CN114480645A - 多发性骨髓瘤耗竭性nk细胞亚群、其特征基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体是多发性骨髓瘤耗竭性NK细胞亚群、其特征基因及其应用。本发明利用单细胞转录组测序分析技术，对多发性骨髓瘤患者与健康人外周血、骨髓来源的NK细胞进行单细胞转录组测序，鉴定出一群多发性骨髓瘤特异性NK细胞亚群，即耗竭性NK细胞亚群，并确定了耗竭性NK细胞表达的特征基因ZNF683，所述特征基因能够用于识别或鉴定来自多发性骨髓瘤的耗竭性NK细胞，进一步用于多发性骨髓瘤的辅助诊断、预后判断及免疫治疗，以及提供相关的检测试剂。

Description

多发性骨髓瘤耗竭性NK细胞亚群、其特征基因及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体地说，是多发性骨髓瘤耗竭性NK细胞亚群、其特征基因及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统恶性增殖性疾病，以骨髓中恶性浆细胞异常增殖为特征，临床表现为贫血、高钙血症、肾功能不全、骨破坏等，因该病致残致死率较高，且目前仍无法治愈，严重影响患者的生存质量和社会经济效益。
NK细胞在MM肿瘤免疫监视方面起着重要作用，与T淋巴细胞不同，NK细胞不受MHC限制，无需经抗原提前致敏即可发挥杀伤作用。在肿瘤微环境中，NK细胞能够迅速对外来的“不良信号”做出反应，这对于肿瘤免疫监视极为重要。然而，肿瘤细胞也可以反向“改造”NK细胞，改变其杀伤功能，使得NK呈现“耗竭”状态，最终逃避NK细胞的“捕杀”，引起疾病迁延。
迄今为止，NK细胞在肿瘤微环境中耗竭的机制及其中涉及的关键分子目前尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供多发性骨髓瘤耗竭性NK细胞亚群、其特征基因及其应用。
本发明在前期的研究中发现在多发性骨髓瘤(MM)患者体内存在一群耗竭性NK细胞亚群，且伴随ZNF683基因高表达，并证实该基因编码的转录因子可直接与NK细胞内传递激活信号的接头蛋白EAT-2的启动子区域结合，从而抑制NK细胞的杀伤功能。抑制该转录因子表达后MM患者体内NK细胞的杀伤功能增强。因此ZNF683是NK细胞耗竭的关键分子之一，在制备用于多发性骨髓瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物方面具有关键作用。
本发明的第一方面，提供一种用于识别或鉴定耗竭性NK细胞的生物标志物，所述的生物标志物为ZNF683基因、其编码表达的蛋白或蛋白片段。
本发明的第二方面，提供ZNF683基因、其编码表达的蛋白或蛋白片段在制备识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第三方面，提供一种识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂或试剂盒，所述的检测试剂或试剂盒包含能与ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
进一步地，所述的结合剂包括核酸、配体、酶、底物，和/或抗体。
进一步地，所述的结合剂是能ZNF683基因特异性结合的核酸探针或配体。
进一步地，所述的结合剂是能特异性扩增ZNF683基因的引物。
进一步地，所述的结合剂是能与ZNF683基因编码表达的蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体。
进一步地，所述的结合剂能进一步结合指示分子，所述指示分子包括：荧光物质、放射性物质、和/或酶。
本发明的第四方面，提供检测ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段的试剂在制备识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂盒中的应用。
本发明的第五方面，提供检测ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段的试剂在制备肿瘤辅助诊断、预后判断试剂盒中的应用。
进一步地，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。
本发明的第六方面，提供抑制ZNF683基因或其蛋白表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
进一步地，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。
本发明的第七方面，提供一种耗竭性NK细胞亚群，所述的耗竭性NK细胞亚群高表达基因ZNF683。
本发明利用单细胞转录组测序分析技术，对多发性骨髓瘤患者与健康人外周血、骨髓来源的NK细胞进行了单细胞转录组测序，鉴定了多发性骨髓瘤特异性NK细胞亚群，即耗竭性NK细胞亚群，并确定了促进NK细胞耗竭的特征基因。本发明公开的特征基因，能够识别来自多发性骨髓瘤的耗竭性NK细胞，进一步用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗。
本发明的有益效果在于：
1、本发明利用单细胞转录组测序分析技术，通过对多发性骨髓瘤患者和健康人骨髓、外周血来源的NK细胞进行单细胞转录组测序，筛选出1种特异性表达在耗竭性NK细胞中的特征基因：ZNF683。
2、本发明展示了可以用来鉴定或表征该耗竭性NK细胞亚群的特征基因。更具体地，根据该特征基因，可以引申出一系列与该基因或该基因表达地蛋白产物相结合地核酸、配体、酶、底物，和/或抗体，能够鉴定出多发性骨髓瘤中耗竭性NK细胞亚群。该耗竭性NK细胞亚群可以反应多发性骨髓瘤的免疫状态，可以用于多发性骨髓瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物制备。
附图说明
图1.NK细胞共分群(C0-C6)及各亚群差异基因表达情况。
图2.耗竭相关分子(LAG3，KLRG1，KIR3DL2)以及ZNF683在MM患者与健康人C3亚群中的表达情况。
图3.KEGG分析揭示骨髓瘤患者耗竭性NK细胞中下调的信号通路。
图4.特征基因与NK细胞杀伤活性分子的相关性。
图5.ZNF683过表达对NK细胞内杀伤相关分子表达的影响。
图6.杀伤试验检测ZNF683过表达对NK细胞杀伤活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：单细胞转录组测序
1)样本收集：
本发明前期收集了10例初发多发性骨髓瘤患者及3例健康对照的骨髓及外周血标本，由上海交通大学医学院附属仁济医院负责采集和提供。采集样本前所有受试者签署了知情同意书，样本采集过程经上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准。样本采集完成后立即将新鲜样本4℃平稳运回实验室，在2h内进行单个核细胞分离，以保证细胞最大活性。
2)单个核细胞分离：
取骨髓液/外周血5ml，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞：取等体积的PBS稀释标本，吹打混匀后，加入提前准备好的5ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)中，2500rpm离心20min后，用吸管吸出白细胞层至另一干净离心管中，向离心管中加入PBS至10ml，1500rpm离心，弃上清后加入红细胞裂解液2-3ml，4℃裂解5min后加入PBS至10ml重悬，吹打洗涤后1500rpm离心5min，弃上清后即得单个核细胞。
3)10X Genomic平台进行单细胞测序：
上述单个核细胞样本制备成1000-1200细胞/μl的细胞悬液，将细胞悬液与含Barcode序列的Gel beads混合后加载到10x Chromium Controller平台，Gel beads溶解释放反转录随机引物进行反转录。接着使用Chromium Single Cell3’v2 reagent kit构建测序文库，完成文库制备后再Illumina Hiseq 2000平台上进行测序。
实施例2：不同细胞亚群的基因表达量分析
1)聚类分析
通过单细胞转录组测序技术获得原始测序数据后，经过质量控制、与参考基因组比对、定量和构建单细胞基因表达矩阵，然后对单细胞基因表达矩阵的数据进行聚类，通过基因的差异表达分析获得不同的标记基因簇，并通过查阅文献或细胞标记基因数据库等方法获得由标记基因代表的细胞类型，最终对MM患者NK细胞的全貌进行进一步数据分析。通过对测序的30008个NK细胞采用经典的UMAP(Uniform Manifold Approximation andProjection)降维算法对scRNA数据进行降维分析，将NK细胞分为不同亚群，再根据基因表达比值对数的绝对值(log fold change，log FC)由高到低排序，分别筛选出不同亚群中前10个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)，结果以热图形式呈现。结果参见图1。
根据各亚群差异表达的基因对NK细胞进行分群，并通过查阅已发表的文献，定义不同亚群的NK细胞。经多发性骨髓瘤患者与健康人骨髓组织和外周血中NK细胞亚群聚类的对比，我们发现耗竭性NK细胞亚群特异性分布于多发性骨髓瘤患者中，这可能成为多发性骨髓瘤治疗的靶点。我们进一步分析了耗竭性NK细胞与其他NK细胞亚群的基因表达差异情况(表1)。具体方法为，通过将该亚群与样品中其他所有亚群进行比较，得到该亚群与其他亚群之间的差异基因列表，利用Wilcoxon rank sum test方法，寻找该亚群的差异高表达基因。
表1耗竭性NK细胞亚群差异表达基因
Figure BDA0003468181800000041
Figure BDA0003468181800000051
通过比较多发性骨髓瘤患者与健康对照来源的NK细胞各亚群差异基因表达情况，我们发现C3亚群NK细胞仅在多发性骨髓瘤患者来源的样本中存在耗竭相关分子高表达，而在健康人来源的标本中几乎不表达，结果参见图2。因此考虑骨髓瘤患者来源的C3亚群NK细胞为耗竭的NK细胞。
经筛选，耗竭性NK细胞特征基因为ZNF683。
对临床取得的多发性骨髓瘤患者和健康人标本中的ZNF683 mRNA水平在各个NK细胞亚群以及在MM患者与健康人耗竭性NK细胞中的表达进行基因表达量分析，绘制小提琴图。
结果参见图2，与健康对照相比，多发性骨髓瘤患者的C3亚群因高表达LAG3、KLRG1、KIR3DL2等NK细胞耗竭相关分子，因此定义骨髓瘤患者来源的C3亚群NK细胞为耗竭性NK细胞。进一步研究发现特异性表达ZNF683基因(下图)，且ZNF683仅在骨髓瘤患者的C3亚群中高表达，在健康对照C3亚群中不表达。
ZNF683编码一种锌指结构蛋白，对T淋巴细胞和NK细胞分化，尤其在细胞分化的终末阶段起着关键性作用。
LAG3(Lymphocyte activation gene-3)是一种分布于NK细胞和T细胞表面的跨膜糖蛋白，它作为一种新型的免疫检查点，通过与相应配体结合负向调控免疫应答。KLRG1(killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1)主要分布于T细胞和NK细胞，有研究表明KLRG1的表达与NK细胞数量减少和功能受损相关。KIR3DL2隶属于KIR受体家族，是分布于NK细胞表面一类关键的抑制性受体。目前已有大量研究证实LAG3、KLRG1、KIR高表达与NK细胞耗竭相关。本发明中，用LAG3、KIR3DL2和KLRG1作为耗竭性NK细胞亚群基因的阳性对照。
实施例3：多发性骨髓瘤患者与健康人中耗竭性NK细胞差异表达基因的通路富集分析
利用R studio中的Seurat包获得不同亚群的差异表达基因后，为了进一步比较各亚群内患者与健康对照间激活的信号通路差异，我们采用clusterProfiler R包(v3.14.3)进行KEGG分析。
结果参见图3，分析结果表明，骨髓瘤患者中耗竭性NK细胞内存在NK细胞通路明显下调。
实施例4：特征基因与NK细胞杀伤活性分子的相关性
对于上述耗竭性NK细胞的特征基因ZNF683，分别比较在ZNF683高表达(3)和低表达(2)的亚群间NK细胞杀伤活性分子GZMA，GNLY，GZMH表达水平的差异，绘制小提琴图，结果参见图4。
分析结果表明降低ZNF683表达水平，可以显著提高NK细胞杀伤活性分子表达水平。
实施例5：体外向NK细胞转染ZNF683过表达质粒对NK细胞杀伤活性的影响
1)正常人外周血NK细胞的分离：
抽取健康人外周血10ml，Ficoll法分离单个核细胞(具体方法同前)，得到的PBMC经CD56磁珠阳选、CD3磁珠阴选后获得NK细胞，NK细胞在含10％FBS、1％青霉素/链霉素、400IU/mlIL-2的SCGM培养液中培养7d后，再与K562细胞以10：1的靶效比共培养以激活NK细胞，激活后5-6d的NK细胞用以进行体外试验。
2)ZNF683过表达载体的构建：
①引物设计与合成，引物序列详见表2。
表2引物序列
Figure BDA0003468181800000061
Figure BDA0003468181800000071
②载体的双酶切
将含载体质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5ml提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。去1μg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切(37℃，3h)，酶切体系详见表3。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。然后弃掉管内液体，向柱内加入500μL的WA Solution，13000转离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500μL的Wash Solution，13000转离心30S(可重复一次)。然后空离3min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35μL的ddH2O，静置5min，13000转离心1.5min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。
表3酶切体系
载体 1μg
green Buffer 3μL
Xhol 1.5μL
BamHI 1.5μL
ddH<sub>2</sub>O 补足30μL
③目的片段的扩增
将合成的引物稀释成终浓度为10μmol/L的储藏液，利用稀释的引物及模板进行PCR扩增。体系详见表4。将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始PCR扩增。
表4 PCR扩增体系
Figure BDA0003468181800000072
Figure BDA0003468181800000081
④过表达载体与目的片段的连接、转化
测定回收载体和目的片段的浓度。Hieff CloneTM重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。过表达载体与目的片段链接于50度连接20min。将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min，之后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min，加入500μL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45min，3000转离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。送测证实质粒构建成功。
3)慢病毒包装
转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％～80％时准备转染。转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿。取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，转染体系详见表5。混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染10～12h后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染，100μl/皿。转染18～20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的细胞培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.22μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。将病毒分装后保存于-80℃。
表5病毒转染体系
Figure BDA0003468181800000082
Figure BDA0003468181800000091
4)包装完成的慢病毒转染激活的NK细胞
在6孔板中用完全培养基(SCGM+10％FBS+400U/ml IL-2)制备1ml NK细胞液，调整细胞浓度为1*106/ml，加入慢病毒和polybrene(5μg/ml)后，1000g离心1h。向6孔板中加入1ml培养液，此时细胞浓度为5*105/ml。37℃培养48h。离心换液后再培养24h，FCM/PCR测转染效率；剩余细胞继续扩增5-7天。待镜下细胞数充足后，回收细胞，用于后续实验。
5)ZNF683过表达对NK细胞内杀伤相关分子表达的影响：
上述转染ZNF683过表达质粒的NK细胞离心弃上清后，PBS重悬，离心(350xg，5min)弃上清，50μlPBS重悬，分别移取25μl固定液至每只试管。涡旋振荡后室温孵育15min，再次涡旋振荡后加入300μl透化剂，立即涡旋后向试管内加入胞内抗体(IFN-γ、Perforin)，室温孵育15-30min后，向试管内加入3ml1x的最终试剂，离心后500μlPBS重悬，上机检测。
结果参见图5，向NK细胞转染ZNF683过表达质粒后，NK细胞杀伤活性分子表达明显下调，且具统计学意义。
6)杀伤试验检测ZNF683过表达对NK细胞杀伤活性的影响：
转染ZNF683过表达质粒和转染空质粒的NK细胞与插入荧光素酶基因的Raji细胞株(Luc-Raji)分别以不同的靶效比(1：1，1：2.5，1：5，1：10)各100μl加入96孔板中，充分混匀，每个靶效比设置3复孔，另设仅含Raji细胞的3复孔作为对照。制备好的96孔板放入37℃，5％CO2培养箱中，孵育4h后，向各孔加入50μl荧光素工作液，避光反应10min后，酶标仪读数。结果的计算公式为：杀伤效率％＝(细胞对照组-杀伤组)/细胞对照组*100％。
结果参加图6，向NK细胞转染ZNF683过表达质粒后，NK细胞对靶细胞的细胞毒性显著降低。
结论：
在多发性骨髓瘤体内存在一群耗竭的NK细胞亚群，ZNF683为该耗竭性NK细胞亚群的特征基因，ZNF683高表达使得NK细胞发挥杀伤肿瘤的能力明显下降；ZNF683低表达后，NK细胞的杀伤功能明显增高。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 多发性骨髓瘤耗竭性NK细胞亚群、其特征基因及其应用
<130> /
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cgcgaattcg aagtatacct cgaggccacc atgaaggaag aatcagc 47
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
cgatcgcaga tccttggatc cttaattgtt ctggtcctgc ccca 44

Claims (10)

1.一种用于识别或鉴定耗竭性NK细胞的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为ZNF683基因、其编码表达的蛋白或蛋白片段。
2.ZNF683基因、其编码表达的蛋白或蛋白片段在制备识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒包含能与ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
4.根据权利要求3所述的识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的结合剂包括核酸、配体、酶、底物，和/或抗体。
5.检测ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段的试剂在制备识别或鉴定耗竭性NK细胞的试剂盒中的应用。
6.检测ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段的试剂在制备肿瘤辅助诊断、预后判断试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的检测ZNF683基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段的试剂在制备肿瘤辅助诊断、预后判断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。
8.抑制ZNF683基因或其蛋白表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的制ZNF683基因或其蛋白表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。
10.一种耗竭性NK细胞亚群，其特征在于，所述的耗竭性NK细胞亚群高表达基因ZNF683。
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