CN109957546A - 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向CD317的嵌合抗原受体CAR‑CD317，CAR‑CD317包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD317的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，靶向CD317的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，胞内信号区包括顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区，CD28信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。CAR‑CD317可以专一性地靶向CD317，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞。本发明还提供了该T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势。CD317是脂筏相关蛋白，主要表达在肝癌、结肠癌等多种实体瘤细胞上，而在普通细胞中几乎很少表达。CD317的表达往往是细胞对gamma-干扰素通路的应答表现，因此与肿瘤的发生有密切关系。
CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。但目前CAR-T技术的应用还局限于血液瘤，对肝癌等多种实体瘤还未有进展。此外，CAR-T细胞的在体维持能力(persistence)是CAR-T长期疗效的保证，但实际上CAR-T在回输后几天到几周就完全消失，而未能发挥长效持久的杀伤肿瘤细胞的能力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317，。所述靶向CD317的嵌合抗原受体可以专一性地靶向CD317，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，并且几乎不对正常细胞造成损伤。同时人源化单链抗体制得的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞能够持久地维持其自我更新能力和肿瘤杀伤力。本发明还提供了一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317，所述CAR-CD317包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD317的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向CD317的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区，所述CD28信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD317的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
可选的，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
可选的，所述靶向CD317的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:6具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向CD317的单链抗体与肿瘤上的CD317结合。可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:7。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317。可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
本发明中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区。
可选的，所述CD28信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD28信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD28信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
可选的，所述CAR-CD317的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-CD317的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-CD317的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。
本发明第一方面提供的所述靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317，该受体可供所述T细胞专一性地靶向表达CD317的肿瘤细胞，在CAR-CD317与CD317结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤。而且，如SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的CD28信号区作为所述T细胞的共刺激信号，在它与作为T细胞的抗原特异性信号(即，第一信号)的CD3ζ信号区的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。特别地，选用如SEQ ID NO：2的CD27信号区作为共刺激信号，可以更好地提升后续T细胞的扩增能力、杀伤活力。
此外，靶向CD317的单链抗体为人源化单链抗体，这使得所述靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞避免引起人机体的免疫反应，具有持久的在体维持能力(包括活力和杀伤力)。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第二方面所述的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的CAR-CD317的编码基因。
可选的，所述CAR-CD317的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-CD317的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。如SEQID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CD317表达到细胞表面。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体具有很高的感染效率以及转录效率，插入的CAR-CD317编码基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，得到靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，从而使其持续、稳定地表达靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
所述宿主细胞用于组装如第三方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。
进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
第四方面，本发明提供了一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD317的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；其中，所述靶向CD317的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的CD28信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因，所述CD28信号区的编码基因包括编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD317的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD317重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-CD317重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向CD317的单链抗体的编码基因序列的5’端相连，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因序列的3’端与所述胞外铰链区的编码基因序列的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因序列的3’端与所述跨膜区的编码基因序列的5’端相连，所述跨膜区的编码基因序列的3’端与所述胞内信号区的编码基因序列的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-CD317表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因序列应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:14。
对于所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列，可参见本发明第一方面部分的描述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-CD317的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。如SEQID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了所述连接肽的编码基因，但在所述嵌合抗原受体CD317表达到细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的所述嵌合抗原受体CAR-CD317的氨基酸序列中并未带有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
所述CAR-CD317的编码基因序列插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD317的基因序列插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD317的基因序列的5’端还可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入终止密码子与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳可以协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的或如第四方面所述的制备方法制得的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的重组病毒载体或如第三方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤药物中的应用。适用于表达CD317的肿瘤的诊断和治疗等，例如肝癌、结肠癌、宫颈癌等实体瘤。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的重组病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CD317重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的基因序列
分别制备信号肽、靶向CD317的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD28信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因序列如SEQ ID NO：15所示，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因序列如SEQID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因序列如SEQ ID NO：9所示，所述CD28信号区的编码基因序列如SEQ ID NO：11所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向CD317的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD28信号区和CD3ζ信号区的编码基因序列依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因，所述CAR-CD317的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示，其中所述靶向CD317的单链抗体为人源化单链抗体。
(2)构建pWPXLd-CAR-CD317重组质粒
将CAR-CD317的编码基因序列插入到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CD317的编码基因序列插入到pWPXLD载体时，所述CAR-CD317的编码基因序列的5’端添加有起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-CD317重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-CD317重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并后一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；对筛选出的细胞去除磁珠，PBS洗涤，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Glu His Ser Ala
50 55 60
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Arg Ser Met Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Ile Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ala
130 135 140
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 2
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
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Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 3
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Gly Asn Gly Tyr Thr Thr Glu His Ser Ala
50 55 60
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Arg Ser Met Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Ile Val Thr Val Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ala
130 135 140
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
180 185 190
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
305 310 315 320
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
325 330 335
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
340 345 350
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
355 360 365
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
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<210> 4
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctgtgcaa cttctgggtt cacgttctct gattactaca tggcctgggt ccgccagcct 120
ccaggaaagg cacttgagtg gttgggttta attagaaaca aaggtaatgg ttacacaaca 180
gagcacagtg catctgtgag gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagacct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gattaccggt ctatggacta ctggggcgca ggaactatag tcacagtcaa tggtggcggt 360
ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgctcac acaatctaca 420
ccttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatat cctgcagagc cagtgaaagt 480
gttgatagtt atggcaacag ttttatgcac tggttccagc agaaaccagg acagccaccc 540
aaactcctca tctatcgtgc atccaaccta gaatctggga tccctgccag gttcagtggc 600
agtgggtcta ggacagactt caccctcacc attaatcctg tggaggctga tgatgttgca 660
acctattact gtcagcaaag taatgaggat ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg 720
gaaataaaaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgctttt gggtgctggt ggtggttggt 960
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agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 1200
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 1260
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gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 1380
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
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gaaataaaa 729
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<211> 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (10)

1.一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317，所述CAR-CD317包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD317的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向CD317的单链抗体包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的CD28信号区和CD3ζ信号区，所述CD28信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区。
3.如权利要求2所述的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-CD317的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-CD317的编码基因序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
5.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求1-4任一项所述的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的CAR-CD317的编码基因序列。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-CD317的编码基因序列包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体。
8.一种靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD317的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；其中，所述靶向CD317的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的CD28信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因，所述CD28信号区的编码基因包括编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CD317的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD317重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-CD317重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。
9.如权利要求8所述的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CD317的编码基因序列包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
10.一种如权利要求3-4任一项所述的或如权利要求8-9任一项所述的制备方法制得的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤药物中的应用。
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