KR100547049B1 - 바이러스 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

바이러스 치료, 진단 및 예방을 위한 방법 및 조성물은 바이러스 단백질의 부위와 반응하여 감염성을 중화시키거나 바이러스 생활 주기에서 기능적으로 필수적인 사건을 불활성화시키는 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이 항체는 감염에 의하거나 환경에 노출시 사람에 있어서는 면역 반응을 나타내지 않는 바이러스성 에피토프를 인식한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 사람 면역결핍(HIV) 감염의 치료 및 진단에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.
바이러스 감염증, 백신접종, 바이러스 생활 주기.

Description

바이러스 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법{Compositions and Methods for Treating Viral Infections}
<기술분야>
본 발명은 일반적으로 바이러스 감염의 치료 및 방지에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 치료 및 진단에 유용한 펩티드 및 항체 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
<배경기술>
바이러스 감염의 진단, 치료 및 방지는 수많은 의학 연구의 주된 촛점이다. 바이러스 감염을 진단하고, 치료하고 백신접종하기 위한 방법 및 조성물이 공지되어 있지만, 사람에 있어서 검출하기 어려운 많은 바이러스가 여전히 존재하고, 이에 대한 효과적인 치료 또는 백신접종 방법이 알려져 있지 않다. 이들 중 가장 심각한 것 중 하나가 HIV이다.
후천성 면역결핍증(AIDS) 및 이의 전조증상, AIDS-관련(ARC) 및 림프절장애(LAS)에 대한 감염자는, 바이러스의 분류에 대한 국제 위원회에서 권장된 바와 같은 LAV, HTLV-III, ARV 및 최근에는 HIV라고 하는 림프친화성 레트로바이러스이다(참고 문헌 299). 본 명세서에서의 명명법은 AIDS와 관련하여 명명된 바이러스 및 그의 균주에 대한 이들 권장서를 사용한다. LAV 및 ARV-2 균주에 대 한 내력적인 대조는 각각 HIV1 LAI 및 HIV1SF2이다.
HIV가 범발적인 비율로 퍼질 때, 감염된 개인의 치료 및 노출 위험에 있는 비감염된 개인에 대한 전달 방지가 매우 중요하다. 다양한 치료 전략은 바이러스의 생활 주기의 다른 단계들을 표적으로 하였고, 이는 문헌[Mitsuya and Broder, 1987, Nature 325: 773]에 개시하고 있다. 하나의 접근법은 바이러스가 숙주 세포 에 침투하는 것을 방해하거나 어떤 다른 기작에 의해서, 바이러스에 결합하여 바이러스 복제를 억제하는 항체를 사용하는 것이다. 일단 항체 감염에 민감한 바이러스 성분이 확인되면, 이는 바이러스의 감염성을 중화시키기에 충분한 항체 반응성을 유발시켜, HIV 감염 환자에게 면역글로불린 또는 정제된 항체의 형태로 투여할 수 있고, 이러한 수동 면역법은 HIV 감염의 진행을 변경시키거나 역전시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한, MHC 상호작용이 증진되도록 개질시킨, 선택된 에피토프로 비감염된 개인을 백신접종시키면, HIV에 노출 후에 따른 감염으로부터 보호할 것으로 기대된다.
대부분의 레트로바이러스의 외피 당단백질은 민감성 세포의 표면상의 수용체 분자와 반응하는 것으로 생각되고, 따라서 특정 숙주에 대한 바이러스의 감염성을 결정한다. 이러한 외피 당단백질에 결합하는 항체는 세포 수용체와 바이러스와의 상호작용을 차단하고, 바이러스의 감염성을 중화시킬 수 있다. 일반적으로 문헌[The Molecular Biology of Viruses, 534(J. Tooze,ed., 1973); RNA Tumor Viruses, 226, 236,(R. Weiss et al., eds., 1982); Gonalez-Scarano et al., 1982, Virology 120:42(La Crosse Virus); Matsuno and Inouye, 1983, Infect. Innun. 39:155(Neonatal Calf Diarrhea Virus); and Mathews et al., 1982, J. Immunol., 129:2763(Encelphalomyelitis Virus)]을 참고한다. 지금까지, HIV 단백질/펩티드로 백신접종함으로써 사람에 있어서 보호적인 면역 반응을 나타내려는 치료학적 전략들은 실패해왔다. 또한, HIV 감염된 환자로부터 회수된 높은 역가의 중화성 항체나 쥐에서 생산된 모노클로날 항체 모두 HIV 감염의 AIDS 및 죽음으로 진행하는 것을 변화시키는데 성공하지 못하였다. 당업계에서는, HIV 감염 경로를 변화시킬 수 있는 면역 반응을 나타낼 또다른 면역학적 표적을 찾아내는 것이 필요하다.
HIV의 일반적인 구조는, 리보핵단백질 코어가 바이러스 감염된 숙주 세포 막으로부터 출아하는 과정 동안 얻어지는 지질-함유 외피에 의해서 둘러싸여 있는 구조이다. 바이러스 코딩된 당단백질은 외피내에 심겨져 있고 밖으로 돌출해 있다. HIV의 외피 당단백질은 150,000 내지 160,000 달톤(gp 160)의 전구체 분자로서 감염된 세포에서 처음으로 합성되고, 그 후 세포내에서 110,000 내지 120,000 달톤(gp 120)의 N-말단 단편으로 처리되어 외부 당단백질 및 막내외 외피 당단백질인 41,000 내지 46,000 달톤(gp 41)의 C-말단 단편을 생성한다.
상기 논의된 근거로, HIV의 gp 120 당단백질이 바이러스 생활 주기를 방해하기 위한 유력한 표적으로서 많은 연구의 대상이 되어왔다. HIV-감염된 개인의 혈청이 시험관내 HIV를 중화시켰고, 정제된 gp 120에 결합한 항체가 이러한 혈청내에 존재하는 것으로 나타났다(문헌[Robert-Guroff et al., 1985, Nature 316:72; Weiss et al., 1985, Nature 316:69; and Mathews et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:9709]). 정제된 재조합 gp 120은 동물 (Robey et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:7023; Lasky et al., 1986, Science, 233:209) 및 사람(Zagury et al., 1986, Nature 326:249)을 면역시키는데 사용시 중화성 혈청 항체의 생산을 촉진하였다. 또한, CD4 수용체에 gp 120 분자가 결합하는 것이 밝혀졌고, CD4 수용체의 특정 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체가 HIV 결합, 합포체 생성 및 감염성을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[McDougal et al., 1986, Science 231:382 and Putney et al. 1986, Science 234:1392]에는 gp 120분자의 카르복실 말단 절반을 함유하는 재조합 융합 단백질로 면역시킨 후 동물내에서 중화성 혈청 항체를 나타내었고, 또한, 중화성 항체 반응에 있어서 외피 단백질의 글리코실화가 불필요함을 입증하였다.
HIV 감염 후 곧 사람의 면역계는 항체 생산과 세포 매개된 면역 반응으로 바이러스에 반응한다. 레트로바이러스에 대한 면역 반응의 개관이 발간되어 있다(문헌[Norley, S., and Kurth R., 1994: The Retroviridae, Vol E, J.A. Levy, ed., 1994: The Retroviridae, Vol E, J.A. Levy, ed., pp. 363-464, Plenum Press]). gp 160, gp 120, p 66, p 55, p 41, p 32, p 24 및 p 17을 포함하는 수많은 HIV 단백질에 대하여 특이적인 사람 항체가 보고되어 있다(문헌[Carlson, 1988, J.Am. Med. Assoc. 206:674]). HIV에 대한 사람의 초기 항체 반응은 p 17 및 p 24, 이어 gp 120/160, 그 후 gp 41, p66/55 그리고 최종적으로 p32로 이어진다(문헌[Lange 35 et al 1986, Br. Med. J. 292:228]). HIV 감염이 AIDS로 진행됨 에 따라서, p 17 및 p 24에 대한 항체 농노는 감지할 수 없을 정도로 급격히 떨어지고, p 17 및 p 24 항원혈증으로 대체된다. p32 및 p55에 대한 항체 역가는 단지 보다 적게 감소한다(문헌[Mcdougal et al 1987 J. Clin. Invest. 80:316]). 그러나, gp 160/120에 대한 항체의 실질적인 양은 HIV 감염의 전체 경로 내내 지속된다. HIV 감염의 초기 상태 동안, 총 면역글로불린의 상승이 관찰되고, 이러한 증가된 항체의 양은 HIV에 특이적이고, gp 120에 대해서 우세하다(문헌[Amadori et al., 1988 Clin. Innunol. Immunopathol. 46:342; Amadori et al, 1989, J. Innunol 143:2146]). 이러한 HIV 특이 고감마 글로불린혈증에 대한 가능한 기작은 발커 이.(Barker E.) 등의 문헌[1995, The retroviridae vol 4, J.A. Levy, ed. pp 1-96 Plenum Press.]에 개관되어 있다. HIV 감염시 생성된 이러한 항체에 의해 표적된 기능성 및 에피토프를 서술하고 있고, 항체 매개된 중화에 민감한 에피토프를 포함한다. 이러한 주요한 표적 에피토프는 주로 외피 당 gp160(gp 120/gp 41) 및 gag 단백질 p17에 위치한다(문헌[Levy, 1994 am.Soc. Micro; Nixon et al, 1992 Innunol 76:515] 참고). HIV 외피 단백질에 대한 중화성 항체가 확인되었고, 이는 gp 120상의 보존되고 분기된 도메인에 결합된다. 이들은 CD4 결합 부위에 한정된 부위(Linsley et al 1988 and Thali et al, 1992); 제2 및 제3의 댜앙한 루프 도메인(Fung et al, 1992 and Haigwood et al 1990); 및 탄수화물 잔기(Benjouad et al, 1992 and Feizi and Larkin, 1990)를 포함한다. gp 41의 외부 및 p 17상의 결합 위치에서 다른 중화 위치가 확인되었다(Changh et al, 1986). 초기 연구에서는 중화성 항체의 존재가 보다 유리한 임상 결과를 내는 것으로 제시하였다(Robert- Guroff et al, 1985). 그러나, 이들 연구는 실험실의 HIV 균주에 대하여 높은 중화력을 갖지만 자가 유래 HIV 단리물에 대해서는 높은 중화력을 갖지 않는, 선택된 혈청을 사용하였다(문헌[Homsy et al 1990; Tremblay and Wainberg, 1990]). 후속되는 연구 결과, 자가유래 항체는 자가유래 HIV 단리물에 대한 중화 활성을 거의 갖지 않거나 없다는 것을 입증하였다(문헌[Homsy et al, 1990]). 중화성 항체의 존재에서 항체 매개된 중화에 대한 감수성의 부족은, 새로운 항체 특이성이 생성되면서 감염 내내 및 혈청변환(Arendrup etal, 1992) 후에 나타나는 일탈 돌연변이체의 발달로 인한 것으로 생각된다. HIV 감염 결과로 생산되는 중화성 항체의 임상적 관련성은 불명확하다. 그러나, HIV로 감염된 개인에서는 HIV에 대한 격렬한 면역 반응에도 불구하고, AIDS로 진행하고 면역 결핍 우세화의 결과로서 결국은 죽게된다. 따라서, 새로운 치료 방법이 강구되고 있다.
<발명의 목적>
본 발명의 목적은 사람에 있어서는 면역 반응을 나타낼 수 없지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 나타내는 바이러스 단백질의 중화성 부위를 찾아내는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 단백질의 이러한 확인된 중화성 부위 및 진단에서 이들과 반응적인 항체를 사용하여 바이러스에 의해 유발되는 질병의 치료 및 방지하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 하기 상술된 발명의 설명으로부터 명백하게 될 것이다.
<발명의 요약>
본 발명에 따라서, 바이러스의 생활 주기에서 필수적인 사건을 기능적으로 중화시키고 불활성화시키는 바이러스 단백질 부위와 반응하는 항체를 사용함으로써 바이러스 감염의 치료, 진단 및 방지를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이 항체는, 감염에 의하거나 환경에 노출시 사람에 있어서 면역 반응을 나타낼 수 없지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 나타내는 바이러스의 에피토프를 인식한다.
사람이 아닌 항-바이러스 항체와는 반응하지만 사람 항-바이러스 항체와는 반응하지 않는, 선택된 에피토프가 확인되었다. 이러한 에피토프는 사람 단백질과 유사한(mimic, 사람 단백질을 모방하는) 분자를 통해 사람 면역계에 의한 감시기구를 벗어나고, 어떤 경우에는 항원 프로세싱 세포 내의 효소에 의한 절단에 민감한 아미노산으로 구성된다. 바람직한 에피토프는 사람 효소에 의해 효소적으로 절단되는 것이고, 따라서 프로세싱되어 면역 제시되는 것이 아니다.
이러한 에피토프를 대표하는 펩티드는 합성, 임의로 변형 및 거대캐리어 보조제에 결합되어 사람이 아닌 포유동물에서 항체 반응을 나타낼 수 있다. 바람직한 보조제는 프로피오니박테리움 악시니(Propionibacterium acini)로부터 추출된 무라밀 디펩티드의 다중 반복부를 포함하는 미립자이다.
본 발명의 항체 및 펩티드는 특이한 에피토프 종류를 확인하고, 사람 조직 및 유체 중 바이러스성 항체를 정량하는 면역측정 형태에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 바이러스에 감염된 개인의 치료 및 진단에 유용한 항체, 펩티드 조성물 및 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 중요한 바이러스는 HIV이다.
본 발명은 바이러스 감염을 중화시키고 진단하기 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 HIV를 중요한 바이러스로 하는 실시태양에 촛점을 두고 상세히 설명할 것이다. 그러나, 본 발명의 원리는 다른 바이러스 단백질의 중화 부위를 확인하고, 또한 이러한 다른 바이러스에 의해서 유발된 감염을 진단하고 치료하고 방지하는데 사용될 수 있는 그러한 단백질과 반응적인 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 HIV를 촛점으로 하여, HIV 감염을 중화시키고, HIV 감염성, 세포 에서 세포로의 전달, 및 감염된 숙주에서의 바이러스 생산을 방지하거나 본질적으로 억제하기 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 하기 상술된 바와 같이, 감염에 의하거나 환경에 자연스럽게 노출시 사람에 있어서 면역 반응을 나타내지 않는 에피토프를 포함하는 HIV 단백질 서열을 사용하여 사람이 아닌 포유동물에서 항체를 생산하여, HIV 감염성을 중화시키고, 감염된 CD4 림프구를 쉽게 죽이고, HIV의 생활 주기에서 필수적인 단계를 불활성화시키는데 투여될 수 있다. "중화 부위"라는 용어는 본 발명의 다른 항체와 결합하거나 개별적으로 HIV 감염을 중화시킬 수 있는 항체와 반응적인 하나 이상의 에피토프를 정의하는 아미노산 세그먼트를 포함하는 HIV, 특히 HIV 단백질의 그러한 부분을 말한다. 중화를 조사하기 위한 적합한 분석이 또한 공지되어 있고, T-세포계 내에서 HIV 감염의 감소, HIV의 외피 당단백질을 갖는 VSV(HIV) 슈도(pseudo) 타입의 단위를 형성하는 혈소판의 감소, 합포체 저해 시험 및 비리온-수용체 결합 시험을 측정하는 분석을 포함할 수 있다. "불활성 부위"라는 용어는 본 발명의 항체와 조합하거나 또는 개 별적으로 반응시, HIV 생활 주기에서 중요한 사건을 기능적으로 불활성화시키는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 HIV 단백질의 세그먼트를 말한다. 항체-매개된 HIV 감염된 림프구의 파괴율을 조사하는 적합한 분석법이 공지되어 있고, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성, 보체 매개된 용해 및 천연 킬러(NK) 분석을 포함할 수 있다. HIV 생활 주기의 필수 단계의 항체-매개된 불활성화을 측정하기 위한 적합한 분석은, 역전사효소의 불활성화를 결정하거나 중합효소 및 프로테아제 활성을 측정하거나, 또는 바이러스 RNA를 리보뉴클리아제 분해에 노출하여 핵 캡시드 침투성에서 항체 매개된 보체 의존성 변화를 평가하는 분석을 포함한다. 필요시, 면역형광법, 면역블롯, 효소-결합 면역분석 및 방사성면역분석과 같은 면역화학 분석법에서, 중화 활성은 항체 활성과 비교할 수 있다.
본 발명은 HIV 생활 주기에서는 기능적으로 중요하지만 사람에서는 면역원성이 없는 에피토프를, 사람이 아닌 선택된 포유동물에서 생산되는 항체를 사용하여 확인하고 특성화할 수 있다는 발견을 근거로 하고 있다. 또한, 이들 부위에 대한 사람의 면역학적 비-반응성은, 요구되는 MHC HLA 클래스 1 및 클래스 2 관련된 사건을 통한 항원 제시를 포함하는, 분자 모방성의 작용 및 MHC 관련 사건의 결여로 인한 것임을 알아내었다. 분자 유사성으로 인해, 에피토프는 자가(self)로서 인식되어 정상 환경하에서는 이제 대한 반응이 일어나지 않는다. 항원 제시에 있어서의 MHC 관련 사건에 있어서는 여러 단계가 관련되어 있는데, 임의의 한 단계에서의 실패가 항원에 대한 면역학적 반응의 부재를 초래할 수 있다.
다중 오버랩핑 에피토프를 포함하는 펩티드 부위 및 이러한 에피토프에 대한 항체를 생산하였고, 이들은 시험관내 HIV의 생활 주기의 필수적인 단계를 중화시키고 불활성화시키는 것으로 나타났다. 또한, AIDS와 함께 HIV-감염 환자를 이러한 펩티드 부위에 대한 항체로 치료하였고, 총 배양가능한 감염성 투여량(total culturable infectious dose(TCID))에 의해서 측정된 혈액계 감염성에 있어서 빠른 감소를 나타내었다. 이러한 항체를 사용한 만성 AIDS 환자 치료는 체중 증가, 기회 감염의 해소, 감소된 감염 횟수 및 심각성, 의사의 방문 및 HIV-관련 신경장애의 해소의 뚜렷한 임상적 향상을 나타내었다. 또한, 환자는 HIV-RNA의 감소, 증가된 CD4 수, 증가된 CD8수, 및 CD4 수 및 CD8 수 및 기능의 향성과 관련된 사이토킨계의 회복으로 정의된 바와 같이, 면역학적 회복을 나타내었다.
<에피토프의 확인 및 항체의 생산>
대부분의 면역 반응은 면역우성의 에피토프를 표적으로 한다. HIV 에피토프가 가장 자주 확인되고, HIV에 대한 항혈청, HIV 에피토프 표적에 대한 세포독성 T 림프구 반응성 및 HIV 에피토프의 보조자 림프구 항원 발현을 사용하는 다양한 면역학적 방법에 의해서 맵핑된다. 이러한 관찰을 확립하기 위하여 널리 공지된 분석법을 사용하여 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 인하는 HIV 서열과 유사한 공지된 서열의 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 면역계의 자극은 면역 반응을 강화시키거나 억제시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이를 지배하는 인자는 다음과 같다:
A. 면역원에 의해서 자극된 림프구의 서브 집락수(억제자 대 보조자)
B. 내주하는 세포 집락을 포함하는, 제1 면역원을 접촉하는 미세 환경
C. 면역원과 주효기관 세포 접촉 시간에 미세 환경내 존재하는 사이토킨의 타입
7D. 면역원과 주효기관 세포 접촉 후 나타나는 사이토킨의 타입
E. 면역원의 구조 및 생화학적 조성
F. 면역원의 아미노산 서열 및 그의 미세환경내 프로테아제에 의한 프로테아제 분해에 대한 감수성
예비 실험으로부터, 하기 특성들은 사람의 질병 발달, 특히 AIDS를 포함하여 모든 단계에서의 HIV 감염의 치료 또는 완화에서 수동 면역치료 용도로 의도된 항체의 생산에 사용하기 위한 특정 단백질 및 펩티드의 잠재적인 가치를 결정하는데 있어서 기본적으로 중요한 것으로 결정되었다.
A. 하기의 예외를 두고, 수동 면역치료의 용도를 위한 항체를 생산하는데 사용시, 면역원은 사람 세포 및 조직에게 발현되는 에피토프 결정체가 부족해야 한다:
1. 항원 분포는 항체에 대하여 격리되고(거나) 이용할 수 없는 위치로 제한된다.
2. 발달 상태 동안에 항원은, 항원을 이용할 수 없을 경우에 발달 주기 동안의 특정 시간에 항체를 사용할 수 있도록 발현된다.
3. 숙주내 에피토프 위치는 필수적인 구조와 인접해 있지 않다.
4. 숙주 세포상의 항원 분포는 손상을 일으키는데 필요한 밀도보다 낮은 밀도로 존재하지만, 목적하는 표적상에 유리하므로 선택적으로 표적겨냥을 나타낸다.
5. 정상적인 비율에 대한 표적은 충분하게 달라야 하고, 목적하는 표적으로의 항체 전달이 유리해야 한다.
B. 항원-제시 세포에 전달된 펩티드 반복부의 수는 면역학적 반응의 규모에 직접 영향을 준다.
C. 에피토프가 항체를 중화시키거나 표적겨냥을 방해하는 농도의 체액 중에 존재하지 않아야 한다.
지금까지 백신 개발은 사람 면역계가 반응하는 표적에 대한 반응을 증폭시키는 보다 우수한 기술을 고안하는데 촛점을 두어 왔고, 수동 면역요법은 만족스럽지 못한 결과를 나타내었다. 이전에는 얻을 수 없었던, HIV에 대한 면역 반응을 나타내는 항원을 전달하는 새로운 형태 뿐 아니라 사람에게는 면역 사건을 나타내지 않는 HIV상의 또다른 표적들이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 방법들은 HIV 및 AIDS의 치료에 촛점을 두고 있지만, 본 발명의 제제는 광범위한 용도를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 염소에 있어서 항체 반응에서 HIV상 주요 표적에 대한 항체의 생산에 의해서, 또한 AIDS의 치료에 임상적 호전을 나타내는 치료에 의해서 본 발명의 유용성을 입증한다. 이러한 기술은 백신 개발에 있어서 광범위하게 사용된다.
항원 도전에 대한 성공적인 면역 유도는 MHC 사건을 통하여 항원 제시 세포(APC)에 의한 다중 에피토프 반복부의 존재를 요구한다. 가장 면역원성인 에피토프는 하나의 말단부상에 소수성 아미노산, 다른 말단부상에 친수성 아미노산을 갖는 양친매적인 형태를 하고 있고, 양친매성 헬릭스 생성과 일치하는 아미노산( 즉, 이들은 프롤린과 같은 헬릭스 파괴 아미노산이 없고 탄수화물도 없음)을 포함한다. 미세환경 내에서 프로테아제에 의한 프로테아제 분해에 민감한 아미노산이 없는 서열이 특히 요구된다.
기능적 중요성을 갖는 HIV상의 면역학적 표적을 확인하기 위해서, 사람이 아닌 동물에서 HIV-관련 단백질상의 면역원성 부위를 결정하였다. 탄수화물군을 갖는 것과 갖지 않는, 정제된 HIV 용해물로 염소를 면역시켰다. HIV 단백질로부터 탄수화물 잔기를 제거하는 것은 단백질에 대한 면역학적 반응에 대하여 어떤 영향도 주지 않지만, 숨겨진 에피토프를 노출시킬 수 있다. 사람 HLA 클래스 1 항원, HLA 클래스 2 항원 및 베타-2-마이크로글로불린을 포함하여 조직 배양 유래물의 단백질을 제거하기 위해서, 시판용 HIV 용해물을 추가 정제하였다. 염소의 항혈청을 면역시킨 후, HIV-감염된 환자로부터 모아진 항체에 의해서 인식되지 않은 HIV 펩티드를 확인하기 위해서 경쟁적 면역 분석법을 수행하여 시험하였다. 사람 HLA 항혈청의 풀(pool)을 높은 중화 활성 및 웨스턴 블롯 활성을 갖는 선택된 환자 혈청으로부터 제조하였고, 표준 경쟁적 면역 분석법을 사용하여 경쟁적인 항체로서 사용하였다. 사람 안티-HIV 항혈청 풀에 의해 인식된 것들과 면역학적으로 구별되는 HIV 결정인자와 반응하는 염소 항체의 넓은 스펙트럼을 확인하였다.
당업자는 이러한 에피토프에 대한 항체를 생산하는데 다른 동물을 사용할 수 있고, 그러한 항체가 ADCC 및 보체 매개 반응에서 작용할 수 있음을 알았다. 항체 생산을 위한 다른 적합한 동물은 양, 토끼, 말, 소 및 쥐이고, 이에 제한되지는 않는다.
안티-HIV 항체의 에피토프 반응성은 HIV1SF2의 선아미노산 서열을 스패닝(spanning)하는 12량체 펩티드를 사용하여 특성화하였다. 항체와 잘 반응하고 이러한 크기의 펩티드는 쉽게 합성할 수 있고, 높은 정제 형태로 제조할 수 있다. 펩티드는 퓨리피케이션 시프템(Purification System)사에 의해서 합성되고 시판되었다. 합성 펩티드를 퍼옥시다제 표지된 염소 안티-HIV 항체와 결합하고, HIV로 코팅된 마이크로타이터 웰 각각 두 세트와 합하였다. 하나의 세트는 사람 IgG 안티-HIV로 블록킹하였고, 나머지 하나는 블록킹하지 않았다. 사람 안티-HIV로 블록킹된 HIV 단백질 위치에 결합하는 염소 안티-HIV 결합의 펩티드 억제율을 결정하였다.
특이적인 합성 펩티드로 결합의 억제를 관찰할 때, 에피토프 서열을 추가로 정의하기 위하여 원래의 억제성 펩티드의 아미노산 서열을 오버랩핑하는 아미노산 서열로 부가적인 에피토프를 합성하였다.
염소 안티-HIV IgG로 인식되지만 사람 안티-HIV IgG로는 인식되지 않는 HIV 단백질상의 에피토프 위치를 추가로 조사하고, 확인 마커로서 HIV 펩티드-HRP 결합인자를 사용하여 확정하였다. 이러한 분석에서, HIV 단백질을 마이크로타이터 플레이트 웰 또는 경질의 폴리스티렌 비드와 같은 지지체에 흡수시켰다. HIV1SF2 의 선아미노산을 스패닝하는 12량체 펩티드를 고추냉이과 퍼옥시다제에 공유적으로 결합시켰다. 사람 및 염소 안티-HIV 반응성은, 퍼옥시다제에 공유적으로 결합된 펩티드 에피토프에 또한 지지체에 흡수된 천연 에피토프를 브릿징하는 사람 및 염소 로부터의 안티-HIV 반응성과는 독립적으로 측정하였다. 이러한 방법으로, 실시예 8에 상술된 바와 같이 합성 펩티드내 함유된 유일하게 정확한 에피토프를 인식하였다.
일단 사람 단백질과 상당한 유사성을 갖는 펩티드가 확인되면, HIV의 생활 주기에서 기능적 중요성을 갖는 그러한 서열을 결정한다. 이는 하기 서술되고 실시예 8에서 입증된 바와 같이 가능한 펩티드에 대한 항체를 생성한 후, 이들 항체를 HIV 감염성 및 바이러스 중화에 대한 이들의 효과에 대하여 시험함으로써 수행된다.
상기 알 수 있는 바와 같이, 많은 특이적인 에피토프 부위가 확인되었고, 9 개가 달리 언급이 없는 한 HIV1SF2 서열을 참고로 하기 상세하게 서술된다. HIV1SF2에 대한 본 출원 전체 및 하기에 제시된 아미노산 잔기 제품은 로스 알아모스 데이타 뱅크(Los Alamos Data Bank)(AIDS 바이러스 시퀀스 테이타 베이스, 로스 알라모스 내셔날 래버러토리, 티오레티칼 디비젼, 로스 알라모스, 엔. 엠. 87545)사로부터 입수된다. HIV2NZ에 대한 본 출원 전체와 하기에 제시된 아미노산 잔기 제품은 제네바 유니버시티 호스피탈 및 제네바 유니버스티의 이엑스 파시 월드 와이드 웹 몰레큘라 바이올로지 서버 및 이스라엘 바이즈만 소재 컴퓨겐사에서 입수가능한 바이오악셀러레이터, 및 일본 도쿄 미쓰비시 나리지 인더스트리사 엘티디., 바이오사이언스 시스템 디파트먼트, 아끼라 오야마로부터 입수된다. 당업자는 다른 HIV 단리물로부터의 부가적인 부위("동족체")를 다양한 단리물로부터 관련된 단백질내 이들의 위치를 근거로 하여 확인할 수 있다. 실제로, 이러한 동족체는 하기와 같은 HIV1SF2 서열 데이타를 참고하여 확인할 수 있다:
(a) HIV 단리물 및 HIV1SF2 아미노산 서열은 2 개 서열 간의 최대 상동성, 통상적으로 서열 간에 약 75 % 이상의 상동성을 갖도록 배열될 수 있다.
(b) 일단 아미노산 서열이 HIV1SF2 단백질내 상응하는 위치에 배열되면, 유사하거나 동일한 서열에 대한 항체 반응성의 보유에 의해서 정의한 바와 같이, HIV1SF2와의 면역학적 모방성, 유사성 또는 동일성을 나타낼 것이다. 다른 HIV 단리물로부터의 펩티드 및 전형적으로 이렇게 확인된 그들의 아미노산 서열은 HIV1SF2상의 상응하는 부위와 면역학적으로 유사할 것이다.
주요 에피토프를 찾아내는 이 방법을 이제 발견될 HIV 균주에 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 새로운 HIV 균주를 확인할 때, 이 균주와의 최대 서열 상동성을 얻기 위해서는 이들의 외피 및 코어 아미노산 서열을 HIV1SF2의 서열과 함께 배열시킬 수 있다. 서열을 배열시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 서열을 배열하는데 있어서, 가능한 한 시스테인 잔기들 간에 그 만큼의 상동성을 유지하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 구체적으로 기재된 펩티드의 위치에 상응하는 새로운 HIV 균주 또는 종의 아미노산 서열을 본 발명에 따라서 합성하고 사용할 수 있다.
본 발명에서 그러한 서열내 포함된 에피토프가 HIV의 모든 균주 또는 종에 대한 항체와 교차 반응해야 할 필요는 없다. 다른 것들에 대해서 일정 종류 또는 또다른 혈청군을 구별하는 면역학적 에피토프를 포함하는 펩티드는 특별한 종류 또는 혈청군을 확인하는데 있어서 유용성을 발견할 것이고, HIV의 하나 이상의 종류 또는 혈청군으로 감염된 개인을 확인하는데 도움을 줄 수 있다. 이들은 또한, 치료학적 요법에서 상동 부위 또는 또다른 중화 부위의 다른 펩티드와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 전형적으로, 약 5 내지 약 50 아미노산을 포함하고, 감염에 의하거나 환경적인 접촉이 있을 경우 사람에게는 보호적인 면역 반응을 나타내지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 반응을 나타내는 HIV 단백질상에 위치된 에피토프 부위 또는 다중 에피토프 부위를 포함한다. 바람직하게는, 이 서열은 약 5 내지 35 아미노산으로 이루어진다. 목적하는 아미노산 서열을 함유하는 천연 HIV 단백질의 합성 펩티드 또는 처리된 용해물을 사용하여 이들에 면역학적으로 반응하는 동물을 면역시키고, HIV 감염 치료에 있어서 치료학적 가치를 갖는 항체를 생산한다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 펩티드는 사람 및 다른 단백질상의 에피토프의 유사성을 통하여 사람에 있어서는 면역 반응을 나타내지 않는다. HIV 단백질 및 알파 사람 태아단백질 사이에 공유된 펩티드 에피토프, 아스파르틸 프로테아제, 데옥시우리딘 5'-트리포스페이트, 뉴클레오티도히드롤라제, 호산성 양이온성 단백질, 또는 호산구-유도 신경독소 및 리보뉴클리아제 4 전구체 및 붕가리스 나자(Bungaris Naja), 덴도아스비스(Dendoaspis), 슈데치스(Psudechis) 또는 안드록토너스 센트루로이데스(Androctonus Centruroides)로부터의 신경독소에 의한 유 사한 펩티드 에피토프 부위가 특히 중요하다.
하기 논의에서는, 단백질에 대한 약어를 나타내는 표준을 사용하고 있는 많은 사람 단백질 및 신경독소를 참고로 한다.
<HIV 단백질에 대한 서열 유사성를 갖는 사람 단백질>
스위스 프로트 ID XXXX-사람 단백질
ACE 안지오텐신-전환성 효소 전구체
ACHE 아세틸 콜린 수용체 단백질
3BH1 3-베타 히드록시-5-엔 스테로이드 탈수소효소 타입 I
3BH2 3-베타 히드록시-5-엔 스테로이드 탈수소효소 타입 II
41BL 4-1BB 리간드
BLSA 베타-림프구 항원 전구체
CATD 카텝신 D 전구체
CD69 초기 활성화 항원 CD69
CD81 CD81 항원
CO02 종양 관련 항원 CO-029
CP11 사이토크롬 P450 IA1
CYRP 사이토킨 수용체 공통 베타-사슬 전구체
CYPC 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 C
DIAC 디-N-아세틸키토비아제 전구체
DUT 디옥시우리딘 5'-트리포스페이트 뉴클레오티도히드롤라제
ECP 호산성 양이온성 단백질 전구체
EV2B 엑토트로픽 바이러스 통합 위치 2B 단백질
FETA 알파 태아단백질
FOL1 엽산염 수용체 알파 전구체
GSHR 글루타티온 환원효소
IL9 인터루킨 9 전구체
IN19 인터루킨 유도가능 단백질 9-27
INIU 인터루킨 유도가능 단백질 I-8U
INR2 인터루킨 알파/베타 수용체 베타-사슬 전구체
KLTK 백혈구 티로신 키나제 수용체 전구체
KPCL 에타 타입 단백질 키나제 C
LBP 리포폴리사카라이드 결합 단백질 전구체
LCAT 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제
LECH 아시알로당단백질 수용체 1
LFA3 림프구 기능 관련 항원-3 전구체
LMA1 라마닌 알파-1 사슬 전구체
LONN 미토콘드리아 LON 프로테아제 동족 전구체
LONM 미토콘드리아 LON 프로테아제 동족 전구체
LYOX 단백질-리신 6-옥시다제 전구체
MAG1 멜라노마 관련 항원 1
MAG2 멜라노마 관련 항원 2
MAG3 멜라노마 관련 항원 3
MC5R 멜라노코르틴-5 수용체
MYSE 엠브리오성 미오신 중쇄
NOL1 증식성 세포핵의 항원 P120
NRM1 천연 저항성 관련 대식세포 단백질 1
NT3 뉴로트로핀-3 전구체
NTCR 나트륨 및 염소-의존성 크레아틴 트랜스포터 1
NXS-1-NAJAT 코브로톡신
PA2M 막 관련 포스포리파제 A2 전구체
PIP5 포스폴리파제 C-감마-2
PGDS 알파-혈소판 유도 성장 인자 전구체
PLK 프로테오글리칸 결합 단백질 전구체
POL1 레트로바이러스-관련된 폴 다단백질
PSS1 포르파티딜세린 신타제 I
RENI 레닌 전구체
RNKD 비분비성 리보뉴클리아제 전구체
S5A2 3-옥소-5-알파-스테로이드-4-탈수소효소 2
SDC1 신데칸-1 전구체
SDC4 신데칸-4 전구체
SEMI1 세메노겔린 1 단백질 전구체
SON SON 단백질
SPCB 적혈구 스펙트린 베타쇄
SRE1 스테롤 정규 요소 결합 단백질 1
SYV 발릴-tRNA 신타제
TCO2 트랜스코발린 II 전구체
TGL3 단백질-글루타민 글루타밀트랜스퍼라제 E3 전구체
TFPI 조직 인자 경로 억제자 전구체
TRFL 락토트랜스페린 전구체
TYK2 비-수용체 티로신-단백질 키나제
VPRT 레트로바이러스 관련 프로테아제
WNT2 WNT-2 단백질 전구체
ZN45 아연 핑거 단백질 45
상기 논의된 9 개의 고도로 보존된 에피토프 부위의 아미노산 서열을 하기에 제공한다. 이들 부위 중 3 개는 외피 당단백질 gp120 (2 개 표적) 및 gp41 (1 개 표적)상에 있고, 하나는 역전사효소 헤테로다이머 p66/55상에 있고, 하나는 프로테아제 p10상에 있다. 부가적인 표적은 p17상(2 개 표적), p24 및 p7 위치와 함께 gag 전구체(p55/gag)상에 있다.
HIV1SF2 gp120상의 하나의 에피토프 부위는 HIV1의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하고, 두 번째 부위는 HIV1의 아미노산 잔기 54로부터 76에 해당한다. gp120상에 위치된 에피토프 부위에 대한 항체는 상승적으로 작용하여 gp41로부터 gp120을 유리시킨다. gp41로부터 gp120의 유리는 항체 투여 의존적이고, HIV 감염성을 측정하는, TCID와 같은 중화 분석에 의해서 입증될 수 있다.
또한, HIV2NZ gp120의 중화 또는 불활성화 부위의 에피토프 부위를 결정하였다. HIV2NZ 외피 당단백질 gp120의 서열을 맵핑하였고, 아미노산 잔기 약 7 내지 43의 부위가 HIV2SF2 gp120 및 특정 사람 단백질의 서열과 유사한 부위이다. 이 부위를 표적으로 하는 항체는 gp41로부터 HIV2 gp120을 분리시키고, 이는 감염성의 감소과 관련된다.
HIV2SF2에 대한 제3의 HIV 외피 당단백질 표적은 gp41 막내외 당단백질의 아미노산 잔기 502 내지 541에 위치되어 있었다. 보체 존재하에 이 부위를 표적으로하는 항체는, HIV 외피 당단백질의 항체 의존성 보체 매개된 용해 및 HIV 감염성에 있어서 뚜렷한 감소를 나타낸다.
외피 당단백질 에피토프 부위 이외에 또다른 중요한 HIV1 에피토프 부위는 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254 내지 295이다. 이 부위를 표적으로 하는 항체는 역전사효소 활성에서 항체 투여량 의존적인 감소를 나타낸다. 또한, 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69 내지 94를 포함하는 에피토프 부위 가 중요하다. 이 부위를 표적으로 하는 항체는 프로테아제 활성에서 항체 투여량 의존적인 감소를 나타낸다.
역전사효소 및 프로테아제에 대한 표적은 효소 활성 위치에 인접한 보존된 부위에 있고, 이는 그의 변이 및 경쟁적 억제자에 대한 후속적인 저항성으로 잘 알려져 있다. 항체-매개된 불활성화는 제2의 활성 손실과 함께 효소의 입체적 또는 형태적 변화로부터 기인한다. 이러한 불활성화 방법은 독립적으로 작용하고, 효소 활성 위치의 변이에 의해서 영향을 받지 않으며, 비가역적이다.
또한, gag 유전자내 3 개의 에피토프 부위가 중요하다. 구체적으로, gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166 내지 181, 아미노산 잔기 2 내지 23의 하나의 표적, 및 gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89 내지 122 및 gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390 내지 410 및 438 내지 443의 제2의 표적이 본 발명에서 유용하다. 이들 부위를 표적으로 하는 항체는 상기 서술된 항체에 의한 HIV 외피의 용해 후 핵 캡시드의 파열을 초래한다. 이러한 표적겨냥은 혈장정 RNA제 분해에 대한 HIV RNA의 노출과 함께 최고에 달한다. 부가적으로, p17상의 표적들은 출아 후 감염된 림프구의 표면상에 노출된다. 이는 감염된 림프구의 ADCC 용해를 위한 부가적인 표적을 제공한다.
HIV-감염된 환자로부터의 HIV 항체에 의해서 인식되지 않지만 염소 안티-HIV 항체에 의해서는 인식되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 상기 제시한 특이 펩티드 중 하나는 HIV1SF2 외피 gp120 단백질의 아미노산 잔기 4 내지 27 및 하기 서열 을 갖는 서브서열을 갖는 선에피토프를 포함하는 펩티드이다.
K G T R R N Y Q H L W R W G T L L L G M L M I C
이 펩티드는 사람 단백질 FOL1, NTCR, PIP5, PSS1, KLTK, MC5R, ECP, INIU, INI9, VPRT, CD69, MYSE, RNKD, ACHE, TCO2, LCAT, MAG1, MAG2, MAG3 및 LYOX와 유사하다.
HIV1SF2 gp120 외피 당단백질로부터의 제2 에피토프 부위는 하기 서열의 아미노산 잔기 54 내지 76에 해당한다.
A S D A R A Y D T E V H N V W A T H A C V P T
이 펩티드는 사람 단백질 CYRB 및 SYV와 유사하다.
HIV1SF2의 외피내에서 중요한 제3의 에피토프 부위는 당단백질 gp41의 아미노산 잔기 번호 502 내지 541에 해당한다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다.
HIV1-Env502
R V V Q R E K R A V G I V G A M
F L G F L G A A G S T M G A V S
L T L T V Q A R 502-541
이 펩티드는 사람 단백질 CYPC, TYK2, ACHE, NTCF, NTCR, CD81, 41BL, NIDO, GSHR, COO02 및 TC02와 유사하다.
또다른 구체적인 실시태양에서, 중요한 에피토프 부위는 HIV1SF2 gag 단백질 p17의 아미노산 잔기 2 내지 23의 부위이다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
G A R A S V L S G G E L D R W E K I R L R P
이 펩티드는 사람 단백질 TFPI, PA2M, BLSA, ECP 및 FETA, 및 NXS1 또한 NAJAT와 같은 특정 신경독소와 유사하다. 펩티드는 숙주 세포막을 표적으로 하고, 이에 결합하는 소수성 서열을 가지며, 작용은 세포성 번역 단백질 Src와 유사하다.
HIV1SF2 p17의 제2의 표적은 아미노산 잔기 89 내지 122에 해당한다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
L Y C V H Q R I D V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K
이 펩티드는 사람 단백질 FETA 및 TRIC와 유사하다.
또다른 중요한 펩티드는 gag 단백질 p24의 아미노산 잔기 166 내지 181 및 그 서열을 함유하는 에피토프의 펩티드이다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
P E V I P M F S A L S E G A T P
중요한 제3의 gag 유전자 단백질 에피토프 부위는 아미노산 잔기 390 내지 410 및 gag 유전자 단백질 p7의 438 내지 443 및 그의 서브서열을 포함하는 에피토프를 갖는 펩티드이다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
K T V K C F N C G K E G H I A K N C R A P + K I W S S Q
이 펩티드는 사람 단백질 FETA 및 RNA 결합 단백질와 유사하다. 이 펩티드는 바이러스성 RNA와 상호작용하고 이에 결합하는 아연 결합성 도메인을 함유한다. 이 부위에 대한 항체는 감염된 CD4+ 림프구 용해 후 외피가 없는 미성숙 HIV의 제거를 증진시킨다.
또한, 에피토프 부위로서 중요한 것은 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69 내지 94의 펩티드 및 그의 에피토프-함유 서브 서열이다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
R I G G Q L K E A L L D T G A D D T V L E E M N L P
이 펩티드는 사람 단백질 RENI, BLSA, VPRT 및 CATD와 유사하다. 이 서열에 대한 항체는 HIV의 프로테아제 활성을 억제한다.
본 발명에서 유용한 추가의 특이 서열은 HIV1 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254 내지 295를 포함하는 서열이다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
G L K K K K S V T V L D V G D A Y F S V P L D K D
F R K Y T A F T I P S I N N E T P
이 펩티드는 사람 단백질 POL1 및 ECP와 유사하다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩티드 및 항체를 얻기 위해서 HIV의 다른 균주도 또한 사용할 수 있다. 다른 균주로부터의 유용한 펩티드는 HIVSF2 또는 HIV2NZ의 서열에 대한 다른 균주의 서열을 배열하여 비교하고, HIV SF2 또는 HIV2NZ에 대하여 확인된 중요한 에피토프와 동일한 서열의 일부를 발견 함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 확인된 HIVNZ의 중요한 서열은 엔브 gp120 오픈 리딩 플레임에 있고, 아미노산 잔기 번호 7 내지 43에 해당한다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
Q L L I I V L A S A Y L I H C K Q F
V T V F Y G I P A W R N A S I P L F
이 펩티드는 사람 단백질 IL9, SRE1 NRM1, LBP, NOL1, S5A2, LMA1, LECH, LFA3, KPLC, FETA, 3BH2, 3BH1, INR2 및 EV2B와 유사하다.
예를 들어, 일단 목적하는 아미노산 서열이 확인되면, 3 개의 서열을 인식하는 항체가 얻어진다. 그러한 항체는 HIV 용해물, 합성 펩티드, 세균 융합 단백질 및 계통발생학적으로 관련없는 자원으로부터의 목적하는 에피토프를 포함하는 단백질/펩티드를 사용하여 얻을 수 있다.
바이러스성 용해물을 사용하는 경우, 하나의 HIV 균주의 단백질 용해물을 사용하거나 2 종 이상의 다른 균주의 용해물의 혼합물을 사용할 수도 있다. 용해물의 혼합물이 사용되는 경우, 그 혼합물은 다른 HIV1균주의 용해물 또는 1 종 이상의 HIV1 균주 및 1 종 이상의 HIV2 균주의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 혼합물은 HIV1MN, HIV1BAL 및 HIV2NZ로부터의 용해물의 혼합물이다.
먼저, HIV 단백질로부터 지질 및 다른 불순물을 제거하기 위해서 바이러스성 용해물을 처리하였다. 그 후, 사람 백혈구 항원(HLA), 클래스 I 및 클래스 II 항원을 포함하는 세포 배양 유래물로부터의 오염물을 제거하기 위해서 HIV 단백질 혼합물을 처리한다. 이러한 항원의 제거 방법은 당업계에 공지되어 있고, 모노클로날 안티-HLA 클래스 I 및 안티-HLA 클래스 II 항체 및 면역친화법을 사용하는 것을 포함하고, 하나의 방법이 하기 실시예 3에 상세히 기술되어 있다.
또한, HIV 단백질의 탄수화물이 제거되어야 함이 밝혀졌는데, 동물에 탄수화물을 제거하지 않은 HIV 단백질을 투여하면 계통발생적으로 보존된 탄수화물 결정인자가 면역 반응을 자극하여, 사람 조직에 대하여 세포독성인 항체를 생성하기 때문이다. 단백질을 PGN아제, 뉴로미니다제 및 글리코시다제 등을 비롯하여 당업자에게 공지된 효소로 처리함으로써 탄수화물을 제거한다. 이러한 방법 중 하나를 실시예 3에 상세히 서술한다.
동물을 면역시켜 중요한 펩티드에 대한 항체를 생산하기 위해서, 처리된 HIV 단백질의 혼합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이 혼합물은 중요한 펩티드 또는 에피토프 부위를 포유하는 거의 동량의 단백질을 포함한다. 즉, 바람직하게는 이들은 거의 1:1의 비율이고, 임의의 2 개 펩티드 간의 몰비의 차이는 약 10:1, 바람직하게는 3:1보다 크지 않다.
대안으로, 면역원으로서 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 합성 펩티드를 사용할 경우, 임의의 바람직한 펩티드의 아미노산 서열은 예를 들어, 아미노산 서열의 치환되거나 절단된 형태를 사용함으로써 변형될 수 있다.
특정 아미노산 잔기에서 항원 처리시 발생할 수 있는 예상된 효소 분해를 피하고, 양친매적인 형태로 하여금 요구되는 MHC-관련 항원 발현을 충족시키도록 하며, 또한 에피토프 경계 또는 그 가까이에서 절단하여 HLA 발현에 충분한 길이를 제공하여 아미노산 치환을 수행할 수 있다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원 발현 기작에 의해서 예상되는 바와 같이 절단된 서열은, 펩티드가 에피토프 길이 요구에 대한 적응성을 보유하도록 선택된다. 바람직한 아미노산 치환에 대한 보다 광범한 지침을 합성 펩티드에 대한 섹션의 일부로서 하기에 제시한다. 치환되고 절단된 서열 이외에, 고체상 지지체 및 거대분자 캐리어에 용이하게 결합시킬 목적으로, 선택된 에피토프 부위의 한쪽 말단에 부가적인 아미노산을 가하여 연장된 서열을 제조할 수 있다.
예로서, 상기 논의된 HIV1SF2 gp41의 아미노산 잔기 502 내지 541에 해당하는 펩티드의 유용한 절단 서열은 아미노산 잔기 512 내지 531의 서열을 갖는 펩티드:
G I V G A M F L G F L
G A A G S T M G A
및 아미노산 잔기 518 내지 아미노산 잔기 527에 해당하는 서열
F L G F L G A A G S
을 갖는 펩티드를 포함한다.
하기 서열을 갖는 HIV1NZ gp120의 아미노산 잔기 7 내지 43에 해당하는 펩티드의 절단 서열은 또다른 특별하게 유용한 절단 펩티드이다:
L L I Q I V L A S A Y L I H C K Q
다양한 방법으로 펩티드를 제조할 수 있다. 펩티드는, 그의 비교적 작은 크기로 인하여, 통상적인 기술에 따라서 용액 중에서 또는 고체 지지체상에서 합성될 수 있다. 현재 다양한 자동 합성기가 시판되고 있으며, 공지된 프로토콜에 따라서 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984; and Tam et al., J. Am Chem. Soc. (1983) 105:64442]을 참고한다.
다른 방법으로, 폴리펩티드 또는 그의 본질적으로 상보적인 스트랜드를 코딩하는 단일 스트랜드를 사용함으로써 합성 유전자를 제조할 경우, 단일 스트랜드를 오버랩핑하여 어닐링 매질 중에 함께 넣을 경우에 혼성 DNA 기술을 사용할 수 있다. 그 후, 혼성화된 스트랜드를 결착시켜 완전한 유전자를 생성할 수 있고, 적당한 말단의 선택에 의해서, 그 유전자를 발현 벡터 중에 삽입시킬 수 있으며, 많은 발현 백터들은 쉽게 입수할 수 있다. 예를 들어, 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]을 참고한다. 또는, 통상적인 재조합 DNA 기술에 의해 펩티드를 코딩하는 바이러스 게놈 클로닝 부위를 코딩할 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포 발현계에서 발현시켜 목적하는 펩티드를 생산할 수 있다.
바람직하게는, HIV 감염의 생활 주기에서 필수 단계를 중화시키고 불활성시킬 항체를 생산함으로써 면역원은 항원-생산성 B 림프구가 반응할 목적하는 에피토프를 부화시킬 것이다. 명세서에서 사용되는 바와 같이, "부화된다"는 것은 목적하는 에피토프가 HIV 단백질의 25 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상 및 가장 바람직하게는 약 95 % 이상을 이룬다는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 파열된 바이러스 용해물 또는 추출물을 함유하는 용액, 또는 생물학적으로 발현된 재조합 단백질 또는 파열된 발현 백터 또는 유사한 에피토프를 함유하는 단백질의 상등액은 필요하다면, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 정제법을 사용하여 그러 한 단백질로 부화시킬 수 있다. 면역친화성 정제, 예를 들어, 단일 특이적 친화성 정제된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는 친화성 정제는, 목적하는 HIV 에피토프를 포함하는 단백질 및 펩티드의 정제를 위한 바람직하고 통상적인 방법이다. 면역원으로서 사용하기 위한 용액으로부터 펩티드가 정제된 정도는 넓은 범위 즉, 약 50 %, 전형적으로 75 % 이상 내지 95 %, 바람직하게는 95 % 내지 99 %, 및 가장 바람직하게는 절대 균질까지 다양할 수 있다.
목적하는 에피토프에 대한 항체를 얻기 위해서, 상기 서술한 바와 같이 탄수화물 및 HLA 항원을 제거하도록 처리된 중요한 펩티드 또는 이를 함유하는 HIV 단백질 중 하나로 동물을 면역시킨다. 면역 프로토콜은 널리 공지되어 있고, 매우 다양하고 효과적이다. 문헌[Colco, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc. 1995]을 참고한다. 면역시키기 위해서 단백질 및(또는) 펩티드를 적당한 생리학적으로 허용되는 캐리어 중에 현탁시키거나 희석시킬 수 있다. 적합한 캐리어는 살균수 및 0.9 % 염수를 포함하여, 펩티드의 면역원성을 전달하고(거나) 강화시키는 임의의 생리학적으로 상용가능한 비독성 물질이다.
다른 방법으로, 면역원으로서 사용하기 전에 펩티드를 캐리어 분자에 커플링시킬 수 있다. 하기에 보다 상세하게 논의된 하나의 바람직한 기술은 예를 들어, 무라밀 디펩티드(MDP)와 같은 글리코펩티드의 다중 반복부에 단백질 및 그의 단편을 결합시켜, 전형적으로 직경 1 미크론 미만, 바람직하게는 0.2 미크론 미만의 미세입자를 생성하는 것을 포함한다. 그 후, 주사용으로 미세입자를 제약학적으로 허용되는 캐리어에 분산시킬 수 있다. 이 방법으로, 목적하는 면역 반응을 나타 내는데 사용할 수 있는 고밀도의 펩티드를 얻는다. 캐리어의 선택은 투여 경로 및 반응에 따라서 다를 것이다. 통상적인 공지된 살균 기술을 사용하여 조성물을 살균시킬 수 있다. 펩티드를 경구 또는 비경구 경로, 바람직하게는 비경구 경로로 투여할 수 있다.
목적하는 에피토프가 풍부한 항원성 제제의 면역원의 양은, 통상적으로 숙주 체중 1 kg 당 1 ㎍ 내지 20 mg의 농도로 주입된다. 주사, 예를 들어, 근육, 피하, 정맥 등으로 투여할 수 있다. 통상적으로, 1 내지 4 주 간격으로 1 회 또는 다수 투여할 수 있다.
목적하는 에피토프에 대한 항체 생산에 대하여 면역시킨 동물을 모니터한다. IgG 항체를 고정시키는 높은 친화성 보체가 수동 면역분석에 바람직하고, 고유체 또는 Fv, Fab, F(ab')2와 같은 단편을 사용할 수 있다. 보다 대량의 조직 침투가 필요한 경우, 항체 단편이 바람직할 수도 있다. 항체 및 단편을 단독 또는 독성 물질 또는 동위체와의 결합체로서 제공할 수 있다. 일단 목적하는 항체 반응을 달성한 후, 예를 들어, 정맥 천차, 심장 천차 또는 혈장 분리법에 의해서 혈액을 수집한다. 예를 들어, 염침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 사이즈 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 따라서 복합 혈청 또는 혈장 혼합물로부터 항체를 정제한다. 종종 상기 방법을 조합하여 사용한다. 면역친화성 크로마토그래피가 바람직한 방법이다.
사람아닌 동물로부터 유도된 항체를 수용하는 사람에게 있어서 가능한 항원 성을 피하기 위해서 재조합 항체를 제작할 수 있다. 재조합 항체의 하나의 타입은 키메라 항체이고, 여기서 사람 면역글로불린 분자의 일정 부분과 같이, 면역글로불린 분자의 항원 결합 단편(다양한 부위)은 사람에 의해서 외부 물질로서 인식되지 않는 또다른 단백질의 최소한의 부분에 펩티드 결합에 의해서 연결된다. 이는 사람 카파 또는 감마 일정 부위 엑손과 동물 변이성 부위 엑손을 융합시킴으로써 달성할 수 있다. 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 PCT 86/01533, EP171496 및 EP173494에 기재된 바와 같은, 다양한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 재조합 항체의 바람직한 타입은 CDR-그래프트된 항체이다.
<약제학적 제제 및 그의 용도>
감염성을 중화시키고, 감염된 CD4 림프구를 죽이고, HIV의 생활 주기에서 기능적으로 중요한 사건을 불활성화시키는 본 발명의 항체를 제약학적 조성물의 성분으로서 배합시킨다. 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 치료학적 또는 예방적 양으로 포함하고, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 캐리어와 함께 항체 칵테일을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 환자에게 항체 전달하기에 적합한, 임의의 상용가능하고 비독성 물질이다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 캐리어, 바람직하게는 수성 캐리어 중에 용해된 항체의 용액을 포함하는, 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4 % 염소, 0.9 % 염수, 0.3 % 글리신 등의 다양한 수성 캐리어를 사용할 수 있다. 이러한 용액은 살균되고, 통상적으로 입상 물질이 없다. 또한, 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리학적 조건에 가깝게하는데 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 사용할 수 있다. 이러한 제제내 항체의 농도는 전형적으로, 약 0.1 mg/ml 미만 내지 150 또는 200 mg/ml, 바람직하게는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml으로 다양할 수 있고, 바람직하게는 선택된 특정의 투여 형태에 대하여 주로 액체 용량, 점도 등을 기준으로 선택될 것이다. 특정 항체 또는 항체 칵테일의 농도를 결정하는 것은 당업자의 능력 범위내에 속한다. 따라서, 정맥 주입을 위한 전형적인 약제학적 조성물은 살균 링거(Ringer) 용액 250 ml 및 항체 100 내지 200 mg을 함유하도록 제조할 수 있다. 근육 주사용 조성물은 살균 완충된 물 1 ml 및 항체 약 20 내지 50 mg을 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구 투여용 조성물의 제조를 위한 실제적인 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이고, 예를 들어, 본 명세서에 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1980)]에 상세히 기재되어 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 특정 HIV 균주 또는 대부분, 보다 바람직하게는 모든 HIV 균주에 의해서 발현되는 하나의 단백질 또는 당단백질에 특이적인 하나의 항체를 함유할 수 있다. 다른 방법으로, 제약학적 조성물은 하나 이상의 항체를 함유하여 "칵테일"을 생성할 수 있다. 예를 들어, 다양한 단백질 및 HIV 균주에 대한 항체를 함유하는 칵테일은 HIV의 대부분의 임상적인 단리물에 대한 치료학적 또는 예방적 활성을 갖는 일반적인 생성물일 것이다. 칵테일은 HIV 외피의 단백질 또는 당단백질상의 에피토프에 결합하는 항체를 함유할 수 있고, 또는 예를 들어, HIV1SF2 엔브 단백질 gp160, gp120 및 gp41; gag 단백질 p7, p17 및 p24; 역전사효소 헤테로다이머 p66/55 및 프로테아제 p10, 또는 그의 서브그룹상의 상기 확인된 에피토프 위치에 대한 항체의 조합물을 함유하여 HIV의 생활 주기에서 중요한 일련의 에피토프를 중화시킬 수 있다. 또한, HIV 단백질의 다른 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프 위치에 대한 항체도 물론 사용할 수 있다.
예를 들어, 결합, 세포 침투, 전사, 번역, 조립, 혈장 멤브레인에 대한 성숙 비리온의 표적겨냥 및 비리온의 배출을 변화시키는 항체는 HIV 생활 주기 사건을 방해할 것이다. 다수의 필수 HIV 단백질을 불활성화시키는데 항체 칵테일을 보다 자주 사용할 것이다. 이는 특히, 비리온 결여된 외부 외피 범위내에서 치료학적으로 유익하지만, 이들은 미세포흡수작용 또는 트렌스펙션 등과 같은 다른 기작에 의해서 세포 침투되어야만 한다. 다양한 항체 성분의 몰비는 통상적으로 10배 이하, 보다 통상적으로는 5 배 이상일 것이고, 통상적으로 나머지 항체 성분 각각에 대하여 약 1: 1 내지 3의 몰비로 존재할 것이다.
상기 제시한 9 개의 특정 펩티드에 대한 항체에 대하여, 바람직한 항체 칵테일은 2 개의 외피 gp120 펩티드 및 gp41 펩티드에 대한 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 칵테일은 그러한 3 개의 에피토프 부위에 대한 항체와 프로테아제 p10 에피토프 부위에 대한 항체를 포함한다. 보다 바람직하게, 칵테일은 그러한 4 개 에피토프 부위에 대한 항체와 나머지 5 개의 열거된 에피토프 부위 중 하나 이상에 대한 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 및 항체 칵테일은 독립적으로 또는 다른 안티-레트로바이러 스성 제제와 함께 투여될 수 있다. 특히, 다른 안티-레트로바이러스성 제제 및 안티-HIV제의 현재 개발 상태는 미츠야(mistuya) 등의 문헌[Nature 325:773-778, 1987]에 개관되어 있다.
본 발명의 항체 및 펩티드는 항성 활성을 보존하는 공지된 다양한 온도, 예를 들어 -70 ℃, -40 ℃, -20 ℃ 및 0 내지 4 ℃에서 액체 형태로 저장하거나, 저장용으로 동결건조시켜 사용전에 적합한 캐리어 중에서 재구성할 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역 글로불린, 정제된 항체, 단백질, 당단백질 및 펩티드로 이루어진 면역원에서 효과적인 것으로 나타났다. 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있고, 당업자들은, 동결건조 및 재구성으로 인하여 항체 활성의 손실 정도가 변할 수 있으며(통상적인 면역 글로불린과 함께 IgM 항체는 IgG 항체보다 큰 활성 손실을 갖는 경향이 있음), 임의의 손실을 보충하도록 투여량을 조절해야 할 수도 있다고 생각한다.
본 항체 또는 그의 칵테일을 함유하는 조성물은 HIV 감염의 치료학적 및(또는) 예방적 치료를 위해서 투여할 수 있다. 치료학적 용도에서, 조성물은 HIV에 이미 감염된 환자에게 감염 및 그의 복잡화를 치료하거나 최소한 부분적으로 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양을 "치료학적으로 유효한 투여량"으로서 정의한다. 이러한 용도에 유효한 양은 감염의 심각도 및 환자 자체의 면역계의 일반적 상태에 따라서 다르지만, 체중 1 kg 당 항체 약 0.1 내지 약 200 mg 범위이고, kg 당 0.5 내지 25 mg의 투여량이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 생명의 위협하거나 생명을 위협할 수 있는 가능성이 있는 심각한 질병 상 태에서 사용할 수 있다. 이러한 상태에서는 치료하는 담당 의사가 이들 항체의 실질적인 과량을 투여하는 것이 가능하고 바람직하다고 생각된다.
예방적인 용도에서, 본 항체 또는 그의 칵테일을 함유하는 조성물은 HIV에 의해서 아직 감염되지 않았지만 최근 바이러스에 노출되었다고 생각되거나 노출될 위험에 있던 환자(예를 들어, HIV 감염된 개인의 신생아) 또는 곧 HIV에 노출 또는 의심되는 노출 후의 환자에게 투여된다. 조성물을 HIV-감염된 임산부에게 투여할 경우, 모체 혈액내 HIV 감염성을 저하시켜 신생아에게로 HIV 전달의 위험을 줄이기 위해서 분만전에 1 회 또는 다수 회로 투여할 수 있다. 또한, HIV에 감염될 위험을 더 감소시키기 위해서 위험성이 있는 신생아를 치료할 수 있다. "예방학적으로 유효한 투여량"이 정의하는 양은 일반적으로 체중 1 kg 당 0.1 내지 25 mg 범위이고, 환자의 건강 상태 및 면역성의 일반적인 수준에 따라서 다르다.
또한, 본 발명의 항체는 표적-특이성 캐리어 분자로서의 용도를 발견할 수 있다. 항체를 독소에 결합시켜 면역독소를 생성하거나, 방사성 물질 또는 약물과 결합시켜 방사성약제 또는 약제를 생성할 수 있다. 면역 독소 및 방사성약제를 생산하는 방법은 널리 공지되어 있다 (문헌[Cancer Treatment Reports 68:317(1984)] 참고). 본 발명의 항체 및 사람 T-세포 활성화제, 예를 들어 T-세포상의 Fc 감마 수용체 또는 CD3 항원에 대한 모노클로날 항체의 헤테로응집물(heteroaggregate)은 T-세포 또는 Fc 감마 함유 세포 (예를 들어, K 세포 또는 호중구)로 하여금 항체 의존성 세포-매개된 세포용해(ADCC)를 통해서 HIV 감염된 세포를 죽일 수 있다. 본 명세서에 인용된 칼포우트키(Karpowsky) 등의 문헌[J.Exp. Med. 160:1686(1984)]에 기재된 바와 같이, 헤테로이관능성 시약 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜 디티올)프로피오네이트를 사용하여 안티-CD3 항체와 안티-HIV 항체를 공유적으로 가교결합시킴으로써 그러한 헤테로응집물을 조합할 수 있다.
또한, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 2',3'-디데옥시시티딘, 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로시티딘 등과 같은 다른 안티-HIV제를 제제 중에 포함할 수 있다.
항체 조성물 이외에, 본 발명의 펩티드를 함유하는 조성물은 HIV-감염된 개인의 치료학적 및 예방적 백신접종을 위해서 투여할 수 있다. 치료학적 용도를 위하여, 상기 논의된 바와 같이 임의로 변형된 단리 펩티드 또는 상기 설명된 바와 같이 처리되어, 바람직하게는, MDP 미세입자에 커플링되어 면역원성을 더욱 촉진시키는 HIV 단백질내 함유된 펩티드 중 하나의 펩티드를 함유하는 조성물을 HIV에 감염된 환자에게 투여한다. 환자의 면역계에 의해서 전에 인식되지 못한 기능적 HIV 에피토프에 대한 항체 생산을 자극하여, 자극된 항체가 감염을 지연시킬 수 있도록 펩티드의 투여량을 선택한다. 달리, 예방적인 용도에서는 인식되지 않은 에피토프에 대한 항체의 생산을 촉진시켜 미래 감염에 대한 보호적인 기능을 제공하기 위해서 미세입자 MDP에 커플링된 펩티드의 조성물을 HIV에 감염되지 않은 환자에게 투여한다.
<항체 및 항원의 진단 및 예측 용도>
또한, 본 발명에 기재된 항체 및 이들에 의해 인식된 에피토프는 HIV 감염의 진단 및 처리에 유용하다. 전형적으로, 항체 및(또는) 이들의 각 항원을 사용하는 진단 분석은 항원-항체 복합체의 검출을 수반한다. 많은 면역 분석 형태가 기술되 어 있고, 이러한 목적으로 표지되거나 표지되지 않은 면역화학 물질을 사용한다.
표지되지 않는 경우, 항체는 예를 들어, 점착 분석, 항체 의존성 보체 매개된 세포용해 분석 및 중화 분석에서의 용도가 밝혀져 있다. 표지되지 않은 항체는 면역글로불린에 특이적인 항체와 같이, 제1 항체와 반응성이 있는 다른 표지된 항체(제2의 항체)와 함께 사용할 수 있다. 표지되지 않은 항체는 샌드위치 타입 면역분석에서와 같이, 동일한 항원상의 비경쟁적 에피토프와 반응하는 표지된 항체와 함께 또는 표지된 항원과 함께 사용할 수 있다. 다른 방법으로, 항체를 직접 표지하여, 경쟁적 및 비-경쟁적 면역분석 모두에 사용할 수 있다. 이러한 분석 타입 및 형태는 당업계에 널리 공지되어 있다. 방사성동위원소, 형광성 태그, 효소, 효소기질, 효소 보조인자, 효소 억제자, 리간드(특히, 합텐스) 등의 다양한 표지를 사용할 수 있다. 수많은 타입의 면역분석을 이용할 수 있고, 예로서 미국 특허 제3,317,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074 및 4,098,876에 기재된 것들을 포함한다.
통상적으로, 본 발명의 항체 및 펩티드는 예를 들어, 대상 항체 또는 그들의 각 항원을 효소에 결합시키는 효소 면역분석에 이용되고, 면역분석은 사람 혈청, 타액, 정액, 질분비물 또는 바이러스 감염된 세포 배양 현탁액과 같은 생물학적 시료내 HIV 항원을 검출하는데 있어서 최대 민감성 및 특이성을 나타내도록 구성된다.
또한, HIV 감염 또는 HIV 항원 존재의 검출에서 사용하기 위하여 대상 항체와 함께 사용하는 키트를 고안할 수 있다. 키트는 임의로, HIV의 다른 에피토프에 대하여 특이적인 부가 항체와 함께 본 발명의 항체를 포함한다. 표지에 결합될 수 있고, 마이크로타이터 플레이트 웰 또는 폴리스티렌 비드의 표면과 같은 고체 지지체에 결합될 수 없거나 결합될 수 있는 항체가 트리스, 포스페이트, 탄산염 등과 같은 완충제, 안정화제, 살생물제, 불활성 단백질 예를 들어, 소혈청 알부민 등과 함께 키트에 포함된다. 일반적으로, 이러한 물질은 활성 항체의 양을 기준으로 약 5 중량% 미만으로 존재하고, 통상적으로 항체 농도를 기준으로 약 0.001 중량% 이상의 총량으로 존재한다. 종종, 활성 성분을 희석시키기 위해서 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직할 것이고, 여기서 부형제는 총 조성물을 기준으로 1 중량% 내지 99 중량%로 존재할 수 있다. 항원에 결합할 수 있는 제2의 항체가 사용되는 경우, 통상적으로 제2의 항체는 별도의 바이알에 둘 것이다. 제2의 항체는 전형적으로 표지에 결합하여 상기 서술된 항체 제제와 유사한 방식으로 제제화된다. 항체에 의해서 인식된 대상 에피토프는 표지되거나 표지되지 않은 상태로 제공될 수 있고, 펩티드를 지지체에 결합시키고, 이를 지지체의 표면상으로부터 확장시키는데 사용될 수 있는 스페이서 암(arm), 아미노기 또는 시스테인 잔기의 부가와 같은 변화를 가하거나 가하지 않으면서 보다 큰 단백질(합성, 재조합 또는 천연)의 일부로서 제공할 수 있다. 항체로 면역활성을 최적화시키는 배열의 에피토프를 제공하기 위해서 이러한 변형을 수행한다. 이러한 펩티드는 상기 서술한 바와 같은 에피토프 함유 단백질의 생성과 유사한 방식으로 생성된다.
다양한 생물학적 시료내 HIV 항원 또는 전체 바이러스의 검출은 HIV에 의해서 현재의 감염을 진단하고, 치료에 대한 반응을 평가하고, 감염된 세포를 세고, HIV 균주(클라드)의 혈청형을 정하고, 예를 들어, 말초 신경장애, 병소성 백질뇌증 및 카포시(Kaposi) 육종과 같은 제1 감염, 진행 및 복잡화와 관련된 독성인자를 확인하고 정량하는데 유용하다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 타액, 정액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 면역 복합체 생성에 유리한 조건하에 항체를 생물학적 시료와 함께 인큐베이팅한 후, 복합체 생성의 검출에 의해서 바이러스, 바이러스성 항원, 독성 인자 및 혈청형 결정인자의 존재를 시험한다. 하나의 실시태양에서, 복합체 생성은 제1 항체에 결합할 수 있고, 전형적으로 표지에 결합되는 제2의 항체의 사용을 통해서 검출된다. 제2 항체는 상기 서술한 제1 항체 생성에 대하여 설명한 것과 유사한 방식으로 생성된다. 또다른 실시태양에서, 항체는 고체상 지지체에 결합한 후, 생물학적 시료와 접촉한다. 인큐베이팅 단계 후, 표지된 항체를 가하여 결합된 항원을 검출한다. 또다른 실시태양에서, 항체를 검출 표지에 결합시키고, 세포 또는 조직 부분과 같은 생물학적 시료와 함께 인큐베이션 단계 후, 항원에 대한 유동 세포계산 또는 현미경법에 의해서 시료를 평가한다.
<합성 펩티드의 제조 및 용도>
본 발명의 펩티드는 펩티드 중에 아미노산 치환을 도입함으로써 변형시킬 수 있다. 여러가지 레트로바이러스 균주의 에피토프를 더욱 효과적으로 모방하거나 에피토프와의 MHC 상호작용 또는 면역학적 반응을 증대시킴으로써 면역화 또는 백신접종에 사용되는 모방된 에피토프의 면역원성을 증진시키기 위해서는, 1 개 이상의 특정 아미노산을 변화시키는 치환이 바람직할 수 있다. 또한, 펩티드의 화학적 안정성을 증대시키기 위해서 특정 아미노산의 치환을 수행하는 것도 바람직할 수 있다.
보다 구체적으로, 1 종 이상의 HIV 균주 단백질과 면역학적 경쟁을 제공할 수 있는 한, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드가 임의의 특정 HIV 폴리펩티드 서열과 동일할 필요는 없다. 그러므로, 대상 폴리펩티드는 삽입, 삭제 및 치환, 보존 또는 비-보존과 같이 다양하게 변화시킬 수 있고, 여기서 이러한 변화는 목적하는 펩티드의 활성을 증대시킬 것이다. 보존적인 치환은 중성, 산성, 염기성 및 소수성 아미노산과 같은 군 범위내 유사한 아미노산으로의 치환이다. 이러한 군 범위내 치환의 예로는 gly, ala; val, ile; asp, glu;asn, aln; ser, thr;lys, arg; phe, tyr을 포함하지만, met은 포함하지 않는다. HLA 알로타이핑 데이타베이스 분류(DNA 및 혈청학적)에 대한 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 얻어진, 부가적인 아미노산 치환을 나타낸다:
그룹, 1 문제 코드 그룹, 3-문자 코드
F,S phe, ser
Q,R gln, arg
K, N lys, asn
E.G glu, gly
G,R gly, arg
H,Q his, gln
I, T ile, thr
V, A val, ala
D,N asp, asn
Y,F tyr, phe
I,F ile, phe
K,E lys, glu
E,L,R glu,leu,arg
Y,L tyr, leu
S,V ser, val
Y,N,F,D tyr, asn, phe, asp
D,R asp, arg
L, F leu, phe
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 펩티드의 보다 소수성 말단상의 소수성 잔기 및 중요한 펩티드의 보다 친수성 말단상의 친수성 잔기를 치환하기 위해서 아미노산을 변형시킨다. 이러한 치환 결과, 치환 사이에 개재된 목적하는 에피토프를 갖는 양친매성 헬릭스를 생성시킨다. D 이성질체에서 치환된 아미노산을 사용하여 에피토프를 보호하여 안정화시키고, 에피토프의 면역원성을 증대시키기 위해서 에피토프를 일괄처리한다. D-아미노산은 세포내 효소에 의해서 분해되지 않으므로, 이러한 아미노산은, 이들이 적합한 위치에 삽입시 MHC 분자와의 상호작용을 위한 목적하는 길이의 펩티드 에피토프를 제공한다. 이는 하기 실시예 8.5에 상세히 서술되어 있다.
통상적으로, 부가적인 아미노산이 "암"을 제공할 목적으로 본 발명의 펩티드가 고체상 지지체상에서 용이하게 고정되고, 거대분자에 결합하거나, MHC 결합 및 발현을 강화시키거나 변화시켜 면역원성을 강화시킬 수 있게 할 목적으로 하나 또는 양 말단에 가해질 때를 제외하고, 변화된 서열이 1 종 이상의 사람 면역결핍성 레트로바이러스 균주의 서열과 약 20 % 넘게 다르지는 않을 것이다.
티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산 등과 같은 아미노산을 펩티드 또는 올리고펩티드의 C- 또는 N-말단에 도입하어 결합에 대한 유용한 관능성을 제공할 수 있다. 시스테인은 특히, 다른 펩티드에 공유적으로 커플링하는 것을 용이하게 하거나 산화에 의해 중합체를 생성시키는데 특히 바람직하다.
부가적으로, 펩티드 또는 올리코펩티드 서열은, 말단-NH2 아실화(예를 들어, 아실화), 티오글리콜산 아미드화 또는 말단 카르복시 아미드화(예를 들어, 암모니 아 또는 메틸아민 부가)에 의해 변형되므로 천연 서열과 다를 수 있고, 지지체 또는 다른 분자에 대한 링킹(linking) 또는 결합, 또는 중합을 위하여 증가된 소수성 및 안정성을 제공한다.
따라서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 펩티드의 바람직한 실시태양에서, 1 종 이상의 시스테인 잔기 또는 스페이서 아미노산과 1 종 이상의 시스테인 잔기와의 혼합물을 펩티드의 말단에 가할 수 있다. 개별적인 펩티드가 요구될 때 글리신이 특히 바람직한 스페이서이다. 이 펩티드의 다중 펩티드 반복부가 요구되는 경우, 펩티드는 리신 코어를 제거 합성하어 사가 펩티드 반복부를 생성한다. 실시예에서 그 형태를 나타낸다. 산화적 중합에서 사용하기에 바람직한 펩티드는 2 개 이상의 시스테인 잔기가 목적하는 펩티드의 말단에 가해진 그러한 펩티드이다. 2 개의 시스테인 잔기가 펩티드의 동일한 말단에 존재하는 경우, 시스테인 잔기가 1 내지 3 개의 스페이서 아미노산 잔기, 바람직하게는 글리신에 의해서 분리될 때 바람직한 실시양태가 존재한다. 시스테인 잔기의 존재는 펩티드의 이량체를 생성하게 하고(거나) 생성되는 펩티드의 소수성을 증가시켜 고체상 또는 고정된 분석 시스템에서 펩티드의 고정을 용이하게 할 수 있다. 시스테인 또는 티오글리콜산의 머캅토기의 용도가 특히 중요하며, 이들은 말단의 아미노기를 아실화하거나, 다중 펩티드 반복부를 생성하기 위한 제1 아미노산으로서, 또는 2 개의 펩티드 또는 올리고펩티드 또는 이들의 조합물을 디술피드 결합 또는 보다 긴 결합에 의해서 결합하는데 사용하여 많은 에피토프를 포함하는 중합체를 생성한다. 면역시키는데 다른 펩티드가 요구되는 경우, 이들 각각을 모아서 칵테일로 각각 조립하여, 다른 HIV 단리물의 몇몇 항원성 결정인자와 면역반응하는 부가적인 항체 유도성을 제공한다. 항원성 중합체(합성 다량체)를 생성하기 위해서, 비스-할로아세틸기, 니트로할라이드 등과 같은 시약에 대하여 특이적인 기를 갖는 화합물을 사용할 수 있다. 펩티드 또는 올리코펩티드의 하나 또는 두 개의 머캅토기 사이의 결합은 단일 결합이거나 2 개 이상의 탄소 원자의 결합기일 수 있다.
<거대분자 캐리어에 대한 펩티드의 결합>
대상 펩티드는 가용성 거대분자(예를 들어, 5 kDal) 캐리어에 결합시켜 사용할 수 있다. 바람직하게, 캐리어는 합성 또는 천연 폴리(아미노산)일 수 있고, 이에 대한 항체가 사람 혈청내에서 마주치지 않을 것이다. 그러한 캐리어의 예는 폴리-L-리신, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 티로글로불린, 소혈청 알부민과 같은 알부민 또는 파상풍 독소 등이다. 캐리어의 선택은 항원에 대하여 목적하는 궁극적인 용도 및 일종의 용이성 및 유용성에 주로 의존한다. 바람직한 실시태양에서, 캐리어는 프로피오니박테리움 악시니 등과 같은 특정 세균으로부터 합성되거나 분리될 수 있는 글리코펩티드 미세분자의 다중 반복부를 포함한다. 이러한 거대분자는 넓게 가교결합되어 멀티머성 헝태를 이루는 무라밀 디펩티드로 구성된다.
프로피오니박테리움 악시니 또는 관련된 유기체로부터 무라밀 디펩티드가 분리되는 경우, 균주 선택이 용이하고, 그 선택은 세균세포벽의 화학적 분석을 기초로 한다. 바람직한 실시태양은 L-알라닌-D-이소글루타민으로 구성된 디펩티드와 함께 넓게 가교결합된 무라밀 디펩티드이다.
예비 실험으로부터, 디펩티드 조성 및 펩티드 길이가 다양한 균주의 차이를 확인하였다. 고농도의 지질 A를 함유한 단리물과 O-아실화된 베타 미리스테이트는 세포벽의 성분이다. 예비 실험에서 이러한 차이는 독성의 증가 및 보조제 효과의 감소와 관련된다는 것을 보였다. 균주 선택 및 정제의 바람직한 실시태양은 하기 실시예 4에 논의된다.
MDP 미세분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. MDP는 강한 면역촉진제이지만 상당한 독성을 갖는 것으로 널리 알려져 있다. MDP 독성을 감소시키는 많은 시도는, 리포솜 또는 다른 관련된 화합물 중으로 MDP의 배합 또는 말단기의 변형과 같이 방출을 지연시키는 방법을 사용하였다. 화학적 변화는 목적하는 보조제 효과의 뚜렷한 감소를 나타내었고, 전달 속도를 변화시키는 것은 조절하기가 어렵다. 실시예에 의해서 MDP 미세분자 구조, 크기 파라미터 및 항원 전달 결합방법을 나타낸다. 미세분자 구조로부터 지질의 제거는 항원 제시 세포(APC)에 의한 MDP의 빠른 내부화를 용이하게 한다. 항원 제시 세포는 단핵 세포 결합이 우세하고, 단핵 세포, 대식세포, 조직구, 쿠퍼 세포, 덴드리트 세포, 랑거한스 세포 등이고, 이들은 MHC 관련 사건을 통하여 항원 처리 및 항원 발현에 참여한다. 외부 단백질에 대한 면역 반응의 발달에 기여하는 인자는 일부, 거대 환경에서 프로테아제 분해 및 아미노산 서열에 민감한 서열에 의해서 결정될 수 있다. 성공적인 면역 반응은 바람직하게는 아미노 말단상의 소수성 말단 및 가장 많이는 카르복실 말단상의 친수성 아미노산과 함께 양친매성 헬릭스를 생성하는 펩티드에서 가장 자주 관찰된다. 프로테아제 분해에 저항적이고 양친매성 헬릭스 배열을 생성하는 서 열 형태가 때때로 강한 면역원이다. 서열에서 프롤린을 함유하는 잔기는 일반적으로, 헬릭스 형성을 방해함으로써 면역원성이 좋지 못하고, 글리코실화 위치가 덜 유리하며, 펩티드 에피토프에 대한 반응을 종종 억제한다. 숙주 동물에서 성공적인 면역학적 반응을 나타내는 항원 도전은 MHC 관련 사건을 통한 항원의 발현 및 항원 처리를 필요로 한다. 엔도솜으로 내부화한 후, 세포외 항원은 주로 항원 제시 세포(APC)에 의해서 처리된다. 이러한 산상 환경 중에 존재하고 반응하는 카테핀 D와 같은 효소에 의해 단백질 분해 후, 상기 설명한 기준을 만족시키는 펩티드 단편은 MHC 클래스 II와 함께 결합되어 세포 표면상에 나타난다. 펩티드가 충분한 밀도로 존재할 때 면역 사건이 일어난다. 면역 반응의 형태는 APC 당 펩티드의 밀도, 미세환경, 사이토킨 환경 및 항원 제시 세포에 의해서 최초로 자극된 림프구 타입에 의해서 유도된다. 내부화 후, 미세 환경을 변화시키고, 사이토킨 반응의 캐스캐이드가 유도되어 면역학적 사건에 유리한 조건을 만든다.
실시예에서는, 독특한 MDP 미세분자(0.01 내지 0.2 미크론)를 사용하여, 면역원을 항원 제시 세포에 전달하고, 하기 실시예 5에서 나타난 바와 같이 통상적인 방법을 사용하여 관찰되지 않은 열등한 면역원ㅡ이 에피토프에 대한 면역 반응을 나타낸다. 이러한 면역 반응의 정량 결과, 다른 보조제와 비교하여 항체 농도에서 10 내지 100 배의 증가를 나타낸다.
대상 펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단을 사용하여, 면역원으로서 사용되는 대상 펩티드를 무라밀 디펩티드의 카르복실 말단 아미노산 잔기에 결합시키거나, 실시예에 기재된 바와 같은 탄수화물 잔기의 알데히드 산화 생성물에 결합시킬 수 있다. MDP 미세분자 당 1 분자 이상의 대상 펩티드, 바람직하게는 MDP 미세분자 당 대상 펩티드 10 내지 100 분자, 가장 바람직하게는 MDP 미세분자 당 대상 펩티드 100 내지 1000 분자로 존재할 것이다. 그러므로, 캐리어 크기 및 이용가능한 결합기는 캐리어 당 대상 펩티드의 수에 영향을 줄 것이다.
거대-캐리어 조성은 우선적인 세포 흡입, 펩티드 반감기 및 MHC 면역학적 사건을 통한 항원 발현에 영향을 줌으로써 면역원성에 영향을 준다. 하나 이상의 다른 대상 펩티드가 동일한 거대-캐리어에 결합될 수 있지만, 바람직하게는 하나의 대상 펩티드가 거대-캐리어에 일가 또는 사가 형태로 결합된다. 하나 이상의 대상 펩티드로써 면역화가 필요한 경우, 칵테일 중에 도입되는 각 대상 펩티드의 면역원성을 최적화시키는 비율로 각 결합체를 혼합함으로써 대상 펩티드 거대-캐리어 결합체의 칵테일을 제조할 수 있다. 이러한 형태에서는, 하나의 항원 제시 세포에 의해 항원 발현을 증대시키기 위해서 각 거대-캐리어 결합체상에 충분한 펩티드(100 내지 1000 펩티드)가 이용가능하다. 대상 펩티드의 면역원성은 상기 기재한 바와 같이 거대분자 캐리어 당 대상 펩티드의 수, 아미노 대 카르복실 결합과 같은 발현 형태, 말단 아미노산 변형, 및 스페이스 암 길이 및 조성을 조절함으로써 최적화될 것이다. 이러한 형태에서, 항원 제시 세포에 의한 항원 처리는 고밀도, 통상적으로 100 개를 넘고, 또한 흔히 500 개를 넘는 펩티드를 생성하고, 이는 MHC 상호작용을 통한 항원 제시 세포의 세포 표면에서 나타난다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 이러한 구조에서는 면역화 후에 보다 매우 높은 항체 농도를 생성한다.
결합 방식은 p-말레이미도벤조산, p-메틸디티오벤조산, 말레산 무수물, 숙신산 무수물, 글루타르알데히드 등과 같은 시약을 사용하는 통상적인 것이다. N-말단, C-말단 또는 중간 위치에서 분자 말단에 결합될 수 있다. 무라밀 디펩티드의 다중 반복부로써, 알데히드기에 대한 대상 펩티드의 결합은 나트륨 보로히드리드 등과 함께 온화한 환원 후 예를 들어, 나트륨 페리오데이트를 가하여 슈가 잔기의 온화한 산화에 의해서 생성되고, 쉬프(Schiff) 염기 중간체는 안정한 공유 결합으로 전환된다. 산화 조건을 변화시킴으로써 미세분자 당 펩티드의 수를 조절할 수 있고, 방사성 트레이서를 사용하여 정량화할 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 결합 방법 및 결합 형태는 목적하는 반응을 달성하는데 필요한 펩티드로부터 펩티드까지 다양한다.
당업자에게 익숙한 다양한 분석 프로토콜을 사용하여 레트로바이러스성 단백질 에피토프에 대한 항체 중 하나의 존재를 검출하거나 복합 단백질 혼합물내 레트로바이러스 단백질을 검출할 수 있다. 대상 펩티드가 고추냉이과 퍼옥시다제와 같은 검출용 표지에 공유적으로 결합하고, 에피토프 또는 다수의 에피토프를 나타내는 천연 HIV 단백질이 직접 또는 간접적으로 고체상 지지체에 결합되는, 본 명세서에 기재된 새로운 분석법이 특히 중요하다. 이러한 형태에서, 펩티드 에피토프를 인식하는 항체는 표지상의 에피토프와 고체상의 에피토프를 브릿징할 것이다. 이러한 방법으로써, 표지에 결합되는 펩티드를 변화시킴으로써 HIV에 대한 항체의 에피토프 반응성을 결정하고 정량화할 수 있다. 명세서에 기재되고 실시예에서 제공된 일단계 경쟁 면역분석에 의해서 이러한 에피토프를 발현되는 임의의 시료에서 HIV 혈청형, 독성 인자 또는 다른 HIV 특성과 관련된 펩티드 에피토프를 확인하고 측정할 수 있다.
<면역친화성 정제 방법에서 항체 및 이들의 반응성 에피토프의 용도>
HIV 단백질내 함유된 에피토프에 대하여 특이적인 항체 및 이러한 에피토프를 함유하는 정제된 단백질은, 단백질 및 이러한 에피토프를 함유하는 펩티드 및 이들과 반응적인 항체의 면역친화성 정제에서의 용도로 특히 유용하다. 통상적으로, 항체는 108 내지 1010 M 정도의 친화 관련 상수를 가질 것이다. 그러한 항체는 단백질 및 중요한 에피토프를 함유하는 펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다. 종종, 유전적으로 변화시킨 세균을 사용하여 HIV 단백질을 얻을 수 있고, 발현된 단백질이 분비되는 경우 재조합 발현계의 배양 배지로부터, 또는 분비되지 않는 경우 파열된 생물학적 발현계의 성분으로부터, 또는 HIV상 에피토프와 유사한 에피토프를 함유하는 몇몇 또는 일 성분의 단백질의 복합 생물학적 혼합물로부터 중요한 재조합 융합 단백질을 정제할 수 있다. 통상적으로, HIV 에피토프와 반응할 수 있는 항체가 기재 또는 지지체상에 결합되거나 고정된다. 그 후, 에피토프를 함유하는 용액을 항체 및 에피토프를 포함하는 단백질 사이에 면역 복합체를 생성하기에 적합한 조건하에 고정된 항체와 접촉시킨다. 결합되지 않은 물질은 결합된 면역 복합체로부터 분리시키고, 결합된 단백질은 고정된 항체로부터 유리시키고, 용출물로 회수하였다.
유사하게, 단백질 또는 HIV의 에피토프를 포함하거나 HIV의 에피토프와 유사 한 펩티드를 기재 또는 지지체상에 결합시키거나 고정시켜서, 용액으로부터 중요한 항체를 단리하는데 사용한다. 알부민을 제거한 혈장과 같이, 항체를 포함하는 용액을 고정된 펩티드 또는 목적하는 에피토프를 포함하는 단백질의 칼럼을 통과시켜, 면역 복합체를 생성한 후, 비-반응적인 항체는 결합된 면역 복합체로부터 분리시키고, 용출 완충액으로 항체를 유리시키고, 용출물로 회수한다. HIV의 에피토프와 유사한 에피토프를 함유하는 단백질을 정제하는데 특히 유용하지만, 계통발생적으로 HIV와 관련없는 자원으로부터 유도된다.
전형적으로, 항체는 고면역 혈청으로부터 조질로 정제된다. HIV 에피토프와 유사한 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩티드 및 복수액 또는 세포 배양 상등액을 이에 제한되는 것은 아니지만 생체액, 혈액, 혈액성분, 세포 추출물, 성인 및 태아 기원의 조직 추출물, 및 배양 상등액, 배양된 세포의 추출물, 정액 및 지지체에 결합되기 전의 재조합 융합 생성물과 같은 생물학적 자원으로부터 조질로 정제될 것이다. 그러한 방법은 당업자들에게 널리 공지되어 있고, 고농도의 중성염을 사용하는 분별화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 예비 겔 전기영동법 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 다른 정제법을 사용하여 면역흡수제로서 이의 사용 전에 제조물의 순도를 증가시킬 수 있다. 반응적인 에피토프 또는 에피토프를 함유하는 단백질이 결합된 지지 매트릭스와 조질로 정제된 항체 제조물을 반응시킬 필요가 있는 경우 친화 정제된 항체를 제조할 수 있다.
자연을 통해서 계통발생적으로 유사한 HIV 에피토프에 대한 항체가 특히 중 요하다. 그러한 항체는 치료제로서 유용하고, 또한 HIV 단백질의 정제 및 서열 위치 및 기능을 위한 HIV 단백질의 맵핑을 가능하게 함으로써 HIV를 연구하는데 유용하다. HIV로부터 유도된 HIV 단백질/펩티드로 면역시키고, 상기 논의된 바와 같은 지지체상에 고정된 비-HIV 자원 미생물/바이러스 성분, 정액, 태아 단백질과 같은 비-HIV 자원으로부터 유도된 단백질/펩티드와, 생성되는 고면역 폴리클로날 다가 항혈청과 반응시킴으로써 면역친화 정제시킴으로써 그러한 항체를 생산할 수 있다. 생성되는 면역친화 정제된 항체는 이의 면역정제에 사용된 계통발생학적으로 무관한 단백질 및 HIV에 의해서 공유된 에피토프 또는 다수 에피토프에 대하여 특이적인 에피토프이다. 이러한 에피토프 특이 항체는 HIV 및 비-HIV 유래물 모두의 단백질 및 펩티드의 면역-친화 정제에서 특별한 유용성을 갖는다. 그러한 항체를 사용하여, HIV상의 에피토프의 위치를 맵핑하고, 그의 서열을 결정하며, HIV의 생활주기에서 기능적 중요성, HIV의 클라드내 및 다른 레트로바이러스 사이의 그의 분포, HIV 독성과 그의 관계성을 평가할 수 있고, 또한 사람에게 비독성이지만 HIV 생활 주기에서 중요한 기능을 중화시키는 경우, HIV 감염을 치료하는데 사용될 수도 있다.
항체 또는 에피토프가 바람직하게 고정되는 지지체는 하기 일반적인 특성을 갖는다: (a) 비-특이적인 결합을 최소하기 위해서 통상적으로 단백질과 약한 상호작용, (b) 고분자량 물질의 흐름을 가능하게 하는 우수한 유동 특성, (c) 항체 또는 에피토프의 화학적 결합을 가능하도록 활성화시키거나 변화시킬 수 있는 화학적 기의 보유, (d) 항체를 결합하는데 사용되는 조건에서 물리적 및 화학적 안정성 및 (e) 항원의 흡수 및 용출에 요구되는 완충제의 성분 및 조건에 대한 안정성. 통상적으로 사용되는 몇몇 지지체는 아가로스, 유도된 폴리스티렌, 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드 비드, 활성화된 셀룰로오스, 유리 등이다. 기재 및 지지체에 대한 항체 및 항원의 결합을 위한 여러 화학적 방법이 있다. 통상적으로 하기 문헌[Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29(1972)]을 참조한다. 본 발명의 항원 및 항체를 지지체에 직접 또는 링커 또는 스페이서 암을 통하여 결합시킬 수 있다. 크로마토그래피형 지지체에 대한 항원 및 항체의 고정에 요구되는 일반적인 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 인용된 하기 문헌[Tijssen, P., 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay]을 참조한다. 실제 커플링 방법은 커플링될 항원 또는 항체의 타입 및 특성에 따라서 약간 다를 것이다. 전형적으로, 결합은 공유 결합을 통해 형성된다.
면역 혈청, 항체가 풍부한 복수액 또는 배양 상등액, 또는 HIV 바이러스의 추출물 또는 용해물, 배양된 생물학적 발현계로부터의 상등액 또는 추출물, 파열된 세포 조직의 현탁액으로부터의 상등액 또는 추출물 또는 혈액 성분(성인 또는 태아) 또는 다른 복합 단백질 혼합물, 예를 들어, 정액, 체액 또는 에피토프를 포함하는 배양 생성물을 적합한 분리 매트릭스에 가한다. 항체-항원 결합이 발생하기에 충분한 시간, 즉 통상적으로 30 분 이상, 보다 통상적으로 2 내지 24 시간 및 그러한 조건하에서 혼합물을 인큐베이팅하였다. 그 후, 특이하게 결합된 항체 또는 에피토프를 함유하는 고정된 면역 복합체를 복합 혼합물로부터 분리하고, 흡수 완충제로 넓게 세척하여 비-결합된 오염물을 제거한다. 그 후, 특정 지지체, 부착 된 단백질 및 용출 단백질과 상용가능한 용출 완충제를 가하여 면역 복합체를 분리할 수 있다. 용출가능한 단백질, 항원 또는 항체를 용출물로 회수한다. 용출 완충제 및 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 항체에 의해서 인식되는 에피토프를 함유하는 펩티드를 사용하여 용출 완충액 내에서 항체 결합 위치에 대하여 경쟁시킬 수 있고, 온건한 용출 조건하에서 용출을 수행할 수 있다. 완충제의 pH 및(또는) 이온 강도를 변화시키거나 카오트로픽제로써 친화 흡수제로부터 선택적으로 흡수된 단백질을 용출시킬 수 있다. 용출 완충제의 선택, 그의 농도 및 다른 용출 조건들은 항체-항원 상호작용의 특성에 의존적이며, 일단 결정되면 크게 변화시키지 않아야 한다.
면역 복합체를 분리시키기 위하여 낮거나 높은 pH 및 이온 강도 완충제 또는 카오트로픽제가 사용되는 경우, 용출된 단백질은 생리학적 pH 및 이온 강도의 조정이 필요할 수 있다. 그러한 조절은 투석 또는 겔여과 크로마토그래피에 의해서 수행할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 용출된 단백질로 하여금 그의 천연 형태를 다시 얻도록 한다.
앞선 방법은 예를 들어, HIV의 에피토프, 또는 이와 유사한 에피토프를 함유하는 본질적으로 정제된 단백질 및 그 에피토프와 반응적인 항체를 얻는다. 정제된 단백질은 전형적으로, 순도가 50 %를 넘고, 보다 통상적으로는 75 % 이상 및 보다 흔히 95 % 내지 99 %를 넘는 순도를 가질 것이다. 실시예로써 본 발명을 입증하는 하기 실험적 설명으로부터 본 발명의 다른 특징 및 장점이 분명해질 것이다. 실시예는 본 발명의 방법을 추가 예시하고 있지만, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
사람과 염소 면역 반응 간의 HIV 에피토프 차이를 맵핑하는데 사용하기 위한 사람 안티-HIV 항체(IgG 분획) 풀의 제조
사회 체육 클리닉으로부터 환자의 허가, 환자 싸인된 정보 내용, 담당 의사의 승인 및 지방 IRB 승인과 함께 HIV-감염된 환자의 사람 혈청을 얻었다. 아보트 래버러토리즈(Abbott Laboratories)사로부터의 시판용 시험 킷트를 사용하여 1:10의 희석률에서 모든 혈청을 HIV 반응성에 대하여 먼저 스크리닝하였다. 높은 반응성을 갖는 혈청(1 보다 큰 흡광도 시험 결과에 의해서 임의로 정의)을 웨스턴 블롯 분석에 의해서 추가로 조사하여 대부분의 HIV 단백질(엔비, gag 및 폴)에 대한 항체 반응성을 갖는 그러한 혈청을 확인하였다. 정의된 바와 같이 대부분의 HIV 단백질에 대하여 우수한 반응성을 나타낸 환자 혈청을, 미세배양 분석(총 배양가능한 감염성 투여량(TCID) 중화)에서 HIV 감염성을 중화시킬 수 있는 혈청 함유 항체 특이성을 확인하였다. gp160, gp120, p66/55, gp41, p24 및 gp17 및 p10에 대하여 높은 역가의 항체 반응성을 갖는 29 명 환자의 혈청 및 미세배양에서 중화된 HIV 감염성을 확인하고 모았다(각 20 내지 40 ml). 또한, 모은 안티-사람 HIV를 추가 조사한 결과, 상기 상술된 9 개의 에피토프 부위에 대한 높은 역가의 항체(웨스턴 블롯에 의해 포지티브 1:100 또는 그 이상) 및 HIV의 여러 균주에 대한 넓은 중화 활성이 나타났다. 통상적인 방법을 사용하여 이러한 혈청 풀로부터 사람 IgG를 정 제하였다. 정제 후, 총 IgG 농도를 10 mg/ml로 조절하고, 표준 면역분석 방법으로 그의 농도 및 순도를 평가하였다. 결과, 98 %를 넘는 순도 및 사람 IgG의 조성을 나타내었다. 정제된 사람 안티-HIV는 분액으로 나누고, 하기 기재된 실험 및 과정에서 계속 사용하기 위하여 동결시켰다. 비교 목적으로 미지의 항체 또는 항원에 대하여 계속되는 결정에서 사용될 지도 모르는 특이성을 정의하기 위하여 항원 및 항체 모든 풀을 특성화하는 방법은 당업자들에게 익숙할 것이다.
하기 실시예에서 설명된 바와 같이, 이러한 사람 안티-HIV을 사용하여, 조질의 바이러스 용해물로부터 HIV 단백질의 정제를 수행하고, 사람 면역계에 의해 인식되는 HIV 에피토프를 맵핑하며, 또한 경쟁 EIA에서 사람아닌 염소에서 생산된 항체에 의해 표적된 HIV 에피토프를 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 중요한 펩티드를 함유하는 정제된 HIV 단백질 또는 그러한 펩티드의 합성물로써 면역시킨 염소에서 항체 반응을 특성화하고, 열등한 면역원의 펩티드에 대한 면역반응을 증가시키기 위해서 고안된 미세입자 캐리어 복합체의 효능을 조사하였다. 불필요한 세포를 제거하기 위해서 모노클로날 항체-결합된 자기성 입자를 사용하는 표준 기술을 사용하여, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리 정제된 사람 CD4 림프구를 사용한 미세배양법에 의해서 HIV 감염성을 중화시키는 항체를 평가하였다. CD4 림프구를 미토겐으로 자극하여 HIV 감염에 대한 이들의 감수성을 증가시키고, 달리 언급하지 않는 한, HIV 감염을 위한 숙주 표적으로서 계속 사용하였다. 대조 HIV 균주로서는 달리 언급하지 않는 한, HIV1SF2를 계속 사용하였다. 당업자에게 익숙한 기술을 사용하여, HIV 감염성에 대한 항체의 효과를 미세배양으로 결정하였다. 감염성은 감염 단위(IU)로서 나타내었다. 항체 매개된 IU 감소는 바이러스 감염성의 중화와 관련되고, 감염 단위의 변화로 나타내었다. 사람 안티-HIV 항체가 요구되는 본 명세서에 기재된 모든 실험에서 사람 안티-HIV 풀을 계속 사용하였다. 이러한 사람 IgG 안티-HIV 풀을 몇몇 시판용 사람 안티-HIV 조제물과 비교하였고, 이는 HIV 중화 활성과 동일하거나 보다 크고, 웨스턴 블롯 분석으로 비교시, 매우 보다 반응적이었다.
<실시예 2>
본 명세서에서 사용되는 시판용 HIV 바이러스 용해물의 특성화
<예비 연구>
미국 매릴란드주 콜롬비아 소재 어드밴스드 바이오-테크놀로지사(Advanced Bio-Thechnology, Inc.)로부터 HIV1MN, HIV1BAL 및 HIV2NZ를 구입하였다. 이들 정제된 바이러스 용해물의 분석 결과, 0.8 mg/ml 내지 1.2 mg/ml 범위의 총 단백질 함량으로 롯 투 롯(lot to lot) 편차를 나타내었다. 각 HIV 용해물의 단백질 조성은 SDS-PAGE 및 사람 IgG 안티-HIV를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해서 조사하였다. HIV 용해물을 프로테아제 억제제 및 노니뎃(Nonidet) P-40 또는 이게팔(Igepal) CA630과 같은 비이온성 청정제(1,0 % v/v)로 처리하여, HIV 단백질 및 당단백질을 완전히 이들의 단량체 형태로 분리하였고, 0.22 미크론 필터를 통하여 여과시켜 청징화하였다. 표준 방법을 사용하여 세로클리어(SeroClear)로써 지방을 제거하였 다. HIV가 출아 과정의 일부로서 사람 단백질을 그의 외피 중에 혼입시키는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일단 확인된 그러한 오염물을 면역친화성 크로마토그래피에 의해서 제거하였다. 초기 정제 단계에서, 세포 성장을 용이하게 하기 위해서 가해진 성장 배지 중에 존재하는 혈청 오염물 및 HIV 용해물 중의 오염물은 안티-정상 사람 혈청 세팔로스 CL6B(2 내지 3 mg 항체/g 세파로스)를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의해서 제거하였다. HIV 용해물의 크로마토그래피는 10 ml/시의 유속에서 1:1 부피/부피의 매트릭스 대 용해물 비율에서 수행하였다. 280 nm의 파장에서 분광측정적으로 크로마토그래피 및 용출을 모니터하였다. HIV 관련 단백질을 함유하는 단백질 풍부 비-결합성 분획을 1 mg 단백질/ml까지 농축시키고, 필요시 이 후 사용하기 위하여 - 70 ℃에서 보관하였다. 매트릭스 친화성에 의해서 결합된 단백질은 0.9 % NaCl 중의 글리신-HCl 완충액 pH 2.2로 용출시켰다. 용출물을 중화시키고, 0.1 % 이게팔 CA630을 함유하는 pH 7.8의 PBS 내에서 투석시킨 후, 농축하고, 이 후의 분석에 사용하기 위하여 -70 ℃에서 보관하였다. HIV 조제물의 웨스턴 블롯 분석과 함께 SDS-PAGE는 사람 안티-HIV IgG를 사용하여 gp160, gp120, p66/55, gp41, p10, p24, p17 및 p7의 존재를 입증하였다. HIV 단백질은 웨스턴 블롯 분석 수행시 글리신 HCl 용출물 중에서 검출되지 않았지만, 단백질의 시각화를 위해서 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색시킨 SDS-PAGE겔에서는 2 내지 3 개의 약하게 염색된 밴드를 나타내었다.
<부분 정제된 HIV 용해물에 대하여 생성된 안티-HIV 항체의 특성화>
상기 얻어진 정제된 HIV 단백질로 염소(n=2)를 면역시켜, HIV상의 면역우세 성의 에피토프와 반응한 항체와 면역학적으로 반응시켰다. 또한, 이러한 항혈청의 조사 결과, HIV-감염된 림파구와 감염되지 않은 CD4+ 림파구 모두와 반응한 세포독성 항체의 존재 및 적혈구(RBC) 응집소가 검출되었다. 이러한 응집소는 사람 RBC 혈액군 및 토끼와 귀니아 피그로부터의 RBC 혈액군 모두와 반응하였다. 이러한 불필요한 항체 특이성에 대하여 2 가지 가능성을 고려하였다. 하나의 가능성은 원래 세포 배양액의 단백질로 HIV 용해물의 오염이고, 두 번째는 사람 및 다른 동물에서 발견된 HIV 단백질/당단백질 및 당단백질간의 유사성이었다. 숙주 막단백질은 HIV의 외피에서 자주 확인되는 것으로 알려져 있다. 숙주 막성분의 HIV 외피 중으로의 혼입은 비특이적일 것으로 생각되고, 성숙 비리온의 출아와 관련되어 있다. 성숙 비리온 외피에서 이전에 확인된 2 개의 그러한 단백질은 사람 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원이다. 효소 관련 면역분석을 수행하여 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원 모두를 정량하였고, 결과는 감염되지 않은 배양 세포로부터 유도된 세포막 조제물에서 측정된 이들의 농도에 대하여 불균형적인 농도에서 이들 HIV 조제물 중 사람 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원 모두의 존재를 입증하였다. 추가 연구 결과, HIV 바이러스성 용해물의 다른 조제물(n=17) 중 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원의 존재를 확인하였다. 이러한 조제물에서 측정된 농도는 다양하지만, 비감염된 대조 세포로부터의 막 추출물에서 측정된 것 보다 10 내지 100 배 더 컸다. 염소 안티-HIV 항체를 공지된 HLA 클래스 I 및 클래스 II 단리물에 대한 웨스턴 블롯 분석으로 시험하였고 HLA 클래스 I, 클래스 II(알파 및 베타 사슬) 및 베타 2 마이크 로글로불린에 대하여 항체 특이성을 함유하는 것을 확인하였다. 이 항체를 HLA 알로타입 특이성에 대하여 조사하였다. 공지된 알로타입의 림프구를 포함하는 시판 트레이를 표적으로 사용하였다. 분석 조건하에서, 이 항체는 모든 림파구에 대해서 세포독성이었고, 이 세포독성은 가용성 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II와 함께 투여량 의존 방식으로 억제되었다(표 2.1).
정제된 HIV 용해물에 대하여 생성된 항혈청내 림프구독성의 HLA 클래스 I 억제
희석율 안티-HIV 안티-HIV & HLAI&II 25 ug 안티-HIV & HLAI&II 50 ug 안티-HIV & HLAI&II 100 ug 안티-HIV & HLAI&II 200 ug 예비-면역혈청
u 8 8 8 8 8 0
1:5 8 8 8 8 8 0
1:10 8 8 4 4 4 0
1:20 8 8 4 4 4 0
1:40 8 8 4 4 4 0
1:80 8 4 2 4 2 0
1:160 8 4 0 2 0 0
1:320 8 2 0 0 0 0
1:640 8 0 0 0 0 0
1:1280 4 0 0 0 0 0
포함하는 미세 티터 웰에 가용성 HLA 클래스 I&II를 안티-HIV 항체를 가하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 가용성 HLA I&II는 림프구세포독성을 감소시켰지만 50 ㎍를 넘는 농도에서는 부가적인 효과는 없었다.
추가 연구는 gp120, 사람 적혈구 및 백혈구, 토끼, 쥐 및 귀니아 피그를 포함하는 다른 동물로부터의 적혈구 상에 존재하는 계통발생학적으로 보존된 탄수화물 항원과 반응하는 항체를 입증하였다. S-HLA-I & II로 흡수 후, 사람 및 토끼 적혈구를 사용한 흡수 연구 결과, RBC(표 2.2) 및 림프구(표 2.3) 모두에 대하여 남아있는 항체 활성을 완전히 제거하였다.
RBC 응집소 세포에 대한 안티 RBC 흡수된 안티-HIV 항체의 분석
RBC 흡수 # 안티*HIV1 안티*HIV2 안티*HIV1&2
AB+ O+ 래빗 AB+ O+ 래빗 AB+ O+ 래빗
0 256 256 256 256 128 128 128 256 128
1 128 128 128 128 64 128 64 128 128
2 32 32 32 32 32 64 32 32 32
3 8 4 4 4 4 4 8 4 4
4 2 -- -- -- -- -- 2 -- --
* 정제된 HIV 용해물에 대하여 생성된 항혈청은 면역화 후 염소내에서 생성된 RBC 응집소를 생성하였다. 염소(각 n=2)를 HIV1MN 및 HIV1BAL 및(또는) HIV2NZ로 각각 면역시켰다.
면역화시 림프구세포독성에 대한 안티 RBC 흡수된 안티-HIV 항체의 분석
RBC 흡수 # 안티*HIV1 안티*HIV2 안티*HIV1&2
AB+ O+ 래빗 AB+ O+ 래빗 AB+ O+ 래빗
0 512 512 256 1024 1024 1024 512 1024 1024
1 256 256 256 256 512 512 256 256 256
2 128 64 128 64 64 128 64 128 64
3 32 16 16 16 16 32 16 16 16
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
5 2 2 2 ± 2 2 2 2 2
* 20 주 혈액 수집에서 글리코시다제 처리없이 HIV에 대하여 생산된 항혈청을 적혈구와 함께 0 내지 5 회 흡수시키고, 림프구세포독성에 대한 림프구에 대하여 시험하였다.
HLA 및 혈응집소에 대한 항체 특이성의 흡수 및 제거 후, 염소 안티-HIV 항체는 문헌에서 이전에 설명한 특이성과 유사한 특이성을 갖는 것으로 확인하였다. 이러한 사실은 사람 항원에 대한 세포독성 항체의 생성을 피하기 위해서 HLA 항원 및 탄수화물을 제거하는, HIV 단백질의 변형에 대한 필요를 입증하였다.
<실시예 3>
HIV 용해물로부터 단리된 HIV 단백질의 탄수화물 제거 및 HLA 클래스 I와 클래스 II 항원 제거 및 정제
미국 매릴랜드주 콜롬비아 소재 어드밴스드 바이오-테크놀로지즈사로부터 HIV1MN, HIV1BAL 및 HIV2NZ의 HIV 용해물을 구입하였다. 이들은 0.8 mg 내지 1.2 mg 단백질/ml 범위의 단백질 농도를 함유하였다. 단백질이 분해되는 것을 막기 위해서 프로테아제 억제제를 가하고, HIV 단백질을 분리시키기 위해서 비이온성 (이게팔 Ca-630 또는 노니뎃 P-40)을 가하였다. 혼합물을 탈지화제와 함께 캡핑된 추출 튜브 중에서 처리하여 지질을 제거하고 혼합물을 청징화시켰다. 원심분리 후 지질은 유기층에 별도로 용해되었고 수상은 제거하였다.
HLA를 포함하는, 원래 세포 배양물의 오염물은, 사람 혈청 단백질에 대한 면역친화성 정제된 폴리클로날 IgG 항체, HLA-1에 대한 모노클로날 IgG 항체, HLA-2에 대한 모노클로날 IgG 항체, β2-마이크로글로불린에 대한 모노클로날 항체, 림프구에 대한 면역친화성 정제된 폴리클로날 IgG 항체 및 적혈구막 항원의 공유 결합에 의해서 제조된, 5 개의 별도의 친화성 매트리스상에서 면역친화성 크로마토그래피하여 제거하였다. 각 매트릭스는 세팔로스 CL6B g 당 2 내지 3 mg 항체를 함유하였다. 칼럼은 탠덤 배열 형태였고, 매트리스에 0.1 % 이게팔 Ca-630을 함유하 는 pH 7.8의 PBS를 부어 평형화시켰다. 칼럼상 부피와 동일한 부피의 용해물 용액을 10 ml/시의 유속으로 각 칼럼을 통하여 계속해서 크로마토그래피하였다. 280 nm의 파장에서 분광측정적으로 크로마토그래피 및 용출을 모니터하였다. HIV 관련 단백질을 함유하는 단백질 풍부 비-결합성분획을 1 mg 단백질/ml로 농축시켰다.
SDS를 본 HIV 단백질을 함유하는 면역친화성-정제된 혼합물에 가하고, 이 혼합물을 70 ℃에서 10 분 동안 가열하였다. 단백질을 PGN아제를 사용하여 효소적으로 탈글리코실화하였다. 단백질 혼합물을 0.1 % 비이온상 청정제를 함유하는 염수로 예비 평형시킨 세팔로스 G50상에서 사이즈 크로마토그래피하여 분별시켰다. 단백질 분획을 수집하고, 목적하는 HIV 단백질을 함유하는 것들을 각각 모았다. gp160 및 gp 120, p66/55 및 gp 41, 및 p 24, p 17 및 p 10 각각에 대하여 풍부한 3 개의 단백질 풀을 얻었다. 분획들을 추가 처리될 때까지 -70 ℃에서 보관하였다.
사람 백혈구 항원(HLA)의 정량화 및 제거를 위한 상세한 방법이, 본 명세서에 인용된 문헌["Idetification, Characterisation, and Quantitation of Soluble HLA Antigen in Circulation and Peritoneal Dialysate of Renal Patients", F. Gelder, Annals of Surgery Vol.213,(1991)]에 기재되어 있다.
표 3.1은 정제로부터 얻어진 데이터를 나타내었다.
HIV 용해물의 정제
분별 단계 단백질 mg/ml 부피 ml 총 단백질 HLA I ng/ml HLA II ng/ml 회수율%
HIV 용해물 1.13 10 11.3 1833 692 100%
지방 제거 후 0.96 10.3 9.8 1726 683 86.7
친화성 크로마토그래피 후 0.44 19.5 8.58 <10 <10 75.9
농축 후 1.01 8.1 8.18 <10 <10 72.3
설명된 바와 같이, 전형적으로 정제된 HLA 조제물은 HLA 클래스 I 또는 클래스 II를 포함하여 오염물이 없없다. 정제된 HIV 조제물의 웨스턴 블롯 분석과 함께 SDS-PAGE 결과, 모아진 사람 IgG 항 HIV를 사용하여 gp160, gp 120, p66/55, gp 41, p24, p17 및 p7의 존재를 입증하였다.
<실시예 4>
정제된 HIV와 함께 보조제 효과를 나타내기 위한 MDP 미세입자의 생화학적 및 형태적 요구의 조제물 및 특성
프로피오니박테리움 악시니로부터 단리된 무라밀 디펩티드(MDP)의 다중 반복부는 이 실시예의 MDP 미세캐리어 복합체의 코어 구조를 형성하였다. 단량체적 서브유닛의 화학 조성은 하기와 같다:
Figure 111999003187829-pct00001
MDP는 면역 기능을 증가시키는 것에 대한 효과를 결정하기 위한 연구에서 광범위하게 조사되는 면역자극성을 갖는 것으로 알려져 있다. 당업자들은 이러한 효 과를 익히 알고 있다.
지금까지, 천연 자원으로부터 단리된 MDP 및 합성 MDP 모두 포유동물에 투여시 상당한 독성을 갖는 것으로 알려져 왔다. 이러한 독성은 캐리어로서 MDP의 효율성을 제한하였다.
독성 성분이 없는 MDP의 분리 방법이 본 명세서에 제시되어 있다. 프로피오니박테리움 악시니를 중간-정지 성장 상태까지 성장시킨 후, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 원래 세균 배양액의 오염물을 제거하기 위하여 세척하였다. 세포벽 및 세포질내 함유된 소수성 성분을 승온에서 에탄올/메탄올/물의 점진적인 농도에서 연속적으로 세척하여 순차적으로 추출하였다. 생성되는 MDP 미세입자를 10 % 에탄올 중에 현탁시키고, 540 nm에서의 그의 흡광도와 관련하여 표준 탁도의 흡광도에 대한 그의 농도를 측정하였다. 저장 및 나중 사용을 위하여 MDP 미세입자의 농도를 1 mg/ml로 조정하였다.
이러한 조제물의 분석 결과, 무라밀 디펩티드가 0.1 내지 0.2 미크론 크기의 미세입자와 광범위하게 가교결합되어 있음을 입증하였다. 아미노 결합된 말단 디펩티드 L-알라닌-D-이소글루타민은 상기 나타난 단량체 구조와 동일하였다. 세균 균주들 간의 차이가 있을 수 있고, 이러한 차이는 5 개 이상의 아미노산을 갖는 말단 펩티드와 같은 펩티드 조성에서의 차이, 디펩티드 아미노산, 특히 L-알라닌-D-이소글루타민 조성물의 변화 및 O-아실화 베타 미리스테이트기가 삽입되어 있는 위치의 변화를 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 바람직하지 않으며, 천연 자원으로부터 단리된 MDP의 독성 및 열등한 보조제 특성을 고려하지 않는다. 바람직한 실시태양에서, MDP 미세입자(0.01 내지 0.2 미크론; 바람직하게는 0.05 내지 0.1)는 아미노-결합된 L-알라닌-D-이소글루타민 디펩티드를 갖는다. 그러한 미세입자는 상기와 같은 천연 자원으로부터 단리되거나, 공지된 합성법을 사용하여 합성될 수 있다.
<실시예 5>
MDP 결합체의 제조 및 예비 평가
, 면역원(I)으로서 술피히드릴 브릿지(Mr ~ 18,000)에서 약 22 아미노산이 부족한 열등한 면역원성 모노클로날 사람 람다 광 사슬 단편을 사용하여 항체 제조에 대한 앞선 실시예의 MDP 미세입자(0.2 u)의 보조제 효과를 조사하였다. 두 개의 결합체를 제조하였는데, 그 중 하나의 면역원은 카르복실 말단기를 통하여 MDP에 공유적으로 결합되어 있고, 다른 하나는 아미노산 말단기를 통하여 결합되었다. MDP-면역원 결합체를 단계적으로 어셈블링하고, 원심분리, 상등액 제거 및 MDP를 통하여 결합을 순차적으로 계속하기 위해서(면역원 어셈블리) 요구되는 시약으로의 대체시키는 각 단계 후에 시약 교환을 수행하였다. 각 단계 후에 수행된 각 반응 및 시약 교환에서 나타난 몰비는 면역원의 다수 지점의 결합을 방지하여, 예비 실험에서 면역 항체 반응을 상당히 감소시켰다.
<MDP:NH2:면역원:CO2H의 합성>
EDC를 사용하여 무라밀 디펩티드에 대한 HIV 단백질의 효과적인 2 단계 커플링를 위한 프로토콜
그라바렉, 제트 및 거겔리, 제이(Grabarek, Z. and Gergely, J.)의 문헌[J. Anal. Biochem. 185:1311(1990)]에 기재된 방법으로부터 채택된 하기 방법은 HIV 단백질을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)에 HIV를 노출시키지 않고 MDP에 대한 HIV 단백질 및 펩티드의 순차적인 커플링을 가능하게 함으로써 HIV에 대한 카르복실에 영향을 주었다. 이러한 방법은 제1 반응을 티올 화합물로 켄칭하는 것을 요구하였다. 이 반응은 2-[N-모르폴리노]에탄 술폰산(MES) (pH 4.5 내지 5.0) 중에서 수행한다.
MES(0.5mg)(pH 4.5 내지 5.0)중에 재현탁시킨 물로부터 동결건조된 MDP(10 mg) 및 MES(pH 4.5 내지 5.0)중에 용해시킨 EDC (0.5 내지 2 mM)를 합하여 실온에서 15 분 동안 반응시켰다. 2-메르캅토에탄올(최종 농도 20 mM)을 가하여 EDC를 켄칭시키고, 원심분리에 의해서 분리하였다. 반응 혼합물을 MES로 1 회 세척하고 0.5 ml MES(pH 4.5 내지 5.0)로 재현탁시켰다. MES 중에 용해된 사람 λ광 사슬 단편을 약 2:1의 몰비로 활성화된 MDP에 가하였다. MES(0.5 M, pH 8.5)의 첨가에 의해서 반응물의 pH를 15 분에 걸쳐서 8.5로 서서히 증가시키고, 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. MDP에 가해진 사람 λ광 사슬 단편의 농도를 MDP 말단 CO2H기의 정량분석으로부터 계산하여 MDP mg 당 CO2H 몰로서 나타내었다. 반응물을 히드록시아민을 가하여 최종 농도 10 mM로 켄칭시켰다. 이러한 켄칭 방법은 미반응된 모든 MDP 활성화 부위를 가수분해시켜 원래 카르복실을 재생시켰다. 다른 켄칭 방법은 20 내지 50 mM 트리스, 리신, 글리신, 또는 에탄올아민을 가하는 것이지만, 이러 한 제1 아민 함유 화합물은 변형된 카르복실 MDP를 생산할 것이다. HIV 합성 펩티드와 함께 MDP를 사용하고, 소수성을 변화시키거나 생-활성 화합물을 결합하기 위해서 이러한 펩티드의 변형이 필요한 경우, 최종 켄치 단계 전에 요구되는 화합물을 가함으로써 변형시킬 수 있다. 이는 HIV 펩티드와 초기 커플링 후 요구되는 화합물을 순차적으로 가할 수 있게 하였다. 또한, 펩티드 면역원성의 보다큰 조절이 요구되는 경우, 생활성 펩티드를 하나의 단계로서 요구되는 비율로 가할 수 있다. IL2와 같은 생물학적 반응 조절제가 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이러한 목적으로 사용할 수 있었다.
원심분리, 세척 단계 및 선택된 완충액 중에 재현탁시킴으로써 분리시켰다.
<MDP-CO2H-면역원-NH2의 제조>
MDP:NH 2 CH 2 CH 2 NH 2 :CO 2 H:면역원:NH2 의 합성
EDC를 사용하여 무라밀 디펩티드에 대한 단백질의 효과적인 3 단계 커플링을 위한 프로토콜
이 방법은 단백질을 EDC에 노출시키지 않은 상태에서 MDP에 대한 단백질 및 펩티드의 순차적인 커플링을 가능하게 하여 단백질상의 아미노기에 영향을 준다. 방법은 순차적으로 수행된 2 개의 중간 단계를 사용하였다. MES(pH 4.5 내지 5.0)중에서 초기 반응을 수행하였다. MES(0.5mg)(pH 4.5 내지 5.0)중에 재현탁된 물로부터 동결건조된 MDP(10 mg) 및 MES중에 용해된 EDC (0.5 내지 2 mM)를 합하여 실온에서 15 분 동안 반응시켰다. 2-메르캅토에탄올(최종 농도 20 mM)을 가하여 과 량의 EDC를 켄칭시키고, 원심분리에 의해서 활성 MDP를 분리하고, MES로 2 회 세척하고 0.5 ml MES(pH 4.5)로 재현탁시켰다. MES(pH 4.5) 중에 용해된 디아미노에탄(NH2CH2CH2NH2)를 약 10:1의 몰비로 활성화된 MDP에 가하였다. MES(0.5 M, pH 8.5)의 첨가에 의해서 반응물의 pH를 15 분에 걸쳐서 pH 8.5로 서서히 증가시키고, 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. MDP:NH2CH2CH2NH2를 원심분리에 의해서 분리하고, MES로 2 회 세척하고 0.5 ml MES(pH 4.5)로 재현탁시켰다. λ광 사슬 단편을 0.5 ml MES(pH 4.5) 중에 재현탁시키고, MES중에 용해된 EDC (0.5 내지 2 mM)를 가하여 실온에서 15 분 동안 반응시켰다. 2-메르캅토에탄올(최종 농도 20 mM)을 가하여 과량의 EDC를 켄칭시키고, 과량의 환원제로부터 활성화된 단백질 및 불활성화된 가교결합제를 사이즈 크로마토그래피에 의해서 적당한 사이즈의 겔 여과 칼럼상에서 분리하였다. 활성화된 단백질을 약 5:1의 몰비의 활성화된 MDP:NH2CH2CH2NH2에 가하고, 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. MDP에 가해진 단백질의 농도를 MDP 말단 CO2H기의 정량분석으로부터 계산하여 MDP mg 당 CO2H 몰로서 나타내었다. 반응물을 히드록시아민을 가하여 최종 농도 10 mM로 켄칭시켰다. 이러한 켄칭 방법은 미반응된 모든 MDP 활성화 부위를 가수분해시켜 원래 카르복실을 재생시켰다. 면역원으로서 HIV 합성 펩티드를 사용하고, 그러한 펩티드의 소수성을 변화시키거나 생-활성 화합물을 결합하기 위해서 이러한 펩티드의 변형가 필요한 경우, 상기 설명한 바와 같이 변형시킬 수 있다. 원심분리, 세척 단계 및 선택된 완충액 중에서의 재현탁에 의해서 분리시켰다.
생활성 화합물은 CO2H기를 통한 결합이 요구될 때 상기 설명한 중간 단계를 필요하다는 것을 알아야 한다.
<실시예 6>
시판용 보조제인 프룬드(Freund) 완전 보조제, 리비(RIBI)(등록상표), 티터 맥스(Titer Max)(등록상표) 및 알럼(Alum)에 대한 MDP 면역 결합체의 비교 연구.
항체 제조에 대한 이들 MDP 미세입자의 보조제 효과를, 면역원(I)으로서 앞의 실시예에서 설명한, 열등한 면역원 모노클로날 사람 람다 광 사슬 단편을 사용하여 조사하였다. 두 개의 결합체를 제조하였는데, 그 중 하나의 면역원은 카르복실 말단기를 통하여 MDP에 공유적으로 결합되어 있고, 다른 하나는 아미노산 말단기를 통하여 결합되었다.
MDP 500 mg에 결합되어 스쿠알렌 중에 유화된 사람 람다 광 사슬 약 100 mg을 래빗(각 그룹 n=5)의 피하로 면역시켰다. 한 달 간격을 두고 동물을 면역시키고, 면역 전에 시험 혈액을 얻고, 2 주 간격을 두고 결과를 내었다. MDP:NH2-I-CO2H-면역원 및 MDP:NH2CH2CH2NH2-HO2C-I-NH 2에 대한 항체 반응은 활성에 있어서 유사하였다. 그러나, MDP:NH2-I-CO2H-촉진된 래빗은 경잭적인 EIA에 의해서 결정된 하나 이상의 부가적인 항체 특이성을 생산하였다. 얻어지는 항체 반응은, 프룬드 완전 보조제, 리비(등록상표), 티터 맥스(등록상표) 및 알럼(알루미늄 히드록시드)를 포함하는, 항체 반응에 통상적인 보조제를 사용할 때와 비교하였다. MDP:HO2C-I- NH2 및 MDP-I-CO2H 모든 면역원을 갖는 통상적인 보조제보다 항체를 유도하는데 있어서 더 우수하였다. 면역원 농도(100 ㎍/면역화) 및 면역화 스케줄은 모든 군에서 동일하였다. 표 6.1은 2 주 간격으로 측정된 항체 역가를 나타내었고, 역가는 상기 설명한 바와 같은 포지피브 반응을 생성하는 희석율의 역수로서 나타내었다. MDP-결합체 모두 통상적으로 널리 알려진 보조제보다 더 우수하였다.
주 *MDP:I CO2H +MDP:I NH2 프룬드 완전 보조제 리비 티터 맥스 알럼
T-O --- --- --- --- --- ---
2 --- --- --- --- --- ---
4 2 --- --- --- --- ---
6 16 4 --- --- --- ---
8 256 128 --- --- --- ---
10 512 512 4 4 4 ---
12 1024 512 16 16 16 ---
14 4096 2048 32 32 64 4
16 4096 4096 64 128 256 8
18 8192 1096 256 512 1024 32
20 16384 8192 256 512 2048 32
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
MDP:I 무라밀 디펩티드:면역원 미세분자(≤0.2 m)
* 아미노 말단기에서 펩티드를 노출된 카르복시 말단과 함께 이소글루타민에 결합시켰다(MDP:I:CO2H).
+ 카르복실 말단을 변형시키기 위해서, 디아미노에틸렌을 사용하는 중간 단계를 통하여 펩티드를 카르복시 말단기에서 결합시켰다(MDP:I:NH2).
<실시예 7>
MDP:NH2:I:CO2H 및 MDP:NH2CH2CH2NH2:HO 2C-I-NH2 면역원으로 유도된 말초 혈액 단핵 세포의 사이토킨 반응
MDP 미세분자-면역원 복합체에 대한 증가된 항체 반응과 관련된 기작을 추가로 평가하기 위해서, 사이토킨 생산 또는 말초 혈액 단핵 세포를 측정하는 시험관내 방법을 사용하여 공지된 사이토킨 유도제와 비교하였다. 리포폴리사카라이드(LPS) 및 식물성적혈구응집소(PHA)를 갖는 LPS를 공지된 유도제로서 사용하였다. 공지된 분석법을 사용하여 사이토킨을 정량하여 단위/ml로 나타내었다. 피콜 하이파그(Ficol Hypague) 구배 원심분리에 의해서 말초 혈액 단핵 세포를 단리하고, 조직 배양 배지내 2 x 105/ml의 농도로 조절하였다. 세포(100 ㎕)를 미세배양 웰 중에 플레이팅하였다. MDP:I:CO2H, MDP:I:NH2, PHA + LPS, LPS 및 배지 자체를 희석하지 않거나 1:10 및 1:25(10 ㎕)로 희석하여 가하였다. 배양액을 5 % CO2 분위기 하에 37 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이팅하고, 상등액을 제거하고, 표준 생분석 및(또는) EIA 방법으로 분석하였다.
IFNR IL2 TNF IL6
MDP:I:CO2H 550 510 152 62
MDP:I:NH2 520 495 176 73
LPS + PHA 340 320 495 450
LPS 210 150 325 310
배지 0 0 0 0
I:CO2H 496 398 68 25
NH2 23 410 72 21
LPS + PHA 205 165 210 152
LPS 175 90 135 140
I:CO2H 125 90 5 10
I:NH2 51 85 9 10
LPS + PHA 20 10 15 20
LPS 20 10 15 20
MDP:I:CO2H 및 MDP:I:NH2 모두가 PHA + LPS 또는 LPS 자체보다 타입 I 사이토킨 반응을 크게 촉진하였다. 보다 높은 IFN 감마 및 IL2 및 보다 낮은 수준의 TNF 및 IL6에 의해서 타입 2 사이토킨 반응이 진행하는 동안, 타입 1 사이토킨 반응은 면역 사건을 증진시켰다.
<실시예 8>
탄수화물 잔기를 제거하도록 처리되거나 비처리된 HIV 단백질에 대한 염소에 있어서 항체 반응의 특성화 및 통상적인 보조제와 MDP 미세 분자의 보조제 특성의 비교
<실시예 8.1>
미국 매릴랜드주 콜롬비아 소재 어드밴스드 바이오-테크놀로지즈사로부터 HIV1MN, HIV1BAL 및 HIV2NZ 바이러스 용해물을 구입하여, 각 제제의 반은 탄수화물을 제거하기 위해서 효소적으로 처리하고, 모든 제제(탄수화물 함유 및 무함유)를 상기와 같이 정제하였다. 실시예 5에서 제시한 방법에 따라서, 각 알리쿼트를 아미노 말단 잔기를 통하여 MDP에 결합시키고, 각각 스쿠알렌에 현탁시켰다. 또한, 비교 목적으로 이들 HIV 단백질을 MDP에 결합시키지 않고 프룬드 완전 보조제 중에 유화시켰다.
그룹 1 - HIV1MN:HIV1BAL, 1:1, 탄수화물 무함유;
그룹 2 - HIV1MN:HIV1BAL, 1:1, 탄수화물 함유;
그룹 3 - HIV2NZ 탄수화물 제거하지 않음;
그룹 4 - HIV2NZ 탄수화물 제거함;
그룹 5 - HIV1MN:HIV1BAL:HIV2NZ, 1:1:1, 탄수화물 제거하지 않음;
그룹 6 - HIV1MN:HIV1BAL:HIV2NZ, 1:1:1, 탄수화물 제거함;
그룹 7 - HIV1MN:HIV1BAL:HIV2NZ, 1:1:1, 탄수화물 제거하지 않고, MDP에 결합없이 프룬드 완전 보조제 중에 유화시킴;
그룹 8 - HIV1MN:HIV1BAL:HIV2NZ, 1:1:1, 탄수화물 제거하고, MDP에 결합하여 프룬드 완전 보조제 중에 유화시킴.
염소를 면역 그룹 1 내지 8(각 n=3)로 나누어서 각각 100 ㎍ HIV/면역으로 표 8.1에 나타낸 간격을 두고 면역시켰다. 면역화 전에 2 주 간격으로 혈액 시료를 얻었다. 아보트 래버러토리사로부터 입수된 FDA 인정된 시판용 시험 키트를 사용하는 EIA로 항체 반응성을 정량하였다. 결과는 흡광도 > 1.0을 내는 항혈청 희석율의 역수로서 나타내었다.
HIV 단백질에 대한 안티 HIV 항체 반응의 분석
주 # 그룹 1 안티 HIV1 그룹 2 안티 HIV1 그룹 3 안티 HIV2 그룹 4 안티 HIV22 그룹 5 안티 HIV1&2 그룹 6 안티 HIV1&21 그룹 7 안티 HIV1&2 그룹 8 안티 HIV1&21
T-O 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
4* 8 8 8 4 8 8 0 0
6 64 32 32 16 64 128 2 0
8* 128 32 32 32 64 128 4 2
10 512 64 64 128 256 512 16 8
12* 1024 128 128 256 512 1024 16 16
14 2048 512 512 512 1024 2048 32 32
16* 4096 256 256 512 4096 4096 64 32
18 4096 512 512 1024 8192 8192 128 54
20 8192 1024 1024 16834 16834 16384 128 64
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
1 - 제거된 탄수화물
* 면역화 & 부스터
항체 반응을 면역기간 중 2 주 간격으로 측정하였다. MDP와 함께 EIA로 측정시, 각 동물 그룹(그룹 1&2, 3&4, 5&6) 사이에 항체 반응성의 큰 차이는 없었다. 목적하는 안티-HIV 단백질에 대한 항체 생산에 있어서 탄수화물 제거는 효과가 없었다.
<실시예 8.2>
혈구응집성 항체에 대하여 실시예 8.1에서 설명대로 얻어진 항혈청을 조사하였다. 표 8.2에서 볼 수 있는 바와 같이, HIV 단백질로부터의 탄수화물 제거는 혈구응집화 반응을 제거하였다.
적혈구에 대한 안티 HIV 항체 반응의 분석
주 # 그룹 1 안티 HIV1 그룹 2 안티 HIV11 그룹 3 안티 HIV2 그룹 4 안티 HIV22 그룹 5 안티 HIV1&2 그룹 6 안티 HIV1&21 그룹 7 안티 HIV1&2 그룹 8 안티 HIV1&21
T-O -- -- -- -- -- -- -- --
2 -- -- -- -- -- -- -- --
4* -- -- -- -- -- -- -- --
6 2 -- 2 -- 4 -- 4 --
8* 4 -- 4 -- 4 -- 8 --
10 16 -- 8 -- 8 -- 16 --
12* 32 -- 8 -- 32 -- 16 --
14 64 -- 64 -- 128 -- 64 --
16* 64 -- 64 -- 64 -- 128 --
18 128 -- 128 -- 128 -- 256 --
20 256 -- 256 -- 128 -- 256 --
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
1 - 제거된 탄수화물
* 면역화 & 부스터
탄수화물군을 제거하도록 처리된 HIV 제제는 적혈구를 응집시킬 수 있는 항체 반응성을 나타내지 않았다(표 8.2A). 탄수화물 제거없이 MDP-HIV 결합체로 면역시킨 염소 및 탄수화물 제거없이 프룬드 완전 보조제 중에 유화시킨, 정제된 HIV로 면역시킨 염소는 적혈구 응집소를 생성하였다. MDP-HIV 결합체 또는 프룬드 완전 보조제 중에 유화시킨 HIV로 면역시킨 염소로부터의 항혈청 중의 적혈구 응집소의 역가에서는 차이를 인식할 수 없었다. 명세서에 기재된 적혈구 응집소는 실시예 2의 예비 연구에서 설명된 것과 본질적으로 동일하였다. 이들 응집소는 세포독성이었다(표 8.2A). 그러나, HLA 클래스 I 및 클래스 II에 대한 검출가능한 항체 반응성은 없었고, 혈응집성 및 세포독성 항체 반응성 모두 완전히 제거된 적혈구의 흡수도 없었다.
림프구독성에 대한 안티 HIV 항체의 순차적 분석
주 # 그룹 1 안티 HIV1 그룹 2 안티 HIV11 그룹 3 안티 HIV2 그룹 4 안티 HIV22 그룹 5 안티 HIV1&2 그룹 6 안티 HIV1&21 그룹 7 안티 HIV1&2 그룹 8 안티 HIV1&21
T-O* ± ± ± ± ± ± ± --
2 ± ± ± ± ± ± ± --
4* +4 ± +2 ± +4 ± ± --
6 +8 ± +2 ± +8 ± +2 --
8* +8 ± +4 ± +16 ± +4 --
10 +64 ± +32 ± +32 ± +4 --
12* +256 ± +256 ± +128 ± +16 --
14 +256 ± +512 ± +256 ± +32 --
16* +512 ± +512 ± +512 ± +64 --
18 +512 ± +1024 ± +512 ± +128 --
20 +512 ± +1024 ± +1024 ± +128 --
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
1 - 제거된 탄수화물
* 면역화 & 부스터
HIV 및 RBC 탄수화물군 사이의 유사 가능성을 평가하기 위해서, 사람 적혈구로부터 단리된, 정제하여 모은 세포막으로 구성된 면역원으로 염소를 면역시킴으로써 부가적인 항혈청을 생성하였다. 이러한 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯 분석 결과, 적혈구 당단백질과의 반응성을 입증하였다. 그러나, 탄수화물군을 제거하도록 처리된 HIV gp41 및 gp120은 반응성이 없었다. 이러한 데이타는 HIV상의 탄수화물 에피토프와 적혈구 당단백질 상이의 계통발생학적인 유사성과 일치하였다.
웨스턴 블롯 분석은 gp160, gp120, gp41, p66/55, p10, p24, p17 및 p7을 포함하여, 미세배양에서 중화된 대부분의 HIV 단백질에 대한 강한 반응성을 나타내었다. 명세서에 기재된 HIV 에피토프에 대한 이러한 항체의 반응성 또는 특이성에 있어서 뚜렷한 차이는 없었다. 이러한 항체는 역전사효소 및 프로테아제 억제제에 대하여 저항성을 갖는 것으로 나타난 것들을 포함하여 시험한 모든 HIV 단리물에 반응하였다.
<실시예 8.3>
탄수화물-고갈된 HIV에 대하여 생성된 항체에 의한 HIV 감염성의 중화
이 실시예는 상기 설명한 탄수화물 고갈된 HIV에 대하여 생산된 항체를 사용하여 HIV 감염성의 중화를 입증하고 특성화하였다. 결과, 이들 항체는 고농도의 중화 활성을 포함하고, CEM 세포를 감염으로부터 투여량 의존 방식으로 보호하였다.
중화 분석:
A. 민감한 중화 분석을 사용하여 HIV 감염성에 대한 염소 안티-HIV의 효과를 정량하였다. HIV 감염성에 대한 이러한 항체의 효과를 결정하기 위하여 표적 세포로서 HIV 감염에 고도로 민감한 CEM CD4+ 세포계를 선택하였다. 항체 및 희석율은 10 % 소혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 요구하는 대로 하였다. 로그 성장 상태의 CEM 약 4 일 배양한 것으로부터 HIV1SF2 현탁액을 얻어서 0.2 또는 0.45 미크론 필터를 통과시키고, 분주하여 -70 ℃에서 동결시켰다. 하나의 분액을 해동시키고, 적정하여 TCID50를 결정하고, 후속해서 신선하게 해동된 분액을 배양 배지 중 1:500 희석율 내지 배양액 중 CEM 세포 중 50 %를 감염시키는데 요구되는 양의 10 배 농도로 분석을 수행하였다(10 TCID50). 바이러스 현탁액을 동량의 5 배 항체 희 석물과 1:5 내지 1:9,765,625로 혼합하였다. 바이러스/항체 조합물을 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이팅하고, 200 ㎕의 동일한 2 개 시료를 사용하여 웰 당 약 2 x 105 CEM 세포 1.0 ml를 함유하는 웰에 접종하였다. 배양액을 5 % CO2의 습한 대기하 37 ℃에서 14 일 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 수확하고 펠렛화한 후, PBS 중의 1 % 트리톤 X-100으로 100 분 동안 용해시켰다. 시판용 p24 분석을 사용하여, 세포내 존재하는 바이러스(바이러스 항원)의 양을 정량하였다. 항체없이 또는 유사한 방식으로 제조된 염소의 면역전 IgG와 함께 인큐베이팅된 바이러스 억제 배양물의 50 % 보다 크게 p24 항원 생성을 억제하는 항체 희석율의 역수로서 중화 활성의 역가를 결정하였다. 용해된 세포 현탁액 200 마이크로리터를 분석하였다.
안티 HIV 항체 중화 활성의 분석
주 # 그룹1 안티 HIV1 그룹 2 안티 HIV11 그룹 3 안티 HIV2 그룹 4 안티 HIV22 그룹 5 안티 HIV1&2 그룹 6안티 HIV1&21 그룹 7안티 HIV1&2 그룹 8안티 HIV1&21
T-O* -- -- -- -- -- -- -- --
2 -- -- -- -- -- -- --
4* -- -- -- -- -- 4 -- -
6 32 16 -- -- 16 16 -- --
8* 256 32 4 -- 64 128 2 --
10 1024 128 4 4 512 256 8 --
12* 1024 512 16 8 2048 1024 32 --
14 5096 1024 256 32 5096 2048 64 --
16* 10192 2048 512 64 10192 2048 128 --
18 20384 2048 1024 128 20384 5096 128 --
20** 20384/204 5096/5096 2048/256 256/256 40766/101 10192/101 256/12 --
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
1 - 제거된 탄수화물
* 면역화 & 부스터
** = 20 주 혈액으로부터 얻어진 안티 HIV 제제를 사람 적혈구에 흡수시키고, 흡수된 시료 및 흡수되지 않은 시료 모두 동일한 조건하에서 시험하였다. 결과는 (비흡스/흡수) 중화 역가로서 나타내었다.
탄수화물 결정체를 제거하도록 처리되지 않은 HIV-MDP 결합체에 대하여 가장 큰 중화 활성을 갖는 안티 HIV제를 제조하였다(표 8.3A). 탄수화물-고갈된 HIV 결합체에 대한 항체의 적혈구 흡수는 효과가 없었다. 그러나, 탄수화물-고유한 HIV 결합체에 대한 항체의 RBC 흡수는 중화 반응성에 있어서 상당한 감소를 초래하였고, HIV 및 사람 간에 공유된 계통발생학적인 탄수화물 잔기의 존재를 확인하였다(맨 아랫줄, 표 8.3A). HIV-MDP결합체에 대하여 생산된 모든 안티-HIV 항체 제제는 프룬드 완전 보조제를 사용하여 생산된 안티-HIV보다 통계학적으로 더 많았다. HIV의 예상된 유전적 다양한 특성으로 인하여, 상기 설명한 것들과 동일한 조건하에서 복수개 약물 저항성 균주로서의 특징을 포함하는 4 개의 HIV 야생 단리물과 HIV1MN을 사용하여, 중화 활성에 대하여 20 주의 안티-HIV 제조물을 시험하였다. HIV 결합체에 대하여 생성된, 탄수화물이 없는 20 주의 안티-HIV 항체 제조물은 모든 균주를 중화시켰다(표 8.3B).
당업자들은 HLA가 없고 탄수화물이 없는 HIV 단백질에 대하여 생성된 중화 활성이 사람-안티-HIV 혈청에서 전형적으로 관찰된 중화 활성보다 매우 더 크다는 것을 인식할 것이다.
다수 균주에 대한 안티 HIV 항체 중화 활성의 분석
HIV 균주/단리율 안티 HIVI1 안티 HIV21 안티 HIV1&21 면역전 IgG
HIVSF 10192 512 20384 0
HIVMN 5096 256 10192 0
Wild#1 10192 512 20384 0
Wild#2 2048 256 5096 0
Wild#3 2048 128 5096 0
1 - 제거된 탄수화물
<실시예 8.4>
항체 의존성 보체 매개된 세포독성에 있어서 HIV 감염된 CD4 림프구에 대한 안티 HIV의 효과
탄수화물-고갈된 HIV 접합체 및 탄수화물-무손상 HIV 접합체에 대한 항체를 HIV로 감염되거나 감염되지 않은, CD4 림프구가 많은 정상 말초혈 단핵 세포에 대한 보체 매개 세포독성 반응성에 관해 평가하였다. 정상 말초 단핵 세포를 단리하고, 피콜 하이파크 구배 원심분리를 수행하여 CD4+ 림프구를 풍부하게 했다. CD4+ 림프구를 PHA로 자극시키고, 미세배양액 중에서 7 일 동안 HIV1MN으로 감염시켰다. 상등액을 제거하고, 당 기를 제거한 HIV 제제에 대하여 생성된 안티-HIV로 대체하였을 때 정상 세포에 대한 세포독성 효과는 없었다. 표 8.4에서 볼 수 있는 바와 같이, 안티 HIV는 감염된 CD4 림프구를 투여량 의존 방식으로 용해시켰다.
감염된 CD4 림프구의 안티 HIV 항체 매개된 세포독성의 분석
주 # 그룹 1안티 HIV1 그룹 2안티 HIV11 그룹 3안티 HIV2 그룹 4안티 HIV22 그룹 5안티 HIV1&2 그룹 6안티 HIV1&21 그룹 7안티 HIV1&2 그룹 8안티 HIV1&21
T-O* ± ± ± ± ± ± ± --
2 ± ± ± ± ± ± ± --
4* 4 4 2 ± 4 4 ± --
6 8 16 2 ± 32 32 ± --
8* 32 32 4 4 256 256 2 --
10 128 54 32 32 512 512 8 --
12* 256 128 256 64 1024 1024 16 --
14 1024 512 512 256 2048 2048 16 2
16* 2048 1024 512 256 4096 4096 32 4
18 4096 2048 1024 512 8192 8192 64 8
20 8192 4096 1024 512 8192 8192 256 8
T-O = 제1 면역 및 예비-면역 혈액 수집
1 - 제거된 탄수화물
* 면역화 & 부스터
<실시예 8.5>
HIV 단백질의 아미노산 서열에 따른 펩티드의 합성
합성 펩티드를 HIV1SF2 아미노산 서열과 유사한 12량체 펩티드로서 제작하였다. gp120, gp41, 비프(Vif), gag p17, gag p24, nef, Rev, 인테그라제, 프로테아제, Tat:HxB2 및 역전사효소 및 6 개의 아미노산 잔기와 오버래핑된 역전사효소에 대한 아미노산 서열을 고체상 기술을 사용하여 합성하거나 퓨리피케이션 시스템사로부터 구입하였다.
4-N,N-디메틸아미노피리딘의 촉매량과 함께 디시클로헥실카르보디이미드를 사용하여, 폴리스틸렌에 커플링된 부틸옥시카르보닐-S-4-메틸벤젠-L-시스틴을 합성을 위한 고체상 지지체로서 사용하였다. 아미노기를 tert-부틸옥시카르보닐(t- Boc)로 보호하고, 측쇄 보호기는 하기와 같다: 세린의 히드록실에 대하여 벤질 에테르, 세린의 페놀성 히드록실에 대하여 디클로로벤질 에테르, 베타 벤질-에스테르는 글루탐산 및 아스파르트산 각각에 대한 카르복실기에 대하여 사용하였다. 트리플루오로아세트산(CH2Cl2중의 40 %)을 사용하여 t-Boc를 제거하였고, 생성되는 염을 N-디이소프로필에틸아민(CH2Cl2중의 10 %)으로 중화시켰다. 디이소프로필카르보디이미드를 사용하여 t-Boc 아미노산을 커플링시켰다. 보호기를 제거하고, 펩티드를 0 ℃에서 스캐빈져로서 10 % 아니솔 및 1 % 에탄디티올을 함유하는 무수 불화수소와 함께 수지로부터 분해시켰다. 트리플루오로아세트산으로 수지로부터 펩티드를 추출한 후, 용매를 15 ℃까지 증발시키고, 펩티드를 다시 에테르로 침전시켰다. 원심분리 후 에테르를 데칸팅하고, 6 M 구아니딘 HCl를 함유한 5 % 아세트산 중에 펠렛을 용해시켰다. 이 용액을 5 % 아세트산 중의 평형화시킨 바이오겔 P2 칼럼 상에서 탈염시키고, 펩티드 함유 분획들을 모야서 동결건조시켰다. 캐리어 단백질 또는 EIA 방법을 위한 고체상에 또는 MDP에 펩티드의 커플링을 위한 관능성 SH기를 제공하기 위해서 필요한 펩티드의 카르복실 말단에 시스테인 잔기를 가하였다(실시예 5). 펩티드의 다중 반복부가 필요한 경우, 먼저 시스테인 잔기를 수지 지지체에 결합시킴으로써 합성을 수행하였다. 다양한 길이의 탄소 스페이서를 가하고, 용도에 의존적인 다양한 스페이서 길이의 선택, 펩티드 하전 및 길이 및 입체적 영향은 지지체에 대한 펩티드의 결합에서 얻어진 예비 데이타로부터 예측하였다. 먼저, 실시예 5에서 디아미노에탄으로 상기 설명한 리신-(리신)2-(리신)4 부가와 함 께 보호기 블록킹의 순서를 변화시키는 6-아미노헥사노산과 같은 6 개의 탄소 스페이서를 결합시켰다. 아미노기를 보호하고 나서, 탈보호하여 2 개의 리신 잔기로 하여금 탈보호된 아미노 말단에 결합시키고, 탈보호 후, 리신을 부가하여 펩티드 합성을 위한 분지쇄 구조를 생성하였다. 특정 생물학적 기능 또는 효소적 분해에 민감한 서열을 갖는 펩티드를 D-아미노산 부가에 의해서 변형시켰다. 하나의 특별하게 유용한 부가는 D-이소글루타민의 NH2 말단을 제거 합성한 중요한 펩티드와 함께 L-알라닌-D-이소글루타민의 부가이다. 또다른 배열에서는, L-리신-L-리신-펩티드-D-이소글루타민과 함께 펩티드를 합성하였다. 카르복실 말단 리신기는 미세 환경내 많은 효소에 의한 효소 분해에 매우 민감한 반면, D-이소글루타민은 펩티드의 반감기를 증가시키고, 양친매성이 필요한 펩티드를 모으는 소수성 위치를 제공하여 수용체 결합 및 MHC 관련 사건을 통한 면역 유도와 같은 기능을 나타내었다. 펩티드 대 캐리어 단백질 커플링 효율을 결정하고, 정제시 펩티드를 확인하기 위하여, 티로신 잔기를 아미노산 말단에 가하여 125요오드로 방사성 표지화하였다. 또한, 티로신 부가에 의해 펩티드 기능이 영향을 받지 않을 때, 125요오드는 생물학적 계내 펩티드의 반감기를 나타내고, 수용체 결합을 조사하는 트레이서를 제공하였다.
<실시예 8.6>
바이러스 에피토프의 확인을 위하여, HIV 및 다른 레트로바이러스의 펩티드 서열과 유사한 합성 펩티드의 용도
본 발명의 범위내에서는, HIV 및 다른 레트로바이러스에서 발견된 고도로 보존된 서열과 유사한 합성 펩티드 서열이 기재되어 있고, 바이러스 감염을 치료하는데 있어서 면역학적 표적으로서 이들의 기능적 중요성이 확인되었다. 이러한 펩티드는 면역 반응, 자가면역 유도의 비특이적인 하강 조절을 통하여, 또한 HIV-관련 말초 신경장애를 초래하는 독성 효과를 통하여 HIV의 병발생시키는 서열을 갖는 HIV 미세변이체로부터 HIV 감염의 진단 및 처리에서의 부가적 용도를 갖는다. 이러한 각 사건들이 환자에개 나타날 때, HIV의 병발생을 일으키고 생명의 질을 저하시켰다. 이러한 사건을 초기화하는 이러한 HIV-펩티드 부위를 확인하고 정량하기 위해서 사용되는 합성 펩티드는 자기면역 및 말초 신경장애에 대한 위험 인자를 찾아내는데 유용하다. 합성 펩티드는 질병 진행 및 치료의 결과로서 진행의 변화를 모니터하는 신규 정량법에서 또한 유용하였다.
본 발명의 하나의 단계에서, 효소 면역분석(EIA)는 사람 안티-HIV에 의해서 인식되지 않은 HIV상의 염소 항체 특이성을 확인하기 위한 형태이다. HIV gp120 및 gp41 단백질의 정제된 제조물은 단백질을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이팅함으로써 포스페이트 완충된 염수(PBS<pH 7.8) 중에 5 ㎍/ml에서 폴리비닐 마이크로타이터 플레이트의 웰상에 코팅하였다. 웰을 0.1 % 트윈 20(PBS<트윈)을 함유하는 PBS로 세척하고, 사용되지 않은 각 웰 위치는 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅함으로써 5 % 소열청 알부민으로 포화시켰다. 플레이트는 곧 사용하거나 4 ℃에서 보관하였다. 사람 IgG 안티-HIV(100 ul)(실시예 1)을 각 웰에 가하고 4 ℃에서 25 시간 동안 인큐베이팅하고, 웰을 PBS<트윈으로 세척하였다. 표준 방법으로 HRP 로 표지되고 이전에 생성된 염소 안티-HIV를 분석 조건에서 흡광도 1.0을 얻는데 요구되는 희석율로 웰에 가하고(1:10000 역가), 4 ℃에서 25 시간 동안 인큐베이팅하였다. 웰을 세척하고 염소 IgG의 결합량을 결정하기 위해서 기질을 가하였다. HIV 단백질을 사람 안티-HIV로 차단함으로써 유도되는 결합 저해률은 공식을 사용하여 계산하였다.
{(차단되지 않은 OD-차단된 OD)/차단되지 않은 OD x 100} - 차단된 네가티브 대조의 OD
사람 안티-HIV에 의한 염소 안티-HIV-HRP 결합체의 최소 차단은 사람 안티-HIV와는 다른 염소 안티-HIV의 결합의 지표였다.
또다른 단계에서, EIA는 염소 항체에서는 항원성이지만 사람 항체에서는 항원성을 갖지 않는 HIV 단백질상의 에피토프를 확인하기 위한 형태이었다. HIV gp120 및 gp41 단백질의 정제된 제조물은, 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이팅함으로써 PBS 중 5 ㎍/ml에서 폴리스티렌 비드상에 코팅되었다. 비드를 0.1 % 트윈 20((PBS/트윈)을 함유하는 PBS로 세척하고, 사용되지 않은 각 비드 위치는 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅함으로써 5 % 소혈청 알부민으로 포화시켰다. 비드는 곧 사용하거나 4 ℃에서 보관하였다. 사람 IgG 안티-HIV(100 ul)(실시예 1)을 각 비드에 가하고 4 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이팅하고, 비드를 PBS/트윈으로 세척하였다. 합성 펩티드를 소혈청 알부민(5 mg/ml) 및 0.1 % 트윈 20을 함유하는 PBS 중에 0.1 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 펩티드(25 ul)를 염소 염소 안티-HIV-HRP 결합체 용액(100 ul)에 가하고, 24 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 혼합물을 HIV로 코팅된 비드 2 셋트에 가하였다. 하나의 셋트는 HIV로 코팅된 비드의 2 개의 세트에 가해진 사람 안티-HIV로 차단하였다. 하나의 셋트는 염소 안티-HIV-HRP 결합체 결합체에 가해진 팹티드로서 동시에 가해진 사람 안티-HIV로 차단하였다. 하나의 함으로써 PBS 중 5 ㎍/ml에서 폴리스티렌 비드상에 코팅되었다. 반응물과 함께 비드를 24 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 비드를 세척하고, 퍼옥시다제 활성을 상기에 설명한 대로 측정하였다. 활성은 HIV 단백질내의 펩티드 위치에 대하여 플롯하였다. 이러한 플롯은 사람 항체에 의해서 인식되지 않았던 염소 HIV 면역 IgG에 의해서 표적된 HIV 단백질의 부위를 나타내었다. 특이적인 합성 펩티드로 결합 억제를 관찰할 때, 부가적인 펩티드가 합성되어 부가적 길이의 펩티드에 의해서 원래 펩티드를 오버랩핑시켰다. 합성 펩티드에 의한 저해 부족은 염소 면역계에 의한 면역학적 표적겨냥의 부족을 나타내는 것으로 생각되었다. 이러한 방법을 사용하여 선 펩티드 에피토프를 연구하였다.
본 발명의 또다른 바람직한 방법에서 EIA는 염소에 의해서 인식되지만 사람 면역계에 의해서 인신되지 않는 HIV 단백질상의 항체 반응적인 에피토프를 확인하기 위하여, 하기 설명된 바와 같이 생성되는 펩티드-퍼옥시다제 결합체를 사용하는 형태이었다. HIV 서열과 유사한 펩티드는 HRP에 공유적으로 결합하여 항체 특이성을 맵핑하는데 사용하기 위한 효소 표지된 펩티드 라이브러리를 생성하였다. 구체적으로, HRP를 1 부 HRP: 10 부 펩티드의 계산된 몰비에서 반응 튜브 중에서 처리하였다. 커플링될 각 펩티드를 각각 미세관 중에서 0.1 내지 1 ml의 부피에서 0.1 내지 1 umol/ml의 농도에서 처리하였고, 이들 각각은 요구되는 결합체의 양 및 펩티드에 대한 몰량에 의존하여 변하였다. 1 내지 10 umol/ml 농도의 HRP를 4 ℃에서 0.1 M 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.8) 중에 용해시키고, 나트륨 퍼코데이트를 가하여 최종 농도 0.02 M를 이루었다. 혼합물은 곧 30 분 동안 혼합 반응시킨 펩티드를 포함하는 미세관 중에서 처리하였다. 펩티드의 아미노 말단 및 HRP 탄수화물 잔기의 산화에 의해서 생성된 알데히드 사이에 생성된 중간 시프는 물 중의 나트륨 보로히드리드(0.2 M)를 가하여 환원시켰다. 세파덱스 G25에서 각 펩티드-퍼옥시다제 결합체의 크로마토그래피를 사용하여 반응물 및 과량의 펩티드를 제거하였다.
바람직한 분석에서, 항체를 사용하여 HIV 바이러스 용해물로부터 제조된 HIV 단백질상의 확인된 에피토프를 브릿징하였고, HIV 에피토프에 반응적인 항체는 퍼옥시다제에 결합된 합성 펩티드 에피토프와 반응할 수 있는 항원-결합 위치를 보유하고 있으므로, 합성 HIV 펩티드는 HRP에 공유적으로 결합하였다. 상기 설명한 바와 같이 HIV 단백질로 비드를 코팅하였다. 코팅된 비드를 염소 안티-HIV IgG와 24 시간 동안 반응시키고, 비드를 세척하고 기질과 반응시켜 퍼옥시다제 활성, 즉 펩티드 결합을 결정하였다. 이러한 방법으로, 합성 펩티드 내에 함유된 단지 정확한 에피토프를 인식하였다. 이 분석에서 염소 반응성의 완전한 에피토프을 확인하였다. 사람 안티-HIV 및 염소 안티-HIV 반응성을 비교하고, 단지 염소 안티-HIV와 반응한 펩티드를 유력한 에피토프 표적으로 선택하였다. 반응성의 차이 때문에 이러한 데이터가 HIV 단백질에 대한 사람과 염소 반응성 사이의 차이를 모두 포함하는 것이라고 생각되지 않고, HIV 단백질상의 아미노산 펩티드 서열 상동성 간의 시 프트(shSHIFT)는 합성 펩티드의 선택에 2차 에피토프 반응성을 잃게 할 수도 있다.
<실시예 9>
치료제로서 항체 효능성
HIV/AIDS의 치료를 위한 치료제로서 항체의 효능을 결정하기 위해서 면역화학적으로 지정된 항체의 군으로 연구를 수행하였다. 구체적으로, HIV 단리물 HIV1MN, HIV1BAL 및 HIV2NZ의 용해물의 혼합물을 실시예 3에서와 같이 처리하여 저분자량 오염물 및 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 제거하고, HIV 단백질을 탈글리코실화하였다. 단백질 혼합물을 분석하고, 하기 HIV1SF2 단백질의 부위와 유사한 펩티드를 포함하는 것을 알게되었다.
gp120 : 아미노산 잔기 4 내지 27에 해당하는 하나의 에피토프 부위 및 아미노산 잔기 54 내지 76에 해당하는 제2의 에피토프 부위;
gp41 : 아미노산 잔기 502 내지 541에 해당하는 에피토프 부위;
역전사효소 헤테로다이머 p66/55 : 아미노산 잔기 254 내지 295에 해당하는 에피토프 부위;
프로테아제 p10 : 아미노산 잔기 69 내지 94에 해당하는 에피토프 부위;
gag 유전자 단백질 p24 : 아미노산 잔기 166 내지 181에 해당하는 에피토프 부위;
gag 유전자 단백질 p17 : 아미노산 잔기 2 내지 23에 해당하는 하나의 에피토프 부위 및 아미노산 잔기 89 내지 122에 해당하는 제2의 에피토프 부위;
gag 유전자 단백질 p7 : 아미노산 잔기 390 내지 410 및 438 내지 443에 해당하는 에피토프 부위.
이러한 아미노산 서열은 감염에 의하거나 환경에 자연적으로 접촉시 사람에게는 면역 반응을 나타내지 않지만 포유동물에서는 면역 반응을 나타내었다.
정제되고 처리된 단백질을 부화시키고, 예비 SDS-PAGE 전기영동법을 사용하여 추가 정제하였고, 필요하다면, 당업계 공지된 방법을 사용하여 각각 세파로스 CL4B에 커플링된 gp 160, gp 41, pp 66/55, p 24, p 17 및 p 10에 대한 시판용 모노클로날 항체(ICN, Costa Mesa, CA 및 미국 매릴란드주 콜롬비아 소재 어드밴스드 바이오-테크놀로지사)를 사용하는 면역친화 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 후, 중요한 각 정제된 HIV 단백질 에피토프를 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 각각 MDP 미세분자에 결합시켰다. HIV-MDP 미세분자 결합체는 약 1 mg 단백질/ml 생리 염수의 최종 농도에서 동몰 농도의 각 HIV 단백질/펩티드를 함유하는 칵테일로서 생성하였다. HIV-MDP 칵테일(0.5 ml)을 스쿠알렌(0.05 % 트윈 80을 함유하는 1.5 ml) 중에 유화시키고, 60 마리의 염소에 각 염소 당 4 내지 6 개 주사 위치에서 피하 주사하였다. 부스터(booster) 면역화는 1 달 간격으로 수행하여 목적하는 면역 반응을 달성하였다. 실시예 8.6에서 서술한 바와 같이, 1 개월 마다 혈청 시료를 매월 부스터를 진행하는 각 염소로부터 얻고, 웨스턴 블롯 분석, HIV 중화 및 효소 면역분석으로 시험하였다. 일단 목적하는 항체 반응이 얻어지면, 박스터(Baxter) A201-A401 오토프레시스(Autophresis) 기계를 사용하여 경정맥으로부터 염소를 혈장반출시켰다. 염소 적혈구를 생리 염수 중에 넣었다. 각 혈장반 출시 각 동물로부터 수집된 혈장 용량은 35000 ml ± 5.0 ml였다.
카프린(Cprine) 면역 혈장은 옥타노산으로 pH를 4.8로 조정한 후, 염산을 가하여 옥타노산과 함께 분별화하였다. 혼합물을 원심분리하고, 여과시킨 후 활성화된 목탄 필터를 통과시켜 덩어리를 제거하고, 옥타노산 농도를 0.05 %로 저하시켰다. 면역글로불린(IgG)을 함유하는 분획을 일련의 칼럼을 통과시켜 정제하였다.
1, 20 mM 포스페이트 완충액을 사용하는 세파덱스 G25
2, 포스페이트 완충액 중에서 평형화시킨 와트만 DE53로 이온 교환
3, 0.9 % 염수 중에서 평형화시킨 세파덱스 G25
최종 칼럼 여액을 살균 여과시킨 후, 목적하는 생물 활성을 갖는 최종 농도 10 mg IgG/ml로 농축시키거나 희석시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과, gp120, p66/55, gp41, p10, p24, p17 및 p7의 7 개의 명확한 바이러스 단백질과 1:100 희석률의 카프린 IgG 면역글로불린의 반응성을 입증하였다. HIV 중화 분석은 실시예 8.3에 기재된 바와 같은 HIV1 래버러토리 및 야생형 균주의 넓은 중화를 나타내었다. 실시예 8.3에 기재된 효소 결합된 면역분석은 목적하는 1:1000 또는 보다 큰 시료 희석율에서 9 개의 에피토프에 대하여 포지티브 반응을 나타내었다. 이러한 기준을 충족시키는 많은 생성물은 기재된 바와 같은 HRG 214의 상표명으로 얻을 수 있고, 부형제없이 0.9 % 염화나트륨 중에 현탁된 10 mg/ml의 살균된 무발열 카프린 IgG로 구성되었다. HRG 214의 활성 당량을 결정하기 위해서 많은 각 생성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 대조와 비교하였다. 활성은 mg 당량/ml으로 나타내었다.
AIDS 정의 기준, 임상학적인 증상 및 연수시작전 30 일 내의 CD4 T 림프구의 수<300 세포/ul과 함꼐 웨스턴 블롯으로 제시된 그들의 HIV 감염의 혈청진단을 기준으로 18 세 이상의 남성 및 임신하지 않은 여성을 선택하였다. 임상적 및 실험실 파라미터를 사용하여 효능을 평가하였다. 임상적 파라미터는 스툴(stool) 일치성 및 횟수, 에너지 수준, 식욕의 변화, 물리적 강도 및 지속성, 및 질적 생명의 전체적인 변화를 포함하여 기회 감염의 변화, 체중 변화, 위장 기능의 변화를 포함하였다. 실험실 파라미터는 CD4 및 CD8 림프구의 수, 선택된 혈액학, 혈액 화학 및 요소분해성 및 가능하다면, PCR에 의한 바이러스 RNA를 측정함으로써 바이러스 로드(load)의 변화를 포함하였다. 연구 결과, 면역화학적으로 고안된 항체의 사용으로 환자는 덜 심한 설사, 에너지 수준의 증가, 식욕 증가, 물리적 강도 및 지속성, 및 질적 생명의 전체적인 향상을 포함하여, 위장 기능의 변화, 체중 증가, 기회 감염의 감소와 함께 임상적으로 향상되었음을 보였다. 실험실 파라미터는 CD4 및 CD8 림프구 수의 증가, 혈액학, 혈액 화학 및 요소분해성의 향상 및 PCR에 의한 바이러스 RNA를 측정시 바이러스 로드(load)의 감소 및 TCID로 측정시 감염성 감소로 향상되었음을 보였다.
상세한 실험실 연구 결과를 표 9.1 내지 9.13에 나타내었다.
<실시예 9.1>
HIV-감염된 환자를 치료하는데 HRG214의 독성 및 효능의 임상적 평가
35명의 HIV 감염된 환자를 HRG214로 치료하였다. 질병 증상 및 발달을 가중시키고 악화시키는 HIV 바이러스를 감소시키는 효능에 대하여 HRG214를 조사하였 다. 환자를 CD4 수/mm3(<200 및 ≥200) 및 치료 규정으로 확정하였다.
그룹 1: HRG214, CD4 <200, n = 11;
그룹 2: HRG214 및 매월 재치료, CD4 <200, n = 6;
그룹 3: HRG214 및 진전시 재치료, CD4 <200, n = 5;
그룹 4: HRG214, CD4 <200, n = 7;
그룹 5: HRG214 및 진전시 재치료(악성종양에 대하여 화학치료를 받는 환자), CD4 <200, n = 6;
그룹 6: 플라세보(Placebo) 대조, CD4 > 500, n = 19;
그룹 6: 플라세보 대조, CD4 > 200 내지 500, n = 3;
치료 그룹의 환자들에게 1 내지 1.5 mg/kg 체중의 HRG214를 매일 주사하였다. CD4 <200의 환자는 매달 3 일 재치료하거나(n=6), HIV 진전의 근거로 재치료하였다(n=6). 부작용은 2 ℉의 미열, 오한, 두통 및 근융통으로 제한하였다. 치료 전후에 임상 화학 측정 및 혈액 측정은 변하기 않았거나 90 일 기간에서 모든 환자에게서 향상되었다. 24 명은 평균 4.4 lbs 증가로 2 내지 22 lbs 체중을 얻었다(p = 0.0014). 악성종양에 대하여 전신 화학요법을 받은 6 환자 중의 4 명은 안정하거나(n=2), 체중 감소하였다(각각 2 및 6 lbs). 체중 증가는 혈청 총 단백질 및 알부민 값의 증가와 직접 연관되었다. 정량적인 HIV-RNA는 모든 치료 그룹에서 감소하였다.
그룹 #: 수행된 일수 총=n, 생존수=s CD4# 전 / 후 CD8# 전 / 후 HIV RNA 전 / 후
총 1HRG214 : 150일, n=11, S=4 153/156 601/699 -18%
총 2HRG214 : 345일, n=6, S=6 44/168 477/1143 -94%
총 3HRG214+ : 469일, n=5, S=3 25/67 705/856 -67%
총 4HRG214 : 405일, n=7, S=7 315/487 970/1164 -94%
총 5HRG214 : 469일, n=6, S=2 43/41 476/592 - 54%
총 6HRG214 : 469일, n=19 909/628 NA NA
총 7HRG214 : 469일, n=3 315/177 NA NA
시간에 따른 CD4/mm3의 비율은 대조군 6 및 7과 비교해 볼 때 모든 치료군에서 감소(p<0.01)하였다. CD4의 지속적인 증가가 군 2, 3 및 4에서 관찰되었다. 미세배양 (TCID)에 의한 감염 측정값은 7-14 일에서 처리하여 측정한 감염성이 2 로그 감소(p<0.001)하였음을 나타내고, 이것은 정량적인 HIV-RNA 측정치로부터는 분명하지 않았다. 수반되는 임상적 변화에서는 임상적인 피로 증후군, 설사, 흡수 불량, 칸디다증, CMV (망막염 제외), 단순포진 및 대상포진, 피부 전염성 연속종, 구강 모 백반, 수척 증후군, 세균성 모낭염 및 폐염과 HIV 관련 말초성 신경장해에서의 현저한 개선과 함께 식욕 및 스테미나가 증가하였다.
HRG214는 HIV 감염 관리에 도움을 주는 신규 약물을 제공하였다.
환자군 2-5에 대한 데이타를 하기에 보다 상세히 제시하였다.
환자군 2
환자 n = 6
1차 목적: HIV 감염에 대한 HRG214 치료의 안전성 및 효능을 1.5 mg/kg/일의 1일 용량으로 28일 동안 매달 재치료 3회를 하여 평가하였다. 임상적 추적 검사는 3년 동안 지속하였다. 환자에게 반복하여 임의의 치료를 다시한다.
결말 지점: 기회주의적 감염, 감염 발병률, 수척 증후군, 말초성 신경 장해에서의 개선을 비롯한 임상적 시험적 매개변수의 표준화, 비정상적 혈액 화학 및 혈액학에서의 개선, CD4 및 CD8과 HIV-RNA의 감소를 PCR로 정량화하였다.
안전성 변수로는 혈액 화학 및 혈액학과, 임상적 매개변수가 있다.
효능 변수로는 PCR에 의한 HIV-RNA의 정량적 분석, CD4 및 CD8 계수가 있다.
추적 검사 기간 = 3 년
추적 검사 시작 일 = > 345 일
인구 통계학적 연구: 환자 n = 6; 시작일 = 1995년 10월 23일, 390일 정도, 생존자 = 6; 사망 = 0; 추적 검사까지 사망 = 0
환자 통계학: CD4 수<50/mm3의 AIDS를 정의하는 기준을 갖는 HIV 양성.
치료 약물(들): HRG-214 - 1.5 mg/kg/일로 매달 재치료
환자군 2
PCR에 의한 정량적 량
TEST 1일 21-28일 60-90일 120-150일 330-390일
평균 4918.3 2092.5 1338 731.8 696.6
표준 에러 2422.6 1222 927.2 433.1 331.2
최대값 10649 4880 3993 1825 1164
최소값 494 23 19 17 15
중간값 4265 1733.5 670 542.5 466
환자군 2
정량적 CD4/mm3
TEST 1일 21-28일 60-90일 120-150일 330-390일
평균 44 52.8 52.8 109.3 167.8
표준 에러 14.2 19.1 16.8 33.2 4.7
최대값 72 96 82 154 189
최소값 5 4 5 11 23
중간값 49.5 55.5 62 136 139
환자군 2
정량적 CD8/mm3
TEST 1일 21-28일 60-90일 120-150일 330-390일
평균 477.5 437 603.3 911.8 1143
표준 에러 157.1 171.8 173.6 228.9 186.7
최대값 869 883 804 1376 1752
최소값 145 63 84 319 576
중간값 448 398.5 762.5 976 1293
환자군 3
환자 n = 5
1차 목적: HIV 감염에 대한 HRG214 치료의 안전성 및 효능을 1.5 mg/kg/일의 1일 용량으로 28일 동안 매달 재치료 3회를 하여 평가하였다. 임상적 추적 검사는 3년 동안 지속하였다. 환자에게 반복하여 임의의 치료를 다시한다.
결말 지점: 기회주의적 감염, 감염 발병률, 수척 증후군, 말초성 신경 장해에서의 개선을 비롯한 임상적 시험적 매개변수의 표준화, 비정상적 혈액 화학 및 혈액학에서의 개선, CD4 및 CD8과 HIV-RNA의 감소를 PCR로 정량화하였다.
안전성 변수로는 혈액 화학 및 혈액학과, 임상적 매개변수가 있다.
효능 변수로는 PCR에 의한 HIV-RNA의 정량적 분석, CD4 및 CD8 계수가 있다.
추적 검사 기간 = 3 년
추적 검사 시작 일 = > 469 일
시작일: 1995년 6월 13일; 380 일 정도, 생존자 = 3; 사망 = 2; 추적 검사까지 사망 = 0,
환자 집단: AIDS로 정의되는 기준을 갖는 HIV 양성 환자. 5 명의 환자 중 5 명이 CD4 < 50/mm3 혈액이었다. PCR에 의한 HIV-RNA의 정량 분석 결과 치료 7 일 (P = 0.0179) 및 21-28일 (P = 0.043) 후에 통계학적으로 두드러진 감소가 나타났다, 60-90 일 째와 120-150일 째에서의 HIV RNA 측정치는 감소하였으나, HIV RNA 값은 증가한 것으로 나타났다. 5 명의 환자 모두를 재 치료 (120에서 150 일 사이에 시작하여 매달 3회 연속으로 투여) 하였다. 재치료 후 HIV RNA에서 통계학적으로 두드러진 (P = 0.0006) 감소가 250일 이후에 관찰되었다. 짝을 이룬 t-검사, 윌콕손 사인드 랭크 시험 (Wilcoxon Signed Rank Test)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
시작 일: 1995년 6월 13일
종결 일: 미정
환자군 2
HIV-RNA PCR에 의한 정량적 량
TEST 1일 7일 21-28일 60-90일 180-210일 240-300일 >380일
평균 21911 10643.2 10962.6 15231.8 18424 9385.2 8217
표준 에러 5003.7 3244.3 222.5 7385.9 5473.5 5436.3 5135
최대값 41182 21223 17679 41922 35129 30412 36412
최소값 12292 4448 3790 2984 4017 1036 756
중간값 18976 6317 11570 6787 16854 4708 4926
환자군 3
정량적 CD4/mm3
TEST 1일 7일 21-28일 60-90일 180-210일 240-300일 >380일
평균 25 30.8 13.8 35 40.4 59.6 67
표준 에러 6.47 8.16 3.01 9.66 13.39 25.72 33.74
최대값 42 51 20 60 82 154 178
최소값 9 8 3 10 8 13 16.01
중간값 26 24 16 42 28 36 42.12
환자군 3
정량적 CD8/mm3
TEST 1일 7일 21-28일 60-90일 180-210일 240-300일 >380일
평균 705.6 633.8 486.4 681.4 570.8 826.6 856.24
표준 에러 137.8 168.2 86 229 120.6 200.9 226
최대값 1152 1037 700 1380 756 1320 1346
최소값 444 220 260 180 101 169 556
중간값 585 828 540 720 639 812 843
환자군 4
환자 n = 7
1차 목적: HIV 감염에 대한 HRG214 치료의 독성 및 효능을 1.5 mg/kg/일의 1일 용량으로 28일 동안 IFN 유도제로 1-7 일 및 21-23 일 째에 평가하였다. 임상적 추적 검사는 3년 동안 지속하였다. 환자에게 반복하여 임의의 치료를 다시한다.
결말 지점: OI, 감염 발명률, 수척 증후군 등의 개선을 비롯한 임상적 매개변수 및 시험적 매개변수의 표준화, 비정상적 혈액 화학 및 혈액학, CD4 및 CD8, HIV-RNA의 감소를 PCR로 정량분석하였다.
추적 검사 기간 = 3 년
추적 검사 시작 일 = > 405 일
인구 통계학적 연구: 환자 n= 7; 시작일: 1995년 8월 25일; 390 일 정도, 생존자 = 7; 사망 = 0; 추적 검사까지의 사망 = 0,
환자 통계학: AIDS로 정의되는 기준 없이 CD4 수 >200인 HIV 양성 환자
치료 약물(들): 28일 동안 1.5 mg/kg/일. 환자에게 반복하여 임의의 치료를 다시한다.
환자군 4
PCR에 의한 HIV-RNA량
시험 1일 21-28일 60-90일 180-210일 330-390일
평균 6078.7 964.3 899.7 658 386.2
표준에러 949.4 639.6 199.1 544 257
최대값 7936 2207 1257 1202 983
최소값 4808 80 569 114 54.1
중간값 5492 606 873 658 432
환자군 4
정량적 CD4/㎟
시험 1일 21-28일 60-90일 180-210일 330-390일
평균 315 302.7 361.3 409.3 486.5
표준에러 72.6 70.3 66.8 72.9 71.8
최대값 429 440 460 540 611
최소값 180 208 234 288 301
중간값 336 260 390 400 435
환자군 4
정량적 CD4/㎟
시험 1일 21-28일 60-90일 180-210일 330-390일
평균 970.7 867.7 1016 1094 1164
표준에러 247.7 158.7 378.8 229.5 235.2
최대값 1464 1180 1770 1550 1672
최소값 685 663 576 820 921
중간값 763 760 702 912 986
환자군 5
환자 n = 6
1차 목적: HRG214 치료의 독성 및 효능을 평가하였다. 임상적 추적 검사는 3년 동안 지속하였다. 환자에게게 임의의 치료를 다시한다.
결말 지점: OI, 감염 발명률, 수척 증후군 등의 개선을 비롯한 임상적 매개변수 및 시험적 매개변수의 표준화, 비정상적 혈액 화학 및 혈액학, CD4 및 CD8, HIV-RNA의 감소를 PCR로 정량분석하였다.
추적 검사 기간 = 3 년
추적 검사 시작일 = > 469 일
시작일: 1995년 6월 13일; 270 일 정도, 생존자 = 2; 사망 = 4 (180에서 210일 사이에 2 명 사망, 240에서 270 일 사이에 1 명 사망, 270 일 이후에 1 명 사망); 추적 검사까지의 사망 = 0,
환자 집단: CD4<200/mm3 혈액을 비롯하여 AIDS로 정의되는 표준을 갖고 카포시 육종이 퍼져 있는 HIV 양성 환자. 환자를 전신 화학요법으로 치료하였다. 180-210 일 사에에 2 명의 환자가 사망하였고 240일 후에 2 명의 환자가 사망하였다. PCR에 의한 HIV-RNA 정량 분석 결과 60-90, 120-150 및 240-270 일에서 감소하였다 (p = 0.018).
짝을 이룬 t 검사 윌콕스, 사인드 랭크 시험 및 만-휘트니 랭크 섬 시험 (Mann-Whitney Rank Sum Test)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
환자군 5
PCR에 의한 HIV-RNA량
시험 1일 21-28일 60-90일 120-150일 180-210일 240-270일
평균 12483.3 16973.7 8373.7 8237.8 8287 4717.5
표준에러 3159.1 6889.1 3081.8 2152.3 2466.6 3609.5
최대값 20233 46586 19514 15249 15570 8327
최소값 442 1242 490 1358 4708 1108
중간값 13682 14510 7027 7392 6435 4717.5
환자군 5
정량적 CD4/㎟
시험 1일 21-28일 60-90일 120-150일 180-210일 240-270일
평균 43.7 20.5 22.3 17.5 12.6 36
표준에러 31.46 12.04 8.45 6.76 4.12
최대값 200 80 48 48 24 36
최소값 4 4 2 2 4 36
중간값 12 9.5 17 11 8 36
환자군 5
정량적 CD4/㎟
시험 1일 21-28일 60-90일 120-150일 180-210일 240-270일
평균 476.3 303.5 415.8 371 326.4 676
표준에러 152.9 62.7 159.1 100.7 96.2 불명확
최대값 1170 540 1152 710 618 676
최소값 98 86 92 62 101 676
중간값 352 271.5 293.5 358 245 676
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36. C. Cabradilla, et al., Bio/Technology 4, 128-133 (1986).
37. Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, 1995).
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40. P. Cuatrecasas, Advances in Enzymology 36, 29 (1972).
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49. M. Fung, et al., J. Virology, 66, 848-56 (1992)

Claims (158)

  1. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 단리물의 용해물을 그에 존재하는 사람 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 제거하는 처리를 하여 단리한 것이며 탈글리코실화시킨 것이고, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 1 종 이상의 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 에피토프 부위를 1 종 이상 포함하는 HIV 단백질을 포함하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 에피토프 부위(들)을 풍부하게 한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 에피토프 부위(들)이 상기 단백질의 25 % 이상을 구성하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에피토프 부위(들)이 상기 단백질의 50 % 내지 95 %를 구성하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보조제가 HIV 단백질과 커플링되는 캐리어 분자를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 폴리-L-리신, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 티로글로불린, 알부민 또는 파상풍 독소를 포함하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 글리코펩티드의 다중 반복부를 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 무라밀 디펩티드의 다중 반복부를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 가교결합된 조성 물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 L-알라닌-D-이소글루타민의 말단 디펩티드를 포함하는 조성물.
  19. (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 에피토프 부위를 1 종 이상 포함하며, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 1 종 이상의 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 합성 펩티드를 포함하는 조성물.
  20. 삭제
  21. 제19항에 있어서, 상기 에피토프 부위내 하나 이상의 아미노산이 변형되어 사람이 아닌 포유동물에게 상기 펩티드를 투여하여 달성되는 면역 반응 또는 MHC 상호작용을 증진시키는 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 변형되어 상기 에피토프 부위가 친수성 아미노산과 소수성 아미노산 사이에 개재된(bracketed) 양친매성 헬릭스가 생성된 것인 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 합성 펩티드의 혼합물을 포함하며, 상기 펩티드가
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 에피토프 부위를 2 개 이상 포함하는 조성물.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제19항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 보조제가 HIV 펩티드와 커플링되는 캐리어 분자를 포함하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 폴리-L-리신, 키홀 림펫 헤모시아닌, 티로글로불린, 알부민 또는 파상풍 독소를 포함하는 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 글리코펩티드의 다중 반복부를 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 무라밀 디펩티드의 다중 반복부를 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 가교결합된 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 L-알라닌-D-이소글루타민의 말단 디펩티드를 포함하는 조성물.
  35. (a) HIV 균주의 용해물로부터 HIV 단백질을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출물로 사람이 아닌 포유동물을 면역화시키는 단계;
    (c) 상기 면역화된 포유동물로부터 항혈청을 수득하는 단계;
    (d) 상기 항혈청을 사람 HIV 항혈청과의 경쟁 면역분석에 사용하여, 상기 항혈청 중의 항체에 의해서는 인식되지만 상기 사람 항혈청 중의 항체에 의해서는 인식되지 않는 HIV 단백질 부위를 확인하는 단계; 및
    (e) 상기 부위 중 어떤 부위가 중화 또는 불활성화 부위인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위의 확인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 중화 또는 불활성화 부위가
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438으로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    인 HIV 단리물 HIV1SF2 단백질의 부위 중 하나를 포함하거나 이에 상동성이 있는 것인 방법.
  37. (a) HIV 단리물의 용해물로부터 단백질을 단리하는 단계;
    (b) 1 종 이상의 상기 단백질 상에서, 제35항의 방법으로 확인된 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프의 아미노산 서열을 갖는 에피토프를 확인하는 단계;
    (c) 상기 단백질을 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 합하는 단계;
    (d) 상기 단백질 및 캐리어로 사람이 아닌 포유동물 숙주를 면역화시키는 단계; 및
    (e) 상기 면역화된 숙주로부터 상기 에피토프에 대한 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 제35항의 방법으로 확인된 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프와 반응하는 항체를 수득하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 용해물에 그에 존재하는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 제거하는 처리를 하는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하기 전에 탈글리코실화시키는 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 에피토프의 아미노산 서열이 사람 단백질 아미노산 서열의 일부인 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 합하기 전에 상기 단백질을 보조제와 접합시키는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 보조제가 거대분자 캐리어를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 거대분자 캐리어가 무라밀 디펩티드의 다중 반복부를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 L-알라닌-D-이소글루타민의 말단 디펩티드를 포함하는 방법.
  45. 제37항에 있어서, 상기 단백질이 둘 이상의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  46. 제37항에 있어서, 상기 중화 또는 불활성화 부위가 외피 당단백질 또는 막내외 단백질의 일부를 포함하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 하나 이상의 상기 중화 또는 불활성화 부위가 외피 당단백질 또는 막내외 단백질의 일부를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 프로테아제 p10의 중화 또는 불활성화 부위를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제37항에 있어서, 상기 에피토프가
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2의 에피토프 부위인 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 단백질이 둘 이상의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 포함하고, 상기 에피토프가 HIV1SF2의 상기 에피토프 부위 중 2 종 이상인 것인 방법.
  51. 제37항 또는 제45항에 있어서, 상기 단백질에 상기 에피토프 부위(들)이 풍부하게 한 것인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 상기 에피토프가 존재하는 상대적인 비율이 1:1 이상이고, 임의의 2 개 에피토프 사이의 양적 차이의 최대값은 10:1인 방법.
  53. (a) 제35항의 방법으로 확인된 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 합성하는 단계;
    (b) 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하는 단계;
    (c) 상기 펩티드 및 캐리어로 사람이 아닌 포유동물 숙주를 면역화시키는 단계; 및
    (d) 상기 면역화된 숙주로부터 상기 에피토프에 대한 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 제35항의 방법으로 확인된 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프와 반응하는 항체를 수득하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 펩티드가 사람 단백질 아미노산 서열의 일부의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 펩티드를 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 합하기 전에 보조제와 접합시키는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 보조제가 거대분자 캐리어를 포함하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 거대분자 캐리어가 무라밀 디펩티드의 다중 반복부를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 무라밀 디펩티드의 다중 반복부가 L-알라닌-D-이소글루타민의 말단 디펩티드를 포함하는 방법.
  59. 제53항에 있어서, 상기 펩티드들의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  60. 제53항에 있어서, 상기 펩티드가 외피 당단백질 또는 막내외 단백질의 일부를 포함하는 중화 또는 불활성화 부위 상의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 1 종 이상의 펩티드가 외피 당단백질 또는 막내외 단백질의 일부를 포함하는 중화 또는 불활성화 부위의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 프로테아제 p10의 중화 또는 불활성화 부위의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  63. 제53항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열이
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프의 아미노산 서열인 것인 방법.
  64. 제59항에 있어서, 상기 펩티드가
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 2 종 이상의 에피토프의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  65. 제59항에 있어서, 상기 펩티드가 존재하는 상대적인 비율이 1:1 이상이고, 임의의 2 개 에피토프 사이의 양적 차이의 최대값은 10:1인 방법.
  66. 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체.
  67. 삭제
  68. 제66항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (a), (b) 또는 (c)를 포함하는 항체.
  69. 제66항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (d), (f), (g), (h) 또는 (i)를 포함하는 항체.
  70. 제66항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (d) 또는 (e)를 포함하는 항체.
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체 2 종 이상의 조합물.
  74. 삭제
  75. 제73항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (a), (b) 또는 (c)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체 조합물.
  76. 제73항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (d), (f), (g), (h) 또는 (i)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체의 조합물.
  77. 제73항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (d) 또는 (e)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체의 조합물.
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 제73항에 있어서, (a), (b) 및 (c)의 각 에피토프를 인식하는 항체를 포함하는 항체 조합물.
  81. 제73항에 있어서, (a), (b), (c) 및 (e)의 각 에피토프를 인식하는 항체를 포함하는 항체 조합물.
  82. 제73항에 있어서, (a), (b), (c)의 각 에피토프 및 (d), (e), (f), (g), (h) 또는 (i) 중 1 종 이상의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하는 항체 조합물.
  83. 제73항에 있어서, (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)의 각 에피토프를 인식하는 항체를 포함하는 항체 조합물.
  84. 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에 제73항에 따른 항체 조합물을 포함하는 조성물.
  85. 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에 제80항에 따른 항체 조합물을 포함하는 조성물.
  86. 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에 제81항에 따른 항체 조합물을 포함하는 조성물.
  87. 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에 제82항에 따른 항체 조합물을 포함하는 조성물.
  88. 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에 제83항에 따른 항체 조합물을 포함하는 조성물.
  89. 제66항에 있어서, 검출용 방사성동위원소 또는 형광성 태그에 결합된 항체.
  90. 삭제
  91. 제66항에 따른 항체와 아시데-3'데옥시티미딘, 2',3'-디데옥시시티딘, 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로시티딘을 포함하는 조성물.
  92. 제1항의 단백질과 생리학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  93. 제92항에 있어서, 상기 단백질이 거대분자 캐리어에 커플링된 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 캐리어가 무라밀 디펩티드 미립자인 조성물.
  95. 제19항에 기재된 합성 펩티드 1 종 이상과 생리학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 펩티드가 거대분자 캐리어에 커플링된 조성물.
  97. 제96항에 있어서, 상기 캐리어가 무라밀 디펩티드의 미립자인 조성물.
  98. 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 1 종 이상 포함하는, HIV로 감염된 사람에서 HIV 감염을 억제하기 위한 제약 조성물.
  99. 삭제
  100. 제98항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (a), (b) 또는 (c)을 포함하는 제약 조성물.
  101. 제98항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (d), (f), (g), (h) 또는 (i)를 포함하는 제약 조성물.
  102. 제98항에 있어서, 상기 단백질이 탄수화물-고갈된 (d) 또는 (e)를 포함하는 제약 조성물.
  103. 제98항에 있어서, 상기 항체를 체중 1 kg 당 0.1 내지 200 mg의 1 일 투여량으로 투여하기 위한 제약 조성물.
  104. 제98항에 있어서, 항체 조합물을 투여하기 위한 것이며 상기 항체 각각의 서로에 대한 비율이 10배를 초과하지 않는 제약 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 상기 항체 각각의 서로에 대한 비율이 1:1인 제약 조성물.
  106. 제98항에 있어서, 상기 항체가 거대분자 캐리어에 접합된 제약 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 상기 캐리어 분자가 무라밀 디펩티드 미립자인 제약 조성물.
  108. 삭제
  109. 제98항에 있어서, 상기 항체를 2 종 이상 포함하는 제약 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (a), (b) 또는 (c)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 제약 조성물.
  111. 제109항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (d), (f), (g), (h) 또는 (i)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 제약 조성물.
  112. 제109항에 있어서, 상기 항체 중 1 종 이상이 탄수화물-고갈된 (d) 또는 (e)의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 제약 조성물.
  113. 삭제
  114. 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    를 포함하는 HIV1SF2 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 1 종 이상 포함하는, HIV로 감염된 환자에서 HIV 생활 주기의 하나 이상의 필수 단계를 중화 또는 불활성화시키기 위한 제약 조성물.
  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 제114항에 있어서, 상기 항체를 2 종 이상 포함하는 제약 조성물.
  118. 제114항에 있어서, (a), (b) 및 (c)의 각 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 포함하는 제약 조성물.
  119. 제114항에 있어서, (a), (b), (c) 및 (e)의 각 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 포함하는 제약 조성물.
  120. 삭제
  121. 제114항에 있어서, 상기 항체가 거대분자 캐리어에 접합된 제약 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 상기 캐리어가 무라밀 디펩티드 미립자를 포함하는 제약 조성물.
  123. 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않는
    (a) gp120의 아미노산 잔기 4로부터 아미노산 잔기 27에 해당하는 부위;
    (b) gp120의 아미노산 잔기 54로부터 아미노산 잔기 76에 해당하는 부위;
    (c) gp41의 아미노산 잔기 502로부터 아미노산 잔기 541에 해당하는 부위;
    (d) 역전사효소 헤테로다이머 p66/55의 아미노산 잔기 254로부터 아미노산 잔기 295에 해당하는 부위;
    (e) 프로테아제 p10의 아미노산 잔기 69로부터 아미노산 잔기 94에 해당하는 부위;
    (f) gag 유전자 단백질 p24의 아미노산 잔기 166으로부터 아미노산 잔기 181에 해당하는 부위;
    (g) gag 유전자 단백질 p7의 아미노산 잔기 390으로부터 아미노산 잔기 410 및 아미노산 잔기 438로부터 아미노산 잔기 443에 해당하는 부위;
    (h) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 2로부터 아미노산 잔기 23에 해당하는 부위; 또는
    (i) gag 유전자 단백질 p17의 아미노산 잔기 89로부터 아미노산 잔기 122에 해당하는 부위
    인 HIV 단리물 HIV1SF2의 중화 또는 불활성화 부위 중 하나에 존재하는 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 1 종 이상 포함하는, HIV로 감염된 환자에서 HIV 감염을 예방하기 위한 제약 조성물.
  124. 삭제
  125. 삭제
  126. 제123항에 있어서, 상기 항체를 2 종 이상 포함하는 제약 조성물.
  127. 제123항에 있어서, (a), (b) 및 (c)의 각 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 포함하는 제약 조성물.
  128. 제123항에 있어서, (a), (b), (c) 및 (e)의 각 에피토프를 인식하고 이와 반응하는 항체를 포함하는 제약 조성물.
  129. 삭제
  130. 제66항의 항체를 항원-항체 복합체 형성에 유리한 조건 하에서 HIV 감염이 의심되는 개인으로부터의 체액 시료와 합하고 상기 항체의 HIV 항원 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는 항체-항원 분석에 사용되는 제66항의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV 감염이 의심스러운 개인으로부터의 생물학적 유체 시료 중에서 HIV 존재를 검출하기 위한 조성물.
  131. 제66항의 항체를 효소와 접합시켜 항원-항체 복합체 형성에 유리한 조건 하에 HIV 감염이 의심되는 개인으로부터의 체액 시료와 접촉시키고 상기 항체의 HIV 항원 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는 효소 면역 분석에 사용되는 제66항의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, HIV 감염이 의심스러운 개인에서 HIV 존재를 검출하기 위한 조성물.
  132. 제66항에 따른 항체를 기판 또는 고상 지지체에 고정시키고, 상기 고정된 항체를 항체와 단백질 사이의 면역 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 단백질을 함유하는 용액과 접촉시키고, 항체에 결합된 상기 단백질로부터 결합되지 않은 단백질을 분리하고, 상기 항체로부터 상기 결합된 단백질을 유리시키고, 상기 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 단백질 용액으로부터 HIV 단백질의 중화 또는 불활성화 부위의 에피토프 1 종 이상을 포함하는 단백질의 정제 방법.
  133. 삭제
  134. 삭제
  135. 삭제
  136. 삭제
  137. 삭제
  138. 삭제
  139. 삭제
  140. 삭제
  141. 삭제
  142. 삭제
  143. 삭제
  144. (a) 바이러스 용해물로부터 바이러스 단백질을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출물로 사람이 아닌 포유동물을 면역화시키는 단계;
    (c) 상기 면역화된 포유동물로부터 항혈청을 수득하는 단계;
    (d) 상기 항혈청을 사람 바이러스 항혈청과의 경쟁 면역분석에 사용하여, 상기 항혈청 중의 항체에 의해서는 인식되지만 상기 사람 항혈청 중의 항체에 의해서는 인식되지 않는 바이러스 단백질 부위를 확인하는 단계; 및
    (e) 상기 부위 중 어떤 부위가 중화 또는 불활성화 부위인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위의 확인 방법.
  145. (a) 바이러스 용해물로부터 단백질을 단리하는 단계;
    (b) 1 종 이상의 상기 단백질 상에서, 제144항의 방법으로 확인된 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위 상의 에피토프의 아미노산 서열을 갖는 에피토프를 확인하는 단계;
    (c) 상기 단백질을 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 합하는 단계;
    (d) 상기 단백질 및 캐리어로 사람이 아닌 포유동물 숙주를 면역화시키는 단계;
    (e) 상기 면역화된 숙주로부터 상기 에피토프에 대한 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 제144항의 방법으로 확인된 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프와 반응하는 항체를 수득하는 방법.
  146. 제145항에 있어서, 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하기 전에 사람 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 제거하고 탄수화물을 제거하는 처리를 하는 것인 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하기 전에 무라밀 디펩티드 미립자를 포함하는 거대분자 캐리어에 접합시키는 것인 방법.
  148. (a) 제144항의 방법으로 확인된 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 합성하는 단계;
    (b) 상기 펩티드를 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 합하는 단계;
    (c) 상기 펩티드 및 캐리어로 사람이 아닌 포유동물 숙주를 면역화시키는 단계; 및
    (d) 상기 면역화된 숙주로부터 상기 에피토프에 대한 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 감염에 의하거나 환경에의 노출시에 사람에서는 면역 반응을 유발하지 않지만 사람이 아닌 포유동물에서는 면역 반응을 유발하는 제144항의 방법으로 확인된 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위상의 에피토프와 반응하는 항체를 수득하는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하기 전에 사람 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 제거하고 탄수화물을 제거하는 처리를 하는 것인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 단백질을 생리학적으로 허용되는 캐리어와 합하기 전에 무라밀 디펩티드 미립자를 포함하는 거대분자 캐리어에 접합시키는 것인 방법.
  151. 삭제
  152. 삭제
  153. 삭제
  154. 삭제
  155. 삭제
  156. 삭제
  157. 삭제
  158. 제148항의 방법으로 수득된 항체를 기판 또는 고상 지지체에 고정시키고, 상기 고정된 항체를 항체와 단백질 사이의 면역 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 상기 단백질을 함유하는 용액과 접촉시키고, 상기 항체에 결합된 단백질로부터 결합되지 않은 단백질을 분리하고, 상기 항체로부터 결합된 단백질을 유리시키고, 상기 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 단백질 용액으로부터 바이러스 단백질의 중화 또는 불활성화 부위의 에피토프 1 종 이상을 포함하는 단백질의 정제 방법.
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