FR2850384A1

FR2850384A1 - Antigenes mimant les domaines extracellulaires de proteines membranaires de type iii issues de microorganismes intracellulaires pathogenes, anticorps conformationnels derives, et leurs applications

Info

Publication number: FR2850384A1
Application number: FR0300943A
Authority: FR
Inventors: Bunel Denis Tranchand
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rouen; Universite Lille 2 Droit et Sante
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rouen; Universite Lille 2 Droit et Sante
Priority date: 2003-01-28
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2004-07-30
Also published as: WO2004069140A3; EP1587825A2; WO2004069140A2; US7803378B2; US20080075717A1

Abstract

Antigène dérivé d'un microorganisme intracellulaire pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment peptidique essentiellement constitué par la concaténation des séquences d'au moins deux domaines extracellulaires adjacents dans la structure native d'une protéine membranaire de type III à 2n domaines transmembranaires dudit microorganisme intracellulaire pathogène, anticorps conformationnels dérives, et leurs applications.

Description

La présente invention est relative à des antigènes mimant la structure des domaines extracellulaires de protéines membranaires de type III issues de microorganismes intracellulaires pathogènes, aux anticorps conformationnels préparés à partir desdits antigènes, ainsi qu'à leurs applications pour la détection, la prévention et le traitement des infections latentes ou chroniques par ces microorganismes et des pathologies associées, notamment tumorales ou auto-immunes.

Certains microorganismes intracellulaires (virus ou bactéries) responsables d'infections latentes ou chroniques posent des problèmes de santé publique dans de nombreux pays ; à titre d'exemple non-limitatif, on peut citer des virus comme le virus de l'hépatite C (HCV), le virus de l'immunodéficience humaine (HIV), des virus de la famille des Herpesviridae [virus Epstein-Barr (EBV) ; cytomégalovirus (CMV) ; herpesvirus du sarcome de Kaposi (KSHV) ; virus de l'herpes simplex (HSV) ; virus de la varicelle (VZV) ] et le virus de l'hépatite B (HBV), ainsi que des bactéries intracellulaires, notamment Chlamydia trachomatis et Mycobacterium tuberculosis.

Ces microorganismes intracellulaires sont caractérisés par leur capacité à persister à l'état latent durant toute la vie de l'hôte (humain ou animal) sans être éradiqués par le système immunitaire à la suite de l'infection primaire ; cette relation hôte-virus qui est très complexe et mal élucidée implique des mécanismes viraux ou bactériens d'échappement à la réponse immunitaire comme la variabilité génétique (HCV, HIV) et l'expression de protéines modulant la réponse immunitaire [protéine EBNA1 (EBV)].

Alors que l'infection par ces microorganismes intracellulaires est cliniquement silencieuse chez la majorité des individus, certains d'entre-eux, notamment les sujets immunodéprimés, développent des pathologies chroniques, notamment pulmonaires (Mycobacterium tuberculosis), génitales et oculaires (Chlamydia trachomatis), tumorales (EBV, HCV, HBV, KSHV) ou auto-immunes (EBV). Par exemple, EBV est associé à un nombre important de pathologies tumorales : lymphome de Burkitt (Afrique Centrale), carcinome du nasopharynx (Asie du Sud-Est), carcinome gastrique, maladie de Hodgkin, lymphomes nasaux et cancer du sein, maladies lymphoprolifératives post-transplantation et lymphomes associés au

SIDA, ainsi que de pathologies auto-immunes : arthrite rhumatoïde, lupus érythémateux disséminé et syndrome de Sjôren.

Les antigènes exprimés pendant la phase chronique ou phase de latence représentent des antigènes cibles pour la vaccination à visée préventive ou thérapeutique et le diagnostic des infections par ces microorganismes intracellulaires et des pathologies associées.

Par exemple, l'infection latente par EBV se traduit par l'expression d'un nombre limité de gènes viraux codant respectivement pour 6 protéines nucléaires (EBNA-1, -2,-3a-, -3b,-3c et LP) et deux protéines membranaires [LMP1 et LMP2 (LMP2A/LMP2B) ] ; au moins trois types de latence (I, II, III) représentant au moins trois profils d'expression distincts sont associés à des pathologies tumorales distinctes, et un quatrième type de latence (IV) représentant un profil d'expression différent des précédents, pourrait être associé à un état asymptomatique (porteurs sains), (Figure 1).

Il est généralement admis que l'infection latente par EBV est essentiellement contrôlée par l'immunité cellulaire médiée par une population de lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) CD8+, spécifiques de protéines de latence d'EBV, essentiellement des protéines EBNAs, alors que l'immunité humorale dirigée contre les protéines de latence d'EBV ne joue pas de rôle protecteur chez les individus infectés. La perte de ce contrôle du fait, soit de la baisse de l'activité des effecteurs (CTLs), soit de la baisse de la reconnaissance de la cible (baisse de la présentation des antigènes de classe I) compromettrait sévèrement la capacité de l'hôte à contrôler la prolifération des cellules infectées par EBV et serait à l'origine du développement des tumeurs malignes associées aux infections latentes à EBV.

Ainsi, l'immunothérapie contre les tumeurs malignes associées à EBV fait essentiellement appel à l'activation in vitro de CTLs autologues de patients contre des protéines de latence et à la réimplantation de ceux-ci avec plus ou moins d'efficacité (pour une revue voir Khanna R. et al., TRENDS in Molecular Medicine, 2001,7 : 270-276. ). Cette thérapie cellulaire présente l'inconvénient d'être très coûteuse et lourde à mettre en #uvre.

La détection des antigènes de latence qui est utile pour le diagnostic des infections latentes par EBV et des pathologies associées nécessite

une étape de perméabilisation cellulaire avant la mise en contact avec les anticorps qui est délicate à mettre en #uvre.

Afin de lutter plus efficacement contre les infections latentes ou chroniques par ces microorganismes intracellulaire pathogènes, et les pathologies associées il existe un réel besoin de disposer de nouveaux antigènes pour la vaccination préventive et thérapeutique, ainsi que le diagnostic.

Parmi, les antigènes exprimés pendant la phase chronique ou phase de latence de l'infection, on peut citer des protéines membranaires de type III, en particulier, celles qui sont caractérisées par un nombre pair (2n) de domaines transmembranaires, séparant de courts domaines extracellulaires (DE) et intracellulaires (DI) et bordés par des domaines intracellulaires N et/ou C-terminaux de plus grande taille (Figure 2). A titre d'exemple non-limitatif de protéines membranaires de type III à 2n domaines transmembranaires exprimées pendant la phase chronique ou phase de latence de l'infection, on peut citer les protéines LMP1et LMP2A d'EBV (numéro d'accès dans la base de données SWISSPROT, respectivement P03230 et PI 3285, en référence à la séquence de la souche B95.8 d'EBV), les protéines LAMP K15-P et LAMP K15-M de KSHV (numéros d'accès GENBANK, respectivement AAD45297 et AAD45296), les protéines p7, NS2 et NS4B d'HCV (numéro d'accès EMBL AF009606), la protéine MOMP de Chlamydia trachomatis (Major Outer Membrane Protein ; numéro d'accès NCBI AF352789) et les protéines de transport Mmpl 1 à 12 de Mycobacterium tuberculosis. (numéro d'accès EMBL Z87425.1).

L'absence d'anticorps dirigés contre les protéines membranaires de type III à 2n domaines transmembranaires, chez les individus infectés de façon latente ou chronique par ces microorganismes, indique que ces protéines ne sont pas accessibles à la surface des cellules infectées ou que leurs domaines extracellulaires ne sont pas immunogènes (Figure 2).

L'absence d'anticorps dirigés contre les domaines extracellulaires observée lors de l'immunisation d'animaux de laboratoire avec des protéines LMP et LMP2 recombinantes indique plutôt que leurs domaines extracellulaires ne sont pas immunogènes (Hennessy et al., K., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 1984,81 : 7207-7211) et de LMP2 (Longnecker et al., J. Virol. , 1990, 64 : 3219-3226). En

effet, tous les anticorps anti-LMP1 décrits reconnaissent des fragments plus ou moins identifiés des régions intracellulaires des protéines LMP1 ou LMP2A, à savoir, pour LMP1 : CS1-4 (pool de 4 anticorps monoclonaux, Dako, Glostrup, Denmark), S 12 (Dr Elliott Kieff, Harvard Medical School, Boston, MA), OT22C et OT22CN (Organon Teknika, Boxtel, The Neetherlands).

Des anticorps dirigés contre des domaines extracellulaires des protéines LMP1 et LMP2 ont néanmoins été obtenus par immunisation de lapins avec des peptides synthétiques représentant la séquence d'un seul domaine extracellulaire couplé à une protéine porteuse (Demande européenne EP 1229043). Toutefois, les anticorps obtenus sont des anticorps non-conformationnels qui ne reconnaissent pas l'antigène natif exprimé à la surface des cellules infectées de façon latente par EBV mais uniquement l'antigène dénaturé ou un fragment de celui-ci (peptide linéaire représentant un seul domaine extracellulaire). En outre, ces anticorps ne présentent pas d'activité biologique significative (activité cytotoxique dépendante du complément ou ADCC pour Antibody Dépendent Cellular Cytotoxicity).

Il n'existe donc pas actuellement d'anticorps et d'antigènes efficaces pour le traitement (sérothérapie ou vaccination préventive ou thérapeutique) des infections latentes ou chroniques par les microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus et des pathologies associées, notamment l'infection par EBV et les pathologies tumorales associées.

En conséquence, l'Inventeur s'est donné pour but de pourvoir à des antigènes et à des anticorps qui répondent mieux aux besoins de la pratique. De manière surprenante, l'Inventeur a trouvé que les antigènes chimériques mimant la structure des domaines extracellulaires des protéines membranaires de type III à 2n domaines transmembranaires des microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus, induisent la production, chez les individus immunisés, d'anticorps conformationnels qui reconnaissent spécifiquement lesdites protéines membranaires de type III sous forme native et qui possèdent à la fois une activité cytotoxique dépendante du complément et une activité pro-apoptotique, vis-à-vis des cellules exprimant lesdites protéines membranaires de type III à leur surface.

Parmi ces antigènes, les antigènes chimériques qui miment la structure des domaines extracellulaires des protéines membranaires de latence d'EBV

induisent la production, chez les individus immunisés, d'anticorps conformationnels qui reconnaissent spécifiquement les protéines LMP et LMP2A sous forme native.

L'Inventeur a également montré que ces anticorps conformationnels possèdent une activité cytotoxique dépendante du complément et une activité pro-apoptotique, vis-àvis des cellules exprimant lesdites protéines LMP 1 et LMP2 à leur surface.

De tels anticorps conformationnels sont utiles pour la détection, à partir d'un échantillon biologique approprié (sang total, cellules mononucléées du sang périphérique, biopsie tumorale), des patients atteints d'infections latentes ou chroniques et de pathologies induites par les microorganismes intracellulaires pathogènes, tels que définis ci-dessus, notamment par EBV ; anticorps qui reconnaissent les protéines membranaires de type III-à 2n domaines transmembranaires- sous forme native, de façon sensible et spécifique, ne nécessitent en aucun cas d'étapes préalables de dénaturation et/ou de perméabilisation des cellules et éventuellement de purification des cellules infectées (étape d'enrichissement cellulaire), avant l'étape de mise en contact de l'anticorps avec l'échantillon biologique à tester.

En outre, de tels anticorps conformationnels sont capables de lyser spécifiquement les cellules infectées par des microorganismes intracellulaires pathogènes qui expriment à leur surface les protéines membranaires de type III ; anticorps sont utiles en sérothérapie, pour : - éradiquer les infections latentes ou chroniques par les microorganismes intracellulaires pathogènes, tels que définis ci-dessus, notamment EBV et prévenir les pathologies associées en détruisant le réservoir de latence virale constitué par les cellules infectées exprimant les protéines membranaires de type III (lymphocytes B exprimant LMP1 et/ou LMP2A dans le cas d'EBV, hépatocytes exprimant p7, NS2 et NS4B dans le cas d'HCV et cellules lymphoïdes exprimant LAMP K15-P et LAMP K15-M dans le cas de KSHV ), - traiter les tumeurs malignes associées aux infections latentes ou chroniques par des microorganismes intracellulaires pathogènes, tels que définis cidessus, notamment EBV, KSHV et HCV en ciblant et détruisant les cellules cancéreuses exprimant les protéines membranaires de type III telles que définies ci-

dessus (LMP1et/ou LMP2A (EBV), p7 (HCV), LAMP K15-P et/ou LAMP K15-M (KSHV)).

De même, les antigènes mimant la structure des domaines extracellulaires des protéines membranaires de latence de type III des microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus, qui sont aptes à induire la production, chez les individus immunisés, de tels anticorps conformationnels possédant une activité cytotoxique sont également utiles comme composition vaccinale pour prévenir ou traiter les infections latentes par ces microorganismes intracellulaires et les pathologies associées, notamment l'infection par EBV et les tumeurs malignes associées.

En conséquence, la présente invention a pour objet un antigène dérivé d'un microorganisme intracellulaire pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment peptidique essentiellement constitué par la concaténation des séquences d'au moins deux domaines extracellulaires adjacents dans la structure native d'une protéine membranaire de type III à 2n domaines transmembranaires, dudit microorganisme intracellulaire pathogène.

Au sens de la présente invention, on entend par protéine membranaire de type III, une protéine membranaire de type III à 2n domaines transmembranaires, telle que définie ci-dessus.

L'invention englobe les antigènes issus des protéines membranaires de type III de n'importe quel microorganisme intracellulaire pathogène tel que défini ci-dessus et des variants dérivés.

Conformément à l'invention, les domaines extracellulaires des protéines membranaires de type III sont tels que définis dans le modèle structural de la protéine LMP1native présenté à la figure 3, qui s'applique par analogie aux autres protéines membranaires de type III. Ainsi, les domaines extracellulaires adjacents de ces protéines correspondent à ceux qui sont proches dans la structure native de la protéine, le premier domaine correspondant à celui situé à l'extrémité N-terminale de la protéine.

Les séquences des différents domaines extracellulaires des protéines membranaires de type III correspondent à celles situées entre 2 domaines

transmembranaires successifs (numérotés TM, à TMn, de l'extrémité à N-terminale à l'extrémité C-terminale des protéines), le premier domaine transmembranaire correspondant à un numéro impair. Ces séquences sont déduites à partir de la séquence des différents domaines transmembranaires des protéines membranaires de type III qui est déterminée par analyse de l'hydrophobicité de la séquence en acides aminés desdites protéines, à l'aide d'un logiciel approprié, notamment :

- TM-Finder (www.bioinformatics-Canada.or/TMn, et - TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0n.

Par exemple, la protéine LMP1 de la souche B95-8 d'EBV (numéro d'accès P03230 dans la base de données SWISSPROT) possède 6 domaines transmembranaires potentiels (TM1 à TM6), correspondant, selon le logiciel utilisé, aux positions 25 à environ 42-44, environ 49-52 à 72,77 à environ 97-98, 105 à 125, 139 à 159 et environ 164-166 à 186. Les séquences situées entre les domaines TM1 et TM2, TM3 et TM4, TM5 et TM6 correspondent à celles des 3 domaines extracellulaires (DE1 à DE3), le premier domaine de la protéine correspondant à celui situé à l'extrémité N-terminale de LMP 1 : - LMP1-DE1 SDWTGGA (positions 45 à 51, SEQ ID NO: 1) ou VMSDWT (positions 43 à 48, SEQ ID NO: 24).

- LMP1-DE2 WNLHGQA (positions 98 à 104, SEQ ID NO: 2) ou NLHGQA (positions 99 à 104, SEQ ID NO: 25) - LMP1-DE3 LQQN (positions 160 à 163, SEQ ID NO: 26) ou LQQNWW (positions 160 à 165, SEQ ID NO: 3).

De manière analogue pour la protéine LMP2A de la souche B95-8 d'EBV (numéro d'accès P13285 dans la base de données SWISSPROT), la séquence des 6 domaines extracellulaires (DE1 à DE6) est déduite à partir de celle des 12 domaines transmembranaires potentiels : - LMP2-DE1 SCFTASVS (positions 142 à 149, SEQ ID NO: 4) - LMP2-DE2 RIEDPPFNS (positions 199 à 207, SEQ ID NO: 5) - LMP2-DE3 DAVLQLS (positions 260 à 266, SEQ IS NO: 6) -LMP2-DE4 GTLN (positions 317 à 320, SEQ ID NO: 7) -LMP2-DE5 SILQTNFKSLSSTEFIPN (positions 374 à 391, SEQ ID NO: 8) - LMP2-DE6 SNTLLS (positions 444 à 449, SEQ ID NO: 9).

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment peptidique comprend au moins une séquence hétérologue de liaison de 1 à 5 acides aminés identiques ou différents entre eux, de préférence de 1 à 3 acides aminés, précédant la séquence d'un des domaines extracellulaires tels que définis ci-dessus.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits acides aminés sont différents de ceux présents dans les séquences desdits domaines extracellulaires.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, toutes les séquences des domaines extracellulaires adjacents, à l'exception de celles situées aux extrémités N- et/ou C-terminales dudit fragment peptidique, sont précédées par une séquence hétérologue de liaison telle que définie ci-dessus.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, toutes les séquences des domaines extracellulaires adjacents dudit fragment peptidique sont précédées par une séquence hétérologue de liaison telle que définie ci-dessus.

Conformément à l'invention les résidus d'acides aminés de la séquence de liaison possèdent une chaîne latérale comprenant une fonction réactive.

Parmi ces acides aminés, on peut citer les acides aminés polaires comprenant une fonction : -OH [sérine (S), thréonine (T) ou tyrosine (Y) ], -SH [cystéine (C) ], -NH2 [lysine (K) ou arginine (R) ], -COOH [acide aspartique (D) ou acide glutamique (E)], et les acides aminés polaires à chaîne latérale fonctionnalisée par addition d'une fonction réactive, notamment un chloro- ou bromo-acétyl réactif avec les groupements thiol ou un groupement hydrazine réactif avec les aldéhydes.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits acides aminés sont choisis parmi la cystéine (C) et/ou la lysine (K).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment peptidique inclut également entre les séquences hétérologues de liaison et les séquences des domaines extracellulaires et de part et d'autres desdites séquences des domaines extracellulaires, une séquence d'au moins un acide aminé, de préférence de 1 à 7 acides aminés, de manière préférée 2 acides aminés, correspondant à celle du domaine transmembranaire flanquant ledit domaine extracellulaire dans la structure de ladite protéine membranaire de type III.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit antigène est issu d'une protéine membranaire de type III sélectionnée dans le groupe constitué par : les protéines LMP1 et LMP2A d'EBV (numéro d'accès dans la base de données SWISSPROT, respectivement P03230 et P13285, en référence à la séquence de la souche B95. 8 d'EBV), les protéines LAMP K15-P et LAMP K15-M de KSHV (numéros d'accès GENBANK, respectivement AAD45297 et AAD45296), les protéines p7, NS2 et NS4B d'HCV (numéro d'accès EMBL AF009606), la protéine MOMP de Chlamydia trachomatis (Major Outer Membrane Protein ; numéro d'accès NCBI AF352789) et les protéines de transport Mmpl 1 à 12 de Mycobacterium tuberculosis. (numéro d'accès EMBL Z87425.1).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment peptidique est essentiellement constitué par la concaténation des séquences de 2 à 6 domaines extracellulaires adjacents, de préférence 2 ou 3 domaines extracellulaires adjacents, dans la structure native de ladite protéine.

Selon une disposition avantageuse de l'un des modes de réalisation précédents, ledit antigène est issu des protéines LMP1 ou LMP2A d'EBV et est sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO: 10, 11et 13 à 23.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit antigène comprend au moins deux fragments peptidiques tels que définis cidessus, issus de protéines membranaires de type III différentes ; de préférence, lesdits fragments sont associés de façon covalente par l'intermédiaire de leurs extrémités Cterminale ou N-terminale (liaison peptidique) ou bien d'une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de leur séquence de liaison.

L'invention englobe également les antigènes constitués par des séquences fonctionnellement équivalentes aux séquences telles que définies ci-dessus, c'est-à-dire aptes à induire la production, chez les individus immunisés, d'anticorps conformationnels qui reconnaissent spécifiquement les protéines membranaires de type III sous forme native et qui possèdent une activité cytotoxique dépendante du complément et une activité pro-apoptotique, vis-à-vis des cellules exprimant lesdites protéines membranaires de type III à leur surface. Parmi ces séquences, on peut citer par exemple les séquences dérivées des séquences précédentes par :

- substitution et/ou suppression, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés des séquences telles que définies ci-dessus, - modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique de l'antigène tel que défini ci-dessus, notamment par remplacement par une liaison différente de la liaison-CO-NH- (méthylène amino, carba, cétométhylène, thioamide....) ou par introduction d'une liaison de type rétro ou rétroinverso, et/ou, - substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de l'antigène tel que défini ci-dessus, par un résidu d'acide aminé non protéinogénique.

Par résidu d'acide aminé non protéinogénique, on entend tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel, notamment tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe-CHR-, situé entre-CO- et-NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'un au moins des acides aminés de ladite séquence hétérologue de liaison est lié de façon covalente à au moins une protéine porteuse ou au moins un lipide.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, au moins deux acides aminés, chacun issu de l'unique séquence de liaison de fragments peptidiques distincts (de séquence identique ou différente) sont liés à une protéine porteuse ; l'antigène ainsi obtenu comprend au moins deux fragments peptidiques identiques ou différents liés de façon covalente à une seule protéine porteuse (couplage intermoléculaire, figure 3).

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, au moins deux acides aminés issus d'une ou plusieurs séquence(s) hétérologue (s) de liaison(s) d'un seul fragment peptidique, sont liés chacun à un lipide ; l'antigène ainsi obtenu comprend un seul fragment peptidique lié de façon covalente à plusieurs molécules de lipide (couplage intramoléculaire, figure 3). De tels antigènes lipopeptidiques sont capables de s'auto-assembler en bicouches ou vésicules lipidiques mimant la surface d'une cellule infectée par un microorganisme intracellulaire pathogène exprimant une protéine membranaire de type III telle que définie ci-dessus.

Une telle association, permet avantageusement d'augmenter l'immunogénicité de l'antigène selon l'invention.

Les lipides peuvent être couplés à l'antigène peptidique par l'intermédiaire d'une ou plusieurs fonctions a-aminées ou d'une ou plusieurs fonctions réactives de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; ils peuvent comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, saturées ou insaturées, linéaires ou ramifiées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un ou plusieurs groupes stéroïdes (cholestérol et dérivés). Avantageusement, le ou les lipides sont liés : par une liaison amide à la fonction a-NHz ou S-NH2 d'une lysine (Lys N#(palmitoyl) ou à toute fonction amino dudit peptide de jonction, par une liaison thioester ou thioéther à une fonction thiol d'une cystéine, par une liaison éther à une fonction alcool dudit peptide de jonction ou bien par une liaison ester à une fonction acide ou alcool dudit peptide de jonction. De préférence, le ou les lipides sont branchés par des liaisons éther, thioéther, ester et thioester qui sont plus immunogènes que la liaison amide. De manière encore plus préférée, le ou les lipides sont branchés par une liaison thioester à la fois plus labile et plus immunogène (Greer et al., J.

Immunol., 2001, 166 : 6907-6913). Parmi les groupes lipidiques préférés ont peut citer notamment : Asp (cholestéryl), Glu (cholestéryl), Ser (palmitoyl), Cys (palmitoyl), Ser (cholestéryl) ou Cys (cholestéryl).

La présente invention a également pour objet des micelles ou des vésicules d'un antigène lipopeptidique tel que défini ci-dessus.

La protéine porteuse peut-être couplée à l'antigène peptidique par tout moyen approprié ; ces moyens qui sont connus de l'Homme du métier incluent notamment le couplage à l'aide de glutaraldéhyde ou de benzidine bis-biazotée. De préférence le couplage est réalisé à l'aide d'un agent hétérofonctionnel tel que le mmaléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide (SMCC) ou le sulfo-SMCC qui couple spécifiquement une fonction thiol de l'antigène (résidu cystéine) avec une fonction amine (résidu lysine) de la KLH, et le carbodiimide ou ses dérivés solubles dans l'eau comme l'hydrochlorure d'l-éthyl-diméthylaminopropyl-carbodiimide, et le mmaléimidocaproyl-3-sulfo-N-hydroxysuccinimide. De préférence, le mmaléimidocaproyl-3-sulfo-N-hydroxysuccinimide qui est plus immunogène est utilisé

pour le couplage de l'antigène.

Parmi les protéines porteuses, on peut citer notamment la KLH (Key-Hole Limpet Haemoeyanin), l'albumine bovine ou d'autres albumines telles que celles de souris ou de lapin. Une protéine porteuse préférée est la KLH qui peut être couplée à l'antigène, par une liaison thioéther au niveau d'un résidu cystéine ou par une liaison amide au niveau d'un résidu lysine, de la séquence hétérologue de liaison telle que définie ci dessus.

La présente invention a également pour objet une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène tel que défini ci-dessus, éventuellement sous forme de micelles ou de vésicules de lipopeptide, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement à au moins un adjuvant.

Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés dans les compositions vaccinales, tels que l'hydroxyde d'alumine et le squalène.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition immunogène, ledit antigène est associé à : - un ou plusieurs peptides contenant des épitopes T CD4+ issus de protéines de latence des microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus, notamment d'EBV (Leen et al., J. Virol., 2001,75 : 8649-8659 ; Paludan et al., J. Immunol., 2002, 169 : 1593-1603).

- un ou plusieurs peptides contenant des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide de la toxine tétanique TT (positions 830-846), le peptide de l'hémagglutinine d'Influenza HA (positions 307-319), PADRE (Pan DR Epitope, Alexandre J. et al., Immunity, 1994,1 : 751-761) et le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un antigène tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement des infections latentes ou chroniques et des pathologies associées telles que définies ci dessus, notamment les infections par EBV et les pathologies tumorales associées.

Les antigènes selon l'invention sont préparés par les techniques classiques de synthèse en phase solide ou liquide, connues en elles-mêmes de

l'Homme du métier. Alternativement ils peuvent être préparés par les techniques d'ADN recombinant, connues en elles-mêmes de l'Homme du métier.

En conséquence, la présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant pour un antigène tel que défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet des sondes et des amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction des séquences codant pour un domaine transmembranaire et des séquences codant pour un domaine extracellulaire adjacent au précédent, d'une protéine membranaire de type III telle que définie ci-dessus ; ces sondes et ces amorces permettent de détecter/amplifier spécifiquement lesdites molécules d'acide nucléique codant un antigène selon l'invention.

Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.

AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).

Les séquences codant pour un antigène selon l'invention peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR ou bien par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue. Par exemple, elles sont amplifiées par PCR à l'aide d'une paire d'amorces appropriée telle que définie ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléique codant pour un antigène tel que défini ci-dessus. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.

De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur.

Alternativement, ladite molécule d'acide nucléique peut être insérée dans la séquence codant pour une protéine de capside virale, au niveau d'un site permettant l'exposition de l'antigène selon l'invention, à la surface de la capside virale.

Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.

La présente invention a également pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes modifiées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.

Les vecteurs recombinants et les cellules transformées, tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production de l'antigène tel que défini cidessus.

La présente invention a également pour objet un anticorps dirigé contre les protéines membranaires de type III telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est produit par immunisation d'un animal approprié avec un antigène ou une composition immunogène tels que définis ci-dessus.

L'invention englobe les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques tels que les anticorps humanisés, ainsi que leurs fragments (Fab, Fv, scFv).

Au sens de la présente invention, on entend par anticorps chimérique, relativement à un anticorps d'une espèce animale particulière ou d'une classe particulière d'anticorps, un anticorps comprenant tout ou partie d'une chaîne lourde et/ou d'une chaîne légère d'un anticorps d'une autre espèce animale ou d'une autre classe d'anticorps.

Au sens de la présente invention, on entend par anticorps humanisé une immmunoglobuline humaine dans laquelle les résidus des CDRs (Complementary-Determining Regions) qui forment le site de liaison à l'antigène sont

remplacés par ceux d'un anticorps monoclonal non-humain possédant la spécificité, l'affinité ou l'activité recherchées. Par comparaison avec les anticorps non-humains, les anticorps humanisés sont moins immunogènes et possèdent une demi-vie prolongée chez l'Homme car ils ne possèdent qu'une faible proportion de séquences non-humaines étant donné que la quasi-totalité des résidus des régions FR (Framework) et de la région constante (Fc) de ces anticorps sont ceux d'une séquence consensus d'immunoglobulines humaines.

Des anticorps préférés sont les anticorps monoclonaux et les anticorps humanisés.

Les anticorps selon l'invention et leurs fragments sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que celles décrites dans Antibodies : Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

De manière plus précise : - les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d'un animal approprié avec un antigène tel que défini ci-dessus, éventuellement couplé à la KLH ou à l'albumine et/ou associé à un adjuvant approprié tel que l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l'hydroxyde d'alumine ; après obtention d'un titre en anticorps satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques des protéines membranires de type III sont éventuellement purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne appropriée sur laquelle sont fixés la dite protéine ou l'antigène tel que défini ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d'IgG monospécifiques.

- les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d'un animal immunisé par l'antigène tel que défini ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de Kôhler et Milstein (Nature, 1975,256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notamment dans des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite ; alternativement lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique comme décrit dans le brevet américain US 4,816,567.

- les anticorps humanisés sont produits par des méthodes générales

comme celles décrites dans la Demande Internationale WO 98/45332.

- les fragments d'anticorps sont produits à partir des régions VH et VL clonées, à partir des ARNm d'hybridomes ou de lymphocytes spléniques d'une souris immunisée ; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349,293-299) ; après plusieurs étapes de sélection, les fragments d'anticorps spécifiques de l'antigène sont isolés et exprimés dans un système d'expression approprié, par les techniques classiques de clonage et d'expression d'ADN recombinant.

Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que la chromatographie d'affinité.

Les anticorps selon l'invention sont des anticorps conformationnels c'est-à-dire qu'ils reconnaissent un épitope conformationnel ou épitope non contigu ou bien encore épitope topographique assemblé, lequel épitope correspond à deux ou plusieurs domaines extracellulaires adjacents des protéines membranaires de type III , c'est à dire des région de ces protéines membranaires de type III qui sont éloignées dans la séquence primaire des protéines, car séparées par deux domaines transmembranaires et un domaine intracellulaire (figure 3 illustrant l'exemple de la protéine LMP d'EBV), mais qui sont proches quand les protéines membranaires de type III sont repliées dans leur forme native.

Ces anticorps conformationnels reconnaissent les protéines membranaires de type III, uniquement sous forme native ; ils ne reconnaissent ni les protéines membranaires de type III dénaturées, c'est-à-dire traitées par des agents qui altèrent la structure des protéines, lesquels sont connus de l'Homme du métier (méthanol, alcool, acétone, SDS....), ni les fragments de ces protéines, notamment les peptides représentant un seul domaine extracellulaire desdites protéines membranaires de type III.

Les anticorps selon l'invention qui reconnaissent spécifiquement les protéines membranaires de type III sous forme native avec une affinité élevée pour lesdites protéines natives (constante d'affinité de l'ordre du nM), représentent des réactifs de diagnostic fiables et sensibles pour la détection, à partir d'un échantillon

biologique approprié (sang total, cellules mononucléées du sang périphérique, biopsie tumorale), des patients souffrant d'infections latentes et des pathologies, notamment malignes, induites par les microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus ; ces anticorps qui reconnaissent spécifiquement les protéines membranaires de type III sous forme native ne nécessitent pas d'étapes préalables de dénaturation et/ou de perméabilisation cellulaire, et éventuellement de purification des cellules infectées (enrichissement cellulaire), avant la mise en contact de l'anticorps avec l'échantillon biologique à tester. Ainsi, les anticorps selon l'invention sont utilisables pour la détection d'une infection latente, par exemple, par cytométrie de flux, par immunocytochimie ou immunohistochimie ou bien par immunoprécipitation à partir de cellules non-fixées (congelées ou vivantes) ou fixées dans des conditions nondénaturantes qui sont connues de l'Homme du métier.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection des infections latentes et des pathologies associées telles que définies cidessus, notamment les infections par EBV et les cancers associés.

En outre, de tels anticorps conformationnels qui sont capables de lyser spécifiquement les cellules infectées exprimant les protéines membranaires de type III à leur surface sont utiles en sérothérapie, pour traiter les infections latentes et prévenir ou traiter les pathologies associées telles que définies ci-dessus, notamment les infections par EBV et les cancers associés.

En conséquence, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps tel que défini ci-dessus associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention a également pour objet l'utilisation des anticorps tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des infections latentes et des pathologies associées telles que définies cidessus, notamment les infections par EBV et les cancers associés.

Les anticorps conformationnels selon l'invention dirigés contre les protéine membranaires de type III, présentent les avantages suivants par rapport aux anticorps existants :

- utilisation simple et rapide : du fait de leur nature (conformationnelle), les anticorps selon l'invention permettent la détection directe de cellules infectées dans un échantillon biologique sans étapes préalables de dénaturation et éventuellement de perméabilisation des cellules, ou bien de purification des cellules (enrichissement cellulaire).

- spécificité et sensibilité : du fait de leur affinité élevée pour les protéines membranaires de type III natives, les anticorps selon l'invention permettent de détecter spécifiquement et de façon sensible des cellules infectées par les microorganismes intracellulaires pathogènes tels que définis ci-dessus, à partir d'un échantillon biologique complexe (sang total, biopsie tumorale).

Comparée à la chimiothérapie et à la radiothérapie anti-tumorales qui sont peu spécifiques de leur cible, ou à l'immunothérapie cellulaire ex vivo qui est spécifique de chaque patient mais lourde à mettre en #uvre et onéreuse, la sérothérapie à l'aide des anticorps selon l'invention est peu coûteuse, simple d'emploi et spécifique de sa cible ; du fait de leurs activités cytolytiques et pro-apoptotiques élevées, un nombre limité d'injections par individu sera suffisant pour éliminer efficacement les cellules infectées.

En outre, une composition vaccinale comprenant l'antigène selon l'invention couplé à une protéine porteuse ou à un lipide représente une autre alternative encore moins chère et aussi efficace pour traiter les infections latentes par des microorganismes intracellulaires pathogènes, par exemple EBV, et prévenir ou traiter les pathologies associées à ces infections, notamment les cancers.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre des antigènes et des anticorps selon la présente invention ainsi qu'au tableau 1 résumant les séquences de la Demande, dans lequel les séquences correspondant aux domaines extracellulaires sont indiquées en gras, les séquences correspondant au fragment de liaison sont encadrées, et les acides aminés issus des domaines transmembranaires sont soulignés, et aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre les différents types de latence (Types I, II et III, et éventuellement Type IV) associés aux infections à EBV ; profil d'expression des

gènes viraux et cellulaires et les pathologies associées à chaque type de latence sont indiqués.

- la figure 2 illustre l'analyse comparative de la structure et de l'immunogénicité (présence d'anticorps protecteurs) de différentes types de protéines membranaires virales et bactériennes (Type 1 : immunogène et Types III et V nonimmunogènes).

- la figure 3 illustre la structure des antigènes selon l'invention en prenant comme exemple ceux dérivés des protéines LMP et LMP2A d'EBV. DE: domaine extracellulaire. TM : transmembranaire. DI : intracellulaire.

- la figure 4 illustre les vésicules lipidiques qui se forment spontanément à partir des lipopeptides selon l'invention : Cys (cholestéryl) dérivé des peptides de séquence SEQ ID NO: 13 et 14. A : coloration au bleu de Coomassie. B : coloration à l'oil red.

- la figure 5 illustre l'évolution du titre en anticorps sériques antiLMP1chez 4 souris (souris 1 à souris 4) immunisées avec l'antigène peptidique SEQ ID NO: 10 (DE + DE2 de LMP1) couplé à la KLH ; anticorps sériques ont été dosés en ELISA avec le peptide correspondant (SEQ ID NO: 10), aux jours J21, J42, J63 et J84, soit 3 semaines après chacune des 4 injections successives d'antigène. Souris 1 : souris 2:-# -, souris 3 : -, souris 4 : -#-.

- la figure 6 illustre l'analyse de la spécificité des sérums immuns de souris anti-LMPI (souris immunisée avec l'antigène peptidique SEQ ID NO: 10 (DE1 + DE2) couplé à la KLH), mesurée en ELISA indirect, par un test de compétition avec le peptide correspondant (SEQ ID NO: 10) ou avec un peptide non-pertinent (SEQ ID NO: 12, DE1 + DE3). Les résultats sont exprimés, pour chacun des sérums prélevé à J21 (3.1), J42 (2.1) et J63 (1.1), par le rapport (A/Ao) des valeurs d'absorbance en présence ou en l'absence de peptide compétiteur, en fonction de la concentration molaire (ao) du peptide compétiteur (DE1 + DE2) ou (DE1 + DE3).

Compétition avec le peptide SEQ ID NO: 10 : 3.1 : -#-, 2.1 : -#- et 1.1 : -#-.

Compétition avec le peptide SEQ ID NO: 12 :3.1 : -0-, 2.1 : -#- et 1.1 : -A-.

- la figure 7 illustre la détermination, par régression linéaire à partir de la courbe de la figure 6, de la constante d'affinité (Ka) des anticorps des sérums

immuns de souris anti-LMP 1. Les valeurs de Ka correspondent respectivement à 7,3 nM, 20,8 nM et 557 nM pour les sérums 3.1 (-#-), 2.1 (-#-), et 1.1 (--).

- les figures 8 et 9 illustrent la détection, par immunocytochimie à l'aide des sérums immuns de souris spécifiques des domaines extracellulaires de LMP1, de la protéine LMP native présente à la surface de cellules infectées de façon latente par EBV. Les cellules sont fixées dans du tampon PBS, 4 % formaldéhyde et la détection de la protéine LMP 1 est effectuée comme décrit aux exemples 1.7 et 4.

- la figure 8A illustre la détection de la protéine LMP 1 native sur des lignées de cellules lymphoblastoïdes transformées par EBV (B.LCL-EBV); toutes les cellules sont en latence de type III et expriment LMP qui est détectée sur toutes les cellules.

- la figure 8B illustre la détection de la protéine LMP 1 sur la lignée B95. 8 de lymphocytes B infectés par EBV ; % à 50 % des cellules qui sont en phase lytiques n'expriment pas LMP1(petites cellules non marquées) alors qu'une sous population de cellules expriment les antigènes de latence de type III dont LMP 1 (cellules marquées indiquées par les flèches).

- la figure 9 (9A, 9B et 9C) illustre la détection de la protéine LMP native sur des PBMC de porteurs sains EBV positifs ; quelques lymphocytes B sont infectés et donc détectables chez ces porteurs sains. Le seuil de détection est d'au moins 1 à 2 cellules LMP1positives pour 150 000 à 200 000 PBMC de porteurs sains EBV positifs.

- la figure 10 illustre la détection en immunoprécipitation de la protéine LMP native dans des cellules HEK-293 transfectées par un vecteur d'expression de la protéine LMP1 (pSV-HA-LMPl), à l'aide des sérums immuns de souris spécifiques des domaines extracellulaires de LMP1selon l'invention (Is antiPeptide), par comparaison avec un anticorps monoclonal de souris commercial reconnaissant un domaine intracellulaire de LMP1 (CS1-4). Les cellules HEK-293 transfectées par le vecteur pSV5 sont utilisées comme contrôle (HEK 293 témoins).

Piste 1 : HEK 293 témoins immumoprécipitées par le sérum immun de souris anti- LMP 1. Piste 2 : 293 témoins immumoprécipitées par l'anticorps CS 1-4. Piste 3 HEK 293 transfectées par pSV-HA-LMPI 1 immumoprécipitées par le sérum immun de souris anti-LMP 1. Piste 4 : 293 transfectées par pSV-HA-LMPl

immumoprécipitées par l'anticorps CS 1-4. Les positions des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées.

- la figure 11 illustre l'activité cytotoxique et l'activité proapoptotique des sérums immuns de souris spécifiques des domaines extracellulaires de LMP sur une lignée de cellules lymphoblastoïdes B infectée de façon latente par EBV (B.LCL-EBV ou LCL). A, C et E : LCL incubées pendant respectivement 4 jours en présence de complément seul [sérum normal de lapin (sérum non-immun, non inactivé par la chaleur), dilution 1/60ième]. B, D et F : incubées pendant 4 jours en présence de la même concentration de complément et de concentrations croissantes de

sérum immun anti-LMPI (dilution 1/600ème, 1/300ème et 1/200"""). Avec les LCLs incubées en présence de complément et de la plus faible dilution de sérum immun anti-LMPI(F), on observe une lyse cellulaire importante qui se traduit, au niveau de l'analyse du cycle cellulaire par une augmentation très importante de la proportion de cellules en apoptose ( + 30 %), par rapport au contrôle (A, C et E).

Tableau 1 : Liste des peptides dérivés des protéines LMP1 ou LMP2

<tb>
<tb> Numéro <SEP> Domaine
<tb> d'identification <SEP> Séquence <SEP> Positions <SEP> extracellulaire
<tb> (DE)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> SDWTGGA <SEP> Positions <SEP> 45 <SEP> à <SEP> 51 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> LMP1-DE1
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 2 <SEP> WNLHGQA <SEP> Positions <SEP> 98 <SEP> à <SEP> 104 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> LMP1-DE2
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 3 <SEP> LQQNWN <SEP> Positions <SEP> 160 <SEP> à <SEP> 165 <SEP> de <SEP> LMP1-DE3
<tb> LMP1*
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 4 <SEP> SCFTASVS <SEP> Positions <SEP> 142 <SEP> à <SEP> 149 <SEP> de <SEP> LMP2-DE1
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 5 <SEP> RIEDPPFNS <SEP> Positions <SEP> 199 <SEP> à <SEP> 207 <SEP> de <SEP> LMP2-DE2
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 6 <SEP> DAVLQLS <SEP> Positions <SEP> 260 <SEP> à <SEP> 266 <SEP> de <SEP> LMP2-DE3
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 7 <SEP> GTLN <SEP> Positions <SEP> 317 <SEP> à <SEP> 320 <SEP> de <SEP> LMP2-DE4
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 8 <SEP> SILQTNFKSLSSTEFIPN <SEP> Positions <SEP> 374 <SEP> à <SEP> 391 <SEP> de <SEP> LMP2-DE5
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 9 <SEP> SNTLLS <SEP> Positions <SEP> 444 <SEP> à <SEP> 449 <SEP> de <SEP> LMP2-DE6
<tb> LMP2**
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 10 <SEP> MSDWTGGAL#LWNLHGQAL <SEP> Positions <SEP> 44 <SEP> à <SEP> 51 <SEP> et <SEP> 97 <SEP> à <SEP> 105 <SEP> LMP1-
<tb> (DE1 <SEP> + <SEP> DE2)
<tb>

SEQ ID N0:11 LWNLHGQALKLLYLQQNWWT Positions 97 à 105 et 158-166 LMP1-

SEQ ID NO: 12 MSDWTGGA LYLQQNWWT Positions 44 à 51 et 158-166 LMP1-

<tb>
<tb> ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> de <SEP> LMP1 <SEP> (DE1 <SEP> + <SEP> DE3) <SEP>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 13 <SEP> #MSDWTGGAL#LWNLHGQAL# <SEP> Positions <SEP> 44 <SEP> à <SEP> 51, <SEP> 97 <SEP> à <SEP> 105 <SEP> et <SEP> LMP1- <SEP>
<tb> YLQQNWWT# <SEP> 159-166 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> * <SEP> (DE1 <SEP> + <SEP> DE2
<tb> ~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~~~~~~~+ <SEP> DES) <SEP>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 14 <SEP> MSDWTGGAL#LWNLHGQAL#L <SEP> Positions <SEP> 44 <SEP> à <SEP> 51, <SEP> 97 <SEP> à <SEP> 105 <SEP> et <SEP> LMP1YLQQNWWT <SEP> 158-166 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> * <SEP> (DE1 <SEP> + <SEP> DE2
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> - <SEP> + <SEP> DES)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 15 <SEP> ASSFTASVST#TWRIEDPPFNSL <SEP> Positions <SEP> 141 <SEP> à <SEP> 150 <SEP> et <SEP> 197 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> 208 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE1 <SEP> + <SEP> DE2)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 16 <SEP> TWRIEDPPFNSL#VDAVLQLSPL <SEP> Positions <SEP> 197 <SEP> à <SEP> 208 <SEP> et <SEP> 259 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb>

~~~~~~~ 268 de LMP2** DE2 + DES) SEQ ID NO: 17 IVDAVLQLSP ILGTLNLTTM Positions 258 à 270 et 317 à LMP2 ~~~~~~~~ 324 de LMP2** ~ DE3 + DE4)

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 18 <SEP> ILGTLNLTTM#GGSILQTNFKSLS <SEP> Positions <SEP> 315 <SEP> à <SEP> 324 <SEP> et <SEP> 372 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> STEFIPNL <SEP> 392 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE4 <SEP> + <SEP> DE5)
<tb>

SEQ ID No: 19 GGSILQTNFKSLSSTEFIPNjjÇ|V Positions 372 à 392 et 443 à LMP2

<tb>
<tb> MSNTLLSAW <SEP> 451 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE5 <SEP> + <SEP> DE6)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 20 <SEP> ASSFTASVST#TWRIEDPPFNSL <SEP> Positions <SEP> 141 <SEP> à <SEP> 150,197 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> #VDAVLQLSPL <SEP> 208 <SEP> et <SEP> 259 <SEP> à <SEP> 268 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE1 <SEP> + <SEP> DE2
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> + <SEP> DE3)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 21 <SEP> TWRIEDPPFNSL#VDAVLQLSPL <SEP> Positions <SEP> 197 <SEP> à <SEP> 208 <SEP> et <SEP> 259 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> #ILGTLNLTTM <SEP> 268 <SEP> et <SEP> 315 <SEP> à <SEP> 324 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE2 <SEP> + <SEP> DE3
<tb> ~~~~~~~ <SEP> + <SEP> DE4)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 22 <SEP> VDAVLQLSPL#ILGTLNLT <SEP> Positions <SEP> 259 <SEP> à <SEP> 268 <SEP> et <SEP> 315 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> #GGSILQTNFKSLSSTEFIPNL <SEP> 322 <SEP> et <SEP> 372 <SEP> à <SEP> 392 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE3 <SEP> + <SEP> DE4
<tb> ~~~~~~~~ <SEP> - <SEP> + <SEP> DE5)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 23 <SEP> ILGTLNLT#GGSILQTNFKSLSST <SEP> Positions <SEP> 315 <SEP> à <SEP> 322,372 <SEP> à <SEP> LMP2
<tb> EFIPNL#VMSNTLLSAW <SEP> 392 <SEP> et <SEP> 443 <SEP> à <SEP> 451 <SEP> de <SEP> (DE4+ <SEP> DE5
<tb> TWRIEDPPFNSL#VDAVLQLSPL <SEP> LMP2**Positions <SEP> 197 <SEP> à <SEP> 208 <SEP> et <SEP> + <SEP> DE6)LMP2 <SEP>
<tb> 259 <SEP> à <SEP> 268 <SEP> de <SEP> LMP2** <SEP> (DE2 <SEP> + <SEP> DES)
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 24 <SEP> VMSDWT <SEP> Positions <SEP> 43 <SEP> à <SEP> 48 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> LMP1-DE1
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 25 <SEP> NLHGQA <SEP> Positions <SEP> 99 <SEP> à <SEP> 104 <SEP> de <SEP> LMP1* <SEP> * <SEP> LMP1 <SEP> -DE2 <SEP>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 26 <SEP> LQQN <SEP> Positions <SEP> 160 <SEP> à <SEP> 163 <SEP> de <SEP> LMP1-DE3
<tb> LMP1*
<tb>
*SwissProt P03230 ** SwissProt P13285 Exemple 1 : Matériels et Méthodes 1) Animaux
Des souris femelles BALB/c âgées de quatre semaines (IFFACREDO) sont alimentées à volonté et immunisées à l'âge de 7 à 10 semaines.

2) Antigènes

Des peptides dérivés des domaines extracellulaires de LMP1 et LMP2A ont été synthétisés manuellement en phase solide, selon la méthode originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964,85: 2149-) (1964)), en utilisant la stratégie chimique Fmoc/tert-Butyl à l'échelle 0,1mmole. Les différents acides aminés protégés (Fmoc-L-aa ; NOVABIOCHEM) sont séquentiellement accrochés à la résine Rink amide (APPLIED BIOSYSTEM) après une activation de 3 min à l'HATU (hexafluorophosphate d'0-(7-azabenzotriazol-1-y)- N, N,N',N'-tétramethyluronium), selon la méthode de Miranda et Alewood (P.N.A.S., 1999,96: 1181-1186) en présence d'un excès, d'un facteur 5, de DIEA (diisopropyléthylamine). La neutralisation in situ pendant le couplage donne de meilleurs taux d'acylation en un minimum de temps. L'efficacité de couplage est contrôlée par un test au TNBS (acide trinitrobenzène sulfonique). Si le test est positif, un second couplage est effectué, suivi d'une acétylation de 5 min avec un mélange AC2-DIEA-CH2CI2 3 :0,3:96,7 puis de 3 lavages d'une minute avec du CH2CI2 (chloroforme) puis avec du NMP (N-méthylpyrrolidone). Les groupes protecteurs Fmoc sont clivés avant chaque couplage avec une solution de NMP contenant 20 % de pipéridine. En fin de synthèse, la résine est lavée au diéthyl éther et séchée. Le peptide est clivé de la résine et déprotégé par un mélange TFA (acide trifluoroacétique)-H20EDT-Pr3SiH (92,5: 2,5:2,5:2,5 ; 15 ml) pendant 2 heures à température ambiante, précipité dans du diéthyl éther froid, centrifugé, lavé dans du diéthyl éther froid, recentrifugé, dissous dans l'eau et enfin lyophilisé pour donner un extrait brut peptidique. Le peptide brut est purifié par HPLC sur une colonne semi-préparative en phase inversée (colonne CI 8). La pureté des peptides est toujours supérieure à 95 % et leur identité est confirmée par spectrométrie de masse (positive MALDI-TOF-MS) et HPLC analytique. Les séquences peptidiques synthétisées (SEQ ID NO: 10 à 16) correspondant aux domaines de LMP1(Swiss-Protein Databank numéro P03230) et LMP2A (Swiss Protein Databank numéro P13285) sont présentées dans le Tableau 1 sous la forme du code à une lettre.

3) Immunisation a) Peptides couplés à une protéine porteuse (KLH)
Les peptides dérivés de LMP1ne comportant qu'une seule cystéine exogène (SEQ ID NO: 10,11, 12,15, 16) ont été individuellement couplés à la KLH

activée (Imject maleimide-activated KLH#, PERBIO) selon le protocole du fabricant.

Des souris (4 animal par groupe) sont injectées par voie sous-cutanée dans le flanc, avec une émulsion de peptide (50 g dans 0,1 ml H20) et d'adjuvant complet de Freund (0,1ml). Aux jours 21,42 et 62 suivant la première injection (Jo), les animaux reçoivent une injection de rappel, par la même voie, avec la même quantité d'antigène mais dans de l'adjuvant incomplet de Freund. Du sang est prélevé par ponction rétroorbitale avant chaque injection, pour déterminer le titre des anticorps sériques spécifiques de LMP1 et de LMP2A, par ELISA. b) Peptides couplés à un lipide
Les peptides dérivés de LMP1(SEQ ID NO: 10, 11, 13 et 14) ont été individuellement couplés à une ou plusieurs molécules de cholestérol ou d'acide palmitique, par l'intermédiaire de liaison (s) (cholestérol) ou thioester (acide palmitique) avec la fonction thiol de leur (s) cystéine. Le couplage du peptide (5mg/ml) par une liaison thioéther au cholestérol activé (bromoacétylcholestérol) est spontané en milieu diméthyl-formamide (DMF)/tampon phosphate pH 7,5 (95: 5). Le déroulement de la réaction est suivi par acidification du milieu réactionnel et HPLC analytique. Le lipopeptide est purifié par gel filtration en milieu acide acétique 20 %.

L'acide palmitique est incorporé dans la chaîne peptidique par l'intermédiaire d'une liaison thioester, au cours de la synthèse peptidique. Le lipopeptide s'organise spontanément en vésicules (figure 4) qui sont lavées par centrifugations successives en milieu aqueux. Le protocole d'immunisation des souris est le même que précédemment sauf que l'adjuvant de Freund est remplacé par le Montanide#.

4) ELISA
Des échantillons de sang sont prélevés par ponction rétroorbitale sur les souris immunisées, puis les sérums sont récupérés et congelés à - 20 C par fractions de 20 l. Les puits d'une plaque de microtitration (Maxisorp@, NUNC) sont recouverts de 100 l de peptide (1 g/ml) pendant une nuit à + 4 C. Des plaques recouvertes de peptides non-pertinents de même masse moléculaire servent de contrôle. Les puits sont ensuite lavés avec du tampon PBS contenant 0,5 % de Tween 20 (PBS-T) puis bloqués 1 h en présence de tampon PBS contenant 2 % de poudre de lait écrémé (PBS-SM). Après des lavages dans le même tampon que précédemment, 100 fil de sérum dilué dans du tampon PBS-T-SM (PBS, 0,05 % Tween 20,2 %

poudre de lait écrémé) sont ajoutés dans les puits et les plaques sont incubées pendant 2 heures à 37 C. Après quatre lavages avec du tampon PBS-T, 100 (il d'anticorps secondaire de chèvre anti-immunoglobulines totales ou anti-IgGl, -G2a, G2b et G3 de souris, conjugué à la péroxydase (BIORAD), dilué au 1/10000 dans du tampon PBS-T sont ajoutés dans chaque puits et les plaques sont incubées pendant 1 h à 37 C. Après des lavages extensifs avec du tampon PBS-T, 100 III de substrat (OPD: dihydrochlorure d' o-phénylènediamine, SIGMA) dilué dans du tampon citrate 0,05 M, pH 5,5 contenant du H2O2 sont ajoutés dans chaque puits et les plaques sont incubées 30 min à température ambiante, dans l'obscurité. La réaction est stoppée par addition d'acide sulfurique 4N et l'absorption à 492 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur automatique de microplaques (DYNATECH).

5) Test de compétition
La spécificité de liaison antigène-anticorps est mesurée par un test de compétition, selon la méthode décrite par Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 1985,77: 309-309). Le principe de la méthode est le suivant : la première étape consiste en l'absorption de l'anticorps par l'antigène ou par un peptide non-pertinent, en solution et la deuxième étape consiste au dosage, par un test ELISA indirect, des anticorps libres lorsque l'antigène et l'anticorps sont à l'équilibre.

De manière plus précise : - étape 1 : concentrations de l'antigène peptidique ou d'un peptide non-pertinent (10-11à 10-5 M) sont incubées avec une concentration fixe d'anticorps (sérum dilué au 1/50), dans du tampon PBS-T-SM (PBS, 2 % poudre de lait écrémé, 0,05 % Tween 20), pendant 18 h à 4 C.

- étape2 : 100 l du produit de la réaction obtenu à l'étape 1 sont prélevés, ajoutés dans les puits d'une plaque de microtitration préalablement recouverte de l'antigène peptidique (100 ug/puits dans du tampon NaHC03, pH 9,6) et la plaque est incubée pendant 1 h à 20 C. Après des lavages avec du tampon PBS-T (PBS, 0,05 % Tween 20), les immunoglobulines liées à l'antigène peptidique sont détectées par un anticorps secondaire de chèvre anti-immunoglobulines totales de souris couplé à la peroxydase. La révélation de la réaction et la lecture des plaques sont effectuées comme pour le test ELISA.

6) Culture cellulaire

La lignée HEK-293 de cellules embryonnaires de rein humain (ATCC CRL 1573) et la lignée transfectée par le plasmide pSV-HA-LMP 1, dérivée de la lignée HEK-293, sont cultivées dans des plaques à 24 puits, dans du milieu de Dulbecco (GIBCO) additionné de sérum de veau f#tal (10 %), de glutamine (2 mM), d'acides aminés non-essentiels (1 %), de pyruvate de sodium (1 mM) et de gentamycine (50 ug/ml). Le plasmide pSV-HA-LMPI dérive du plasmide pSV5 (STRATAGENE) par clonage, sous le contrôle du promoteur du virus SV40, d'un insert correspondant à l'ADNc de LMPI de la souche sauvage B95. 8 d'EBV. Les autres cellules sont cultivées dans du milieu RPMI supplémenté comme ci-dessus. La lignée B95. 8 de lymphocytes B de ouistiti infectée par EBV est utilisée pour la production de particules virales. Les lymphocytes B transformés par EBV (BEBVnéo) et les LCL (lignées de cellules lymphoblastoïdes EBV+ en latence de type III) dérivées de PBMC humains par infection par un surnageant de culture de la lignée B95. 8 sont obtenues comme décrit dans Current Protocols in Immunology, 1991, Colingan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Schevach EM, Strober W, Greene. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont purifiées par centrifugation d'un échantillon de sang sur un gradient de Ficoll. La lignée Jurkat de lymphocytes T humains et la lignée DG75 de lymphome de Burkitt EBV négative sont également utilisées comme contrôles.

7) Immunocytochimie
Les expériences sont réalisées sur des lamelles (cellules en suspension) ou sur des plaques à 24 puits (cellules adhérentes) par les techniques classiques d'immunocytochimie, en utilisant un protocole ABC standard. De manière plus précise, les cellules adhérentes cultivées dans des plaques et les cellules nonadhérentes cultivées en suspension sont lavées avec du PBS, puis, uniquement dans le cas des cellules en suspension, déposées sur une lamelle (100 III à 106 cellules /ml).

Les cellules sont ensuite fixées (plaques ou lamelles) dans des conditions nondénaturantes : incubation pendant 30 min dans du tampon PBS, 4 % formaldéhyde, puis 3 lavages pendant 1 min avec du PBS, et enfin bloquage avec 4% d'H202. En parallèle, les cellules sont fixées dans des conditions dénaturantes : incubation pendant 30 min dans du tampon PBS, 4 % formaldéhyde, puis dénaturation par déshydratation

avec des concentrations croissantes d'éthanol (50 , 70 , 90 et 100 ) et enfin bloquage avec 4% d'HzOz.

Les incubations avec les anticorps primaires et secondaires sont réalisées, soit dans du tampon PBS contenant 5 % de poudre de lait écrémé (cellules fixées dans des conditions non-dénaturantes), sans aucun détergent ni composé organique susceptible d'inhiber la liaison de l'anticorps, soit dans du tampon PBS contenant 0,5 % de Tween 20 ou 0,05 % de saponine (cellules fixées dans des conditions dénaturantes). De manière plus précise, les cellules sont d'abord incubées pendant 45 min à température ambiante, en présence de sérum immun de souris spécifique de LMP1, préparé comme décrit à l'exemple 1 et à l'exemple 2 (dilution au 1/1000ème) et de sérum normal de lapin (dilution au 1/300ème). Les anticorps de souris sont ensuite marqués par un anticorps de lapin biotinylé (SIGMA), selon les recommandations du fabricant. Après 3 lavages avec du PBS, la biotine fixée est détectée à l'aide d'un système enzymatique ABC couplé à la peroxydase (Axtravidin, SIGMA) puis la réaction est révélée par la diaminobenzidine (SIGMA).

8) Analyse de la prolifération et du cycle cellulaire
Une culture de cellules lymphoblastoïdes infectée par EBV (LCL, 106 cellules/ml), est distribuée dans une plaque à 6 puits (106 cellules/puits) puis les cellules sont incubées pendant 4 jours dans du milieu RPMI contenant du sérum normal de lapin non décomplémenté (dilution au 1/60ème). Alternativement, les cellules sont incubées pendant 4 jours avec du sérum normal de lapin non décomplémenté à la même concentration et des concentrations croissantes de sérum immun de souris anti-LMP1 (dilutions aux 1/600ème, 1/300ème et 1/200ème), préparé comme décrit aux exemples 1.3 et 2.

La prolifération cellulaire est analysée par observation directe des cultures (nombre de cellules et morphologie cellulaire) en microscopie optique.

Pour l'analyse du cycle cellulaire, 1 ml de cellules sont prélevées à J4, rincées dans du PBS, fixées dans du tampon PBS, 4 % formaldéhyde pendant 30 min à 4 C, lavées 2 fois dans du tampon PBS froid puis centrifugées. Le culot cellulaire obtenu est remis en suspension dans 1 ml de tampon PBS contenant 200 g d'iodure de propidium et 100 g de RNase A (/ml), puis incubé 30 min à 37 C. Les réactions sont conservées une nuit à 4 C puis le contenu en ADN des cellules est

analysé par flurométrie (cytomètre EPICS-XL, COULTER), de façon à déterminer le pourcentage de cellules en phase G0/G1 (2n), S (> 2n et < 4n), G2/M (4n) et en apoptose (< 2n).

9) Immunoprécipitation
106 cellules HEK-293 sont transfectées avec le plasmide pSV-HALMP1 ou avec le plasmide contrôle pSV5, à l'aide de polyéthylène imine, dans les conditions recommandées par le fabricant. 48 heures après la transfection, les cellules sont rincées deux fois avec du tampon PBS, lysées pendant 15 min sur la glace, dans 500 l de tampon PY (20 mM Tris HCI, pH 7,4, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA et 1 % Triton X-100) additionné d'inhibiteurs de protéases (1 mM leupeptine, 1 mM natrium orthovanadate et 5UI/ l d'aprotinine), puis le lysat est enfin clarifié par centrifugation à 14 000 rpm. Le lysat ainsi obtenu est incubé pendant une heure à + 4 C sous agitation légère, avec un anticorps monoclonal murin reconnaissant une région intracellulaire de LMP1 (CS1-4, NOVOCASTRA) ou avec 5 pl de sérum immun de souris anti-LMP préparé comme décrit aux exemples 1. 3 et 2.100 l d'une solution de protéine A-Sépharose (AMERSHAM-PHARMACIA) sont ensuite ajoutés et le mélange est agité légèrement sur un carrousel, pendant une heure à + 4 C. Les billes de Sépharose sont ensuite lavées quatre fois avec du tampon PY, éluées avec 30 l de tampon de Laemmli puis soumises à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE).

Après la séparation électrophorétique, les protéines présentes dans le gel sont ensuite transférées sur des membranes (Immobilon-P, MILLIPORE) par électro-transfert. Les membranes sont saturées pendant 1 heure et demie avec une solution de caséine (0,2 %) dans du tampon PBS-0,1 % Tween 20, puis elles sont incubées une heure avec l'anticorps murin CS1-4. Après des lavages successifs, les membranes sont incubées 15 minutes avec des immunoglobulines anti-IgG de souris conjuguées à la peroxydase (JACKSON IMMUNORESEARCH) et la protéine LMP1 immunoprécipitée est révélée à l'aide du kit ECL (AMERSHAM).

Exemple 2 : Préparation d'anticorps conformationnels dirigés contre les domaines extracellulaires de la protéine LMP1 d'EBV.

Des anticorps dirigés contre les domaines extracellulaires de la protéine LMP 1 d'EBV ont été préparés par immunisation de souris avec les peptides

SEQ ID NO: 10 et 11 couplés à la KLH ou bien avec le peptide SEQ ID NO: 13 couplé au cholestérol, comme décrit à l'exemple 1. La cinétique d'apparition des anticorps sériques dirigés contre les domaines extracellulaires de la protéine LMPa été analysée par ELISA, comme décrit à l'exemple 1.

Les résultats illustrés à la figure 5 et au tableau II montrent que les antigènes selon l'invention sont immunogènes, c'est-à-dire qu'ils induisent la production d'anticorps dirigés contre les domaines extracellulaires de la protéine LMP 1 lorsqu'ils sont administrés in vivo chez un individu.

Tableau II: Pouvoir immunogène des antigènes

<tb>
<tb> Peptide <SEP> Sequence <SEP> Numéro <SEP> Pouvoir
<tb> d'identifica <SEP> immunogène
<tb> tion
<tb> LMP1
<tb> Domaine <SEP> MSDWTGGAL#LWNLHGQAL <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> +++
<tb> 1+2 <SEP> 10
<tb> Domaine <SEP> LWNLHGQAL#LYLQQNWWT <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP>
<tb> 2+3 <SEP> 11
<tb> Domaine <SEP> MSDWTGGAL#LYLQQNWWT <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP>
<tb> 1+3 <SEP> 12
<tb>

Domaine 1VISDWTGGAI CLWNLHGQAI CYLQQNWWT SEQ ID NO: + (IgM) 1+2+3 |ç| 13 Domaine MSDWTGGALuCLWNLHGQALCL,YLQQNWWT SEQ ID NO: + (lgN4

<tb>
<tb> 1+2+314
<tb>
Exemple 3 : de la spécificité et de l'affinité des anticorps
La spécificité et l'affinité des anticorps produits comme décrit aux exemples 1 et 2 sont mesurées par le test de compétition, comme décrit à l'exemple 1.

Les résultats obtenus avec les anticorps dirigés contre l'antigène représentant la concaténation des domaines extracellulaires DE1 et DE2, séparés par un résidu de cystéine (antigène (DE1 + DE2), SEQ ID NO: 10) sont illustrés respectivement par les figures 6 et 7.

L'absence de compétition avec le peptide (DE1 + DE3) démontre ; - d'une part que les anticorps reconnaissent l'antigène (DE1 + DE2) de façon spécifique (figure 6), et - d'autre part, dans la mesure où ces anticorps de nature polyclonale (sérum immun) ne présentent aucune réactivité avec le peptide DE1 + DE3 qui possède la séquence DE1 en commun avec l'antigène (DE1 + DE2), ces résultats indiquent également que ces anticorps sont des anticorps conformationnels étant

donné qu'ils reconnaissent spécifiquement un épitope non contigu correspondant au domaine extracellulaire 1 associé au domaine extracellulaire 2, lesquels domaines sont éloignés dans la séquence primaire des protéines car séparés par un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire mais proches quand la protéine LMP est repliée dans sa forme native.

Les constantes d'affinité déterminées par régression linéaire à partir de la courbe de la figure 6, montrent que l'immunisation avec l'antigène (DE1 + DE2) permet de produire des anticorps possédant une forte affinité pour l'antigène (Ka de 7,3 nM et 20,8 nM).

Exemple 4 : de la réactivité des anticorps vis-à-vis de la protéine LMP1 native ou dénaturée.

La réactivité des sérums immuns de souris préparés comme décrit aux exemples 1. 3 et 2, vis-à-vis de l'antigène LMP1 natif ou dénaturé, est testée par immunocytochimie, comme décrit à l'exemple 1.7. Alternativement, la réactivité des sérums est testée en Western-Blot (conditions dénaturantes), selon les protocoles standards connus en eux-mêmes ou en immunoprécipitation (conditions natives), comme décrit à l'exemple 1.9.

Les résultats illustrés par les figures 8,9 et 10 démontrent que les sérums immuns de souris contiennent des anticorps conformationnels qui reconnaissent de façon sensible et spécifique la protéine LMP native exprimée à la surface des cellules de patients infectés de façon latente par EBV, en immunocytochimie (cellules fixées dans des conditions non-dénaturantes telles que précisées à l'exemple 1. 7) et en immunoprécipitation (lysats cellulaires préparés dans des conditions non-dénaturantes) ; revanche, ils ne reconnaissent pas la protéine LMP sous forme dénaturée, en immunocytochimie (cellules fixées dans des conditions dénaturantes telles que décrites à l'exemple 1. 7) et en Western-Blot (lysats cellulaires préparés dans des conditions dénaturantes).

Exemple 5 : Analyse de l'activité cytotoxique des anticorps (ADCC)
L'activité cytotoxique des anticorps est testée sur des lignées lymphoblastoïdes B infectées de façon latente par EBV (B-LCLs), incubées avec du complément, seul (contrôle) ou en présence de sérum immun de souris anti-LMP 1, comme décrit à l'exemple 1.8.

Les résultats montrent que les sérums immuns anti-LMP possèdent une activité cytotoxique de type ADCC, vis à vis des cellules infectées de façon latente par EBV : - l'observation directe des B-LCLs montre qu'à 24h, 50% des cellules incubées en présence de complément et de la plus faible dilution de sérum immun ont été lysées ; temps plus tardifs, on observe une lyse de l'ensemble des cellules.

- l'analyse du cycle cellulaire (figure 11) montre qu'au bout de 4 jours, 50 % des B-LCLs incubées en présence de complément et de la plus faible dilution de sérum immun sont en apoptose (F) ; par comparaison avec les cellules contrôle incubées en présence de complément seul (A, C et E), on observe avec ces mêmes B-LCLs incubées en présence de complément et de la plus faible dilution de sérum immun, une nette diminution de la prolifération cellulaire (diminution de la proportion de cellules en phases S et G2/M) et une augmentation de 30 % de la proportion de cellules en apoptose.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 ) Antigène dérivé d'un microorganisme intracellulaire pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment peptidique essentiellement constitué par la concaténation des séquences d'au moins deux domaines extracellulaires adjacents dans la structure native d'une protéine membranaire de type III à 2n domaines transmembranaires dudit microorganisme intracellulaire pathogène.

2 ) Antigène selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment peptidique comprend également au moins une séquence hétérologue de liaison de 1 à 5 acides aminés identiques ou différents entre eux, précédant la séquence d'un desdits domaines extracellulaires.

3 ) Antigène selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits acides aminés sont différents de ceux présents dans les séquences desdits domaines extracellulaires.

4 ) Antigène selon la revendication 2, caractérisé en ce que toutes les séquences des domaines extracellulaires adjacents, à l'exception de celles situées aux extrémités N et/ou C-terminales dudit fragment peptidique, sont précédées par une séquence hétérologue de liaison.

5 ) Antigène selon la revendication 2, caractérisé en ce que toutes les séquences des domaines extracellulaires adjacents dudit fragment peptidique sont précédées par une séquence hétérologue de liaison.

6 ) Antigène selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits acides aminés sont choisis parmi la cystéine (C) et/ou la lysine (K).

7 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit fragment peptidique inclut également entre les séquences hétérologues de liaison et les séquences des domaines extracellulaires et de part et d'autres desdites séquences des domaines extracellulaires, une séquence d'au moins un acide aminé, de préférence de 1 à 7 acides aminés, de manière préférée 2 acides aminés, correspondant à celle du domaine transmembranaire flanquant ledit domaine extracellulaire dans la structure de ladite protéine membranaire de type III.

8 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est issu d'une protéine membranaire de type III sélectionnée dans le groupe constitué par : les protéines LMP1et LMP2A d'EBV (numéro d'accès

dans la base de données SWISSPROT, respectivement P03230 et P13285, en référence à la séquence de la souche B95. 8 d'EBV), les protéines LAMP K15-P et LAMP K15-M de KSHV (numéros d'accès, respectivement AAD45297 et AAD45296, dans la base de données GENBANK), la protéine p7 d'HCV, la protéine MOMP de Chlamydia trachomatis et la protéine Mmpl7 de Mycobacterium tuberculosis.

9 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit fragment peptidique tel que défini à la revendication 1 est essentiellement constitué par la concaténation des séquences de 2 à 6 domaines extracellulaires adjacents, de préférence 2 ou 3 domaines extracellulaires adjacents, dans la structure native de ladite protéine.

10 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO: 10, 11et 13 à 23.

11 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux fragments peptidiques tels que définis à la revendication 1, issus de protéines membranaires de type III différentes.

12 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que l'un au moins des acides aminés d'une séquence hétérologue de liaison telle que définie à la revendication 2, est lié de façon covalente à au moins une protéine porteuse ou au moins un lipide.

13 ) Antigène selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'au moins deux acides aminés, chacun issu de l'unique séquence de liaison de fragments peptidiques distincts sont liés à une protéine porteuse.

14 ) Antigène selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'une cystéine ou une lysine d'une séquence hétérologue de liaison sont liées à une protéine porteuse, respectivement par une liaison thioéther et une liaison amide.

15 ) Antigène selon l'une quelconque des revendication 12 à 14, caractérisé en ce que ladite protéine porteuse est la KLH.

16 ) Antigène selon la revendication 12, caractérisé en ce que le ou les lipides sont branchés par des liaisons éther, thioéther, ester et thioester, de

préférence par des liaisons thioester.

17 ) Antigène selon la revendication 15ou la revendication 16, caractérisé en ce qu'au moins deux acides aminés issus d'une ou plusieurs séquence(s) hétérologue (s) de liaison (s) seul fragment peptidique, sont liés chacun à un lipide.

18 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 12, 16 et 17, caractérisé en ce que ledit lipide est sélectionné parmi le cholestérol et l'acide palmitique.

19 ) Antigène selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un cholestérol lié à un résidu cystéine, acide aspartique ou acide glutamique ou bien un acide palmitique lié à une sérine ou à une thréonine.

20 ) Antigène selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisé en se qu'il est sous la forme de vésicules ou de micelles lipopeptidiques.

21 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement à au moins un adjuvant.

22 ) Utilisation d'un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'une infection latente ou chronique par un microorganisme intracellulaire pathogène et de pathologies associées.

23 ) Anticorps dirigé contre une protéine membranaire de type III telle que définie à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est produit par immunisation d'un animal approprié avec un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou une composition immunogène selon la revendication 21.

24 ) Anticorps selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les anticorps monoclonaux et les anticorps humanisés.

25 ) Réactif de diagnostic d'une infection latente ou chronique par un microorganisme intracellulaire pathogène et de pathologies associées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 23 ou la revendication 24.

26 ) Utilisation d'un anticorps selon la revendication 23 ou la revendication 24 pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection

d'une infection latente ou chronique par un microorganisme intracellulaire pathogène et des pathologies associées.

27 ) Kit de diagnostic d'une infection latente ou chronique par un microorganisme intracellulaire pathogène et des pathologies associées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 23 ou la revendication 24.

28 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps selon la revendication 23 ou la revendication 24 associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

29 ) Utilisation d'un anticorps selon la revendication 23 ou la revendication 24 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection latente ou chronique par un microorganisme intracellulaire pathogène et des pathologies associées.

30 ) Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence codant pour un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 20.

31 ) Sondes et/ou amorces pour l'obtention d'un antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction des séquences codant pour un domaine transmembranaire et des séquences codant pour un domaine extracellulaire adjacent au précédent, d'une protéine membranaire de type III telle que définie à la revendication 1.

32 ) Vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléiques selon la revendication 30.

33 ) Cellules eucaryotes ou procaryotes modifiées par un vecteur recombinant selon la revendication 32.