CN110526990A - 靶向cd30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体CAR‑CD30，所述CAR‑CD30包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种包括所述CAR‑CD30的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR‑CD30可以专一性地靶向CD30阳性肿瘤细胞，激活T细胞发挥细胞免疫作用，实现T细胞对CD30阳性肿瘤细胞高效且特异性的杀伤，且具有持久的细胞活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了该靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法、带该CAR‑CD30编码基因的重组病毒载体等。

Description

靶向CD30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向CD30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势。举例来说，成熟T细胞淋巴瘤(MTCL)是一种罕见的极具侵略性的癌症类型，在过去的几十年里，该病的标准化疗方案一直没有发生变化。CD30蛋白是经典霍奇金淋巴瘤(HL)及系统性间变性大细胞淋巴瘤(sALCL)的明确生物标志物，该蛋白表达于多种类型的非霍奇金淋巴瘤(nHL)及霍奇金淋巴瘤(HL)，可以选择CD30作为肿瘤靶点来进行MTCL的治疗。
CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，可弥补诸如抗体药物偶联物等传统疗法的弊端。然而目前还未有靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的相关研究。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30，以及所述靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30可以专一性地靶向CD30阳性肿瘤细胞，激活T细胞发挥细胞免疫作用，实现其对CD30阳性肿瘤细胞高效且特异性的杀伤，且具有持久的细胞活力和杀伤力。本发明还提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30，所述CAR-CD30包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
可选地，所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选地，所述靶向CD30的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该包括与SEQID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:1。
本发明第一方面提供的所述CAR-CD30能够特异性识别CD30抗原蛋白，与CD30抗原蛋白发生特异性结合，对肿瘤细胞，特别是表达CD30的实体瘤细胞具有较强的亲和活性及内化活性。
第二方面，本发明提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30，所述CAR-CD30如本发明第一方面所述。
可选地，所述CAR-CD30包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD30的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列。其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD30的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
本发明中，所述单链抗体能特异性识别肿瘤细胞上的CD30蛋白，并与其发生特异性结合，对表达CD30的恶性肿瘤细胞具有较强的亲和活性及内化活性。所述胞外铰链区用于促进所述靶向CD30的单链抗体与肿瘤上的CD30结合。所述跨膜区用于固定所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30。所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
其中，所述CAR-CD30中的胞内信号区包括CD27信号区和CD3 ζ信号传导结构域。这里，CD3 ζ信号区为所述T细胞的胞内信号传导结构域(即，第一信号结构域)，CD27信号区作为所述T细胞的共刺激结构域，在它们的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。特别地，选用如SEQ ID NO：10的CD27信号区作为共刺激结构域，可以更好地提升后续T细胞的扩增能力、杀伤活力。
其中，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述CD27信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述CD27信号区的氨基酸序列的羧基端与所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
本发明第一方面提供的靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30及本发明第二方面提供的所述靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)中，所述受体CAR-CD30可供所述T细胞专一性地靶向表达CD30的肿瘤细胞，在CAR-CD30与CD30结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤CD30阳性肿瘤细胞。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第一方面所述的靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因。
可选地，所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。其中，如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相比，多了下述连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CD30表达到细胞表面。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。本发明第四方面提供的制备方法的步骤(1)-(2)示出了所述重组病毒载体的一种制备工艺。
进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
更进一步可选地，所述慢病毒载体包括pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个。具体的，当所述慢病毒载体为pWPXLD载体时，所得重组病毒载体中，CAR-CD30的编码基因位于pWPXLD载体的BamH Ⅰ酶切位点和EcoR Ⅰ酶切位点之间。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体为一安全可靠的载体工具，可以高效地转移所述CAR-CD30的编码基因。所述重组病毒载体可用于制备携带有所述CAR-CD30编码基因的病毒，及制备靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞，使所述T细胞实现高度组织特异性的表达。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。进一步可选地，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第四方面提供的所述宿主细胞用于提供将如第二方面所述的重组病毒载体进行组装并制备生成相应病毒的场所，由宿主细胞制备的病毒携带有所述CAR-CD30的遗传信息，具有强侵染性。
第五方面，本发明提供了一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因，所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD30重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-CD30重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞。
可选地，所述CAR-CD30的编码基因中包括一信号肽的编码基因；带信号肽的所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
其中，如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体C AR-CD30表达到细胞表面，但信号肽在蛋白翻译成熟过程中会被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR-CD30的氨基酸序列仍如SEQ ID NO：1所示，并未带有信号肽的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ IDNO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ IDNO:4。
可选地，所述CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体中BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD30的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)，与pWPXLD载体中BamH1酶切位点(gg atcc)相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点(gaattc)相连，这样就使所述CAR-CD30的编码基因位于BamH1和EcoR1酶切位点之间。
可选地，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、Hela细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选地，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体地，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述CAR-CD30的、如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。特别地，可用于诊断和/或治疗表达CD30的恶性肿瘤，例如成熟T细胞淋巴瘤(MTCL)、系统性间变性大细胞淋巴瘤(sALCL)、非霍奇金淋巴瘤(nHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)等。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向CD30的嵌合抗原受体、如第二方面所述的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CD30重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的基因序列
通过PCR的方法制备得到靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因序列，所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
(2)构建pWPXLd-CAR-CD30重组质粒
将CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD30的编码基因的5’端添加起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH Ⅰ酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR Ⅰ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-CD30重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-CD30重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-CD30重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/ml，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
效果实施例一，评估靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明方法制得的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞(简写为CAR-T-CD30)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)的体外肿瘤杀伤效果进行比较，具体的：在体外将效应细胞(CAR-T-CD30或未经制备的T淋巴细胞)与靶细胞数量比为为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果表明本发明所述的方法制备的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞肿瘤杀伤效果远远高于阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞具有强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例二，评估靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明方法制备的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T-CD30)、未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)以及生理盐水(空白对照组)，在小鼠肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果表明经过本方法制备的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞能够更好的保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡，效果优于阴性对照组和空白组。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 靶向CD30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
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<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Asn His Gly Ala Trp Phe Pro Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Ile
130 135 140
Val Met Thr Gln Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg
145 150 155 160
Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
180 185 190
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Lys
305 310 315 320
Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys
325 330 335
Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln
340 345 350
Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro Arg Val Lys Phe
355 360 365
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
385 390 395 400
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
405 410 415
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
420 425 430
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
435 440 445
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
450 455 460
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 2
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccagc ttcacgagtc tggggctgaa gtggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta tactgactac 180
aatcagaact tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag aacagcctac 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctacagtct attactgtac aagaagggga 300
ccctcgtatg gtaaccacgg ggcctggttt ccttactggg gccaagggac tctggtcact 360
gtctctgcag tctcgagcgg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 420
tcgacgaaca ttgtaatgac ccaatctccc agatccatgt ccatgtctgt aggagagagg 480
gtcaccttga gctgcaaggc cagtgagaat gtggatactt atgtatcctg gtatcaacag 540
aaaccagagc agtctcctaa actcctgata tacggggcat ccaaccggta cactggggtc 600
cccgatcgct tcacaggcag tggatctgca acagatttca ctctgaccat cagcagtgtg 660
caggctgaag accttgcaga ttatcactgt ggacagagtt acagatatcc tcccacgttc 720
ggagggggga ccaagctgga aataaaaacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 840
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 900
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggaaa 960
tatagatcaa acaaaggaga aagtcctgtg gagcctgcag agccttgtcg ttacagctgc 1020
cccagggagg aggagggcag caccatcccc atccaggagg attaccgaaa accggagcct 1080
gcctgctccc ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1140
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1200
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1260
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1320
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1380
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1428
<210> 3
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
caggtccagc ttcacgagtc tggggctgaa gtggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 120
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactggat aaaacagagg 180
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta tactgactac 240
aatcagaact tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag aacagcctac 300
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctacagtct attactgtac aagaagggga 360
ccctcgtatg gtaaccacgg ggcctggttt ccttactggg gccaagggac tctggtcact 420
gtctctgcag tctcgagcgg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 480
tcgacgaaca ttgtaatgac ccaatctccc agatccatgt ccatgtctgt aggagagagg 540
gtcaccttga gctgcaaggc cagtgagaat gtggatactt atgtatcctg gtatcaacag 600
aaaccagagc agtctcctaa actcctgata tacggggcat ccaaccggta cactggggtc 660
cccgatcgct tcacaggcag tggatctgca acagatttca ctctgaccat cagcagtgtg 720
caggctgaag accttgcaga ttatcactgt ggacagagtt acagatatcc tcccacgttc 780
ggagggggga ccaagctgga aataaaaacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggaaa 1020
tatagatcaa acaaaggaga aagtcctgtg gagcctgcag agccttgtcg ttacagctgc 1080
cccagggagg aggagggcag caccatcccc atccaggagg attaccgaaa accggagcct 1140
gcctgctccc ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1200
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1260
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1320
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1380
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1440
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1488
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (10)

1.一种靶向CD30的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向CD30的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30，所述CAR-CD30包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-CD30的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
5.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求1-2任一项所述的靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体。
8.一种靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向CD30的嵌合抗原受体CAR-CD30的编码基因，所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD30的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD30重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-CD30重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞。
9.如权利要求8所述的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CD30的编码基因还包括信号肽的编码基因，带信号肽的所述CAR-CD30的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
10.如权利要求1-2任一项所述的靶向CD30的嵌合抗原受体、如权利要求3-4任一项所述的或如权利要求8-9所述的制备方法制得的靶向CD30的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞或在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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