CN109097402A - 一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法 - Google Patents

一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组载体CAR‑CD244‑antiCD19的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将特异性抗体编码基因使用末端带有BfuAI限制性内切酶识别位点的引物进行PCR扩增；所述特异性抗体编码基因序列为CD19抗体的部分序列，为序列表序列2；步骤2、将步骤1的PCR产物分别进行纯化；步骤3、将步骤2纯化的PCR产物在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切，并同时将含有改造的CD244骨架的克隆载体在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切；步骤4、将酶切后产物进行纯化；步骤5、将纯化后的产物按抗体片段与含有改造的CD244骨架的克隆载体摩尔比为3:1配比后，使用T4连接酶进行连接、转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序；将连接正确的质粒，命名为：重组载体CAR‑CD244‑antiCD19。

Description

一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法
本申请是分案申请，原申请的申请号为201710209997.5，申请日为2017年3月31日，发明名称为“一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用”。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体说是一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法。
背景技术
细胞生物治疗是运用自身免疫系统的新型癌症治疗方法，是一种具有显著疗效的治疗模式。它运用分子生物学技术和细胞工程学技术，用生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞在体外进行培养和扩增，再回输到病人体内，从而激发、增强机体自身的免疫功能，达到监视并杀灭病变细胞或修复受损细胞的目的。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)属于粒状淋巴细胞，是机体重要的免疫细胞。二般认为NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。与其他淋巴细胞相比，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，无需抗原预先致敏，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，而嗜天青颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关，故NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞等，因此NK细胞可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞。这意味着NK细胞在机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节中会起到重要的作用。
CD244是由CD244基因编码的人蛋白质，又称为NK细胞受体2B4，是一个NK细胞重要的表面受体。NK细胞通过CD244受体激活细胞毒性功能。
CAR意为嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)，当CAR结构与肿瘤相关抗原抗体融合表达在NK细胞的细胞膜表面时，能够赋予NK细胞特异性识别对应肿瘤细胞的能力，此时的NK细胞即为CAR-NK细胞。一个完整的CAR结构通常包括上膜信号区、抗体区(通常来源于对应单克隆抗体的scFV段)、胞外校链区、跨膜区、胞内信号区。通过基因修饰过的NK细胞(CAR-NK)能够对带有其针对的抗原的细胞产生特异性更强的细胞杀伤作用，从而能够达到对肿瘤等治疗的效果。
慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-l)来源的一种病毒载体，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果，是外源基因常用载体形式之一。其基本过程就是携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒载体在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肿瘤细胞、干细胞、心肌细胞等多种类型的细胞。使用慢病毒载体能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。
目前，尚未建立一种有效的CAR-NK细胞制备的方法及其在肿瘤免疫治疗方面的应用先例。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用。
本发明的目的和要解决的技术问题在于：改造人源CD244序列，使之能够在NK等细胞表面表达特异性蛋白，该特异性蛋白能够识别特定肿瘤细胞，同时能够激活NK细胞，使之具有对特定肿瘤细胞的杀伤功能。包含有改造的CD244序列的慢病毒载体能够包被慢病毒，慢病毒感染NK细胞后能够使NK细胞表达改造的CD244蛋白序列。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种CAR-NK细胞的制备方法，包括如下步骤：
Sl、将特异性抗体(如肿瘤细胞目标抗原的特异性抗体CD19抗体或PSMA抗体)编码基因(包含特异性抗体的轻链部分、重链与轻链的连接部分以及重链部分)连接到经改造的CAR骨架的克隆位点区中获得CAR基因，
所述经改造的CAR骨架包括依次连接的CD244上膜信号区、克隆位点区、CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区，
S2、将所述CAR基因通过慢病毒感染NK细胞，得到表达所述CAR蛋白(即所述CAR基因的表达蛋白，如实施例4中的CAR-CD244-antiCD19蛋白结构和CAR-CD244-antiPSMA蛋白结构)的NK细胞(如NK92MI细胞)，即所述CAR-NK细胞。
在上述CAR-NK细胞的制备方法中，所述CD244上膜信号区的DNA序列如序列表序列1中的第1位至第63位所示；
和/或，所述克隆位点区的DNA序列如序列表序列1中的第64位至第95位所示；
和/或，所述CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区的DNA序列如序列表序列1中的第96位至第560位所示。
在上述CAR-NK细胞的制备方法中，所述经改造的CAR骨架的DNA序列如序列表序列1所示。
在上述CAR-NK细胞的制备方法中，所述步骤S2按照包括如下步骤的方法进行:
S21、将所述CAR基因连入慢病毒载体的克隆位点上获得重组慢病毒载体A，将重组慢病毒载体A转染目的细胞(如293T细胞)进行培养，获得慢病毒；
S22、将慢病毒感染NK细胞，获得所述CAR-NK细胞。
在上述CAR-NK细胞的制备方法中，步骤S21中，所述慢病毒载体为Plenti慢病毒载体；
所述转染使用慢病毒包装质粒进行；
所述慢病毒包装质粒具体为psPAX2和PMD2.G，转染时，按照将所述慢病毒载体、psPAX2和PMD2.G以质量比比例为5ug:3.2ug:l.8ug--7.5ug:4.8ug:2.7ug转染3×I06个目的细胞；
步骤S22中，所述将慢病毒感染NK细胞包括将浓缩的慢病毒加入到完全培养基中，与NK细胞混匀的步骤。
在上述CAR-NK细胞的制备方法中，步骤S22中，所述将慢病毒感染NK细胞还包括加入聚凝胺的步骤；所述聚凝胺的加入终浓度为4ug/mL；
浓缩的慢病毒是将重组慢病毒载体A转染目的细胞进行培养后，将培养的上清液在20000g条件下离心1小时后，取慢病毒用DPBS缓冲液悬浮获得。
本发明还提供了一种DNA分子，是如下(1)或(2)中的任一种：
(1)包括依次连接的CD244上膜信号区、克隆位点区、CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区；
(2)是在(1)所述DNA分子的克隆位点区插入特异性抗体(如肿瘤细胞目标抗原的特异性抗体)编码基因后形成的DNA分子。
在上述DNA分子中，所述CD244上膜信号区的DNA序列如序列表序列1中的第1位至第63位所示；
和/或，所述克隆位点区的DNA序列如序列表序列1中的第64位至第95位所示；
和/或，所述CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区的DNA序列如序列表序列1中的第96位至第560位所示；
所述(1)的DNA分子的序列具体可为序列表序列1所示序列。
本发明保护含有所述DNA分子的重组载体(如重组表达载体、重组慢病毒载体)、重组细胞(如免疫细胞NK细胞或T细胞，或293T细胞)或重组细胞系。
本发明保护所述DNA分子、所述重组载体、重组细胞或重组细胞系、任一上述方法制备得到CAR-NK细胞在制备肿瘤治疗(如抑制肿瘤生长或杀伤肿瘤细胞)药物(如肿瘤免疫治疗细胞)、试剂或试剂盒中的应用。
所述制备肿瘤治疗药物、试剂或试剂盒中含有如下液体：含浓度为5×106个所述CAR-NK细胞/100ul生理盐水。
本发明具有如下有益效果：
本发明用于构建新型肿瘤免疫治疗细胞的细胞材料是自然杀伤细胞(NK细胞)，NK细胞免疫原性低，可以进行异体回输，相较于T细胞解决了细胞来源问题；
本发明所制备的肿瘤疫苗能够诱导有抗原特异性的靶细胞裂解；
本发明所述经改造的CAR骨架同样适用于其他免疫细胞；经本发明的制备方法所修饰的NK细胞能够对带有其针对的抗原的细胞如肿瘤细胞产生特异性更强的细胞杀伤作用，从而能够达到肿瘤等治疗的效果。
本发明所制备的肿瘤免疫治疗细胞除可应用于癌症患者本人外，也可以应用于异体回输。因此，本发明所制备的肿瘤免疫治疗细胞与现有的CAR-T相比，使用范围更广，制备成本更低。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为连接了特异性抗体编码基因的经改造的CD244骨架示意图。
图2为重组慢病毒载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19示意图。
图3为CD244-antiCD19和CD244-antiPSMA在NK92MI细胞中的表达图。
图4为流式细胞术检测NK细胞中CAR结构表达结果，其中，纵坐标为计数，横坐标为CD19-FITC(GRN-Hlog)的绿色荧光强度(对数值)。
图5为NK92MI-CD244-antiCD19对Daudi肿瘤细胞的杀伤实验。
图6为NK92MI-CD244-antiPSMA对PC3肿瘤细胞的杀伤实验。
图7为NK92MI-CD244-antiCD19孵育Daudi肿瘤细胞20h后，IFNγ干扰素水平检测。
图8为NK92MI-CD244-antiPSMA孵育PC3肿瘤细胞20h后，IFNγ干扰素水平检测。
图9为对小鼠进行活体荧光成像后的肿瘤生长情况结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1、重组载体CAR-CD244-antiCD19和重组载体CAR-CD244-antiPSMA制备
1.将特异性抗体编码基因使用末端带有BfuAI限制性内切酶识别位点的引物进行PCR扩增；
本实施例中使用的所述特异性抗体编码基因序列分别为CD19抗体(antiCD19)的部分序列(序列表序列2)和PSMA抗体(antiPSMA)的部分序列(序列表序列3)；
2.将步骤1的PCR产物分别进行纯化；
3.将步骤2纯化的PCR产物进行单酶切(BfuAI)，并同时将含有改造的CD244骨架的克隆载体进行单酶切(BfuA I)；
4.将酶切后产物进行纯化；
5.将纯化后的产物按抗体片段与含有改造的CD244骨架的克隆载体摩尔比为3:1配比后，使用T4连接酶进行连接、转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序；将连接正确的质粒(即在所述改造的CD244骨架的克隆位点区连入了antiCD19或antiPSMA)分别命名为：重组载体CAR-CD244-antiCD19和重组载体CAR-CD244-antiPSMA。
所述改造的CD244骨架序列如序列表序列1所示，其中，序列表序列1中的第1位至第63位所示序列为CD244上膜信号区的DNA序列；序列表序列1中的第64位至第95位所示序列为克隆位点区的DNA序列；序列表序列1中的第96位至第560位所示序列为CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区的DNA序列(胞外铰链区包含在跨膜部分区与胞内部分区)中；序列表序列1中的第561位至第575位所示序列为DDDDK-tag标记；序列表序列1中的第576位至第578位所示序列为终止密码子。
连接特异性抗体编码基因的改造的CD244骨架示意图如图1所示：图1中，CD244leader代表CD244上膜信号区，VL代表特异性抗体的轻链部分，GSlinker代表特异性抗体重链与轻链的连接部分，VH代表特异性抗体的重链部分，CD244代表CD244的胞外铰链区、跨膜部分区与胞内部分区，DDDDK代表DDDDK-tag标记。
实施例2、重组慢病毒载体的制备
1.分别用实施例1制备好的重组载体CAR-CD244-antiCD19和重组载体CAR-CD244-antiPSMA作为模板，使用带有BamHI与XbaI限制性内切酶酶切位点序列的引物PCR扩增；
2.对PCR产物分别进行纯化、酶切(BamHI与Xba I)、纯化；
3.使用T4连接酶分别将步骤2的产物分别连入Plenti慢病毒载体(名称为pLentiCMV/TO eGFP Puro(w159-1)，购自addgene，网址:http://www.addgene.org/17481/)的BamHI与XbaI位点间；
4.转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序，将测序正确的重组慢病毒载体分别命名为重组慢病毒载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19和Plenti-CAR-CD244-antiPSMA。
重组慢病毒载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19的示意图如图2所示，其中，CMV-promoter代表CMV启动子，CD244peptide为CD244上膜信号区，antiCD19为CD19抗体，CD244为CD244胞外铰链区、跨膜部分区与胞内部分区，DDDDK为DDDDK-tag标记，WPRE为功能类似于polyA的3'UTR的区域。
实施例3、慢病毒的制备和浓缩
1、慢病毒的制备
使用实施例2制备好的重组慢病毒载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19与psPAX2(购自addgene，网址为https://www.addgene.org/12260/)、pMD2.G(购自addgene，网址为https://www.addgene.org/12259/)载体按质量比为5ug:3.2ug:1.8ug转染293T细胞(约3×106个293T细胞铺于10cm皿)，8h后更换为新鲜培养基(DMEM培养基，添加10％胎牛血清)，之后每隔24h收集一次上清并加入新鲜培养基(DMEM培养基，添加10％胎牛血清)，共收集3次，获得慢病毒上清A。
使用实施例2制备好的将重组慢病毒载体Plenti-CAR-CD244-antiPSMA与psPAX2、pMD2.G载体按质量比为5ug:3.2ug:1.8ug转染293T细胞(约3×106个293T细胞铺于10cm皿),8h后更换为新鲜培养基(DMEM培养基，添加10％胎牛血清)，之后每隔24h收集一次上清并加入新鲜培养基(DMEM培养基，添加10％胎牛血清)，共收集3次，获得慢病毒上清B。
2、慢病毒的浓缩
分别将步骤1获得的慢病毒上清A和B按30ml/管装入高速离心管，使用高速离心机离心，20000g离心1小时，收集管壁上慢病毒，使用100ul DPBS缓冲液悬浮，分别获得浓缩的慢病毒A和B，-80℃保存。
实施例4、浓缩的慢病毒感染NK细胞制备CAR-NK细胞及检测
1、浓缩的慢病毒感染NK细胞
分别将实施例3制备的浓缩的慢病毒A和B，加入1ml完全培养基，与105个NK92MI细胞(购自ATCC，网址:https://www.atcc.org/)混匀(加入终浓度4ug/ml的聚凝胺polybrene)，得到重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19和重组细胞NK92MI-CD244-antiPSMA(此处得到的重组细胞为混合细胞，其中CAR-NK细胞指NK92MI的重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19和NK92MI-CD244-antiPSMA)。
2、CAR结构在NK细胞中的表达检测
将步骤1得到重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19和实施例3得到的293T转染载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19的细胞进行Westernblot检测表面抗体表达情况：以NK92MI转染Plenti空载体后的细胞为对照，使用CD19-FITC抗原分别于NK92MI转染Plenti空载体后的细胞、重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19进行孵育后，进行Western blot检测，结果如图3所示。
图3的结果表明，NK92MI-CD244-antiCD19和293T转染载体Plenti-CAR-CD244-antiCD19的细胞能够特异表达CAR-CD244-antiCD19蛋白结构。
重组细胞NK92MI-CD244-antiPSMA和实施例3得到的293T转染载体Plenti-CAR-CD244-antiPSMA的细胞的表达检测按照上述方法进行，结果，NK92MI-CD244-antiPSMA和293T转染载体Plenti-CAR-CD244-antiPSMA的细胞能够特异性表达CAR-CD244-antiPSMA蛋白结构。
3、流式细胞术检测CAR-NK细胞中CAR蛋白结构的表达
具体操作按流式抗原标记物使用说明进行，具体如下：
将待检测细胞(步骤2中的重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19)取约105个细胞离心后去上清；
使用200ul DPBS悬浮待检测细胞，加入流式抗原标记物，轻轻混匀，于37℃摇床(100转)孵育30分钟，离心去上清；
使用500ul完全培养基悬浮细胞，37℃培养箱培养5分钟，离心弃上清；
使用200ul DPBS重悬细胞后，上机检测。
结果:如图4所示，流式细胞术检测重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19细胞表面CAR蛋白结构的表达，较深色无边缘实线灰色部分为无任何修饰NK92MI细胞对照，较浅的有实线边缘灰色部分为重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19孵育CD19-FITC抗原，位移说明重组细胞NK92MI-CD244-antiCD19细胞膜表面有CD19抗体表达；边界线为对应横坐标荧光信号位置对应的细胞计数。
实施例5、CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤实验
取104个NK92MI-CD244-antiCD19细胞与104个B淋巴细胞瘤(Daudi)细胞孵育，以NK92MI为对照，记为1:1；
5，000个NK92MI-CD244-antiCD1细胞与104个Daudi孵育，以NK92MI为对照，记为0.5:1；
2，500个NK92MI-CD244-antiCD19细胞与104个Daudi孵育，以NK92MI为对照，记为0.25:1；
1，250个NK92MI-CD244-antiCD19细胞与104个Daudi孵育，以NK92MI为对照，记为0.125:1；
将NK92MI-CD244-antiPSMA与前列腺癌(PC3)细胞孵育，以NK92MI为对照，比例按上述方法进行。
设三组平行对照，孵育20小时后使用CellTox-Green(promega G8471)试剂盒检测细胞活率(通用方法)，制图。
结果如图5和图6所示，其中，菱形点为未修饰NK92MI细胞条件下的肿瘤细胞溶解程度；正方形点为经实施例4方法修饰的NK92MI细胞(NK92MI-antiCD19代表NK92MI-CD244-antiCD19，NK92MI-antiPSMA代表NK92MI-CD244-antiPSMA)条件下的肿瘤溶解程度。结果证明重组CD244修饰过的NK细胞，即CAR-NK重组细胞相比于未修饰过的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果更好。
实施例6、CAR-NK细胞孵育Daudi、PC3细胞20h后的IFNγ干扰素水平检测
取105个NK92MI-CD244-antiCD19与105个Daudi细胞于500ul培养基中孵育20h(记为NK92MI-antiCD19+Daudi)；以未修饰的NK92MI细胞为对照(记为NK92MI+Daudi)；
取105个NK92MI-CD244-antiPSMA细胞与105个PC3细胞于500ul培养基中孵育20h(记为NK92MI-antiPSMA+PC3)；以未修饰的NK92MI细胞为对照(记为NK92MI+PC3)；
将孵育后的细胞离心取上请进行IFNγ干扰素水平检测，具体方法按试剂盒使用说明进行(不同试剂盒方法略有不同)。
结果如图7和图8所示，其中，NK92MI为未修饰的NK92MI细胞单独进行孵育的结果，NK92MI-antiCD19为NK92MI-CD244-antiCD19单独进行孵育的结果，NK92MI-antiPSMA为NK92MI-CD244-antiPSMA单独进行孵育的结果。
结果表明：重组CD244修饰过的NK细胞即CAR-NK细胞NK92MI-CD244-antiCD19和NK92MI-CD244-antiPSMA孵育相应的肿瘤细胞后能够释放更多的IFNγ，说明CAR-NK活性比未修饰的普通NK细胞活性更强，对肿瘤细胞杀伤效果更高。
实施例7、实验动物的肿瘤模型体内实验
将健康的裸鼠(Nude Mouse)共9只随机分为3组，每组3只，3组分别为空白对照组，NK细胞对照组，CAR-NK细胞组。在所有小鼠前胸腋下附近注射5×106个有GFP荧光蛋白标记的PC3肿瘤细胞/只，并正常喂养14天。14天后，对所有组别的小鼠进行活体荧光成像，记录小鼠体内肿瘤的成长情况。荧光成像之后，分别对各组小鼠PC3肿瘤细胞注射点附近分别进行如下给药：
给空白对照组小鼠注射生理盐水100ul；
给NK细胞对照组小鼠注射普通NK92MI细胞悬浮液100ul，总数为5×106个NK细胞/100ul生理盐水；
给CAR-NK细胞组小鼠注射针对于PC3肿瘤细胞的实施例4制成的CAR-NK(NK92MI-CD244-antiPSMA)细胞悬浮液(浓度为5×106个CAR-NK(NK92MI-CD244-antiPSMA)细胞/100ul生理盐水)。
注射完毕后和正常喂养7天之后分别对所有组别的小鼠进行活体荧光成像，记录小鼠体内肿瘤情况。
结果如图9所示，图9中左中右三列分别为：空白对照组、NK细胞对照组、CAR-NK细胞组，第一行为注射完毕后的结果，第二行为正常喂养7天后的结果，图9结果显示，相比于空白对照组和NK细胞对照组，CAR-NK细胞组小鼠体内的平均肿瘤体积明显较小，肿瘤生长明显受到了抑制。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (2)

1.一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将特异性抗体编码基因使用末端带有BfuAI限制性内切酶识别位点的引物进行PCR扩增；
所述特异性抗体编码基因序列为CD19抗体的部分序列，为序列表序列2；
步骤2、将步骤1的PCR产物分别进行纯化；
步骤3、将步骤2纯化的PCR产物在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切，并同时将含有改造的CD244骨架的克隆载体在BfuAI限制性内切酶识别位点进行单酶切；
步骤4、将酶切后产物进行纯化；
步骤5、将纯化后的产物按抗体片段与含有改造的CD244骨架的克隆载体摩尔比为3:1配比后，使用T4连接酶进行连接、转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序；将在所述改造的CD244骨架的克隆位点区连入antiCD19，得到的质粒命名为：重组载体CAR-CD244-antiCD19。
2.如权利要求1所述的重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法，其特征在于，所述改造的CD244骨架序列如序列表序列1所示，其中，序列表序列1中的第1位至第63位所示序列为CD244上膜信号区的DNA序列；序列表序列1中的第64位至第95位所示序列为克隆位点区的DNA序列；序列表序列1中的第96位至第560位所示序列为CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区的DNA序列；序列表序列1中的第561位至第575位所示序列为DDDDK-tag标记；序列表序列1中的第576位至第578位所示序列为终止密码子。
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