CN110526976A - 一种靶向psma的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向psma的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向PSMA的单链抗体，所述靶向PSMA的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种包括所述靶向PSMA的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向PSMA的嵌合抗原受体可以专一性的靶向PSMA阳性肿瘤细胞，激活T细胞发挥细胞免疫作用实现对PSMA阳性肿瘤细胞高效且特异性的杀伤，具有持久的细胞活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向PSMA的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向PSMA的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在美国前列腺癌发病率在所有恶性肿瘤中居第一位，死亡率居第二位，仅次于肺癌。我国前列腺癌患者的发病率虽远低于西方国家，但近年来呈显著增长趋势。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membraneantigen，PSMA)一种新近发现的前列腺癌相关抗原，具有很强的前列腺组织特异性，已成为前列腺癌的诊断及治疗研究过程中一种重要的靶蛋白。正常前列腺细胞上的PSMA并不多，但是细胞发生癌变、生长速度越来越快并开始向周围组织开始浸润的时候，越来越多的PSMA出现在肿瘤细胞表面。此外，研究表明，PSMA可能成为肺癌早期筛查的新标志物和治疗新靶点。
目前，针对前列腺癌这类的恶性肿瘤并没有十分有效的治疗手段。而近年来发展的免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，弥补了传统疗法的弊端，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。但是，CART技术目前的应用还局限于血液瘤，对于多种PSMA阳性实体瘤的应用还未有相关研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种靶向PSMA的单链抗体，以及包括所述靶向PSMA的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向PSMA的嵌合抗原受体可以专一性的靶向PSMA阳性肿瘤细胞，激活T细胞发挥细胞免疫作用实现对PSMA阳性肿瘤细胞高效且特异性的杀伤，具有持久的细胞活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向PSMA的单链抗体，所述靶向PSMA的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
可选的，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选的，所述靶向PSMA的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
本发明第一方面提供的所述靶向PSMA的单链抗体能够特异性识别PSMA抗原蛋白，与PSMA抗原蛋白发生特异性结合，对肿瘤细胞，特别是表达PSMA的实体瘤细胞具有较强的亲和活性及内化活性。
第二方面，本发明提供了一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA，所述CAR-PSMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向PSMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向PSMA的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向PSMA的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
在本发明中所述胞外铰链区用于促进所述靶向PSMA的单链抗体与肿瘤上的PSMA结合。
可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
在本发明中所述跨膜区用于固定所述靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA。
可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。
在本发明中所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
可选的，所述胞内信号区为4-1BB信号区和CD3ζ信号区。
可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选的，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
可选的，所述CAR-PSMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-PSMA的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-PSMA的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。
本发明所述靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞可以高效识别并杀伤包括前列腺癌、肺癌等表达有PSMA的癌细胞，尤其适用于前列腺癌细胞或实体肿瘤组织。
本发明第二方面提供的所述靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA，该受体可供所述T细胞专一性地靶向表达PSMA的肿瘤细胞，在CAR-PSMA与PSMA结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤，从而达到清除肿瘤细胞，实现抗肿瘤的目的。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第二方面所述的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的CAR-PSMA的编码基因。
可选的，所述CAR-PSMA的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。更进一步可选地，所述慢病毒载体包括pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体为一安全可靠的载体工具，可以高效转移所述CAR-PSMA的编码基因；所述重组病毒载体可用于制备携带有所述CAR-PSMA的编码基因的病毒。所述重组病毒载体还可以用于靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备，使所述T细胞实现高度组织特异性的表达。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。
进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第四方面提供的所述宿主细胞用于提供将如第三方面所述的重组病毒载体的组装并制备生成相应病毒的场所，由宿主细胞制备的病毒携带有所述CAR-PSMA的遗传信息，具有强侵染性。
第五方面，本发明提供了一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向PSMA的单链抗体的编码基因、CD8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因，其中，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示；
(2)将所述CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-PSMA重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-PSMA重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒感染CD3阳性T淋巴细胞；
(5)分离并获得靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因序列的5’端相连，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因序列的3’端与所述胞外铰链区的编码基因序列的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因序列的3’端与所述跨膜区的编码基因序列的5’端相连，所述跨膜区的编码基因序列的3’端与所述胞内信号区的编码基因序列的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-PSMA表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:14。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-PSMA的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示。所述CAR-PSMA的编码基因序列中包括所述信号肽编码基因的核苷酸序列。对应地，所述所述CAR-PSMA的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
所述CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-PSMA的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、Hela细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向PSMA的单链抗体、如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。特定地，可用于预防、诊断和治疗多种肿瘤，包括前列腺癌、肺癌等表达有PSMA的癌细胞，尤其适用于前列腺癌细胞或实体肿瘤组织。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向PSMA的单链抗体、如第二方面所述的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞可以专一性的靶向PSMA，促进T细胞在患者体内的扩增，能够高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时PSMA在肿瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱，因此靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞可以特异性的结合PSMA阳性肿瘤细胞，对PSMA阳性肿瘤细胞产生杀伤效果，对正常细胞不会造成损伤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-PSMA重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA的基因序列
分别制备信号肽、靶向PSMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：15所示，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ IDNO：11，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向PSMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA的编码基因，所述CAR-PSMA的编码基因如SEQ ID NO：5所示。
(2)构建pWPXLd-CAR-PSMA重组质粒
将CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体时，所述CAR-PSMA的编码基因的5’端添加起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-PSMA重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-PSMA重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-PSMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/ml，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
效果实施例一，评估靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明方法制得的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞(简写为CAR-T-PSMA)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)的体外肿瘤杀伤效果进行比较，具体的：在体外将105个效应细胞(CAR-T-PSMA或未经制备的T淋巴细胞)与靶细胞(PC-3前列腺癌细胞)数量比为为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果表明本发明所述的方法制备的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞肿瘤杀伤效果远远高于阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞具有强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例二，评估靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
将经过本发明方法制备的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T-PSMA)、未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)以及生理盐水(空白对照组)，在小鼠肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果表明经过本方法制备的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞能够更好的保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡，效果优于阴性对照组和空白组。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种靶向PSMA的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
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Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
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Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgag ctggtgaaac ccggcaccag cgtgaggatc 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc gagtacacca tccactgggt gaagcagagc 120
cacggcaagt ctttagagtg gatcggcaac atcaacccca acaacggcgg caccacctac 180
aaccagaagt tcgaggacaa ggccactctg accgtggaca agagcagctc caccgcctac 240
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aacttcgact actggggcca aggtacaact ttaactgtga gcagcggagg cggaggatct 360
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<210> 3
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
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Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly
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Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser
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Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly
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Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Thr Asn Val
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Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
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Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
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<212> DNA
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cgc 1383
<210> 5
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<212> DNA
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20
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<212> DNA
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<400> 13
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Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
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Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
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Asn Gln Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
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Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe
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Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser
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Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val
195 200 205
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
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275 280 285
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
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Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
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Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
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Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470 475 480
Arg

Claims (10)

1.一种靶向PSMA的单链抗体，其特征在于，所述靶向PSMA的单链抗体包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向PSMA的单链抗体，其特征在于，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA，所述CAR-PSMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向PSMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向PSMA的单链抗体包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-PSMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
5.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求3-4任一项所述的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的CAR-PSMA的编码基因。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-PSMA的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体。
8.一种靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向PSMA的嵌合抗原受体CAR-PSMA的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向PSMA的单链抗体的编码基因、CD8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因，其中，所述靶向PSMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-PSMA的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-PSMA重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-PSMA重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒感染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞。
9.如权利要求8所述的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
10.一种如权利要求1-2任一项所述的靶向PSMA的单链抗体、如权利要求3-4任一项所述的或如权利要求8-9所述的制备方法制得的靶向PSMA的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞或在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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