CN114921496B - 一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用。本发明中所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建成本低，构建成功率高，NK细胞表达稳定，能更好的发挥ADCC作用。本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体的NK细胞，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞能分泌靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体和细胞因子IL15，将本发明中表达IL15的CAR‑NK细胞接种免疫缺陷动物，得到具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型，所述动物模型在人类免疫、癌症和传染病等领域中，在研究人自然杀伤细胞的功能和调节中具有重要应用前景。

Description

一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构 建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫系统发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。
人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物直接的巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。因此，急需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫系统人源化小鼠便应运而生。免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人造的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫系统及其免疫应答的重要工具。
在人类免疫、癌症、传染病和其他领域的研究中，非常需要人自然杀伤(NK)细胞和其他白介素15(IL15)依赖性细胞群体和过程的功能和调节的小鼠模型。人的NK细胞在体内介导针对人类肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。然而，由于缺乏IL15，所以难以研究人NK细胞在癌症免疫治疗中的体内作用。人IL15是成熟的人功能性NK细胞的体内发育和存活所需要的细胞因子，且小鼠IL15不支持人NK细胞的发育，IL15由包括骨髓基质细胞的多种细胞类型产生。
目前具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠构建有2种方式，方法1：在表达白介素15的免疫缺陷小鼠，注射CD34阳性的造血细胞、淋巴细胞。方法2：在免疫缺陷小鼠，注射CD34阳性的造血细胞、淋巴细胞，人工补充外源性细胞因子IL15。这2方式有2个缺点；其一，构建成本高，模型构建成功率低；其二，NK表达不稳定，存续窗口期短。
因此，提供一种表达IL15的CAR-NK细胞并接种免疫缺陷动物，建立一种用于评估NK细胞介导的ADCC的动物模型系统，在人类免疫、癌症和传染病等领域中研究人自然杀伤(NK)细胞的功能和调节具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用。本发明中所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建成本低，构建成功率高，NK细胞表达稳定，能更好的发挥ADCC作用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括慢病毒载体骨架，和连接在所述慢病毒载体骨架上的靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列；
所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；
所述细胞因子包括IL15。
优选地，所述胞外结构域包括CD8a信号肽、特异性结合CD19的单链抗体和CD8铰链区。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜区。
优选地，所述胞内结构域包括共刺激域和信号传导域。
优选地，所述共刺激域包括4-1BB。
优选地，所述信号传导域包括CD3ζ。
优选地，所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列由CD8a信号肽、特异性结合CD19的单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB、CD3ζ、T2A连接肽和IL15表达区的基因序列依次串联构成。
CAR是将能特异性识别靶抗原(如CD19)的抗原结合结构域与能够激活或者刺激免疫细胞的胞内信号转导结构融合的嵌合蛋白。一般来说，CAR包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在本发明中，胞外结构域包括特异性结合CD19的单链抗体(scFV)、CD8a信号肽和CD8铰链区。铰链区通常衍生自CD8或IgG4分子，用其连接细胞内和细胞外蛋白。在本发明中，发明人使用衍生自CD8的CD8 Hinger。
在本发明中，跨膜结构域是连接CAR的胞外结构和胞内结构域的结构，在本发明中使用的是CD28跨膜区。
在本发明中，采用的CAR胞内结构域是胞内信号传导结构域，所述胞内结构域将CD19CAR结合到人CD19的信息传导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能(如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性)。所述CAR的胞内结构域包含胞内信号传导结构域和多个共刺激分子。
人白细胞介素15(interleukin-15，IL15)IL15是一种多效性细胞因子，具有激活T细胞、B细胞和NK细胞，可介导上述细胞的增殖和存活的功能。NK细胞若无IL15等细胞因子持续支持，则成活时间非常短暂。
优选地，所述特异性结合CD19的单链抗体的编码序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述CD8a信号肽的编码序列包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
优选地，所述CD8铰链区的编码序列包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
优选地，所述CD28跨膜区的编码序列包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
优选地，所述4-1BB的编码序列包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
优选地，所述CD3ζ的编码序列包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
优选地，所述T2A连接肽的编码序列包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
优选地，所述IL15表达区的编码序列包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
优选地，所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列包括SEQ IDNo.9所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：
caggctgtgctgactcagccaccctcggtgtctgaagcccccaggcagagggtcaccatctcctgttctggaagcagctccaacatcggaaataatgctgtaagctggtaccagcagctcccaggaaaggctcccaaactcctcatctattatgatgatctgctcccctcaggggtctctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgaatggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgaggaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgcgcctgtcttactcttggtcttcttggtactgggatttctggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctca。
SEQ ID No.2：
atggccctgcctgtgacagctctgctcctccctctggccctgctgctccatgccgccagaccc。
SEQ ID No.3：
ttcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctactactacccctgcacctaggcctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgac。
SEQ ID No.4：
atctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaac。
SEQ ID No.5：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。
SEQ ID No.6：
agagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga。
SEQ ID No.7：
gagggaaggggcagcttattaacatgtggcgatgtggaagagaaccccggtccc。
SEQ ID No.8：
atgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttcttga。
SEQ ID No.9：
caggctgtgctgactcagccaccctcggtgtctgaagcccccaggcagagggtcaccatctcctgttctggaagcagctccaacatcggaaataatgctgtaagctggtaccagcagctcccaggaaaggctcccaaactcctcatctattatgatgatctgctcccctcaggggtctctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgaatggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgaggaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgcgcctgtcttactcttggtcttcttggtactgggatttctggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcaatggccctgcctgtgacagctctgctcctccctctggccctgctgctccatgccgccagacccttcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctactactacccctgcacctaggcctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaggatccggagagggaaggggcagcttattaacatgtggcgatgtggaagagaaccccggtcccatgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtaca。
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第一方面所述的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞制备得到。
优选地，所述包装质粒包括pMD2.BaEVRless辅助质粒、pRSV-Rev辅助质粒和pMDLg/pRRE辅助质粒。
优选地，所述病毒包装细胞包括293T细胞。
第三方面，本发明提供一种表达嵌合抗原受体的NK细胞，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞能分泌靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体；
所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的基因组中含有第一方面所述的靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体编码序列和/或所述表达嵌合抗原受体的NK细胞中含有第二方面所述的重组慢病毒。
IL15具有广泛的免疫调节活性，能够参与调节多种免疫细胞的存活、增殖与功能，其中包括NK细胞、记忆性CD8+T细胞和NKT细胞等。
IL15在NK细胞的活化与增殖中起着重要作用。在IL15及IL15R基因敲除的小鼠体内，NK细胞的数目都不同程度的减少，而在过表达IL15的小鼠体内，NK细胞的数目则明显增加，并能增强小鼠的免疫反应。
第四方面，本发明提供一种第三方面所述的表达嵌合抗原受体的NK细胞的制备方法，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)构建第一方面所述的慢病毒表达载体；
(2)将步骤(1)中的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
(3)将步骤(2)中的重组慢病毒导入NK细胞中，制备表达嵌合抗原受体的NK细胞。
优选地，步骤(3)中，所述重组慢病毒的MOI为4～5，例如可以是4、4.5或5等。
第五方面，本发明提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
(1)将表达靶抗原的细胞接种到免疫缺陷动物体内；
(2)将第三方面所述的表达嵌合抗原受体的NK细胞接种到步骤(1)中所得的动物体内。
优选地，步骤(1)中，所述表达靶抗原的细胞接包括表达CD19的细胞。
优选地，步骤(1)中，所述表达靶抗原的细胞的接种剂量为(1～5)×105/动物，例如可以是1×105、2×105、3×105、4×105或5×105等。
优选地，步骤(1)中，所述动物包括小鼠。
优选地，步骤(2)中，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的接种剂量为(1～2)×107/动物，例如可以是1×107、1.5×107或2×107等。
优选地，所述构建方法还包括鉴定步骤，所述鉴定步骤包括：
检测动物模型外周血中所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的占比。
接种表达嵌合抗原受体的NK细胞1～6周后(例如可以是1、3、5或6等)，采集所述具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的外周血，采用流式检测所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的占比，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞占总细胞的10％以上(例如可以是10％、15％或20％等)，则造模成功。
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity ADCC)是抗体的重要特性，一般由自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)完成杀伤，也可通过巨噬细胞进行杀伤。通过ADCC效应，不仅可以进行直接杀伤，而且被杀伤的细胞释放抗原进而激活获得性免疫。因此ADCC不仅能够直接杀伤细胞，而且调动了天然免疫的调理作用，作用机制更多样，对于实体瘤的治疗具有更重要的实际意义。
第六方面，本发明提供一种药效评价装置，所述药效评价装置采用第五方面所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法构建得到的动物模型进行药效评价，所述药效评价装置包括：
(1)靶细胞接种模块：将靶细胞接种到构建的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型中；
(2)给药模块：对接种了靶细胞的动物模型进行给药处理，评价药物治疗效果。
第七方面，本发明提供第六方面所述的药效评价装置在评价药物治疗效果中的应用。
第八方面，本发明提供第一方面所述的慢病毒表达载体、第二方面所述的重组慢病毒、第三方面所述的表达嵌合抗原受体的NK细胞、第四方面所述的表达嵌合抗原受体的NK细胞的制备方法、第五方面所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法或第六方面所述的一种药效评价装置中任意一种或至少两种的组合在免疫系统发育分化及功能研究中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中所述具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型构建成本低，构建的成功率高。
(2)本发明中所述NK细胞能稳定表达嵌合抗原受体和细胞因子IL15，存续窗口期长。
(3)本发明中所述具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型能更好的发挥ADCC作用，在药效评价中具有重要应用价值。
附图说明
图1是实施例3中CAR-NK细胞检测结果图。
图2A是测试例2中CAR-NK细胞对阳性靶细胞Raji ffluc体外杀伤结果图。
图2B是测试例2中CAR-NK细胞对K562MHC低表达的细胞体外杀伤结果图。
图2C是测试例2中CAR-NK细胞对阴性靶细胞Raji ko CD19体外杀伤结果图。
图3A是测试例3中脱颗粒实验的流程缩略图。
图3B是测试例3中流式结果分析的划门策略。
图3C是测试例3中流式结果分析图。
图3D是测试例3中CD107a的流式检测结果统计图。
图4A是测试例4中细胞因子分泌检测流程缩略图。
图4B是测试例4中Elisa检测结果统计图。
图5A是测试例5中CAR-NK细胞的体外ADCC功能验证流程缩略图。
图5B是测试例5中CAR-NK细胞的体外ADCC功能验证流式结果分析的划门策略。
图5C是测试例5中CAR-NK细胞的体外ADCC功能验证流式结果分析图。
图5D是测试例5中CAR-NK细胞的体外ADCC功能验证流式结果的统计图。
图6A是实施例4中NK小鼠模型建立的流程缩略图。
图6B是实施例4中NK小鼠模型的体外生物发光成像结果图。
图7A是实施例4中CAR-NK接种后D20小鼠外周血流式结果分析图。
图7B是实施例4中具有NK细胞的免疫缺陷小鼠外周血流式结果的统计分析图。
图8A是实施例5中具有NK细胞的免疫缺陷小鼠接种SKOV3细胞后肿瘤体积生长曲线。
图8B是实施例5中具有NK细胞的免疫缺陷小鼠药效评价结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
293细胞：厂商takara，货号F5881；
DMEM培养基：厂商：Thermo，货号：C11995500BT；
X-VIVO：厂商：Lonza，货号：BEBP02-054Q；
PEI：厂商：Polysciences，货号：23966；
Trypsin-EDTA(0.25％)：厂商：Gibco，货号：25200-056；
PE-Labeled Human CD19(20-291)Protein，Fc Tag：厂商：ACRO，货号：CD9-HP2H3；
TrypLE(TM)Express：厂商：Gibco，货号：12604-021；
Lymphocyte Serum-Free Medium KBM581：厂家：Corning，货号：88-581-CM；
NK Cell Isolation Kit，human：厂家：Miltenyi，货号：130-092-657；
IL21 NK细胞扩增试剂(滋养细胞)：厂家：中赢生物，货号：ZY-NKJ-1000；
CryoStor CS10：厂家Stemcell，货号：210102；
AF488 mouse anti-human CD56：厂家：BD，货号：557699；
BV510 Mouse Anti-Human CD3：厂家：BD，货号：563109；
APC anti-human CD69 Antibody：厂家：Biolegend，货号：310910；
Pacific BlueTM anti-human CD159a(NKG2A)Antibody：厂家：Biolegend，货号：375104；
Monensin：厂商：Biolegend，货号：42701；
PE/Cy7 mouse anti-human CD107a：厂商：BD，货号：561348；
BV510 Mouse Anti-Human CD3：厂商：BD，货号：563109；
Trypsin-EDTA(0.25％)：厂商：Gibco，货号：25200-056；
APC-mouse anti-huaman Her2：厂商：Biolegend，货号：324408；
Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution)：厂商：Biolegend，货号：422302；
7AAD：厂商：BD，货号：559925；
赫赛汀曲妥珠单抗：厂商：ROCH。
实施例1
慢病毒表达载体的构建
pLVX EF1a-IRES-Puro载体(购自淼灵质粒平台)含有产生慢病毒所需相关元件，以及能提高病毒滴度和增加转基因表达的元件。
(1)按以下编码基因的顺序设计融合基因片段：CD8a信号肽、CD19scFV、CD8Hinger、CD28跨膜区和4-1BB胞内共刺激域、CD3ζ胞内信号结构域、T2A连接肽、IL15；并且两端分别设计有EcoR1和M1uI限制性内切酶酶切位点。所述融合基因片段由金斯瑞生物科技公司进行基因合成。所述IL15是购自义翘生物，通过T2A连接肽连接构成。将合成的基因片段亚克隆到pLVX-EF1a-IRES-Puro载体的EcoR1和M1uI限制性内切酶的酶切位点，然后将产物转化入stabl3感受态细胞中，通过氨苄青霉素(Ampicilin，Amp)筛选出阳性菌落。挑取阳性菌落送生工测序，将序列正确的菌落抽提质粒，将质粒命名为“2219”，所述质粒中靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID No.9所示。
(2)将pMD2.BaEVRless辅助质粒转入stable3感受态细胞，参照步骤(1)中筛选菌落和抽提质粒的方法，获得满足慢病毒制备需求量且序列正确的pMD2.BaEVRless辅助质粒，将质粒命名为“2427”。
(3)将pRSV-Rev辅助质粒转入stable3感受态细胞，参照步骤(1)中筛选菌落和抽提质粒的方法，获得满足慢病毒制备需求量且序列正确的pRSV-Rev辅助质粒，将质粒命名为“1266”。
(4)将pMDLg/pRRE辅助质粒转入stable3感受态细胞，参照步骤(1)中筛选菌落和抽提质粒的方法，获得满足慢病毒制备需求量且序列正确的pMDLg/pRRE辅助质粒，将质粒命名为“1267”。
SEQ ID No.9：
caggctgtgctgactcagccaccctcggtgtctgaagcccccaggcagagggtcaccatctcctgttctggaagcagctccaacatcggaaataatgctgtaagctggtaccagcagctcccaggaaaggctcccaaactcctcatctattatgatgatctgctcccctcaggggtctctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgaatggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgaggaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgcgcctgtcttactcttggtcttcttggtactgggatttctggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcaatggccctgcctgtgacagctctgctcctccctctggccctgctgctccatgccgccagacccttcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctactactacccctgcacctaggcctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaggatccggagagggaaggggcagcttattaacatgtggcgatgtggaagagaaccccggtcccatgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtaca。
实施例2
嵌合抗原受体慢病毒的制备
慢病毒是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力，并可以在细胞内较长时期表达。本实施例使用的慢病毒是“自杀性”病毒，即病毒感染目的细胞后不再会感染其它细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
嵌合抗原受体慢病毒制备的步骤如下：
(1)取实施例1中抽取的质粒，将载体质粒2219与辅助质粒按比例混合，共转293T细胞。
(2)待293T细胞产生病毒48h后，收集含有病毒的细胞培养液，于4℃，3000g离心5min。
(3)将上清经0.45μm滤器过滤，并将过滤液在4℃，30000g离心3h，弃上清。
(4)用预冷的x-vivo重悬沉淀，即获得2219慢病毒浓缩液，于-80℃保存备用。
测试例1
对实施例2所得嵌合抗原受体慢病毒进行活性滴度检测
PE-Labeled Human CD19(20-291)Protein，His Tag(购自ACRO)上面标记有荧光素，而它能与CD19scFV结合。通过流式细胞仪检测到荧光信号可间接反映慢病毒载体编码的CAR在293T细胞中的表达情况，鉴定出被慢病毒成功侵染的阳性细胞，并根据阳性细胞的占比计算出慢病毒的活性滴度数据。
慢病毒活性滴度检测的实验步骤：
(1)在96孔板中接入293T细胞(1×104细胞/孔)，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.02μL、0.1μL、0.5μL和1μL，并设一个不加慢病毒浓缩液的阴性对照。将96孔板置于37℃含5％CO2的培养箱内培养；
(2)48h后，用Versense溶液(购自Gibco)收集293T细胞；
(3)用PE-Labeled Human CD19(20-291)Protein，His Tag染色后，采用流式细胞仪检测，用Flowjo分析CAR阳性细胞比例；
(4)根据公式：慢病毒活性滴度(TΜ/mL)＝293T细胞数×CAR阳性比例(％)/慢病毒加入量(μL)×1000，计算所述2219慢病毒浓缩液的活性滴度。
实施例3
制备表达嵌合抗原受体的NK细胞
CAR-NK细胞的制备步骤如下：
(1)从健康受试者采集单采血进行NK细胞的分离(分离所用的试剂盒购自美天旎NK阴选Kit)。
(2)用NK完全培养基(Lymphocyte Serum-Free Medium KBM581+2％HPL+5％SR)重悬分离的NK细胞，按说明书中加入Feeder cell(购自中赢)，置于合适的培养容器，在5％CO2浓度的培养箱中培养。
(3)第二天慢病毒转导，按MOI＝5接种；病毒加入后用移液器将细胞吹打混匀，置于5％CO2浓度的培养箱中培养。
(4)在第三天离心换液，400g，室温离心5min后，向弃上清的细胞沉淀加NK完全培养基；
(5)第七天计数添加Feeder cell，Feeder cell:NK＝1:2，加液使总细胞(含Feeder cell细胞)浓度在1e6cells/mL；当培养体积大于200mL则转移至G-rex培养瓶中培养；第10天取样进行QC检测，转效及NK纯度检测，第9～13天每天观察细胞状态，根据培养基颜色及细胞密度补液；第15～16天为细胞收集最佳时间，将收集的细胞(CD19-CAR-NK细胞)冻存，冻存前复测转效及NK纯度，测试结果如图1所示。
测试例2
CAR-NK细胞(CD19-CAR-NK细胞)的体外功能实验
为了验证实施例3制备的CD19-CAR-NK在体外对靶细胞的杀伤作用，设计展开如下实验：证明CD19CAR-NK特异杀伤CD19阳性细胞。
体外细胞杀伤实验采用Raji为CD19阳性靶细胞，Raji Ko CD19作为CD19阴性靶细胞，进行CAR-NK细胞的抗原特异性杀伤能力评价。其中，以上细胞分别通过慢病毒转导方式，获得稳定表达萤火虫荧光素酶的靶细胞，因此样品中荧光素酶的活性可以反映靶细胞的数量。将CAR-NK细胞和靶细胞共孵育培养。当靶细胞被CAR-NK细胞杀伤时，萤火素酶被释放并且很快失活(萤火虫荧光素酶半衰期约0.5h)。如果靶细胞没有被CAR-NK细胞杀伤或者抑制，随着靶细胞的扩增和荧光素酶的持续表达，将会产生更多的荧光素酶。因此，可以通过荧光素酶的活性来检测CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤情况。
体外细胞杀伤的步骤如下：
(1)将Raji细胞和Raji Ko CD19细胞分别在室温下以300g离心5min,弃上清后，用NK细胞培养基重悬为2×105细胞/mL；在96孔板的每孔中分别加入100μL靶细胞；
(2)根据待测CAR-NK样品的CAR阳性率和效靶比，分别在96孔板的每孔中加入100μL CAR-NK细胞，并和靶细胞混匀，然后放入二氧化碳培养箱中孵育培养6h；
(3)使用荧光素酶检测试剂盒分别检测每孔样品中荧光素酶活性。
将CAR-NK细胞样品和固定数量的靶细胞(1×104个)分别按照效靶比(5:1、2.5:1、1.25:1和0.625:1)的比例混合后，共孵育6h，然后检测样品中的荧光素酶活性(RLU)。其中control(对照)为只含有靶细胞的对照样品。由于荧光素酶活性可以反映靶细胞在样品中数量，通过样品中荧光素酶活性的变化，可以得到CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤/抑制能力。荧光素酶活性读数(RLU)越低，靶细胞被杀伤的越多。
结果如图2A、图2B和图2C所示，阳性靶细胞Raji ffluc和CAR-NK细胞共培养6h后，检测靶细胞荧光素酶的活性来指正CAR-NK对靶细胞的杀伤，结果如图2A所示，CAR-NK与阳性靶细胞Raji ffluc共孵育后能有效的杀伤，NK细胞与Raji ffluc共孵育基本没有杀伤。
K562MHC低表达的细胞和CAR-NK细胞共培养6h后，检测靶细胞荧光素酶的活性来指正CAR-NK对靶细胞的杀伤，结果如图2B所示，CAR-NK和NK细胞与MHC低表达的K562 ffluc细胞共孵育都具有有效的杀伤能力。
阴性靶细胞Raji ko CD19和CAR-NK细胞共培养6h后，检测靶细胞荧光素酶的活性来指正CAR-NK对靶细胞的杀伤，结果如图2C所示，CAR-NK和NK与阴选靶细胞Raji ko CD19ffluc共孵育后都没有杀伤。
测试例3
CAR-NK细胞CD107a脱颗粒实验
CD107a是细胞内微囊泡的标志物，当负载有颗粒酶的微囊泡与细胞膜融合后，细胞膜上的CD107a会增加，当用莫能霉素(Monensin，购自Biolegend)阻断其回收时，可以定量反映微囊释放的强度。当CAR-NK受靶细胞上靶抗原刺激后，会造成颗粒酶释放CD107a脱颗粒释放，并可通过流式检测CD107a的增加来判断NK细胞的激活情况，脱颗粒实验的流程缩略图如图3A所示。
CD107a脱颗粒的实验步骤：
(1)将待测的CAR-NK细胞和靶细胞分别在室温下以300g离心5min，弃上清后，用NK细胞培养基重悬为1×106细胞/mL；
(2)在96孔板中，分别加入100μL待测的CAR-NK细胞和100μL靶细胞，并混匀；
(3)每孔细胞中加入1μL PE/cy7 mouse anti-human CD107a抗体和0.2μL莫能霉素，然后放入细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育3h；
(4)孵育完成后，将96孔板离心，500g离心5min弃上清，用buffer(PBS+1％HSA)洗细胞2次；
(5)用100μL buffer重悬细胞，并分别加入1μL mouse anti-human CD56和5μLPE-Labeled Human CD19(20-291)Protein，His Tag，混匀后在冰上避光孵育20min；
(6)孵育完成后，用buffer洗细胞3次，用100μL buffer重悬后用流式细胞仪检测。
测试结果如下：
将所述慢病毒转导的方式获得的CAR-NK细胞在体外培养9～12天后进行CD107a脱颗粒实验。待检测的CAR-NK细胞、靶细胞、莫能酶素和CD107a抗体共孵育3h，CAR-NK细胞与靶细胞的细胞密度均为1×105细胞/mL。然后用CD56抗体、CD19-PE蛋白标记后，进行流式检测。在FSC:SSC散点图中选取活细胞门(P1)，去除细胞碎片；在P1门中的细胞，经过FSC-H:SSC-A分析选取单分散细胞门(P2)；然后，在P2门中进一步选取CD56阳性细胞(P3)；最好，在P3门分析CD19-PE染色呈阳性的细胞(即CAR阳性细胞)中CD107a阳性比例。
流式结果分析的划门策略如图3B所示，分析CD56阳性CD3阴性NK细胞的CD107a释放。
流式结果分析图如图3C所示，CD107a的流式检测结果统计图如图3D所示；图3C中左一列为CAR-NK/NK细胞与阳性靶细胞Raji共孵育下的CD107a释放，左二列为CAR-NK/NK细胞与阴性靶细胞Raji ko CD19共孵育下的CD107a释放，左三列为CAR-NK/NK细胞与MHC低表达的K562共孵育下的CD107a释放，左四列为对照组。
NK细胞在与阳性靶细胞Raji/阴性靶细胞Raji ko CD19共孵育都无法激活NK细胞的有效的CD107a转运，NK细胞在与MHC低表达的K562细胞共孵育能激活NK细胞有效的CD107a转运(图3C第一排)；CAR-NK细胞在与阳性靶细胞Raji共孵育能激活CAR-NK细胞的有效的CD107a转运，NK细胞在与MHC低表达的K562细胞共孵育能激活NK细胞有效的CD107a转运，CAR-NK细胞与阴性靶细胞Raji ko CD19共孵育不能激活CAR-NK细胞的CD107a转运(图3C第二排)，结果说明CAR-NK/NK对MHC低表达的K562细胞都具有CD107a转运，CAR-NK细胞能被阳性靶细胞激活后释放CD107a。
测试例4
细胞因子IL15的分泌检测
将待测的CAR-NK细胞和靶细胞分别在室温下以300g离心5min，弃上清后，用NK细胞培养基重悬为1×106细胞/mL；在96孔板中，分别加入100μL待测的CAR-NK细胞和100μL靶细胞，以效靶比1:1共孵育5h；取上清用Elias检测试剂盒检测IL15分泌。
本测试例的实验流程缩略图如图4A所示，用靶细胞对CAR-NK细胞进行激活，5h后检测IL15细胞因子释放。Elisa检测结果统计图如图4B所示，单独的NK细胞是没有本底的IL15细胞因子释放，NK细胞与K562共孵育也基本没有IL15细胞因子释放，因CAR载体上表达了IL15，单独的CAR-NK细胞本身具有IL15细胞因子释放，CAR-NK细胞与MHC低表达靶细胞K562共孵育后IL15的释放更高。CAR-NK细胞与阳性靶细胞Raji共孵育后IL15的释放最高。
测试例5
CAR-NK细胞的体外ADCC功能验证
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是抗体的重要特性，一般由自然杀伤细胞(NK细胞)完成杀伤，也可通过巨噬细胞进行杀伤。通过ADCC效应，不仅可以进行直接杀伤，被杀伤的细胞释放抗原进而激活获得性免疫。因此ADCC不仅能够直接杀伤细胞，而且调动了天然免疫的调理作用，作用机制更多样，对于实体瘤的治疗具有更重要的实际意义。因此，多数抗体药均采用具有ADCC效应的抗体分子。本测试例选用依赖ADCC作用发挥药效的抗Her2抗体赫赛汀，验证细胞系为Her2高表达细胞系SKOV3。
体外ADCC功能验证的实验步骤：
(1)培养靶细胞SKOV3，用含10％牛血清RPMI-1640培养基悬浮，取100μL/孔，5×105细胞/孔，加入96孔平底板。37℃，5％CO2培养24h。
(2)将实施例3制备的CAR-NK细胞用PBS洗涤，500g离心5min收集沉淀，用含10％FBS的RPMI-1640培养基悬浮，取100μL/孔，分别按CAR-NK:SKOV3比例为20:1、10:1和0.5:1加入96孔平底板中。
(3)赫赛汀抗体用含10％FBS的RPMI-1640培养基稀释成一系列工作浓度分别是10μg/mL和20μg/mL的赫赛汀抗体稀释液，和不加抗体的阴性对照；。
(4)将赫赛汀抗体稀释液加入步骤(2)中的96孔平底板中，置于5％CO2培养箱，37℃孵育24h，取出96孔板。
(5)将96孔板细胞先离心后弃上清，用PBS洗涤2次后，用胰酶消化细化，将细胞转入U底96孔板。
(6)用100μL buffer重悬细胞，先加入1μL Human TruStain FcXTM(Fc ReceptorBlocking Solution)室温避光孵育10min，加入1μL APC-mouse anti-human Her2抗体混匀后在冰上避光孵育20min。
(7)孵育完成后，用buffer洗细胞3次，用100μL buffer重悬，每孔加入2μL 7AAD抗体，室温避光放置10min后用流式细胞仪检测。
将所述通过慢病毒转导的方式获得的CAR-NK细胞在体外培养9～12天后进行ADCC实验。将SKOV3细胞铺板在96孔平底板中培养24h，将CAR-NK细胞、SKOV3靶细胞和赫赛汀抗体共孵育24h，CAR-NK细胞与SKOV3靶细胞的比例分别为20:1、10:1和5:1。然后用Fc抗体先block；再标记APC-Her2抗体后，最后再标记7AAD，进行流式检测。在FSC:SSC散点图中选取活细胞门(P1)，去除细胞碎片；在P1门中的细胞，经过FSC-H:SSC-A分析选取单分散细胞门(P2)；然后，在P2门中进一步选取Her2阳性细胞(P3)；最后在P2门分析7AAD阳性比例。分析结果如图5A、图5B、图5C和图5D所示。
图5A为本测试例的实验流程缩略图；靶细胞SKOV3先预铺板24h，加入不同比例的NK细胞，再加入不同浓度Trastuzumab抗体(曲妥珠单抗)24h后检测NK细胞介导ADCC抗体的杀伤能力；图5B为流式结果分析的划门策略；分析Her2+细胞的7AAD阳性比例；图5C为流式结果分析；左一列为NK:SKOV3＝20:1下不同浓度抗体情况下的杀伤细胞，左二列为NK:SKOV3＝10:1下不同浓度抗体情况下的杀伤细胞，左三列为NK:SKOV3＝5:1下不同浓度抗体情况下的杀伤细胞，左四列为NK:SKOV3＝0:1下不同浓度抗体情况下的杀伤细胞。图5D为本测试例流式结果的统计图。
实施例4
一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠模型的建立
(1)构建具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠模型
取5～6周免疫缺陷的NCG小鼠，尾静脉接种Nalm6-luci细胞，剂量为(1～5)×105细胞/鼠。接种的Nalm6-luci细胞只作为CAR-NK激活扩增的靶抗原。肿瘤生长和侵袭性进展通过体外生物发光成像进行定量。
Nalm6-Luci细胞接种后第三天对所有小鼠活体成像，挑选12只荷瘤均一的小鼠，对10只小鼠尾静脉注射CAR-NK细胞，注射剂量按CAR+细胞(1～2)×107细胞/鼠；2只小鼠不接种CAR-NK细胞作为对照组，具体分组如表1所示，共分成3组，G1组：Nalm6-luci+CAR-NK+SKOV3+赫赛汀；G2组：Nalm6-luci+CAR-NK+SKOV3；G3组：Nalm6-luci。因CAR-NK细胞上携带了自分泌IL15，经过1～6周的IL15刺激和CD19肿瘤抗原的刺激、分化和增殖后，分别在给CAR-NK细胞后第20天、第28天和第34天对小鼠成像，以观察肿瘤的信号强度。
表1
Figure BDA0003625671620000131
将CAR-NK细胞在体外培养9～12天后进行ADCC实验。将SKOV3细胞铺板在96孔平底板中培养24h，将CAR-NK细胞、SKOV3靶细胞和赫赛汀抗体共孵育24h，CAR-NK细胞与SKOV3靶细胞的比例分别为20:1、10:1和5:1。然后用Fc抗体先block；再标记APC-Her2抗体，最后再标记7AAD，进行流式检测。在FSC:SSC散点图中选取活细胞门(P1)，去除细胞碎片；在P1门中的细胞，经过FSC-H:SSC-A分析选取单分散细胞门(P2)；然后，在P2门中进一步选取Her2阳性细胞(P3)；最后在P2门分析7AAD阳性比例。
图6A为本实施例的实验流程缩略图；先接种靶细胞Nalm6-luci细胞，接种后D3(第三天)成像分组后接种CAR-NK细胞，D7接种SKOV3肿瘤细胞，D14后一周内注射3次赫赛汀抗体，期间不同时间点采集外周血检测NK细胞的扩增，及成像检测肿瘤负荷。动物实验分组如表1所示。图6B为成像结果图。第一行是肿瘤细胞接种D23，即CAR-NK细胞接种D20成像结果，G1组和G2组都是接种CAR-NK组基本没有肿瘤细胞，G3组未接种CAR-NK细胞，肿瘤负荷重；第二行是肿瘤接种后D32天即CAR-NK接种D29成像结果，未接种CAR-NK的G3组小鼠都死亡，G1和G2组接种CAR-NK基本没有肿瘤细胞；第三行是肿瘤接种后D39天即CAR-NK接种D36成像结果，G1和G2组接种CAR-NK基本没有肿瘤细胞。
(2)具有NK细胞的免疫缺陷小鼠的鉴定
CAR-NK细胞接种后1～6周，对所述具有NK细胞的免疫缺陷小鼠的外周血中人源NK细胞的占比进行流式检测。当外周血中人源NK细胞的占总细胞的10％以上，则认为造模成功。
具有NK细胞的免疫缺陷小鼠鉴定实验步骤：
分别在NCG小鼠接种CAR-NK后D6、D11、D15、D20、D28、D35和D42采集100μL外周血；将采集的100μL外周血加入1mL裂红液中，裂解15min；室温500g离心10min，弃上清；用500μL裂红液再次裂解10min；室温500g离心10min，弃上清。
用1mL Buffer重悬细胞，室温500g离心10min，弃上清；用300μL Buffer重悬细胞，先加入3μL Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution)室温避光孵育10min，再将细胞悬液分成3管：
管1：加入1μL PE-cy7-mouse anti-human CD56，1μL APC-mouse anti humanCD16，5μL PE-Labeled Human CD19(20-291)Protein，Fc Tag；
管2：加入1μL PE-cy7-mouse anti-human CD56抗体，1μL BV421-mouse anti-human NKG2A，1μL PE-mouse anti-human NKG2D抗体混匀后在冰上避光孵育20min；
管3：不加抗体做空白对照。
孵育完成后，用buffer洗细胞3次，用100μL buffer重悬每孔加入2μL 7AAD抗体，室温避光放置10min后用流式细胞仪检测。
通过采集不同时间点实验小鼠的外周血，裂红后先用Fc抗体block，标记NK细胞表达的抗体，进行流式检测。在FSC:SSC散点图中选取活细胞门(P1)，去除细胞碎片；在P1门中的细胞，经过FSC-H:SSC-A分析选取单分散细胞门(P2)；然后，在P2门中进一步选取CD56+CD16+阳性细胞(P3)；最后在P3门分析CAR阳性比例。分析结果如图7A和图7B所示。表2为鉴定实验的具体分组。
表2
Figure BDA0003625671620000141
Figure BDA0003625671620000151
图7A为采集G1组CAR-NK细胞接种后D20小鼠外周血流式结果分析。第一行是分析CD56+CAR+比例，结果显示5只小鼠重建后个体差异很小，CD56CAR双阳比例基本一致，均大于35％；第二行是分析CD56+CD16+比例，结果显示NK细胞基本是CD56CD16双阳，且NK细胞的比例均大于35％；第三行是分析CD56CD16双阳下，CAR+细胞的比例，CAR+比例均大于80％，说明存续的NK基本都是携带CAR的细胞，第四行是分析CD56CD16双阳下，NKG2A的比例，结果显示NK细胞上NKG2A都高表达。图7B为流式结果的统计分析图。
实施例5
具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠模型用于药效评价
在具有NK细胞的免疫缺陷小鼠的基础上，使用依赖ADCC杀伤功能的抗体，验证所述模型中NK细胞的功能。本实施例选用依赖ADCC作用发挥药效的抗Her2抗体赫赛汀，验证细胞系为Her2高表达细胞系SKOV3。
由于赫赛汀发挥药效高度依赖NK细胞参与的ADCC作用，在本实施例中可见，在缺乏NK细胞的小鼠中给予赫赛汀几乎没有药效，而在有NK细胞存在的小鼠中，其药效非常显著。可见，在具有NK细胞的免疫缺陷小鼠中存在有功能有活性的NK细胞，所述模型构建成功。
本实施例中的SKOV3细胞传代次数小于10次前收取细胞。将1×106的SKOV3细胞用200μL PBS重悬后，通过皮下注射接种于带有或不带有NK细胞的免疫缺陷小鼠中。当肿瘤生长到平均60～100mm3时，根据肿瘤大小和体重被随机分2组，进行一周三次的赫赛汀抗体注射(静脉注射)，一周测量2次SKOV3肿瘤体积，各组SKOV3肿瘤体积曲线如图8A和图8B所示。
图8A为在带有NK细胞的小鼠模型上接种SKOV3细胞后肿瘤体积生长曲线；结果显示，G1组(Nalm6-luci+CAR-NK+SKOV3+赫赛汀组)接种赫赛汀抗体后有明显抑瘤作用；G2组(未注射赫赛汀组)SKOV3肿瘤一直呈上升趋势；说明NK细胞具有介导赫赛汀抗体发挥杀伤的功能。图8B为在带有NK细胞的小鼠上评价ADCC药效学实验时，不同组小鼠的体重变化，结果显示，G1组(注射了赫赛汀抗体组)小鼠体重处于一个平稳状态，没有下降趋势，而G2组(未注射赫斯特抗体组)小鼠体重处于下降的趋势。说明赫赛汀本身毒性小，也说明赫赛汀抗体发挥药效作用。
综上，本发明中所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠模型的构建成本低，构建成功率高，NK细胞表达稳定，能更好的发挥ADCC作用。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 上海驯鹿生物技术有限公司
<120> 一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用
<130> 2022
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctgaagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60
tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taagctggta ccagcagctc 120
ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgatc tgctcccctc aggggtctct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta ggttctagag gtggtggtgg tagcggcggc 360
ggcggctctg gtggtggtgg atccctcgag gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag 420
gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttacc 480
agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc 540
atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc 600
tcagccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac 660
accgccatgt attactgtgc gcgcctgtct tactcttggt cttcttggta ctgggatttc 720
tggggtcaag gtactctggt gaccgtctcc tca 753
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
ccc 63
<210> 3
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgtgcccg tgttcctgcc cgccaaacct actactaccc ctgcacctag gcctcccacc 60
ccagccccaa caatcgccag ccagcctctg tctctgcggc ccgaagcctg tagacctgct 120
gccggcggag ccgtgcacac cagaggcctg gacttcgcct gcgac 165
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtgatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaac 84
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccccg agatgggcgg aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcgcggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagggaaggg gcagcttatt aacatgtggc gatgtggaag agaaccccgg tccc 54
<210> 8
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120
gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180
gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240
cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300
gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360
agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420
gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480
acttcttga 489
<210> 9
<211> 2048
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctgaagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60
tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taagctggta ccagcagctc 120
ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgatc tgctcccctc aggggtctct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta ggttctagag gtggtggtgg tagcggcggc 360
ggcggctctg gtggtggtgg atccctcgag gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag 420
gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggata cagctttacc 480
agctactgga tcggctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc 540
atctatcctg gtgactctga taccagatac agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc 600
tcagccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac 660
accgccatgt attactgtgc gcgcctgtct tactcttggt cttcttggta ctgggatttc 720
tggggtcaag gtactctggt gaccgtctcc tcaatggccc tgcctgtgac agctctgctc 780
ctccctctgg ccctgctgct ccatgccgcc agacccttcg tgcccgtgtt cctgcccgcc 840
aaacctacta ctacccctgc acctaggcct cccaccccag ccccaacaat cgccagccag 900
cctctgtctc tgcggcccga agcctgtaga cctgctgccg gcggagccgt gcacaccaga 960
ggcctggact tcgcctgcga catctacatc tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg 1020
ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac tgcaaccacc ggaacaaacg gggcagaaag 1080
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1140
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1200
ttcagcagat ccgccgacgc ccctgcctac cagcagggac agaaccagct gtacaacgag 1260
ctgaacctgg gcagacggga agagtacgac gtgctggaca agcggagagg ccgggacccc 1320
gagatgggcg gaaagcccag acggaagaac ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag 1380
aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg gaggcgcggc 1440
aagggccacg atggcctgta ccagggcctg agcaccgcca ccaaggacac ctacgacgcc 1500
ctgcacatgc aggccctgcc ccccagagga tccggagagg gaaggggcag cttattaaca 1560
tgtggcgatg tggaagagaa ccccggtccc atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt 1620
atttccatcc agtgctactt gtgtttactt ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc 1680
attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg 1740
gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt gaagatctta ttcaatctat gcatattgat 1800
gctactttat atacggaaag tgatgttcac cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc 1860
tttctcttgg agttacaagt tatttcactt gagtccggag atgcaagtat tcatgataca 1920
gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa 1980
tctggatgca aagaatgtga ggaactggag gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt 2040
tttgtaca 2048

Claims (11)

1.一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
（1）将表达靶抗原的细胞接种到免疫缺陷动物体内；
（2）将表达嵌合抗原受体的NK细胞接种到步骤（1）中所得的动物体内；
其中，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞表达靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体；
所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的基因组中含有所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列；
其中，所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、和胞内结构域；
并且，所述细胞因子为IL15，所述表达靶抗原的细胞为表达CD19的细胞；
并且，所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列由CD8a信号肽、特异性结合CD19的单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、T2A连接肽和IL15表达区的编码序列依次串联构成。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述特异性结合CD19的单链抗体的编码序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述CD8a信号肽的编码序列包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述CD8铰链区的编码序列包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
所述CD28跨膜区的编码序列包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述4-1BB的编码序列包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
所述CD3ζ的编码序列包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述T2A连接肽的编码序列包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和/或
所述IL15表达区的编码序列包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID No.9所示。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的制备方法包括如下步骤：
（i）构建慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括慢病毒载体骨架，和连接在所述慢病毒载体骨架上的所述靶向CD19共表达细胞因子的嵌合抗原受体的编码序列；
（ii）将步骤（i）中的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
（iii）将步骤（ii）中的重组慢病毒导入NK细胞中，制备表达嵌合抗原受体的NK细胞。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（iii）中，所述重组慢病毒的MOI为4~5。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述表达靶抗原的细胞的接种剂量为(1~5)×105/动物。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述动物是小鼠。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的接种剂量为(1~2)×107/动物。
9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括鉴定步骤，所述鉴定步骤包括：
检测动物模型外周血中所述表达嵌合抗原受体的NK细胞的占比。
10.一种药效评价方法，其特征在于，所述药效评价方法采用通过权利要求1-9中任一项所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法构建得到的动物模型进行药效评价，包括步骤：
（a）采用权利要求1-9中任一项所述的构建方法构建具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型；
（b）靶细胞接种步骤：将靶细胞接种到步骤（1）构建的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统动物模型中；
（c）给药步骤：对接种了靶细胞的动物模型进行给药处理，评价药物治疗效果；
其中，所述靶细胞为表达CD19的细胞。
11.如权利要求10所述的药效评价方法，其特征在于，所述药物为抗体药。
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