免疫学的特性ＲＶ−ＥＰ１４　＋　ＣＦＡ　４ −１＋　ＯＮｔｌＲＶ−ＥＰ１５　＋　ＣＦＡ　−１−１＋　Ｏ）ｆＤＲＶ−Ｅ Ｐ１６　＋　（ＴＡ　＋１−＋ＯＮＤＲＶ−ＥＰ２５　＋　ＣＦＡ　＋＋＋＋Ｏ ＮＤＲＶ−ＥＰ２７＋ＣＦＡ　＋＋＋＋０　１０ＲＶ−ＥＰ２７　＋　ａｌｕｍ 　＋１＋＋　ＯＮＤＲＶ−ＥＰ２７’　＋　ＣＡＦ　＋＋−ｊ＋）　ｌ／１６０ 　ＮＤＲＶ−Ｅｎフ’＋ａｌｕｍ　４−＋−１−＋　ＮＤ　’ＨＤＲＶ−ＥＰ２ ８　＋　ＣＦＡ　＋＋＋＋＋　ＯＮ０ＲＶ−ＥＰ２Ｂ　＋　ａｌｕｍ−１＋−＋ ＯＮＤＲＶ−ＥＰ２Ｂ”−ＣＡＦ　＋＋＋＋＋　１／３２０　ＮＤＲＶ−ＥＰ２ Ｂ’＋ａｌｕｍ−１−１−＋＋ＮＯ、ＮＯｌ　＋＋＋、＋＋＋十および＋＋＋＋ ＋は、それぞれｌ／Ｓ、０００．１／２０．０００および＞１７１００，０００ のペプチド特異性ＥＬＩＳＡ″′ｃ測定された抗ペプチド抗血清の平均反応力価 ２　ウィルス中和力価Ｌ±補体の非存在下でペスト検定て測定した。

３　ここでは赤血球凝集阻止反応の検定を行わなかった。

４　ＲＶ−εＰ２７および−ＥＰ２８ペプチドは、いずれもＣｙｓ　２２５及び Ｃｙｓ　２３５分子内ジスルフィド結合を有する酸化体であった。

吸光度　（４０５ｍｍ） ００　（４０５ｎｍ） ００　（４０５ｎｍ） 第５図 Ｍａｂ　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１第６Ａ図 第６Ｂ図 １）島　ｆｉｌ　審　報　牛 ｍｍｍ　ＰＣ■’ム　９３１０００１４；＝ぴ鼾７ｈｍｌ：ｚ＝−一二モ〒″″ ′に□□−−−ｔｘｖ□−ｏ＋１＃ｂｂｍｗａｙｂａｈｈａｈｒ−一―１−−ｈ ｅ−−ｄ−−０３１０９／９３フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５０ 　Ｔ　７０５５−２Ｊ３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ（７２）発明者　ギラム、シャー リー カナダ国、ブイ６テイー　１ゼツト３、ブリティッシュ　コロンビア州、ヴアン クーヴア、ザ　ユニヴアーシティー　オブ　ブリティッシュ　コロンビア （７２）発明者　オウ、ダウエイ カナダ国、ブイ６テイー　１ゼツト３、ブリティッシュ　コロンビア州、ヴアン クーヴア、ザ　ユニヴアーシティー　オブ　ブリティッシュ　コロンビア （７２）発明者　チイングル、オープレイカナダ国、ブイ６テイー　１ゼツト３ 、ブリティッシュ　コロンビア州、ヴアンクーヴア、ザ　ユニヴアーシティー　 オブ　ブリティッシュ　コロンビア

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．風疹ウイルス（ＲＶ）の少なくとも１種類のタンパクの少なくとも１つの抗 原性決定因子に相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。
2. ２．ＲＶのＥ１、Ｅ２およびＣタンパクの少なくとも１つの抗原性決定因子に相 当するアミノ酸配列を有する請求項１に記載の合成ペプチド。
3. ３．前記のＲＶタンパクがＥ１タンパクであり、前記のアミノ酸配列が表１に規 定したアミノ酸配列またはこれらの配列の免疫原性を保持する一部、変異体また は突然変異体から選んだ少なくとも１つであることを特徴とする請求項２に記載 の合成ペプチド。
4. ４．前記のＲＶタンパクがＥ２タンパクであり、前記のアミノ酸配列が表２に規 定したアミノ酸配列１５〜３６、３３〜５７、６９〜９１、１０４〜１２４およ び１９５〜２２０またはこれらの配列の免疫原性を保持する一部、変異体または 突然変異体から選んだ少なくとも１つであることを特徴とする請求項２に記載の 合成ペプチド。
5. ５．前記のＲＶタンパクがＣタンパクであり、前記のアミノ酸配列が表３に規定 したアミノ酸配列またはこれらの配列の免疫原性を保持する一部、変異体または 突然変異体から選んだ少なくとも１つであることを特徴とする請求項２に記載の 合成ペプチド。
6. ６．ペプチドが酸化型であり、哺乳動物においてＲＶに対する抗体の生産を誘導 することのできる請求項２に記載の合成ペプチド。
7. ７．前記の酸化型が硫黄含有アミノ酸の間でジスルフィド結合を有することを特 徴とする請求項６に記載の合成ペプチド。
8. ８．前記のアミノ酸配列がステイン残基２２５と２３５の間に分子内ジスルフィ ド結合を含むＲＶＭ３３株のＥ１タンパクのアミノ酸１９８−２４０に相当する ことを特徴とする請求項６に記載の合成ペプチド。
9. ９．脂質で修飾してリポペプチドとした請求項１、２、３、４、５、６、７およ び８に記載の合成ペプチド。
10. １０．混合して分子凝集物を形成させたとき、哺乳動物においてＲＶに対する免 疫反応を誘導することのできる単一の合成ペプチドまたは合成ペプチドの混合物 である請求項２に記載の合成ペプチド。
11. １１．前記の合成リポペプチドが表１２に規定したアミノ酸配列またはこれらの 配列の免疫原性を保持する一部、変異体または突然変異体から選んだ少なくとも １つであることを特徴とする請求項１０に記載の合成ペプチド。
12. １２．アミノ酸配列トリパルミチルＣＳＳＶＲＡＹＮＱＰＡＧＤＶＲＧＶＷＧＫ ＧＥＲＴＹＡＥＱＤＦＲＶまたは免疫原性を保持するその一部を有する請求項１ ０に記載の合成ペプチド。
13. １３．ＲＶタンパクの少なくとも１つのＢ細胞中和エピトープに相当するアミノ 酸配列を有し、生物試料中のＲＶ特異性抗体の存在を検出ための診断キットの成 分として使用することのできる請求項２に記蔵の合成ペプチド。
14. １４．該塩基のタンパクがＲＶのＥ１、Ｅ２およびＣタンパクであることを特徴 とする請求項１３に記載の合成ペプチド。
15. １５．表１に規定したＥ１タンパクのアミノ酸２４６−２５９、２５６−２７５ 、２７２−２９１、１９８−２３３及び２１２−２４０に相当するものから選ん だアミノ酸配列またはその一部であって、生物試料中のＲＶ特異性抗体を検出こ とができる請求項１４に記載の合成ペプチド。
16. １６．ヒトＴ細胞決定因子である請求項１に記載の合成ペプチド。
17. １７．タンパクがＲＶのＥ１、Ｅ２またはＣタンパクであることを特徴とする請 求項１６に記載の合成ペプチド。
18. １８．ペプチドであって、その類縁体が風疹に関連した自己免疫障害の治療に有 用である請求項１６または１７に記載の合成ペプチド。
19. １９．表１に規定したＥ１タンパクのアミノ酸１−２２．１２２−１４１、１４ ０−１５９、１４７−１７６、１７４−１９３、１９０−２０９、２０７−２２ ６、２２４−２４３、２４０−２５９、２５６−２７５、２７２−２９１、２８ ６−３０８、３０７−３２６、３２４−３４３、３４１−３６０、３５８−３７ ７、３７４−３９０、１９６−２１２、１９８−２３３及び１６８−２４０に相 当するものから選んだアミノ酸配列またはその類縁体の一部であって、風疹に関 連した自己免疫障害の治療に有用である請求項１６に記載の合成ペプチド。
20. ２０．表２に規定したＥ２タンパクのアミノ酸１−２０、５４−７４、１３９− １５９、１５６−１７７、１７−１９９、２１８−２３９及び２３３−２５９に 相当するものから選んだアミノ酸配列またはその類縁体の一部であって、風疹に 関連した自己免疫障害の治療に有用である請求項１６に記載の合成ペプチド。
21. ２１．表３に規定したＣタンパクのアミノ酸１−３０、９６−１２３、１１９− １５２、１５１−１７９、１７７−２０４、２０５−２３３及び２５５−２８０ に相当するものから選んだアミノ酸配列またはその類縁体の一部であって、風疹 に関連した自己免疫障害の治療に有用である請求項１６に記載の合成ペプチド。
22. ２２．少なくとも１つのＴ細胞決定因子（Ｔ）と少なくとも１つのウイルス中和 Ｂ細胞エピトープからなる請求項１に記載の合成ペプチド。
23. ２３．ハイブリッドまたはキメラＴ−Ｂタンデムペプチドの形態である請求項２ ２に記載の合成ペプチド。
24. ２４．Ｅ１、Ｅ２またはＣタンパクの少なくとも１つのヒトＴ細胞決定因子とＥ １、Ｅ２またはＣタンパクの少なくとも１つのウイルス中和Ｂ細胞エピトープか らなるキメラペプチドの形態である請求項２２に記載の合成ペプチド。
25. ２５．キメラリボペプチドの形態である請求項２４に記載の合成ペプチド。
26. ２６．Ｅ２またはＣタンパクの少なくとも１つのヒトＴ細胞決定因子とＥ１タン パクの少なくとも１つのウイルス中和Ｂ細胞エピトープからなるキメラリポペプ チドの形態である請求項２５に記載の合成ペプチド。
27. ２７．アミノ酸配列ＣＳＳＶＲＡＹＮＱＰＡＧＤＶＲＧＶＷＧＫＧＥＲＴＹＡＥ ＱＤＦＲＶＰＤＰＧＤＬＶＥＹＩＭＮＹＴＧＮＱＱＳＲＷＧＬＧＳＰＮＣＨＧＰ ＤＷＡＳＰＶＣＱＲＨＳＰまたは免疫原性を保持しているその一部を有する請求 項２６に記載の合成ペプチド。
28. ２８．化学合成または遺伝子組換え技術により製造される請求項１から２７に記 載の合成ペプチド。
29. ２９．請求項１から２８に記載の免疫原性合成ペプチドの少なくとも１つと、生 理学的に許容される担体とからなる風疹用ワクチン。
30. ３０．前記の合成ペプチドが担体分子または免疫刺激性分子にリンクしているこ とを特徴とする請求項２９に記載のワクチン。
31. ３１．さらに別の免疫原性または免疫刺激性分子の少なくとも１つを合む請求項 ２９に記載のワクチン。
32. ３２．さらにアジュバントを含む請求項２９から３１に記載のワクチン。
33. ３３．さらにリポソーム、微粒子またはカプセルを含む請求項２９から３２に記 載のワクチン。
34. ３４．筋肉内注射、非経口または経口投与用に製剤されている請求項２９から３ ３に記載のワクチン。
35. ３５．さらに前記の合成ペプチドを免疫系に特異的に運搬するための手段からな る請求項２９から３４に記載のワクチン。
36. ３６．前記の運搬手段が毒素分子または抗体からなることを特徴とする請求項３ ５に記載のワクチン。
37. ３７．前記の合成ペプチドが多価ワクチンの１つの成分であることを特徴とする 請求項２９から３６に記載のワクチン。
38. ３８．前記の多価ワクチンが風疹、麻疹およびおたふくかぜに対する防御を提供 するものであることを特徴とする請求項３７に記載のワクチン。
39. ３９．請求項２９から３８に記載のワクチンの有効量を宿主に投与することから なる風疹に対する免疫を宿主に賦与する方法。
40. ４０．請求項１から２８に記載の合成ペプチドからなる風疹ウイルス感染を検出 するための診断用試薬。
41. ４１．請求項１から２８に記載の合成ペプチドを使用することからなる宿主にお ける風疹感染検出法。
42. ４２．請求項１から２８に記蔵の合成ペプチドに対して生成させた抗体。
43. ４３．請求項１から２８に記載の合成ペプチドのアミノ酸配列をコード化したニ ュクレオチド配列を有する遺伝子を含む抗原運搬のための生ベクター。
44. ４４．ウイルスベクターである請求項４３に記載の生ベクター。
45. ４５．前記のウイルスベクターがボックスウイルス、アデノウイルス、レトロウ イルスおよびレトロウイルスのいずれかであることを特徴とする請求項４４に記 載の生ベクター。
46. ４６．細菌性ベクターである請求項４３に記載の生ベクター。
47. ４７．前記の細菌性ベクターがサルモネラ菌またはミコバクテリア菌のいずれか であることを特徴とする請求項４６に記載の生ベクター。
48. ４８．請求項４３から４７に記載の生ベクターと、生理学的に許容される担体と からなる風疹用ワクチン。
49. ４９．請求項１３から２０に記載のペプチドの合成類縁体の少なくとも１つを有 効量で投与することからなる風疹に関連した自己免疫障害の治療法。
50. ５０．（ａ）ＲＶタンパクに相当するオーバーラップペプチドを合成し、（ｂ） ＲＶ抗原に暴露した宿主からＲＶ特異性Ｔ細胞を生成させ、（ｃ）ＲＶ抗原特異 性Ｔ細胞増殖検定を行なうことからなる臨床的に重要なヒトＴ細胞エピトープを 同定する方法。