CN117384858B - 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法及其应用。方法包括：（1）激活T细胞，T细胞激活17~19 h后采用完全培养基调整细胞密度8~9×106/ml，向完全培养基中加入慢病毒，同时加入聚凝胺，对激活后的T细胞进行培养；（2）培养6~8 h后加入完全培养基以稀释聚凝胺，继续培养；（3）培养至第3~5天，每天进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。（4）培养至第5~11天，每48 h进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。本发明的方法可以提高T细胞嵌合抗原受体基因转导效率。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）疗法是血液系统恶性肿瘤领域最重要的突破之一。嵌合抗原受体T细胞疗法作为一种基因工程化免疫细胞治疗方法，能够精准、快速、高效地杀灭肿瘤，近年来在恶性肿瘤治疗中取得了较大的突破和进展，尤其在血液类肿瘤的临床治疗中获得很大成就，但嵌合抗原受体T细胞也面临缺乏特异性靶点、肿瘤微环境抑制及实体瘤浸润效果不佳等问题。
嵌合抗原受体CAR是嵌合抗原受体T细胞发挥作用的关键结构，其表达效率直接关系到嵌合抗原受体T细胞的治疗效果。目前，有多种外源基因导入办法，包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、转座子技术及各种瞬时表达电转技术等。目前嵌合抗原受体几乎用的是逆转录病毒或者瞬时表达技术转导进入并稳定表达在T细胞上，包括γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。
尽管慢病毒转导系统在转导原代细胞比其他病毒转导系统有更大优势，但实现LV-CAR在T细胞上高效率转导仍是该领域的技术难点。临床前科研级慢病毒制备中没有去除包装错误、没有活性的慢病毒颗粒，因此用于直接感染原代细胞效率较低，受细胞状态影响较大，批次差异大（感染细胞系效率可达到80％~100％，原代细胞效率为5%~30％）。目前常用的促感染试剂聚凝胺Polybrene促进慢病毒感染原代T细胞效果不明显。并且在嵌合抗原受体T细胞制备方面仍存在一些瓶颈问题未解决，如T细胞的天然免疫反应使携带嵌合抗原受体基因的慢病毒感染T细胞效率低，这使得嵌合抗原受体T细胞制备效率低，成本高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明公开了一种嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的制备方法及其应用。本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中常用的促感染试剂聚凝胺Polybrene，促进慢病毒感染原代T细胞效果不明显的缺陷。本发明通过调整慢病毒感染时的细胞密度、聚凝胺的浓度及完全培养基的组成等方式，提高慢病毒感染原代T细胞的效率以及慢病毒载体基因的转导效率，与现有技术相比，使用本发明的方法感染效率可提高2~3倍，且能保持嵌合抗原受体T细胞的活性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明第一方面，提供一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）激活T细胞，T细胞激活17~19 h后采用完全培养基调整细胞密度至8~9×106/ml，向含有激活后的T细胞的完全培养基中加入慢病毒，同时加入聚凝胺Polybrene，对所述激活后的T细胞进行培养。
其中，所述完全培养基的配制方法为：向X-VIVO 15培养基中加入质量分数8%~12%的胎牛血清FBS，再加入IL-2，至IL-2的终浓度为280~320 IU/ml。
（2）培养6~8 h后加入完全培养基以稀释聚凝胺，对所述激活后的T细胞继续进行培养，其中，所述完全培养基的加入量与步骤（1）中完全培养基的用量相同。
（3）培养至第3~5天，每天进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。
（4）培养至第5~11天，每48 h进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述聚凝胺的浓度为8~12 μg/ml；优选地，所述聚凝胺的浓度为10 μg/ml。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中激活T细胞之前，还包括：
（1）分离与冻存外周血单个核细胞PBMC。
（2）复苏外周血单个核细胞PBMC。
（3）对T细胞进行分选。
本发明第二方面，提供一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）激活T细胞，T细胞激活17~19 h后采用完全培养基调整细胞密度至8~9×106/ml，向含有激活后的T细胞的完全培养基中加入慢病毒，同时加入聚凝胺，对所述激活后的T细胞进行培养。
其中，所述完全培养基的配制方法为：向X-VIVO 15培养基中加入质量分数8%~12%的胎牛血清FBS，再加入IL-2、IL-7和IL-15，至IL-2的终浓度为280~320 IU/ml，IL-7的终浓度为8~12 ng/ml，IL-15的终浓度为8~12 ng/ml。
（2）培养6~8 h后加入完全培养基以稀释聚凝胺，对所述激活后的T细胞继续进行培养，其中，所述完全培养基的加入量与步骤（1）中完全培养基的用量相同。
（3）培养至第3~5天每天进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。
（4）培养至第5~11天每48 h进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述聚凝胺的浓度为8~12 μg/ml；优选地，所述聚凝胺的浓度为10 μg/ml。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中激活T细胞之前，还包括：
（1）分离与冻存外周血单个核细胞PBMC。
（2）复苏外周血单个核细胞PBMC。
（3）对T细胞进行分选。
在本发明的第三方面，提供一种第一方面和/或第二方面所述嵌合抗原受体（CAR）T细胞的制备方法在制备免疫治疗试剂中的应用。
在一种具体的实施方式中，所述免疫治疗试剂的治疗的疾病为与人体免疫系统相关的疾病，包括但不限于良性肿瘤、恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或过敏性疾病。
优选地，免疫治疗试剂的治疗的疾病为包括自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、皮肤病或慢性肝病中的一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
本发明中的嵌合抗原受体T细胞的制备方法通过调整慢病毒感染时的细胞密度、聚凝胺的浓度及完全培养基的组成等方式，提高了慢病毒感染原代T细胞的效率以及慢病毒载体基因的转导效率，并且不影响细胞状态，用于慢病毒改造的T细胞治疗的临床前研究。
本发明中的嵌合抗原受体T细胞的制备方法制备嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率可高达68.70%，嵌合抗原受体阳性率较常规方法提升3倍以上，平均细胞活率高达90%以上。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例4和实施例5的嵌合抗原受体阳性率比较图。
图2为实施例4和实施例5在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图，其中，图a为实施例4在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图，图b为实施例5在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图。
图3为实施例4和实施例5在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞平均细胞活率比较图。
图4为实施例6和实施例7的嵌合抗原受体阳性率比较图。
图5为实施例6和实施例7在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图，其中，图a为实施例6在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图，图b为实施例7在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图。
图6为实施例6和实施例7在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞平均细胞活率比较图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但是本发明并不仅限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
外周血单个核细胞PBMC的分离与冻存
1、将单采血加入等体积磷酸缓冲盐溶液PBS稀释，用25 ml移液管吹打混匀或颠倒混匀。
2、缓慢地将30 mL稀释后的血液加入到含15 mL淋巴细胞分离液的离心管（提前备好）中，使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，进行离心。
3、离心参数：800 g离心20 min，升速率7，降速率3，温度25℃。
4、离心结束后，取出离心管。吸弃最上层的血浆至白膜层边界上1 cm左右，轻轻吸取单个核细胞（白膜层）以及它下面一半的液体并转移至新的200 ml离心管中，尽量全部吸出外周血单个核细胞PBMCs。
5、加2~3倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS（至150 ml）于所得的外周血单个核细胞PBMCs中，上下颠倒混匀或用移液管轻轻吹打均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2/3~3/4。
6、混匀后离心400 g离心8 min，升速率9，降速率6，弃上清。
7、利用管底少量液体将细胞重悬，转至新50 ml离心管内，用2~3倍的磷酸缓冲盐溶液PBS补至45ml，进行离心。
8、离心参数400 g，升速率9，降速率6，6 min，弃上清。
9、用10ml 磷酸缓冲盐溶液PBS重悬细胞并取20 ul并稀释至20倍进行计数。
10、根据计数结果选择冻存细胞量，混匀后取外周血单个核细胞PBMCs至另一离心管并补磷酸缓冲盐溶液PBS至45ml进行离心。
11、冻存的细胞按照5~10×107/ml 浓度进行冻存。
12、根据需冻存的细胞数及细胞密度计数出需准备冻存液的体积。
。
13、快速分装于冻存管中，5 ml或2 ml/管，封口后迅速使用程控降温仪进行冻存。
冻存结束后转移至液氮，做好冻存记录。
实施例2
外周血单个核细胞PBMC的复苏
1、配制复苏培养基：X-VIVO 15培养基，10％胎牛血清。
2、取一支冻存的外周血单个核细胞PBMC，于37℃水浴锅内化开后加入到40 ml复温的复苏培养基中。
3、400 g离心8 min，升速率9，降速率6。
4、弃上清，用10 ml T细胞培养基重悬细胞，取样计数后离心。
5、弃上清，用培养基重悬后根据计数结果调整细胞浓度5×106/ml，于培养箱中静置培养3 h。
6、3 h后将细胞悬液离心，300 g，8 min。
实施例3
T细胞分选与激活
1、配制完全培养基：X-VIVO 15培养基，10％胎牛血清，并加入IL-2，令IL-2的终浓度为300 IU/ml。
2、缓冲液Buffer 1配制：含1%人血清白蛋白HSA的磷酸缓冲盐溶液PBS（提前准备150ml，加入20%人血清白蛋白HSA7.5 ml）。
3、按外周血单个核细胞PBMC: 人T 细胞激活磁珠Beads=2:1选择Dynabeads人 T活化剂与抗 CD3以及抗 CD28 抗体偶联激活磁珠（Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28, Beads），简称Dynabeads激活磁珠，分选激活磁珠使用量。
4、将Dynabeads激活磁珠间断涡旋1 min混匀重悬。
5、取相应量人T 细胞激活磁珠Beads（Dynabeads激活磁珠）加到含有10 ml 缓冲液Buffer 1的50 ml离心管中，吹打混匀洗涤。
6、将离心管置于磁力架上1 min，吸弃全部上清备用。
7、磁珠-细胞孵育及洗涤。
8、外周血单个核细胞PBMCs混匀后加入到洗涤过的Dynabeads激活磁珠中，再以细胞密度3~3.5×107/ml补磷酸缓冲盐溶液至相应体积（体积为离心管总体积的1/2~2/3），吹打或轻轻颠倒混匀，并立即开始孵育。
9、将含有人T 细胞激活磁珠Beads和细胞的离心管（封口膜封口），置于旋转混合仪上，室温孵育30 min，离心管与旋转混合仪转轴呈30°角。
10、孵育完成后将含有人T 细胞激活磁珠Beads和细胞复合体的离心管置于磁力架上1 min以吸附和人T 细胞激活磁珠Beads结合的CD3+T细胞（拿离心管的时候一定要轻柔，避免破坏Beads-细胞复合体，将磁力架角度调整为60°），缓慢的吸弃废液或至另一个空离心管（检测细胞密度，算出细胞数）。
11、30 ml 磷酸缓冲盐溶液PBS重悬Beads-细胞复合体（此过程必须轻柔，避免破坏Beads-细胞复合体），置于磁力架洗1 min后，吸弃废液。
12、立即用10 ml完全培养基轻柔地重悬Beads-细胞复合体并取20 ul计数。
13、转至T75培养瓶，根据计数结果以3~4×106/ml激活培养密度补完全培养基至相应体积。
14、轻轻摇晃培养瓶以摇匀细胞。
15、37℃，5%CO2培养箱培养过夜。
实施例4
慢病毒感染制备嵌合抗原受体T细胞
1、配制完全培养基：X-VIVO 15培养基，10％胎牛血清，并加入IL-2，令IL-2的终浓度为300 IU/ml。
2、第0天：复苏外周血单个核细胞PBMC细胞、分选T细胞并激活培养，激活培养密度1×106/ml。
3、第2-5天：T细胞激活后感染嵌合抗原受体慢病毒：
（1）第二天 T细胞加入激活磁珠后在37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h后，按照MOI＝10，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝ (MOI×细胞数量)/病毒滴度。向培养瓶中加入上述计算所得的病毒量，同时在对应的孔中加入聚凝胺，聚凝胺的浓度为5 μg/ml，培养箱培养。
（2）第四天培养箱培养2天取样计数后将细胞转移至离心管，400 g，离心6 min；弃去上清液，根据计数结果用完全培养基调整细胞密度为1×106/ml继续培养。
（3）第五天利用磁力架去除磁珠，取样计数补液。
（4）第七天感染5天后流式细胞术检测嵌合抗原受体T细胞表达的阳性率。
4、第7-11天每2天进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度1×106/ml继续培养。
实施例5
慢病毒感染制备嵌合抗原受体T细胞
1、第0天：复苏外周血单个核细胞PBMC细胞、分选T细胞并激活培养，激活培养密度3~4×106/ml。
2、第一天：T细胞激活18 h后感染嵌合抗原受体慢病毒：
（1）T细胞加入激活磁珠后在37℃、5%CO2的培养箱中培养18 h后，取样计数，将细胞转移至离心管离心，400 g，离心6 min；弃去上清液，用完全培养基重悬并调整细胞密度至8~9×106/ml，按照MOI＝10，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度。向培养瓶中加入上述计算所得的病毒量，同时在对应的孔中加入聚凝胺，聚凝胺的浓度为10 μg/ml，培养箱培养。
其中，完全培养基的配制方法为：向X-VIVO15培养基中加入10%的胎牛血清FBS，再加入IL-2，至IL-2的终浓度为300 IU/mL。
（2）培养箱培养6 h后补入1倍的完全培养基，以稀释聚凝胺(稀释至浓度为5 μg/ml)，于培养箱中继续培养。
3、第3-5天每天进行取样计数，根据计数结果补入完全培养基，调整细胞密度1×106/ml继续培养。
4、第5-11天每2天进行取样计数，根据计数结果补入完全培养基，调整细胞密度1×106/ml继续培养；Day7通过流式细胞术检测嵌合抗原受体T细胞表达的阳性率。
实验结果：图1为实施例4和实施例5的嵌合抗原受体阳性率比较图。图2为实施例4和实施例5在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞嵌合抗原受体阳性率流式检测图。基于实施例4对慢病毒感染T细胞条件进行优化的实施例5，其嵌合抗原受体阳性率显著高于实施例4，将阳性率由18.50%提升到47.20%，如图1和图2所示。图3为实施例4和实施例5在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞平均细胞活率比较图。
实施例5慢病毒感染后平均细胞活率88.86%，显著高于实施例4的79.08%，如图3所示。
实施例6
慢病毒感染制备嵌合抗原受体T细胞
与实施例5的区别在于：T细胞激活18 h后感染嵌合抗原受体慢病毒时提高病毒MOI值，按照MOI=15，向培养瓶中加入计算所得的病毒量。
其余实施步骤同实施例5。通过实施例6观察提高MOI值对嵌合抗原受体阳性率及细胞状态的影响。实施例6与实施例5的数据表明，将MOI值由10提升至15后，嵌合抗原受体阳性率由47.20%（图1）提升至64.00%（图4），而细胞活率无显著差异（图3、图6）。
实施例7
慢病毒感染制备嵌合抗原受体T细胞
与实施例6的区别在于：完全培养基的配置方法为：向X-VIVO15培养基中加入10%的胎牛血清FBS，再加IL-2、IL-7和IL-15，至IL-2的终浓度为300 IU/mL，IL-7的终浓度为10ng/ml，IL-15的终浓度为10 ng/ml。
其余实施步骤同实施例6。通过实施例7观察细胞因子IL-7和IL-15对嵌合抗原受体阳性率及细胞状态的影响。
实验结果：图4为实施例6和实施例7的嵌合抗原受体阳性率比较图。图5为实施例6和实施例7在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞CAR阳性率流式检测图。图6为实施例6和实施例7在慢病毒感染后的嵌合抗原受体T细胞平均细胞活率比较图。结果如图4、图5及图6所示，实施例7的嵌合抗原受体阳性率略高于实施例6，达到了68.70%，并且其平均细胞活率也高于实施例6，达到了91.48%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按外周血单个核细胞PBMC：人T细胞激活磁珠Beads=2:1选择Dynabeads人T活化剂与抗CD3以及抗CD28抗体偶联激活磁珠从分离的PBMC细胞中分选获得T细胞，激活T细胞，T细胞激活17~19 h后采用完全培养基调整细胞密度至8~9×106/ml，向含有激活后的T细胞的完全培养基中加入慢病毒，同时加入聚凝胺，对所述激活后的T细胞进行培养；所述聚凝胺的浓度为10 μg/ml；
其中，所述完全培养基的配制方法为：向X-VIVO 15 培养基中加入质量分数8%~12%的胎牛血清，再加入IL-2、IL-7和IL-15，至IL2的终浓度为280~320 IU/ml，IL-7的终浓度为8~12 ng/ml，IL-15的终浓度为8~12 ng/ml；
（2）培养6~8 h后加入完全培养基以稀释聚凝胺，对所述激活后的T细胞继续进行培养，其中，所述完全培养基的加入量与步骤（1）中完全培养基的用量相同；
（3）培养至第3~5天每天进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至1×106/ml继续培养；
（4）培养至第5~11天每48 h进行取样计数，根据计数结果补液，调整细胞密度至 1×106/ml继续培养；
步骤（1）中激活T细胞之前，还包括：
（1）分离与冻存外周血单个核细胞；
（2）复苏外周血单个核细胞；
（3）对T细胞进行分选。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法在制备免疫治疗试剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫治疗试剂的治疗的疾病为以下一种或多种：良性肿瘤、恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和过敏性疾病。
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