CN105246504A - 用于免疫疗法的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供免疫应答细胞，包括T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞和自然杀伤(NK)细胞，其表达抗原识别受体和抑制性嵌合抗原受体(iCAR)。使用免疫应答细胞的方法包括用于治疗瘤形成和其他需要增加抗原特异性免疫应答的病理的方法。

Description

用于免疫疗法的组合物和方法

优先权要求

本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时申请第61/802,118号的优先权，其内容通过引用的方式全部并入本文。

技术领域

本发明提供免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与第一抗原结合的抗原识别受体以及与第二抗原结合的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其中抗原识别受体与第一抗原的结合激活免疫应答细胞，且iCAR与第二抗原的结合抑制免疫应答细胞。本发明还提供制备免疫应答细胞的方法，以及通过使用免疫应答细胞来治疗癌症的方法。

背景技术

基于T细胞的疗法在骨髓和器官移植、癌症免疫疗法、病毒感染和自身免疫疾病中具有医疗潜能。然而，主要的治疗相关的并发症源于T细胞对正常组织的非意向反应性，例如在供体淋巴细胞输注后的移植物抗宿主病(GVHD)，或者在自体靶向T细胞疗法中的“中靶非肿瘤反应性”。

供体淋巴细胞输注(DLI)在同种异体骨髓移植(BMT；全世界每年25,000例)中的应用已经在某些患者亚群中产生出显著的医疗获益。近来，随着以治疗转移性实体瘤方式的试验，DLI已经显示出对具有转移性肾脏细胞癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌的患者提供有效治疗。DLI的关键效能，即作为在血液学恶性肿瘤背景下的移植物抗白血病(GVL)，因引起急性以及慢性移植物抗宿主病(GVHD)(超过40％的比例)而受到以下程度的限制，一些研究组得到的结论是，DLI的当前方案无法改善存活率，除非实现GVHD引发率的降低。

同样地，癌症免疫疗法试验已经报道了TCR和CAR工程化T细胞的“中靶非组织”不利事件，包括例如，在用表达CD19CAR抗体的细胞治疗的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中的B细胞发育不全、由抗-ERBB2CAR的T细胞对肺上皮细胞的交叉反应性引起的致死性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、以及在用Mage-A3TCR治疗的黑色素瘤和骨髓瘤患者中由心肌坏死引起的死亡。

非特异性免疫抑制和T细胞清除当前为仅有的控制非期望的T细胞应答的方法，代价是消除治疗益处并造成严重的二次并发症。它们依赖于症状的出现，而症状可能是严重的并偶尔是难处理的，因而，限制了其他有效细胞治疗的应用。

急需防止细胞副作用后果的策略。当前的方法无法使用更高复杂度的T细胞疗法作为在控制不期望的副作用方面的有利之处。因而，急需新的治疗策略。

发明内容

本发明大体上提供免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、和调节性T细胞)，其表达具有免疫细胞激活活性的抗原结合受体(例如，CAR或TCR)以及选择性地减少或消除免疫应答细胞的免疫活性的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)。因此，减少免疫应答细胞的靶化作用。在一些实施方式中，免疫活性的降低是可逆的。因而，本发明提供使用这些免疫应答细胞来治疗瘤形成、感染病和其他病理的方法。

在一个方面，本发明提供分离的免疫应答细胞，其包含与第一抗原结合的抗原识别受体(其中，该结合激活免疫应答细胞)以及与第二抗原结合的抑制性嵌合抗原受体(其中，该结合抑制免疫应答细胞)。

在另一个方面，本发明提供减少受试者中的肿瘤负荷的方法，该方法涉及在该受试者中施用有效量的免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与第一抗原结合的抗原识别受体(其中，该结合激活免疫应答细胞)以及与第二抗原结合的抑制性嵌合抗原受体(其中，该结合抑制免疫应答细胞)，从而诱发肿瘤细胞死亡。与非肿瘤细胞相比，该方法可以选择性地靶向肿瘤细胞。在一些实施方式中，该方法减少肿瘤细胞的数量。在一些实施方式中，该方法减少肿瘤大小。在其他实施方式中，该方法在受试者中根除肿瘤。

在另一方面，本发明提供增加患有瘤形成的受试者的存活率的方法，该方法涉及在该受试者中施用有效量的免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与第一抗原结合的抗原识别受体(其中，该结合激活免疫应答细胞)以及与第二抗原结合的抑制性嵌合抗原受体(其中，该结合抑制免疫应答细胞)，从而治疗或预防瘤形成。在某些实施方式中，瘤形成选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓癌、成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肉瘤和急性髓细胞样白血病(AML)。

在另一个方面，本发明提供用于制备抗原特异性免疫应答细胞的方法，该免疫应答细胞包含与第一抗原结合的抗原识别受体，该方法涉及向免疫应答细胞引入编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列，该抑制性嵌合抗原受体与第二抗原结合，其中该结合抑制免疫应答细胞。

在另一个方面，本发明提供抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其包含与抗原结合的胞外结构域；与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域；以及激活细胞内信号转导以降低免疫应答的胞内结构域，该胞内结构域与跨膜结构域可操作地连接。在一些实施方式中，胞内信号转导结构域选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽。此外，抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还可以包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。在一些实施方式中，抗原与iCAR的结合激活用于减少免疫应答的胞内信号转导结构域。

在相关的方面，本发明提供编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列，该抑制性嵌合抗原受体与抗原结合，其中该结合激活用于减少免疫应答的胞内信号转导结构域。

在另一相关方面，本发明提供包含编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列的载体，该抑制性嵌合抗原受体与抗原结合，其中该结合激活用于减少免疫应答的胞内信号转导结构域。

在相关的方面，本发明提供药物组合物(用于治疗瘤形成或病原体感染)，其在药学可接受赋形剂中包含有效量的本发明免疫应答细胞。

在另一个方面，本发明提供用于治疗瘤形成、病原体感染、自免疫病症或同种异体移植的试剂盒，该试剂盒包含免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与第一抗原结合并激活免疫应答细胞的抗原识别受体、以及与第二抗原结合并抑制免疫应答细胞的抑制性嵌合抗原受体。在多种实施方式中，该试剂盒还包含用于使用该细胞来治疗患有瘤形成、病原体感染、自免疫病症或同种异体移植的受试者的书面说明书。

在另一方面，本发明提供调节受试者中的移植物抗白血病应答或移植物抗肿瘤应答的方法，该方法涉及在受试者中施用有效量的对受试者同种异体的包含与抗原结合(该结合抑制同种异体免疫应答细胞)的抑制性嵌合抗原受体的免疫应答细胞，从而调节移植物抗白血病应答或移植物抗肿瘤应答。在某些实施方式中，受试者患有转移性乳腺癌、血液学恶性肿瘤或实体瘤，且人白细胞抗原(HLA)为HLA-I。在某些实施方式中，受试者患有已经历上皮间质转化(EMT)的肿瘤，且抗原为上皮间质转化(EMT)抗原、上皮细胞钙粘蛋白和细胞角蛋白中的一种或多种。在多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体与抗原的结合在包含抗原的细胞中减少细胞死亡。该方法可以减少受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)或其症状。

在本文所述方面的多种实施方式中，第一抗原或抗原识别受体的抗原是肿瘤或病原体抗原。在特别的实施方式中，抗原识别受体的抗原为一种或多种选自CD19、CAIX、CEA、CD5、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、F8P、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-α2、κ-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、Muc-1、Muc-16、NKG2D配体、NY-ESO-1、瘤胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、和WT-1的肿瘤抗原。

在本文所述方面的多种实施方式中，第二抗原或抑制性嵌合抗原受体的抗原为CD33、CD38、人白细胞抗原(HLA)、器官特异性抗原、血脑屏障特异性抗原、上皮间质转化(EMT)抗原、上皮细胞钙粘蛋白、细胞角蛋白、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子(OPCML)、HYLA2、结直肠癌缺失蛋白(DCC)、核基质结合区结合蛋白1(SMAR1)、细胞表面碳水化合物、或粘蛋白型O-聚糖。在本文所述方面的多种实施方式中，抗原与iCAR的结合激活用于减少免疫应答的胞内信号转导结构域。

在本文所述方面的多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体经重组表达。在本文所述方面的多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体由载体表达。在本文所述方面的多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的胞内信号转导结构域。在本文所述方面的多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的跨膜结构域。在本文所述方面的多种实施方式中，抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。在某些实施方式中，细胞表达选自19-28z、P28z、M28z和56-28z的重组的或内源性的抗原受体。

在本文所述方面的多种实施方式中，抗原识别受体为T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在本文所述方面的多种实施方式中，抗原识别受体是外源性的或内源性的。在本文所述方面的多种实施方式中，抗原识别受体经重组表达。在本文所述方面的多种实施方式中，抗原识别受体由载体表达。在任意本文所述方面的多种实施方式中，同种异体细胞具有内源性T细胞受体。

在本文所述方面的多种实施方式中，细胞为T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人类胚胎干细胞、先天免疫系统的细胞和可以分化出淋巴样细胞的多能性干细胞中的一种或多种。在一些实施方式中，免疫应答细胞为自体的。在其他实施方式中，免疫应答细胞为非自体的。

定义

除非另外定义，所有本文所用的技术和科技术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献向本领域技术人员提供很多本发明所用术语的通常定义：Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2nded.1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.,1988)；TheGlossaryofGenetics,5thEd.,R.Riegeretal.(eds.),SpringerVerlag(1991)；以及Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。如本文所用，以下术语具有以下归于它们的含义，除非另外指出。

“激活免疫应答细胞”是指诱导细胞中的信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的起始。例如，当CD3链响应于配体结合和免疫受体酪氨酸类抑制基序(ITAM)而聚簇时，产生信号转导级联反应。在某些实施方式中，当内源性TCR或外源性CAR与抗原结合时，发生免疫突触的形成，其包括许多分子在结合受体(例如，CD4或CD8、CD3γ/δ/ε/ζ等)附近聚簇。这种膜结合信号转导分子的聚簇使得包含在CD3链内的ITAM基序变得磷酸化。该磷酸化进而引发T细胞激活通路，最终激活转录因子，例如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T细胞的全局基因表达，以增加IL-2的产生，以用于增殖和主调节T细胞蛋白的表达，以引发T细胞介导的免疫应答。“刺激免疫应答细胞”是指引起稳健且持续的免疫应答的信号。在多种实施方式中，这在免疫细胞(例如T细胞)激活之后发生或者同时发生，通过包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、OX40和ICOS的受体介导。无意拘泥于特定理论，接收多个刺激信号对于发起稳健且长期的T细胞介导的免疫应答是重要的。不接收这些刺激信号，T细胞迅速变得受抑制，且对抗原不应答。尽管这些共刺激信号的作用会变化并且仅部分被理解，它们通常引起基因表达的增加，以产生长寿的、增殖性的和抗细胞凋亡的T细胞，该T细胞稳健地对抗原进行应答，以用于完整和持续的根除。

本文所用的术语“抗原识别受体”是指能够响应于抗原结合而激活免疫细胞(例如T细胞)的受体。示例性的抗原识别受体可以是天然的或内源性的T细胞受体、引入细胞的外源性T细胞受体、和/或将肿瘤抗原结合结构域融合到能够激活免疫细胞(例如，T细胞)的胞内信号转导结构域的嵌合抗原受体。

如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指抗体分子的保持免疫原结合能力的片段。这些片段也是本领域公知的，并经常在体外和在体内使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，还指公知的活性片段F(ab')₂和Fab。F(ab')₂和Fab片段缺少完整抗体的Fc片段，更迅速地从循环中清除，并且可能具有完整抗体的稍弱的非特异性组织结合(Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。本发明的抗体包括完整天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab’、单链V区片段(scFv)、融合多肽以及非常规抗体。

“亲和性”是指结合强度的量度。不约束于理论，亲和性取决于抗体结合位点与抗原决定簇之间的立体化学适合紧密度、它们之间的接触区域大小以及带电基团疏水基团的分布。亲和性也包括术语“亲合力”，其是指在形成可逆复合物之后抗原-抗体键合的强度。计算抗体对抗原亲和性的方法在本领域已知，包括使用结合实验来计算亲和性。在功能检定(例如，流式细胞术检定)中的抗体活性也反应抗体亲和性。抗体和亲和性可以使用功能检定(例如，流式细胞术检定)来进行表型表征和比较。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指与能够激活或刺激免疫细胞的胞内信号转导结构域融合的抗原结合结构域。最常见地，CAR的胞外结合结构域由融合鼠科或人源化单克隆抗体的可变重区与轻区而产生的单链可变片段(scFv)组成。另外可选地，可以使用源自Fab(而非抗体，例如，获自Fab库)的scFv。在多种实施方式中，该scFv与跨膜结构域融合，然后与胞内信号转导结构域融合。“第一代”CAR包括在抗原结合时仅仅提供CD3ζ信号的那些，“第二代”CAR包括提供共刺激(例如CD28或CD137)和激活(CD3ζ)的那些。“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如CD28和CD137)和激活(CD3ζ)的那些。在多种实施方式中，CAR选择成对于抗原具有高的亲和性或亲合力。。

本文所用的术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCAR”是指与能够抑制或压制免疫细胞的免疫活性的胞内信号转导结构域融合的抗原结合结构域。iCAR具有免疫细胞抑制性潜能，并且与作为具有免疫细胞激活潜能的受体的CAR不同且可区分。例如，CAR是激活受体，因为它们包括CD3ζ，iCAR不包含激活结构域。因此，iCAR不同于CAR并且不是CAR的亚群。在某些实施方式中，抗原结合结构域融合于免疫抑制性受体的跨膜结构域和胞内结构域。iCAR的跨膜结构域可以是CD8多肽、CD4多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽或BTLA多肽。iCAR的胞内结构域可以是CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽或BTLA多肽。在多种实施方式中，iCAR的胞外结合域由融合鼠科或人源化单克隆抗体的可变重区与轻区而得到的单链可变片段(scFv)构成。在某些实施方式中，scFv是对前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异的scFV。或者，可以使用源自于Fab’(而非抗体，例如得自Fab库)的scFv。iCAR具有在抗原识别时特异地抑制T细胞功能的免疫抑制活性。

“抑制免疫应答细胞”或“压制免疫应答细胞”是指在细胞中诱导信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的抑制(例如，细胞因子产生的减少)。在优选实施方式中，免疫应答细胞的抑制或压制是选择性的和/或可逆的。

术语“免疫抑制活性”是指在细胞(例如，激活的免疫应答细胞)中诱导信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的降低。已知抑制或减少免疫应答的多肽包括，但不限于，CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽或BTLA多肽(例如，通过与其相应配体结合)。至少，iCAR信号转导利用这些分子的胞内部分，并且还可以包括所述分子中需要用来产生功能性iCAR的跨膜结构域和/或胞外结构域的部分。术语“免疫刺激活性”是指在细胞(例如，激活的免疫应答细胞)中诱导信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的增加。免疫刺激活性可以包括促炎活性。已知经由其结合而刺激或增加免疫应答的多肽包括CD28、OX-40、4-1BB及其相应的配体，包括B7-1、B7-2、OX-40L和4-1BBL。这些多肽存在于肿瘤微环境中，并激活对肿瘤细胞的免疫应答。在多种实施方式中，促进、刺激促炎多肽和/或其配体或使其激动会提高免疫应答细胞的免疫应答。

“CD3ζ多肽”是指与NCBI参考No:NP_932170或其具有激活或刺激性活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白。示例性的CD3ζ提供如下[SEQIDNO:1]。

“CD3ζ核酸分子”是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。

“CD28多肽”是指与NCBI参考No:NP_006130或其具有刺激性活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白。示例性的CD28提供如下[SEQIDNO:2]。

“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。

“19-28z”是指与以下提供的序列[SEQIDNO:3]具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白，该序列包含在氨基酸1-18的前导序列并能够与CD19结合。

MALPVTALLLPLALLLHAFVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPDFVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGJDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRX

包含前导序列的编码19-28z多肽的示例性核酸序列提供如下[SEQIDNO:4]。

ccatggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagagccccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcg

可用于本发明方法的核酸分子包括任何编码本发明的多肽或其片段的核酸分子。这些核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常将表现出相当程度的同一性。与内源性序列具有“相当程度的同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格性条件下在互补性多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之间配对形成双链分子。(参见，例如Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)MethodsEnzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度将通常小于约750mMNaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选小于约250mMNaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格性杂交可以在存在至少约35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件将通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、且最优选至少约42℃的温度。变化的其他参数，例如杂交时间、清洁剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度以及包括还是排除载体DNA，是本领域技术人员公知的。不同的严格性水平通过根据需要将这些不同的条件进行组合来实现。在优选的实施方式中，杂交将在30℃下在750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，杂交将会在37℃下在500mMNaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在最优选的实施方式中，杂交将会在42℃下在250mMNaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/mlssDNA中发生。有关这些条件的可用变化对本领域技术人员来说将会是显而易见的。

对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格性方面变化。洗涤严格性条件可以通过盐浓度及通过温度定义。如上，洗涤严格性可以通过降低盐浓度或者通过增加温度来提高。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将优选为小于约30mMNaCl及3mM柠檬酸三钠，最优选小于约15mMNaCl及1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格温度条件将通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、进而更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将会在25℃下在30mMNaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将会在42℃下在15mMNaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将会在68℃下在15mMNaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。有关这些条件的其他变化对于本领域技术人员来说将很容易是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，且记载于，例如，Benton和Davis(Science196:180,1977)；GrunsteinandHogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA72:3961,1975)；Ausubel等人(CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyInterscience,NewYork,2001)；BergerandKimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques,1987,AcademicPress,NewYork)；和Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。

“基本上同一”是指多肽或核酸分子表现出与参照氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中任一个)或核酸序列(例如，本文所述核酸序列中任一个)至少50％的同一性。优选地，这样的序列与用于对比的序列在氨基酸水平或核酸水平上为至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％同一。

序列同一性通常使用序列分析软件(例如，GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量。这些软件通过比对各种置换、缺失和/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守置换通常包括在以下组别内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在测定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，概率评分在e-3与e-100之间表示序列密切相关。

“类似物”是指具有参照多肽或核酸分子的功能的结构上相关的多肽或核酸分子。

如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子。具体地，配体与另一细胞上的受体结合，使得可以进行细胞-细胞识别和/或相互作用。

如本文所用，术语“构成性表达”是指在所有生理条件下均表达。

“疾病”是指任何损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的病症和障碍。疾病的例子包括瘤形成或细胞的病原体感染。

“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在一个实施方式中，“有效量”是指足以阻止、减轻或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵入或迁移)的量。

“内源性”是指核酸分子或多肽正常地在细胞或组织中表达。

“强制执行耐受性(enforcingtolerance)”是指防止靶向移植器官或组织的自反应性细胞或免疫应答细胞的活性。

“外源性”是指核酸分子或多肽并不内源性地存在于细胞中，或者并未以足以达到在过表达时得到的功能效果的水平存在。因此，术语“外源性”包括任何在细胞中表达的重组核酸分子或多肽，例如，外来的、异源性的以及过表达的核酸分子和多肽。

“异源性(heterologous)核酸分子或多肽”是指核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽在正常情况下不存在于细胞或获自细胞的样品中。这种核酸可以来自另一有机体，或者，其可以是，例如，通常不在细胞或样品中表达的mRNA分子。

“免疫应答细胞”是指在免疫应答中发挥作用的细胞或其祖细胞或子代。

“增加”是指正向地变化至少5％。变化可以是5％、10％、25％、30％、50％、75％或者甚至100％。

“分离的细胞”是指与天然地伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指材料在不同程度上不含在其天然状态下通常伴随其的组分。“分离”是指与原始来源或环境的分开程度。“纯化”是指高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白充分地不含其他材料，使得没有任何杂质对蛋白的生物特性产生实质影响或者造成其他不利后果。也就是说，本发明的核酸或肽如果基本不含细胞材料、病毒材料或培养介质(当通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学品(当化学合成时)，则是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以是指，核酸或蛋白在电泳凝胶中基本给出一条条带。对于可以进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白，不同的修饰可以给出不同的分离蛋白，其可以分别纯化。

如本文所用，术语“肿瘤抗原结合结构域”是指能够特异性地结合存在于肿瘤上的特定抗原决定簇或特定组的抗原决定簇的结构域。

“获得试剂”中的术语“获得”意在包括购买、合成或者以其他方式获取试剂(或者所示的物质或材料)。

如本文所用，“连接部分”是指将两个或更多个多肽或核酸分子共价连接以使得它们彼此相连的官能团(例如，化学品或多肽)。如本文所用，“肽连接部分”是指一个或多个用于将两个蛋白结合在一起(例如，使V_H和V_L结构域结合)的氨基酸。用于本发明的示例性连接序列为GGGGSGGGGSGGGGS[SEQIDNO:10]。

“调节”是指正向地或负向地改变。示例性的调节包括1％、2％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的变化。

“瘤形成”是指以细胞或组织的病变性增殖及其后续迁移或侵入至其他组织或器官为特征的疾病。瘤形成的生长通常是不受控制的且进行性的，并且在不会引起正常细胞繁殖或者导致其停止的条件下发生。瘤形成会影响许多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于，选自膀胱、骨、脑、胸、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道中的器官或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。本发明可以使用的示例说明性肿瘤包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病、非霍奇金氏病)、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病，以及实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰脏癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、乳头状腺癌(papillaryadenocarcinomas)、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm’s瘤、子宫颈癌、子宫癌、睪丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。

如本文所用的“可操作地连接”是指连接两个或更多个生物分子从而至少保留与生物分子相关的生物学功能、活性和/或结构。提及多肽，该术语是指两个或更多个多肽的连接得到保留各个多肽组分的至少一些各自单独活性的融合多肽。两个或更多个多肽可以直接连接或经由连接部分连接。提及核酸，该术语是指第一多核苷酸位于第二多核苷酸邻近，当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合到第二多核苷酸时，第二多核苷酸指导第一多核苷酸的转录。

“病原体”是指能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物。

示例性的病毒包括，但不限于，逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称作HDTV-III、LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其他分离物例如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，导致肠胃炎的菌株)；批膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和奈洛病毒)；沙状病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、orbiviurses和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒(poxviruses))；和虹彩病毒科(lridoviridae)(例如，非洲猪热病病毒)；和未分类的病毒(例如，丁型肝炎试剂(视作是乙肝病毒的缺陷随体)、非甲乙肝炎的试剂(1类＝内部传送；2类＝非肠道传送(即，丙肝)；诺瓦克和相关病毒以及星状病毒)。

示例性的细菌包括，但不限于，巴斯德氏菌(Pasteurella)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonas)和沙门氏菌(Salmonella)。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacterpyloris)、博氏疏螺旋体(Boreliaburgdoiferi)、嗜肺性军团杆菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、M.avium、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、M.kansaii、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A类链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B类链球菌)、链球菌(Streptococcus)(绿色链球菌类)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、Streptococcushovis、链球菌(Streptococcus)(厌氧种属)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、病原性弯曲杆菌(Campylobactersp.)、肠球菌(Enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌(corynebacteriumsp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷氏菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀巴斯德菌(Pasturellamultocida)、拟杆菌(Bacteroidessp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、苍白密螺旋体(Treponemapallidium)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)、和以色列放线菌(Actinomycesisraelli)。

“受体”是指选择性地与一种或多种配体结合的存在于细胞膜上的多肽或其部分。

“降低”是指负向地变化至少5％。变化可以是5％、10％、25％、30％、50％、75％或者甚至100％。

“识别”是指选择性地与靶标结合。识别病毒的T细胞通常表达与病毒表达的抗原结合的受体。

“参照”或“对照”是指比较标准物。例如，表达CAR和iCAR的细胞的免疫应答可以与仅表达CAR的相应细胞的免疫应答比较。

如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接形成VH::VL异质二聚体的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接接合或通过编码肽的连接部分(例如，10、15、20、25个氨基酸)而接合，连接VH的N端与VL的C端、或VH的C端与VL的N端。连接部分通常富含用于柔性的甘氨酸以及用于溶解度的丝氨酸或苏氨酸。尽管除去了恒定区并引入了连接部分，scFv蛋白保留有原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达而来，如Huston等人所记载(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。另外参见美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754号和第20050196754号。

“分泌的”是指多肽通过内质网、高尔基体经由分泌通路由细胞释放，以及作为暂时融合在细胞质膜处并将蛋白释放到细胞外部的囊泡而释放。

“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成蛋白的N-端处的指导其进入分泌通路的肽序列(长度为5、10、15、20、25、30个氨基酸)。

“可溶的”是指多肽游离地扩散于水性环境中(例如，非膜结合的)。

“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合所关注的生物分子(例如，多肽)，但基本上不识别并结合样本(例如，天然地包含本发明多肽的生物样本)中的其他分子。

本文所用的术语“肿瘤抗原”是指与正常或非肿瘤细胞相比独特地或可区别地表达在肿瘤细胞上的抗原(例如，多肽、糖蛋白或糖脂)。参照本发明，肿瘤抗原包括任意由肿瘤表达且能够被抗原识别受体(例如，CD19、Muc-1)识别或能够经由受体-配体结合(例如，CD47、PD-L1/L2、87.112)而抑制免疫应答的多肽。

“组织抗原”是指与肿瘤细胞相比独特地或可区分地表达在正常或非肿瘤细胞或组织上的抗原(例如多肽或糖蛋白或糖脂)。

“病毒抗原”是指由能够诱导免疫应答的病毒所表达的多肽。

术语“包括”、“包含”意在具有美国专利法中赋予的的广义含义，并且可以表示“包括有”、“包含有”等。

如本文所用，“治疗”是指致力于改变被治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或者在临床病理过程中进行。治疗的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或预后改善。通过防止疾病或病症的进展，治疗可以防止由受影响或经诊断的受试者或疑似具有该病症的受试者中的病症所引起的恶化，而且治疗还可以防止在处于该病症风险或疑似具有该病症的受试者中病症的发作或病症症状。

如本文所用，术语“受试者”是指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。

如本文所使用，术语“免疫受损的”是指受试者具有免疫缺陷。受试者非常容易遭受机会性感染，由通常在具有健康免疫系统的人中不造成疾病但可以影响免疫系统功能差或免疫系统功能受抑制的人的有机体所引起的感染。

本发明的其他方面在以下公开内容中说明，并且在本发明的范围之内。

附图说明

以实施例形式给出而不意在将本发明限制于所描述的具体实施方式的以下具体实施方式部分可以结合附图进行理解。

图1A至1D表示在原代人T细胞中的iCAR策略、设计和表达。(A)对于肿瘤组织和靶外(off-target)组织两者均具有特异性的T细胞可以通过使用引入到T细胞中以保护靶外组织的抗原特异性iCAR而仅被限制于肿瘤。(B)用于iCAR和Pdel的双顺反子载体的示意图。iCAR-P：将各个抑制性受体的间臂(spacer)、跨膜和胞内尾区克隆到先前描述的具有CD8前导序列(LS)的逆转录病毒载体。IRES，内部核糖体进入位点；hrGFP，人源化海肾绿色荧光蛋白报告基因。将Pdel对照载体设计为具有间臂和CD8跨膜(TM)结构域，并缺少胞内尾区。(C)iCAR的细胞表面表达通过流式细胞术在转导的原代人T细胞中评测。点图表示8个不同的供体。GAM，山羊抗小鼠免疫球蛋白GF(ab’)2抗体，与小鼠来源的CAR胞外结构域结合。(D)示出在转导的原代人T细胞中使用山羊抗小鼠(GAM)染色进行的iCAR细胞表面表达的流式细胞术分析。

图2A至2F示出iCAR保护iPS-fib免受TCR介导的同种异体反应。使用一系列的E/T比率，将用同种异体moDC激发(primed)的对照Pdel-或iCAR-转导的T细胞与表达与moDC同基因的磕头虫荧光素酶(CBL)的iPS来源的成纤维细胞(iPS-fib)一起孵育。(A)Pdel-、PD-1–、或mutCTLA-4iCAR-P–转导的T细胞与靶标iPS-fib反应(n＝3/条件)。iPS-fib的杀死用Bright-Glo检定系统加以定量。(B)在18小时评测E/T比率4:1的来自(A)的细胞培养上清中的细胞因子分泌。GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；IFN-γ，白介素-g；TNF-α，肿瘤坏死因子-a。(C)将Pdel-或iCAR-阳性T细胞与表达PSMA的靶外iPS-fib(iPS-fib-PSMA)孵育24小时，并且将荧光素酶信号(左)定量(右)(n＝3/条件)。(D至F)在来自(C)的细胞培养上清中在24小时测量的细胞因子分泌。误差条表示±SEM。*P<0.01,***P<0.001，通过比较iCAR与Pdel的方差分析(ANOVA)，事后分析(posthoc)，多重t检验，用Holm-Sidak法校正。原始数据和P值提供在图19A至19E中。

图3A至3D示出，iCAR以化学计量方式起作用。(A)将Pdel-或PD-1iCAR-P-转导的同种异体反应性T细胞针对各个分别受体的高或低表达进行分选，如图13A所示，并接种在表达CBL的iPS-fib-PSMA上。iPS-fib-PSMA相对于未处理细胞的杀死用Bright-Glo检定系统评测(对于各条件n＝3)。(B)细胞因子分泌，在24小时在E/T比率4:1的来自(A)的细胞培养上清中测量。(C)将PD-1iCAR-P转导的同种异体反应性T细胞与如图13B所示针对高或低水平PSMA表达而分选的iPS-fib-PSMA孵育。各个群体相对于未处理细胞的杀死用Bright-Glo检定系统评测(对于各条件n＝3)。(D)在24小时评测来自(C)的细胞因子。误差条表示±SEM。***P<0.001，通过学生t检验。误差条表示±SEM。*P<0.01,***P<0.001，通过ANOVA与高Pdel组比较，事后分析，多重t检验，用Holm-Sidak法校正。原始数据和P值提供在图20A和20B中。

图4A和4B示出iCAR在体内限制同种异体应答。对NOD/SCID/γ_c ^-小鼠腹膜注射1×10⁶iPS来源的表达CBL/PSMA的成纤维细胞(iPS-fib-PSMA)，并且在7天之后，用5×10⁵PD-1iCAR-P-或Pdel-转导的经分选的同种异体反应性T细胞进行腹膜内处理。将未处理的小鼠(无T细胞)用作对照。(A)通过BLI在T细胞输注之前或在T细胞输注之后的选定时间点评测iPS-fib-PSMA的存活率。示出来自各个组的四个代表性小鼠的图像。(B)将各个小鼠的总的体通量(光子/秒)进行定量，并在每组中平均化(n＝5/组)。误差条表示±SEM。*P<0.05,**P<0.01，通过ANOVA相对于Pdel进行比较，事后分析，多重t检验，用Holm-Sidak法校正。原始数据和P值提供在图21A和21B中。

图5A至5F示出iCAR抑制人T细胞细胞因子释放、增殖、以及由19-28zCAR驱使的靶标细胞消除。(A)在3T3-CD19(靶标)或3T3-CD19-PSMA(靶外)AAPC上接种双分选的19-28z/Pdel–或19-28z/iCAR–转导的人T细胞24小时后培养上清的Luminex多重细胞因子分析。将数据表示为靶外/靶标值的比率并从三个独立实验中进行集中(n＝6孔/条件)。误差条表示±SEM。**P<0.01,***P<0.001，通过ANOVA比较iCAR与Pdel，事后分析，多重t检验，用Holm-Sidak法校正。(B)在第0天和第7天用靶外AAPC刺激的19-28z/Pdel或19-28z/iCART细胞的绝对计数。不添加外源性细胞因子。数据代表六个独立实验。(C)在第0天和第7天用靶外AAPC刺激的19-28z/Pdel或19-28z/iCART细胞的增殖相对于在靶标AAPC上的增殖。不添加外源性细胞因子。数据代表六个独立实验。(D)以1:1比率接种在靶标和靶外mCherry⁺AAPC上的T细胞。示出五个独立实验中的一者在38小时和5天的图像。比例尺，0.5mm。(E和F)来自(D)的mCherry信号相对于CD19靶标(E)或CD19-PSMA靶外细胞(F)的定量，如在材料和方法部分中所述。误差条表示±SEM。**P<0.01,***P<0.001，通过学生t检验。原始数据和P值提供在图22A至22C中。

图6A至6F示出iCAR在体内限制19-28zCAR靶标细胞特异性。(A)BLI示出在用分选的19-28z/PD-1iCAR-PT细胞处理的NOD/SCID/γ_c ^-小鼠中NALM/6或NALM/6-PSMA的肿瘤进程。将未处理小鼠(无T细胞)用作对照。(B)对各个小鼠的肿瘤负荷进行定量，并示出相对于每组的平均总通量。(C)在第21天处死的来自(A)的小鼠的脾脏重量。各个点表示一个受试小鼠。(D)来自(C)的股骨骨髓对于肿瘤细胞(CD19⁺GFP⁺)和T细胞(CD19-19-28z/GFP⁺CD4⁺CD8⁺)存在的流式细胞术分析。19-28z表达通过对LNGFR受体染色而进行评测，而该受体的互补DNA(cDNA)与19-28z连接并用作检测标记物。(E和F)在来自(C)的脾脏中的肿瘤细胞(E)和CD19-19-28z/GFP⁺CD4⁺CD8⁺T细胞(F)的绝对数量通过流式细胞术用CountBright珠进行定量(n＝4)。误差条表示±SEM。**P<0.01,***P<0.001，通过学生t检验。

图7A至7D示出iCAR的功能是暂时且可逆的。(A)将9-28z/Pdel或19-28z/PD-1iCAR-PT细胞与靶标(T)或靶外(O)AAPC孵育以进行第一次刺激。在3或7天后，将各个组的细胞用靶标[T→T(1)或O→T(2)]或靶外[T→O(3)或O→O(4)]AAPC以交叉方式进行再刺激，以分析第一次刺激对接下来T细胞功能的作用。(B)靶标(T)或靶外(O)AAPC在与各个T细胞组孵育(第二次刺激)后24小时时的杀死用Bright-Glo检定系统分析(对于各条件n＝3)。(C)对来自(B)的细胞培养上清中效应性细胞因子的分泌在第二次刺激后第24小时进行分析，并将白介素-g(IFN-g)示为代表性结果(对于各条件n＝3)。(D)在第二次刺激后第7天的T细胞增殖(对于各条件n＝3)。误差条表示±SEM。统计比较在各条件内进行(即，T→TPdelvs.PD-1iCAR-P)。***P<0.001，通过学生t检验。

图8A至8E示出表达iCAR和CAR的T细胞在体外和体内辨识靶标。(A)将19-28z/Pdel或19-28z/PD-1iCAR-PT细胞与靶标(CD19⁺GFP⁺，绿色)和靶外(CD19⁺PSMA⁺mCherry⁺，红色)AAPC的1:1混合物孵育，并使用时间推移显微镜检来对各个群体的实时杀死进行可视化，持续38小时。示出代表性的图像，并作出全长动画。比例尺，0.1mm。(B)如在(A)中，将19-28z/Pdel或19-28z/PD-1iCAR-PT细胞与靶标(CD19+)和靶外(CD19+PSMA+)AAPC的1:1混合物孵育。将各个AAPC群的杀死在平行实验中进行评测，在平行实验中，各个AAPC类型中的一种用CBL(CD19+CBL+/CD19+PSMA+混合物或CD19+/CD19+PSMA+CBL+混合物)标记。在第38小时对杀死用Bright-Glo检定系统进行定量(对于各条件n＝3)。(C至E)将NOD/SCID/γ_c ^-小鼠用NALM/6和NALM/6-PSMA细胞的1:1混合物进行注射，并用19-28z或19-28z/PD-1iCAR-PT细胞进行处理。(C)在处死时，骨髓中靶标和靶外NALM/6细胞的存在通过流式细胞术进行分析。(D)在处死小鼠的骨髓中靶标/靶外NALM/6细胞的比率通过流式细胞术进行定量。(E)在处死时也记录处理小鼠的脾脏重量。误差条表示±SEM。***P<0.001，通过学生t检验。

图9A-C示出CTLA-4iCAR细胞表面表达在T细胞激活后增加。(A)CTLA4iCAR-P在转导的原代人T细胞上的细胞表面和胞内表达。(B)在未转导的(2)和CTLA4iCAR-P转导的(1)原代人T细胞上使用对CTLA4的胞内结构域特异的抗体进行的Westernblot分析。鼠科EL4细胞(3)用作为阴性对照。(C)将1928z/CTLA4iCART细胞用3T3-19AAPC激活，并对激活后第7小时和30小时的细胞表面CTLA4iCAR表达进行分析(n＝3)。

图10示出iCAR-P与表达PSMA的细胞结合。在细胞结合检定中，将用亲脂性DiD染料标记的EL4-wt或EL4-PSMA细胞与表达iCAR/GFP的T细胞进行孵育。结合物通过流式细胞术检测为DiD/GFP双阳性事件。

图11A至11D示出使用iPS来源的成纤维细胞和同基因moDC的同种异体反应性模型。(A)诱导的多能性干细胞(iPS)产生自供体1PBMC并用于得到成纤维细胞。供体1PBMC也用于得到moDC，其用成纤维细胞裂解液进行脉冲并可以激发来自第二供体PBMC的同种异体反应。(B)示出在培养基中生长的畸胎瘤来源的iPS成纤维细胞的形态的显微镜检图片。(C)缺少多能性标记物表达的iPS-fib显示出成纤维细胞的形态，并针对一些成纤维细胞的细胞表面标记物包括CD90、PDGFr-b2和CD10染色为阳性。(红色＝同种型对照；蓝色和绿色为两个独立的分离的细胞系)。(D)iPS-fib基本对HLAI类而不对II类呈染色阳性，并在重组INFγ处理时迅速上调两种的表达。

图12A至12C示出iCAR转导的原代人T细胞对同种异体iPS来源的成纤维细胞的有效反应性。(A)将来自一个供体的iCAR转导的T细胞用经不同供体的iPS-fib裂解液进行脉冲的moDC进行激发，并在6天后对活化标记物CD25和HLA-DR进行染色。(B)将两次激发的iCAR转导的T细胞与iPS-fib-luc孵育18小时并且杀死使用Bright-Glo检定系统进行定量(对于各条件n＝3)。(C)在第18小时在E:T比率4:1的来自(B)的细胞培养上清中测量细胞因子。误差条表示+/-SEM。统计比较在各条件内执行(ieT₁T)。***p<0.001，通过学生t检验。

图13A和13B示出iCAR或19-28z/iCART细胞的转导和分选策略。(A)PD1-iCAR(GFP)或Pdel(GFP)转导的T细胞针对转基因表达基于GFP表达水平而进行分选。各个供体表示单独的实验。执行分选后分析来证实纯度。(B)将19-28z(LNGFR)/iCAR(GFP)或19-28z/Pdel/GFP转导的T细胞针对转基因表达基于GFP表达和LNGFR水平进行分选。各个供体表示单独的实验。执行分选后分析来证实纯度和iCAR表达。

图14A和14B示出表达低/高iCAR的T细胞以及表达PSMA的iPS成纤维细胞的分选策略。(A)将PD1-iCAR/GFP或Pdel/GFP转导的T细胞针对低或高转基因表达基于GFP表达水平而分选。(B)将iPS来源的成纤维细胞(iPS-fib)转导成表达PSMA并使用PSMA抗体进行分选(iPS-fib-PSMA分选体+)。将这些细胞用于图2和4中的实验。使用PSMA抗体，将第二个单独的分选用于纯化表达低或高表面PSMA的iPS-fib，并将这些细胞用于图3中的实验。

图15A至15D示出iCAR抑制19-28z驱使的人T细胞的细胞因子释放和增殖。(A)在表达CD19或CD19与PSMA两者的人造抗原提呈细胞(AAPC)中人T细胞的增殖。(B)在CD19(靶标)或CD19/PSMA(靶外)阳性AAPC上接种双分选的19-28z/Pdel或iCAR转导的人T细胞后第24小时和48小时上清的代表性INFγ细胞因子分析。数据表示为靶外/靶标值的比率并从三个独立实验中进行集中。(n＝6孔/条件)。误差条表示+/-SEM。(C)在第0天和第7天用CD19+(靶标)AAPC刺激的双阳性19-28z/Pdel或iCART细胞的绝对计数。(D)治疗性T细胞应答与NALM/6以及NALM/6-PSMA细胞在异种移植NOD/SCID/γ_c ^-小鼠模型中的比较。

图16A至16I示出，iCAR的基础表达并不影响原代人T细胞的功能。(A、B)用1928z/iCAR转导后7天，将T细胞用CD3/CD28珠激活，并在24小时后评测IL-2/INFγ水平(C)。在珠子激活后第8天，对绝对T细胞扩张使用CountBright珠进行定量(D)，并且各个iCAR组中的GFP阳性细胞的百分比变化相对于未刺激细胞进行标准化。(E)将1928z/iCART细胞与经照射的EL4-WT或EL4-PSMA细胞共培养5天，并使用流式细胞术进行免疫表型化。(F)示出EL4-wt或EL4-PSMA细胞的细胞结合检定，用亲脂性DiD染料标记并与表达iCAR的T细胞孵育。(G)表示示出在用1928z/iCAR转导后7天、用CD3/CD28珠激活后24小时的T细胞中IL-2/INFγ水平的图。(H)是示出在珠子活化8天后使用CountBright珠对绝对T细胞扩张进行定量的图。(I)是示出各个iCAR组中相对于未刺激细胞计算的GFP阳性细胞的百分比变化的图。

图17A至17C表示PD-1iCAR的信号转导和生化通路特征。将19-28z/PD-1iCAR细胞暴露于不表达抗原(WT)、表达CD19(靶标)或CD19与PSMA(靶外)的AAPC60分钟，E:T比为4:1。(A)人磷酸-免疫受体阵列与100μg来自19-28z/PD-1iCART细胞以及各个AAPC的裂解液进行孵育。所有点均用化学发光在同一X线光片上检测以使曝光水平标准化。(B、C)使用扫描的X线光片图像，用图像分析软件分析，对(A)中的阵列进行定量。所有像素密度均使用内部pY控制在各个阵列上进行标准化。(B)SHP1和SHP2磷酸化在靶标、靶外或对照AAPC上表述。(C)59种ITAM/ITIM相关的免疫受体的磷酸化水平的定量。

图18示出iCAR直接作用于刺激性受体以阻断其信号转导。

图19A至19E示出图2A至2F的原始数据和统计显著性测试。(A)iPS-成纤维细胞的杀死使用Bright-Glo检定系统对Pdel、PD-1或mutCTLA-4iCAR-P转导的T细胞进行定量。(B)在第18小时检测E:T比为4:1的(A)细胞培养上清中的细胞因子分泌。(C)将Pdel或iCAR阳性T细胞与表达PSMA的靶外iPS-fib(iPS-fib-PSMA)孵育24小时并对荧光素酶信号进行定量。(D)使用多重t检验对(C)执行事后分析，用Holm-Sidak法校正。(E)在来自(C)的细胞培养上清中，在第24小时测量的细胞因子分泌。呈现对于GM-CSF的原始数值。E:T比，效应物:靶标比。

图20A和20B示出图3A至图3D的原始数据和统计显著性测试。(A)iPSfib-PSMA相对于未处理细胞的杀死通过使用Bright-Glo检定系统对分选的高和低Pdel或PD1iCAR-P转导的同种异体反应性T细胞进行评测。使用Holm-Sidak法校正的多重t检验执行事后分析。(B)PD1iCAR-P转导的同种异体反应性T细胞对针对高或低水平PSMA表达而分选的iPS-fib-PSMA的杀死使用Bright-Glo检定系统进行定量。使用Holm-Sidak法校正的多重t检验执行事后分析。

图21A和21B示出图4A和4B的原始数据和统计显著性测试。(A)在T细胞输注之前以及在T细胞输注后选定的时间点的iPS-fib-PSMA的生物发光成像(BLI)。(B)使用Holm-Sidak法校正的多重t检验执行事后分析。

图22A至22C示出图5A至5F的原始数据和统计显著性测试。(A)在第24小时的培养上清的Luminex多重细胞因子分析，数据表示为靶外/靶标值的比率，并从三个独立实验中进行集中(n＝6孔/条件)。使用Holm-Sidak法校正的多重t检验来执行事后分析。(B)对于图5B使用Holm-Sidak法校正的多重t检验来执行事后分析，比较19-28z/Pdel和19-28z/PD1iCAR的增殖。(C)mCherry信号对CD19靶标或CD19-PSMA靶外细胞的定量，如方法部分所述。使用Holm-Sidak法校正的多重t检验来执行事后分析。

图23是对iCAR和CAR选择靶标抗原的示意性图示。

具体实施方式

本发明大体上提供细胞，包括遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞(包括所有亚类例如CD4、CD8、记忆型、幼稚型、效应性、T-reg等)、先天免疫系统、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL))，其至少表达抗原识别受体(例如，TCR或CAR)与选择性地降低或减少免疫应答细胞的免疫活性的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的组合，以及提供使用这些细胞来治疗需要降低“靶外”免疫应答的瘤形成和其他病理的方法。本发明至少部分地基于以下发现，即与靶标抗原(例如，本文所示的PSMA)结合的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)可用于选择性地抑制并压制免疫反应细胞。具体而言，本发明的iCAR降低或防止免疫反应细胞的免疫应答的激活。本发明的方法提供对肿瘤根除的选择性免疫原性，而将非肿瘤组织排除在免疫应答外。因而，表达抗原识别受体和iCAR的T细胞代表与常规过继T细胞疗法相比显著的进步。

广泛使用供体白细胞输注来治疗癌症受到无法将移植物抗肿瘤效果(GVT)与移植物抗宿主病(GVHD)的潜在致死作用分开的限制。两个常见的方法已经被用于控制T细胞疗法副作用。第一个是使用免疫抑制性药物，其通过阻断细胞分裂(细胞抑制剂)而非特异性地工作，并广谱地限制免疫应答(糖皮质激素、亲免素等)，或者靶向T细胞以清除/死亡(抗体)。尽管有效力，这些方法在分离治疗功能性T细胞与造成有害副作用的T细胞方面没有特异性。此外，所有这些药物造成显著的长期二次副作用(易感于感染、心脏、肾脏和神经损伤)。

第二个方法用自杀基因/杀伤开关对T细胞工程化。这些是遗传学方法，其在给出合适的提示时引起工程细胞死亡。它们中的一些基于引入有毒试剂的选择性的酶促代谢剂，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。此外，使用经二聚作用的特定化学引发剂激活的可诱导的半胱天冬酶-9蛋白已经是有希望的积极诱导广泛细胞死亡的方法。这些方法的主要限制是它们在所有靶标细胞中诱导细胞死亡(从而消除有益细胞)。与常规的免疫抑制类似，它们通常在实施前需要症状的出现(以及因此可能的对患者的永久性损伤)。

相反，本文所述的iCAR策略选择性地过滤T细胞作用，限制在靶外位点的活性，同时留出针对意向靶标的治疗性功能性。如本文所示，iCAR能够在使用iPS来源的人成纤维细胞的新的体外和体内模型中抑制人同种异体反应性T细胞攻击“宿主”组织。存在于GVHD靶标组织(例如，髓系的CD33或器官特异性抗原)但不存在于靶向的恶性肿瘤的独特的表面抗原是iCAR靶标的候选物，以区分GVHD和GVT。相似地，本文所述的结果显示，iCAR介导的抑制成功地限制CAR工程化T细胞的“中靶非组织”作用，其实例包括在用表达CD19-特异性CAR的T细胞治疗的白血病患者中的B细胞发育不全(Kalos等人，Sciencetranslationalmedicine,2011.3(95):95ra73)、认为来自抗-ERBB2CART细胞在肺上皮上的交叉反应性的胎儿急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(Morgan等人，Mol.Ther.,2010.18(4):843-51)、以及在用Mage-A3TCR治疗的黑色素瘤和骨髓瘤患者中源自心肌坏死的死亡(June,UpdateonImmunotherapyTrialsforHIVandCancer,inRecombinantDNAAdvisoryCommittee,2012)。因识别出在心肌细胞或肺上皮上表达而不在肿瘤细胞上表达的表面抗原，iCAR可以潜在地用于保护免受Mage-A3TCR或抗-ERBB2CAR交叉反应性，从而使其他有前途的治疗再生效。或者，由于很多肿瘤积极地下调HLA分子以逃离免疫识别，HLA靶向的iCAR具有对一些组织同时提供保护的潜能。

对iCAR的临床应用性的重要要求在于，尽管存在iCAR的先前信号转导，但仍保持T细胞的功能性。有趣的是，发现iCAR转导的T细胞在暴露于抑制性抗原后仍然对靶标抗原发动应答。这一可逆性模似自然杀伤细胞的行为，其中信号转导分子的磷酸化状态而非转录状态控制快速的功能应答例如细胞毒性。PD-1抗体和CTLA4抗体能够反转无效能(anergized)或疲劳T细胞的受损功能，再次要求暂时性调节T细胞应答的能力。此外，PD1-和CTLA-4对TCR复合物的作用的生物化学分析已经表明为依赖于磷酸化状态、下游激酶和运动性而非细胞凋亡。体外和体内结果均表明对靶外细胞应答的抑制，并带有持续的治疗功能，尽管存在一些细胞可能无效能的可能性。除在T细胞中起作用外，CTLA4和PD-1也在B细胞、巨噬细胞和树突细胞中运作。因此，iCAR也具有操控其他免疫现象的潜能。

本发明的iCAR可以用作阻碍工具来限制全身性细胞因子风暴或免疫细胞应答，例如，通过向iCAR引入抗原-例如输注到患者中的重组PSMA-Ig。PSMA-Ig可以结合并激活iCAR，因此可以暂时性地抑制T细胞活化。这可以暂时性地破坏造成细胞因子风暴的环状螺旋并使得T细胞以受限的全身性副作用进行活化。iCAR具有这种功能性，如交联iCAR所示的。

本发明利用生理机制来限制T细胞副作用。该途径模拟自然发生的对T细胞反应性的限制，因而不需要消除宝贵的治疗上可行的细胞。本发明的方法利用细胞的全方位功能性作为药物，通过使用引导并指导T细胞仅执行所需功能的合成性受体。总而言之，抗原特异性抑制性受体成功地在特异性细胞表面抗原参与时限制T细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒性，从而对正常组织赋予保护并保持重要的TCR或CAR介导的治疗功能。因此，iCAR提供新的策略在自体和同种异体环境中建立更安全更有效的T细胞疗法。

移植物抗白血病效果(GVL)和移植物抗宿主病(GVHD)

从首次施用同种异体骨髓移植以来，已经意识到白血病的根除依赖于源自供体的免疫应答。在同种异体骨髓移植(BMT)之后成功的供体淋巴细胞输注之后，移植物抗白血病效果(GVL)被进一步阐述和理解。供体淋巴细胞输注(DLI)是最确定且最广泛的对于恶性肿瘤的过继性免疫疗法的使用。不幸的是，在DLI后的发病率和死亡率的主要来源是移植物抗宿主病(GVHD)的发生。减少其发生率和严重程度是对在实体瘤和血液学肿瘤中更广地更有潜力治疗地使用DLI的重要限制。iCAR策略意在通过将GVL的有益作用与GVHD的有害后果分开而解决该问题。GVHD主要影响皮肤、肝脏和肠道，即具有可以不存在于靶标恶性肿瘤上的独特抗原例如少量不同抗原(minoralia-antigen)的位点。这些发现均支持，iCAR在分离GVL和GVHD作用中的可能作用。

在过继性疗法中，已经示出再靶向的T细胞在多种恶性肿瘤中发挥潜在的治疗作用。然而，该变化的方法由于对重要正常组织(心脏、肺)的交叉反应性和随后的毒性而受到限制。因此，对开发控制T细胞反应性而不阻碍其治疗功能的(即iCAR策略设计成要做的)方式存在明显需求。因识别出在心肌细胞或肺上皮上表达而不存在于肿瘤细胞的表面抗原，iCAR可以潜在地用于保护免受Mage-A3TCR或抗-ERBB2CAR交叉反应性，从而使其他有前途的疗法再生效。或者，由于很多肿瘤积极地下调HLA分子来逃离免疫识别，HLA靶向的iCAR可以潜在地对一些组织同时提供保护。

在一个实施方式中，将同种异体淋巴细胞(具有一定程度的免疫错配)工程化成表达靶向HLA-I的iCAR以治疗转移性乳腺癌(一类具有特别活跃的HLA-I下调的癌症)，HLA-I是广泛表达在不同组织中的抗原。对患者输注细胞。iCAR保护所有表达HLA-1的正常或非肿瘤组织，而肿瘤由于阴性或极低的HLA-I表达而被消除。

在另一实施方式中，患者经历HSCT以治疗血液学恶性肿瘤或作为实体瘤的辅助治疗。患者复发或具有残留疾病，其被分析为HLA-I阴性或下调。将供体淋巴细胞用靶向HLA-I的iCAR进行工程化。对患者输注细胞。iCAR保护所有表达HLA-I的正常或非肿瘤组织，而肿瘤由于阴性或极低的HLA-I表达而被消除。

在另一实施方式中，患者患有来源于与皮肤、肝脏或肠道细胞(GVHD相关死亡的主要位点)无关的位点的肿瘤。供体淋巴细胞用靶向皮肤、肝脏或肠道或所有三者表达的抗原的iCAR进行工程化。例如，如果肿瘤已经经历上皮间质转化(EMT)，如发现有肿瘤进展和转移性肿瘤，上皮细胞钙粘蛋白和细胞角蛋白作为该过程的一部分而示出为下调。上皮细胞钙粘蛋白在正常的皮肤、肝脏和肠中高度表达(Tsuchiya等人，Arch.Histol.Cytol.,69(2):135-145(2006))。因此，表达针对上皮细胞钙粘蛋白的iCAR的供体淋巴细胞以GVL的方式作用于肿瘤，但是其攻击皮肤、肝脏或肠道的能力受到限制。

iCAR和CAR的靶标抗原的选择

本发明提供一种方法和一组新的试剂，通过使用利用免疫抑制性受体(iCAR)的信号转导结构域的合成受体，控制T细胞或其他免疫调节细胞的应答。iCAR的合适抗原有时候将由于自然的肿瘤变动而利用个性化的医药途径。同时，取决于iCAR的使用和类型，一些潜在“类型”的抗原具有对一些组织同时提供保护的潜能。这些包括：(1)广泛表达且通过肿瘤而非正常组织下调的免疫原性抗原，例如人白细胞抗原(HLA)。(2)在肿瘤进程特别是获得转移性表型中下调而在某些正常组织中保持的抗原。这些抗原包括：(3)细胞表面EMT抗原(例如上皮细胞钙粘蛋白和细胞角蛋白)；(4)细胞表面肿瘤抑制基因抗原，例如OPCML(Cui等人，PLoSONE.2008；3(8):e2990)；和(6)其他相似的抗原例如HYAL2、DCC、SMAR1等。OPCML-v1以变化的水平在所有正常成人和胎儿组织中(除胎盘和外周血单核细胞外)广泛地表达。(7)细胞表面碳水化合物、脂类和翻译后修饰，例如粘蛋白型O-聚糖(核心3O-聚糖)(LeeandFukuda,MethodsEnzymol.2010；479:143-54；Suzuki-Anekoji等人，JBioiChem.2011Sep16；286(37):32824-33；Bao和Fukuda,MethodsEnzymol.20l0；479:387-96)。(8)此外，有很多其他在肿瘤中被扰乱的过程(代谢、细胞凋亡、运输、分化等)，各自引起表面抗原的下调，其中任意者均可以用作潜在的iCAR抗原靶标。

大体而言，本发明提供可以用于各个患者的个性方法。如本文所述，iCAR抗原可以通过算法过程而选择，之后医生可以定制适于患者肿瘤的特定受体。之后将该受体与刺激性受体(即，TCR或CAR或GVL信号)一起引入，以提供对选定组织的保护。

较为重要的是要注意到，iCAR可以结合与激活性CAR一样的抗原。例如，可以有一种情况，没有发现在肿瘤与正常组织之间的表达是双重的抗体(即，全部不存在于一者而存在于另一者)。然而，如果在肿瘤上的抗原以比正常组织高得多的水平表达，则刺激性CAR和iCAR受体均可以靶向该相同的抗原。在肿瘤的情况下，由于存在大量的抗原，刺激性CAR将主导并使肿瘤消除。在正常组织的情况下，由于抗原表达水平低，iCAR将提供足够的抑制。这是真实情况，因为两个/或单个靶标抗原的水平以及刺激性CAR和iCAR的水平会影响免疫应答细胞的应答结果(图23)。此外，改变各个受体的亲和性可以用于调节并微调应答。

在靶标和靶外组织之间的抗原不一致可以限制于主要在表达水平方面的差异而非绝对的表达缺失。此外，如果数种组织由一种常见的使用iCAR进行保护的抗原代表，则可以预期可变的表达水平。一个这样的例子是HLA分子的表达，该分子在大多种细胞类型上广泛发现，但经常具有不同的表达水平。有趣的是，HLA分子的下调表示肿瘤逃离T细胞免疫应答的主要机制。在这样的情形下，用针对在恶性肿瘤中下调的HLA分子的iCAR进行工程化的DLIT细胞将对多种组织类型提供广泛的保护以免受GVHD并同时保持GVL效果。

这些抗原选择的组合可能性仅受到可得抗体、肿瘤表面抗原分布和已知的组织特异性抗原的限制。

细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)

CTLA-4是由活化的T细胞所表达的抑制性受体，当被其相对的配体(分别为CD80和CD86；B7-1和B7-2)接合时，介导活化T细胞的抑制或无效能化。在临床前和临床研究中，CTLA-4经由全身性抗体输注的阻断尽管会增强内源性抗肿瘤应答，但在临床环境中，具有重大未预见的毒性。

CTLA-4包含胞外V结构域、跨膜结构域和细胞质尾区。可替代的剪切变体，编码不同的同工型，已经被表征。膜结合的同工型起到由二硫键互连的同质二聚体的作用，而可溶的同工型起到单体的作用。胞内结构域与CD28的胞内结构域相似，其没有固有的催化活性，并且包含一个能够结合PI3K、PP2A和SHP-2的YVKM基序和一个能够与包含SH3的蛋白结合的富含脯氨酸的基序。CTLA-4在抑制T细胞应答中的一个作用似乎是直接通过TCR近旁信号转导蛋白例如CD3和LAT的SHP-2和PP2A去磷酸化。CTLA-4也可以经由与CD28竞争CD80/86结合而间接影响信号转导。也已显示CTLA-4与PI3K、CD80、AP2M1和PPP2R5A结合和/或相互作用。

CTLA-4可以具有如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。

根据本发明，CTLA-4多肽可以具有与SEQIDNO:5至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列(本文的同源性可以使用标准软件例如BLAST或FASTA确定)。在非限制性实施方式中，CTLA-4多肽可以具有作为SEQIDNO:5的保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且多达222个氨基酸。或者或另外地，在非限制性的多种实施方式中，CTLA-4多肽具有SEQIDNO:5的氨基酸1～223、1～50、50～100、100～140、141～161、162～182、183～223、141～223、162～223、或183～223的氨基酸序列。在一个实施方式中，CTLA-4多肽具有SEQIDNO:5的氨基酸183～223的氨基酸序列。在某些实施方式中，iCAR的胞内信号转导结构域包括具有SEQIDNO:5的氨基酸183～223的氨基酸序列的CTLA-4多肽。在某些实施方式中，iCAR的跨膜结构域包括具有SEQIDNO:5的氨基酸162～182的氨基酸序列的CTLA-4多肽。

根据本发明，“CTLA-4核酸分子”是指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)

PD-1在与其相应的表达在内源性巨噬细胞和树突细胞上的配体PD-L1和PD-L2接合时是活化T细胞的负性免疫调节剂。PD-1是268个氨基酸的I型膜蛋白。PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，其为B7家族的成员。蛋白的结构包含胞外IgV结构域，之后为跨膜区域和胞内尾区。胞内尾区包含两个位于免疫受体酪氨酸类抑制性基序和免疫受体酪氨酸类开关基序的磷酸化位点，PD-1负性地调节TCR信号。SHP-I和SHP-2磷酸酶在配体结合时与PD-1的细胞质尾区结合。PD-L1的上调是一种肿瘤细胞可以逃避(evade)宿主免疫系统的机制。在临床前和临床试验中，拮抗性抗体所引起的PD-1阻断诱发经宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤应答。

PD-1可以具有在SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列。

根据本发明，PD-1多肽可以具有与SEQIDNO:6至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在非限制性实施方式中，PD-1多肽可以具有作为SEQIDNO:6的保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且多达287个氨基酸。或者或另外地，在非限制性的多种实施方式中，PD-1多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸1～288、1～50、50～100、100～144、145～170、171～191、192～288、145～288、171～288、或192～288的氨基酸序列。在一个实施方式中，PD-1多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸192～288的氨基酸序列。在某些实施方式中，iCAR的胞内信号转导结构域包括具有SEQIDNO:6的氨基酸192～288的氨基酸序列的PD-1多肽。在某些实施方式中，iCAR的跨膜结构域包括具有SEQIDNO:6的氨基酸171～191的氨基酸序列的PD-1多肽。

根据本发明，“PD-1核酸分子”是指编码PD-1多肽的多核苷酸。

淋巴细胞-活化基因3(LAG-3)

淋巴细胞-活化基因3(LAG-3)是免疫细胞的负性免疫调节剂。LAG-3属于免疫球蛋白(Ig)超家族并包含4个胞外Ig样结构域。LAG3基因包含8个外显子。序列数据、外显子/内含子结构和染色体定位均表明LAG3与CD4的紧密关系。LAG3也命名为CD223(分化簇223)。

LAG-3可以具有在SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列。

根据本发明，LAG-3多肽可以具有与SEQIDNO:7至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在非限制性实施方式中，LAG-3多肽可以具有作为SEQIDNO:7的保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且多达524个氨基酸。或者或另外地，在非限制性的多种实施方式中，LAG-3多肽具有SEQIDNO:7的氨基酸1～525、1～50、50～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～350、350～400、400～420、421～450、451～471、472～525、421～525、451～525或472～525的氨基酸序列。在一个实施方式中，LAG-3多肽具有SEQIDNO:7的氨基酸472～525的氨基酸序列。在某些实施方式中，iCAR的胞内信号转导结构域包括具有SEQIDNO:7的氨基酸472～525的氨基酸序列的LAG-3多肽。在某些实施方式中，iCAR的跨膜结构域包括具有SEQIDNO:7的氨基酸451～471的氨基酸序列的LAG-3多肽。

根据本发明，“LAG-3核酸分子”是指编码LAG-3多肽的多核苷酸。

自然杀伤细胞受体2B4(2B4)

自然杀伤细胞受体2B4(2B4)介导在NK细胞和T细胞亚群上非MHC限制的细胞杀死。迄今为止，2B4的功能还在研究中，其中2B4-S同工型被认为是激活性受体，且2B4-L同工型被认为是免疫细胞的负性免疫调节剂。2B4在结合其高亲和性配体CD48时变得被占用。2B4包含酪氨酸类开关基序，即使得蛋白与多种磷酸酶结合的分子开关。2B4也被命名为CD244(分化簇244)。

2B4可以具有在SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列。

根据本发明，2B4多肽可以具有与SEQIDNO:8至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在非限制性实施方式中，2B4多肽可以具有作为SEQIDNO:8的保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且多达369个氨基酸。或者或另外地，在非限制性的多种实施方式中，2B4多肽具有SEQIDNO:8的氨基酸1～370、1～50、50～100、100～150、150～215、216～229、230～250、251～370、216～370、230～370、或251～370的氨基酸序列。在一个实施方式中，2B4多肽具有SEQIDNO:8的氨基酸251～370的氨基酸序列。在某些实施方式中，iCAR的胞内信号转导结构域包括具有SEQIDNO:8的氨基酸251～370的氨基酸序列的2B4多肽。在某些实施方式中，iCAR的跨膜结构域包括具有SEQIDNO:8的氨基酸230～250的氨基酸序列的2B4多肽。

根据本发明，“2B4核酸分子”是指编码2B4多肽的多核苷酸。

B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)

B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)的表达在T细胞活化过程中被诱导，且BTLA在Th1细胞而不在Th2细胞中保持表达。与PD1和CTLA4类似，BTLA与B7同系物B7H4相互作用。然而，与PD-1和CTLA-4不同，BTLA经由与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)而不仅是细胞表面受体的B7家族的相互作用而显示出T细胞抑制。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14(也称为疱疹病毒侵入介质(HVEM))的配体。BTLA-HVEM复合物负性地调节T细胞免疫应答。BTLA激活已经显示出抑制人CD8⁺癌症特异性T细胞的功能。BTLA也命名为CD272(分化簇272)。

BTLA可以具有在SEQIDNO:9中所列的氨基酸序列。

根据本发明，BTLA多肽可以具有与SEQIDNO:9至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在非限制性实施方式中，BTLA多肽可以具有作为SEQIDNO:9的保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且多达288个氨基酸。或者或另外地，在非限制性的多种实施方式中，BTLA多肽具有SEQIDNO:9的氨基酸1～289、1～50、50～100、100～134、135～157、158～178、179～289、135～289、158～289、或179～289的氨基酸序列。在一个实施方式中，BTLA多肽具有SEQIDNO:9的氨基酸179～289的氨基酸序列。在某些实施方式中，iCAR的胞内信号转导结构域包括具有SEQIDNO:9的氨基酸179～289的氨基酸序列的BTLA多肽。在某些实施方式中，iCAR的跨膜结构域包括具有SEQIDNO:9的氨基酸158～178的氨基酸序列的BTLA多肽。

根据本发明，“BTLA核酸分子”是指编码BTLA多肽的多核苷酸。

造血细胞谱系

哺乳动物造血(血)细胞提供范围很宽的生理学活性。造血细胞划分为淋系、髓系和红系。淋系，包括B、T、和自然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来试剂的检测、对宿主而言外来细胞的检测等。如本文所用，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟并主要负责细胞介导的免疫力的淋巴细胞。T细胞参与到适应性免疫系统中。如本文所用，术语“自然杀伤(NK)细胞”是指作为细胞介导的免疫力的一部分并在先天免疫应答中发挥作用的淋巴细胞。它们不要求在先的活化来发挥其对靶标细胞的细胞毒性作用。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的淋巴细胞的亚群。

用在本发明方法中的细胞

本发明提供组合表达激活免疫应答细胞的抗原识别受体(例如，TCR、CAR)与抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的细胞，以及使用这些细胞来治疗需要增强的免疫应答的疾病的方法。在一个方法中，将肿瘤抗原特异性T细胞(所有亚群包括CD4、CD8、记忆型、幼稚型、效应性、T-reg等)、先天免疫系统细胞、NK细胞、CTL细胞或其他免疫应答细胞用于表达与非肿瘤组织上的抗原结合的iCAR，以用于治疗或预防瘤形成。例如，表达识别CD19的嵌合抗原受体19-28z的T细胞在表达与CD33结合的iCAR的T细胞中共表达。将这些细胞施用至有需求的人类受试者中以用于治疗或预防血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)。在另一个方法中，病毒抗原特异性的T细胞、NK细胞、CTL细胞可以用于治疗病毒疾病。细胞可以表达重组或内源性抗原受体，其可以是对CD19特异的19-28z、对PSMA特异的P28z、对间皮素特异的M28z、或对CD56特异的56-28z。

患者自身的T细胞可以通过引入编码人造T细胞受体(称为嵌合抗原受体，CAR)的基因而遗传修饰成靶向肿瘤。CAR包括激活免疫应答的CAR和抑制免疫应答的iCAR。

肿瘤抗原特异性T淋巴细胞(和NK细胞)

可以用在本发明方法中的肿瘤抗原特异性人淋巴细胞的类型包括，但不限于，遗传修饰成表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain,M.,等人，2003NatRevCancer3:35-45)、遗传修饰成表达包含异质二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞(Morgan,R.A.,等人，2006Science314:126-129)、来源于肿瘤活组织检查中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物(Panelli,M.C.等人,2000JImmunol164:495-504；Panelli,M.C.等人,2000JImmunol164:4382-4392)、以及采用人造抗原提呈细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞选择性地在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞(Dupont,J.等人,2005CancerRes65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人,2003Blood102:2498-2505)。T细胞可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或体外得自工程化的祖细胞或干细胞。T细胞可以大量制备，如通常用外周血淋巴细胞(PBL)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行，T细胞可以通过使用例如CD4、CD8、CD62L纯化。

任何合适的肿瘤抗原(抗原肽)适于用在本文所述的肿瘤相关的实施方式中。免疫应答激活性抗原的来源包括但不限于癌蛋白。抗原可以表达为肽或完整蛋白或其部分。完整蛋白或其部分可以是天然的或诱变的。合适的免疫应答激活抗原包括前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺干细胞抗原(PCSA)。

病毒抗原特异性T淋巴细胞(和NK细胞)

用于例如在免疫受损的受试者中治疗病原体感染或其他感染性疾病的合适抗原包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒中存在的病毒抗原。

CTL的未纯化来源可以是本领域任何已知的，例如，骨髓、胎儿、新生儿或成人或其他的造血细胞来源，例如，胎肝、外周血或脐带血。可以使用多种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可以在最初除去非CTL。对于阳性选择和阴性选择，mAb对于识别与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记物特别有用。

较大比例的终末分化细胞可以在最初通过相对较粗的分离而除去。例如，最初可以使用磁珠分离，以除去大量不相关的细胞。优选地，至少约80％、通常至少70％的总造血细胞将在细胞分离之前除去。

分离步骤包括，但不限于，密度梯度离心；重置(resetting)；与改变细胞密度的颗粒结合；用涂有抗体的磁珠进行磁性分离；亲和色谱；与mAb连接或结合使用的细胞毒性剂，包括，但不限于，补体和细胞毒素；以及用与固体基质例如板、芯片连接的抗体进行淘选，淘析或任何其他传统技术。

用于分离和分析的技术包括，但不限于，流式细胞术，其可以具有不同程度的改进，例如，多种色彩通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。

可以通过使用与死亡细胞有关的染料例如碘化丙啶(PI)将细胞针对死亡细胞进行选择。优选地，将细胞收集在包含2％肽牛血清(FCS)或0.2％牛血清白蛋白(BSA)的介质或者任何其他合适的优选为无菌的等渗介质中。

因此，本发明总体上提供免疫应答细胞，例如，病毒特异性或肿瘤特异性T细胞，其包含与第一抗原结合并激活免疫应答细胞的受体以及与第二抗原结合并抑制免疫应答细胞的受体。

载体

免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导基本均质的细胞组成而完成。优选地，将逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于向宿主细胞基因组引入DNA或RNA构建体。例如，编码与抗原(例如，肿瘤抗原或其变体或片段)结合的受体的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，且表达可以由其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列、或可替代的内部启动子驱动。也可以使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如，使用核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、和/或成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR))、或转基因表达(例如，使用天然或化学修饰的RNA。)

对于对细胞进行最初遗传修饰以提供肿瘤或病毒抗原特异性细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，但可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续遗传修饰以提供包含抗原提呈复合物(包含至少两种共刺激配体)的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证实是有效的。逆转录病毒载体和适当的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白作用于感染人细胞。多种产生兼向性病毒的细胞系是已知的，包括，但不限于PA12(Miller等人,(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等人,(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460-6464)。非兼向性颗粒也适用，例如，用VSVG、RD114或GALV外壳假型化的颗粒和任何其他本领域已知的。

可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如，通过Bregni等人,(1992)Blood80:1418-1422的方法，或者在存在或不存在适当生长因子和聚阳离子的情况下与单独的病毒上清液或浓缩载体储液一起培养，例如，通过Xu等人,(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes等人,(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。

转导性病毒载体可以用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体。优选地，所选的载体表现出高效率的感染和稳定的整合与表达(参见，例如，Cayouette等人，HumanGeneTherapy8:423-430,1997；Kido等人，CurrentEyeResearch15:833-844,1996；Bloomer等人，JournalofVirology71:6641-6649,1997；Naldini等人，Science272:263267,1996；以及Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。其他可以使用的病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒例如EB病毒(也参见，例如thevectorsofMiller,HumanGeneTherapy15-14,1990；Friedman,Science244:1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques6:608-614,1988；Tolstoshev等人,CurrentOpinioninBiotechnology1:55-61,1990；Sharp,TheLancet337:1277-1278,1991；Cornetta等人,NucleicAcidResearchandMolecularBiology36:311-322,1987；Anderson,Science226:401-409,1984；Moen,BloodCells17:407-416,1991；Miller等人,Biotechnology7:980-990,1989；LeGalLaSalle等人,Science259:988-990,1993；和Johnson,Chest107:77S-83S,1995)。逆转录载体被特别好地开发并已经用在临床环境中(Rosenberg等人,N.Engl.J.Med323:370,1990；Anderson等人，美国专利第5,399,346号)。

也可以将非病毒方法用于细胞中蛋白的表达。例如，核酸分子可以通过在脂质转染的存在下施用核酸(Feigner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,NeuroscienceLetters17:259,1990；Brigham等人,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger等人,MethodsinEnzymology101:512,1983)，通过脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸结合(Wu等人,JournalofBiologicalChemistry263:14621,1988；Wu等人,JournalofBiologicalChemistry264:16985,1989)，或者通过在手术条件下微注射(Wolff等人,Science247:1465,1990)，从而引入到细胞中。其他用于基因转移的非病毒方式包括在体外使用磷酸钙、DEAE右旋糖苷、电穿孔和原生质体融合进行转染。脂质体对于将DNA递送至细胞中也是潜在有益的。正常基因移植到受试者的受感染组织中也可以通过将正常核酸先体外后体内转移到可培养细胞型中(例如，自体或异种原代细胞或其子代)，之后将细胞(或其后代)注射到靶标组织中或全身性注射而完成。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALE核酸酶)得到或获得。暂时的表达可以通过RNA电穿孔获得。

用在多核苷酸疗法中的eDNA表达可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并通过任何合适的哺乳动物调控元件或内含子(例如，延伸因子1α增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要的话，已知偏好地指导基因在特定细胞类型中表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括，但不限于，表征为组织-或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗构件，则调控可以通过同源调控序列或如果需要的话通过得自异源的调控序列(包括上述任意的启动子或调控元件)而介导。

所得的细胞可以在与用于未修饰细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以扩增并用于多种目的。

多肽和类似物

同时包括在本发明中的是以在免疫应答细胞中表达时增强抗肿瘤活性(例如，人源化单克隆抗体)或抑制细胞毒性活性(例如，iCAR)的方式修饰的αCD19、αPSMA、CD28、CD3ζ、CTLA-4、PD-1和19-28z多肽或其片段。本发明提供通过在序列中产生变化来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这类的变化可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本发明还包括本发明的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以因氨基酸序列差异、翻译后修饰或以上两者而与本发明的自然存在的多肽不同。本发明的类似物将通常表现出与本发明自然存在的氨基酸序列的全部或部分至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15、或20个氨基酸残基，优选为至少25、50或75个氨基酸残基，且更加优选为多于100个氨基酸残基。此外，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，概率评分在e^-3与e^-100之间表明序列紧密相关。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这些修饰可以在多肽合成中或在用分离的修饰酶的处理中或处理后发生。类似物也可以因在初级序列中的变化而与本发明的自然存在的多肽不同。这些包括遗传变体，天然的和诱导的(例如，得自通过照射或暴露于乙烷甲基硫酸酯的随机突变或通过位点特异性突变，如在Sambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.),CSHPress,1989或Ausubel等人(同上)中所记载的)。同时包括的是包含L-氨基酸之外的残基(例如D-氨基酸)或非自然存在的或合成的氨基酸例如β-或γ-氨基酸的环状肽、分子和类似物。

除全长多肽外，本发明还提供本发明任一多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在其他实施方式中，片段为至少20个相连的氨基酸、至少30个相连的氨基酸或至少50个相连的氨基酸，并且在其他实施方式中至少60～80、100、200、300或更多相连的氨基酸。本发明的片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以得自于普通的蛋白加工(例如，从初生多肽中除去生物活性不必须的氨基酸或通过另外可选的mRNA剪接或另外可选的蛋白加工事件除去氨基酸)。

非蛋白类似物具有设计成模拟本发明蛋白的功能活性的化学结构。这样的类似物根据本发明的方法而施用。这样的类似物可以超出原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域熟知，且类似物的合成可以根据这些方法通过修饰化学结构使得所得类似物在表达于免疫应答细胞中时增加抗肿瘤活性而进行。这些化学修饰包括但不限于在参照多肽的特定碳原子处取代可替换R基团以及改变饱和度。优选地，蛋白类似物相对耐受于体内降解，从而在施用时引起更加延长的疗效。用于测定功能活性的检定包括但不限于在以下实施例中所述的那些。

共刺激配体

与至少一种共刺激配体的相互作用提供对于免疫细胞(例如T细胞)的完全激活来说非常重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括，但不限于，肿瘤坏死因子(TNF)配体、细胞因子(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL21)和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。肿瘤坏死因子(TNF)是参与全身炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用在于对免疫细胞进行调节。肿瘤坏死因子(TNF)配体共享多种共同特征。大多数配体合成为含有短胞质链段和相对较长的胞外区域的II型跨膜蛋白(胞外C-端)。TNF配体包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD40L(CD40L)/CD154、CDI137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFα)、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD30L/CD153、肿瘤坏死因子β(TNFβ)/淋巴毒素-α(LTα)、淋巴毒素-β(LTβ)、CD257/B细胞激活因子(BAFF)/Biys/THANK/Tall-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)、和TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是参与细胞识别、结合或粘附过程的一大类细胞表面可溶性蛋白。这些蛋白与免疫球蛋白共享结构特征，即它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80、CD86、和ICOS，CD28的两种配体。

给药

可以将包含本发明遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、先天免疫系统的细胞、NK细胞、CTL细胞或其祖细胞)的组合物全身性地或直接地提供给受试者以治疗瘤形成、病原体感染或感染性疾病。在一个实施方式中，本发明的细胞直接注射到所关注的器官中(例如，受瘤形成影响的器官)。或者，将包含遗传修饰的免疫应答细胞的组合物间接地提供到所关注的器官，例如通过施用到循环系统中(例如，肿瘤脉管系统)。扩张剂和分化剂可以在细胞给药之前、过程中或之后提供，以提高T细胞、先天免疫系统细胞、NK细胞或CTL细胞的体外或体内产生。

可以将修饰的细胞在任何生理学可接受的载体中施用，通常是血管内给药，尽管它们也可以引入到骨或细胞可以找到再生和分化的合适位点的其他方便位点中(例如，胸腺)。通常，将施用至少l×l0⁵细胞，最终达到l×l0¹⁰或更多。本发明的遗传修饰的免疫应答细胞可以包括纯化的细胞群。本领域技术人员可以容易地使用各种公知方法例如荧光活化细胞分选(FACS)来确定群中遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。包含遗传修饰的免疫应答细胞的群体中的优选纯度范围为约50％至约55％、约55％至约60％、以及约65％至约70％。更优选地，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％；更优选地，纯度为约85％至约90％、约90％至约95％、以及约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低会要求剂量增加)。细胞可以通过注射、导管等引入。如果需要的话，还可以包括因子，包括，但不限于，白介素，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、Ill5、IL21以及其他白介素，菌落刺激因子例如G-、M-和GM-CSF，干扰素例如γ-干扰素和红细胞生成素。

本发明的组合物包括药物组合物，其包含遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞以及药学可接受的载体。给药可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以得自一个受试者，并施用给同一受试者或者不同的相容的受试者。本发明的源自外周血的免疫应答细胞或其子代(例如，体内、先体外后体内或体外获得的)可以经由局部注射给药，包括导管给药、全身性注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、混悬液、乳液)。

制剂

本发明的包含遗传修饰的免疫应答细胞的组合物可以方便地提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、混悬液、乳液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在一定程度上更加方便给药，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触期。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。

无菌可注射溶液可以通过以下方法制备：将用于实施本发明的遗传修饰的免疫应答细胞引入到所需量的适当溶剂(如果需要的话，具有不同量的其他成份)中。这些组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂混合，例如，无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。组合物还可以冻干。取决于给药途径和所需的制剂，组合物可以含有辅助性物质，例如，润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘添加剂、防腐剂、风味剂、着色剂等。可以参考标准教科书，例如“REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCE”,17thedition,1985(通过引用的方式并入本文)，以制备合适的制剂而无需过度的实验。

可以加入各种提高组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。微生物作用的防止可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂来确保，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射药物形式的延长吸收。但是，根据本发明，使用的任何载体、稀释剂或添加剂均必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。

组合物可以是等渗的，即，它们具有的渗透压可以与血液和泪液相同。本发明的组合物所需的等渗性可以使用氯化钠或其他药学可接受的试剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠对于含有钠离子的缓冲剂来说是特别优选的。

如果需要，组合物的粘度可以使用药学可接受的增稠剂而保持在选定的水平。优选甲基纤维素，因为它易于获得，经济，并且易于处理。其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。优选的增稠剂浓度将取决于所选的试剂。要点在于使用将会实现所选粘度的量。显然，合适的载体和其他添加剂的选择将取决于具体的给药途径和特定剂量形式例如液体剂型的性质(例如，组合物是否配制成溶液、混悬液、凝胶或其他液体形式例如延时释放形式或液体充填形式)。

本领域技术人员将会认识到，组合物的组分应当选择成在化学上呈惰性，且不影响本发明所述的遗传修饰的免疫应答细胞的生存力或效力。这对于化学和药物原理的技术人员来说不成问题，或者从当前公开内容及本文引用的文件，很容易通过参考标准教科书或通过简单的实验(不涉及过度实验)来避免问题。

涉及本发明的遗传修饰免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是实现最优效果所需的细胞的量。将要施用的细胞的量将针对正被治疗的受试者而变化。在一个实施方式中，将10⁴至10¹⁰、10⁵至10⁹或者10⁶至10⁸本发明的遗传修饰的免疫应答细胞施用至人类受试者。更有效的细胞可以进而以更少的量进行给药。在一些实施方式中，将至少约1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸和5×10⁸本发明的遗传修饰免疫应答细胞施用至人类受试者。何为有效剂量的精确确定可以基于对于每个受试者而言独立的因素，包括特定受试者的体型大小、年龄、性别、体重和状况。由本公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以很容易地确定剂量。

本领域技术人员可以容易地确定组合物中以及将要在本发明方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常而言，任何添加剂(除活性细胞和/或试剂以外)以磷酸盐缓冲盐水中0.001-50％(重量)溶液的量存在，且活性成分以微克至毫克的量级存在，例如，约0.0001wt％至约5wt％，优选为约0.0001wt％至约1wt％，进而更优选为约0.0001wt％至约0.05wt％，或者约0.001wt％至约20wt％，优选为约0.01wt％至约10wt％，进而更优选为约0.05wt％至约5wt％。当然，对于任何将要给予动物或人的组合物，以及对于任何特定的给药方法，因而优选的是确定：毒性，例如，通过确定在适当的动物模型例如啮齿动物如小鼠中的致死剂量(LD)和LD50；和组合物的剂量、其中组分的浓度以及施用组合物的时机，其引发适当的应答。根据技术人员的知识、本公开内容以及本文引用的文件，这些确定不需要过度的实验。而且，依序给药的时间可以不经过度实验而确定。

处理方法

本文提供的是在受试者中治疗瘤形成的方法。同时包含在本文中的是在受试者例如免疫受损的人类受试者中治疗病原体感染或其他感染性疾病的方法。方法包括以可有效达成所需效果的量施用本发明的T细胞、先天免疫系统细胞、NK细胞或CTL细胞，减轻现有病症或预防复发。对于治疗，施用量是可有效产生所期望效果的量。有效量可以在一次或一系列给药中提供。有效量可以以推注(bolus)或通过连续输注提供。

“有效量”(或者“治疗有效的量”)是在治疗时足以实现有益或所需的临床结果的量。有效量可以以一或多个剂量给予受试者。就治疗而言，有效量是指足以减轻、减缓、稳定、逆转或减缓疾病进展，或者降低疾病的病理后果的量。有效量通常由医师基于个案确定，并在本领域技术人员的技能以内。当确定达到有效量的适当剂量时，通常考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的病症、病症的严重程度以及施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。

对于使用抗原特异性T细胞的过继性免疫疗法，通常输注10⁶-10¹⁰范围内(例如10⁹)的细胞剂量。在将遗传修饰的细胞施用到宿主中并进行后续分化时，诱导出特异性地导向特定抗原的T细胞。T细胞的“诱导”可以包括抗原特异性T细胞的失活，例如通过缺失或无效能化。失活特别可用于在例如自身免疫性病症中建立或重建耐受性。修饰的细胞可以通过本领域已知的任意方法进行施用，包括，但不限于，静脉内、皮下、结节内(intranodal)、瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接到胸腺。

治疗方法

本发明提供在有需求的受试者中增加免疫应答的方法。在一个实施方式中，本发明提供治疗或预防受试者中瘤形成的方法。本发明提供特别可用于治疗具有不适合常规治疗性干预的血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌的受试者的疗法。适用于疗法的人类受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。具有“重度疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是荷临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是可以基于肿瘤质量而检测的肿瘤(例如，通过触诊、CAT扫描、声波图、乳房X线光片或X-射线；阳性生化或组织病理学标记物本身不足以识别该群体)。将本发明中实施的药物组合物施用给这些受试者，以引发抗肿瘤应答，目的在于减轻他们的病症。理想地，作为结果发生肿瘤质量的减少，但是任何临床改善均构成益处。临床改善包括风险或进展速度降低或者肿瘤的病理学后果减少。

第二组合适的受试者在本领域中称作“辅助组”。他们是已经具有瘤形成史，但已经对另一治疗模式有响应的个体。在先的疗法可以包括，但不限于，手术切除、放疗和传统化疗。结果，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。但是，他们疑似在原始肿瘤位点附近或者通过转移而处于疾病进展的风险中。这一组可以进一步细分成高风险个体和低风险个体。细分基于初始治疗之前或之后观察到的特征而作出。这些特征是临床领域已知的，并且对于每种不同的瘤形成均加以适当定义。高风险亚组典型的特征是肿瘤已经侵入邻近组织的那些，或者表现出牵涉到淋巴结的那些。

另一组具有瘤形成的遗传倾向性，但尚没有观察到瘤形成的临床体征。例如，对乳腺癌相关的基因突变测试呈阳性，但仍处于育龄年纪的女性可能希望在预防性治疗中接受一种或多种本文所述的抗原结合片段，以防止瘤形成的发生，直至适合进行预防性手术。

具有任意以下瘤形成的人类瘤形成受试者是特别适合的受试者：成胶质细胞瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌症还包括任何肿瘤学领域已知者，包括但不限于，星形细胞瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和重链病、乳腺肿瘤例如导管和小叶腺癌、子宫颈鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮性癌、前列腺癌、膀胱的移行性鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节状和弥散性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。

受试者可以具有进展形式的疾病，在该情形中治疗目的可以包括疾病进展的减轻或逆转，和/或副作用的减轻。受试者可以具有病症史，他们已经对病症进行过治疗，在这种情况下，治疗目的通常包括降低或延迟复发的风险。

因此，本发明提供在受试者中治疗或预防瘤形成的方法，该方法包括施用有效量的免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与肿瘤抗原结合并激活免疫应答细胞的受体(例如，TCR、CAR)以及编码与靶标抗原结合并抑制免疫应答细胞的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的载体。作为与肿瘤抗原结合并激活免疫应答细胞的受体(例如，TCR、CAR)以及编码与靶标抗原结合并抑制免疫应答细胞的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的载体的表面表达结果，过继转移的人T或NK细胞被赋予选择性细胞溶解活性。

在一个实施方式中，瘤形成选自于血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、肉瘤和急性髓细胞样白血病(AML)、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、成胶质细胞瘤、和喉癌。在另一个实施方式中，肿瘤抗原是碳酸酐酶IX(CA1X)、癌胚抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人上皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白介素-13受体亚基α2(IL-13R-α2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、lewisY(LeY)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、黑色素瘤抗原家族A，1(MAGE-AI)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、间皮素(MSLN)、NKG2D配体、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列前特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、或Wilms瘤蛋白(WT-1)。

在其他实施方式中，本发明提供用于治疗患有病原体感染(例如，病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的受试者的方法。本发明特别可用于在免疫受损受试者中增强免疫应答。对使用本发明方法的治疗易感的示例性病毒感染包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、和流感病毒感染。因此，本发明提供在受试者中治疗或预防病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的本文所述的免疫应答细胞。

试剂盒

本发明提供用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含治疗性或预防性组合物，该组合物包含有效量的单位剂量形式的免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含激活性抗原受体和抑制性嵌合抗原受体(iCAR)。在一些实施方式中，试剂盒包含无菌容器，该容器包含治疗性或预防性疫苗；该容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩或本领域已知的其他合适的容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适于容纳药物的材料制成。

如果需要，免疫应答细胞与用于将细胞施用至具有瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植或处于其罹患风险中的受试者的说明书一起提供。说明书通常会包括有关使用组合物治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的信息。在其他实施方式中，说明书包括以下的至少一种：对治疗剂的说明；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植或其症状的剂量日程和给药；预防措施；警告；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印刷在容器上(如果存在)，或者作为涂敷于容器的标签，或者作为在容器中或者与其一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或折叠式印刷物。

实施例

除非另外指出，本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其均在技术人员知晓的范围以内。这些技术在文献中得以充分解释，例如，“MolecularCloning:ALaboratoryManual”,secondedition(Sambrook,1989)；“OligonucleotideSynthesis”(Gait,1984)；“AnimalCellCulture”(Freshney,1987)；“MethodsinEnzymology”“HandbookofExperimentalImmunology”(Weir,1996)；“GeneTransferVectorsforMammalianCells”(MillerandCalos,1987)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel,1987)；“PCR:ThePolymeraseChainReaction”,(Mullis,1994)；“CurrentProtocolsinImmunology”(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的制备，如此，可以在本发明的制作和实施中加以考虑。特别可用于具体实施方式的技术将在以下部分中讨论。

给出以下实施例，以对本领域普通技术人员提供如何进行并使用本发明的检定、筛选和治疗方法的充分公开和说明，并无意于对发明人视作其发明的范围进行限定。

实施例1.抑制性嵌合抗原受体(iCAR)转移靶外应答

概述

T细胞疗法已经表明对治疗一些癌症的长期效能和治疗潜能。然而，其应用受到对近旁组织的损害的限制，如在供体淋巴细胞输注后的移植物抗宿主病、或在一些工程化T细胞疗法中引起的“中靶非肿瘤”毒性中看到的。非特异性免疫抑制和可逆的T细胞消除在当前是仅有的控制这些有害应答的方式，但是代价是消除治疗益处或造成二次并发症。在免疫抑制性受体的生理学范例的基础上，将抗原特异性抑制性嵌合抗原受体(iCAR)设计成先发制人地限制T细胞应答。在以下呈现的结果表明，基于CTLA-4或PD-1的iCAR可以选择性地限制经内源性T细胞受体或激活性嵌合受体引发的细胞因子分泌、细胞毒性和增殖。iCAR的初始效果是暂时性的，因而使得T细胞可以在下一次遇到由其激活性受体识别的抗原时起作用。因而，iCAR提供动态的自调节安全开关，与其说是治疗，更确切的说是防止不足的T细胞特异性的后果。

介绍

T细胞疗法已经在骨髓和器官移植、癌症免疫疗法、病毒感染和自免疫疾病中显示出临床效能(1～6)。不幸地是，T细胞也可以参与有害的副作用。“中靶非肿瘤”不利事件已经在使用T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的癌症免疫治疗临床试验中有过报道。这些包括在用表达抗CD19CAR的T细胞治疗的慢性淋巴细胞白血病患者中的B细胞发育不全(7～9)、在抗-ERBB2CART细胞输注后认为源自对肺上皮交叉反应性的胎儿急性呼吸窘迫综合征(10)、和在用识别癌症-睾丸抗原的TCR治疗的患者中引起的源自心肌坏死或神经毒性的TCR引起的死亡(11～13)。相似地，在同种异体骨髓转移中供体淋巴细胞输注(DLI)的治疗益处受到急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓发育不全两者的诱发的限制(14)。将移植物抗肿瘤(GVT)的有益效果与GVHD分开的策略迄今已经达到有限的成功(15)。

当前抑制T细胞介导的毒性的方法依赖于免疫抑制性方案例如高剂量皮质类固醇疗法的使用，其对T细胞发挥细胞抑制作用或细胞毒性作用，以限制免疫应答(16)。尽管有效，该方法无法区分有益的和有害的T细胞功能。此外，免疫抑制性药物造成很大的二次副作用，例如对感染的易感性以及心脏、肾脏和神经损伤(14)。自杀基因工程化策略可以使用毒性剂的选择性酶促代谢剂例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(17)或可诱导的半胱天冬酶-9(18)，或靶向工程化到T细胞中的异位表位的抗体介导的消耗策略(19、20)，也是对治疗效能不加区分地消除T细胞。此外，这些方法是反应式的，因为它们在观察到有害副作用后实施。因而，防止不想要的T细胞反应性的策略是高度期望的。

T细胞激活的生理调控通过一些包括免疫抑制性受体的机制完成，其在减弱或终止T细胞应答方面发挥关键作用(21、22)。抑制性受体可以在T细胞激发过程中上调以提供逐渐变小的免疫应答或在基础水平表达来调节活化阈值。因此，缺失抑制性受体CTLA-4的小鼠显示出大量的T细胞激活和增殖，并最终屈从于严重的全身性自免疫疾病，带有活化T细胞的浸润(23)。相似地，特异性表达在活化T细胞上的另一种抑制性受体PD-1的缺失在C57BL/6小鼠中造成进展性关节炎和肾小球性肾炎，并在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠中造成加速的胰岛炎(24、25)。这些受体及其下游信号转导通路的调节对T细胞功能具有重大的影响。在T细胞刺激过程中CTLA-4或PD-1的体外连接阻断活化、细胞因子释放和增殖(26)。明显地，抗-CTLA-4和抗-PD-1抗体已经通过在一些患有黑色素瘤、肺癌和肾癌的患者中抑制抗-T细胞应答而显示出临床前景(22、27、28)。CTLA-4和PD-1的阻断也在活跃地被研究用于反转在慢性乙肝和HIV感染中的免疫紊乱和病毒持续感染(29、30)。然而，与非特异性免疫抑制相似，抗体介导的抑制性受体检查点阻断是非抗原特异性的，因而无法辨明有益和有害T细胞群。

将遗传工程化策略用于以抗原选择性的方式治理天然T细胞抑制生理并调控T细胞应答。设计出具有与有力的急性抑制性信号转导结构域结合以限制T细胞反应性的表面抗原识别结构域的抑制性嵌合抗原受体(CAR(iCAR))，尽管有激活性受体的共同参与(图1A)。如下所示，在人原代T细胞中，基于PD-1和CTLA-4的iCAR可逆地限制关键的TCR或激活性CAR功能，因而使得可以在体外和体内区分靶标细胞和靶外细胞。

材料和方法

研究设计

本研究的目的是构建可以以抗原依赖可逆方式限制T细胞对靶标细胞的毒性的合成受体。设计出两个使用CTLA-4或PD-1的胞内尾区和scFv靶向结构域(针对PSMA)的这类受体，并分析其是否可以在体外和体内阻断(i)TCR或(ii)CAR驱动的T细胞功能性。在体外，聚焦于分析(i)细胞毒性、(ii)细胞因子分泌、和(iii)T细胞增殖。体内实验使用实时成像和端点分析(由未处理小鼠组指示)分析iCAR保护细胞靶标的综合能力。实验过程由纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构(MemorialSloan-KetteringCancerCenter，MSKCC)的动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准。实验的整体设计是将T细胞(表达iCAR或对照Pdel受体)暴露于靶标细胞(表达或缺少PSMA)，并对尝试探索iCAR功能的各组进行比较，总是在内部对照的存在下。通过将T细胞分选为iCAR或iCAR/CAR双阳性(使用报告基因)，缺少iCAR的T细胞不会影响结果。各个实验使用不同供体T细胞进行多次(T细胞不混合)。在大多数情况下，提供使用代表性实验(样本重复多于三个)的数据，以避免变量混杂，变量例如由转导和分选效率引起的差异、供体相关的变化性和E/T比。

抑制性嵌合抗原受体(iCAR)设计

使用两种方法用UniProt序列注解设计各个抑制性嵌合抗原受体(iCAR)。首先，使用商业基因合成或cDNA，将各个受体的胞内结构域克隆到前述Pz1受体的CD28/CD3ζ的位置(Stephan等人,Naturemedicine,2007.13(12):1440-9)，从而利用CD8跨膜和铰链结构域。CD8多肽可以具有以下列出的氨基酸序列：

MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRLSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSQLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENRGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTYIWAPLADTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV[SEQIDNO：11]

CD8跨膜和铰链结构域可以具有SEQIDNO:11的氨基酸137～209的氨基酸序列。可选地或额外地，也可以使用并测试CD4跨膜和铰链结构域。iCAR构建体的核酸序列和氨基酸序列提供在附录A。或者，包含多至第一注解的胞外拓扑结构域的跨膜结构域和氨基酸(对于PD-1，氨基酸145～288；对于CTLA4，氨基酸161～223)，从而利用各个受体的内源性铰链区域。将这些构建体在PSMAscFv后克隆到P28z载体中。在由两种方法产生的受体之间没有观察到显著的功能差异。此外，创建各个iCAR的缺少任何靶向结构域但保持各个受体的跨膜和胞内部分的版本。通过切除P-28z的CD28/CD3ζ来设计对照Pdel受体(34)。iCAR应当与CAR清楚地区分开，所有CAR均引发T细胞激活，与iCAR大相径庭。PSMAscFv的核酸序列提供如下：

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcA[SEQIDNO：12]

PSMAscFv的氨基酸序列提供如下：

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAA[SEQIDNO：13]

受体例如PD-1、CTLA-4、2B4、LAG-3和BTLA-4也用CD19靶标scFv加以测试。CD19scFv的核酸序列提供如下：

ATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTCAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAAGACCATTAGTTCGGTAGTAGATTTCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGTGGATCAGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACCACTGATTTACTCGGCAACCTACCGGAACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACTAACGTGCAGTCTAAAGACTTGGCAGACTATTTCTGTCAACAATATAACAGGTATCCGTACACGTCCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGGgcggccgcA[SEQIDNO：14]

CD19scFV的氨基酸序列提供如下：

MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAMALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAEKVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNTNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVDDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFYLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAA[SEQIDNO：15]

由于iCAR的分子性质，PSMA靶标scFv和CD19靶标scFV可以交换，只要意识到合适的结构考虑即可。

结合检定、WesternBlot和GAM染色

各个iCAR的细胞表面表达使用之前所述的山羊抗小鼠染色操作指南(Markley等人,Blood,2010.115(17):3508-19)来分析。细胞结合检定如之前所述进行(BurshtynandDavidson,Naturalkillercellconjugateassayusingtwo-colorflowcytometry.Methodsinmolecularbiology,2010.612:89-96)。简单而言，将EL4或EL4-PSMA细胞用亲脂性DiD染料(Invitrogen)标记并在FACS管中与T细胞以1:1比率混合，在37℃孵育5分钟，并在流式细胞仪中分析。使用标准操作指南用BioradMini-PROTEANTetra系统进行Westernblot分析。CTLA-4的胞内尾区使用识别CTLA-4末端的多克隆抗体C-19(SantaCruzBiotechnology)来检测。

逆转录病毒载体和病毒产生

使用标准分子生物学技术来制备编码SFG致癌逆转录病毒载体的质粒。19-28z-IRES-LNGFR、CD19、PSMA、GFP、mCherry和磕头虫荧光素酶(CBL)载体的合成已经有过记载(Markley等人,Blood,2010.115(17):3508-19；Stephan等人,Naturemedicine,2007.13(12):1440-9；Brentjens等人,Clin.CancerRes.,2007.13(18:1):5426-35)。从质粒转染的H29细胞上清液制备逆转录病毒产生体(Stephan等人,Naturemedicine,2007.13(12):1440-9)。

细胞系

EL4-CD19、EL4-PSMA、以及人造抗原提呈细胞(AAPC)NIH3T3-CD19和NIH3T3-PSMA已经有过记载(Gade(2005)；Stephan等人,Naturemedicine,2007.13(12):1440-9；Maher等人,NatureBiotechnology,2002.20(1):70-75；Markley等人,Blood,2010.115(17):3508-19；Brentjens等人,Clin.CancerRes.,2007.13(18:1):5426-35)。NIH3T3-CD19-PSMA、NIH3T3-CD19-mCherry、NIH3T3-CD19-GFP和NIH3T3-CD19-CBL以及NALM/6-CBL和NALM/6-PSMA-CBL在用H29产生细胞的各个逆转录病毒上清液转导后获得。细胞系的所有比较组均使用MoFlo分选器针对CD19、GFP、或mCherry的等值表达而进行分选。

外周血白细胞(PBL)收集和逆转录病毒转导

在知情同意后在由纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC)机构审查委员会批准的操作指南下从健康供体获得外周血。PBL用Ficoll-Paque分离并用植物凝集素(PHA)活化48小时。将活化的T细胞连续三天通过在Retronectin涂覆的(Takara)逆转录病毒载体结合的板上离心而进行转导。每3天向细胞提供补充有20UIL-2的RPMI培养基。转导后10天，将基于增强的GFP(标记iCAR)和LNGFR(标记19-28z)的FACS选择用于在MoFlo分选器上分离阳性细胞。执行分选后分析来确保两种受体的等值表达。

iPS来源的成纤维细胞的生成

将外周血淋巴细胞用PHA激活，用逆转录病毒上清液(f-citrine-P2A-Myc-E2A-Sox2和f-vexGFP-P2A-Okt4-T2A-Klf4)转导，并在24小时后在MEF饲养细胞(Themeli(2013))上铺板。在转导后第5天，将培养基变为具有成纤维细胞生长因子(FGF)(8ng/ml)的人ES培养基，并且在之后每天换掉一半培养基。T-iPS菌落在转导后约22～25天出现。使用T-iPS-1.10细胞系进行皮下异种移植畸胎瘤检定。在第三个月，移除畸胎瘤并用100U/ml胶原酶(Invitrogen)和2U/ml分散酶(Invitrogen)在37℃处理两个小时，以产生单细胞悬浮液。对细胞分选HLA-ABC-阳性细胞，在补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清(FBS)的RPMI中培养1周后，它们自发可再生产地生成iPS-fib。

流式细胞术

所有流式细胞术分析在LSRII细胞计(BDBiosciences)上进行并在FlowJo软件9.6版本(TreeStar)上分析。抗-人LNGFR、CD45、CD140b、CD10、HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86和CD62L抗体得自BDBiosciences；抗-人CD4、CD8、CD3、CD19、CD90抗体、以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)得自Invitrogen；且抗-人PSMA抗体得自Medical&BiologicalLaboratories；且抗-人CCR7抗体得自R&D；抗-人Foxp3(236A/E7)和Foxp3同工型的抗体得自eBioscience。

体外T细胞检定

总体上对于增殖、效应性细胞因子生成检定以及细胞毒性检定，将分选纯化的T细胞的系列稀释液接种到96孔平底板(仅有板的外侧壁含有培养基以使蒸发作用最小化)中的各AAPC上(用40～50Gy照射，并以3x10⁴/孔在24小时前接种)。iPS-成纤维细胞在用作靶标时不进行照射。每3～4天或在培养基颜色改变时添加新鲜培养基。通过教科书上所说的酶联免疫吸附检定(ELISA)试剂盒(eBioscience)或Luminex检定(Invitrogen)按照制造商说明书来对细胞因子的产生进行定量。使用活细胞数量(DAPI)和CountBright珠(Invitrogen)在LSRII流式细胞仪(BD)上通过收集所有的孔来计算T细胞计数。所有体外培养实验均在补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素、1％链霉素和10％FBS的RPMI上完成。除非明确指出，在任何时候均不施用外源性细胞因子。

荧光素酶CTL检定

使用生物发光作为示值读数的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)检定如先前所述进行(Fu等人,PloSone,2010.5(7):e11867)。简单而言，所有体外荧光素酶检定均用Bright-Glo荧光素酶检定系统(Promega)和96孔光学黑底微孔板(Nunc)来进行，并且根据制造商的操作指南经微调而进行。所有靶标细胞均工程化成表达具有aGFP报告分子的CBL，以确保等值水平的表达。将每孔的培养基移除为50μl，并将50μl的所制备的荧光素酶试剂添加到96孔板的每个孔，并将板孵育5分钟来完全裂解细胞。用IVIS成像系统100系列(IVISImagingSystem100Series，Xenogen)进行测量。将实时图像软件版本2.6(Xenogen)用于对光子发射强度进行定量。

时间推移荧光显微术CTL

所有的显微成像均使用装配有实时成像系统的ZeissAxioVert200M进行。获取时间推移录像并使用MetaMorph软件中的多维获取(Multi-DimensionalAcquisition)进行编辑。对于CTL实验，来自mCherry阳性的AAPC的信号使用MetaMorph中的整合性形态测量分析功能(IntegratedMorphometricAnalysisfunction)进行数量测定。

moDCs和激发(priming)

使用Mo-DC产生工具箱(Mo-DCGenerationToolBox，Miltenyi)由同一供体生成单核细胞来源的树突细胞作为T-iPS细胞。moDC在未成熟阶段(第5～6天)用iPS-Fib的裂解液(其通过六个冻融循环产生)脉冲24小时。DC的成熟通过CD80、CD86和HLA-DR的流式细胞术证实。激发如先前所述进行(Yuan等人,Journalofimmunology,2005.174(2):758-66)。简单来说，第一轮的激发使用1:30T细胞/moDC比率进行，第二轮使用1:10～1:30比率进行。使用补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素、1％链霉素、10％人AB血清(CellGro)和5ng/ml人IL-15(R&DSystems)的RPMI。在第3天，添加20U/ml的IL-2。

ProteomePfofiler阵列

根据制造商的操作指南将T细胞以4:1的E/T比暴露于AAPC60分钟，洗涤，裂解，并孵育(100μg)在人磷酸-免疫受体阵列(R&DSystems)。所有图均使用化学发光在同一x线光片上检测，以使曝光水平标准化。所扫描的x线光片图像用图像分析软件分析。所有像素密度均在每一阵列上用内部pY对照标准化。

小鼠模型和定量的生物发光

对于NALM/6研究，对6～12周龄的雄性NOD/SCID/γ_c ^-小鼠(JacksonLaboratory)静脉接种5x10⁵肿瘤细胞(对单一肿瘤或混合肿瘤实验均为相同剂量)。将NALM/6细胞工程化成表达具有GFP受体的CBL。4天之后，静脉输注3x10⁵分选的T细胞；细胞剂量基于分选后分析所证实的GFP⁺19-28z⁺百分比。小鼠在第21天处死(没有T细胞对照显示出后腿麻痹)。对于iPS-fib研究，对6～12周龄雄性NOD/SCID/γ_c(敲除)小鼠腹膜内接种在冰冷RPMI和Matrigel混合物(BDBiosciences)的1:1混合物中制备的1x10⁶细胞。8天后，将5x10⁵两次moDC激发的GFP分选的T细胞进行腹膜内输注；细胞剂量基于分选后分析所证实的GFP⁺百分比。此外，进行体外荧光素酶CTL检定来在所有使用iPS-Fib作为靶标的组中建立等值的同种异体反应性。在两个模型中，将D-luciferin(Xenogen，150mg/kg，腹膜内)用作磕头虫荧光素酶的底物，并在IVIS100成像系统上采集生物发光图像。将实时图像软件2.6版本用于获取生物发光成像数据集并对其定量，如以前所述(Markley等人,Blood,2010.115(17):3508-19)。根据纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC)的机构准则来护理小鼠。

统计方法

如在教课书中所述，数据呈现为均值±均值的标准偏差/标准误差。结果通过教科书中所述的未配对的学生t检验(双尾)或通过ANOVA来分析结果，并将统计显著性限定为p<0.05。配对的多重比较使用多重t检验进行，其用Holm-Sidak法对多重比较进行校正。提供所有精确的P值。所有统计分析均在Prism软件6.0版本(GraphPad)中完成。

结果

1.iCAR在原代人T细胞的细胞表面上较好表达

不约束于特定的理论，假设对经由跨膜区与免疫抑制性受体(CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4或BTLA)的信号转导结构域融合的抗原特异的单链可变片段(scFv)或Fab在抗原识别时特异性地抑制T细胞功能。这些受体称为iCAR，因为它们具有免疫细胞抑制性潜能，与特定抗原结合并与CAR不同的嵌合受体，其中CAR是用于描述具有免疫细胞激活潜能的受体。

将对人前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异的scFv用作模型表面抗原(31)。该scFv已经被大量研究并正在前列腺癌免疫疗法的1期试验中进行研究(32)。PSMA在转移性前列腺癌中过表达，但是也在正常肾脏、肝脏、结肠和脑星形细胞中发现(33)。生成五种不同的对于PSMA特异的iCAR(称为iCAR-P)，其分别具有CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4和BTLA胞内结构域。生成对照受体Pdel，其具有仅靶向scFv和跨膜结构域但是缺少胞质结构域(图1B)。将各个iCAR克隆到具有IRES-GFP受体模块的双顺反子逆转录病毒载体中(图1B)。在将来自外周血单核细胞的人原代T细胞进行转导时，CTLA4-iCAR在细胞表面较好表达，且PD-1-iCAR-P和Pdel以与P28z受体(一种基于CD28/CD3ζ双信号转导的PSMA特异性受体，其当前用在临床试验中(图1C和1D))相似的水平在细胞表面表达(34)。将磷酸-阵列用于研究PD1-iCAR在受体结合时是否转导信号。磷酸化状态在暴露于3t3-Dvs.3T3-S靶标时使用RnD人磷酸-免疫受体阵列进行分析。将1928z-P-PD1细胞与3T3WT、3T3-S或3T3-D细胞孵育。使受体结合进行两小时，并在之后分析细胞裂解液的磷酸化状态。暴露于3T3-D的细胞在SHP-1、SHP-2以及2B4(均为PD1信号转导的下游靶标，重要的是，在暴露于3t3-S的情况中，三者均显示出信号强度的降低)磷酸化方面具有显著增加(图18)。在CTLA4-iCAR的情况中，通过WesternBlot和胞内流式细胞术观察到稳健的胞内表达，但是受限的细胞表面表达(图1C、1D和9A～C)。表面表达使用Y165G突变CTLA4-尾区(对于细胞表面运输的关键残基)来构建mutCTLA4-iCAR而得以恢复(图1C、1D和9A～C)。该发现与CTLA-4的生理运输一致，其在静息(resting)细胞中构成性地内在化并经由其酪氨酸基序YVKM通过与内吞衔接(adaptor)复合物AP-2的相互作用而降低(35)。确实，在T细胞活化后发现CTLA-4-iCAR-P对细胞表面的上调(图9C)，并且使用酪氨酸基序Y165G突变体来构建mutCTLA-4-iCAR-P来恢复构成性表面表达，其在静息细胞中表现出细胞表面表达(图1C)。PSMA经iCAR的识别，使用细胞结合检定来证实，在细胞结合检定中表达iCAR的T细胞与表达PSMA的小鼠胸腺瘤EL4细胞结合(图10A)。

2.iCAR以抗原限制的方式限制TCR应答

除在自体靶向的T细胞中的使用外，iCAR对于在移植后供体淋巴细胞输注中GVHD的预防具有潜在的功用。因此，iCAR的效能在同种异体反应性(引起移植物排斥、GVHD和治疗性移植物抗肿瘤(GVT)应答的强大免疫应答)背景下保护非转化的替代性正常组织的过程中进行评估。此外，为研究iCAR对内源性TCR驱动的原代人T细胞应答的作用，建立使用同种异体树突细胞(DC)作为激发性抗原提呈细胞并使用与DC同基因的成纤维细胞作为靶标的同种异体模型(图11A)(图11A)。在该模型中，将iCAR或Pdel-工程化的T细胞用单核细胞来源的树突细胞(moDC)(其为内源性T细胞受体(TCR)的特别强效的刺激物)激发，并然后针对表达或不表达PSMA抗原的成纤维细胞进行评估。为获得与DC同基因的可补给成纤维细胞而无需迭代皮肤活检切片，建立诱导的多能性干细胞(iPSC)；稳定的成纤维细胞系，称为iPS-fib得自iPSC(图11B～D)。iPS-fib显示出复制性衰老和接触抑制，并且可以简单地转导、传代(passaged)并植入NOD/重症联合免疫缺陷(SCID)γ_c ^-小鼠中，其中它们坚持数周而没有形成肿瘤。为获取具有针对iPS-fib的内源性TCR特异性的有效同种异体反应性T细胞，将具有来自同基因iPS-fib的裂解液的moDC进行脉冲。该激发性培养体系刺激来自一些T细胞供体的强烈细胞毒性和细胞因子分泌，产生CD4-和CD8-驱动的应答(图12A～C)。

为研究iCAR限制针对PSMA⁺细胞的同种异体反应性的能力，对用两轮脉冲moDC激发的表达iCAR或Pdel的T细胞加以分选并与iPS-fib或表达PSMA的iPS-fib共孵育(图13A)(36)。所有组的T细胞高效地杀死iPS-fib，表明同种异体细胞毒性(图2A和2B)，但是iCAR-阳性T细胞的杀死iPS-fib-PSMA⁺细胞的能力受到显著抑制(图2C)。表达基于PD-1的iCAR的T细胞造成的细胞毒性在低效应物-靶标(E/T)比率下减少高达95％。因为细胞毒性快速发生且相对于其他T细胞应答具有低激活阈值，也分析细胞因子的分泌。PD-1iCAR产生更强的对细胞因子分泌的抑制(79～88％降低)，而mutCTLA-4iCAR引起55～71％降低(图2D～F)。这些结果表明，iCAR能够以抗原依赖的方式限制反应性。

3.iCAR以化学计量方式起作用

对PD-1iCAR-P是否取决于其表达水平或靶标抗原的表达水平而提供不同水平的抑制进行研究。激发的T细胞针对高或低水平的PD-1iCAR-P或Pdel表达进行分选并暴露于iPS-fib-PSMA(图14A)。发现T细胞杀伤、细胞因子释放与iCAR表达水平之间的化学计量关系。对于低水平的PD-1iCAR-P表达水平而分选的T细胞在高达1:1的E/T比时仅提供50％抑制，但是高水平的PD-1iCAR-P表达在高达8:1的E/T比时允许80％抑制，甚至在16:1下50％抑制(图3A和3B)。为检验iCAR抗原表达水平的影响，分选对于高或低PSMA表达的iPS-fib，并将其暴露于分选的PD-1iCAR-PT细胞(图14B)。具有高PSMA表达的iPS-fib跨E/T比范围(1:1～4:1)抑制至少80％的PD-1iCAR-PT细胞的杀伤和细胞因子分泌，而具有低PSMA表达的iPS-fib无法提供相同水平的抑制(图3C和3D)。

4.iCAR在体内抑制同种异体应答

为研究iCAR是否在体内保护组织免受T细胞介导的消除，将iPS-fib-PSMA⁺细胞(其还表达CBL)经腹膜内注入NOD/SCID/γc^-小鼠(图14B)。细胞细胞建立节瘤(nodules)，其可以通过生物发光成像(BLI)而监测。在注入1×10⁶iPS-fib-PSMA⁺细胞五天后，对小鼠用5×10⁵moDC-激发的表达Pdel-或PD-1–iCAR-P的T细胞进行处理。Pdel组消除iPS-fib-PSMA⁺细胞，在BLI信号方面有显著降低(7～22倍)，而PD-1-iCAR-P组不能清除节瘤，BLI与未经T细胞处理的对照小鼠相似(图4A和4B)。这些结果提供以下证据，即iCAR可以在体内以抗原特异性的方式限制TCR驱动的应答。

5.iCAR可以抑制激活性嵌合抗原受体

为研究iCAR对调节激活性CAR的作用，使用当前用在临床试验中的广泛表征的二代CAR19-28z；19-28z响应于CD19抗原而提供激活和CD28共刺激(9、34)。将原代T细胞用19-28zCAR和iCAR-P受体进行转导，对于双表达进行分选，并分别接种在先前报道的表达CD19或CD19与PSMA两者的人造抗原提呈细胞(AAPC)，从而对靶标组织和靶外组织进行建模(图13B和15A)。19-28z嵌合抗原受体(CAR)，一种当前用在临床试验中的广泛表征的二代CAR，被用于响应于CD19抗原而提供激活和共刺激信号(Brentjens等人,Blood,2011.118(18):4817-28；Maher等人,NatureBiotechnology,2002.20(1):70-75)。尽管来自对照组的T细胞(单独19-28z或19-28z/Pdel)对两种AAPC均显示出相似的细胞因子分泌，但表达iCAR的T细胞在暴露于靶外细胞时相对于靶标细胞显示出显著降低的细胞因子分泌(图5A和15B)。PD-1iCAR-P产生最强的细胞因子水平降低(71～89％)，而mutCTLA-4iCAR-P引起较少的降低(48～67％)，且LAG-3-、BTLA-、和2B4iCAR-P引起30％抑制。

19-28z提供强大的增殖信号，由表达CD19的AAPC诱导。尽管19-28z/PdelT细胞在各AAPC上相似地扩张，表达mutCTLA-4或PD-1iCAR的T细胞在靶外AAPC的存在下显示出减少的累积，PD-1iCAR-P在第二次AAPC刺激后在T细胞积聚中造成累积的90％降低(图5B、5C和15C)。由于已表明iCAR阻断T细胞细胞因子分泌和增殖的能力，对iCAR评测其对细胞毒性的作用，其快速发生并具有比其他T细胞功能更低的激活阈值。在该共培养体系中，定量显微镜检测这些AAPC的命运，其被修饰成额外地表达mCherry(图5D)。在38小时内，所有组的19-28z/iCAR-P和对照双阳性T细胞均使靶标细胞裂解(图5E)。当暴露于CD19⁺PSMA⁺靶外细胞时，基于mutCTLA-4和PD-1的iCAR在细胞毒性方面分别造成67％和91％的降低(图5F)。在PD-1的情况下，AAPC坚持5天，而mutCTLA-4iCAR的效果更加受限(图5D)。因此，选择基于PD-1的iCAR用于进一步的体内评估。

为在体内评估PD-1iCAR的功能，评估具有PSMA的NALM/6(CD19⁺B细胞白血病细胞系)，且治疗性T细胞应答在之前建立的异种移植NOD/SCID/γ_c ^-小鼠模型中针对NALM/6和NALM/6-PSMA细胞进行比较(Markley等人,Blood,2010.115(17):3508-19；Brentjens等人,Clin.CancerRes.,2007.13(18:1):5426-35)(图15D)。在全身性肿瘤输注五天后，将小鼠用单剂量的3×10⁵19-28z/PD-1–iCARP–分选的双阳性T细胞处理。肿瘤负荷的生物发光成像(BLI)在NALM/6-PSMA(靶外)的根除方面显示出显著差异(3～10倍减少)，与NALM-6(靶标)相反(图6A和6B)。尽管初始地限制于骨髓，NALM/6白血病最终入侵脾脏，其重量提供疾病负荷的晚期指标。在用19-28z/PD-1-iCAR-PT细胞处理后，NALM/6-PSMA小鼠在脾脏重量上与对照“无T细胞”组没有显示出显著差异，但是具有NALM/6的小鼠的脾脏重量低2.6倍(图6C)。流式细胞术分析证实了脾脏和骨髓中NALM/6细胞的减少数量，与NALM/6-PSMA组相比(图6D和6E)。平行地，在NALM/6组中发现比NALM/6-PSMA组更强的T细胞持续性(图6D和6F)。这些发现确定，基于PD-1的iCAR在体内选择性地防止“靶外”NALM/6-PSMA细胞的消除，而同时使得针对“靶标”NALM/6细胞的治疗性应答继续。

6.iCAR以暂时且可逆的方式起作用

iCAR临床用处的吸引人的方面是功能可逆性，即T细胞功能性在之前接触抑制性靶外组织后再度出现。通过iCAR的有效PSMA识别通过表达iCAR的T细胞与表达PSMA的EL4细胞而非野生型EL4细胞的结合形成来证实(图16FA)。与对照T细胞相比，iCAR的构成性表达并不破坏T细胞的增殖能力(CD-3/CD28珠或DC活化后)、细胞因子分泌或表面标记物表达(图16A～E和16G～I)。为评估iCAR介导的抑制的时序特征，建立通过靶标和靶外细胞的按序T细胞刺激来分析在4中不同顺序中的杀死潜能、细胞因子分泌和增殖。将19-28z/Pdel或19-28z/PD-1–iCAR-PT细胞暴露于靶标(CD19⁺)或靶外(CD19⁺PSMA⁺)AAPC作为第一刺激，之后在第二刺激中暴露于各AAPC(图7A)。在第二刺激中，两个T细胞组均相当地杀死靶标细胞，不管第一刺激靶标如何(图7B)，从而支持以下观点，即与在两次刺激中均暴露于靶标细胞的T细胞相同，在第一刺激中暴露于靶外细胞的19-28z/iCAR-PT细胞在第二刺激过程中也杀死靶标细胞并增殖。表达19-28z/Pdel的对照T细胞在相同条件下没有显示出降低的功能性。此外，在第一刺激中活化的T细胞仍能在第二刺激时因暴露于由靶外AAPC提呈的iCAR配体而被抑制，表明iCAR可以调节活化的T细胞。也观察到，在两次刺激中暴露于靶外细胞的T细胞在第二次暴露中具有更大的杀死能力抑制(图7C和7D)。

为证实这些功能性发现，我们发现，PD-1iCAR、19-28z/Pdel、和19-28z/PD-1–iCAR-PT细胞可区分地使调节性SHP-1和SHP-2磷酸酶磷酸化(图17A～C)。暴露于CD19⁺靶标AAPC显示出与在暴露于缺少CD19的AAPC后看到的基础水平相比更低的SHP-1和SHP-2磷酸化水平，与之前表明在T细胞激活时去磷酸化和随之发生的SHP-1/2抑制性作用的阻断的研究相一致(39、40)。相反，在暴露于表达CD19和PSMA的靶外AAPC后，SHP-1和SHP-2显示出增加水平的磷酸化，从而支持以下观点，即PD-1iCAR采用与内源性PD-1分子相同的生化通路。

7.iCAR和CAR双表达T细胞在体外和体内辨明靶标

评测表达基于PD-1的iCAR的T细胞是否可以在体外以及特别在体内在同一有机体内在靶标细胞的存在下通过保护靶外细胞而区分靶标细胞。该方案首次在1:1比率混合GFP⁺CD19⁺靶标AAPC和mCherry⁺CD19⁺PSMA⁺靶外AAPC的体外共培养体系中处理。进行时间推移显微镜检来分析19-28z/Pdel或19-28z/iCAR-PT细胞的作用。靶标和靶外细胞均通过19-28z/PdelT细胞以相似速率消除，但19-28z/iCAR-PT细胞优先消除靶标细胞而不伤害靶外细胞(图8A)。将使用磕头虫荧光素酶(CBL)转导的AAPC版本进行的交叉实验用于对选择性定量。在38小时时，19-28z/iCAR-PT细胞消除大多数(85％)的靶标AAPC而几乎不消除(10％)靶外细胞，证实时间推移显微镜检的结果(图8B)。

为分析在体内是否获得相同的选择性，用NALM/6和NALM/6-PSMA肿瘤细胞的混合物注射NOD/SCID/γ_c ^-小鼠，并用19-28z–或19-28z/iCAR-P–转导的T细胞处理这些动物。在处死时，与用19-28z/iCAR-PT细胞处理的小鼠相比，用19-28zT细胞处理的小鼠显示出脾脏和骨髓中PSMA+细胞数量的三倍减少(图8C和8D)。因而，iCAR处理的组在脾脏重量方面有3.3倍增加并具有总体上增加的肿瘤负荷(图8E)。这些实验表明，在靶标和靶外细胞的混合物的存在下，iCAR在体内还是体外均可以选择性地保护靶外细胞而不消除对靶标细胞的抑制。

讨论

在该实施例中，采用遗传方法来限制T细胞的特异性，且表明，T细胞可以工程化为具有内源性调节性靶向机制以递送肿瘤特异性的免疫治疗。抗原识别结构域成功地与免疫抑制性受体CTLA-4和PD-1的信号转导结构域结合来达到T细胞细胞毒性、细胞因子释放和增殖的抗原特异性抑制。该概念验证研究证实了iCAR作为在靶外位点限制T细胞功能并因而从非意向靶标组织转移免疫应答的策略的潜能。

iCAR策略的核心在于三个关键特性。第一个是iCAR的基础表达在缺少抗原的情况下并不抑制T细胞功能。内源性CTLA-4或PD-1信号转导需要各个配体的存在来发挥其作用。相似地，未发现本文所述的iCAR的表达会影响基础T细胞功能。限制于T细胞亚群的其他抑制性受体可以一致作用于微调T细胞应答(21、22)。受体例如LAG-3、2B4和BTLA及其组合(例如，具有多个结合的胞质结构域的单个二代iCAR)成为进一步研究的依据。

第二个关键特性在于，尽管之前与iCAR结合，仍保持T细胞功能性。已经发现，iCAR转导的T细胞在先前暴露于抑制性抗原之后仍可以发动对靶标抗原的应答。该可逆性类似自然杀伤细胞的行为，其中信号转导分子的磷酸化状态而非转录变化控制快速的功能应答，例如细胞毒性(41)。抗-PD-1和抗-CTLA-4抗体能够反转无效能或衰竭的T细胞的受损功能，再次要求暂时性地调节T细胞应答的能力(22)。此外，生化分析PD-1和CTLA-4对TCR复合物的作用取决于磷酸化状态、下游激酶和运动性而非细胞凋亡(40、42～44)。尽管体外和体内结果均表明，响应于靶外细胞的抑制具有持续的治疗功能性，但仍存在一些细胞可能随时间推移而无效能的可能性(42)。从根本上讲，T细胞输注是随机的，一些T细胞快速地遇到其靶标并将其消除，而其他T细胞首先遇到抑制性细胞。可以想象的是，反复地遇到靶外细胞的T细胞不会扩张(iCAR策略的令人满意的结果)，其目标是使得治疗性应答继续进行而减少对正常组织的免疫攻击。输注的T细胞群的总体扩张将对这些发生在克隆水平的不同路径进行整合，一些T细胞经历扩张而其他被抑制，可能引起所有输注的T细胞随时间推移的消失。在实验条件下，足够的T细胞持续多于3周来消除靶向的肿瘤。在这一情况下，如果需要的话，可以输注第二次或第三次T细胞输注，其在临床上可能是有利的，如别处所讨论的(9)。作为保护靶外组织并同时使得肿瘤消除得以继续进行的方法，无效能化和克隆消除的最终诱发应当与自杀基因策略进行比较，在自杀基因策略中，不利的反应性本身必须在引发T细胞消除前清楚显现，其也引起治疗应答的终止。

iCAR介导的免疫应答可用于控制在用于治疗癌症和慢性感染的供体淋巴细胞输注后的移植物抗宿主病(具体地使得发挥DLI的有益特性，具有有限的毒性)。此外，iCAR可用于控制用于治疗癌症和慢性感染的工程化过继性T细胞的靶标非组织毒性。这提升使有前途的治疗再生效的可能性，这些有前途的治疗具有不可接受的毒性分布例如在过继性T细胞疗法后非意向的心脏或肺识别。因此，iCAR提供新的在自体和同种异体环境下建立安全有效的T细胞疗法的策略。

第三，iCAR方法是抗原特异性的，并且因此需要识别肿瘤上不存在的或下调的但由靶外组织表达的组织特异性靶标抗原的能力。这个问题还没有作为肿瘤抗原的搜索而广泛研究，尽管正在做出努力例如蛋白图谱数据库来表征所有人类组织的“表面基因组(surfaceome)”(45)。一个策略是使用较广类别的在肿瘤细胞中下调的表面抗原。一个实例以人类白细胞抗原(HLA)分子为代表，其基本在所有细胞类型中找到，但是在肿瘤中下调作为肿瘤逃离T细胞免疫应答的机制(46)。因此，表达针对在肿瘤上下调的宿主HLA分子的iCAR的同种异体T细胞可以选择性地促进GVT效果。iCAR方法在DLI环境下作为保护GVHD靶标组织而不破坏GVT应答的方式特别让人感兴趣。另一类偏好相似策略的抗原包括细胞表面肿瘤抑制抗原例如OPCML、HYAL2、DCC和SMAR1(47～49)。例如，OPCML-v1广泛地在所有正常成人和胎儿组织中表达但在淋巴瘤和乳腺癌和前列腺癌中下调。已经发现细胞表面碳水化合物、脂类、和翻译后修饰，例如粘蛋白型O-聚糖(核心3O-多糖)因肿瘤而下调(50)。另一个候选靶标是上皮细胞钙粘蛋白，其在作为GVHD的主要靶标的正常皮肤、肝脏和肠道中高度表达(51)但是因经历上皮间质转化(表明肿瘤进展和转移)的肿瘤细胞而下调(52)。

该研究的主要限制是缺少稳健的临床相关的人“正常组织”模型的可得性，特别是允许利用人细胞、人抗原和人TCR、CAR和iCAR的模型。已尝试通过使用人T细胞、人靶标抗原和人iCAR来构建与来自同一供体的DC结合的iPS细胞以得到同种异体反应，从而填补这个空白。简单说来，共孵育HLA错配的同种异体T细胞与iPS或iPS-fib细胞并不产生同种异体反应性。同基因DC的使用对于产生有效的同种异体反应性很关键。这种同种异体反应性的特性没有被限定，因此可能的是，阻断的应答对GVHD涉及的机制无关。

已经示出，iCAR的表达水平较为关键。在高表达水平的激活性受体或抗原和/或低表达的iCAR或iCAR靶向的抗原的环境下，可能无法达到充分的阻断。在大多数分析中，iCAR诱导T细胞功能但是不对其消除，在任何检定中罕见地超过90％的抑制。在临床环境中应用iCAR策略时，每个iCAR的功能性将需要在受体亲和性、受体表达水平(即，启动子强度)和部分基于其表达水平的合适靶标抗原的选择的基础上进行优化。这些也将需要针对激活性受体进行平衡以在靶外位点实现抑制。在CAR靶向疗法的情况中，优化的CAR/iCAR比将通过仔细的载体设计而实现。

总而言之，提供一种概念验证，即抗原特异性抑制受体可以在结合特异细胞表面抗原时成功地对T细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒性进行重定向，从而从一个组织上转移掉T细胞毒性并同时保持针对表达同一抗原的另一组织的关键效应功能。这在由TCR或CAR介导的应答中显示出。该方法防止，或至少减少，对非意向靶标组织的损伤，从而不需要在发生不可接受的毒性之后不可逆地消除治疗性T细胞。这是颠覆传统的方法，其通过使用引导并培养T细胞以仅执行有益功能的合成受体，利用作为药物的细胞的多方面的功能性。该动态安全性开关可以在大量自体和同种异体T细胞疗法中找到有用的应用。

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本发明的实施方式

根据前述说明，显而易见的是，可以对本文所述的发明做出变化和修改以使其适合于各种用途和条件。这些实施方式也在权利要求的范围以内。

在本文变量的任意定义中对元素名录的列举包括该变量作为任何单一元素或所列元素的组合(或亚组合)的定义。本文中对实施方式的列举包括实施方式作为任何单一实施方式或者与任何其他实施方式或其部分组合。

本申请的一些主题可能涉及到美国专利申请第12/593,751号，其是2010年3月8日提交的国际专利申请PCT/US2008/004251根据35U.S.C.§371的美国国家阶段申请，其要求2007年3月30日提交的美国临时申请系列第60/921,144号优先权，其公开内容通过引用的方式全部并入本文。

在此通过引用的方式将本说明书中提及的所有专利和公开物并入，其程度如同具体且各自单独地表明将各个独立的专利和公开物经引用而并入。

附录A

“P-PD1tm-PD1”的核酸序列。“P-PD1tm-PD1”是包含PD-1跨膜结构 域、PD-1胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcAgagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtggttggtgtcgtgggcggcctgctgggcagcctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatctgctcccgggccgcacgagggacaataggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggacccctcagccgtgcctgtgttctctgtggactatggggagctggatttccagtggcgagagaagaccccggagccccccgtgccctgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtctttcctagcggaatgggcacctcatcccccgcccgcaggggctcagccgacggccctcggagtgcccagccactgaggcctgaggatggacactgctcttggcccctctga[SEQIDNO：16]

“P-PD1tm-PD1”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAAERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLWGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL[SEQIDNO：17]

“P-CTLA-4tm-CTLA-4wt”的核酸序列。“P-CTLA-4tm-CTLA-4wt”是 包含CTLA-4跨膜结构域、野生型CTLA-4胞质结构域和PSMAsvFV 的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCCCCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGA[SEQIDNO：18]

“P-CTLA-4tm-CTLA-4wt”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAALGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN[SEQIDNO：19]

“P-CTLA-4tm-CTLA-4mut”的核酸序列“P-CTLA-4tm-CTLA-4mut” 是包含突变CTLA-4跨膜结构域(Y165G突变体)、CTLA-1胞质结构 域和PSMA靶标svFV的iCAR。还制备出CTLA-4的另两个突变体版本：Y182G突变体和Y165G&Y182G突变体。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCGGTGTGAAAATGCCCCCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGA[SEQIDNO：20]

“P-CTLA-4tm-CTLA-4mut”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAALGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN[SEQIDNO：21]

“P-LAG3tm-LAG3”的核酸序列。“P-LAG3tm-LAG3”是包含LAG3 跨膜结构域、LAG3胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACTTGGAGCAGCAGTGTACTTCACAGAGCTGTCTAGCCCAGGTGCCCAACGCTCTGGGAGAGCCCCAGGTGCCCTCCCAGCAGGCCACCTCCTGCTGTTTCTCATCCTTGGTGTCCTTTCTCTGCTCCTTTTGGTGACTGGAGCCTTTGGCTTTCACCTTTGGAGAAGACAGTGGCGACCAAGACGATTTTCTGCCTTAGAGCAAGGGATTCACCCTCCGCAGGCTCAGAGCAAGATAGAGGAGCTGGAGCAAGAACCGGAGCCGGAGCCGGAGCCGGAACCGGAGCCCGAGCCCGAGCCCGAGCCGGAGCAGCTCTGA[SEQIDNO：22]

“P-LAG3tm-LAG3”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAALGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL[SEQIDNO：23]

“P-BTLAtm-BTLA”的核酸序列。“P-BTLAtm-BTLA”是包含BTLA 跨膜结构域、BTLA胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcAGATGTAAAAAGTGCCTCAGAACGACCCTCCAAGGACGAAATGGCAAGCAGACCCTGGCTCCTGTATAGTTTACTTCCTTTGGGGGGATTGCCTCTACTCATCACTACCTGTTTCTGCCTGTTCTGCTGCCTGAGAAGGCACCAAGGAAAGCAAAATGAACTCTCTGACACAGCAGGAAGGGAAATTAACCTGGTTGATGCTCACCTTAAGAGTGAGCAAACAGAAGCAAGCACCAGGCAAAATTCCCAAGTACTGCTATCAGAAACTGGAATTTATGATAATGACCCTGACCTTTGTTTCAGGATGCAGGAAGGGTCTGAAGTTTATTCTAATCCATGCCTGGAAGAAAACAAACCAGGCATTGTTTATGCTTCCCTGAACCATTCTGTCATTGGACCGAACTCAAGACTGGCAAGAAATGTAAAAGAAGCACCAACAGAATATGCATCCATATGTGTGAGGAGTTAA[SEQIDNO：24]

“P-BTLAtm-BTLA”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAADVKSASERPSKDEMASRPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS[SEQIDNO：25]

“P-2B4tm-2B4”的核酸序列。“P-2B4tm-2B4”是包含2B4跨膜结构 域、2B4胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACAGGACTGTCAGAATGCCCATCAGGAATTCAGATTTTGGCCGTTTTTGGTGATCATCGTGATTCTAAGCGCACTGTTCCTTGGCACCCTTGCCTGCTTCTGTGTGTGGAGGAGAAAGAGGAAGGAGAAGCAGTCAGAGACCAGTCCCAAGGAATTTTTGACAATTTACGAAGATGTCAAGGATCTGAAAACCAGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAGACTTTTCCTGGAGGGGGGAGCACCATCTACTCTATGATCCAGTCCCAGTCTTCTGCTCCCACGTCACAAGAACCTGCATATACATTATATTCATTAATTCAGCCTTCCAGGAAGTCTGGATCCAGGAAGAGGAACCACAGCCCTTCCTTCAATAGCACTATCTATGAAGTGATTGGAAAGAGTCAACCTAAAGCCCAGAACCCTGCTCGATTGAGCCGCAAAGAGCTGGAGAACTTTGATGTTTATTCCTAG[SEQIDNO：26]

“P-2B4tm-2B4”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAAQDCQNAHQEFRFWPFLVIIVILSALFLGTLACFCVWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS[SEQIDNO：27]

“全CTLA4尾区CD8铰链和tm”的核酸序列，其为包含CD8铰链和 跨膜结构域、CTLA-4胞内尾区和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccCtggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacagagcaccggcgGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCGGTGTGAAAATGCCCCCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGA[SEQIDNO：28]

“全CTLA4尾区CD8铰链和tm”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRAPAVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN[SEQIDNO：29]

-----------------------------------------------------

“P-CD8tm-PD1”的核酸序列。“P-CD8tm-PD1”是包含CD8跨膜结 构域、PD-1胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccCtggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacagaatgcattgctcccgggccgcacgagggacaataggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggacccctcagccgtgcctgtgttctctgtggactatggggagctggatttccagtggcgagagaagaccccggagccccccgtgccctgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtctttcctagcggaatgggcacctcatcccccgcccgcaggggctcagccgacggccctcggagtgcccagccactgaggcctgaggatggacactgctcttggcccctctga[SEQ1DNO：30]

“P-CD8tm-PD1”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRMHCSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL[SEQIDNO：31]

“P-CD8tm-CTLA4wt”的核酸序列。“P-CD8tm-CTLA4wt”是包含CD8 跨膜结构域、野生型CTLA-4胞质结构域和PSMAsvFV的iCAR。

atggCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAGAGGTGCAGCTGCAGcagtcaggacctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaagacttctggatacacattcactgaatataccatacactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaaacatcaatcctaacaatggtggtaccacctacaatcagaagttcgaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctaacatctgaggattctgcagtctattattgtgcagctggttggaactttgactactggggccaagggaccacGGTCACCgtctcctcaggtggaggTggAtcaggTggaggtggAtctggTggAggTggatcTGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATCTGTAAGGCCAGTCAAGATGTGGGTACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTATTGGGCATCCACTCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATTACTAATGTTCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCCCTCACGTTCGGTGCTGGGACCATGCTGGACCTGAAACGGgcggccgcACCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACCCCGGCGCCCACGATCGCGTCGCAGCCCctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccCtggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacagagcaccggcgATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCCCCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGA[SEQIDNO：32]

“P-CD8tm-CTLA4wt”的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAEVQLQQSGPELVKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRAPAMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN[SEQIDNO：33]

Claims (75)

1.一种分离的免疫应答细胞，包含：

1)抗原识别受体，其与第一抗原结合，其中所述结合激活所述免疫应答细胞；以及

2)抑制性嵌合抗原受体，其与第二抗原结合，其中所述结合抑制所述免疫应答细胞。

2.根据权利要求1所述的分离的免疫应答细胞，其中所述第一抗原是肿瘤或病原体抗原。

3.根据权利要求1所述的分离的免疫应答细胞，其中所述第二抗原是CD33、CD38、人白细胞抗原(HLA)、上皮间质转化(EMT)抗原、器官特异性抗原、血脑屏障特异性抗原、上皮细胞钙粘蛋白、细胞角蛋白、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子(OPCML)、HYLA2、结直肠癌缺失蛋白(DCC)、核基质结合区结合蛋白1(SMAR1)、细胞表面碳水化合物、或粘蛋白型O-聚糖。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抑制性嵌合抗原受体经重组表达。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抑制性嵌合抗原受体由载体表达。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体是外源性或内源性的。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体经重组表达。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体由载体表达。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞、先天免疫系统的细胞、和可以分化出淋巴样细胞的多能性干细胞。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞是自体的。

12.根据权利要求1～10中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞是非自体的。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述第一抗原是选自CD19、CAIX、CEA、CDS、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-α2、κ-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、Muc-1、Muc-16、NKG2D配体、NY-ESO-1、瘤胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2和WT-1的肿瘤抗原。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的胞内信号转导结构域。

15.根据权利要求14所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的跨膜结构域。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。

17.根据权利要求1～16中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中所述细胞表达选自19-28z、P28z、M28z和56-28z的重组的或内源性的抗原受体。

18.一种减少受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包括施用有效量的免疫应答细胞，从而在受试者中诱导肿瘤细胞死亡，所述免疫应答细胞包含抗原识别受体和抑制性嵌合抗原受体，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中所述结合激活所述免疫应答细胞，所述抑制性嵌合抗原受体与第二抗原结合，其中所述结合抑制所述免疫应答细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中与非肿瘤细胞相比，所述方法选择性地靶向肿瘤细胞。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法减小肿瘤尺寸。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法根除受试者中的肿瘤。

23.一种增加患有瘤形成的受试者的存活率的方法，所述方法包括施用有效量的免疫应答细胞，从而在受试者中治疗或预防瘤形成，所述免疫应答细胞包含抗原识别受体和抑制性嵌合抗原受体，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中所述结合激活所述免疫应答细胞，所述抑制性嵌合抗原受体与第二抗原结合，其中所述结合抑制所述免疫应答细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述瘤形成选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓癌、成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、和肉瘤、急性髓细胞样白血病(AML)。

25.根据权利要求17～23中任一项所述的方法，其中所述第一抗原是肿瘤或病原体抗原。

26.根据权利要求18～25中任一项所述的方法，其中所述第二抗原是CD33、CD38、人白细胞抗原(HLA)、上皮间质转化(EMT)抗原、器官特异性抗原、血脑屏障特异性抗原、上皮细胞钙粘蛋白、细胞角蛋白、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子(OPCML)、HYLA2、结直肠癌缺失蛋白(DCC)、核基质结合区结合蛋白1(SMAR1)、细胞表面碳水化合物、或粘蛋白型O-聚糖。

27.根据权利要求18～25中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体经重组表达。

28.根据权利要求18～27中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体由载体表达。

29.根据权利要求18～28中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

30.根据权利要求18～29中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体是外源性或内源性的。

31.根据权利要求18～30中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体经重组表达。

32.根据权利要求18～31中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体由载体表达。

33.根据权利要求18～32中任一项所述的方法，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞、先天免疫系统的细胞、和可以分化出淋巴样细胞的多能性干细胞。

34.根据权利要求18～33中任一项所述的方法，其中所述免疫应答细胞是自体的。

35.根据权利要求18～33中任一项所述的方法，其中所述免疫应答细胞是非自体的。

36.根据权利要求18～35中任一项所述的方法，其中所述第一抗原是选自CD19、CAIX、CEA、CDS、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-α2、κ-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、Muc-1、Muc-16、NKG2D配体、NY-ESO-1、瘤胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2和WT-1的肿瘤抗原。

37.根据权利要求18～36中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的胞内信号转导结构域。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的跨膜结构域。

39.根据权利要求18～38中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。

40.根据权利要求18～39中任一项所述的方法，其中所述方法减少或根除受试者中的肿瘤负荷。

41.根据权利要求18～40中任一项所述的方法，其中所述方法减少受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)或其症状。

42.一种用于制备抗原特异性免疫应答细胞的方法，所述免疫应答细胞包含与第一抗原结合的抗原识别受体，所述方法包括向所述免疫应答细胞引入编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列，所述抑制性嵌合抗原受体与第二抗原结合，其中所述结合抑制所述免疫应答细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一抗原是是肿瘤或病原体抗原。

44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述第二抗原是CD33、CD38、人白细胞抗原(HLA)、上皮间质转化(EMT)抗原、器官特异性抗原、血脑屏障特异性抗原、上皮细胞钙粘蛋白、细胞角蛋白、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子(OPCML)、HYLA2、结直肠癌缺失蛋白(DCC)、核基质结合区结合蛋白1(SMAR1)、细胞表面碳水化合物、或粘蛋白型O-聚糖。

45.根据权利要求42～44中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体经重组表达。

46.根据权利要求42～45中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体由载体表达。

47.根据权利要求42～46中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

48.根据权利要求42～47中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体是外源性或内源性的。

49.根据权利要求42～48中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体经重组表达。

50.根据权利要求42～49中任一项所述的方法，其中所述抗原识别受体由载体表达。

51.根据权利要求42～50中任一项所述的方法，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞、先天免疫系统的细胞、和可以分化出淋巴样细胞的多能性干细胞。

52.根据权利要求42～51中任一项所述的方法，其中所述免疫应答细胞是自体的。

53.根据权利要求42～51中任一项所述的方法，其中所述免疫应答细胞是非自体的。

54.根据权利要求42～53中任一项所述的方法，其中所述第一抗原是选自CD19、CAIX、CEA、CD4、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞抗原、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-α2、κ-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、Muc-1、Muc-16、NKG2D配体、NY-ESO-1、瘤胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2和WT-1的肿瘤抗原。

55.根据权利要求42～54中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)包含选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的胞内信号转导结构域。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽的跨膜结构域。

57.根据权利要求42～56中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体(iCAR)还包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。

58.一种抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其包含：

(i)胞外结构域，其与抗原结合；

(ii)跨膜结构域，其与所述胞外结构域可操作地连接；以及

(iii)胞内结构域，其激活胞内信号转导以降低免疫应答，所述胞内结构域与所述跨膜结构域可操作地连接。

59.根据权利要求58所述的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其中所述胞内信号转导结构域选自CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽。

60.根据权利要求59所述的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其中所述跨膜结构域选自CD4多肽、CD8多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽和BTLA多肽。

61.根据权利要求58～60中任一项所述的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，还包含Fab、scFv、配体、特异性配体或多价配体。

62.根据权利要求58～61中任一项所述的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其中所述抗原与所述iCAR的结合激活用于降低免疫应答的所述胞内信号转导结构域。

63.一种编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列，所述抑制性嵌合抗原受体与抗原结合，其中所述结合激活用于降低免疫应答的胞内信号转导结构域。

64.一种包含编码抑制性嵌合抗原受体的核酸序列的载体，所述抑制性嵌合抗原受体与抗原结合，其中所述结合激活用于降低免疫应答的胞内信号转导结构域。

65.一种药物组合物，其在药学可接受的赋形剂中包含有效量的根据权利要求1～17中任一项所述的免疫应答细胞。

66.一种用于治疗瘤形成的药物组合物，其在药学可接受的赋形剂中包含有效量的根据权利要求1～17中任一项所述的肿瘤抗原特异性T细胞。

67.一种用于治疗瘤形成、病原体感染、自免疫病症或同种异体移植的试剂盒，所述试剂盒包含免疫应答细胞，所述免疫应答细胞包含与第一抗原结合并激活所述免疫应答细胞的抗原识别受体、以及与第二抗原结合并抑制所述免疫应答细胞的抑制性嵌合抗原受体。

68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含使用所述细胞来治疗患有瘤形成、病原体感染、自免疫疾病或同种异体移植的受试者的书面说明书。

69.一种调节受试者中的移植物抗白血病应答或移植物抗肿瘤应答的方法，所述方法包括施用有效量的对受试者同种异体的免疫应答细胞，从而调节受试者中的移植物抗白血病应答或移植物抗肿瘤应答，所述免疫应答细胞包含与抗原结合的抑制性嵌合抗原受体，其中所述结合抑制所述同种异体免疫应答细胞。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述同种异体细胞包含内源性T细胞受体。

71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述抗原是CD33、CD38、人白细胞抗原(HLA)、上皮间质转化(EMT)抗原、器官特异性抗原、血脑屏障特异性抗原、上皮细胞钙粘蛋白、细胞角蛋白、阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子(OPCML)、HYLA2、结直肠癌缺失蛋白(DCC)、核基质结合区结合蛋白1(SMAR1)、细胞表面碳水化合物、或粘蛋白型O-聚糖。

72.根据权利要求71所述的方法，其中受试者患有转移性乳腺癌、血液学恶性肿瘤或实体瘤，且所述人白细胞抗原(HLA)为HLA-I。

73.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者患有已经历上皮间质转化(EMT)的肿瘤，且所述抗原为上皮间质转化(EMT)抗原、上皮细胞钙粘蛋白和细胞角蛋白中的一种或多种。

74.根据权利要求69～73中任一项所述的方法，其中所述抑制性嵌合抗原受体与所述抗原的结合在包含所述抗原的细胞中减少细胞死亡。

75.根据权利要求69～74中任一项所述的方法，其中所述方法减少受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)或其症状。