CN114736874B - 一种增强car-t细胞功能的培养基及其应用 - Google Patents

一种增强car-t细胞功能的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强CAR‑T细胞功能的培养基及其应用。本发明CAR‑T细胞培养用的培养基包括基本培养基和SF2523。本发明在研究中发现，SF2523能提高CAR‑T细胞的增殖能力、抗耗竭能力和肿瘤杀伤能力，S‑CAR‑T细胞耗竭水平显著低于普通CAR‑T细胞。在Nalm6细胞刺激的耗竭模型种，S‑CAR‑T仍然保持高效的杀伤能力，CAR‑T细胞的抗肿瘤功能增强。在GD2‑CAR‑T细胞耗竭模型中，SF2523处理仍能促进GD2‑CART杀伤功能，降低其凋亡比例。

Description

一种增强CAR-T细胞功能的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，特别是涉及一种增强CAR-T细胞功能的培养基及其应用，是一种在CAR-T细胞培养过程中使用并增强其功能的培养基及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗是一种肿瘤过继免疫治疗的新途径。该疗法通过体外基因编辑技术使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，赋予T细胞对肿瘤细胞表面抗原的特异性，从而实现肿瘤精准靶向治疗。近年来，CAR-T治疗在治疗恶性造血系统肿瘤取得显著效果。通过4-1BB/CD3ζ或CD28/CD3ζ的CAR-T细胞治疗，超过80％的复发或难治B细胞性急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者获得完全缓解，但临床数据表明仍有30-60％患者在CAR-T治疗后仍出现复发情况，主要原因是CAR-T细胞有限的扩增和持久性导致CAR-T细胞功能障碍从而影响CAR-T细胞治疗效果。因此，抑制CAR-T耗竭，提高CAR-T细胞持久性，增殖能力以及杀伤能力成为了继续克服和解决的问题。
表观遗传学的调控对CAR-T细胞的功能和活性具有重要影响，表观遗传重编程参与调控T细胞耗竭和记忆相关基因的转录与表达(文献1：Pauken,K.E.et al.Epigeneticstability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1blockade.Science 354,1160-1165(2016).文献2：)。其中含溴结构域和额外终端域家族蛋白(BET)通过招募转录共激活因子或抑制因子来调节基因活性。据报道BET抑制剂在增加小鼠CAR-T细胞中的中央记忆型T细胞(Central Memory T cell,TCM)，抑制CAR-T细胞的耗竭具有重要作用。因此，BET蛋白抑制剂在肿瘤和炎症等临床前疾病模型中表现出良好的疗效，部分已进入临床阶段(参考文献3：Kong,W.et al.BET bromodomain proteininhibition reverses chimeric antigen receptor extinction and reinvigoratesexhausted T cells in chronic lymphocytic leukemia.J Clin Invest 131,doi:10.1172/JCI145459(2021).)。此外，PI3K信号通路被发现与CAR-T细胞功能密切相关，抑制剂PI3K信号通路可使TCM数量增加，相对应效应记忆型T细胞(Effector Memory T cell,TEM)数量降低，CD4/CD8比例正常化，线粒体数量增加，增强抗白血病相关的表观遗传修饰(参考文献4：Funk,C.A.-O.et al.PI3Kδ/γinhibition promotes human CART cellepigenetic and metabolic reprogramming to enhance antitumorcytotoxicity.Blood 139,523-537(2022).)。
SF2523(分子式C19H17NO5S，CAS号1174428-47-7)是PI3K和BET蛋白的双重抑制剂。它有效抑制肿瘤细胞的生存、增殖和迁移，并诱导肿瘤细胞凋亡活化，对实体瘤和血液瘤都有广泛的抑制作用。然而，SF2523对CAR-T细胞功能作用有待研究。SF2523结构式为：
发明内容
本发明的目的是克服现有研究方案中各类CAR-T细胞普遍的功能减弱这一缺点，提供一种增强CAR-T细胞功能的培养基。
本发明提供的一种增强CAR-T细胞功能的培养基，包括基本培养基和SF2523。
优选的，SF2523的使用浓度为500nm-3μM，更优选的，SF2523的使用浓度为1μM。
优选的，基本培养基为：10％体积比的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素以及200U/ml的白介素2(IL-2)，余量为RPMI 1640培养基。
本发明又提供了所述培养基在CAR-T细胞的构建及培养中的应用。
本发明所述的应用，通过以下步骤实现：
(1)分离制备CAR-T细胞所需的T细胞；
(2)构建用于表达CAR基因序列的慢病毒载体，将所述慢病毒载体在转染剂存在的条件下对步骤(1)中的T细胞转染，制成CAR-T细胞，转染剂为聚凝胺(polybrene)；
(3)对步骤(2)制备的CAR-T细胞进行培养，第1-6天使用基本培养基，第6～12天使用所述培养基。
优选的，步骤(2)中，从转入CAR基因后的第6～12天开始使用所述培养基进行培养。更优选的，步骤(3)中每1～3天更换一次所述培养基。
本发明的应用，是一种提高杀伤能力、抗耗竭能力、适应范围广的CAR-T细胞制备和培养方法，该方法制备和培养的SF2523-CAR-T(S-CAR-T)细胞具有更强的抗耗竭能力、肿瘤杀伤能力和增殖能力。
本发明筛选了有利于功能性CAR-T细胞制备的SF2523最佳使用浓度。CAR-T细胞作为本发明的一个实际案例，通过添加SF2523小分子的产品工艺优化，实现了对血液肿瘤治疗效果上的突破，具备较好的临床应用前景。
本发明在研究中发现，在CAR-T细胞普通培养模型中，SF2523处理能提高CAR-T细胞的记忆细胞比例，增强抗耗竭能力，提高增殖能力和肿瘤杀伤能力。CAR-T细胞与肿瘤共培养后形成的耗竭模型中，SF2523处理能部分逆转CAR-T细胞耗竭，提高CAR-T细胞活力。在GD2-CAR-T容易耗竭模型中，SF2523仍能提高CAR-T细胞的记忆细胞比例，S-GD2-CAR-T细胞耗竭水平显著低于普通GD2-CAR-T细胞且保持高效的杀伤能力。在不同模型中，S-CAR-T仍能稳定发挥作用，提高CAR-T细胞杀伤能力，抑制其凋亡。综上，在不同CAR-T细胞模型，特别是耗竭模型中，SF2523处理都能稳定增强CAR-T细胞的抗耗竭能力和肿瘤杀伤能力。
附图说明
图1为不同浓度SF2523处理3天后的CD19-CAR-T细胞中央记忆型细胞提高情况；A为CD19-CAR-T细胞TCM比例提高情况，B为CD19-CAR-T细胞TEM比例降低情况；****表示p<0.0001。
图2为不同浓度SF2523处理3天后的CD19-CAR-T细胞中PD-1、TIM-3、LAG-3耗竭指标降低情况；A为CD19-CAR-T细胞PD-1耗竭指标降低情况，B为CD19-CAR-T细胞TIM-3耗竭指标降低情况,C为CD19-CAR-T细胞LAG-3耗竭指标降低情况；****表示p<0.0001。
图3为1μM SF2523处理后D3至D12的CD19-CAR-T细胞增殖曲线。
图4为CD19-CAR-T细胞以1：1比例与Nalm6肿瘤细胞共培养48小时，成功制备Nalm6细胞刺激的CAR-T细胞耗竭模型后，再加入SF2325处理3天后CD19-CAR-T细胞中央记忆型细胞比例提高情况；A为CD19-CAR-T细胞TCM比例提高情况，B为CD19-CAR-T细胞TEM比例降低情况；****表示p<0.0001。
图5为CD19-CAR-T细胞以1：1与Nalm6肿瘤细胞共培养48小时后，再加入SF2325处理的CD19-CAR-T细胞PD1、TIM3、LAG3耗竭指标降低情况；A为CD19-CAR-T细胞PD-1耗竭指标降低情况，B为CD19-CAR-T细胞TIM-3耗竭指标降低情况,C为CD19-CAR-T细胞LAG-3耗竭指标降低情况；****表示p<0.0001。
图6为1μM SF2523处理3天后的GD2-CAR-T细胞中央记忆型细胞比例提高情况；A为GD2-CAR-T细胞TCM比例提高情况，B为GD2-CAR-T细胞TEM比例降低情况；****表示p<0.0001。
图7为1μM SF2523处理3天后的GD2-CAR-T细胞PD1、TIM3、LAG3耗竭指标降低情况；A为GD2-CAR-T细胞PD-1耗竭指标降低情况，B为GD2-CAR-T细胞TIM-3耗竭指标降低情况,C为GD2-CAR-T细胞LAG-3耗竭指标降低情况；****表示p<0.0001。
图8为1μM SF2523处理后的不同病毒感染的T细胞以1∶1、1：15、1：30的效靶比对Nalm6肿瘤细胞的杀伤情况图；其中，A为SF2523处理3天后的CD19-CD28z-CAR-T细胞杀伤效果提高情况；B为SF2523处理3天后的CD19-4-1BB-CAR-T细胞杀伤效果提高情况；C为SF2523处理3天后的GD2-CD28z-CAR-T细胞杀伤效果提高情况。****表示p<0.0001。
图9为1μM SF2523处理3天后的不同病毒感染的T细胞凋亡比例下降情况；其中，A为SF2523处理3天后的CD19-CD28z-CAR-T细胞凋亡比例降低情况；B为SF2523处理3天后的CD19-4-1BB-CAR-T细胞凋亡比例降低情况；C为SF2523处理3天后的GD2-CD28z-CAR-T细胞凋亡比例降低情况。****表示p<0.0001。
具体实施方式
以下对本发明结合附图和具体实施方式进行详细说明。此处描述的具体实施方式仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供一种S-CAR-T细胞的制备方法，该方法包括将常规CAR-T细胞在SF2523的处理下进行培养，得到S-CAR-T细胞，所述S-CAR-T细胞在不同培养模型下，都具有更高的杀伤能力和抗耗竭能力。
根据本发明，所述SF2523的加入时期可以在较宽的范围内进行选择。优选的，所述SF2523在CAR-T细胞培养的第6-12天连续加入，例如，6天、9天、12天、15天加入。
根据本发明，所述CAR-T细胞在SF2523中培养的时间也可以在较宽的范围内进行选择。优选的，所述CAR-T细胞在SF2523中培养的时间为72h，即可显著改善CAR-T细胞功能。
根据本发明，对所述SF2523用量可在较宽的范围内进行选择。优选的，在培养基中，所述SF2523的用量使得其浓度为500nM-3μM，例如，1μM。
根据本发明，待处理的CAR-T细胞可以为本领域中任意的CAR-T细胞，其可以为单靶标CAR-T细胞和/或多靶标CAR-T细胞。优选的，所述CAR-T细胞选自CD19-CAR-T细胞、CD20-CAR-T细胞、CD22-CAR-T细胞、CD20/CD19-CAR-T细胞。
其中，CAR-T细胞的制备方法如实施例2所示。
第二方面，本发明提供了如上述方法制得的S-CAR-T细胞。
根据本发明，使用SF2523制备的S-CAR-T细胞，细胞中TCM的比例显著提高；对肿瘤细胞具有更强的杀伤能力，在持续杀伤过程中，更为明显。
第三方面，本发明提供了如上述的S-CAR-T细胞在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
第四方面，本发明提供了SF2523在CAR-T临床治疗中的潜在应用价值，任何CAR-T临床治疗中使用SF2523作为辅助药剂治疗所属权利应包含在本发明中。
其中，所述待治疗肿瘤的种类可以根据不同的CAR-T细胞类型进行选择，这些均是本领域技术人员所公知的，此处不再详述。
以下，将通过实施例对本发明进行详细描述。
HEK293T细胞，ALL细胞株Nalm6由中科院上海细胞所引进保存。聚乙烯亚胺酸盐(PEI)购自美国Polysciences公司。青链霉素混合液(100X)购自北京索莱宝科技有限公司。RPMI1640培养基购自美国Corning公司)。DMEM(High Glucose)培养基购自美国Corning公司。胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司。Ficoll淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。IL-2购自美国Peprotech公司。质粒：CD28z，GD2，41BB，psPAX2和pMD2.G由浙江大学血液病研究所保存。anti-CD3/CD28磁珠：临床研究级别，购自美国Thermo公司，CAT#40203D。Polybrene购自美国Sigma-Adrich公司。流式荧光抗体：anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)、anti-human PD-1(APC)、anti-human LAG-3(PE-cy7)；、Annexin V(APC)；PE、APC、PE-cy7、同型对照均购自美国Biolegend公司。EasySepTM人T细胞阴选试剂盒购自美国Stem Cell公司，CAT#17951。
实施例1：病毒制备
1、使用DMEM完全培养基培养293T细胞，其中DMEM完全培养基包括DMEM(HighGlucose)培养基、体积比10％FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素。当293T密度达到60％-70％时换液，加入6ml新的DMEM完全培养基，进行下一步。
2、配置质粒公共体系，规格为每个10cm培养皿中加入目的质粒(CD28z-CAR SEQID No.1或4-1BBCAR SEQ ID No.4或GD2-CAR SEQ ID No.7)7.5μg，psPAX2质粒5.625μg，pMD2.G质粒1.875μg，PEI溶液45μl，DMEM(High Glucose)培养基1ml。按照DMEM(HighGlucose)培养基、质粒、PEI的顺序配置DNA混合物，混匀后静置。(备注：CD28z-CAR质粒上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示；4-1BB-CAR质粒上游引物如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；GD2-CAR质粒上游引物序列如SEQID No.8所示，下游引物序列如SEQ ID No.9所示)
3、静置15min后，每个培养皿均匀滴入1ml配置好的混合物，十字摇晃2-3次后放入37℃培养箱。
4、6-8h后换液，加入10ml DMEM完全培养基。
5、加完质粒48h后收第一批病毒，放在4℃保存，向培养皿补加7ml DMEM完全培养基。
6、加完质粒72h后收第二批病毒。
7、离心参数设置为400g、10min，离心，去除细胞碎片。
8、用0.45μm黄色滤膜过滤，超速落地离心机离心，离心机参数设置为25000rpm、3h、4℃。
9、倒去上清，加RPMI 1640培养基浓缩100-200倍，在4度冰箱静置12h，每个EP管分装500μl，放置-80℃保存。
实施例2：CAR-T细胞的制备
1、取健康成年人外周血10ml至含EDTA采血管中，用滴管将血液转移到50ml离心管中，加入等体积的PBS溶液，混匀；
2、先取4ml Ficoll淋巴细胞分离液加入新的15mL离心管中，再用滴管轻轻加入等体积的血液样品；
3、离心，设置转速为400g，时长为30min，参数调为升4降0；
4、用移液枪吸取离心管中间部位的外周血单个核细胞组成的白膜层，吸到新的离心管中；
5、用PBS稀释到10ml洗涤，离心，转速为400g，时长10min，参数为升9降9；
6、离心后弃去上清，再加10ml PBS混匀计数，离心，转速为400g，时长10min，离心后弃去上清，用PBS溶液将细胞浓度调整为5×107个/ml，将细胞转移至流式管中；
7、使用EasySepTM人T细胞阴选试剂盒，按试剂盒标准量加入isolation cocktail，室温放置5min；
8、将试剂盒中rapid spheres预先斡旋震荡30s；
9、按试剂盒标准量加入rapid spheres beads，将总体积补充至2.5ml，混匀，室温静置3min；
10、将流式管放入小的磁力架中，静置1min，随后将获得的T细胞倒入一个新的15ml离心管中,混匀后计数；
11、离心，转速为300g，时长6min；弃去上清，用1.5ml基本培养基重悬混匀细胞沉淀；
12、取anti-CD3/CD28磁珠，以磁珠∶细胞＝3∶1的比例，计算用量；
13、吸取磁珠到新的15ml离心管，加入6ml RPMI 1640培养基清洗磁珠，将离心管放磁力架静置2min，用枪吸去废液，洗两次；
14、将1.5ml细胞加入15ml离心管中与磁珠混合后，转移至T25培养瓶底部，侧立在摇床上摇25min，100rpm，使T细胞和磁珠充分接触；
15、补加5ml基本培养基，37℃培养箱培养24h；
16、24h后算作CAR-T细胞的第1天，配置T细胞感染体系，按照每孔(1.5～2)×106个T细胞、每孔600μl体系配置，体系包含T细胞、实施例1中制备的病毒、polybrene、基本培养基，用基本培养基重悬T细胞，所用病毒体积使得病毒量为T细胞量的5倍，polybrene转染剂4.8mg，同时按照200U/ml IL-2和体积比10％FBS的浓度补足IL-2和FBS，体系中剩余体积用基本培养基补足。其中，基本培养基包括RPMI 1640培养基、体积比10％FBS、200U/ml IL-2、体积比1％青链霉素混合液(100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素)；
17、6h后离心换液，离心参数为300g，5min，用基本培养基以5×105/ml浓度培养；
18、第6、9、12天将细胞接种在6孔板，每个时间点实验分组：untransduced T细胞+等体积的DMSO组，CAR-T细胞+等体积的DMSO组，CAR-T细胞+500nM SF2523组，CAR-T细胞+1μM SF2523组，CAR-T细胞+3μM SF2523组对照组。各组分别设立3个复孔，每孔4ml。加药后每2-3天进行基本培养基换液，并在实验组中补加相应量的SF2523。将用SF2523处理过的CAR-T细胞称为S-CAR-T细胞，得到对照组CAR-T细胞和实验组S-CAR-T细胞。
实施例3：流式细胞术检测CAR-T细胞的亚群分布
1、从对照组和S-CAR-T组中分别取5×105个细胞，转移至流式管中，并加入1mlPBS，离心，设置参数为300g，5min；
2、去除上清，并加入1ml PBS清洗，再次离心，参数设为300g，5min；
3、去除上清后，每管加入100μl PBS，再加入抗体anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)各1μl，室温避光孵育20min；
4、20min后加入1ml PBS清洗抗体，离心，参数设为300g，5min，去上清；
5、加入300μl PBS重悬混匀细胞沉淀，流式细胞仪上机检测；设置每管获得20000个细胞，以CD62L和CD45RO双阳性作为Central Memory(TCM)的表型标准，分析TCM占比；CD62L阴性和CD45RO阳性性作为Effect Memory(TEM)的表型标准,分析TEM占比。
检测结果发现1μM SF2523处理的CAR-T细胞，TCM占比最高，且不同浓度S-CAR-T组的TCM占比都显著高于对照组的数值。结果参见图1的流式分析图，结果表明SF2523能有效提高CAR-T细胞中TCM的百分比，且在1μM浓度下SF2523升高CAR-T细胞中TCM的百分比最明显。
实施例4：流式细胞术检测CAR-T细胞的耗竭指标
1、从对照组和S-CAR-T组中分别取5×105个细胞，转移至流式管中，离心，设置参数为300g、5min；
2、去除上清，并加入1ml PBS清洗，再次离心，参数设为300g、5min；
3、去除上清后，每管加入100μl PBS，再加入抗体anti-human PD-1(APC)、anti-human LAG-3(PE-Cy7)各1μl，室温避光孵育20min；
4、加入1ml PBS清洗抗体，离心，参数设为300g，5min，去上清；
5、加入300μl PBS重悬后，流式细胞仪上机检测。设置每管获得10000个细胞，以PD1、TIM3、LAG3作为耗竭的表型标准，分析PD1、TIM3、LAG3的平均荧光强度(MFI)。
检测结果发现不同浓度SF2523都会降低耗竭指标，且1μM SF2523处理的CAR-T细胞耗竭表型最低。如图2的图A所示为流式分析图PD1指标的变化，图B所示为TIM3指标的变化，图C所示为LAG3指标的变化。以上结果表明SF2523能有效降低CAR-T细胞的耗竭指标数值，且在1μM浓度下降低CAR-T细胞的耗竭表型最明显。
实施例5：CAR-T细胞绝对数量计数及比例检测
1、在细胞培养第6天，取CAR-T细胞和untransduced T细胞，用Count Star全自动细胞计数仪进行计数，按5×105个/孔接种至6孔板中，每孔4ml，进行加药处理，实验分组为：untransduced T细胞+等体积的DMSO组，CAR-T细胞+等体积的DMSO组和CAR-T细胞+1μMSF2523组，在37℃细胞培养箱中培养。
2、在培养3天后，分别将六孔板中的各组细胞悬液混匀并吸取至15ml离心管中，离心，参数设置为300g，5min。后弃上清，各管分别加入1ml培养基重悬并混匀细胞沉淀，而后分别吸取20μl细胞悬液于96孔板中，加入20μl 0.8％台盼蓝进行稀释。取20μl稀释后的细胞悬液加入细胞计数板中用全自动细胞计数仪计数活细胞的数量三次，取平均值；计数后取1×106个细胞按照步骤1的实验分组重新加药，在37℃细胞培养箱中继续培养3天。
3、在3天后(加药处理6天)后，按照步骤2重复操作。
4、在加药处理9天后，按照步骤2重复操作。
5、在加药处理12天后，按照步骤2重复操作。
6、计算各组细胞扩增情况：CAR-T细胞扩增倍数＝CAR-T细胞数量/初始细胞数量。
检测结果显示1μM SF2523显著促进CAR-T细胞增殖。如图3增殖曲线显示随着时间的推移，SF2523能持久性的促进CAR-T细胞增殖。
实施例6：Nalm6细胞刺激CAR-T细胞耗竭模型制备
1、将5×106个不经任何处理的CAR-T细胞接种到T25培养皿中，将细胞密度调整为1×106个/ml；再向培养中加入5×106个Nalm6细胞(带GFP荧光)，用基本培养基将体积补足使总体积至10ml，在37℃培养箱中培养48h。
2、培养48h后从该T25培养皿中取5×105个细胞，转移至流式管中，并加入1mlPBS，离心，设置参数为300g，5min。
3、去除上清，该流式管中加入300μl PBS重悬后，流式细胞仪上机检测；设置每管获得20000个细胞，以FITC阳性比例作为Nalm6细胞(带GFP荧光)是否仍存活的标准，以此反映CAR-T细胞杀伤能力(具有正常杀伤能力的CAR-T细胞与Nalm6细胞共培养24h后，将Nalm6细胞全部杀光)，实验确定48h后FITC阳性比例为0，判定Nalm6细胞全部杀光。
4、Nalm6细胞刺激CAR-T细胞耗竭模型制备成功后，将CAR-T细胞等分为两份，分别加入(与溶解SF2523相同体积)DMSO和1μM SF2523处理3天后进行流式细胞术检测，按照实施例3和实施例4进行流式细胞仪检测，分析对照组与实验组对Nalm6细胞刺激CAR-T细胞耗竭模型的亚群分布和耗竭表型的作用。
检测结果发现即使在制备的Nalm6细胞刺激CAR-T细胞耗竭模型中，1μM SF2523处理的CAR-T细胞TCM比例显著高于对照组的数值，参见图4的流式分析图，结果表明与对照组相比，SF2523能显著提高已耗竭CAR-T细胞中TCM的百分比。在已制备Nalm6细胞刺激CAR-T细胞耗竭模型中，经过1μM SF2523处理的已耗竭CAR-T细胞，其耗竭表型与对照组相比降低显著。说明1μM SF2523处理能部分逆转CAR-T细胞耗竭状态。如图5的图A所示为流式分析图PD1指标的变化，图B所示为TIM3指标的变化，图C所示为LAG3指标的变化。以上结果表明SF2523处理能有效降低已耗竭CAR-T细胞的耗竭指标数值。
实施例7：GD2高表达的CAR-T耗竭模型制备
1、按照实施例1制备病毒。在配置质粒公共体系时，规格为每个10cm培养皿中加入目的质粒(GD2)7.5μg，psPAX2质粒5.625μg，pMD2.G质粒1.875μg，PEI溶液45μl，DMEM(HighGlucose)培养基200μl。按照DMEM(High Glucose)培养基、质粒、PEI的顺序配置DNA混合物。
2、按照实施例2制备GD2-CAR-T细胞。
3、取untraduced T细胞和制备好的GD2-CAR-T细胞，实验分组为：untransduced T细胞+等体积的DMSO组，GD2-CAR-T细胞+等体积的DMSO组和GD2-CAR-T细胞+1μM SF2523组。各组分别设立3个复孔，每孔4ml。在培养箱培养3天后，按照实施例3和实施例4进行流式细胞仪检测，分析GD2-CAR-T细胞经过SF2523处理后的亚群分布和耗竭表型。
检测结果发现在GD2-CAR-T耗竭模型中，1μM SF2523处理的GD2-CAR-T细胞TCM占比显著高于对照组的数值，参见图6的流式分析图，结果表明与对照组相比，SF2523能显著提高已耗竭GD2-CAR-T细胞中TCM的百分比。已耗竭GD2-CAR-T细胞经过1μM SF2523处理，与对照组相比，耗竭表型降低显著。1μM SF2523处理能部分逆转GD2-CAR-T细胞耗竭状态。如图7的图A所示为流式分析图PD1指标的变化，图B所示为TIM3指标的变化，图C所示为LAG3指标的变化。以上结果表明SF2523处理能显著降低已耗竭GD2-CAR-T细胞的耗竭指标数值。
实施例8：Annexin V凋亡流式检测
1、按照实施例1和实施例2制备CD19-CD28z-CAR-T细胞、CD19-4-1BB-CAR-T细胞、GD2-CD28z-CAR-T细胞。
2、取untransduced T细胞和制备好的CAR-T细胞，实验分组为：untransduced T细胞+等体积的DMSO组，CAR-T细胞+等体积的DMSO组和CAR-T细胞+1μM SF2523组。各组分别设立3个复孔，每孔4ml。在37℃细胞培养箱中培养3天。
3、培养3天后，每管取5×105个细胞，加入1ml PBS离心,参数设置为300g，5min。弃去上清，每管加入100μ1×Annexin V binding buffer重悬。
4、重悬细胞后，每管加入1.5μl Annexin V APC抗体，放置4℃冰箱，避光染色30min。
5、染色结束后加入200μl 1×Annexin V binding buffer，用枪头混匀细胞后流式细胞仪上机检测，检测Annexin V阳性细胞比例，以此反映凋亡情况。
检测结果如图8所示，对于CD19-CD28z-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组凋亡百分比显著低于对照组(如图8A)；对于CD19-4-1BB-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组凋亡百分比显著低于对照组(如图8B)；对于GD2-CD28z-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组凋亡百分比显著低于对照组(如图8C)。综上，在不同CAR-T细胞中，SF2523显著降低了Annexin V阳性比例，有效抑制CAR-T细胞凋亡，对改善CAR-T细胞状态有促进作用。
实施例9：Bright-GloTM Luciferase Assay system检测CAR-T细胞的杀伤功能
1、按照实施例1和实施例2制备CD19-CD28z-CAR-T细胞、CD19-4-1BB-CAR-T细胞、GD2-CD28z-CAR-T细胞。
2、取untransduced T细胞和制备好的CAR-T细胞，实验分组为：untransduced T细胞+等体积的DMSO组，CAR-T细胞+等体积的DMSO组和CAR-T细胞+1μM SF2523组。
3、向96孔板中每孔中加入浓度为1×105个/mL的Nalm6细胞100μL，将CAR-T(DMSO)和1μM的SF2523处理3天后的S-CAR-T细胞浓度调整至1×105个/mL，按照已有Nalm6细胞数量和对应效靶比(E∶T＝1：1；1：15；1：30)每孔加入不同体积的CAR-T细胞体系，在37℃培养箱中培养16h。
2、16h培养结束后离心，转速为300×g，时长10min；同时将萤光素酶检测系统的底物放置室温避光溶解；离心结束后弃掉上清，加50μL PBS重悬细胞，混匀后转移到OPAQUE黑板中，再加入50μL底物；
3、在酶标仪上选择luminescence通道，时长设置为1000ms，选择自动混匀5s，选择板型为OPAQUE。由于活肿瘤细胞数量与荧光值成正相关，计算各组细胞杀伤情况：杀伤肿瘤细胞百分比＝(Nalm6细胞荧光读值-CAR-T细胞荧光读值)/Nalm6细胞荧光读值。
结果如图9所示，对于CD19-CD28z-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组杀伤效果显著高于对照组(如图9A)；对于CD19-4-1BB-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组杀伤效果显著高于对照组(如图9B)；对于GD2-CD28z-CAR-T细胞，1μM SF2523处理的实验组杀伤效果显著高于对照组(如图9C)。综上，在不同CAR-T细胞中，SF2523显著杀伤肿瘤的效率，有效提高肿瘤杀伤能力。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种增强CAR-T细胞功能的培养基及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1464
<212> DNA
<213> CD19-CD28z-CAR人工序列(Unknow)
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatttctgg gtgctggtcg ttgtgggcgg cgtgctggcc 960
tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc atcatctttt gggtgaggag caagcggagc 1020
agactgctgc acagcgacta catgaacatg accccccgga ggcctggccc cacccggaag 1080
cactaccagc cctacgcccc tcccagggat ttcgccgcct accggagcag agtgaagttc 1140
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
ttcgaattcg ccgccaccat ggcctt 26
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
cggtctagat tactacttgt acagctcgtc c 31
<210> 4
<211> 1458
<212> DNA
<213> CD19-41BB-CAR人工序列(Unknow)
<400> 4
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgc 1458
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
atggccttac cagtgaccgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 6
tgcaggccct gccccctcgc 20
<210> 7
<211> 1479
<212> DNA
<213> CD19-GD2-CAR人工序列(Unknow)
<400> 7
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggatattt tgctgaccca aactccactc tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc 120
tccatctctt gcagatctag tcagagtctt gtacaccgta atggaaacac ctatttacat 180
tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aagctcctga ttcacaaagt ttccaaccga 240
ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 300
atcagcagag tggaggctga ggatctggga gtttatttct gttctcaaag tacacatgtt 360
cctccgctca cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aacgggctga tgctgcacca 420
actgtatcca tcttcccagg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcgaggt gaagcttcag 480
cagtctggac ctagcctggt ggagcctggc gcttcagtga tgatatcctg caaggcttct 540
ggttcctcat tcactggcta caacatgaac tgggtgaggc agaacattgg aaagagcctt 600
gaatggattg gagctattga tccttactat ggtggaacta gctacaacca gaagttcaag 660
ggcagggcca cattgactgt agacaaatcg tccagcacag cctacatgca cctcaagagc 720
ctgacatctg aggactctgc agtctattac tgtgtaagcg gaatgaagta ctggggtcaa 780
ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgatt tctgggtgct ggtcgttgtg 960
ggcggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtgacagtgg ccttcatcat cttttgggtg 1020
aggagcaagc ggagcagact gctgcacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 1080
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggatttcgc cgcctaccgg 1140
agcagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1479
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 8
atggccttac cagtgaccgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 9
tgcaggccct gccccctcgc 20

Claims (5)

1.一种增强CAR-T细胞功能的培养基，其特征在于，由基本培养基和SF2523组成，其中SF2523的使用浓度为1μM，SF2523的分子式 C19H17NO5S，CAS号1174428-47-7，其中基本培养基为：10%体积比的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素以及200U/ml的白介素2，余量为RPMI 1640培养基。
2.权利要求1所述的培养基在非治疗目的CAR-T细胞的构建及培养中应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CAR-T细胞的构建及培养通过以下步骤实现：
（1）分离制备CAR-T细胞所需的T细胞；
（2）构建用于表达CAR基因序列的慢病毒载体，将所述慢病毒载体在转染剂存在的条件下对步骤（1）中的T细胞转染，制成CAR-T细胞，转染剂为聚凝胺；在培养全程所述CAR-T细胞在培养基中的浓度为1-10×105个/mL；
（3）对步骤（2）制备的CAR-T细胞进行培养，在培养的第1-6天使用基本培养基，在培养的第6~12天使用权利要求1所述培养基。
4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于，所述CAR-T细胞在培养基中的浓度为5×105个/mL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，对CAR-T细胞培养时间12-15天，每1~3天更换一次权利要求1所述培养基。
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CN113943710A (zh) * 2021-09-17 2022-01-18 浙江大学医学院附属第一医院 一种car-t细胞培养用的培养基及其应用

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