MXPA02010374A - Composiciones y metodos para tratar infecciones virales. - Google Patents

Abstract

Los metodos y las composiciones para tratar, diagnosticar y prevenir un virus, comprenden administrar a un paciente anticuerpos que reaccionen con regiones de las proteinas virales y den por resultado la neutralizacion de la infectividad y la inactivacion de los eventos funcionalmente esenciales en el ciclo de vida del virus; los anticuerpos reconocen los epitopes virales que no pueden provocar una respuesta inmunologica en el hombre cuando se encuentran debido a infeccion o naturalmente en el ambiente; en una modalidad preferida la invencion provee composiciones y metodos utiles en el tratamiento y el diagnostico de infecciones por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR INFECCIONES VIRALES CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere en general al tratamiento y la prevención de infecciones virales. En particular la invención provee composiciones y métodos para la producción de anticuerpos y péptidos útiles en el tratamiento y el diagnóstico de infecciones por virus de ¡nmunodeficiencia humana (VIH).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El diagnóstico, el tratamiento y la prevención de infecciones virales es un foco primario de muchos investigadores médicos. Aunque se conoce las composiciones y los métodos de diagnóstico, tratamiento y vacuna contra diversas infecciones virales, todavía hay varios virus que son difíciles de detectar en el hombre y para los cuales no se conoce métodos efectivos de tratamiento ni de vacuna. De ellos, uno de los más significativos, por supuesto, es el VIH. El agente infeccioso responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y sus fases prodrómicas, el complejo relacionado con el SIDA (CRS) y el síndrome de linfadenopatía (SLA), es un retrovirus linfotrófico denominado VLA, VLTH-III, VRA y, recientemente, VIH, por recomendación del Comité Internacional sobre Taxonomía de los Virus (Ref 299). La nomenclatura en la presente emplea esas recomendaciones para los virus designados (trasladadas al español) asociados con el SIDA y sus cepas. Las referencias históricas a las cepas, que incluyen VLA y VRA-2 5 se denominan ahora VIH1 LAI y VIH1SR2, respectivamente. A medida que la difusión del VIH alcanza proporciones pandémicas, se vuelve una preocupación general el tratamiento de los individuos infectados y la prevención de la transmisión a los individuos no infectados, en riesgo de exposición. Se ha buscado como objetivo una i o variedad de estrategias terapéuticas en diferentes etapas del ciclo de vida del virus, y han sido señaladas por Mitsuya y Broder, 1987, Nature 325:773. Un enfoque involucra el uso de anticuerpos que se unen al virus e inhiben la reproducción viral, ya sea interfiriendo con la introducción del virus dentro de las células anfitrionas o por algún otro mecanismo. Una vez que el/los 15 componente(s) viral(es) susceptible(s) a la intervención del anticuefo son identificados, era de esperar que se pudiera generar reactividad de anticuefo suficiente para neutralizar la infectividad del virus, y se administrara a pacientes infectados con VIH en la forma de inmunoglobulinas o anticuefos purificados, y que ese procedimiento de inmunización pasiva alterara o 20 invirtiera el avance de la infección por VIH. Adicionalmente, era de esperar que la vacuna de los individuos no infectados con epítopes seleccionados, modificados para incrementar las interacciones de MHC, diera protección contra infección subsecuente, después de la exposición al VIH.

Se cree que las glicoproteínas de envolvente de la mayoría de los retrovirus, reaccionan con moléculas receptoras presentes en la superficie de células susceptibles, determinando de esa manera la infectividad del virus para ciertos anfitriones. Los anticuerpos que se unen a esas glicoproteínas de envolvente pueden bloquear la interacción del virus con los receptores de la célula, neutralizando la infectividad del virus. Véase, en general, The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze, ed., 1973); y RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss y otros, eds., 1982); González-Scarano y coautores, 1982, Virology, 120:42 (virus La Crosse); Matsuno e Inouye, 1983, Infecí. Immun., 39:155 (Virus de la diarrea neonatal de terneras); y Mathews y coautores, 1982, J. Immunol., 129:2763 (virus de encefalomielitis). Hasta la actualidad, las estrategias terapéuticas dirigidas a desatar respuestas inmunológicas protectoras en el hombre, por vacuna con proteínas/péptidos de VIH, han fallado. Además, ni los anticuerpos neutralizadores de elevado título, recuperados de pacientes infectados con VIH, ni los anticuefos monoclonales producidos en ratones, han tenido éxito en alterar el avance de la infección por VIH a SIDA y a la muerte. Hay necesidad en la técnica de identificar blancos inmunológicos alternativos en el VIH, que desaten respuestas inmunológicas que modifiquen el curso de la infección por VIH. La estructura general del VIH es la de un núcleo de ribonucleoproteína rodeado por una envolvente que contiene lípidos, que adquiere el virus durante el curso de gemación a partir de la membrana de la célula anfitriona infectada. Embebidas dentro de la envolvente y proyectándose hacia afuera, están las glicoproteínas virales codificadas. Las glicoproteínas de envolvente del VIH son sintetizadas inicialmente en la célula infectada, como una molécula precursora de 150,000-160,000 dalton (gp 160), que son procesadas entonces en la célula a un fragmento N-terminal de 110,000-120,000 dalton (gp 120) para generar la glicoproteína externa; y un fragmento C-terminal de 41,000-45,000 dalton (gp 41) que es la glicoproteína de envolvente de transmembrana. Por las razones discutidas más arriba, la glicoproteína gp 120 del VIH ha sido objeto de mucha investigación como un blanco potencial para interrumpir el ciclo de vida del virus. Los sueros de individuos infectados con VIH han demostrado que neutralizan el VIH in vitro, y los anticuerpos que se unen a gp 120 están presentes en esos sueros (Robert-Guroff y coautores, 1985, Nature 316:72; Weiss y coautores, 1985, Nature, 316:69; y Mathews y coautores, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 83:9709). El gp 120 purificado y recombinante, estimuló la producción de anticuefos de suero neutralizadores cuando se usó para inmunizar animales (Robey y coautores, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 83: 7023; Las y y coautores, 1986, Science, 233:209) y un humano (Zagury y coautores, 1986, Nature 326:249). La unión de la molécula gp 120 al receptor CD4 también se ha demostrado y se ha demostrado que los anticuefos monoclonales que reconocen ciertos epítopes del receptor CD4 bloquean la unión de VIH, la formación de sincitios y la infectividad. McDougal y coautores (1986, Science, 231:382) y Putney y coautores (1986, Science, 234:1392), iniciaron la neutralización de anticuerpos del suero en animales, después de inmunizarlos con una proteína de fusión recombinante que contenía la mitad terminal carboxilo de la molécula gp 120 y demostraron adicionalmente que la glicosilación de la proteína de envolvente es innecesaria para neutralizar la respuesta al anticuerpo. Poco después de la infección por VIH, el sistema inmunológico del hombre responde al virus tanto con producción de anticuefo como con respuestas inmunológicas mediadas por las células. Un repaso de las respuestas inmunológicas a los retrovirus ha sido publicado (Norley, S. Y Kurth R., 1994: The Retroviridae, tomo B, J. A. Levy, ed., pp. 363-464, Plenum Press). Los anticuefos humanos, específicos para numerosas proteínas de VIH, incluyendo gp 160, gp 120, p 66, p 55, gp 41, p 32, p 24 y p 17, han sido informados (Carison, 198, J. Am. Med. Assoc., 206:674). La respuesta inicial de anticuefo en el hombre para el VIH está dirigida a p17 y p24, seguida por gp 120/160, luego por gp 41 , p66/55 y finalmente, p32 (Lange, 35 y coautores, 1986, Br. Med. J., 292-228). A medida que avanza la infección por VIH a SIDA, los niveles de anticuefo para P17 y P24 caen notablemente a límites indetectables y son reemplazados por antignemias para p17 y p24. Los títulos de anticuefo para p32 y p55 también declinan, pero en menor grado (McDougal y coautores, 1987, J. Clin. Invest., 80:316). Sin embargo, persisten cantidades sustanciales de anticuerpos para gp160/120 durante todo el curso de la infección con VIH. Durante las fases tempranas de la infección con VIH se observa una elevación en las inmunoglobulinas totales, y esta cantidad incrementada de anticuefo es específica para VIH y está dirigida predominantemente a gp 120 (Amadori y coautores, 1988, Clin.

Immunol. Immunopathol., 46:342; Amadori y coautores, 1989, J. Immunol., 143:2146). Los posibles mecanismos para esta hiper gamma-globulinemia específica para VIH han sido resumidos por Barker E y coautores, 1995: The Retroviridae, tomo 4, J. A. Levy, ed. Pp. 1-96, Plenum Press. Las propiedades funcionales y los epítopes seleccionados como destino por esos anticuerpos producidos durante la infección por VIH, han sido descritos e incluyen epítopes que son susceptibles a la neutralización mediada por anticuerpo. Estos epítopes de destino primarios están localizados primariamente en la proteína gp160 de envolvente (gp120/gp41) y en la proteína gag p17; para resumen, véase Levy, 1994, Am. Soc. Micro.; Nixon y coautores, 1992, Immunol., 76: 515. Los anticuefos neutralizadores para la proteína de envolvente de VIH han sido identificados y unidos a dominios conservados y divergentes en gp 120. Estas incluyen las regiones localizadas a las regiones de unión CD4 (Linsley y coautores, 1988 y Thali y coautores, 1992); los dominios de rizo variables segundo y tercero (Fung y coautores, 1992 y Haigwood y coautores, 1990) y las porciones carbohidrato (Benjouad y coautores, 1992 y Feizi y Larkin, 1990). Otros sitios de neutralización han sido identificados en la porción externa de gp 41 y un sitio de unión e p17 (Changh y coautores, 1986). Los primeros estudios sugirieron que la presencia de anticuefos neutralizantes conducía a un resultado clínico más favorable (Robert-Guroff y coautores, 1985). Sin embargo, esos estudios emplearon sueros seleccionados con capacidad neutralizadora elevada contra las cepas de laboratorio de VIH y no contra aislados de VIH autólogo (Homsy y coautores, 1990; Tremblay y Wainberg, 1990). La investigación subsecuente demostró que el anticuerpo autólogo tenía poca o ninguna actividad neutralizante contra los aislados de VIH autólogo (Homsy y coautores, 1990). La falta de susceptibilidad a la neutralización mediada por el anticuerpo, en presencia de un anticuefo neutralizador, se cree que sea el resultado del desarrollo de mutantes de escape que aparecen después de la seroconversión (Arendrup y coautores, 1992) y durante toda la infección conforme se producen nuevas especificidades de anticuefo. La relevancia clínica de los anticuefos neutralizadores producidos como consecuencia de la infección por VIH no está clara. Sin embargo, es claro que, a pesar de una respuesta inmunológica vigorosa al VIH en los individuos infectados con VIH, predomina el avance al SIDA y, finalmente, a la muerte, como consecuencia de la disfunción inmunológica. Consecuentemente, se busca nuevos métodos de tratamiento.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Es un aspecto de esta invención identificar las regiones neutralizadoras de proteínas virales, que no pueden desatar respuestas inmunológicas en el hombre, pero que sí provocan respuestas inmunológicas en mamíferos no humanos y producir anticuerpos reactivos con esas regiones. Es otro objetivo de esta invención utilizar esas regiones neutralizadoras identificadas, de las proteínas, y los anticuefos reactivos con ellas, en el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de enfermedades provocadas por el virus. Otros objetivos de esta invención serán aparentes de la descripción de la invención detallada más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención se provee métodos y composiciones para el tratamiento, el diagnóstico y la prevención de infección viral mediante el uso de anticuerpos que reaccionan con regiones de proteínas virales para neutralizar e inactivar eventos funcionalmente esenciales en el ciclo de vida del virus. Los anticuefos reconocen epítopes virales que no pueden desatar una respuesta inmunológica en humanos, cuando se encuentran durante la infección o por exposición ambiental, pero que sí provocan una respuesta inmunológica en mamíferos no humanos.

Se identifica los epítopes seleccionados que reaccionan con anticuerpos antivirales no humanos, pero no con anticuerpos antivirales humanos. Esos epítopes escapan a la vigilancia del sistema inmunológico humano al imitar molecularmente proteínas humanas y, en algunos casos, están compuestos de aminoácidos susceptibles a la descomposición enzimática en células procesadoras de antígeno. Los epítopes deseados son divididos enzimáticamente por enzimas humanas y, por consiguiente, no son procesados por la presentación inmunológica. Los péptidos que representan esos epítopes pueden ser sintetizados, modificados opcionalmente y conjugados a un adyuvante macroportador para desatar respuestas de anticuerpo en no humanos. El adyuvante preferido es una micropartícula que consta de repeticiones múltiples del dipéptido muramilo extraído de Propionibacterium acini. Los anticuefos y los péptidos de esta invención pueden ser usados en configuraciones de inmunoanálisis para identificar especies de epítopes específicos y para cuantificar los antígenos virales en tejidos y fluidos humanos. En una modalidad preferida, la invención provee composiciones y métodos de anticuefo y péptido, útiles en el tratamiento y el diagnóstico de individuos infectados con el virus. En una modalidad preferida, el virus de que se trata es VIH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones novedosas y métodos novedosos para diagnosticar y neutralizar infecciones virales. La invención será descrita detalladamente enfocándola sobre una modalidad preferida, en la que el virus de interés es el VIH. Sin embargo, se debe entender que los principios de la invención pueden ser usados para identificar regiones neutralizadoras de proteínas de otros virus y para producir anticuerpos reactivos con esas proteínas, que pueden ser usados para diagnosticar, tratar y prevenir infecciones provocadas por esos otros virus también. Haciendo énfasis ahora en el VIH, esta invención provee composiciones novedosas y métodos novedosos para neutralizar infecciones por VIH y para prevenir o inhibir sustancialmente la infectividad por VIH, la transmisión de célula a célula y la producción de virus en el anfitrión infectado. Más específicamente, las secuencias de proteína de VIH que contienen epítopes que no pueden desatar una respuesta inmunológica en el hombre, cuando se encuentran mediante infección o naturalmente por medio del ambiente, son utilizadas como se describe detalladamente más adelante para producir anticuefos en mamíferos no humanos, que pueden ser administrados para neutralizar la infectividad de VIH, facilitar la muerte de los linfocitos CD4 infectados e inactivar pasos esenciales en el ciclo de vida del VIH. El término "región neutralizadora" o "región neutralizante" indica aquellas porciones del VIH, particularmente proteínas de VIH, que contienen segmentos de aminoácido que definen uno o más epítopes reactivos con anticuerpos que, ya sea individualmente o en combinación con otros anticuerpos de la presente invención, son capaces de neutralizar infecciones por VIH. Los análisis adecuados para evaluar la neutralización son bien conocidos y pueden incluir análisis que miden la reducción de infecciones por VIH en líneas de células T, la reducción de unidades formadoras de placa de pseudotipos VSV (VIH) que llevan las glicoproteínas de envolvente de VIH, pruebas de inhibición sincitial y pruebas de unión de virión-receptor. El término "región inactivadora" indica aquellos segmentos de las proteínas de VIH que contienen uno o más epítopes que, cuando se los hace reaccionar con anticuefos de la presente invención, ya sea individualmente o en combinación, inactivan eventos funcionalmente importantes en el ciclo de vida de VIH. Los análisis adecuados para evaluar la destrucción, mediada por anticuerpos, de linfocitos infectados con VIH, son bien conocidos y pueden incluir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuefo, lisis mediada por complemento y análisis de matador natural (NK). Los análisis adecuados para medir la inactivación mediada por anticuefo, de pasos esenciales en el ciclo de vida del VIH incluyen análisis que determinan la inactivación de transcriptasa inversa o que miden la actividad de polimerasa y proteasa, o que evalúan los cambios dependientes del complemento, mediados por anticuefo, en la permeabilidad de cápsido nuclear, que expone el ARN viral a la degradación por ribonucleasa. Cuando se desea, se puede comparar la actividad neutralizadora con la reactividad al anticuerpo en análisis inmunoquímicos, tales como inmunofluorescencia, inmunoteñido, inmunoanálisis enlazado con enzima y radioinmunoanálisis. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los epítopes que son funcionalmente importantes en el ciclo de vida del VIH, pero que no son inmunogénicos en el hombre, pueden ser identificados y caracterizados empleando anticuefos producidos en especies de mamíferos seleccionadas, diferentes del hombre. Además, se ha descubierto que la carencia de responsividad inmunológica en el hombre, a esas regiones, es una función de la imitación molecular y la falta de eventos asociados con MHC, que incluyen la presentación de antígeno a través de eventos asociados con MHC HLA de clase 1 y HLA de clase 2. Con la imitación molecular, se ve que el epítope es autológico y no responde a circunstancias por debajo de las normales. Con la falta de eventos asociados con MHC en la presentación de antígeno, están involucrados varios pasos y la falla de cualquier paso puede dar por resultado la ausencia de una respuesta inmunológica al antígeno. Las regiones de péptido que contienen epítopes de traslape múltiple y los anticuerpos a esos epítopes, han sido producidos y están mostrados para neutralizar e inactivar pasos esenciales en el ciclo de vida de VIH in vitro. Además, se ha tratado pacientes infectados con VIH, que ya tienen SIDA, con anticuefos para esas regiones de péptido, lo que da por resultado una reducción rápida en la infectividad llevada en la sangre, medida por la dosis infecciosa cultivable total (TCID, acrónimo por su designación en inglés: Total Culturable Infectious Dose). El tratamiento de pacientes crónicos de SIDA con estos anticuerpos, ha dado por resultado notable mejora clínica, que incluye ganancia de peso, resolución de infecciones oportunistas, incidencia disminuida y severidad disminuida de las infecciones y menos visitas médicas, así como la resolución de la neuropatía asociada con VIH. Los pacientes adicionalmente han mostrado recuperación inmunológica, como se define por una reducción del ARN de VIH, aumento en el número de CD4, disminución en el número de CD8 y restablecimiento del sistema de citocina asociado con números mejorados de CD4 y CD8, y su función.

IDENTIFICACIÓN DE EPITOPES Y PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS La mayoría de las reacciones inmunológicas tienen como destino epítopes inmunodominantes. Los epítopes de VIH muy frecuentemente son identificados y mapeados por diversos métodos inmunológicos que emplean antisueros para VIH, reactividad citotóxica de linfocito T a los blancos de epítope de VIH, y presentación de antígeno auxiliar de linfocito de epítopes de VIH. Se puede emplear los péptidos sintéticos de secuencia conocida, que reproducen o imitan la secuencia de VIH, de manera competitiva y no competitiva, utilizando análisis bien conocidos para confirmar esas observaciones. Se debe entender que la estimulación del sistema inmunológica puede conducir ya sea al incremento o a la supresión de la respuesta inmunológica. Los factores que rigen esto incluyen: A. La subpoblación de linfocitos estimulada por el inmunógeno (supresor contra auxiliar). B. El microambiente, que incluye la población de células que reside allí, que está en contacto primero con el inmunógeno. C. El tipo de citocinas presentes en el microambiente en el momento en que la célula efectora hace contacto con el inmunógeno. D. El tipo de citocinas provocadas después que la célula efectora hace contacto con el inmunógeno. E. La composición estructura y bioquímica del inmunógeno. F. La secuencia de aminoácidos del inmunógeno y su susceptibilidad a la degradación por proteasa, mediante las proteasas del microambiente. De experimentos preliminares se determinó que las siguientes propiedades eran fundamentalmente importantes para determinar el valor potencial de ciertas proteínas y ciertos péptidos, para uso en la producción de anticuerpos que están destinados a aplicación en inmunoterapia pasiva, en ei tratamiento o paliación de procedimientos de enfermedad en el hombre y, en particular, la infección con VIH en todas las etapas, incluyendo el SIDA: A. El inmunógeno debe carecer de determinantes de epítope que sean expresadas en células humanas y tejidos humanos, cuando se los emplea para producir el anticuefo para uso en inmunoterapia pasiva, con las siguientes excepciones: 1. La distribución de antígeno está restringida a sitios secuestrados y/o no disponibles para el anticuerpo; 2. Se expresa el antígeno durante las fases de desarrollo que permiten el uso de anticuerpo en momentos específicos durante el ciclo de desarrollo, cuando el antígeno no está disponible. 3. El sitio de epítope dentro del anfitrión no está adyacente a una estructura vital. 4. La distribución de antígeno en la célula anfitriona se hace a una densidad inferior a la necesaria para producir daños, pero favorable sobre el blanco deseado, lo que da por resultado la dirección al destino selectiva. 5. La razón de destino o blanco a normal debe ser suficientemente diferente y favorecer el suministro de anticuerpo al destino o blanco deseado. B. El número de repeticiones de péptido suministradas a una célula que presenta antígeno, influye directamente en la magnitud de la respuesta inmunológica. C. El epítope no debe estar presente en fluidos del cuerpo a concentraciones que neutralizaran el anticuerpo y previnieran la dirección al destino o blanco. Hasta ahora el desarrollo de vacunas se ha enfocado en diseñar mejor tecnología para amplificar las respuestas a los destinos a los que responde el sistema inmunológico del hombre, y la inmunoterapia pasiva ha dado resultados que no son concluyentes. Se describe aquí destinos o blancos alternativos en VIH que no desatan eventos inmunológicos en el hombre, así como una nueva configuración para suministrar antígeno, que da por resultado reacciones inmunológicas al VIH no alcanzables previamente. Los métodos descritos aquí se enfocan en el tratamiento de VIH y SIDA, pero se debe entender que las formulaciones de esta invención tienen amplia aplicación. La respuesta de anticuerpo en cabras demuestra la utilidad de la invención por medio de la producción de anticuefo a los destinos clave, en VIH, y a manera de tratamiento que da por resultado mejora clínica del SIDA.

Esta tecnología tiene amplia aplicación en el desarrollo de vacunas. La inducción inmunológica satisfactoria al desafío con antígeno requiere la presentación de múltiples repeticiones de epítope por una célula que presenta antígeno (APC, acrónimo por su designación en inglés: Antigen-Presenting Cell) durante eventos MHC. Los epítopes que son muy inmunogénicos tienen una configuración antipática con un aminoácido hidrófobo en un extremo, un aminoácido hidrófilo en el otro extremo, contienen aminoácidos consistentes con la formación de las espirales antipáticas, es decir, carecen de aminoácidos rompedores de espiral, tales como prolina, y carecen de carbohidrato. Las secuencias que carecen de aminoácidos que sean susceptibles a la degradación de proteasa por proteasas presentes en el microambiente, son especialmente convenientes. Para identificar los blancos o destinos inmunológicos en el VIH con importancia funcional, se determinó las regiones inmunogénicas en las proteínas relacionadas con VIH en especies animales diferentes del hombre. Se inmunizó cabras con lisato de VIH purificado, con y sin grupos caFohidrato eliminados. La eliminación de residuos carbohidrato de las proteínas de VIH tiene poco efecto sobre la respuesta inmunológica a las proteínas pero puede exponer epítopes ocultos. Los lisatos de VIH obtenidos comercialmente fueron purificados adicionalmente para eliminar las proteínas de los orígenes del cultivo de tejido, incluyendo los antígenos de HLA clase 1 humanos, los antígenos HLA de clase 2 y la beta-2-microglobulina. Después de la inmunización se probó los antisueros de cabra empleando metodología de inmunoanálisis competitivo para identificar los péptidos de VIH no reconocidos por anticuefos reunidos de pacientes infectados con VIH. Se preparó depósitos de antisueros VIH humanos de sueros de pacientes seleccionados con elevada actividad neutralizadora y de manchado Western, y se los emplea como anticuefos competitivos, usando métodos de inmunoanálisis competitivo comunes y corrientes. Se identificó un amplío espectro de anticuerpos de cabra que reaccionaba con determinantes de VIH inmunológicamente distintos de los reconocidos por los depósitos de antisueros anti-VIH humanos. Los expertos en la materia reconocerán que podría usarse otras especies animales para producir anticuefos para esos epítopes y que dichos anticuerpos podrían funcionar en reacciones mediadas por ADCC y su complemento. Otras especies animales adecuadas para la producción de anticuerpos incluyen, pero sin limitación a ellas: ovejas, conejos, caballo, reses y ratones.

La reactividad de epítope de los anticuefos anti-VIH se caracterizó por usando péptidos 12-méricos que cubren las secuencias lineales de aminoácidos de VIHQSF2- LOS péptidos de este tamaño reaccionan bien con anticuerpos, pueden ser sintetizados fácilmente y pueden ser preparados en forma sumamente purificada. Se sintetizó los péptidos por, y se los adquirió de, Purification Systems, Inc. Se combinó los péptidos sintéticos con anticuefos anti-VIH de cabra, marcados con peroxidasa, y se los combinó con cada uno de dos series de concavidades de microtitulación revestidas con VIH. Se bloqueó una serie con anti-VIH de IgG humana; la otra serie, no. Se determinó el porcentaje de inhibición de anti-VIH de cabra que se une a sitios de proteína de VIH bloqueados con anti-VIH humano. Cuando se observó inhibición de unión con un péptido sintético específico, se sintetizó péptidos adicionales con secuencias de aminoácido que traslapaban las del péptido inhibidor original, para definir adicionalmente las secuencias de epítope. La situación de los epítopes en las proteínas de VIH reconocida por el IgG anti-VIH de cabra, pero no por la IgG anti-VIH no humana fue evaluada adicionalmente y confirmada usando conjugados de péptido de VI H-PRH como marcadores de identificación. En ese análisis, se absorbió proteínas de VIH para soportar dichas concavidades de placa de microtitulación o glóbulos de poliestireno de precisión. Se unió covalentemente péptidos 12-méricos que cubren la secuencia lineal de aminoácidos de VIH1SF2 a peroxidasa de rábano picante. Se midió la reactividad anti-VIH humano y de cabra independientemente, conectando la reactividad anti-VIH de humano y de cabra con los epítopes nativos adsorbidos al soporte y con el epítope de péptido unido covalentemente a la peroxidasa. Con este procedimiento, detallado en el ejemplo 8, sólo se reconoció los epítopes contenidos dentro del péptido sintético. Una vez que se había identificado los péptidos que tienen imitación significativa con las proteínas humanas, se determina las secuencias que tienen importancia funcional en el ciclo de vida del VIH. Esto se hace, como se describe más adelante y se ilustra en el ejemplo 8, generando anticuerpos a los péptidos candidatos y luego probando esos anticuefos en cuanto a su efecto sobre la infectividad de VIH y la neutralización. Tal como se hizo notar anteriormente, se ha identificado varias regiones de epítope específicas, y nueve están descritas detalladamente más adelante, con referencia a la secuencia de VIH1SF2, a menos que se indique de otra manera. Las designaciones de residuo de aminoácido, que están señaladas más adelante y en toda esta solicitud para VIHSF2 son del banco de datos de Los Alamos (AIDS Virus Sequence Data Base, Los Alamos National Laboratories, Theoretical División, Los Alamos, NM 87545, E. U. A.). Las designaciones de residuos de aminoácido dadas más adelante y en toda esta solicitud, para VIH2NZ son del servidor Ex Pasy World Wide Web Molecular Biology, del Hospital de la Universidad de Ginebra y de la Universidad de Ginebra; y del BioAccelerator, obtenible a través de Compugen Ltd, en el Weizman Institute, Israel, y Akira Ohyama, BioScience Systems Department, Mitsuey Knowledge Industry Co., Ltd., Tokio, Japón. Los expertos en la materia apreciarán que se puede identificar regiones análogas adicionales ("homólogos") de otros aislados de VIH, con base en su situación dentro de proteínas relacionadas procedentes de diversos aislados. En la práctica, se 5 puede identificar dichos homólogos mediante referencia a los datos de secuencia de VIH1SF2, de la siguiente manera: (a) Se puede alinear las secuencias de aminoácidos de los aislados de VIH y VIH1SF2 para obtener la máxima homología entre las dos secuencias, generalmente por lo menos alrededor de 75% de identificación entre las l o secuencias; (b) Una vez que una secuencia de aminoácido está alineada con el sitio correspondiente dentro de VIH1 SF2 las proteínas demostrarán parecido inmunológico, similitud o identidad con VIH1SF2, como se define por la retención de la reactividad de anticuerpo a la secuencia imitada u 15 homologa. Los péptidos de otros aislados de VIH y sus secuencias de aminoácido así identificadas, típicamente imitarán inmunológicamente las regiones correspondientes en el VIH1SF2- Este método para identificar los epítopes clave puede ser aplicado a las cepas de VIH que todavía no han sido descubiertas. Por ejemplo, conforme 0 se identifique nuevas cepas de VIH, sus secuencias de aminoácido de envolvente y de núcleo pueden ser alineadas con la de VIH1SF2 para obtener la máxima homología de secuencia con esa cepa. Los métodos mediante los cuales se alinean las secuencias son conocidos por los expertos en la materia. Al alinear las secuencias es conveniente mantener la mayor homología posible entre los residuos de cisteína. La(s) secuencia(s) de aminoácido de la nueva cepa o especie de VIH, que corresponde(n) a la ubicación de los péptidos descritos específicamente aquí, se puede sintetizar y usar de acuerdo con la invención. No es necesario para la presente invención que los epítopes contenidos dentro de dichas secuencias sean reactivos cruzados con los anticuerpos para todas las cepas o especies de VIH. Los péptidos que comprenden epítopes inmunológicos que distinguen una especie o serogrupo respecto a otros, tendrán utilidad para identificar especies o serogrupos particulares y pueden ayudar a identificar individuos infectados con una o más especies o serogrupos de VIH. También pueden ser útiles en combinación con otros péptidos, ya sea de una región homologa o de otra región neutralizadora, en regímenes terapéuticos. Las secuencias de aminoácidos de esta invención comprenden típicamente alrededor de 5 a 50 aminoácidos y comprenden una región epítope o múltiples regiones epítopes, situadas en las proteínas de VIH, que no pueden desatar una respuesta inmunológica protectora en el hombre, cuando se encuentran por infección o contacto ambiental, pero que sí provocan una respuesta en un mamífero no humano. De preferencia, las secuencias comprenden entre alrededor de 5 y 35 aminoácidos. Los péptidos sintéticos o los lisatos tratados de proteínas naturales de VIH que contienen las secuencias deseadas de aminoácido son usados para inmunizar animales que respondan inmunológicamente a ellos, y para producir anticuerpos que tienen valor terapéutico en el tratamiento de infecciones de VIH. Las secuencias de aminoácido o los péptidos de interés no pueden desatar una respuesta inmunológica en el hombre a través de la imitación de epítopes en proteínas humanas y otras. Son de interés particular los epítopes de péptido compartidos entre proteínas de VIH y alfa-fetoproteína humana, aspartil-proteasa, 5'-trifosfato de desoxiuridina. Nucleotidohidrolasa, proteína catiónica de eosinófilo, neurotoxina derivada de eosinófilo y precursor de ribonucleasa 4 y regiones epítopes de péptido, imitadas por neurotoxínas de Bungaris naja, Dendoaspis, Psudechis o Androctonus centruroides. En la discusión que sigue, se hace referencia a varías proteínas y neurotoxinas humanas usando abreviaturas de identificación normales para las proteínas. Se da a continuación un cuadro que señala esas abreviaturas y los nombres completos de las proteínas a las que corresponden: PROTEÍNAS HUMANAS CON SIMILITUD DE SECUENCIA CON LAS PROTEÍNAS DE VIH Se da más adelante las secuencias de aminoácido de nueve de las regiones de epítope sumamente conservadas, discutidas más arriba.

Tres de esas regiones están en las glicoproteínas de envolvente gp120 (dos blancos o destinos) y gp41 (un destino); una está en el heterodímero p66/55 de transcriptasa inversa, y uno en la proteasa p10. Otros objetivos o destinos están en el precursor de Gag (p55/Gag), con sitios en p17 (dos destinos)), p24 y p7. Una región epítope en VIH1SF2 gp120 se extiende desde el residuo 4 de aminoácido hasta el 27 y una segunda región se extiende desde el residuo 54 de aminoácido hasta 76, de VIH1. Los anticuefos para las regiones de epítope situadas en gp120, funcionan sinergísticamente para afectar la liberación de gp120 de gp41. La liberación de gp120 de gp41 es dependiente de la dosis de anticuefo y se puede demostrar mediante análisis de neutralización, como TCID, que mide la infectividad por VIH. También se ha determinado una región epítope de una región neutralizadora o inactivadora de gp120 de VIH2NZ. Se ha mapeado la secuencia de la glicoproteína gp122 de envolvente de VIH2Nz y aproximadamente desde el residuo de aminoácido 7 al 43, es una región que reproduce o imita una secuencia de VIH1SF2 gp120, y ciertas proteínas humanas. Dirigir como destino el anticuefo a la región da por resultado la disociación de HIV2 gp120 de gp41, lo que se correlaciona con una reducción en la infectividad.

Un tercer destino de glicoproteína de envolvente de VIH para VIH1SF2 fue localizado en los residuos de aminoácido 502-541 de la glicoproteína de transmembrana gp41. Dirigir como destino el anticuerpo de esta región en presencia del complemento, da por resultado una lisis mediada por el complemento dependiente del anticuerpo, de la glicoproteína de envolvente de VIH, y una reducción notable en la infectividad por VIH. Además de las regiones epítopes de glicoproteína de envolvente, otra región de epítope de VIH1 , de interés, incluye los residuos de aminoácido 254 a 295 del heterodímero de transcriptasa inversa p66/55. Dirigir como destino el anticuerpo de esta región, da por resultado una reducción en la actividad de transcriptasa inversa, que depende de la dosis de anticuerpo. También es de interés la región de epítope que comprende los residuos de aminoácido 69-94 de la proteasa p10. La dirección como destino de anticuerpo de esta región da por resultado una reducción en la actividad de proteasa que depende de la dosis de anticuefo. Los destinos de transcriptasa inversa y de proteasa están en las regiones conservadas, adyacentes al sitio de enzima activa, que es bien conocido por su mutación y su resistencia subsecuente a los inhibidores competitivos. La inactivación mediada por anticuerpo es el resultado de un cambio esférico o de conformación en la enzima, con pérdida secundaria de actividad. Este método de inactivación funciona independientemente de si no es influenciado por la mutación en el sitio activo de la enzima, y es irreversible.

También son de interés tres regiones de epítope dentro del gene Gag. Específicamente, los residuos de aminoácido 166 a 181 de la proteína p24 del gene Gag, un blanco en los residuos de aminoácido 1 a 23 y un segundo blanco en los residuos de aminoácido 89 a 122 de la proteína p17 del gene Gag y los residuos de aminoácido 390 a 410 y 438 a 443 de la proteína p7 del gene Gag, son útiles en esta invención. Los anticuefos que se dirigen como blanco a esas regiones, dan por resultado rompimiento del cápsido nuclear después de la lisis de la envolvente de VIH, mediante los anticuerpos descritos arriba. Esta dirección a destino culmina con la exposición del ARN de VIH a la degradación con ARNasa dei plasma.

Adicionalmente, los blancos en P17 están expuestos en la superficie de los linfocitos infectados, después de gemación. Esto provee un blando adicional para la lisis con ADCC de los linfocitos infectados. Uno de los péptidos específicos señalados arriba, que comprende por lo menos un epítope no reconocido por los anticuerpos de pacientes infectados por VIH, pero reconocido por anticuefos anti-VIH de cabra, es el péptido que comprende los residuos de aminoácido 4 a 27 de la proteína gp120 de envolvente de VIH1SF2 y sus subsecuencias que contienen el epítope, lineales, que tiene la siguiente secuencia: K G T R R N Y Q H L W R W G T L L L G M L M I C. (SEQ ID NO: 1 ) Este péptido imita las proteínas humanas FOL1, NTCR, PIP5, PPS1, KLTK, MC5R, ECP, INIU, INI9, VPRT, CD69, MYSE, RNKD, ADHE, TCO2, LCAT, MAG1, MAG2, MAG3 y LYOX. Una segunda región de epítope de la glicoproteína de envolvente gp120 de VIH1SF2 se extiende desde el residuo de aminoácido 54 hasta 76, que tiene la secuencia: ASDARAYDTEVHNVWATHACVPT (SEQ ID NO: 2) Este péptido reproduce las proteínas CYRB y SYV. Una tercera región de epítope, de interés, en la envolvente de VIH1SF2 se extiende desde el residuo de aminoácido 502 hasta el 541 de la glicoproteína gp41. Este péptido tiene la siguiente secuencia de aminoácido: VIH1_Env502 RVVQREKRAVGIVGAM FLGFLGAAGSTMGAVS LTLTVQAR 502-541 (SEQ ID NO: 3) Este péptido reproduce o imita las proteínas humanas CYPC, TYK2, ACHE, NTCF, NTCR, CD81 , 41 BL, NIDO, GSHR, COO2 y TCO2. En otra modalidad específica, una región epítope de interés es la de los residuos de aminoácido 2 a 23 de la proteína p17 de Gag en VIH1SF2-Este péptido tiene la siguiente secuencia: GARASVLSGGELDRWEKIRLRP (SEQ ID NO: 4) Este péptido reproduce o imita las proteínas TFPI, PA2M, BLSA, ECP y FETA y ciertas neurotoxinas, como NXS1 y NAJAT. El péptido tiene una secuencia hidrófoba que se une a, y apunta como destino a la membrana de célula anfitriona, e imita la función de la proteína Src de translación celular. Un segundo destino o blanco en VIH1SF2 p 17 se extiende desde el residuo de aminoácido 89 hasta el 122. Este péptido tiene la secuencia: LYCVHQRIDVKDTKEALEKIEEEQNKSK. (SEQ ID NO: 5) Este péptido imita o reproduce FETA y TRIC. Otro péptido de interés es el de los residuos de aminoácido 166 a 181 de la proteína p24 del gene Gag y el epítope que contiene las subsecuencias. Este péptido tiene la secuencia: PEVIPMFSALSEGATP (SEQ ID NO: 6) Este péptido imita o reproduce las proteínas humanas FETA y TRFL. Una tercera región epítope de proteína del gene Gag, de interés, es el péptido que tiene los residuos de aminoácido 390 a 410 y 438 a 443 de la proteína p7 del gene Gag, y el epítope que contiene sus subsecuencias. Este péptido tiene la secuencia: KTVKCFNCGKEGHIAKNCRAP (SEQ ID NO.7) + K I W S S Q (SEQ ID NO: 8) Este péptido imita o reproduce FETA humana y las proteínas que se unen a ARN. Este péptido contiene un dominio de unión de zinc que interactúa con, y se une a, el ARN viral. Los anticuefos para esta región incrementan la eliminación del VIH prematuro, desprovisto de envolvente, después de la lisis de los linfocitos infectados CD4+. También es de interés como región epítope el péptido de los residuos de aminoácido 69 a 94 de la proteasa p10 y el epítope que contiene sus subsecuencias. Este péptido tiene la secuencia: RIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLP (SEQ ID NO: 9).

Esta secuencia de péptido imita o reproduce las proteínas humanas RENI, BLSA, VPRT y CATD. Los anticuerpos para esa secuencia inhiben la actividad de proteasa de VIH. Otra secuencia específica adicional, útil en esta invención, es una secuencia que comprende los residuos de aminoácido 254 a 295 del 3 heterodímero p66/55 de transcriptasa inversa de VIH1. Este péptido tiene la secuencia: GLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKD FRKYTAFTIPSINNETP(SEQIDNO: 10).

Esta secuencia de péptido imita las proteínas humanas POL1 y ECP. Como se hizo notar más atrás, otras cepas de VIH también pueden ser usadas para obtener péptidos y anticuefos de acuerdo con la presente invención. Los péptidos útiles de otras cepas pueden ser determinados comparando y alineando la secuencia de otra cepa con la secuencia de VIH1SF2 O VIH2NZ y encontrando la parte de la secuencia homologa para los epítopes de interés, identificada para VIH1SF2 O VIH2 Z. Una secuencia de interés en VIH2NZ identificada mediante este método de esta invención, está en el marco de lectura abierto env gp120 y se extiende desde el residuo de aminoácido No.7, hasta el 43. Este péptido tiene la siguiente secuencia: QLLIAIVLASAYLIHCKQF VTVFYGIPAWRNASIPLF(SEQIDNO:11) Este péptido imita las proteínas humanas IL9, SRE1, NRM1, LBP, NOL1, S5A2, LMA1, LECH, LFA3, KPLC, FETA, 3BH2, 3BH1, INR2 y EV2B.

Por ejemplo, una vez que se ha identificado las secuencias deseadas de aminoácido, se obtiene los anticuerpos que reconocen esas secuencias. Esos anticuefos pueden ser obtenidos usando proteínas que contienen los péptidos aislados de los listos de VIH, péptidos sintéticos, proteínas de fusión bacteriana y proteínas/péptidos de fuentes no relacionadas filogenéticamente, que contienen los epítopes deseados. Si se va a usar lisatos virales, se puede usar un lisato de proteína de una sola cepa de VIH, o una mezcla de lisatos de dos o más cepas diferentes. Si se utiliza una mezcla de lisatos, la mezcla puede comprender lisatos de diferentes cepas de VIH1 o una combinación de cuando menos una cepta VIH1 y por lo menos una cepa VI H2. Una mezcla preferida es una combinación de lisatos de VIHI BAL, VIH1MN y VIH2NZ. Los lisatos virales son tratados inicialmente para eliminar los lípidos y demás impurezas de las proteínas VIH. Luego se trata la mezcla de proteína de VIH para eliminar los contaminantes de origen en el cultivo de células, incluyendo el antígeno de leucocito humano (HLA), los antígenos de clase I y de clase II. Los métodos para eliminar esos antígenos son conocidos en la técnica e incluyen los anticuerpos monoclonales anti-HLA clase I y antiHLA ciase II, y los procedimientos de inmunoafinidad; un método está dado con detalle en el ejemplo 3 que viene más adelante. Además, se ha encontrado que los carbohidratos de las proteínas de VIH deben ser eliminados; de otra manera, las determinantes de carbohidratos filogénicamente preservadas estimularían respuestas inmunológicas cuando se administra las proteínas de VIH a un animal, lo que daría por resultado la producción de anticuerpos que serían citotóxicos contra los tejidos humanos. Las proteínas son tratadas con enzimas conocidas por los expertos en la materia, para eliminar los carbohidratos, incluyendo PGNasa, neurominidasa y glicosidasa. Uno de dichos métodos está descrito detalladamente en el ejemplo 3. La mezcla de proteínas de VIH tratadas puede ser usada entonces para inmunizar a un animal para producir anticuefos para los péptidos de interés. Convenientemente, la mezcla contiene cantidades aproximadamente iguales de las proteínas que comprenden los péptidos o las regiones epítopes de interés. Es decir, convenientemente son provistos en proporciones aproximadas de 1:1 y la diferencia en las razones molares entre cualesquiera dos péptidos no es mayor que alrededor de 10:1, de preferencia 3:1. Alternativamente, se puede usar los péptidos sintéticos como inmunógeno. Si se utiliza péptidos sintéticos, la secuencia de aminoácido de cualquier péptido deseado puede modificarse, por ejemplo, utilizando una forma sustituta o truncada de la secuencia de aminoácidos. Se puede hacer sustituciones de aminoácido para evitar la división enzimática predicha que puede ocurrir durante el procesamiento del antígeno en una porción particular de aminoácido, para forzar la conformación anfipática para satisfacer la presentación de antígeno asociada con MHC, y para proveer longitud suficiente para la presentación de HLA debe ocurrir una división en o cerca del límite del epítope. Se selecciona las secuencias truncadas de tal manera que el péptido retenga la conformidad con los requerimientos de longitud del epítope, como se predice mediante los motivos de presentación de antígeno de MHC clase 1 y clase 2. Se da más adelante lineamientos más extensos sobre las sustituciones convenientes de aminoácido, como parte de la sección sobre los péptidos sintéticos. Además de las secuencias sustituidas y truncadas, también se puede preparar secuencias extendidas en las que se añade aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos de una región epítope seleccionada, con el propósito de facilitar la fijación a los soportes de fase sólida y los portadores macromoleculares. Como ejemplo, las secuencias truncadas del péptido, que se extienden desde el residuo 502 de aminoácido hasta ei 541 de VIH1SF2 gp41, discutido más atrás, incluyen un péptido con la secuencia de residuos de aminoácido 512-531 : G I V G A M F L G F L G A A G S T M G A (SEQ ID NO: 12) y también una secuencia que se extiende desde el residuo de aminoácido 518 hasta el residuo de aminoácido 527: F L G F L G A A G S (SEQ ID NO: 13) Otro péptido truncado, particularmente útil, es una secuencia truncada del péptido que se extiende desde el aminoácido 7 hasta el 43 de gp120 de VIH2NZ y que tiene la siguiente secuencia: L L I A I V L A S A Y L I H C K Q (SEQ ID NO: 14) Este péptido puede ser preparado en una gran variedad de formas. El péptido, debido a su tamaño relativamente pequeño, puede ser sintetizado en solución o sobre un soporte sólido, de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos están disponibles en el comercio en la actualidad, y pueden ser usados de conformidad con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, So//cf Phase Paptide Synthesis, 2a. Edición, Pierce Chemical Co., 1984; y Tam y coautores, J. Am. Chem. Soc., (1983) 105:6442. Alternativamente, se puede emplear tecnología de ADN híbrido, cuando se prepara un gene sintético empleando un solo filamento que codifica el polipéptido de filamentos sustancialmente complementarios del mismo; cuando los filamentos individuales se traslapan y pueden ser reunidos en un medio de fijación, a fin de hibridarlos. Los filamentos hibridados pueden ser ligados entonces para formar el gene completo y, por selección de los extremos apropiados, se puede insertar el gene en un vector de expresión, muchos de los cuales están disponibles actualmente sin dificultad. Véase, por ejemplo, Maniatis y coautores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. O la región de la genoma viral que codifica el péptido puede clonarse mediante técnicas convencionales de ADN recombinante, y se puede expresar en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos para producir los péptidos deseados. De preferencia el inmunógeno será enriquecido para los epítopes deseados a los que responderán los linfocitos B productores de anticuerpo produciendo anticuefos que neutralicen e inactiven pasos esenciales en el ciclo de vida de la infección por VIH. Tal como se usa aquí, "enriquecido" significa que un epítope deseado constituye por lo menos el 25% de la proteína de VIH, de preferencia por lo menos 50% y, muy preferible, alrededor de 95%. Más en particular, las soluciones que contienen lisato o extractos de virus roto, o el sobrenadante de las proteínas recombinantes expresadas biológicamente, o vectores de expresión rotos o proteínas que contienen epítopes imitados, pueden ser enriquecidos para dichas proteínas, cuando se desee, utilizando métodos de purificación, tales como, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida. La purificación por inmunoafinidad es un método preferido y conveniente para la purificación de proteínas y péptidos que contienen los epítopes de VIH deseados, por ejemplo, la purificación por afinidad usando anticuerpos policlonales o monoclonales purificados por afinidad, monoespecíficos. El grado al que se purifica los péptidos a partir de la soluciones para usarlos como un inmunógeno, puede variar ampliamente, es decir, desde alrededor de 50%, típicamente cuando menos 75% a 95%, convenientemente de 95% a 99% y, muy conveniente, a homogeneidad absoluta. Para obtener anticuerpos para los epítopes deseados, se inmuniza animales con cualquiera de los péptidos de interés o proteínas de VIH que los contengan, que hayan sido tratadas para eliminar los carbohidratos y los antígenos de HLA, como se describió más atrás. Los protocolos de inmunización son bien conocidos y pueden variar considerablemente, pero permanecer todavía efectivos. Véase, Coico, Current Protocols in immunology, John Wiley and Sons, Inc., 1995. Se puede suspender las proteínas y/o los péptidos o se los puede diluir en portador fisiológico apropiado para la inmunización. Los portadores adecuados son cualesquiera sustancias no tóxicas, biológicamente compatibles, para suministrar y/o incrementar la inmunogenicidad de los péptidos, incluyendo agua estéril y salina al 0.9%. Alternativamente, se puede acoplar los péptidos a una molécula portadora antes de ser usados como inmunógeno. Una técnica preferida, por ejemplo, discutida con mayor detalle más adelante, implica la unión de las proteínas y sus fragmentos a repeticiones múltiples de un glicopéptido, tal como el dipéptido muramilo (MDP) para formar una micropartícula, de típicamente menos de 1 miera, y de preferencia menos de 0.2 mieras de diámetro. La micropartícula puede ser dispersada entonces en un portador farmacéutico para inyección. Este procedimiento obtiene una densidad elevada del péptido, que puede ser usado entonces para desatar la respuesta inmunológica deseada. La selección del portador variará, dependiendo de la ruta de administración y de la respuesta. Se puede esterilizar las composiciones mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Se puede administrar los péptidos mediante rutas oral o parenteral, de preferencia esta última. Las cantidades inmunógenas de las preparaciones antígenas enriquecidas para los epítopes deseados, son inyectadas, generalmente a concentraciones en la escala de 1 µg a 20 mg/kg de peso del cuerpo del anfitrión. La administración puede ser por inyección, por ejemplo, intramuscular, peritoneal, subcutánea, intravenosa, etc. La administración puede ser una sola vez o una pluralidad de veces, usualmente a intervalos de una a cuatro semanas. Se vigila los animales inmunizados para la producción de anticuerpo para el epítope deseado. Se prefiere el anticuefo de IgG fijador de complemento, de gran afinidad, para la inmunoterapia pasiva, y se puede usar intacto, o como fragmentos, como Fv, Gab, F(ab')2. Puede preferirse los fragmentos de anticuefo cuando es conveniente mayor penetración en el tejido. Los anticuerpos y los fragmentos pueden ser administrados solos o como conjugados con sustancias tóxicas o isótopos. Una vez que se obtiene la respuesta deseada al anticuefo, se recoge la sangre, por ejemplo, mediante venipunción, punción cardiaca o plasmaféresis. Se purifica los anticuerpos de la mezcla compleja de suero o plasma, de acuerdo con procedimientos convencionales que incluyen, por ejemplo, precipitación con sal, cromatografía de cambio de iones, cromatografía por tamaño, cromatografía por afinidad. Frecuentemente se usa una combinación de métodos. La cromatografía por inmunoafinidad es un método preferido. Para evitar posible antigenicidad en un humano que recibe el anticuerpo derivado de un animal no humano, se puede construir anticuefos recombinantes. Un tipo de anticuefo recombinante es un anticuefo quimérico, en el que el fragmento de unión al antígeno, de una molécula de inmunoglobulina (región variable) es conectado mediante una ligadura de péptido, a por lo menos parte de otra proteína no reconocida como extraña por los humanos, tal como la porción constante de una molécula de inmunoglobulina humana. Esto se puede lograr fundiendo exones de región variable del animal con exones de la región constante, kappa o gamma, humana. Se conoce diversas técnicas por los expertos en la materia, tales como las descritas en TCP 86/01533, EP171496 y EP173494, cuya descripción queda incoforada aquí mediante esta referencia. Un tipo preferido de anticuefos recombinantes está constituido por los anticuefos injertados en RDC.

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Y SU USO Los anticuefos de esta invención que neutralizan la infectividad matan los linfocitos CD4 infectados e inactivan eventos funcionalmente importantes en el ciclo de vida del VIH, son incoforados como componentes de composiciones farmacéuticas. Las composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profiláctica de cuando menos uno de los anticuefos de esta invención, y convenientemente una combinación de anticuefos, con un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable es cualquier sustancia no tóxica, compatible, adecuada para el suministro de los anticuerpos al paciente. Así, esta invención provee composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de anticuefo disuelta en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua con regulador, salina al 0.4%, salina al 0.9%, glicina al 0.3% y similares. Esas soluciones son estériles y generalmente están libres de material en partículas. Las composiciones pueden comprender adicionalmente sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiere para las condiciones fisiológicas aproximadas, tales como agentes ajustadores y reguladores de pH, agentes ajustadores de toxicidad y similares. Por ejemplo, se puede usar acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración del anticuerpo en estas formulaciones puede variar, típicamente desde menos de alrededor de 0.1 mg/ml hasta 150 o 200 mg/ml, de preferencia entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 20 mg/ml, y se seleccionará primariamente con base en los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de preferencia para el modo particular de administración seleccionado. Determinar la concentración de un anticuerpo particular o de una combinación de anticuefos, está dentro de las capacidades de quien tenga experiencia ordinaria en la técnica. Así, una composición farmacéutica típica para infusión intravenosa puede estar constituida para contener 250 ml de solución estéril de Ringer y 100-200 mg de anticuerpo. Las composiciones para inyección intramuscular pueden formarse para contener 1 ml de agua estéril con regulador y alrededor de 20 a 50 mg de anticuefo. Los métodos reales para preparar composiciones parenteralmente administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia, y están descritos con mayor detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutícal Science, 15a. Edición, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980), el cual queda incoforado aquí mediante esta referencia. Esas composiciones pueden contener un solo anticuefo que, por ejemplo, sea específico para determinadas cepas de VIH, o para una sola proteína o glicoproteína expresada por la mayoría de y, más preferible, por la totalidad de, las cepas de VIH. Alternativamente, una composición farmacéutica puede contener más de un anticuerpo para formar una "combinación". Por ejemplo, una combinación que contenga anticuefos contra diversas proteínas y cepas de VIH sería un producto universal con actividad terapéutica o profiláctica contra la gran mayoría de los aislados clínicos de VIH. La combinación puede contener anticuefos que se unan a epítopes en proteínas o glicoproteínas de la envolvente de VIH, por ejemplo, o pueden contener una combinación de anticuefos para sitios epítopes identificados más arriba, en las proteínas gp160, gp120 y gp41 de VIH1SF2 Env; las proteínas p7, p17 y p24 de Gag; el heterodímero p66/55 de transcriptasa inversa y proteasa p10, o un subgrupo de ellos; neutralizando así una serie de epítopes cruciales en el ciclo de vida de VIH. Por supuesto también se puede emplear anticuefos para sitios epítopes en otras regiones neutralizadoras o inactivadoras de las proteínas de VIH. Por ejemplo, los anticuefos que modifican la fijación, la entrada en la célula, la transcripción, la translación, el ensamble, la determinación de blanco del virión maduro para la membrana del plasma y la extrusión del virión, interferirán con los eventos del ciclo de vida de VIH. Las combinaciones de anticuerpo más frecuentemente serán empleadas para obtener la inactivación de múltiples proteínas esenciales de VIH. Esto será de beneficio terapéutico en particular dentro de los viriopes carentes de envolvente externa, pero posiblemente sean infecciosos en caso de que logren entrar en la célula mediante otros mecanismos, como micropinocitosis o transfección o similares. La razón molar de los diversos componentes de anticuerpo usualmente no diferirá en más de un factor de 10, más habitualmente en no más de un factor de 5, y usualmente estará en una razón molar de alrededor de 1:1-3 con cada uno de los demás componentes de anticuerpo. Con respecto a los anticuefos para nueve péptidos específicos señalados más arriba, una combinación de anticuerpos deseable comprende anticuerpos para los dos péptidos de envolvente gp120 y para el péptido gp41. Más convenientemente, la combinación comprende anticuerpos para esas tres regiones de epítope más un anticuefo para la región de epítope de proteasa p10. Todavía más conveniente, la combinación comprende anticuerpos para esas cuatro regiones de epítope más anticuefos para al menos una de las otras cinco regiones de epítope enumeradas. En una modalidad muy preferida, la combinación comprende anticuefos para las nueve regiones de epítope. Los anticuefos y las combinaciones de anticuerpo de la presente invención pueden ser administrados independientemente o dados conjuntamente con otros agentes anti-retrovirales. El estado actual del desarrollo de otros agentes anti-retrovirales y de agentes anti-VIH en particular se resume en Mitsuya y coautores, Nature, 325:773-778, 1987. Los anticuerpos y los péptidos de esta invención pueden ser almacenados en formato líquido a diversas temperaturas, que se sabe que preservan la actividad de anticuefo, por ejemplo, -70°C, -40°C, -20°C y 0-4°C, o se los liofiliza para guardarlos y reconstituirios en un portador adecuado antes de usarlos. Esta técnica ha demostrado ser efectiva con inmunoglobulinas convencionales, anticuefos purificados y composiciones mixtas inmunógenas de proteínas, glicoproteínas y péptidos. Se puede emplear técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en este campo, y los expertos en la materia apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados diversos de pérdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuefos IgM tienden a tener mayor actividad que los anticuerpos IgG) y que se tendrá que ajustar las dosis para compensar cualquier pérdida. Las composiciones que contienen los anticuerpos de la presente o sus combinaciones pueden ser administradas para tratamiento terapéutico y/o profiláctico de infecciones por VIH. En la aplicación terapéutica, las composiciones son administradas a un paciente ya infectado con VIH, en una cantidad suficiente para tratar, o al menos detener parcialmente, la infección y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la infección y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente; pero en general variarán de 0.1 a 200 mg, aproximadamente, de anticuefo por kilogramo de peso del cuefo, prefiriéndose dosis de 0.5 a 25 mg por kilogramo. Las composiciones de esta invención pueden ser empleadas en estados de enfermedad serios que amenacen la vida o en situaciones que sean potencialmente amenazantes para la vida. En esos casos es posible, y puede decirse que es conveniente que el médico que está tratando administre excesos sustanciales de esos anticuefos. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos de la presente o su combinación, son administrados a un paciente todavía no infectado por VIH, pero que quizás ha estado expuesto recientemente a, o se cree que haya estado expuesto a, o en riesgo de exponerse al virus (tal como, por ejemplo, el recién nacido de un individuo infectado por VIH) o inmediatamente después de una exposición o supuesta exposición a VIH. Si la composición va a ser administrada a una mujer embarazada, infectada con VIH, puede darse una sola vez o varias veces antes del suministro para reducir la infectividad de VIH en la sangre materna y, de esa manera, reducir el riesgo de transmisión de VIH al recién nacido. El recién nacido en riesgo también puede ser tratado para reducir adicionalmente el riesgo de contraer VIH. Una cantidad definida para ser una "dosis profilácticamente efectiva" varía generalmente de 0.1 mg a 25 mg por kilogramo de peso del cuerpo, dependiendo del estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden tener uso como molécula portadora, específica para el destino o blanco. Se puede unir un anticuefo a una toxina para formar una inmunotoxina o a un material radioactivo o un fármaco para formar un producto radie-farmacéutico o farmacéutico. Los métodos para producir inmunotoxinas y productos radiofarmacéuticos son bien conocidos (véase, por ejemplo, Cáncer Treatment Reports, 68:317 (1984)). Los heteroagregados de anticuefos de la presente invención y los activadores de célula T humana, como los anticuerpos monoclonales para el antígeno CD3 o para el receptor gamma Fc en las células T, puede permitir que las células T humanas o las células que llevan Fc-gamma (tales como las células K o los neutrófilos) maten las células infectadas con VIH mediante citólisis mediada por célula, dependiente del anticuerpo (ADCC, acrónimo por su designación en inglés: Antibody Dependent Cell-mediated Cytolysis). Dichos heteroagregados pueden ser ensamblados, por ejemplo, mediante entrelazamiento covalente de los anticuerpos anti-VIH con los anticuerpos antiCD3, usando el reactivo heterobifuncional 3-(2-piridil-ditiol)propionato de N-succinimidilo, tal como se describe en Kafowsky y coautores, J. Exp. Med., 160:1686 (1984), el cual queda incoforado aquí mediante esta referencia. También se puede incluir otros agentes anti-VIH en las formulaciones, como la 3'-azido-3'-desoxitimidina, Z.S'-didesoxicitidina, 2',3'-didesoxi-2', 3'-dideshidrocitidina, etc. Además de las composiciones de anticuefo, se puede administrar composiciones que comprenden los péptidos de esta invención para vacuna terapéutica y profiláctica de individuos infectados con VIH. Para aplicación terapéutica, las composiciones que comprenden péptidos, ya sea como péptidos aislados opcionalmente modificados como se discutió antes, o contenidos dentro de proteínas de VIH, tratadas como se describió antes, y acopladas convenientemente a una micropartícula para estimular adicionalmente la inmunogenicidad, son administradas a un paciente infectado con VIH. La cantidad de péptido administrado está seleccionada de manera que estimule la producción de anticuerpo a epítopes funcionales de VIH no reconocidos previamente por el sistema inmunológico del paciente, de manea que los anticuefos estimulados puedan detener la infección. En aplicaciones profilácticas, las composiciones de los péptidos acoplados a la micropartícula MDP son administrados a personas no infectadas con VIH para estimular la producción de anticuerpos contra epítopes no reconocidos de otra manera, a fin de dar una función protectora contra futura infección.

USOS EN DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO DE LOS ANTICUERPOS Y EL ANTIGENO Los anticuerpos y los epítopes reconocidos por ellos y descritos en la presente invención también son útiles para el diagnóstico y manejo de infección por VIH. Típicamente, los análisis de diagnóstico que emplean anticuerpos y/o sus antígenos respectivos implican la detección del complejo antígeno-anticuefo. Se ha descrito numerosas configuraciones de inmunoanálisis y se ha empleado inmunoquímicos marcados o no marcados para ese propósito. Cuando no están marcados, los anticuerpos tienen aplicación, por ejemplo, en análisis de aglutinación, en análisis de citólisis mediada por complemento dependiente del anticuerpo, y en análisis de neutralización. Se puede usar anticuerpos no marcados en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuefos) que sean reactivos con el anticuerpo primario, tales como anticuerpos específicos para inmunoglobulina. Se puede usar anticuerpos no marcados en combinación con un anticuerpo marcado, que sea reactivo con un epítope no competitivo en el mismo antígeno, tal como en inmunoanálisis del tipo emparedado, o en combinación con un antígeno marcado. Alternativamente, los anticuefos pueden ser marcados directamente y usados en inmunoanálisis competitivos y no competitivos. Estos tipos de análisis y esas configuraciones son bien conocidos en la técnica. Se puede emplear una gran variedad de marcadores, como radioisótopos, etiquetas fluorescentes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (en particular haptenos), etc. Están disponibles numerosos tipos de inmunoanálisis y, a manera de ejemplo, incluyen los descritos en las patentes estadounidenses No. 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 y 4,098,876. Comúnmente los anticuefos y los péptidos de la presente invención son utilizados en inmunoanálisis enzimáticos donde, por ejemplo, los anticuefos de la presente, o sus respectivos antígenos son conjugados a una enzima y el inmunoanálisis se configura para proveer máxima sensibilidad y especificidad máxima para detectar los antígenos de VIH en muestras biológicas, tales como suero de sangre humana, saliva, semen, secreciones vaginales o suspensión de cultivo de células con infección viral. También se puede diseñar equipos para uso con los anticuefos de la presente en la detección de infección por VIH o la presencia del antígeno de VIH. Los equipos comprenden anticuefos de la presente invención opcionalmente junto con anticuerpos adicionales, específicos para otros epítopes de VIH. Los anticuefos, que pueden estar conjugados a un marcador o etiqueta, no conjugados o unidos a un soporte sólido, tal como la superficie de una concavidad de placa de microtitulador, o un granulo de poliestireno, están incluidos en los estuches o equipos con reguladores, como Tris, fosfato, carbonato, etc.; estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero bovino y similares. En general, esos materiales estarán presentes en menos de alrededor de 5% en peso, con base en la cantidad de anticuefo activo y usualmente presente en una cantidad total de cuando menos alrededor de 0.001% en peso, con base nuevamente en la concentración de anticuerpo. Con frecuencia será conveniente incluir un extendedor inerte o excipiente para diluir los ingredientes activos, cuando el excipiente puede estar presente en alrededor de 1% a 99% en peso de la composición total. Cuando se emplea un segundo anticuefo, capaz de unirse al anticuerpo, el segundo anticuerpo habitualmente estará presente en una ampolleta separada. El segundo anticuefo típicamente está conjugado a una etiqueta y formulado de una manera análoga con las formulaciones de anticuerpo descritas arriba. El epítope de la presente, reconocido por el anticuerpo, puede ser provisto marcado o no marcado y puede estar provisto como parte de una proteína mayor (sintética, recombinante o natural), con o sin modificación, como la adición de brazos separadores, grupos amino o residuos de cisteína, que se puede usar para fijar el péptido a un soporte y extenderlo desde la superficie del soporte. Esas modificaciones son empleadas para proveer el epítope en una disposición para elevar al punto óptimo la inmunorreactividad con el anticuerpo. Dichos péptidos son formulados de manera análoga a la de las proteínas que contienen epítope, que fueron descritas arriba.

La detección de los antígenos de VIH o del virus total en diversas muestras biológicas es útil para diagnosticar una infección corriente con VIH, evaluar la respuesta a la terapia, enumerar células infectadas, cepas de VIH determinadoras de serotipo, (vainas), identificar y cuantificar factores de virulencia asociados con infección primaria, avance y complicaciones, tales como neuropatía periférica, leucoencefalopatía multifocal y sarcoma de Kaposi. Las muestras biológicas pueden incluir, pero sin limitación a ellas: sangre, suero, saliva, semen, muestras de biopsia de tejido (cerebro, piel, nodos linfáticos, bazo, etc.), sobrenadantes de cultivos de células, sistemas de expresión eucarióticos y bacterianos interrumpidos y similares. La presencia de virus, antígenos virales, factores de virulencia y determinantes de serotipo son probados incubando ei anticuefo con la muestra biológica bajo condiciones que llevan a la formación de complejo inmunológico, seguida por la detección de la formación de complejo. En una modalidad, se detecta la formación de complejo mediante el uso de un segundo anticuefo, capaz de unirse al anticuerpo primario y conjugarse típicamente a un marcador. Se formula el segundo anticuefo de una manera análoga a la descrita para las formulaciones de anticuefo primario descritas anteriormente. En otra modalidad, se fija el anticuefo a un soporte de fase sólida que puede ponerse en contacto luego con una muestra biológica. Después de un paso de incubación, se añade el anticuefo marcado para detectar el antígeno unido. En otra modalidad, se conjuga el anticuerpo a un marcador de detección y después de un paso de incubación con una muestra biológica, tal como células o secciones de tejido, se evalúa la muestra mediante citometría de flujo o microscopía para el antígeno.

PREPARACIÓN Y USO DE LOS PEPTIDOS SINTÉTICOS Se puede modificar los péptidos de esta invención introduciendo sustituciones de aminoácido en el péptido. Las sustituciones pueden ser convenientes para variar uno o más aminoácidos particulares, para imitar más efectivamente los epítopes de las diferentes cepas retrovirales, o para incrementar las respuestas inmunológicas o las interacciones MHC con el epítope, lo que da por resultado mayor inmunogenicidad del epítope imitado cuando se usa para la inmunización o la vacunación. Además, puede ser conveniente efectuar ciertas sustituciones de aminoácido para incrementar la estabilidad química del péptido. Más específicamente, un polipéptido empleado en la presente invención no necesariamente debe ser idéntico a ninguna secuencia particular de polipéptido de VIH, siempre y cuando sea capaz de proveer competencia inmunológica con las proteínas de por lo menos una de las cepas de VIH. Por consiguiente, los polipéptidos de la presente pueden ser sometidos a diversos cambios, tales como inserciones, omisiones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, donde dichos cambios incrementarán la actividad deseada del péptido. Las sustituciones conservadoras son sustituciones con aminoácidos similares dentro de un grupo, tal como aminoácidos neutros, ácidos, básicos e hidrófobos. Los ejemplos de sustituciones dentro de dichos grupos incluirían: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; y ñor, met. Otras sustituciones adicionales de aminoácido, obtenidas mediante la aplicación de programas de aplicación para modelos moleculares, a la clasificación de base de datos determinadora de alotipo HLA (ADN y serológica) están mostradas: En una modalidad preferida de la invención, se efectúa las modificaciones de aminoácido de manera que se sustituye los residuos hidrófilos en el extremo más hidrófilo del péptido de interés y los residuos hidrófobos en el extremo más hidrófobo del péptido. Dichas sustituciones dan por resultado la formación de una hélice antipática con un epítope deseado encerrado entre las sustituciones. Los aminoácidos sustituidos en el isómero D pueden ser empleados para encerrar epítopes para proteger y estabilizar el epítope e incrementar la inmunogenicidad del epítope. Puesto que los D-aminoácidos no son divididos por enzimas intracelulares, dicha porción provee epítopes de péptido de la longitud deseada para interacción con moléculas MHC cuando son insertadas en los sitios apropiados. Esto se describe detalladamente en el ejemplo 8.5 que viene más adelante. Habitualmente la secuencia modificada no diferirá en más de alrededor de 20% de la secuencia de la al menos una cepa del retrovirus de inmunodeficiencia humana excepto cuando se añade más aminoácidos en uno o en ambos extremos con el propósito de proveer un "brazo" mediante el cual el péptido de esta invención pueda inmovilizarse convenientemente sobre soportes de fase sólida, fijados a macromoléculas o modificados para incrementar la inmunogenicidad alterando o incrementando la unión de MHC y su presentación. Los brazos pueden comprender un solo aminoácido o hasta 50 o más aminoácidos, y típicamente son de 1 a 10 aminoácidos de longitud. Se puede introducir los aminoácidos, tales como tirosina, cisteína, lisina, glutamina y ácido aspártico o similares, en el extremo C o N del péptido o del oligopéptido, para dar una funcionalidad útil para el enlazamiento. Se prefiere en particular la cisteína para facilitar el acoplamiento covalente a otros péptidos o para formar polímeros mediante oxidación. Adicionalmente las secuencias de péptido o de oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al modificarse la secuencia por acilación en el terminal NH2 (por ejemplo, acetilación), amidación con ácido tioglicólico o amidación en el extremo carboxi (por ejemplo, con amoniaco o metilamina) para proveer estabilidad, hidrofobicidad incrementada para el enlazamíento o unión a un soporte u otra molécula, o para polimerización. Así, por ejemplo, en una modalidad preferida de los péptidos descritos aquí, uno o más residuos de cisteína o una combinación de uno o más residuos de cisteína con aminoácidos separadores se puede añadir a los extremos del péptido. La glicina es un separador particularmente preferido cuando se desea péptidos individuales. Cuando se desea repeticiones de múltiple péptido del péptido, se sintetiza el péptido de un núcleo de lisina para formar una repetición de péptido tetravalente. La configuración está mostrada a manera de ejemplo. Los péptidos preferidos para uso en la polimerización oxidante son aquellos en los que se añade por lo menos dos residuos de cisteína a los extremos de un péptido deseado. Cuando están presentes dos residuos de cisteína en el mismo extremo del péptido, existe una modalidad preferida cuando se separa los residuos de cisteína mediante uno a tres residuos de aminoácido, de preferencia glicina. La presencia de los residuos de cisteína puede permitir la formación de dímeros del péptido y/o aumentar la hidrofobicidad del péptido resultante, lo que facilita la inmovilización del péptido en sistemas de análisis de fase sólida o inmovilizados. Es de interés particular ei uso del grupo mercapto de las cisteínas o de los ácidos tioglicólicos usados para acilar los grupos amino terminales, o como primer aminoácido para constituir repeticiones de múltiple péptido o similares, para enlazar dos de los péptidos u oligopéptidos o sus combinaciones, mediante una ligadura disulfuro o una ligadura más larga, para formar polímeros que contengan un número de epítopes. Dichos polímeros tienen la ventaja de incrementar la reacción inmunológica. Cuando se desea diferentes péptidos para inmunización, son ensamblados individualmente y combinados en una combinación para dar la capacidad adicional de inducir los anticuerpos a que inmunorreaccionen con diversos determinantes antigénicos de diferentes aislados de VIH. Para obtener la formación de polímeros antigénicos (multímeros sintéticos), se puede emplear compuestos que tengan grupos bis-halogenoacetilo, halogenuros de nitroarilo o similares, donde los reactivos son específicos para esos grupos. El enlazamiento entre el uno o los dos grupos mercapto de los péptidos u oligopéptidos, puede ser una sola unión o un grupo enlazador e cuando menos 2 o más átomos de carbono.

ENLAZAMIENTO DE LOS PEPTIDOS A PORTADORES MACROMOLECULARES Se puede emplear el péptido de la presente enlazado a un portador macromolecular soluble (por ejemplo, no menor que 5 kDal). Convenientemente el portador puede ser un poli(aminoácido), ya sea que ocurre naturalmente o sintético, a los que no es probable que los anticuefos se encuentren en el suero humano. Los ejemplos de esos portadores son poii-L-lisina, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, tiroglobulina, albúminas, tales como albúmina de suero bovino, toxoide del tétanos, etc. La selección del portador depende primariamente del uso final a que se destina el antígeno y de la conveniencia y disponibilidad. En una modalidad preferida, el portador comprende múltiples repeticiones de glicopéptido a micropartícula que se puede sintetizar o aislar de ciertas bacterias, tales como Proprionibacterium acini o similares. Esta micropartícula está compuesta de dipéptido muramílico, entrelazado extensamente, lo que da por resultado configuraciones multiméricas. Cuando se aisla el dipéptido muramílico de Propionibacterium acini o de organismos relacionados, es útil la selección de cepa y se basa la selección en el análisis químico de la pared de célula bacteriana. La modalidad preferida es el dipéptido muramílico entrelazado extensamente con un dipéptido compuesto de L-alanina-D-isoglutamina.

De experimentos preliminares, se ha identificado las diferencias de cepa en las que varían la composición del dipéptido y la longitud del péptido. Los aislados con elevadas concentraciones de lípido A y de beta-miristato O-acetilado son componentes de la pared de la célula. Los experimentos preliminares mostraron que estas diferencias están asociadas con aumentos en la toxicidad y disminuciones en el efecto adyuvante. La selección de cepa y la purificación de la modalidad preferida están discutidas por medio del ejemplo 4 que viene después. Se puede sintetizar la micropartícula MDP empleando procedimientos conocidos en la técnica. Se ha establecido bien que MDP es un inmunoestimulador potente, pero tiene toxicidad significativa. Muchos intentos por reducir la toxicidad de MDP han empleado procedimientos para retardar la liberación, como la incorporación de MDP en liposomas y otros compuestos relacionados, o la modificación de grupos terminales. La modificación química da por resultado una notable reducción en el efecto adyuvante deseado, y han sido difíciles de controlar los diseños con cambio del régimen de suministro. A manera de ejemplo, la configuración de micropartícula de MDP, los parámetros de tamaño y los métodos de fijación del suministro de antígeno, se dan más adelante. La separación de los lípidos de la configuración de micropartícula facilita la intemalización rápida de MDP mediante las células que presentan antígeno (APC, acrónimo por su designación en inglés: Antigen Presenting Cells). Las células que presentan antígeno predominantemente son de linaje monocítico e incluyen monocitos, macrofagos, histiocitos, células de Kuffer, células dendríticas, células de Langerhans, etc., y participan en el procesamiento del antígeno y en la presentación del antígeno a través de eventos asociados con MHC. Los factores que contribuyen al desarrollo de las respuestas inmunológicas a proteína extrañas, en parte, pueden ser determinados por la secuencia de aminoácidos y la secuencia susceptible a la división con proteasa en el microambiente. Muy frecuentemente se observa respuestas inmunológicas satisfactorias en péptidos que forman una hélice antipática con un extremo hidrófobo, de preferencia en el extremo amino-terminal y aminoácidos hidrófilos muy frecuentemente en el extremo terminal carboxilo. Las configuraciones de secuencia que son resistentes a la degradación por proteasa y forman disposiciones de hélice antipática frecuentemente son inmunógenos fuertes. Los residuos que contienen prolina en la secuencia generalmente son deficientemente inmunógenos, por prevenir la formación de hélice y los sitios de glicosilación son menos favorables y, frecuentemente, inhiben respuestas dirigidas en los epítopes del péptido. El desafío con antígeno, que da por resultado una respuesta inmunológica satisfactoria en el animal anfitrión, requiere procesamiento del antígeno y presentación del antígeno durante los eventos asociados con MHC. El antígeno exógeno es procesado primariamente por células que presentan antígeno (APC) después de la internalización en los endosomas. Después de la proteólisis por las enzimas, tales como catepsina D, que están presentes y reaccionan en este ambiente ácido, se ensamblan los fragmentos de péptido que satisfacen los criterios descritos más arriba, con MHC de clase II y se presentan en la superficie de la célula. Cuando los péptidos están presentes en densidad suficiente, se obtiene como resultado eventos inmunológicos. El tipo de respuesta inmunológica es regido por la densidad del péptido por APC, el microambiente, el ambiente de citocina y el tipo de linfocito inicialmente estimulado por las células que presentan antígeno. Después de la internalización se induce una cascada de respuestas de citocina, que modifican el microambiente y establecen condiciones que conducen a eventos inmunológicos. A manera de ejemplo, una micropartícula única de MDP (0.01 a 0.2 mieras) es usada para suministrar inmunógeno a células que presentan antígeno, lo que da por resultado respuestas inmunológicas a epítopes deficientemente inmunogénicos no observados usando los métodos convencionales que están mostrados en el ejemplo 5 que viene después. La cuantificación de estas respuestas inmunológicas demuestran aumentos de 10 a 100 veces en la concentración de anticuerpo, en comparación con otros adyuvantes. Los péptidos de la presente, empleados como inmunógenos, pueden ser enlazados a la porción de aminoácido del terminal carboxilo, del dipéptido muramílico, utilizando el extremo amino o el extremo carboxilo del péptido de la presente, o al producto de oxidación de aldehido de la porción carbohidrato, como se describe en los ejemplos. Habrá por lo menos una molécula del presente péptido por micropartícula MDP, de preferencia de 10 a 100 moléculas del péptido de la presente por micropartícula MDP y, muy preferible, 100 a 1,000 péptidos de la presente por micropartícula de MDP.

Por consiguiente, el tamaño de portador y los grupos de enlace disponibles, influirán en el número de péptidos de la presente por portador. La composición macroportadora afecta la inmunogenicidad al influir en la captación preferencial de células, la vida media del péptido y la presentación del antígeno durante los eventos inmunológicos con MHC. Se puede enlazar uno o más péptidos diferentes de la presente al mismo macroportador, pero de preferencia se fija un solo péptido de la presente ya sea en la configuración monovalente o tetravalente, al macroportador. Cuando se desea la inmunización con más de un péptido de la presente, se puede preparar una combinación de conjugados de péptido de la presente-macroportador, mezclando los conjugados individuales a razones que eleven al óptimo la inmunogenicidad de cada péptido de la presente introducido en la combinación. En esa configuración está disponible suficiente configuración de péptido en cada conjugado macroportador (100-1,000 péptidos) para incrementar la presentación de antígeno mediante una sola célula que presenta antígeno. La inmunogenicidad del péptido de la presente será elevada al óptimo ajustando tanto el número de los péptidos de la presente por portador macromolecular, como la configuración de la presentación, tal como fijación amino contra carboxilo, la modificación del aminoácido terminal y la longitud y la composición del brazo separador, tal como se describe. En esa configuración el procesamiento con antígeno mediante la célula que presenta antígeno da por resultado una densidad elevada, usualmente más de 100 y, muy frecuentemente más de 500 péptidos, presentes en la superficie de la célula de la célula que presenta antígeno, durante las interacciones de MHC. Con esta configuración se produce concentraciones de anticuefo significativamente mayores, después de la inmunización, como se muestra en los ejemplos que vienen después. La manera de enlazar es convencional, empleando reactivos tales como ácido p-maleimidobenzoico, ácido p-metilditiobenzoico, anhídrido de ácido maleico, anhídrido de ácido succínico, glutaraldehído, etc. Se puede efectuar el enlaza en el extremo N, en el extremo C o en un sitio intermedio a los extremos de la molécula. Con repeticiones múltiples del dipéptido muramílico, la fijación del péptido de la presente a grupos aldehido producidos por la oxidación moderada de residuos azúcar, por ejemplo, con peryodato de sodio, después de la reducción moderada con borohidruro de sodio y similares, se convierte el intermediario a una ligadura covalente estable. Se puede controlar el número de péptidos por micropartícula, variando las condiciones de oxidación y se cuantifica empleando un trazador radiactivo.

Estos métodos son bien conocidos en la técnica. El método de fijación y la configuración de la fijación pueden variar de un péptido a otro, según se necesite, para lograr la respuesta deseada. Se puede emplear diversos protocolos de análisis, con los que están familiarizados los expertos en la materia, para detectar la presencia de anticuerpos para los epítopes de proteína retroviral, o para detectar las proteínas retrovirales en mezclas complejas de proteínas. Es de interés particular un análisis novedoso descrito aquí, en el que el péptido de la presente es fijado covalentemente a una etiqueta de detección, tal como peroxidasa de rábano picante y la proteína de VIH natural que expresa el epítope o los epítopes está fijada directa o indirectamente a un soporte de fase sólida. En esa configuración un anticuerpo que reconoce el epítope del péptido será unido al epítope en fase sólida, con el epítope en la etiqueta.

Con este método, se puede determinar ia reactividad al epítope de un anticuerpo para VIH, y se puede cuantificar variando los péptidos fijados a la etiqueta. Los epítopes de péptido que están asociados con ei serotipo VIH, los factores de virulencia u otras características de VIH pueden ser identificados y medidos en cualquier muestra que exprese esos epítopes mediante un inmunoanálisis competitivo de un solo paso, aquí descrito, y provisto a manera de ejemplo.

EL USO DE ANTICUERPOS Y SUS RESPECTIVOS EPITOPES EN LOS PROCEDIMIENTOS DE PURIFICACIÓN POR INMUNOAFINIDAD Los anticuefos específicos para los epítopes contenidos dentro de las proteínas de VIH y las proteínas purificadas que contienen esos epítopes, son particularmente ventajosos para uso en la purificación por inmunoafinidad de proteínas y péptidos que contienen esos epítopes y anticuerpos reactivos con ellos. En general los anticuerpos tendrán constantes de asociación por afinidad del orden de 108 a 1012 M. Esos anticuerpos pueden ser usados para purificar proteínas y péptidos que contienen los epítopes de interés. Con frecuencia se puede usar bacterias modificadas genéticamente para hacer las proteínas de VIH y se puede purificar las proteínas de fusión recombinantes de interés del medio de cultivo del sistema de expresión recombinante si se secreta la proteína expresada, o de los componentes del sistema de expresión biológico alterado, si no es secretado, o de las mezclas biológicas complejas de proteínas de las que algunos o un componente contiene el epítope que imite un epítope del VIH. En general, los anticuefos que son capaces de reaccionar con los epítopes de VIH están unidos a, o inmovilizados en, un substrato o soporte. La solución que contiene los epítopes se pone en contacto entonces con el anticuerpo inmovilizado, bajo condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunológicos entre el anticuefo y la proteína que contiene el epítope. Se separa el material no unido de los complejos inmunológicos unidos, y se libera las proteínas unidas dei anticuefo inmovilizado y se recuperan en el eluado. De manera similar, se puede fijar las proteínas o péptidos que contienen epítopes de VIH o que imitan los epítopes de VIH, a un substrato o soporte, o se los puede inmovilizar en ellos, y usarios para aislar anticuerpos de interés, de una solución. Una solución que contiene los anticuefos, como plasma del que se ha eliminado la albúmina, se hace pasar a través de una columna de péptidos inmovilizados o de proteínas que contienen los epítopes deseados y, después de la formación de complejo inmunológico, se separa el anticuerpo no reactivo del complejo ¡nmunológico unido y se libera el anticuerpo con un regulador de elución y se recupera en el eluado. Esto tiene valor particular para purificar proteína que contiene epítopes que imitan los epítopes de VIH, pero derivados de fuente fiiogenéticamente no relacionadas con el VIH. Típicamente, los anticuefos son purificados en crudo del suero hiperinmunológico. Se purifica en crudo el fluido de ascites o los sobrenadantes del cultivo de células y las proteínas o péptidos que contienen epítopes que imitan los epítopes de VIH, a partir de fuentes biológicas como, pero sin limitación a ellas, fluidos del cuefo, sangre, componentes de sangre, extractos de células, extractos de tejido de origen adulto y embriónico, y sobrenadantes de cultivo, extractos de células cultivadas, venenos y productos de fusión recombinante antes de la fijación a un soporte. Dichos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden incluir fraccionación con sales neutras a concentración elevada. Otros métodos de purificación, tales como cromatografía por cambio de iones, cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel preparatorio, o cromatografía por afinidad, también pueden ser usados para aumentar la pureza de la preparación antes de su uso como inmunoabsorbente. Se puede preparar el anticuefo purificado por afinidad cuando se desee, haciendo reaccionar preparaciones de anticuefo purificadas en crudo con una matriz soportadora a la que se ha fijado el epítope reactivo o la proteína que contiene el epítope. Son de interés particular los anticuerpos para epítopes de VIH, que los imitan filogenéticamente, en la naturaleza. Dichos anticuefos son 5 útiles como agentes terapéuticos y también son útiles para estudiar el VIH al permitir la purificación de las proteínas de VIH y el mapeo de las proteínas de VIH para ubicación de secuencias y su función. Esos anticuerpos pueden ser producidos por inmunización con proteínas/péptidos de VIH, derivados de VIH y purificados por inmunoafinidad haciendo reaccionar los antisueros i o multivalentes policlonales, hiperinmunes, con proteínas/péptidos derivados de fuentes que no son VIH, como proteínas embriónicas, venenos y componentes microbianos/virales que no son de VIH, inmovilizados en un soporte como los discutidos antes. El antícuefo resultante, purificado por inmunoafinidad, es específico a epítope para uno o más epítopes compartidos 15 por el VIH y la proteína filogenéticamente no relacionada, usada para su inmunopurificación. Esos anticuefos específicos para epítope tienen utilidad particular en la purificación por inmunoafinidad de proteínas y péptidos, tanto de origen VIH como no originados en VIH. Dichos anticuerpos pueden ser usados para mapear la ubicación del epítope en VIH para determinar su 0 secuencia, evaluar la importancia funcional en el ciclo de ida del VIH, su distribución dentro de las vainas de VIH y entre otros retrovirus, su asociación con la virulencia de VIH y, cuando no es tóxico para el hombre sino neutralizados una función crucial en el ciclo de vida del VIH, es usado para tratar la infección por VIH. El soporte al que se inmoviliza los anticuerpos o epítopes, convenientemente tiene las siguientes características generales: (a) interacciones débiles con proteínas en general, para reducir al mínimo la unión no específica; (b) buenas características de flujo, que permiten que fluya a través de materiales de elevado peso molecular; (c) posesión de grupos químicos que pueden ser activados o modificados para permitir en enlace químico del anticuefo o epítope; (d) estabilidad física y química en las condiciones usadas para enlazarse al anticuefo; y (e) estabilidad a las condiciones y constituyentes de los reguladores necesarios para la absorción y la elución del antígeno. Algunos soportes usados comúnmente son: agarosa, poliestirenos derivados, polisacáridos, granulos de poliacrilamida, celulosa activada, vidrio y similares. Existen métodos químicos para la fijación de los anticuerpos y los antígenos a los soportes de substrato. Véase, en general, Cuatrecasas, P., Advances in Eznymology, 36:29 (1972). Los anticuerpos y los antígenos de la presente invención pueden ser fijados directamente al soporte o, alternativamente, por medio de un enlazador o de un brazo separador. Las condiciones generales requeridas para la inmovilización del anticuefo y de los antígenos a soportes cromatográficos, son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Tijssen, P., 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, que se incorpora aquí mediante la referencia. Los procedimientos de acoplamiento reales dependerán ligeramente de las características y del tipo de anticuefo o antígeno que se va a acoplar. Típicamente ocurre la fijación por medio de ligaduras covalentes. Se añade entonces a la matriz de separación apropiada un suero inmunológico, un fluido de ascites o un sobrenadante de cultivo, rico en anticuefo o un extracto o lisato de virus VIH, el sobrenadante o extracto de un sistema de expresión biológica cultivado, el sobrenadante o extracto de una suspensión del tejido de células alterado, o un componente de sangre (adulto o embriónico) u otras mezclas complejas de proteínas, como venenos, fluidos del cuerpo o productos de cultivo que contienen el epítope. Se incuba la mezcla bajo condiciones y durante tiempos suficientes para que ocurra la fijación de antígeno-anticuefo, habitualmente por lo menos 30 minutos, más usual, de 2 a 24 horas. Luego se separa los complejos inmunológicos inmovilizados que contienen el anticuefo específicamente unido o los epítopes, de la mezcla compleja y se los lava extensamente con regulador de absorción para eliminar los contaminantes no unidos. Se puede disociar entonces los complejos inmunológicos con un regulador de elución compatible con el soporte particular, la proteína fijada y la proteína del eluado. Se recupera en el eluado la proteína eluíble, el antígeno o el anticuerpo. Los reguladores de elución y las técnicas de elución son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede usar péptidos que contengan el epítope reconocido por el anticuefo, en el regulador de elución para competir por el sitio de unión del anticuefo y se puede efectuar eluciones bajo condiciones de elución moderadas. Se puede eluir la proteína absorbida selectivamente del absorbente de afinidad, alterando el pH y/o la resistencia iónica del regulador o con agentes caotrópicos. La selección de un regulador de elución, su concentración y demás condiciones de elución, dependen de las 5 características de la interacción anticuerpo-antígeno y una vez determinadas, no se las debe someter a ningún cambio importante. La proteína eluida puede necesitar ajuste a un pH fisiológico y concentración iónica, si se usa reguladores de concentración iónica o agentes caotróficos para disociar el complejo inmunológico. Dicho ajuste puede l o hacerse mediante diálisis o cromatografía por filtración en gel. Estos métodos también permiten que la proteína eluada vuelva a alcanzar su conformación natural. Los métodos precedentes producen, por ejemplo, proteínas sustancialmente purificadas que contienen epítopes de, o que imitan los 15 epítopes de, VIH y anticuerpos reactivos con los epítopes. Las proteínas purificadas típicamente serán de más de 50% de pureza, más habitualmente, por lo menos 75% puras y, con frecuencia, más de 95% a 99% puras. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes de las descripciones experimentales siguientes, que describen la 0 invención a manera de ejemplo. Los ejemplos ilustran adicionalmente el procedimiento de esa invención, pero de ninguna manera se pretende que limiten la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE AGRUPACIONES DE ANTICUERPO ANTI-VIH HUMANO (FRACCIÓN laG). PARA USO EN EL MAPEO DE LAS DIFERENCIAS DE EPITOPE DE VIH ENTRE REACCIONES INMUNOLOGÍAS EN EL HOMBRE Y LAS CABRAS Se obtuvo sueros humanos de pacientes infectados con VIH de una clínica de salud comunitaria, con permiso de los pacientes; se hizo firmar a cada paciente un consentimiento informado, se obtuvo la aprobación del médico y la aprobación del IRB local. Se seleccionó originalmente todos los cueros en cuento a la reactividad de VIH a una dilución de 1 :10, empleando un equipo de prueba obtenible comercialmente de Abbott Laboratories. Luego se evaluó adicionalmente los sueros con reactividad alta (definida arbitrariamente mediante absorbencias del resultado de prueba mayores que 1 , por medio de análisis de manchado Western para identificar los sueros que tienen reactividades de anticuefo a la mayoría de las proteínas de VIH (env, gag y pol). Los sueros de paciente que demostraron buena reactividad a la mayoría de las proteínas de VIH como se define, fueron evaluadas adicionalmente mediante análisis de neutralización de microcultivos para identificar las especificidades de anticuefo que contienen suero que neutralizarían la infectividad de VIH en análisis de microcultivo (neutralización de dosis total infecciosa cultivable (TCID, acrónimo por su designación en inglés: Total Culturable Infectious Dose)). Se identificó y reunió (20-40 ml de cada uno) suero de veintinueve pacientes con elevado título de anticuefo, reactividad a gp160, gp120, p66/55, gp41, p24 y p17 yp10, e infectividad de VIH neutralizada en microcultivo. La evaluación ulterior del VIH anti-humano reunido reveló amplia actividad de neutralización contra múltiples cepas de VIH y elevado título de anticuerpo (positivo mediante manchado de Western 1:100 o más) a las nueve regiones de epítope descritas detalladamente arriba.

Se purificó IgG humana de esta reunión de sueros empleando procedimientos convencionales. Después de la purificación se ajustó la concentración total de IgG a 10 mg/ml, se evaluó su composición y su pureza mediante procedimientos de inmunoanálisis normales. Los resultados demostraron una pureza de más de 98% y una composición de IgG humana. Se dividió el anti-VI H humano purificado en alícuotas y se lo congeló para uso subsecuente en experimentos y procedimientos descritos más adelante. Los expertos en la materia estarán familiarizados con métodos para caracterizar tanto los conjuntos de antígeno como los de anticuefo para definir las especificidades que pueden ser usadas en determinaciones subsecuentes contra anticuerpos desconocidos o antígenos desconocidos, para fines comparativos. Tal como se describe en los ejemplos que siguen, este anti-VIH humano fue empleado para seguir la purificación de proteínas de VIH de listos virales crudos y mapear los epítopes de VIH reconocidos por el sistema inmunológico humano y en EIA competitivo para identificar epítopes de VIH a los que se destina anticuerpos producidos en cabras, pero no en el hombre. Se empleó ei análisis de manchado de Western para caracterizar las 3 respuestas de anticuerpo en cabras inmunizadas con proteínas de VIH purificadas que contienen los péptidos de interés, o bien versiones sintéticas de esos péptidos, para evaluar la eficacia de un complejo portador de micropartícula, diseñado para amplificar las respuestas inmunológicas a péptidos deficientemente inmunógenos. Los anticuefos que neutralizaron la infectividad de VIH fueron evaluados mediante un procedimiento de microcultivo que empleó linfocitos CDr humanos, purificados, aislados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, acrónimo por su designación en inglés: Peripheral Blood Mononuclear Cells), empleando técnicas comunes y corrientes que utilizan partículas magnéticas conjugadas a anticuefo monoclonal para eliminar las células indeseables. Se estimuló los linfocitos CD4 con mitógeno para incrementar su susceptibilidad a la infección con VIH y fueron usados en todas partes, a menos que se haga notar de otra manera, como el blanco de destino anfitrión para la infección de VIH. Se empleó VIH1SF2 en todas partes, a menos que se haga notar de otra manera, como la cepa de VIH de referencia. El efecto del anticuefo sobre la infectividad de VIH fue determinado por microcultivo empleando técnicas familiares para los expertos en la materia. Se expresa la infectividad como las unidades infecciosas (Ul). Se asoció las reducciones en Ul mediadas por anticuerpo con neutralización de la infectividad de virus y se expresó como el cambio en unidades infecciosas. Se usó el conjunto anti-VIH humano en la totalidad de los experimentos aquí descritos, que requieren de anticuefo anti-VIH humano. Este conjunto de anti-VIH de IgG humana fue comparado con varias preparaciones anti-VIH humano obtenidas comercialmente, y tuvieron igual o mayor actividad neutralizadora de VIH, y cuando se las compara mediante análisis de manchado Western, fueron significativamente más reactivas.

EJEMPLO 2 CARACTERIZACIÓN DE LISATOS VIRALES DE VIH OBTENIBLES EN EL COMERCIO. EMPLEADOS AQUÍ.

Estudios preliminares Se compró VIH1MN, VIHIBAL y VIH2NZ de Advanced Bio-Technology, Inc., Columbia, MD, E. U. A., en la forma de lisatos virales purificados. El análisis de estos lisatos virales purificados demostró variación de lote en lote, en el contenido total de proteína, con una escala de 0.8 mg/ml a 1.2 mg/ml. Se evaluó la composición proteínica de cada lisato de VIH mediante SDS-PAGE y análisis de manchado Western, con anti-VIH de IgG humana. Se trató los lisatos de VIH con inhibidores de proteasa y detergentes no iónicos (1.0% en volumen/volumen); como Nonidet P-40 o Igepal CA630, para disociar plenamente las proteínas de VIH y las glicoproteínas a su forma monomérica, y se aclaró mediante filtración a través de un filtro de 0.22 mieras. Se eliminó los lípidos con SeroClear, empleando procedimientos comunes y corrientes. Es bien sabido por los expertos en la materia que el VIH incofora proteínas humanas en su envolvente como parte del proceso de gemación. Dichos contaminantes, una vez identificados, fueron retirados mediante cromatografía por inmunoafinidad. En el paso inicial de purificación, los contaminantes del suero, presentes en el medio de desarrollo añadido para facilitar el crecimiento de las células, y los contaminantes en el lisato de VIH, fueron eliminados mediante cromatografía por inmunoafinidad, empleando Sepharose CL6B (2-3 mg de anticuerpo/g de Sepharose) de suero humano anti-normal. La cromatografía de lisatos de VIH fue efectuada en una matriz a una razón de lisato de 1:1 en volumen/volumen, a un régimen de flujo de 10 ml/hora. Se vigiló la cromatografía y la elución espectrofotométricamente a una longitud de onda de 280 nm. Se concentró la fracción que no es de unión, rica en proteína, que contiene las proteínas relacionadas con VIH, a 1 mg de proteína/ml y se las almacenó a -70°C para uso futuro, cuando se las necesite. Se eluyó las proteínas unidas mediante las matrices de afinidad con regulador de glicina-HCI, pH 2.2 en 0.9% de NaCl. Se neutralizó los eluados, se dializó en BPS pH 7.8 que contenía 0.1% de Igepal CA630, se concentró y almacenó a -70°C para futuro análisis. Los análisis SDS-PAGE con manchado de Western, de las preparaciones de VIH purificadas, demostraron consistentemente la presencia de gp160, gp120, p66/55, gp41, p10, p24, p17 y p7, empleando IgG de anti-VIH humana. Las proteínas de VIH no fueron detectadas en el eluado de HCl de glicina, empleando el análisis de manchado Western, pero los geles de SDS-PAGE teñidos con azul brillante coomassie para la visualización de proteína, demostraron 2-3 bandas débilmente teñidas.

CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH PRODUCIDOS A LISATOS DE VIH PARCIALMENTE PURIFICADOS Se inmunizó cabras (n = 2) con las proteínas de VIH purificadas, obtenidas antes, y respondieron inmunológicamente con anticuefos que reaccionaron con epítopes inmunodominantes en VIH. La evaluación ulterior de este antisuero demostró la presencia de anticuefos citotóxicos que reaccionaron con linfocitos infectados con VIH y CD4* no infectados, y se detectó aglutininas de glóbulos rojos (GR). Estas aglutininas fueron reaccionadas con todos los grupos sanguíneos de GR y con GR de conejos y de conejillos de indias. Se consideró dos posibilidades para esas especificidades de anticuefo. Una posibilidad fue la contaminación de lisatos de VIH con proteínas de origen del cultivo de células, y la segunda fue la imitación entre las proteínas/glicoproteínas de VIH y las glicoproteínas encontradas en el hombre y otras especies animales. Se sabe bien que las proteínas de membrana anfitrionas frecuentemente son identificadas en la envolvente del VIH. La incoforación de los componentes de membrana anfitriona en la envolvente de VIH se cree que no es específica y está asociada con la gemación del virión maduro. Dos de dichas proteínas previamente identificadas en la envolvente de virión maduro son antígenos de HLA de clase I y de clase II. Ambos antígenos de HLA de clase I y de clase II fueron cuantificados empleando un inmunoanálisis enlazado a enzima, y los resultados demostraron la presencia de antígenos de HLA de clase I y de clase II en estas preparaciones de VIH, y a concentraciones desproporcionadas con su concentración medida en preparaciones de membrana de célula derivadas de células de cultivo no infectadas. Otros estudios confirmaron la presencia de antígenos de HLA de clase I y de clase II, en diferentes preparaciones (n = 17) de lisato viral de VIH. La concentración medida en esas preparaciones fue variable pero consistentemente de 10 a 100 veces mayor que la medida en los extractos de membrana de células de control infectadas. Se probó el anticuefo anti-VIH de cabra mediante análisis de manchado Western contra aislados conocidos de HLA de clase I y clase II y se confirmó que contenían especificidades de anticuerpo dirigidas contra HLA de clase I, HLA de clase II (cadena alfa y beta) y beta-2-microglobulina. Este anticuefo fue evaluado para su especificidad de alotipo HLA. Se empleó bandejas comerciales que contienen linfocitos de alotipos conocidos, como blancos de destino. Bajo condiciones de análisis, este anticuefo fue citotóxico para todos los linfocitos y esta citotoxicidad fue inhibida parcialmente con HLA de clase I y HLA de clase II, solubles, en una forma que depende de la dosis (cuadro 2.1 ).

CUADRO 2.1 INHIBICIÓN POR HLA DE CLASE I DE LA LINFOCITOTOXICIDAD EN ANTICUERPO PRODUCIDO PARA LISATOS PURIFICADOS DE VIH Se añadió HLA clase I y II, soluble, a concavidades de miaotitulador que contenían el anticuefo de VIH y se incubó durante la noche a 4°C. HLA I y II soluble redujeron la linfocitotoxicidad, pero no tuvieron efecto adicional a concentraciones superiores a 50 ug.

Otros estudios demostraron un anticuerpo que reaccionaba con un antígeno de carbohidrato filogenéticamente preservado, presente en gp120, glóbulos rojos humanos y glóbulos blancos humanos, y en glóbulos rojos de diferentes animales, incluyendo conejos, ratas y conejillos de indias. Los estudios de absorción con glóbulos rojos de humanos y de conejos eliminaron completamente la actividad restante de anticuerpo para ambas RBC (cuadro 2.2) y los linfocitos (cuadro 2.3) después de absorción con S-HLA-I y II.

CUADRO 2.2 ANÁLISIS DE ANTICUERPO ANTI-VIH ABSORBIDO. ANTI-GLOBULOS ROJOS (GR). PARA CÉLULAS DE AGLUTININAS DE GLÓBULOS ROJOS (GR) *Los antisueros producidos para lisato de VIH purificado dieron por resultado aglutininas de GR producidas en cabras después de la inmunización. Se inmunizó las cabras (n = 2 de cada una) con VIH1MN y VIH1 BAL y VIH2NZ, respectivamente.

CUADRO 2.3 ANÁLISIS DE ANTICUERPOS ANTI-VIH ABSORBIDOS EN ANTI-GR PARA LINFOCITOTOXICIDAD DURANTE LA INMUNIZACIÓN *Antisueros producidos para VIH sin tratamiento con glicosidasa a 20 semanas de la fecha de recolección de la sangre y absorbidos 0-5 veces con glóbulos rojos y probados contra linfocitos para la linfocitotoxicidad.

Después de la absorción y eliminación de las especificidades de anticuerpo a HLA y hemoaglutininas, se identificó el anticuerpo anti-VIH de cabra por el contenido de especificidades similar a los descritos previamente en la literatura. Esta información demostró la necesidad de modificar las proteínas de VIH para eliminar el carbohidrato y los antígenos de HLA para evitar la generación de anticuefos citotóxicos dirigidos contra los antígenos humanos.

EJEMPLO 3 PURIFICACIÓN Y ELIMINACIOIN DE ANTIGENO DE HALA CLASE I Y CLASE II Y ELIMINACIÓN DE CARBOHIDRATO DE LA PROTEINA DE VIH SIALDA DE LOS Ll SATOS DE VIH Se compró lisatos de VIH de VIHIMN, VIHIBAL y VIH2N2, de Advanced Biotechnologies, Columbian, MD, E. U. A. Contenían concentraciones de proteína en la escala de 0.8 a 1.2 mg de proteína/ml. Se añadió inhibidores de proteasa para proteger las proteínas contra la degradación y se añadió detergente no iónico (Igepal Ca-630, o Nonidet P-40) para disociar proteínas de VIH. Se dispensó la mezcla en tubos de extracción tapados, con un reactivo deslipidador para eliminas los lípidos y clarificar la mezcla. Se disolvió diferencialmente los lípidos en la capa orgánica, después de centrifugación y se eliminó la fase acuosa.

Se retiró contaminantes de origen de cultivo celular, incluyendo HLA, mediante cromatografía por inmunoafinidad en cinco matrices de afinidad separadas, preparadas mediante la fijación covalente de: anticuerpos IgG policlonales purificados por inmunoafinidad para las proteínas de suero humano; anticuerpo IgG monoclonal para HLA-1, anticuefo IgG monoclonal para HLA-2, anticuerpo monoclonal para beta2-microglobulina, anticuerpos IgG policlonales, purificados por inmunoafinidad para antígenos de membrana de linfocitos y de glóbulos rojos. Cada matriz contenía 2 a 3 mg de anticuerpo por g de Sepharose CL6B. Se configuró las columnas en una disposición aleatoria y se vertió y equilibró las matrices con PBS a pH 7.8 que contenía 0.1% de Igepal Ca-630. Se cromatografió sucesivamente las soluciones de lisato en volumen equivalente al volumen del lecho de columna, a través de cada columna, a un régimen de flujo de 10 ml/hora. Se vigiló espectrofotométricamente la cromatografía y la elución a una longitud de onda de 280 nm. Se concentró a 1 mg de proteína/ml la fracción no adherente, rica en proteína, que contenía las proteínas relacionadas con VIH. Se añadió SDS a la mezcla purificada por inmunoafinidad, que contenía las proteínas VIH de interés y se calentó la mezcla a 70°C durante 10 minutos. Se desglicosiló enzimáticamente la proteína utilizando PGNasa. Se fraccionó la mezcla de proteína mediante cromatografía de tamaño en Sepharose G50 previamente equilibrada con salina que contenía 0.1% de detergente no iónico. Se recogió las fracciones proteínicas y las que contenían las proteínas de VIH deseadas fueron reunidas individualmente.

Los tres conjuntos de proteínas, enriquecidos individualmente para gp160 y gp120, p66/55 y gp41, y p24, p17 y p10, fueron retenidos. Se almacenó las fracciones a -70°C hasta su procesamiento ulterior. Los métodos detallados para la cuantificación y la eliminación del antígeno de leucocito humano (HLA, acrónimo por su designación en inglés: Human Leukocyte Antigen) están descritos en Identification, characterization and quantitation of soluble HLA antigens in circulating and peritoneal dialysate of renal patients, F Gelder, Annals of Surgery, tomo 213 (1991), incorporado aquí mediante esta referencia. El cuadro 3.1 muestra datos obtenidos de la purificación.

CUADRO 3.1 PURIFICACIÓN DE LISATO DE VIH Las preparaciones de VIH purificadas como se describe típicamente estaban desprovistas de contaminantes, incluyendo HLA de clase I o de clase II. SDS-PAGE con análisis de manchado Western de las preparaciones de VIH purificadas, demostró consistentemente la presencia de gp160, gp120, p66/55, gp41, p10, p24, p17 y p7, empleando el anti VIH de igG humana reunido.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS REQUERIMIENTOS BIOQUÍMICOS Y DE CONFORMACIÓN DE LA MICROPARTICULA DE MDP PARA PROVOCAR EFECTOS ADYUVANTES CON VIH PURIFICADO Una repetición múltiple del dipéptido muramílico (MDP), aislado de Propionibacterium acini, formó la estructura central del complejo microportador MDP de este ejemplo. La composición química de la subunidad monomérica es: O-NHCH (CHgCHg-COOH) CONHg MDP tiene propiedades inmunoestimuladoras bien conocidas que han sido evaluadas extensamente en estudios diseñados para determinar su efecto sobre el incremento de la función inmunológica. Los expertos en la materia están familiarizados con este efecto. 5 Hasta ahora los aislados de MDP de fuentes naturales y MDP sintético, han sido asociados con toxicidad significativa cuando son administrados a mamíferos. Esa toxicidad ha limitado la efectividad de MDP como portador. Un método para el aislamiento de MDP libre de componentes i o tóxicos está provisto aquí. Se desarrolló Propionibacterium acini a una fase de crecimiento estacionario medio y se lavó para eliminar los contaminantes originados en el cultivo bacteriano, empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Los componentes hidrófobos contenidos en las paredes de las células y el citoplasma fueron extraídos secuencialmente 15 mediante lavados sucesivos en concentraciones graduales de etanol/metanol/agua, a temperaturas elevadas. Se suspendió la micropartícula de MDP resultante en etanol al 10% y se midió su concentración relacionando su absorbencia a 540 nm con la absorbencia de normas de turbidez. La concentración de la micropartícula de MDP se ajustó 0 a 1 mg/ml para almacenamiento y uso posterior. El análisis de esta preparación demostró que el dipéptido muramílico se entrelazaba extensamente con un tamaño de micropartícula de 0.1 a 0.2 mieras. El dipéptido terminal L-alanina-D-isoglutamina enlazada con amino fue idéntico a la estructura monomérica mostrada arriba. Es bien sabido que puede haber diferencias entre cepas bacterianas, y que esas diferencias pueden dar por resultado diferencias en la composición de péptido, tales como péptidos terminales con cinco o más aminoácidos, cambios en la composición de aminoácido de dipéptido, en particular L-alanina-L-isoglutamina, y sitios en los que se había incoforado los grupos beta-miristato O-acilados. Esto no es conveniente y cuenta para la toxicidad y para las propiedades deficientes de adyuvante del MDP aislado de fuentes naturales. En una modalidad preferida, las micropartículas de MDP (0.01-0.2 mieras, de preferencia 0.05-0.1) tienen el dipéptido L-alanina-D-isoglutamina enlazado con amino. Dicha micropartícula puede ser aislada de fuentes naturales, como antes, o se puede sintetizar usando procedimientos de síntesis bien conocidos.

EJEMPLO 5 PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN PRELIMINAR DEL CONJUGADO MDP- INMUNOGENO Se evaluó el efecto adyuvante de la micropartícula de MDP (0.2 u) del ejemplo precedente sobre la producción de anticuefo, empleando un fragmento de cadena ligera lambda humano, monoclonal, deficientemente inmunógeno, que carece aproximadamente de 22 aminoácidos en el puente sulfhidrilo (Mr alrededor de 18,000) como inmunógeno (I). Se formó dos conjugados: uno en el que el inmunógeno estaba conjugado covalentemente a MDP por medio del grupo carboxilo terminal y uno en el que la conjugación se efectuó por medio del grupo amino terminal. Se ensambló los conjugados MDP-inmunógeno por pasos, y se efectuó el cambio de reactivo después de cada paso mediante centrifugación, eliminación del sobrenadante y reemplazo con el reactivo requerido para continuar la conjugación secuencialmente durante todo el ensamble MDP: inmunógeno. Se muestra las razones molares con cada reacción y el cambio de reactivo que se efectuó después de cada paso previno la unión en puntos múltiples del inmunógeno que, desde experimentos preliminares, redujo significativamente las respuestas de anticuerpo inmunológicas.

SÍNTESIS DE MDP:NH?:INMUNOGENO:CO?H Protocolo para el acoplamiento eficiente en dos pasos de proteínas de VIH al dipéptido muramílico, utilizando EDC El siguiente procedimiento, adaptado de un procedimiento descrito por Grabarek, Z y Gergely, J., J. Anal. Biochem, 185:1311 (1990), permite el acoplamiento secuencial de proteínas de VIH y péptidos a MDP sin exponer la proteína de VIH a 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y, de tal manera, afectar los carboxilos en VIH. Este procedimiento exige extinguir la primera reacción con un compuesto tiol. Se lleva a cabo la reacción en ácido 2-[N-morfolino]etansulfónico (MES) (pH 4.5-5.0). Se volvió a suspender 10 mg de MDP, liofilizado en agua, en 0.5 ml de MES (pH 4.5-5.0) y se combinó 0.5 mg (2 mM) de EDC disueltos en MES (pH 4.5-5.0) y se hizo reaccionar durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió 2-mercaptoetanol (concentración final de 20 mM) para extinguir el EDC y se separó por centrifugación. Se lavó una vez la mezcla de reacción con MES y se volvió a suspender en 0.5 ml de MES (pH 4.5-5.0). Se añadió el fragmento de cadena ligera lambda humano, disuelto en MES, al MDP activado a una razón molar aproximada de 2:1. Se volvió a utilizar lentamente el pH de la reacción durante un periodo de 15 minutos a 8.5 mediante la adición de MES (0.5 M, pH 8.5) y se hizo reaccionar durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se calculó la concentración del fragmento de cadena ligera lambda añadido a MDP a partir del análisis cuantitativo del grupo CO2H terminal de MDP y se expresó como moles de CO2H por mg de MDP. Se extinguió la reacción añadiendo hidroxilamina a una concentración final de 10 mM. Este método de extinción hidrolizó cualesquiera sitios de activación de MDP sin reaccionar y dio por resultado la regeneración de los carboxilos originales. Otros medios de extinción implican añadir 20-50 mM de Tris, lisina, glicina o etanolamina; sin embargo, estos compuestos que contienen amina primaria dará por resultado MDP de carboxilos modificados. Cuando se usa MDP con péptido sintético de VIH y se desea la modificación de ese péptido, de manera que cambie la hidrofobicidad o se unan compuestos bioactivos, se puede lograr la modificación añadiendo el compuesto deseado antes del paso de extinción final. Esto permite que los compuestos deseados sean añadidos secuencialmente después del acoplamiento inicial con péptidos de VIH. Se podría añadir también los 5 péptidos bioactivos a razones deseadas con péptidos de VIH como un paso único, cuando se desea mayor control de la inmunogenicidad del péptido. Los modificadores de respuesta biológica, tales como IL2, son bien conocidos por los expertos en la materia y podrían ser usados para ese propósito. La separación se logró mediante centrifugación, un paso de i o lavado y la suspensión de nuevo en el regulador seleccionado.

PREPARACIÓN DE MDP-CO,H-INMUNOGENO-NH? Síntesis de DP:NH?CH?CH?NH?:CO?H:lnmunóaeno:NH? 15 Protocolo para el acoplamiento eficiente en tres pasos de proteínas al dipéptido muramílico utilizando EDC Este procedimiento permite el acoplamiento secuencial de una proteína o péptidos a MDP sin exponer la proteína a EDC y, de tal manera, 0 afectar los grupos amino en la proteína. El procedimiento emplea dos pasos intermediarios efectuados secuencialmente. Se lleva a cabo la reacción inicial en MES (pH 4.5-5.0). Se combinó MDP (10 mg) liofilizado en agua, suspendido de nuevo en 0.5 ml de MES, pH 4.5 y 0.5 ml de EDC (0.5 mg, alrededor de 2 mM), disuelto en MES, y se hizo reaccionar durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se extinguió el EDC en exceso añadiendo 2- mercaptoetanol (concentración final de 20 mM) y se separó el MDP activado, por medio de centrifugación, se lavó dos veces con MES y se volvió a suspender en 0.5 ml de MES (pH 4.5). Se añadió diaminoetano (NH2CH2CH2NH2), se disolvió en MES (pH 4.5), se añadió al MDP activado a una razón molar de 10:1, aproximadamente. Se dejó aumentar lentamente el pH durante un periodo de 15 minutos, mediante la adición de MES 0.5M, pH 8.5, y se hizo reaccionar durante una hora a la temperatura ambiente. Se separó el MDP:NH2CH2CH2NH2 mediante centrifugación, se lavó dos veces con MES y se volvió a suspender en 0.5 ml de MES, pH 4.5. Se suspendió el fragmento de cadena ligera lambda en 0.5 ml de MES, pH 4.5 y se añadió 0.5 ml de EDC (0.5 mg, alrededor de 2 mM) disuelto en MES y se hizo reaccionar durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se extinguió el EDC en exceso mediante la adición de 2-mercaptoetanol (concentración final de 20 mM) y se separó la proteína activada de los agentes reductores en exceso y los entrelazadores inactivados, mediante cromatografía de tamaños, en una columna de filtración con gel, de tamaño apropiado. Se añadió la proteína activada al MDP:NH2CH2CH2NH2 activado a una razón molar aproximada de 5:1 y se hizo reaccionar durante dos horas a la temperatura ambiente. Se calculó la concentración de proteína añadida a MDP a partir del análisis cuantitativo del grupo CO2H terminal de MDP, y se expresó como las moles de CO2H por mg de MDP. Se extinguió la reacción añadiendo hidroxilamina a una concentración final de 10 mM. Este método de extinción hidrolizó cualesquiera sitios de activación de MDP sin reaccionar, y dio por resultado la regeneración de los carboxilos originales. Si se usa un péptido sintético de VIH como inmunógeno y se desea la modificación de ese péptido, tal como cambiar la hidrofobicidad del péptido o atacar compuestos bioactivos, se puede lograr la modificación como se describió antes. Se logra la separación mediante centrifugación, un paso de lavado y suspensión de nuevo en el regulador seleccionado. Se debe notar que los compuestos bioactivos pueden requerir del paso intermedio descrito anteriormente cuando se desea la fijación por medio del grupo CO2H.

EJEMPLO ß ESTUDIO COMPARATIVO DE CONJUGADO MDP-INMUNOGENO CONTRA ADYUVANTES COMERCIALES. QUE INCLUYEN ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND. RIBKR). TITER MAX (R) Y ALUM Se evaluó el efecto adyuvante de esta micropartícula de MDP (0.1 u) empleando el fragmento de cadena ligera lambda humana, monoclonal, deficientemente inmunógeno, descrito en el ejemplo precedente (Mr alrededor de 18,000) como inmunógeno (I). Se preparó dos conjugados, uno en el cual el inmunógeno estaba conjugado covalentemente a MDP por medio del grupo carboxilo terminal, y uno en el que la conjugación se efectuó a través del grupo amino terminal. Se inmunizó subcutáneamente conejos (n = 5 en cada grupo) con alrededor de 100 microgramos de la cadena ligera lambda, fijada a 500 microgramos de MDP y se emulsificó en escualeno. Se inmunizó los animales a intervalos mensuales y se obtuvo sangrados de prueba antes de la inmunización y a intervalos de dos semanas, en todo el experimento. Las respuestas de anticuerpo a MDP:NH2-l-CO2H y MDP:NH2CH2CH2H02C-I-NH2 fueron comparables en actividad; sin embargo, los conejos estimulados con MDP:NH2-I-C02H produjeron por lo menos una especificidad a anticuerpo adicional, determinada por EIA competitivo. Las respuestas a anticuefo obtenidas fueron comparadas con las obtenidas cuando se empleó adyuvantes convencionales para respuesta de anticuerpo, incluyendo adyuvante completo de Freund, Ribi (R), Titer Max (R) y Alum (hidróxido de aluminio). Tanto MDP:HO C-l-NH como MDP:NH2-l-CO2H fueron significativamente superiores a los adyuvantes convencionales con inmunógeno, al inducir el anticuefo. La concentración de inmunógeno (100 ug/inmunización) y el patrón de inmunización fueron idénticos en todos los grupos. El cuadro 6.1 muestra el título de anticuefo medido a intervalos bisemanales y el título está expresado como la recíproca de la dilución que produce una reacción positiva como la descrita arriba. Ambos conjugados MDP fueron superiores a los adyuvantes convencionales y bien conocidos.

CUADRO 6.1 T-O = Recolección de sangre antes de inmunización primaria y de preinmunización. MDP: I = dipéptido muramílico:micropartícula inmunógena (< 0.2 m). *Se conjugó el péptido en el grupo amino terminal a isoglutamina con el extremo carboxi expuesto (MDP:l:C?2H). + Se conjugó el péptido en el extremo carboxi, por medio de un paso intermedio, empleando diaminoetileno para modificar el extremo carboxilo de MDP. (MDP:I:NH2).

EJEMPLO 7 RESPUESTA A Cl COCÍ NA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERIDA. INDUCIDA CON INMUNOGENOS MDP:NH,:l:CO?H y DP:NH?CH?CH?NH?:O?HC-l-NH? 5 Para evaluar adicionalmente los mecanismos asociados con la respuesta incrementada al anticuerpo a los complejos de micropartícula MDP- inmunógeno, se empleó un método in vitro que medía la producción de citocina o células mononucleares de sangre periférica, y se comparó con l o inductores de citocina conocidos. Se empleó lipopolisacárido (LPS) y LPS con fitohemaglutinina (PHA) como inductores de citocina conocidos. Se cuantificó las citocinas empleando un análisis bien establecido y se expresó como unidades/ml. Se aisló células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de Ficol Hypague y se ajustó a una concentración 15 de 2 x 106/ml en medio de cultivo de tejido. Se formó placas con células (100 ul) en concavidades de microcultivo. Se añadió MDP CO?H, MDP:I:NH2, PHA + LPS, LPS y medio solo, sin diluir o diluido a 1:10 y 1 :25 (10 ul.) Se incubó los cultivos a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 durante 48 horas, y se eliminó los sobrenadantes y se los analizó mediante bioanálisis normales 0 y/o métodos EIA.

CUADRO 7.1 Tanto MDP:l:C?2H como MDP:I:NH estimularon mayores respuestas de citocina tipo I que LPS + PHA o que LPS solo. Las respuestas de citocina tipo 1 aumentaron los eventos inmunológicos, mientras que la respuesta de citocina tipo 2 está indicada por niveles elevados de gamma IFN y de IL2, y menores niveles de FNT e IL6.

EJEMPLO 8 CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA AL ANTICUERPO EN CABRAS. A PROTEÍNAS DE VIH SIN TRATAR Y TRATADAS PARA ELIMINAR LAS PORCIONES CARBOHIDRATO Y COMPARACIÓN DE LAS PROPIEDADES ADYUVANTES DE LAS MICROPARTICULAS DE MDP CON ADYUVANTES CONVENCIONALES EJEMPLO 8.1 Se compró lisatos virales VIH1MN, VIH1 BAL y VIH2N2 DE Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD, E. U. A., y se trató la mitad de cada preparación enzimáticamente para eliminar el carbohidrato y todas las preparaciones (con o sin carbohidrato) fueron purificadas como antes. Se conjugó una alícuota de cada uno a MDP por medio del residuo amino terminal, de conformidad con los procedimientos señalados en el ejemplo 5, y se suspendió individualmente en escualeno. Para comparación también se emulsificó estas proteínas de VIH en adyuvante completo de Freund, sin conjugación a MDP. Grupo 1 - VIH1MN:VIH1 BAL, 1:1 , sin eliminación del carbohidrato. Grupo 2 - VIH1MN:VIH1 BAL, 1:1 , con eliminación del carbohidrato. Grupo 3 - VIH2 Z sin eliminación del carbohidrato. Grupo 4 - VIH2NZ con eliminación del carbohidrato Grupo 5 - VIH1 N:VIH1BA 'VIH2NZ, 1:1:1, sin eliminación del carbohidrato.

Grupo 6 - VIH1MN:VIH1 BAL.:VIH2NZ, 1:1 :1 , con eliminación del carbohidrato. Grupo 7 - VIH1MN:VIH1 BAL.:VIH2NZ, 1 :1 :1 , sin eliminación del carbohidrato y emulsificado en adyuvante completo de Freund, sin conjugación a MDP. Grupo 8 - VIH1MN:VIH1 BAL.:VIH2NZ, 1 :1 :1, con eliminación del carbohidrato y emulsificado en adyuvante completo de Freund, con conjugación a MDP. Se estratificó las cabras en grupos de inmunización 1-8 (n = 3 cada uno) y se inmunizó respectivamente a intervalos mostrados en el cuadro 8.1 con 100 ug de VIH/inmunización. Se obtuvo muestras de sangre antes de la inmunización y a intervalos bisemanales. Se cuantifícó la reactividad de anticuerpo mediante EIA usando el equipo de análisis obtenible en el comercio, aprobado por la FDA, de Abbott Laboratories. Los resultados fueron expresados como la recíproca de la dilución de antisueros que produjo un valor de absorbencia >1.0.

CUADRO 8.1 ANÁLISIS DE RESPUESTA DE ANTICUERPO ANTI-VIH A PROTEÍNAS DE VIH CUADRO 8.1 (continuación) T-O = Recolección de sangre de inmunización primaria y pre-inmunización. *- inmunización y reforzador. Se midió las respuestas de anticuefo a intervalos bisemanales, durante toda la inmunización. No hubo diferencia significativa en la reactividad de anticuefo, medida mediante EIA, entre grupos individuales de animales (grupos 1y2, 3y4, 5y6) con MDP. La eliminación del carbohidrato no tuvo efectos sobre la producción de anticuerpo para las proteínas anti-VIH deseadas.

EJEMPLO 8.2 Se evaluó los antisueros obtenidos como se describió en el ejemplo 8.1, para la hemaglutina?ón de anticuerpos. Como se puede ver del cuadro 8.2, la eliminación de carbohidrato de las proteínas de VIH obliteró la respuesta de hemoaglutinación.

CUADRO 8.2 ANÁLISIS DE RESPUESTA DE ANTICUERPO ANTI-V1H PARA GLÓBULOS ROJOS CUADRO 8.2 (continuacién) T-O = Recolección de sangre de inmunización primaria y pre-inmunización. 1 - Carbohidratos eliminados inmunización y reforzador Las preparaciones de VIH tratadas para eliminar los grupos carbohidrato no pudieron producir reactividades de anticuerpo capaces de aglutinar ios glóbulos rojos (cuadro 8.2A). Cabras inmunizadas con conjugados de MDP-VIH sin eliminación de carbohidratos y una cabra inmunizada con VIH purificado, sin eliminación de carbohidrato, emulsificado en adyuvante completo de Freund, produjeron aglutininas de glóbulo rojo.

No hubo diferencia detectable en el título de las aglutininas de glóbulo rojo en antisueros procedentes de cabras inmunizadas con conjugados de MDP-VIH o con VIH emulsificado en adyuvante completo de Freund. Las aglutininas de glóbulo rojo aquí descritas fueron esencialmente idénticas a las descritas en los estudios preliminares del ejemplo 2. Esas aglutininas fueron citotóxicas (cuadro 8.2A). Sin embargo, no hubo reactividad de anticuerpo detectable a HLA de clase I o de clase II y la absorción con los glóbulos rojos eliminó completamente la hemaglutinación y la reactividad de anticuerpo citotóxica.

CUADRO 8.2A ANÁLISIS SECUENCIAS DE ANTICUERPOS ANTI-VIH PARA LINFOCITOTOXICIDAD CUADRO 8.2A (continuación) T-O = Inmunización primaria y recolección de sangre previa a la inmunización. 1 - Carbohidratos eliminados. inmunización y refuerzo Para evaluar la posibilidad de imitación entre los grupos carbohidrato de VIH y RBC, se produjo antisueros adicionales inmunizando una cabra con un inmunógeno compuesto de membranas de célula purificadas y reunidas, aisladas de glóbulos rojos humanos. El análisis de manchado Western empleando estos antisueros demostró reactividad con una glicoproteína de glóbulo rojo (Mr alrededor de 35,000)y reaccionó con gp41 y gp120 de VIH. Sin embargo, gp41 y gp120 de VIH tratados para eliminar los grupos carbohidrato no fueron reactivos. Estos catos fueron consistentes con la imitación filogenética entre el epítope de carbohidrato en VIH y las glicoproteínas de glóbulo rojo. El análisis de manchado Western demostró fuerte reactividad a la mayoría de las proteínas VIH, incluyendo gp160, gp120, gp41, p66/55, p10, p24, p17 y p7. No hubo diferencia aparente en la reactividad o especificidad de estos anticuerpos para los epítopes de VIH aquí descritos. Esos anticuerpos reaccionaron para todos los aislados de VIH probados, incluyendo aquellos que habían demostrado tener resistencia a los inhibidores de transcriptasa inversa y proteasa.

EJEMPLO 8.3 NEUTRALIZACIÓN DE LA INFECTIVIDAD CON VIH POR ANTICUERPOS PRODUCIDOS PAA VIH CON CARBOHIDRATO ELIMINADO Este ejemplo describe y caracteriza la neutralización de la infectividad con VIH usando los anticuerpos producidos para VIH con carbohidrato eliminado, descritos más arriba. Los resultados indican que estos anticuefos contienen altos niveles de actividad neutralizadora y protegen las células CEM contra infección de una manera que depende de la dosis.

Análisis de neutralización Se empleó un análisis de neutralización sensible para cuantificar el efecto de anti VIH de cabra sobre la infectividad con VIH. Se seleccionó como célula de destino la línea de células CEM CD4~, que es sumamente susceptible a la infección con VIH, para determinar el efecto de este anticuerpo sobre la infectividad con VIH. Se hizo el anticuerpo y las diluciones según se requiere en medio RPMl que contiene 10% de suero de ternera fetal. Se cosechó una suspensión de VIH1SF2 de cultivos de alrededor de 4 días de CEM en fase de desarrollo logarítmico, se filtró a través de filtros de 0.2 o 0.45 mieras, se formó alícuotas y se congeló a -70°C. Se descongeló una alícuota, se tituló para determinar la DITC50, y se efectuó análisis subsecuentes con alícuotas recién descongeladas, diluidas 1:500 en medio de cultivo, a una concentración aproximada de diez veces la cantidad requerida para infectar el 50% de las células CEM en el cultivo (10 veces la DITC50). Se mezcló la suspensión de virus con un volumen igual (250 ul) de diluciones al quíntuplo de anticuefo desde 1:5 hasta 1:9,765,625. Se incubó la mezcla de virus/anticuerpo durante 60 minutos a 37°C y se usó muestras duplicadas de 200 ul para inocular concavidades que contenían 1.0 ml de alrededor de 2x1o5 células CEM por concavidad. Se incubó los cultivos a 37°C en una atmósfera humidifícada, con 5% de CO2 durante 14 días. Se cosechó las células, se formó pellas y se sometió a lisis con 1% de Tritón X-100 en PBS durante alrededor de 10 minutos. Se cuantificó la cantidad de virus (o antígeno viral) presente en las células sometidas a lisis, utilizando un análisis p24 obtenible en ei comercio. Se determinó el título de la actividad neutralizadora como la recíproca de la dilución de anticuefo que inhibió la producción del antígeno p24 en más de 50% de IgG pre-inmune de cabra, preparada de manera similar. Se analizó 200 microlitros de la suspensión celular sometida a lisis.

CUADRO 8.3A ANÁLISIS DE ACTIVIDAD NEUTRALIZADORA DE ANTICUERPO ANTI- VIH CUADRO 8.3A (continuación T-0: Inmunización primaria y recolección de sangre antes de la inmunización 1 = carbohidratos eliminados. inmunización y refuerzo **Preparaciones anti-VIH obtenidas de los 20 sangrados semanales fueron absorbidas con glóbulos rojos humanos y tanto las muestras no absorbidas como las absorbidas fueron probadas bajo condiciones idénticas. Los resultados están expresados como título de neutralización (no absorbido/absorbido). Se produjo preparaciones anti VIH con la máxima actividad neutralizadora para conjugados VIH-MDP que no fueron tratados para eliminar las determinantes de carbohidrato (cuadro 8.3A). La absorción en glóbulos rojos de anticuefos para los conjugados de VIH con carbohidrato eliminado no tuvieron efecto. Sin embargo, la absorción en glóbulos rojos de anticuerpos para conjugados de VIH con el carbohidrato intacto, dieron por resultado una reducción significativa en la reactividad neutralizadora, lo que confirma la presencia de porciones carbohidrato filogenéticamente presentes, compartidas entre VIH y los humanos (fila inferior, cuadro 8.3A). Todas las preparaciones de anticuefo anti-VIH producidas para conjugados VIH-MDP fueron estadísticamente mayores que anti-VIH producido usando el adyuvante completo de Freund. Debido a la característica de variabilidad genética predicha del VIH, se probó anti-VIH de las veinte preparaciones semanales para la actividad neutralizadora utilizando VIHMN y cuatro aislados silvestres de VIH, incluyendo uno caracterizado como una cepa resistente a fármacos múltiples, bajo condiciones idénticas a las descritas arriba. El anti-VIH de las 20 preparaciones de anticuefo semanales producidas para conjugados de VIH desprovistos de carbohidrato, neutralizaron todas las cepas (cuadro 8.3B). Los expertos en la materia reconocerán que la actividad neutralizadora producida para proteínas de VIH con HLA eliminado, con carbohidrato eliminado, es considerablemente mayor que la actividad neutralizadora observada típicamente en sueros anti-VIH humanos.

CUADRO 8.3B ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD NEUTRALEADORA DE ANTICUERPO ANTI- VIH CONTRA MÚLTIPLES CEPAS 1 = carbohidratos eliminados EJEMPLO 8.4 EFECTO DE ANTI-VIH SOBRE LINFOCITOS CD4 INFECTDOS CON VIH EN CITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO. DEPENDENTE DE ANTICUERPO Se evaluó anticuefos contra conjugados de VIH con carbohidrato eliminado y con carbohidrato intacto, para la reactividad de citotoxicidad mediada por complemento a las células mononucleares de sangre periférica normal, enriquecidas para linfocitos CD4 con y sin infección por VIH. Se aisló células mononucleares periféricas, normales; se las sometió a centrifugación con gradiente de Ficol Hypaque y enriquecidas para linfocitos CD4\ Se estimuló los linfocitos CD4' con PHA y se los infectó con VIHMN durante 7 días en microcultivo. Se eliminó los sobrenadantes y se reemplazó con anti-VIH, producido para preparaciones de VIH después de la eliminación del grupo azúcar, y demostró que no tenía efectos citotóxicos sobre células normales. Como se puede ver del cuadro 8.4, el anti-VIH efectuó lisis de linfocitos CD4 infectados, de una manera que dependió de la dosis.

CUADRO 8.4 ANÁLISIS DE CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPO ANTI-VIH. DE LINFOCITOS CD4 INFECTADOS CUADRO 8.4 (continuación) T-O = inmunización primaria y recolección de sangre previa a la inmunización. 1 = carbohidratos eliminados inmunización y refuerzo.

EJEMPLO 8.5 SÍNTESIS DE PEPTIDOS QUE CORRESPONDEN A LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS DE VIH 5 Se construyó péptidos sintéticos como péptidos dodecámeros que imitan o reproducen la secuencia de aminoácido de VIH1SF2- Secuencias de aminoácido para gp 120, gp 41 , gag p 17, gag p 24, nef, Rev, integrasa, proteasa, Tat:HxB2 y transcriptasa inversa y transcriptasa inversa con traslapes mediante seis residuos de aminoácido, fueron sintetizadas por y l o compradas de Purification Systems Inc., empleando tecnología de fase sólida. Se usó butiloxicarbonil-S-4-metilbencil-L-cistina acoplada con poliestireno, utilizando diciclohexilcarbodiimida con una cantidad catalítica de 4-N,N-dimetilaminopiridina como soporte de fase sólida para la síntesis. Se protegió los grupos amino con terbutiloxicarbonilo (t-BOC) y los grupos 15 protectores de cadena lateral fueron como sigue: éter bencílico para el hidroxilo de serina, éter diclorobencílico para el hidroxilo fenólico de tirosina, y los esteres beta-bencílicos fueron usados para los grupos carboxilo en ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Se usó ácido trifluoroacético (40% en cloruro de metileno) para eliminar t-BOC y se neutralizó la sal 0 resultante con N-diisopropiletilamina (10% en cloruro de metileno). Se usó diisopropilcarbodiimida para acoplar t-BOC-aminoácidos. Los grupos protectores fueron eliminados y se dividió el péptido de la resina a 0°C con fluoruro de hidrógeno anhidro que contiene 10% de anisol y 1% de etanoditiol como depuradores. Se eliminó ai vacío el reactivo fluoruro de hidrógeno a 0°C y luego se precipitó el péptido y se lo lavó con éter anhidro. Después de extracción del péptido de la resina, con ácido trifluoroacético, se evaporó el solvente a 15°C y se precipitó de nuevo el péptido con éter. Se decantó el éter después de la centrifugación y se disolvió la pella en ácido acético al 5% con clorhidrato de guanidina 6M. Se desaló esta solución en una columna BioGel P2 equilibrada en ácido acético al 5% y se reunió las fracciones que contenían péptido y se las liofilizó. Se añadió un residuo de cisteína al extremo carboxilo del péptido, según fue necesario, para dar un grupo SH funcional para el acoplamiento del péptido a proteínas portadoras o a un soporte sólido para procedimientos EIA o para MDP (ejemplo 5). Cuando se deseó múltiples repeticiones del péptido, se condujo síntesis fijando primero un residuo cisteína al soporte de resina. Se añadió separadores de carbono de diversas longitudes; la selección de la longitud de separador varió y dependió de la aplicación, de la carga de péptido y de la longitud y las influencias estéticas predichas a partir de datos preliminares que resultan de fijaciones de péptido a los soportes. Se fijó primero un separador de seis carbonos, como ácido 6-aminohexanoico con adiciones de lisina (lisina)-2-(lisina)4 como se describió anteriormente, con diaminoetano en el ejemplo 5, pero alterando la secuencia del bloqueo del grupo protector. Se protegió los grupos amino y luego se desprotegió para permitir que dos residuos lisina se fijaran al extremo amino desprotegido, la desprotección, seguida por adición de lisina, formó una estructura de cadena ramificada para la síntesis de péptido. Los péptidos con función biológica específica o con secuencias que son susceptibles a la degradación enzimática fueron modificados mediante la adición de D-aminoácidos. Una adición particularmente útil es la adición de L-alanina-D-isoglutamina con el péptido de interés sintetizado del extremo NH2 de D-isoglutamina. En otra disposición, se sintetizó el péptido con L-lisina-L-lisina-péptido-D-isoglutamina. Los grupos lisina del extremo carboxi son sumamente susceptibles a la degradación enzimática por muchas enzimas en el microambiente, mientras que la D-isoglutamina da por resultado un aumento en la media vida del péptido y provee un sitio hidrófobo para ensamblar péptidos que requieran de propiedades anfapáticas para provocar una función tal como unión a receptor e inducción inmunológica a través de eventos asociados con MHC. Se añadió un residuo tirosina al extremo amino para mareaje radiactivo con 125yodo para determinar la eficiencia de acoplamiento de péptido a proteína portadora, y para identificar el péptido durante la purificación. El 125l también proporcionó un trazador para seguir la media vida del péptido en sistemas biológicos y evaluar la unión a receptor cuando la función del péptido no fue afectada por la adición de tirosina.

EJEMPLO 8.6 EL USO DE PEPTIDOS SINTÉTICOS QUE IMITAN LAS SECUENCIAS DE PEPTIDO DE VIH Y OTROS RETROVIRUS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE EPITOPES VIRALES Dentro de esta invención, se describe secuencias de péptido sintético que imitan las secuencias sumamente conservadas, encontradas en VIH y otros retrovirus, y se identifica su significado funcional como destinos inmunológicos en el tratamiento de infecciones virales. Estos péptidos tienen aplicación adicional en el diagnóstico y manejo de infección por VIH que es el resultado de microvariantes de VIH con secuencias que contribuyen a la patogénesis de VIH a través de regulación descendente no específica de reacciones inmunológicas, inducción de autoinmunidad y por medio de efectos tóxicos que conducen a neuropatía periférica asociada con VIH. Cada uno de esos eventos, cuando se presentan en un paciente, contribuyen a la patogénesis de VIH y declinan la calidad de vida. Los péptidos sintéticos empleados para identificar y cuantificar aquellas regiones de péptido de VIH que inician esos eventos, tienen utilidad para identificar factores de riesgo para la autoinmunidad y la neuropatía periférica. Los péptidos sintéticos proveen utilidad adicional en un procedimiento de análisis novedoso para vigilar el avance de la enfermedad y los cambios en el avance como resultado del tratamiento.

En un paso de esta invención se configuró un inmunoanálisis enzimático (ElA) para la identificación de especificidades de anticuerpo de cabra sobre VIH no reconocido por anti-VIH humano. Las preparaciones purificadas de las proteínas gp120 y gp41 de VIH1 fueron aplicadas sobre 5 concavidades de placas de microtitulación de polivinilo a 5 ug/ml en salina regulada con fosfato (PBS< pH 7.8) mediante incubación durante 20 horas a 37°C. Se lavó las concavidades con PBS que contenía 0.1% de Tween 20 (PBS/Tween) y se saturó os sitios no ocupados de cada concavidad con albúmina de suero bovino al 5% mediante incubación durante una hora a i o 37°C. Se usó las placas inmediatamente o se las guardó a 4°C. Se añadió 100 ul de anti-VIH de IgG humana (ejemplo 1) a cada concavidad, se incubó durante 25 horas a 4°C y se lavó las concavidades con PBS/Tween. Se añadió anti-VIH de cabra previamente producido y marcado con HRP mediante procedimientos comunes y comentes, a las concavidades, a una 15 dilución necesaria para producir una absorbencia de 1.0 en las condiciones del análisis (1:10,000 de título) y se incubó durante 24 horas a 4°C. Se lavó las concavidades y se añadió substrato para determinar la cantidad de unión del IgG de cabra. Se calculó el porcentaje de inhibición de la unión inducida por las proteínas de VIH bloqueadoras, con anti-VIH humano, utilizando la 0 fórmula: (DO sin bloqueo - DO bloqueado) x 100 - DO de control negativo bloqueado DO sin bloqueo El bloqueo mínimo del conjugado anti-VIH-HRP de cabra por anti-VIH humano fue indicativo de la unión de anti-VIH de cabra diferente del anti-VIH humano. En otro paso, se configuró el EIA para identificar los epítopes en proteínas de VIH que fueran antigénicas con anticuerpos de cabra, pero no con anticuerpos humanos. Las preparaciones purificadas de proteínas gp120 y gp41 de VIH 1 fueron aplicadas sobre granulos de poliestireno a 5 ug/ml en PBS mediante incubación durante 24 horas a 37°C. Se lavó los granulos con PBS que contenía 0.1% de Tween 20 (PBS/Tween) y se saturó los sitios no ocupados en cada granulo con albúmina de suero bovino al 5%, incubando durante 1 hora a 37°C. Se usó inmediatamente los granulos o fueron guardados a 4°C. Se añadió 100 ul de anti-VIH de IgG humana (ejemplo 1) a cada granulo, se incubó durante 24 horas a 4°C. Se añadió 100 ul de anti-VIH de IgG humana (ejemplo 1) a cada granulo, se incubó durante 24 horas a 4°C y se lavó los granulos con PBS/Tween. Se disolvió péptidos sintéticos en PBS que contenía 5 mg/ml de albúmina de suero bovino y 0.1% de Tween 20, a una concentración de 0.1 mg/ml. Se añadió 25 ul de péptidos a 100 ul de solución del conjugado anti-VIH de cabra-lgG-HRP y se incubó durante 24 horas a 4°C. Se añadió luego la mezcla a dos series de granulos revestidos con VIH. Una serie fue bloqueada con anti-VIH humano que se añadió a dos series de granulos revestidos con VIH. Se bloqueó una serie con anti-VIH humano que se añadió al mismo tiempo que se añadió los péptidos al conjugado de anti-VIH de cabra-HRP. Los granulos con los reactivos fueron incubados durante 24 horas a 4°C. Después de la incubación se lavó los granulos y se midió la actividad de peroxidasa, como se describió antes. Se gráfico la actividad contra la posición del péptido dentro de las proteínas de VIH. Estas gráficas mostraron áreas de las proteínas de VIH usadas como blanco por IgG inmune de VIH de cabra, que no fue reconocido por el anticuerpo humano. Cuando se observó la inhibición de la unión con un péptido sintético específico, se sintetizó más péptidos para traslapar el péptido original mediante péptidos de longitudes adicionales. La falta de inhibición por los péptidos sintéticos se consideró que representaba la carencia de blanco inmunológico por el sistema inmunológico de cabra. Empleando este procedimiento se seleccionó epítopes de péptido lineal para estudio. En otra modalidad preferida de esta invención se configuró un EIA para utilizar conjugados de péptido-peroxidasa, producidos como se describe más adelante, para identificar epítopes reactivos al anticuerpo en proteínas de VIH, reconocidos por el sistema inmunológico de cabra, pero no por el humano. Se unió covalentemente los péptidos que imitan las secuencias de VIH unidas covalentemente a HRP para producir un banco de péptidos marcados con enzima para uso en el mapeo de la especificidad de anticuerpo. Específicamente se suministró HRP a un tubo de reacción, a una razón molar calculada de 1 parte de HRP: 10 partes de péptido. Se suministró individualmente cada péptido para ser acoplado, a microtubos a una concentración de 0.1-1 umol/ml, a volúmenes de 0.1-1 ml, cada uno de los cuales varió, dependiendo de la cantidad de conjugado deseado y del peso molecular para el péptido. Se disolvió HRP a una concentración de 1-10 umol/ml en regulador de carbonato bicarbonato 0.1 M (pH 9.8) a 4°C y se añadió peryodato de sodio para obtener una concentración final de 0.02M. Se dispensó inmediatamente la mezcla en microtubos que contenían los péptidos, se mezcló y se hizo reaccionar durante 30 minutos. Se añadió 0.02 M de etilenglicol para inactivar el peryodato de sodio restante. La base de Schiff intermediaria, formada entre el extremo amino del péptido y el aldehido formado por oxidación de las porciones carbohidrato de HRP se redujo mediante la adición de 0.2 M de borohidruro de sodio en agua. Se usó cromatografía de cada conjugado péptido-peroxidasa en Sephadex G25, para eliminar los reactivos y el exceso de péptido. En este análisis preferido se usó el anticuefo para unir epítopes identificados en las proteínas de VIH preparadas a partir de los lisatos de virus VIH y péptidos de VIH sintéticos, unidos covalentemente a HRP, puesto que el anticuerpo reactivo con los epítopes de VIH retuvo un sitio de unión de antígeno que pudo reaccionar con los epítopes de péptido sintético fijados a la peroxidasa. Se revistió los granulos con proteínas VIH como se describió anteriormente. Se hizo reaccionar granulos revestidos con IgG anti-VIH de cabra durante 24 horas, se lavó los granulos y se hizo reaccionar con el substrato para determinar la actividad de peroxidasa y, por consiguiente, la unión de péptido. Con este procedimiento se reconoció sólo los epítopes exactos contenidos entro del péptido sintético. En este análisis se identificó el repertorio completo de las reactividades de cabra. Se comparó las reactividades anti-VIH humano y anti-VIH de cabra, y se seleccionó los péptidos que reaccionaron únicamente con el anti-VIH de cabra, como blancos de destino de epítope candidatos. Estos datos no fueron considerados incluyendo todos las diferencias entre la reactividad humana y de cabra a las proteínas de VIH, puesto que las diferencias entre estas reactividades y las desviaciones entre las homologías de secuencia de péptido de aminoácido en la proteína VIH pudieron dar por resultado reactividad de epítope faltante, secundaria para la selección del péptido sintético.

EJEMPLO 9 EFICACIA DE ANTICUERPO COMO AGENTE TERAPÉUTICO ST llevó a cabo un estudio con un grupo de anticuefos inmunoquímicamente diseñados para determinar la eficacia de los anticuerpos como un agente terapéutico para el tratamiento de VIH/SIDA. Específicamente se trató una mezcla de lisatos de aislados de VIH VIH1MN, VIHI BAL y VIH2NZ, como en el ejemplo 3, para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular y los antígenos HLA de clase I y de clase II, y para desglicosilar las proteínas de VIH. Se analizó la mezcla de proteína y se encontró que constaba de péptidos que reproducían o imitaban las siguientes regiones de proteínas VIH1SF2: gp120: una región epítope que se extiende desde el residuo 4-27 de aminoácido y una segunda región epítope que se extiende desde el residuo 54-76 de aminoácido; gp41: una región epítope que se extiende desde el residuo 502-531 de aminoácido; el heterodímero p66/55 de transcriptasa inversa: una región epítope que se extiende desde el residuo 254-295 de aminoácido; proteasa p10: una región epítope que se extiende desde la región 69-94 de aminoácido; proteína p24 de gene Gag: una región epítope que se extiende desde la región 166-181 de aminoácido; proteína p17 de gene Gag: una región epítope que se extiende desde la región 2-23 de aminoácido y una segunda región epítope que se extiende desde la región de aminoácido 89-122; y proteína p7 de gene Gage: una región epítope que se extiende desde la región 390-41 y 438-443 de aminoácido. Estas secuencias de aminoácido no pueden desatar una respuesta inmunológica en humanos cuando se ponen en contacto por medio de infección o naturalmente a través del ambiente, pero sí provocan una respuesta inmunológica en otras especies de mamíferos.

Se enriqueció las proteínas purificadas y tratadas y se las purificó adicionalmente usando electroforesis de SDS-PAGE preparatoria y, cuando se desea, mediante cromatografía por inmunoafinidad empleando anticuefos monoclonales obtenibles comercialmente (ICN Costa Mesa, CA, y Advanced Biotechnologies, Columbia, MD, E. U. A.), para gp120, gp41, pp66/55, p24, p17 y p10, cada uno acoplado individualmente a Sepharose CL4B, usando procedimientos conocidos en la técnica. Después de la purificación, cada péptido de proteína de VIH purificado, de interés, fue conjugado individualmente a la micropartícula de MDP que está descrita en el ejemplo 4. Se formuló los conjugados de VIH-MDP en micropartículas como una combinación que contenía concentraciones equimolares de cada proteína/péptido de VIH, a una concentración final de aproximadamente 1 mg de proteína/ml de salina fisiológica. Se emulsificó 0.5 ml de combinación VIH/MDP en 1.5 ml de escualeno que contenía 0.05% de Tween 80, y se inyectó subcutáneamente en 60 cabras en 4 a 6 sitios de inyección por cabra. Se dio inmunizaciones de refuerzo a intervalos mensuales para obtener las respuestas de anticuerpo. Se obtuvo mensualmente muestras de suero de cada cabra, antes del refuerzo mensual, y se probó mediante análisis de manchado Western, neutralización de VIH e inmunoanálisis con enzima, descritos en el ejemplo 8.6. Una vez que se obtiene la respuesta de anticuerpo deseada, se sometió las cabras a plasmaféresis desde la vena yugular, empleando una máquina Baxter A 201-A-401 Autophresis. Se regresó los glóbulos rojos de cabra en salina fisiológica. El volumen de plasma recogido de cada animal, en cada plasmaféresis fue de 350 ml ± 5.0 ml. Se fraccionó el plasma inmunológico caprino con ácido octanoico, después de ajustar el pH a 4.8 con ácido clorhídrico. Se centrifugó la mezcla y se hizo pasar a través de un filtro de carbón activado para eliminar los aglomerados y reducir el nivel de ácido octanoico a menos de 0.05%. Se purificó adicionalmente la fracción que contiene inmunoglobulina (IgG) haciéndola pasar a través de una serie de columnas: 1. Sephadex G25 con 20 mM de regulador fosfato; 2. Cambio de iones con Whatman DE53 equilibrado en regulador fosfato; 3. Sephadex G25 equilibrado en salina al 0.9%. Se filtró en filtro estéril el filtrado de la columna final y luego se concentró o se diluyó para dar una concentración final de 10 mg de IgG/ml, con la actividad biológica deseada. Los análisis SDS-PAGE y de manchado Western demostraron reactividad de la inmunoglobulina IgG caprina a una dilución de 1:100 con las siete distintas proteínas virales como gp120, gp41, p51/66, p24, p17, p7 y p10. Los análisis para la neutralización de VIH demostraron amplia neutralización de cepas de laboratorio y silvestres de VIH1, como las descritas en el ejemplo 8.3. El análisis por inmunoanálisis enlazado a enzima, descrito en el ejemplo 8.3, demostró reacciones positivas a los nueve epítopes deseados en diluciones de muestra de 1:1000 o más. Se dio a los lotes de producción que satisfacían estos criterios, el nombre comercial de HRG214, como se describe, y consistieron de IgG caprina libre de pirógenos, estéril, a una concentración de 10 mg/ml suspendida en 0.9% de cloruro de sodio, sin excipientes. Cada lote de producción es comparado con el lote de referencia, como se describe aquí, para determinar la equivalencia de la actividad de HRG214. La potencia se expresa como mg-equivalente/ml. Se seleccionó varones y mujeres no embarazadas, de más de 18 años, con base en si tenían un serodiagnóstico de infección por VIH documentado por manchado de Western, con criterios definidores de SIDA, clínicamente sintomáticos, y con una cuenta de linfocitos CD4 T <300 células/ul en el término de 30 días antes de entrar al estudio. Se usó parámetros clínicos y de laboratorio para evaluar la eficacia. Los parámetros clínicos incluyeron cambios en infecciones oportunistas, cambios en el peso del cuerpo, cambios en la función gastrointestinal, incluyendo consistencia de evacuación y frecuencia de ella, cambios en el nivel de energía, cambios en el apetito, la fuerza física y la resistencia, y un cambio general en la calidad de vida. Los parámetros de laboratorio incluyeron cambios en los números de linfocitos CD4 y CD8, hematología seleccionada, química sanguínea y urinálisis y, cuando estuvo disponible, cambios en cargas virales midiendo el ARN viral mediante RCP. Los resultados del estudio mostraron que, con el uso de los anticuerpos diseñados inmunoquímicamente, los pacientes mejoraron clínicamente, con disminución en las infecciones oportunistas, aumento de peso de cuefo, cambios en la función gastrointestinal, incluyendo diarrea menos severa, aumentos en el nivel de energía, aumento en el apetito, mejora en la fuerza y resistencia física, y una mejora general en ia calidad de vida. Los parámetros de laboratorio mostraron mejoras con aumento en el número de linfocitos CD4 y CD8, mejora en hematología, química sanguínea y números de análisis de orina, así como disminución en las cargas virales midiendo el ARN viral mediante RCP, y disminución en la infectividad, cuando se midió por TCID. Los resultados detallados de laboratorio del estudio están señalados en ios cuadros anexos 91. A 9.13.

EJEMPLO 9.1 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA TOXICIDAD Y LA EFICACIA DE HRG214 EN EL TRATAMIENTO DE PACIENTES INFECTADOS CON VIH Se trató treinta y cinco pacientes infectados con VIH, con HRG214. Se evaluó HRG214 en cuanto a su eficacia para reducir la carga viral de VIH y mejorar el avance y los síntomas de la enfermedad. Se estratificó los pacientes mediante el número de CD4/mm3 (<200 y >200) el régimen terapéutico: Grupo 1 : HRG214 CD4<200, n = 11. Grupo 2: HRG214 y tratamiento repetido mensualmente; CD4<200, n=6. Grupo 3: HRG214 y tratamiento repetido al avance, CD4<200, n=5. Grupo 4: HRG214 CD4>200, n = 7 Grupo 5: HRG214 y tratamiento repetido al avance (los pacientes están recibido quimioterapia para la malignidad), CD4<200, n = 6. Grupo 6: control con placebo CD4>500, n=3. Grupo 7: Control con placebo, CD4>200-500, n=3. Los pacientes de los grupos de tratamiento recibieron 21-28 infusiones diarias de HRG214 a 1-1.5 mg/kg de peso del cuefo. Se volvió a tratar los pacientes con CD4 <200 durante tres días, mensualmente (n = 6) o se los volvió a tratar con evidencia de avance de VIH (n = 11). Se limitó las reacciones adversas a fiebre menor de <2°C, calofríos, dolor de cabeza y dolor muscular. Las mediciones de química clínica y hematología durante y después del tratamiento permanecieron invariables o mejoraron en todos los pacientes durante un periodo de 90 días. Se evaluó veintiocho pacientes para los cambios en el estado nutricional. Veinticuatro aumentaron de alrededor de 1 a 10 kg de peso de cuerpo, con un aumento medio de alrededor de 2 kg (p = 0.0014). Cuatro de los seis pacientes que recibían quimioterapia sistémica para malignidad permanecieron estables (n = 2) o perdieron peso (alrededor de 1 y 2.7 kg, respectivamente). Los aumentos de pesos estaban correlacionados directamente con los aumentos en las mediciones de proteína total del suero y albúmina del suero. El ARN-VIH cuantitativo disminuyó en todos los grupos de tratamiento.

La velocidad de pérdida de CD4/mm3 con el tiempo en todos los grupos de tratamiento se redujo (p<0.01) en comparación con los grupos de control 6 y 7. Se observó un aumento sostenido de CD4 en los grupos 2, 3 y 4. Las mediciones de infectividad mediante microcultivo (TCID) demostraron una reducción logarítmica 2 en infectividad mediante tratamiento en el día 7-14 (p<0.001), que no fue obvia de las mediciones cuantitativas de VIH-ARN. Los cambios clínicos incluyeron aumentos de apetito y estamina con notables mejoras en el síndrome de fatiga crónica, diarrea, mala absorción, candidiasis, VMC (retinitis excluida) Hefes simplex y zoster, Molluscum contagiosum cutáneo, leucoplaquia pilosa oral, síndrome de desperdicio, foliculitis bacteriana y neumonitis, así como neuropatía periférica relacionada con VIH. HRG214 ofrece un nuevo fármaco que ayuda al manejo de la infección por VIH.

Los datos para los grupos de pacientes 2-5 están presentados con mayor detalle en lo que sigue: Grupo de pacientes 2: Pacientes n = 6 Objetivo primario: Evaluar la seguridad y la eficacia del tratamiento con HRG214 de la infección por VIH, a una dosis diaria de 1.5 mg/kg/día durante 28 días y un tratamiento repetido mensualmente 3 veces. El seguimiento clínico continuará durante 3 años. Los pacientes tendrán opciones de tratamiento repetido con la recurrencia. Puntos finales: La normalización de parámetros clínicos y de laboratorio, incluyendo mejora en infecciones oportunistas, incidencia de infecciones, síndrome de desperdicio, neuropatía periférica y mejora en la química de sangre y la hematología anormales, CD4 y CD8 y reducciones en VIH-ARN, se cuantificaron mediante RCP. Las variables de seguridad incluyen: Química sanguínea y hematología y parámetros clínicos. La variable de eficacia incluye: VIH-ARN cuantitativo mediante RCP, cuentas de CD4 y CD8. Período de seguimiento = 3 años Período de seguimiento a la fecha = >345 días. Estudio demográfico: Pacientes n = 6. Fecha de inicio: 23 de octubre de 1995; Días transcurridos: 390; sobrevivientes = 6; defunciones = 0; pérdida de seguimiento = 0.

Demografía de paciente: VIH positivo; criterios definidores de SIDA con número de CD4 < 50/mm3. Fármaco(s) de tratamiento: HRG-214 - 1.5 mg/kg/día, con tratamientos repetidos mensualmente.

CUADRO 9.2 GRUPO DE PACIENTES 2 CUADRO 9.3 GRUPO DE PACIENTES 2 CUADRO 9.4 GRUPO DE PACIENTES 2 Grupo de pacientes 3: Pacientes n = 5 Objetivo primario: Evaluar la seguridad y la eficacia del tratamiento con HRG 214 de la infección por VIH a una dosis diaria de 1.5 mg/kg/día durante 28 días. Ei seguimiento clínico continuará durante 3 años. Los pacientes tendrán opciones de repetir tratamiento con la recurrencia. Puntos finales: La normalización de los parámetros clínicos y de laboratorio que incluyen mejoras en infecciones oportunistas, incidencia de infecciones, síndrome de desperdicio, neuropatía periférica y mejoras en química sanguínea y hematología anormales, CD4 Y CD8 y reducciones en VIH-ARN, fueron cuantificados mediante RCP. Las variables de seguridad incluyen: Química sanguínea y parámetros de hematología y clínicos. La variable de eficacia incluye: VIH-ARN cuantitativo mediante cuentas de RCP, CD4 y CD8. Período de seguimiento = 3 años. Período de seguimiento hasta la fecha = >469 días. Fecha de inicio: 13 de junio de 1995; días transcurridos, 380; sobrevivientes = 3; defunciones = 2; pérdida de seguimiento = 0. Población de pacientes: Pacientes positivos al VIH con criterios definidores de SIDA. Cinco (5) de los cinco (5) pacientes tenían CD4 <50/mm3 de sangre. El VIH-ARN cuantificado mediante RCP demostró reducciones estadística-mente importantes después del tratamiento; el día 7 (P = 0.0179) y los días 21-28 (P = 0.043). Las mediciones de VIH-ARN los días 60-90 y 120-150 demostraron valores reducidos pero que aumentaban de VIH-ARN. Los 5 pacientes fueron tratados de nuevo (tres dosis consecutivas mensualmente, comenzando entre los días 120-150). Después del nuevo tratamiento se observó una caída estadísticamente importante (P = 0.0006) en las mediciones del VIH-ARN el día >250. Se llevó a cabo análisis estadísticos utilizando prueba t por pares, prueba de rango firmado de Wilcoxon y prueba de suma de rango de Mann-Whitney. FECHA DE INICIO: 13 de junio de 1995 FECHA DE FINALIZACIÓN: abierta CUADRO 9.5 GRUPO DE PACIENTES 3 CUADRO 9.6 GRUPO DE PACIENTES 3 CUADRO 9.7 GRUPO DE PACIENTES 3 Grupo de Pacientes 4 Pacientes n = 7 Objetivo primario: Evaluar la toxicidad y la eficacia del tratamiento con HRG214 de infección por VIH a una dosis diaria de 1.5 mg/kg/día durante 28 días con inductor de IFN los días 1-7 y 21-23. El seguimiento clínico continuará durante 3 años. Los pacientes tendrán opción a repetir el tratamiento con la recurrencia. Puntos finales: Normalización de parámetros clínicos y parámetros de laboratorio que incluyen mejora en IO, incidencia de infecciones, síndrome de desperdicio, etc., en química sanguínea y hematología anormales, CD4 y CD8, reducciones en VIH-ARN cuantificado por RCP. Período de seguimiento: 3 años. Periodo de seguimiento hasta la fecha: >405 días. Demografía del estudio: Pacientes n = 7; fecha de inicio: 25 de agosto de 1995; Hasta el día 390, sobrevivientes: 7; defunciones: 0, pérdida de seguimiento: 0. Demografía de pacientes: Pacientes positivos a VIH con número de CD4 >200 sin criterio definidor de SIDA. Fármaco(s) del tratamiento: 1.5 mg/kg/día durante 28 días. Los pacientes tendrán opción a repetir el tratamiento con ia recurrencia.

CUADRO 9.8 GRUPO DE PACIENTES 4 CUADRO 9.9 GRUPO DE PACIENTES 4 CUADRO 9.10 GRUPO DE PACIENTES 4 Grupo de pacientes 5. Pacientes n = 6 Objetivo primario: Evaluar la toxicidad y la eficacia del tratamiento con HRG214. El seguimiento clínico continuará durante tres años. Los pacientes tendrán opciones de repetir el tratamiento con la recurrencia. Puntos finales: Normalización de los parámetros clínicos y parámetros de laboratorio que incluyen la mejora en IO, incidencia de infecciones, síndrome de desperdicio, etc., en química sanguínea y hematología anormales, CD4 y CD8, reducciones en VIH-ARN cuantificados mediante RCP. Periodo de seguimiento: 3 años. Periodo de seguimiento a ia fecha: >469 días.

Fecha de inicio: 13 de junio de 1995; hasta el día 270, sobrevivientes = 2; defunciones = 4 (2 defunciones entre 180-210; 1 defunción entre 240-270; una defunción después de 270); pérdida de seguimiento: 0. Población de pacientes: Pacientes positivos a VIH con criterios definidores de SIDA que incluyen CDR<200/mm3 de sangre y sarcoma de Kaposi diseminado. Se trató pacientes con quimioterapia sistémica. Dos pacientes murieron entre los días 180-210 y dos pacientes murieron después del día 240. VIH-ARN cuantificado mediante RCP, demostró reducciones en los días 60-90, 120-150, 180-210 y 240-270 (p = 0.018). Se efectuó análisis estadístico usando análisis t por pares, análisis Wilcox, de rango firmado y de suma de rango de Mann-Whitney.

CUADRO 9.11 GRUPO DE PACIENTES 5 CUADRO 9.12 GRUPO DE PACIENTES 5 CUADRO 9.13 GRUPO DE PACIENTES 5 BIBLIOGRAFÍA 1. H. Mitsuya, S. Broder, Nature 325, 773-778 (1987). 2. The Molecular Biology of Tumor Viruses, J. Tooze y otros, Ed. (1973). 3. RNA Tumor Viruses, R. Weiss, Ed. (1982). 4. F. González-Scarano, R. E. Shoppe, C. E. Calisher, N. Nathanson, Virology, 120, 42-53 (1982). 5. S. Matsuno, S. Inouye, Infection and Immunity, 390, 155-158 (1983). 6. J. Mathews, J. Roehrig, The Journal of Immunology, 129 2763.2767 (1982). 7. M. Robert-Guroff, M. Brown, R. Gallo, Nature 316, 72-74 (1985). 8. R. Weiss, y coautores, Nature 316, 69-72 (1985). 9. T. Matthews y coautores, Proceedings of the National Academy of Sciences 83, 9709-9713 (1986). 10. W. Robey y coautores, Proceedings of the National Academy of Sciences, 83, 7023-7027 (1986). 11. L. Lasky y coautores, Science 233, 209-212 ( 1986). 12. D. Zagury y coautores, Nature 326, 249-250 (1987). 13. J. McDougal y coautores, Science, 231 , 382-385 (1986) 14. S. Putney y coautores, Science 234, 1392-13905 (1986) 15. S. Norley, R. Kurth, The Retroviridae, J. Levy Ed. (Plenum Press, 1994), tomo 5. 16. J. Carlson, JAMA 260, 674-679 (1988). 17. J. Lange y coautores, British Medical Journal 292, 228-230 (1986). 18. J. McDougal y coautores, Journal of Clincal Investigation, 80, 316-324 (1987). 19. A. Amadori, A. De Rossi, G. Faulker-Valle, 1. Chieco-Bianchi, Clinical Immunology and Immunopathology, 46, 342-351 , ( 1988). 20. A. Amardori y coautores, The Journal of Immunology, 89, 2146, 2152 (1989). 21. E. Barker, S. W. Barnett, L. Stamataos, J. A. Levy, en The Viruses: The Retroviridae, J. A. Levy Ed. (Plenum Press, New York y Londres, 1995), tomo 4, páginas 1 -7. 22. J. A. Levy en HIV and the Pathogenesis of AIDS, A. Press, Ed. (ASM Press, Washington, DC, E. U. A., 1994), páginas 1-5. 23. D. F. Nixon, K. Broliden, G. Ogg, P.-A. Broliden, Immunology 76, 515- 534 (1992). 24. P. Linsley, J. Ledbetter, E. Kinney-Thomas, S.-L Hu, J Virology 62, 3695-3702 (1988). 25. M. Thali y coautores, J. Virology, 66 (5635-5641 (1992). 26. A. Benjouard, J. Gluckmna, H. Rochat, L. Montagnier, E. Bahroui, J. Virology, 66, 2473-83 (1992). 27. T. Chanh y coautores, The EMBO Journal, 5, 3065-71 (1986). 28. J. Homsy, M. Meyer, J. Levy, J. Virology 64, 1437-40 (1990). 29. M. Tremblay y coautores, J. Immunology, 145, 2896-2901 (1990). 30. R. Garry, Science 250, 1127-1129 (1990). 31. M. Mackett, G. Smith, B. Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79, 7415- 7419 (1982). 32. D. Panicali, E. Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 4927-4931 (1982). 5 33. S.-L. Hu, S. Kosowski, J. Carymple, Nature, 320, 537-540 (1986). 34. S. Chakrabarti, M. Robert-Guroff, F. Wong-Staal, R. Gallo, B. Moss, Nature 320, 535-537 (1986). 35. D. G. Kleid y otros, Science 214, 1125-1129 (1981). 36. C. Cabradilla y coautores, Bio/Technology, 4, 128-133 (1986). l o 37. 37Current Protocols in Immunology (John Wiley % Sons, 1995). 38. Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a. Edición, 1990). 39. B. Karpovsky, J. Titus, D. Stephany, D. Segal, Journal of Experimental Medicine, 160, 1686-1701 (1984). 15 40. P. Cuatrecasas, Advances in Enzymology 36, 29 (1972). 41. P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay (1985). 42. Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemicals Co., 2a. Edición, 1984). 43. J. Tam y coautores, Journal American Chemical Society 105, 6442 0 (1983). 44. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). 45. Z. Grabarek, J. Gergely, Analytical Biochemistry, 185 (1990). 46. J. Staros, R. Wright, D. Swingle, Analytical Biochemistry, 156, 220-222 (186). 47. R. Timkovich, Analytical Biochemistry, 79, 135-143 (1977). 48. F. Gelder y coautores, Annals of Surgery, 591 -599 (1991 ) 49. M. Fung y coautores, J. Virology, 66, 858-56 (1992).

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1 : (ii) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: No relevante (D) TIPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 : Lys Gly Thr Arg Arg Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Met Leu Met De Cys 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIASEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: No relevante (D) TIPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2: Ala Ser Asp Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala 1 5 10 15 Thr His Ala Cys Val Pro Thr 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO:3: (ii) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: No relevante (D) TIPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO. Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO:3: Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly He Val Gly Ala Met 1 5 10 15 Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Val Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO:4: (ii)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 (B) TTPO: aminoácido (C) UPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TEPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HTPOTETICA: NO (v) TD?O DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO:4: Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Tf Glu 1 5 10 15 Lys He Arg Leu Arg Pro 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 (B) TIPO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TrPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TJTO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRffCION DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO:5: Leu Tyr Cys Val His Gln Arg He Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala 1 5 10 15 Leu Glu Lys He Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA'SEQ DO NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 (B) TffO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRTPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6: Pro Glu Val He Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 (B) TTPO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TH?O DE MOLÉCULA: péptido (iii) fflPOTETTCA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His He Ala Lys 1 5 10 15 Asn Cys Arg Ala Pro 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 (B) TIPO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO: 8: Lys He Trp Ser Ser Gln 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ TD NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 (B) TTPO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) Tp>O DE MOLÉCULA: péptido (iii) HTPOTETICA: NO (v) TrPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO:9: Arg He Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 (B) TTPO: aminoácido (C) TTPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO: 10: Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe 20 25 30 Thr He Pro Ser He Asn Asn Glu Thr Pro 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO: 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 (B) ?PO: aminoácido (C) ?PO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (B) CEPA: NZ (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 : Gln Leu Leu He Ala He Val Leu Ala Ser Ala Tyr Leu He His Cys 1 5 10 15 Lys Gln Phe Val Thr Val Phe Tyr Gly He Pro Ala Trp Arg Asn Ala 20 25 30 Ser He Pro Leu Phe 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ DO NO: 12: Gly He Val Gly Ala Met Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser 1 5 10 15 Thr Met Gly Ala 20 s (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIASEQ DO NO: 13: (ii.) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 (B) TIPO: aminoácido (C) UPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA. NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: intemo (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (B) CEPA: SF2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ DO NO: 13: Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ DO NO: 14: (i)CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 (B) UPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: No relevante (D) TOPOLOGÍA: No relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (B)CEPA: NZ (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ DO NO: 14: Leu Leu He Ala He Val Leu Ala Ser Ala Tyr Leu De His Cys Lys 1 5 10 15 Gln

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para detectar la presencia de VIH en una muestra de fluido biológico procedente de un individuo que puede haber sido infectado con VIH, caracterizado porque comprende emplear un anticuefo que reconoce a, y reacciona con, un epítope que corresponde a o imita un epítope en una región neutralizadora o inactivadora de una proteína de VIH, caracterizado porque dicha región neutralizadora o inactivadora de la proteína no puede provocar una respuesta inmunológica en el hombre, cuando se encuentra por infección o por exposición ambiental, en un análisis de anticuerpo-antígeno en el cual se combina el anticuefo con una muestra de fluido corporal del individuo bajo condiciones que conducen a la formación de complejo anticuerpo-antígeno, y determinar si dicho anticuefo se une a un antígeno de VIH.

2.- Un método para detectar la presencia de VIH en un individuo que puede haber sido infectado con VIH, caracterizado porque comprende emplear un anticuerpo que reconoce a, y reacciona con, un epítope que corresponde a o imita un epítope en una región neutralizadora o inactivadora de una proteína de VIH, caracterizado porque dicha región neutralizadora o inactivadora de la proteína no puede provocar una respuesta inmunológica en el hombre, cuando se encuentra por infección o por exposición ambiental, en un inmunoanálisis con enzima, en donde el anticuefo se conjuga a una enzima y se pone en contacto con una muestra de fluido corporal del individuo, bajo condiciones que conducen a la formación del complejo anticuefo-antígeno, y determinar si el anticuerpo se une a un antígeno de VIH.

3.- Un método para purificar proteína que contiene por lo menos un epítope que corresponde o imita a un epítope de una región neutralizadora o inactivadora de una proteína de VIH, a partir de una solución proteínica, dicho método estando caracterizado porque comprende inmovilizar un anticuefo que reconoce a, y reacciona con, un epítope que corresponde a o imita un epítope en una región neutralizadora o inactivadora de una proteína de VIH, caracterizado porque dicha región neutralizadora o inactivadora de la proteína no puede provocar una respuesta inmunológica en el hombre, cuando se encuentra por infección o por exposición ambiental, en un substrato o soporte sólido; poner en contacto dicho anticuerpo inmovilizado con una solución que contiene la proteína bajo condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunológicos entre el anticuefo y la proteína; separar la proteína no unida de la proteína unida al anticuefo, y liberar la proteína unida del anticuerpo y recuperar dicha proteína.

4.- Una composición, caracterizada porque comprende por lo menos una proteína o un fragmento de la misma de un patógeno, en donde dicha proteína o fragmento de la misma comprende por lo menos una región de epítope que no provoca una respuesta inmunológica en una primera especie animal cuando se encuentra a través de infección o de exposición ambiental, pero que si provoca una respuesta inmunológica en por lo menos una segunda especie animal.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la primera especie animal es el hombre y la segunda especie animal es una especie animal no humana.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 4 ó la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha proteína o fragmento de la misma se aisla a partir de un lisado del patógeno.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho lisado ha sido tratado para eliminar antígenos humanos HLA de clase I y de clase II.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha proteína o fragmento de la misma ha sido desglicosilada.

9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizada además porque dicho patógeno es un virus.

10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizada además porque la o cada región de epítope incluye una región neutralizadora o inactivadora de la o cada proteína, o fragmento de la misma.

11.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada además porque dicha región de epítope tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde o imita inmunológicamente a una porción de una secuencia de aminoácidos de proteína humana.

12.- La composición de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones 4 a 11, caracterizada además porque la o cada proteína o fragmento está acoplada a un portador macromolecular.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicho portador es una micropartícula de dipéptido muramílico. ío

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, *• caracterizada además porque dicho dipéptido muramílico comprende un dipéptido terminal de L-alanina-D-isoglutamina.

15.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizada además porque dicha especie animal no 15 humana es un mamífero.

16.- Una composición, caracterizada porque comprende por lo menos un péptido sintético, el o cada péptido comprende por lo menos una región de epítope que corresponde o imita a una región neutralizadora o inactivadora de una proteína de un patógeno, en donde dicho(s) péptido(s) no 20 provoca(n) una respuesta inmunológica en una primera especie animal cuando se encuentra por infección o exposición ambiental, pero que si provoca una respuesta inmunológica en por lo menos una segunda especie animal.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la primera especie animal es el hombre y la segunda especie animal es una especie animal no humana.

18.- Una composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque dicha por lo menos una región de epítope tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde o imita inmunológicamente a una porción de una secuencia de aminoácidos de proteína humana.

19.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada además porque por lo menos un péptido sintético está acoplado a un portador macromolecular.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque dicho portador es una micropartícula de dipéptido muramílico.

21.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicho dipéptido muramílico comprende un dipéptido terminal de L-alanina-D-isoglutamina.

22.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, caracterizada además porque el patógeno es un virus.

23.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizada además porque la especie no humana es un mamífero.