CN115397460A - 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 - Google Patents

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C·P·P·吉马拉斯
H·利姆
S·夏尔马
A·索霍尼
L·特雷纳
朱许
J·布罗格顿
S·卡尔博诺
G·德拉诺夫
M·R·格林
A·哈克
M·H·P·希尔德
O·考德拉斯
E·D·普拉蒂科
A·普赖斯
A·M·斯坦
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    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
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    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本披露提供了制备免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法以及通过此类方法生成的组合物，这些免疫效应细胞包含(i)编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的核酸分子或(ii)编码CAR和调节分子的核酸分子。

Description

制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
相关申请
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序列表
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技术领域
本披露总体上涉及制备经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及包含这些免疫效应细胞的组合物。
背景技术
使用T细胞(特别是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在几项血液癌症试验中显示出前景。目前，基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程。存在对改善表达CAR的细胞疗法产品的产生、提高产品质量和使产品的治疗功效最大化的方法和程序的需求。
发明内容
本披露关于制备经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及使用此类方法生成的组合物。还披露了使用此类组合物用于治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法。
在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含：编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子。在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，第二核酸分子包含一种或多种核酸分子，例如，第二核酸分子包含第三核酸分子和第四核酸分子，其中第三核酸分子包含编码CAR的核酸序列，并且第四核酸分子包含编码调节分子的核酸序列。
在一些实施例中，该方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；(ii)使细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含该第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及(iii)收获该细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制该细胞群体)或施用。在一些实施例中，步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行。在一些实施例中，步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如，不超过10％。在一些实施例中，步骤(ii)中的第一或第二核酸分子在病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含第一或第二核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段或scFv)、小分子或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体，并且刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体，并且刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的细胞的百分比。在一些实施例中，与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的包含第一或第二核酸分子的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同或相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍。在一些实施例中，细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的初始T细胞(例如，包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比在步骤(ii)的持续时间期间增加，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间增加例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，如与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比不降低或降低不超过5％或10％。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的初始T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的初始T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的初始T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的初始T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)。
在一些实施例中，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相同或相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。在一些实施例中，在步骤(ii)的持续时间期间，包含第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+细胞)的百分比降低，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间降低例如至少8％、10％、12％、14％、16％、18％、或20％。在一些实施例中，如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比不增加或增加不超过5％或10％。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比更低(例如至少10％、20％、30％或40％更低)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比更低(例如至少10％、20％、30％或40％更低)。
在一些实施例中，如与步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，如与步骤(i)开始时的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞(例如包含第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(GeneSetScore)(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与以下的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比更低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％、或300％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与以下的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比更低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与以下的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比更低(例如，至少低约50％、100％、或125％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与以下的中位数基因集评分(向上缺氧)相比更低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与以下的中位数基因集评分(向上自噬)相比更低(例如，至少低约20％、30％、或40％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞。
在一些实施例中，例如，如使用实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CCAR或CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个包含第一或第二核酸分子的活细胞的剂量)。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如，不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较在步骤(i)开始时的细胞群体中的活细胞数目减少。
在一些实施例中，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
在一些实施例中，步骤(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。
在一些实施例中，步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。在一些实施例中，血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)(任选地)接受来自实体(例如实验室、医院或医疗保健提供者)的新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))，以及(v)从新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))，以及(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，该方法进一步包括步骤(vi)：将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量在该部分中的CAR表达水平(例如测量该部分中表达CAR的活细胞的百分比)。在一些实施例中，步骤(iii)包括收获和冷冻细胞(例如T细胞)群体，并且步骤(vi)包括将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分解冻，将该部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量该部分中的CAR表达水平(例如测量该部分中表达CAR的活细胞的百分比)。
在一些实施例中，本文提供了制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含：编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子。在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，第二核酸分子包含一种或多种核酸分子，例如，第二核酸分子包含第三核酸分子和第四核酸分子，其中第三核酸分子包含编码CAR的核酸序列，并且第四核酸分子包含编码调节分子的核酸序列。
在一些实施例中，该方法包括：(1)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的白细胞单采产物分离的T细胞)群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6、或其组合)接触，(2)使该细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含该第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及(3)收获该细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制该细胞群体)或施用。在一些实施例中，步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如，不超过10％。在一些实施例中，步骤(2)中的第一或第二核酸分子在病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含第一或第二核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。
在一些实施例中，与通过除进一步包括使细胞群体与例如抗CD3抗体接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在包含第一或第二核酸分子的细胞中更高百分比的初始细胞(例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)。
在一些实施例中，来自步骤(3)细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比：(a)与步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同或相差不超过5％或10％，或(b)与步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比增加，例如增加至少10％或20％。
在一些实施例中，与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。
在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。
在一些实施例中，与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如，不超过10％，任选地其中来自步骤(3)的细胞群体中的活细胞数目较在步骤(1)开始时的细胞群体中的活细胞数目减少。
在一些实施例中，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时(例如不超过1小时或1.5小时)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)，并且刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂，任选地其中该刺激CD3/TCR复合物的药剂或该刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。
在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，该细胞培养基包含：不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清，任选地其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，该细胞培养基包含约2％血清、或LSD1抑制剂或MALT1抑制剂。
在一些实施例中，该方法进一步包括接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于50％、60％或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。在一些实施例中，步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的细胞培养基中进行。在一些实施例中，例如10、15、20、或25天后，IL-15增加细胞群体扩增的能力。在一些实施例中，IL-15增加在细胞群体中表达IL6Rβ的细胞的百分比。
在一些实施例中，CCAR或CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和/或细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域与选自以下的抗原结合：CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL或scFv序列，任选地其中：(a)抗原结合结构域与BCMA结合，并且包含表3-15中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；(b)抗原结合结构域与CD19结合，并且包含表2中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；(c)抗原结合结构域与CD20结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；或(d)抗原结合结构域与CD22结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH和VL通过接头连接，任选地其中该接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。在一些实施例中，(a)跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域，(b)跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域，(c)跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(d)第一或第二核酸分子包含编码跨膜结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接，任选地其中：(a)铰链区包含SEQ ID NO:2、3或4的氨基酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(b)第一或第二核酸分子包含编码铰链区的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，任选地其中该初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、或CD66d的功能性信号传导结构域，任选地其中：(a)初级信号传导结构域包含源自CD3ζ的功能性信号传导结构域，(b)初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(c)第一或第二核酸分子包含编码初级信号传导结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，任选地其中该共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，(a)共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域，(b)共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(c)第一或第二核酸分子包含编码共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域和源自CD3ζ的功能性信号传导结构域，任选地其中该细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)，任选地其中该细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。在一些实施例中，CCAR或CAR进一步包含前导序列，该前导序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文提供了细胞群体，该细胞群体包含通过前述方法制备的第一或第二核酸分子(例如，包含第一或第二核酸分子的自体或同种异体T细胞或NK细胞)。
在一些实施例中，本文提供了细胞群体，该细胞群体经工程化以包含：编码CCAR的第一核酸分子，或编码CAR和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，本文提供了细胞群体，该细胞群体经工程化以包含编码CCAR的第一核酸分子。在一些实施例中，本文提供了细胞群体，该细胞群体经工程化以包含编码CAR和调节分子的第二核酸分子。在一些实施例中，第二核酸分子包含一种或多种核酸分子，例如，第二核酸分子包含第三核酸分子和第四核酸分子，其中第三核酸分子包含编码CAR的核酸序列，并且第四核酸分子包含编码调节分子的核酸序列。
在一些实施例中，群体包含：(a)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，约相同百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+ T细胞)；(b)例如如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，变化在约5％至约10％内的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+T细胞)；(c)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，百分比增加的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+ T细胞)，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(d)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，约相同百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)；(e)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，变化在约5％至约10％内的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)；(f)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+T细胞)的百分比相比，百分比降低的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)，例如降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；(g)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，约相同百分比的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)；(h)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，变化在约5％至约10％的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)；或(i)如与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，百分比增加的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)。
在一些实施例中，本文提供了细胞群体，该细胞群体经工程化以包含：编码CCAR的第一核酸分子，或编码CAR和调节分子的第二核酸分子，其中：(a)细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；(b)细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；(c)细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；(d)细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；或(e)细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与经工程化以包含第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。
在一些实施例中，细胞群体包含编码CCAR的第一核酸分子。
在一些实施例中，CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)。在一些实施例中，(i)降解多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:310-315、320-324、337-339、360-361、367-369和374(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)，任选地其中该降解多肽包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列或由其组成；(ii)降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β转角，任选地其中该降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β发夹或β链；(iii)降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的α螺旋；(iv)降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋；(v)降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋，任选地其中该β发夹和该第二α螺旋通过不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开；(vi)降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基；(vii)降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸、或至少95个氨基酸；(viii)在不存在COF1或COF2(例如免疫调节酰亚胺药物(IMiD)，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，融合多肽与小脑蛋白(cereblon)(CRBN)的缔合不超过在存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，该融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、或20％；(ix)在不存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，融合多肽的泛素化不超过在存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，该融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；(x)在不存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，融合多肽的降解不超过在存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，该融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；和/或(xi)如与在不存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下融合多肽的表达水平相比，在存在COF1或COF2(例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺)的情况下，该融合多肽的表达水平降低，例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、或99％。
在一些实施例中，降解多肽包含选自由SEQ ID NO:375-377(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)组成的组的氨基酸序列或由其组成，任选地其中该降解多肽包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β转角，任选地其中该降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β发夹或β链。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋，任选地其中该β发夹和该第二α螺旋通过不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸、或至少95个氨基酸。在一些实施例中，在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，融合多肽与小脑蛋白(CRBN)的缔合，不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，该融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、或20％。在一些实施例中，在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，融合多肽的泛素化不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，该融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施例中，在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，融合多肽的降解不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，该融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施例中，如与在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，融合多肽的表达水平相比，在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，该融合多肽的表达水平减少例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、或99％。
在一些实施例中，(i)降解多肽与CAR多肽融合；(ii)降解多肽和CAR多肽通过肽键连接；(iii)降解多肽和CAR多肽通过除肽键以外的键连接；(iv)降解多肽与CAR多肽直接连接；(v)降解多肽与CAR多肽间接连接；(vi)降解多肽与CAR多肽经由接头，例如甘氨酸-丝氨酸接头，例如包含GGGGSGGGGTGGGGSG的氨基酸序列(SEQ ID NO:335)的接头可操作地连接；(vii)降解多肽与CAR多肽的C-末端或N-末端连接；或(viii)降解多肽位于CAR多肽的中部。
在一些实施例中，CCAR是包含降解结构域(例如，本文披露的降解结构域)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)的融合多肽，任选地其中该降解结构域与CAR多肽通过异源蛋白酶切割位点分开，任选地其中该CCAR从N-末端至C-末端包含降解结构域、异源蛋白酶切割位点以及CAR多肽。
在一些实施例中，降解结构域具有与融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在存在稳定化合物的情况下，第二水平比第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍，任选地其中：(a)在不存在稳定化合物的情况下，融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，降解至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的融合多肽；(b)相对于在不存在稳定化合物的情况下的构象，在存在稳定化合物的情况下，降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；和/或(c)相对于在不存在稳定化合物的情况下的构象，在存在稳定化合物的情况下，融合多肽的构象在异源蛋白酶切割位点处更容易切割。
在一些实施例中，降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，任选地其中：(a)降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，例如，包含SEQ ID NO:342或344的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中该稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐；(b)降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域，例如，包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中该稳定化合物是盾护物-1或其药学上可接受的盐；或(c)降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，例如，包含SEQ ID NO:347的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中该稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割，任选地其中：(a)异源蛋白酶切割位点被选自由以下组成的组的蛋白酶切割：弗林蛋白酶、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶(genenase)、分选酶、精确蛋白酶(precission protease)、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1；(b)异源蛋白酶切割位点包含具有选自由以下组成的组的切割基序的序列：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:349)、RRX共有基序(SEQ ID NO:350)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:351)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:352)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:353)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:354)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:355)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:356)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ IDNO:358)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:359)；或(c)异源蛋白酶切割位点包含选自由以下组成的组的弗林蛋白酶切割位点：RTKR(SEQ ID NO:378)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:383)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:385)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:387)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:389)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:391)；以及SARNRQKR(SEQ ID NO:336)。在一些实施例中，异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割，任选地其中：(a)异源蛋白酶切割位点被选自由以下组成的组的蛋白酶切割：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1；或(b)异源蛋白酶切割位点包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:352)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:353)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:354)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:355)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:356)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:358)、以及[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:359)。
在一些实施例中，CCAR是可调节的CAR(RCAR)(例如，本文披露的RCAR)。在一些实施例中，RCAR包含：(i)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；(ii)抗原结合成员，该抗原结合成员包含：抗原结合结构域和第二开关结构域；以及(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将该跨膜结构域布置在细胞内信号传导成员和/或抗原结合成员上。在一些实施例中，RCAR包含：(i)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；(ii)抑制性细胞外结构域成员，该抑制性细胞外结构域成员包含：抑制性细胞外结构域(例如，包含B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA、LAIR1或TGF-β受体的细胞外结构域或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的抑制性细胞外结构域)，和第二开关结构域；以及(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将该跨膜结构域布置在细胞内信号传导成员和/或抑制性细胞外结构域成员上。在一些实施例中，RCAR包含：(i)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；(ii)共刺激细胞外结构域成员，该共刺激细胞外结构域成员包含：共刺激细胞外结构域(例如，包含ICOS、CD28、VEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226的细胞外结构域或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的共刺激细胞外结构域)，和第二开关结构域；以及(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将该跨膜结构域布置在细胞内信号传导成员和/或共刺激细胞外结构域成员上。
在一些实施例中，第一和第二开关结构域可以形成二聚化开关，例如，在存在二聚化分子的情况下，任选地其中：(i)二聚化开关是细胞内二聚化开关或细胞外二聚化开关；(ii)二聚化开关是同源二聚化开关或异源二聚化开关；(iii)二聚化开关包含基于FKBP-FRB的开关，例如，包含含有FRB结合片段或FKBP的类似物的开关结构域和含有FKBP结合片段或FRB的类似物的开关结构域的二聚化开关，任选地其中FKBP结合片段或FRB的类似物包含本文披露的一种或多种突变(例如，选自E2032突变、T2098突变或E2032以及T2098突变的一种或多种突变)，任选地其中二聚化分子是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素类似物，例如RAD001；和/或(iv)抗原结合结构域与靶抗原结合，但不促进T细胞的免疫效应子应答，直到存在二聚化分子。
在一些实施例中，(i)细胞内信号传导成员包含初级细胞内信号传导结构域，例如本文披露的初级细胞内信号传导结构域，例如CD3ζ结构域；(ii)细胞内信号传导成员包含共刺激信号传导结构域，例如本文披露的共刺激信号传导结构域，例如4-1BB结构域或CD28结构域；(iii)抗原结合成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如抗原结合成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域；(iv)抑制性细胞外结构域成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如抑制性细胞外结构域成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域；和/或(v)共刺激细胞外结构域成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如共刺激细胞外结构域成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞群体包含编码CAR和调节分子的第二核酸分子。
在一些实施例中，第二核酸分子包含编码CAR的核酸序列和编码调节分子的核酸序列，任选地其中编码CAR的核酸序列和编码调节分子的核酸序列：(i)布置在单个核酸分子上，例如，其中编码CAR的核酸序列和编码调节分子的核酸序列通过编码自切割位点的核酸序列分开；或(ii)布置在分开的核酸分子上。
在一些实施例中，调节分子包含嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含(i)多聚体配体结合区和(ii)半胱天冬酶9分子。在一些实施例中，半胱天冬酶9分子是截短的半胱天冬酶9，任选地其中该半胱天冬酶9分子缺少半胱天冬酶募集结构域。在一些实施例中，多聚体配体结合区选自由以下组成的组：FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、由通过柔性接头结构域串联分开的重链和轻链可变区组成的单链抗体及其突变序列，任选地其中该多聚体配体结合区是FKBP12区。
在一些实施例中，调节分子包含截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。在一些实施例中，EGFRt具有以下性质中的1种、2种、3种、4种或所有：(i)EGFRt包含EGFR结构域III和EGFR结构域IV中的一者或两者；(ii)EGFRt不包含以下中的1个、2个、3个或所有：EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域、以及EGFR酪氨酸激酶结构域；(iii)EGFRt不介导信号传导或运输；(iv)EGFRt不结合内源性EGFR配体，例如表皮生长因子(EGF)；以及(v)EGFRt与抗EGFR抗体分子(例如，西妥昔单抗、马帕木单抗、耐昔妥珠单抗和帕尼单抗)、EGFR特异性siRNA、或靶向EGFR的小分子结合。
在一些实施例中，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含本文披露的细胞群体和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，本文提供了增加受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文披露的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而增加受试者的免疫应答。在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文披露的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而治疗受试者的癌症。在一些实施例中，癌症是实体癌，例如选自：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑素瘤、肾癌(renal cancer)、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、癌(carcinoma)、子宫癌、肾癌(kidney cancer)、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌、食道癌、或膀胱癌、或其转移癌中的一种或多种。在一些实施例中，癌症是液体癌，例如选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结节性边缘区淋巴瘤、小儿结节性边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。
在一些实施例中，该方法进一步包括，在施用细胞群体或药物组合物后，
向受试者施用有效量的IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112。在一些实施例中，在施用细胞群体或药物组合物后，受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112响应于受试者中不良反应的发生，或响应于受试者中不良反应的预期发生。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。在一些实施例中，细胞群体包含编码CCAR的核酸分子，其中该CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)。
在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：
i)使细胞群体与IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112离体接触，其中该细胞群体包含编码CCAR的核酸分子，其中该CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)，以及
ii)向受试者施用有效量的细胞群体，从而治疗癌症。
在一些实施例中，在存在IMiD或化合物I-112的情况下，CCAR的表达水平相对于在细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之前的CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，该方法新一步包括在步骤i)之后和在步骤ii)之前：减少与细胞群体接触的，例如细胞群体内和/或细胞群体周围的IMiD或化合物I-112的量。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向受试者施用有效量的IMiD或化合物I-112。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的CCAR的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112响应于受试者中不良反应的发生，或响应于受试者中不良反应的预期发生。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止施用IMiD或化合物I-112。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于在步骤iii)之后和在步骤iv)之前的CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平恢复至在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的表达水平。在一些实施例中，受试者已经复发、正在复发或预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112响应于受试者的肿瘤复发，或响应于受试者的预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，从而治疗癌症。
在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：
i)向受试者施用有效量的细胞群体，其中该细胞群体包含编码CCAR的核酸分子，其中该CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)，从而治疗癌症。在一些实施例中，在施用之前，使细胞群体与IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112离体接触。在一些实施例中，在存在IMiD或化合物I-112的情况下，CCAR的表达水平相对于在细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之前的CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，在将细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之后和向受试者施用细胞群体之前，减少与细胞群体接触的，例如细胞群体内和/或细胞群体周围的IMiD或化合物I-112的量。
在一些实施例中，在施用之前，细胞群体不与IMiD或化合物I-112离体接触。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)向受试者施用有效量的IMiD或化合物I-112。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前CCAR的表达水平降低了例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112响应于受试者中不良反应的发生，或响应于受试者中不良反应的预期发生。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止施用IMiD或化合物I-112。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于在步骤ii)之后和在步骤iii)之前CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平恢复至在步骤i)之后和在步骤ii)之前的表达水平。在一些实施例中，受试者已经复发、正在复发或预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112响应于受试者的肿瘤复发，或响应于受试者的预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，从而治疗癌症。
在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：
i)向受试者施用有效量的IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112，其中该受试者包含细胞群体，其中该细胞群体包含编码CCAR的核酸分子，其中该CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)，从而治疗癌症。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于施用IMiD或化合物I-112之前的CCAR的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112响应于受试者中不良反应的发生，或响应于受试者中不良反应的预期发生。在一些实施例中，施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止施用IMiD或化合物I-112。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平恢复至施用IMiD或化合物I-112之前的表达水平。在一些实施例中，受试者已经复发、正在复发或预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112响应于受试者的肿瘤复发，或响应于受试者的预期复发。在一些实施例中，中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，从而治疗癌症。
在一些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：
i)向受试者施用：(1)稳定化合物，以及(2)有效量的细胞群体，从而治疗癌症，其中该细胞群体包含编码CCAR的核酸分子，其中该CCAR是融合多肽，该融合多肽包含降解结构域(例如，本文披露的降解结构域)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)，任选地其中该降解结构域与CAR多肽通过异源蛋白酶切割位点分开。在一些实施例中，在存在稳定化合物的情况下的CCAR的表达水平比在不存在稳定化合物的情况下的CCAR的表达水平高例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止施用稳定化合物。在一些实施例中，中止施用稳定化合物使CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前的CCAR的表达水平减少例如，至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，受试者应答步骤i)的治疗(例如，受试者对步骤i)的治疗具有完全响应，受试者显示肿瘤团块缩小，受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在受试者中是有效的)。在一些实施例中，中止施用稳定化合物响应于受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，受试者显示肿瘤团块缩小，受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在受试者中是有效的)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止施用稳定化合物。在一些实施例中，中止施用稳定化合物使CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前的CCAR的表达水平减少例如，至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应。在一些实施例中，中止施用稳定化合物响应于受试者中不良反应的发生，或响应于受试者中不良反应的预期发生。在一些实施例中，中止施用稳定化合物减少或预防不良作用。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤ii)或iii)之后：
iv)施用有效量的稳定化合物。在一些实施例中，施用稳定化合物使CCAR的表达水平相对于在步骤ii)或iii)之后和在步骤iv)之前CCAR的表达水平增加例如，至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。在一些实施例中，受试者已经复发、正在复发或预期复发。在一些实施例中，施用稳定化合物响应于受试者的肿瘤复发，或响应于受试者的预期复发。在一些实施例中，施用稳定化合物治疗或预防肿瘤复发。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤ii)、iii)或iv)，从而治疗癌症。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤i)之前：
vi)使细胞群体与稳定化合物离体接触。在一些实施例中，在存在稳定化合物的情况下的CCAR的表达水平比在不存在稳定化合物的情况下的CCAR的表达水平高例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。
在一些实施例中，在施用之前，细胞群体不与稳定化合物离体接触。
在一些实施例中，本文提供了本文披露的细胞群体或本文披露的药物组合物，用于在增加受试者的免疫应答的方法中使用，所述方法包括向受试者施用有效量的细胞群体或有效量的药物组合物。在一些实施例中，本文提供了本文披露的细胞群体或本文披露的药物组合物，用于在治疗受试者癌症的方法中使用，所述方法包括向受试者施用有效量的细胞群体或有效量的药物组合物。
在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如T细胞)群体的方法，该细胞群体表达嵌合抗原受体(CAR)，例如本文披露的CAR，例如本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体进一步表达调节分子。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。在一些实施例中，该方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；(ii)使细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含该核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和(iii)收获该细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、或25小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如，选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(ii)与i步骤(i)一起进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于20小时进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(i)开始后不晚于18小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、或25小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于24小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体未扩增。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过10％。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含水凝胶。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含水凝胶。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂不包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂不包含海藻酸盐。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含水凝胶。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含水凝胶。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含海藻酸盐。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂包含来自阔得技术公司(Quad Technologies)的MagCloudzTM。
在一些实施例中，与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中的表达CAR的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的表达CAR的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)。
在一些实施例中，在来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过5％或10％。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少高10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少高10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过5％或10％。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少低10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少低10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。
在一些实施例中，如与步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，如与步骤(i)开始时细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞(例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比更高。
在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比较低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％或300％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比较低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％或300％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比较低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比较低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％或175％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他类似是方法制备的细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比较低(例如，至少低约50％、100％、或125％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比较低(例如，至少低约50％、100％、或125％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)相比较低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)相比较低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上自噬)相比较低(例如至少低20％、30％、或40％)。在一些实施例中，来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞的中位数基因集评分(向上自噬)相比较低(例如至少低20％、30％、或40％)。
在一些实施例中，例如，如使用实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)扩增(例如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评价)。
在一些实施例中，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时(例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个表达CAR的活细胞的剂量)。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于0.5、1、1.5、或2小时(例如小于1或1.5小时)。
在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-7、IL-21、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)和(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-7、IL-21、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-7、IL-21、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(i)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，步骤(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。在一些实施例中，细胞培养基是包含血清替代物的无血清培养基。在一些实施例中，血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如T细胞)群体的方法，该细胞群体表达嵌合抗原受体(CAR)，例如本文披露的CAR，例如本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体进一步表达调节分子。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。在一些实施例中，该方法包括：(1)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的白细胞单采产物分离的T细胞)群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6、或其组合)接触；(2)使该细胞(例如T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含该核酸分子的细胞(例如T细胞)群体；和(3)收获该细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、24、或25小时，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行；或(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(2)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，步骤(2)与步骤(1)一起进行。在一些实施例中，步骤(2)在步骤(1)开始后不晚于5小时进行。在一些实施例中，步骤(2)在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于22、23、24、或25小时进行。在一些实施例中，步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于24小时进行。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过10％。
在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-7接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-21和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，步骤(1)包括使细胞(例如T细胞)群体与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。
在一些实施例中，与通过除进一步包括使细胞群体与例如抗CD3抗体接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在表达CAR的细胞中更高百分比的初始细胞(例如至少高10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)。
在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比增加至少10％或20％。
在一些实施例中，与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少高10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如至少高10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。
在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相同。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、或12％。在一些实施例中，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相差不超过5％或10％。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低至少10％或20％。在一些实施例中，如与步骤(1)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，在来自步骤(3)的细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)的百分比降低至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。
在一些实施例中，与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少低10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前，在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞)(例如至少低10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％)。
在一些实施例中，与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时(例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估的)。在一些实施例中，与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天(例如5、6、7、8、或9天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平(例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、或40％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(3)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(1)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
在一些实施例中，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，例如，如通过活细胞数目进行评估，来自步骤(3)的细胞群体不扩增。在一些实施例中，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体扩增少于0.5、1、1.5、或2小时(例如少于1或1.5小时)。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时(例如不超过1小时或1.5小时)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段或scFv)、小分子或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。
在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)和/或(2)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含不超过2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含约2％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(1)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，步骤(2)在包含LSD1抑制剂或MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
在一些实施例中，前述方法进一步包括在步骤(i)之前：(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体。在一些实施例中，步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时(例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时)进行。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如不超过10％)。
在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
在一些实施例中，在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
在一些实施例中，步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的细胞培养基中进行。在一些实施例中，例如10、15、20、或25天后，IL-15增加细胞群体扩增的能力。在一些实施例中，IL-15增加在细胞群体中表达IL6Rβ的细胞的百分比。
在前述方法的一些实施例中，这些方法在封闭系统中进行。在一些实施例中，T细胞分离、活化、转导、孵育和洗涤均在封闭系统中进行。在前述方法的一些实施例中，这些方法在分开的装置中进行。在一些实施例中，T细胞分离、活化和转导、孵育、和洗涤在分开的装置中进行。
在前述方法的一些实施例中，这些方法进一步包括在细胞培养基中添加佐剂或转导增强试剂以增强转导效率。在一些实施例中，佐剂或转导增强试剂包含阳离子聚合物。在一些实施例中，佐剂或转导增强试剂选自：LentiBOOSTTM(希瑞安生物技术公司(SirionBiotech))、vectofusin-1、F108、海美溴铵(聚凝胺)、PEA、普朗尼克F68、普朗尼克F127、泊洛沙姆或LentiTransTM。在一些实施例中，佐剂为LentiBOOSTTM(Sirion Biotech公司)。
在前述方法的一些实施例中，用病毒载体转导细胞群体(例如，T细胞)包括在增强转导效率的条件下使细胞群体和病毒载体经受离心力。在实施例中，通过离心接种(spinoculation)转导细胞。
在前述方法的一些实施例中，细胞(例如，T细胞)在细胞培养瓶中被活化和转导，该细胞培养瓶在基底处包含气体可渗透膜，其支持大的培养基体积而基本上不损害气体交换。在一些实施例中，通过经由对流提供对营养物的接近，例如基本上不间断的接近来实现细胞生长。
在前述方法的一些实施例中，CAR或CCAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，抗原结合结构域与选自以下的抗原结合：CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列。在一些实施例中，抗原结合结构域包含VH和VL，其中该VH和VL通过接头连接，任选地其中该接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。
在一些实施例中，跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码跨膜结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:2、3、或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码铰链区的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包括源自CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码初级信号传导结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中该核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域和源自CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQID NO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列)。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR或CCAR进一步包含前导序列，该前导序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施例中，本披露的特征在于通过任何前述方法或本文披露的任何其他的方法制备的表达CAR的细胞(例如，表达CCAR的细胞)(例如，表达CAR的自体或同种异体T细胞或NK细胞)群体。在一些实施例中，本文披露了包含药物组合物，该药物组合物包含本文披露的表达CAR的细胞群体和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，在使用本文所述的方法制造的最终的CAR细胞产物中，珠(例如CD4珠、CD8珠和/或TransACT珠)的总量不超过在制造过程中添加的珠的总量的0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、或0.5％。
在一些实施例中，本披露的特征在于表达CAR的细胞(例如，表达CCAR的细胞)(例如表达CAR的自体或同种异体T细胞或NK细胞)群体，该细胞群体具有以下特征中的一个或多个：(a)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，约相同百分比的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+ T细胞；(b)例如如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+ T细胞；(c)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，百分比增加的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RO-CCR7+ T细胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(d)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，约相同百分比的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)；(e)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，变化在约5％至约10％内的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)；(f)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)的百分比相比，百分比降低的中枢记忆细胞(例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞)，例如降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；(g)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，约相同百分比的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)；(h)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，变化在约5％至约10％的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)；或(i)如与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)的百分比相比，百分比增加的干细胞记忆T细胞(例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞)。
在一些实施例中，本披露的特征在于表达CAR的细胞(例如，表达CCAR的细胞)(例如表达CAR的自体或同种异体T细胞或NK细胞)群体，其中：(a)细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与经工程化以表达CAR之前的相同细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；(b)细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与经工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；(c)细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与经工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；(d)细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与经工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；或(e)细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与经工程化以表达CAR之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。
在一些实施例中，本披露的特征在于增加受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文披露的表达CAR的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而增加受试者的免疫应答。
在一些实施例中，本文披露了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文披露的表达CAR的细胞群体或本文披露的药物组合物，从而在受试者中治疗癌症。在一些实施例中，癌症是实体癌，例如选自：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑素瘤、肾癌(renal cancer)、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、癌(carcinoma)、子宫癌、肾癌(kidney cancer)、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌、食道癌、或膀胱癌、或其转移癌中的一种或多种。在一些实施例中，癌症是液体癌，例如选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结节性边缘区淋巴瘤、小儿结节性边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
在一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施例中，第二治疗剂是抗癌治疗剂，例如化学疗法、放射疗法或免疫调节疗法。在一些实施例中，第二治疗剂是IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))。
虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是以下描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如序列数据库参考号)通过引用以其全文而并入。例如本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列(例如在本文的任一表中)均通过引用而并入。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本披露的其他特征、目标和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A-1I：当纯化的T细胞与细胞因子一起孵育时，初始细胞是转导的优势群体。图1A是示出示例性细胞因子过程的图。图1B是显示转导后在每个指定时间点的CD3+CAR+细胞百分比的一对图。图1C是显示与在两个独立供体中仅细胞因子群体(右)相比，CD3/CD28珠刺激群体(左)中CD3+CCR7+CD45RO-群体内的转导的一组图。对于在图1C中称为“短暂刺激IL7+IL15”的样品，用珠刺激细胞2天，然后在存在IL7和IL15的情况下将它们除去。图1D、1E和1F是一组流式细胞术图，显示经三天期间的每天用IL2(图1D)、IL15(图1E)和IL7+IL15(图1F)培养的T细胞亚群的转导。图1G是一组流式细胞术图，显示在用IL2(右上图)或IL-15(右下图)刺激后CCR7和CD45RO在第0天(左)和第1天(右)的T细胞分化。图1H和1I是显示CD3+CCR7+RO-、CD3+CCR7+RO+、CD3+CCR7-RO+、和CD3+CCR7-RO-细胞在第0天或与指定的细胞因子培养24小时后的百分比的一组图。
图2A-2D：用一天的细胞因子刺激产生的CART是功能性的。图2A：用MOI为1转导纯化的T细胞，并且在所有测试的细胞因子条件下，在第1天和第10天观察到的表达CAR的细胞的百分比是相似的。CART在一天内产生并在收获后经由CD3/CD28珠扩增9天以模拟体内环境。图2A是显示第1天CART(左)和第10天CART(右)的每种条件下CD3+CAR+细胞的平均百分比的一对图。图2B：使用Nalm6作为靶细胞测量扩增后第1天CART的细胞毒性能力。图2B是显示来自每种条件的CART对CD19阳性Nalm6细胞的％杀伤的图。使用CD3/CD28珠扩展的第10天的CART被标记为“第10天”。所有其他样品都是第1天的CART。图2C：测试了响应于Nalm6靶细胞的扩增的第1天CART的IFNg的分泌。图2C是显示在存在CD19阳性或CD19阴性靶细胞的情况下来自每种条件的CART的IFN-γ分泌量的图。图2D：通过测量EDU的掺入来测试第1天CART的增殖能力。图2D是显示每种条件下EDU阳性细胞的平均百分比的图。与图2B类似，第10天CART被标记为“第10天”，并且所有其他样品是第1天CART。
图3A-3B：MOI和培养基组合物对第0天转导的影响。图3A：在存在IL15、IL2+IL15、IL2+IL7、或IL7+IL15的情况下，用从1至10的范围的MOI转导纯化的T细胞。无论使用何种细胞因子，都观察到转导的线性增加。图3A是一组图，其中对于每种测试的条件，绘制CD3+CAR+细胞的百分比相对于MOI的图。图3B：培养基组合物影响细胞因子过程中的转导。图3B是显示每种测试的条件在第1天(左)或第8天(右)的CD3+CAR+细胞百分比的一对图。“2.50”指示2.50的MOI。“5.00”指示5.00的MOI。
图4A-4D：24小时内产生的CAR T细胞可以消除肿瘤。图4A：用CAR19转导纯化的T细胞，并在24小时后收获。图4A是一组流式细胞术图，显示使用用IL2、IL15和IL7+IL15培养的CAR19对T细胞的转导，说明了用每种细胞因子条件的转导。图4B：显示在所有测试的条件下平均活力超过80％的图表。图4C：如与第10天的对应物相比，外周血中第1天CART的扩增在体内增加。对于每种测试的条件，在输注后的指定时间点，活CD45+CD11b-CD3+CAR+细胞的百分比。第10天CART标记为“D10 1e6”或“D10 5e6”，并且所有其他样品是第1天CART。图4D：第1天CART可以消除体内肿瘤，尽管与第10天CART相比具有延迟的动力学。图4D是显示对于每种测试的条件，在肿瘤接种后的指定时间点的总通量的图。在肿瘤接种后4天施用CART。第10天CART被标记为“5e6 d.10”，并且所有其他样品是第1天CART。
图5A-5B：细胞因子过程是可扩展的。图5A：在
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上富集T细胞，并将B细胞隔室减少至小于1％。图5A是一组流式细胞术图，显示用抗CD3抗体(左)或抗CD19抗体和抗CD14抗体(右)对leukopak细胞(上)或CD4+CD8+富集后的细胞(下)的细胞染色。图5B：富集后在24孔板或PL30袋中用CAR19转导来自冷冻的单采的纯化的T细胞。24小时后收获CART。图5B是一组流式细胞术图，显示在存在IL2或hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)的情况下制备的细胞的CD3和CAR染色。
图6A-6C：通过活化过程制备的CART在体内显示出优异的抗肿瘤功效。图6A和6B是绘制的肿瘤植入后肿瘤负荷相对于指定时间点的图。“d.1”指示使用活化过程制造的CART。“d.9”指示使用传统的9天扩增方案制造的CART，在本研究中用作阳性对照。图6C是显示来自小鼠的生物发光的一组代表性图像。
图7A-7B：表达IL6Rα和IL6Rβ的细胞富集在分化程度较低的T细胞群体中。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查CD4(图7A)和CD8(图7B)T细胞亚群上IL6Rα和IL6Rβ的表达水平。
图8A和8B：表达IL6Rα和IL6Rβ的细胞均富集在分化程度较低的T细胞群体中。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查CD4(图8A)和CD8(图8B)T细胞亚群上指定的表面抗原的表达水平。
图9：表达IL6Rα的细胞表达分化程度较低的T细胞的表面标志物。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查IL6Rα高、中和低表达细胞亚群中各种表面抗原的表达水平。
图10：表达IL6Rβ的细胞表达分化程度较低的T细胞的表面标志物。针对指定的表面抗原对新鲜T细胞进行染色，并检查IL6Rβ高、中和低表达细胞亚群中各种表面抗原的表达水平。
图11：TCR接合后IL6Rα而非IL6Rβ表达下调。在第0天用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点检查IL6Rα和IL6Rβ的表达水平。
图12：TCR接合后细胞因子处理的T细胞的倍数扩增。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点监测细胞数量。
图13A和13B：TCR接合后，IL2、IL7和IL15处理不影响细胞大小和活力。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点监测细胞大小(图13A)和活力(图13B)。
图14：细胞因子处理后各种表面分子在CD4 T细胞上的表达动力学。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点通过流式细胞术检查各种表面分子的表达。
图15：细胞因子处理后各种表面分子在CD8 T细胞上的表达动力学。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在指定的时间点通过流式细胞术检查各种表面分子的表达。
图16：在TCR接合后，IL6Rβ表达主要限于表达CD27的T细胞亚群。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第15天通过流式细胞术检查IL6Rβ表达。
图17：在TCR接合后，IL6Rβ表达主要限于不表达CD57的T细胞亚群。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第25天通过流式细胞术检查IL6Rβ表达。
图18：常见的γ链细胞因子处理的T细胞在第25天产生功能性细胞因子。在第0天，在存在指定的细胞因子的情况下用αCD3αCD28珠活化T细胞，然后在第25天通过流式细胞术检查产生T细胞的IL2、IFNγ和TNFα的百分比。
图19A和19B：第1天的BCMA CAR表达使用来自两个健康供体的T细胞中的MOI＝2.5的ARM。图19A是一组显示通过流式细胞术测量的BCMA CAR表达的直方图。图19B是列出流式细胞术分析中使用的试剂/条件的表。
图20A、20B、和20C：使用ARM过程制造的细胞的从第1天至第4天的体外CAR表达动力学。CAR在第3天稳定表达。图20A是一组显示在指定时间点通过流式细胞术测量的CAR表达的直方图。图20B和20C分别是显示CAR+％和MFI值随时间的曲线图。
图21A和21B：在KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中的体内分类。每只小鼠接受第1天CART产品的1.5E6。图21A是一组显示CART细胞中第1天和第7天CAR表达的直方图。图21B是显示CART处理后肿瘤动力学(BLI水平)的图。
图22A、22B、和22C：使用剂量滴定在KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型中BCMA CAR的体内分类。图22A是一组显示在第1天和第3天的CAR表达直方图。图22B是显示使用两种不同剂量的CART治疗后肿瘤摄入动力学的图：一个剂量的1.5e5 CAR+ T细胞和一个剂量的5e4 CAR+ T细胞。基于第3天CAR表达将CAR+细胞的剂量标准化。图22C是显示在经该研究过程中体重动力学的图。
图23A、23B、和23C.图23A和23B是显示在其细胞表面上表达CAR的T细胞的百分比(图23A)和随时间观察的CD3+CAR+细胞的平均荧光强度(MFI)(图23B)的图(重复效率从图23C所示的两个流量图平均)。图23C是一组流式细胞术图，显示了基于UTD样品的活CD3+细胞上表面CAR表达的门控策略。图中的数字指示CAR阳性百分比。
图24A和24B.图24A是显示起始材料(
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产品)的端对端组合物和在培养开始后的不同时间点收获时的图。初始(n)、中枢记忆(cm)、效应记忆(em)、和效应子(eff)亚群由CD4、CD8、CCR7和CD45RO表面表达或其缺乏来定义。指定了CD4组合物。对于每个时间点，左侧柱显示整体CD3+群体(总)的细胞组成，右侧柱显示CAR+级分的细胞组成。图24B是一组流式细胞术图，显示应用于活CD3+事件的门控策略，以确定整体CD3+群体(总)和CAR+级分内的总转导效率(顶行)，CD4/CD8组合物(中间行)和记忆亚群(底行)。
图25.表达表面CAR的T细胞亚群随时间的动力学，表示为各亚群中活细胞的数量。
图26.从预洗涤计数确定培养起始后12至24小时的活细胞回收(在收获时回收的活细胞数与接种的活细胞数)。
图27.在培养开始后12至24小时收获快速CART的活力，如在收获时的预洗涤和洗涤后所确定的。
图28A、28B、28C、和28D.图28A是显示通过流式细胞术分析的起始材料(健康供体leukopak；LKPK)和富含T细胞的产物的组合物的图。数字指示亲本的百分比(活细胞，单细胞)。T：T细胞；mono：单核细胞；B：B细胞；CD56(NK)：NK细胞。图28B是一组流式细胞术图，显示用于确定转导率(前向散射FSC对比CAR)和T细胞亚群(CD4对比CD8和CCR7对比CD45RO)的活CD3+事件的门控策略。对于ARM-CD19 CAR(使用活化快速制造(ARM)过程制造的CD19CART细胞)和TM-CD19 CAR(使用传统制造(TM)过程制造的CD19CART细胞)，左下图表示总培养物，而右图表示CAR+ T细胞。“ARM-UTD”和“TM-UTD”分别指根据ARM和TM过程制造的未转导的T细胞(UTD)。象限中的数字指示亲本群体的百分比。TM-UTD和TM-CD19 CAR图中的框表明TM过程向TCM表型偏斜。ARM-UTD和ARM-CD19 CAR图中的框表示通过ARM过程维护初始样细胞。NA：不适用。图28C是显示ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR的端对端T细胞组成的图。在适用的情况下，显示“总”和“CAR+”群体的组成。各个群体的百分比是指亲本的百分比(CD3+或CAR+CD3+)(如果适用)。指定了相应的总或CAR+群体的CD4细胞的百分比。LKPK：Leukopak起始材料；4和8：分别为CD4+和CD8+；eff：效应子；em：效应子记忆；cm：中枢记忆；n：初始样。数据代表用3个不同的健康供体(n＝3)进行3次全规模运行，并且有几次小规模运行用于优化该过程。图28D是表示图28C中所示百分比的表。
图29A、29B、29C、和29D.细胞培养上清液中的细胞因子浓度。IFN-γ(图29A和29B)和IL-2(图29C和29D)。图29A和29C：将TM-CD19CAR、ARM-CD19 CAR和各自的UTD与NALM6-WT(ALL)、TMD-8(DLBCL)共培养，或不与癌细胞(仅T细胞)共培养。48小时后收集上清液。图29B和29D：ARM-CD19 CAR与NALM6-WT、NALM6-19KO(CD19阴性)共培养或单独培养。24小时或48小时后收集上清液。为了进一步评估抗原特异性细胞因子分泌，将ARM-CD19CAR单独培养24小时，洗涤，然后与靶细胞共培养24小时。显示的数据来自2个健康供体T细胞，并且代表2个实验，总计3个供体。
图30A、30B、和30C.图30A是概述异种移植小鼠模型以研究ARM-CD19 CAR的抗肿瘤活性的图。图30B是一组流式细胞术图，显示了来自哨兵小瓶(sentinel vial)的ARM-CD19CAR细胞上CAR表达的测定。在流式细胞术分析之前，将ARM-CD19 CAR细胞培养图中所述的时间段。CAR表达的门控基于同种型对照(Iso)染色。图30C是显示ARM-CD19 CAR在异种移植小鼠模型中的体内功效的图。给NSG小鼠注射前B ALL系NALM6，表达荧光素酶报告基因；肿瘤负荷表示为全身发光(p/s)，描绘为平均肿瘤负荷，具有95％置信区间。在肿瘤接种后第7天，用各自剂量的ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。由于X-GVHD的发作，高剂量ARM-CD19CAR组在第33天终止。媒介物(PBS)和未转导的T细胞(UTD)用作阴性对照。对于所有组，n＝5只小鼠，除了对于ARM-UTD 1×106剂量组和所有TM-CD19CAR剂量组的n＝4。用来自5个不同健康供体的CAR-T细胞进行5次异种移植研究，其中3个包括与TM-CD19 CAR的比较。
图31A、31B、31C、和31D.在相应的CAR-T细胞剂量下用ARM-CD19 CAR或TM-CD19CAR处理的携带NALM6肿瘤的小鼠的血浆细胞因子水平。将小鼠放血并通过MSD测定法测量血浆细胞因子。对于用CAR-T(图31A和31C)或ARM-和TM-UTD(图31B和31D)细胞处理的小鼠，显示了IFN-γ(图31A和31B)和IL-2(图31C和31D)。每个剂量内的条形代表组内不同时间点的组内的平均细胞因子水平(从左侧开始：第4、7、10、12、16、19、23、26天)。水平条和数字指示文本中描述的ARM-CD19 CAR(1×106剂量组)和TM-CD19 CAR(0.5×106剂量组)之间的倍数变化比较：3倍(IFN-γ)；和10倍(IL-2)。由于肿瘤负荷或体重减轻而被取下的组没有显示最后的时间点。测量2项研究的血浆细胞因子水平。no tum：无肿瘤。
图32.用PBS媒介物、UTD、TM-CD19 CAR或ARM-CD19 CAR处理的携带NALM6肿瘤的小鼠中总和和CAR+ T细胞浓度的时间过程。在CAR-T细胞注射后4、7、14、21和28天采集血样。在设计的时间点通过流式细胞术分析总T细胞(CD3+，上)和CAR+ T细胞(CD3+CAR+，下)浓度，描绘为具有95％置信区间的平均细胞。
图33A和33B.三方共培养上清液中的IL-6蛋白水平，以pg/mL表示。ARM-CD19 CAR/K562共培养细胞(图33A)或TM-CD19 CAR/K562细胞共培养细胞(图33B)，以不同比例(1:1和1:2.5)孵育6或24小时，然后将其添加至PMA分化的THP-1细胞中另外24小时。显示了与K562-CD19细胞共培养的CAR-T细胞，与K562-间皮素细胞共培养的CAR-T细胞和仅CAR-T细胞的结果。为清楚起见未示出1:5比率。仅ARM-CD19 CAR和仅TM-CD19 CAR的指定条代表没有靶细胞的CAR-T细胞培养物(6小时，24小时)。平均值+SEM，n＝1(TM-CD19CAR)和n＝3(ARM-CD19 CAR)的重复。
图34A、34B、和34C.ARM过程保留了BCMA CAR+T细胞的干细胞性。评估使用ARM过程制备的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞在解冻时(图34A)和解冻后48小时(图34B)的CAR表达。还评估了解冻后48小时产物的CCR7/CD45RO标志物(图34C)。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图35A和35B.TM过程主要产生中枢记忆T细胞(TCM)(CD45RO+/CCR7+)，而初始样T细胞群体几乎在使用TM过程制造的CAR+T细胞中消失。在第9天评估使用TM过程制备的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞的CAR表达(图35A)。还在解冻后产物的第9天评估CCR7/CD45RO标志物(图35B)。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图36A、36B、36C、和36D.ARM处理的BCMA CAR-T细胞表现出BCMA特异性活化并分泌更高水平的IL2和IFN-γ。细胞培养上清液中的IL-2和IFN-γ浓度。使用ARM或TM过程制造的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞和各自的UTD与KMS-11以2.5:1的比例共培养。20小时后收集上清液。对于ARM产物，IFN-γ浓度显示在图36A中，IL-2浓度显示在图36B中。对于TM产物，IFN-γ浓度显示在图36C中，IL-2浓度显示在图36D中。显示的数据是来自使用两个供体T细胞进行的两个实验的一个代表。
图37A、37B、和37C.输入细胞(图37A)、第1天细胞(图37B)和第9天细胞(图37C)的单细胞RNA-seq数据。“nGene”图显示每个细胞中表达的基因的数量。“nUMI”图显示每个细胞中独特分子标识符(UMI)的数量。
图38A、38B、38C、和38D.T-分布随机邻域嵌入(TSNE)图比较输入细胞(图38A)、第1天细胞(图38B)和第9天细胞(图38C)的增殖特征，其基于基因CCNB1、CCND1、CCNE1、PLK1、和MKI67的表达确定。每个点代表该样品中的一个细胞。显示为浅灰色的细胞不表达增殖基因，而深色阴影的细胞表达一种或多种增殖基因。图38D是小提琴图，示出了基因集的基因集评分的分布，该基因集由多个基因集成，该多个基因表征第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的静息对比活化T细胞状态。在图38D中，较高的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明静息T细胞表型增加，而较低的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明活化的T细胞表型增加。与第9天和第1天细胞相比，输入细胞总体上处于静息状态。第1天细胞显示最大的活化基因集评分。
图39A、39B、39C、39D和39E.输入细胞、第1天细胞和第9天细胞的基因集分析。在图39A中，基因集“向上TEM对比向下TSCM”的较高基因集评分表明该样品中细胞的效应记忆T细胞(TEM)表型增加，而较低的基因集评分表明干细胞记忆T细胞(TSCM)表型增加。在图39B中，基因集“向上Treg对比向下Teff”的较高基因集评分表明增加的调节性T细胞(Treg)表型，而较低的基因集评分表明增加的效应T细胞(Teff)表型。在图39C中，基因集“向下干细胞性”的较低基因集评分表明干细胞性表型增加。在图39D中，基因集“向上缺氧”的较高基因集评分表明高缺氧表型增加。在图39E中，基因集“向上自噬”的较高基因集评分表明高自噬表型增加。在记忆、干细胞样和分化特征方面，第1天细胞看起来与输入细胞相似。另一方面，第9天细胞显示出更高的代谢应激富集。
图40A、40B、和40C.输入细胞的基因簇分析。图40A-40C是小提琴图，示出了来自输入细胞的四个簇的基因集分析的基因集评分。图40A-40C小提琴图中重叠的每个点表示细胞的基因集评分。在图40A中，基因集“向上Treg对比向下Teff”的较高基因集评分表明Treg细胞表型增加，而基因集“向上Treg对比向下Teff”的较低基因集评分表明Teff细胞表型增加。在图40B中，基因集“记忆分化逐渐增加”的更高的基因集评分表明晚期记忆细胞T细胞表型增加，而基因集“记忆分化逐渐增加”的更低的基因集评分表明早期记忆细胞T细胞表型增加。在图40C中，基因集“向上TEM对比向下TN”的较高基因集评分表明效应记忆T细胞表型增加，而基因集“向上TEM对比向下TN”的较低基因集评分表明初始T细胞表型增加。簇3中的细胞显示处于晚期记忆(进一步分化的)T细胞状态中，与处于早期记忆的簇1和簇2中的细胞相比，呈现较低分化的T细胞状态。簇0似乎处于中间T细胞状态。总之，该数据示出了输入细胞内存在相当水平的异质性。
图41A、41B、和41C.TCR测序和测量克隆型多样性。第9天细胞具有更平坦的克隆型频率分布(更高的多样性)。
图42是显示在患有复发和/或难治性多发性骨髓瘤的成年患者中使用ARM过程制造的BCMA CART细胞的I期临床试验的设计的流程图。
图43是显示在存在或不存在两种不同浓度(30μM和100μM)的AZT的情况下病毒添加后不同收集时间点的ARM-BCMA CAR表达的FACS分析的图。在活化和细胞接种时，在AZT处理之前1小时添加慢病毒载体。
图44A和44B是显示在解冻时ARM-BCMA CAR的CAR表达的评估(图44A)和解冻后48小时和在48h解冻后产物CCR7/CD45RO标志物以及第9天的TM-BCMA CAR的CAR表达的评估(图44B)。显示的数据是来自使用来自两个供体的T细胞进行的两个实验的一个代表。
图45A和45B是显示细胞培养上清液中的细胞因子浓度的图。将ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR以及各自的UTD与KMS-11共培养。24小时后收集上清液。显示的数据是来自使用来自两个供体的T细胞进行的两个实验的一个代表。
图46是显示用于测试ARM-BCMA的异种移植物功效研究的概要的图。
图47是比较异种移植模型中ARM-BCMA CAR的功效与TM-BCMA CAR的功效的图。给NSG小鼠注射MM细胞系KMS11，表达荧光素酶报告基因。肿瘤负荷表示为全身发光(p/s)，描绘为平均肿瘤负荷+SEM。在肿瘤接种后第8天，用各自剂量的ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。媒介物(PBS)和UTD T细胞用作阴性对照。对于所有组，N＝5只小鼠，除了对于ARM-BCMA CAR(1e4个细胞)、PBS和UTD组N＝4。
图48A、48B和48C是显示用ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理的小鼠的血浆IFN-γ动力学的图。在相应的CAR-T细胞剂量下用UTD、ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理的携带KMS11-luc肿瘤的小鼠的血浆IFN-γ水平。所有IFN-γ水平均表示为平均值±SEM。将小鼠放血并通过Meso Scale Discovery(MSD)测定法测量血浆细胞因子。
图49是显示体内ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR的细胞动力学的图。用不同剂量的TM UTD、ARM UTD、ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR处理的携带KMS11肿瘤的小鼠的外周血中的细胞动力学。细胞计数表示为平均细胞计数+SD。在肿瘤接种后第8天，用各自剂量的ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR处理小鼠(活CAR+ T细胞的数目)。媒介物(PBS)和UTD T细胞用作阴性对照。在CAR-T注射后第7、14和21天采集血液样品，并在设计的时间点通过流式细胞术分析。对于所有组，N＝5只小鼠，除了对于ARM-BCMA CAR(1e4个细胞)、PBS和UTD组N＝4。
图50A和50B是显示24小时后活力百分比(图50A)和24小时后回收百分比(图50B)的一对图。图50A和50B中所示的列从左到右代表CAR19(MOI为1)、CAR19(MOI为2)、CAR19.HilD(MOI为1)、CAR19.HilD(MOI为2)、UTD(MOI为1)、以及UTD(MOI为2)的数据。
图51A-51D是显示在如图中所示的来那度胺或DMSO存在下，CAR19细胞(图51A和51B)或CAR19.HilD细胞(图51C和51D)中CAR表达百分比的图。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，“可控嵌合抗原受体(CCAR)”是指水平和/或活性可以调节的CAR。在一些实施例中，可以调节CCAR的表达水平或活性以增强CAR功能和/或减少毒性。在一些实施例中，CCAR在转录、翻译或翻译后水平上受到调节。在一些实施例中，CCAR由打开开关调节，该打开开关导致CAR的稳定或打开CAR的表达和/或活性。在一些实施例中，CCAR由关闭开关调节，该关闭开关导致CAR的泛素化和降解或关闭CAR的表达和/或活性。在一些实施例中，CCAR由打开开关和关闭开关两者调节。在一些实施例中，CCAR包含WO 2019079569中披露的降解决定子(degron)标签，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，CCAR是WO 2015090229中披露的可调节的CAR(RCAR)，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，CCAR是WO 2014127261中披露的异二聚体的、条件活性CAR，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，CCAR是WO 2016014553中披露的分选酶合成CAR，将其通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，“调节分子”是指具有调节活性的分子或可用于介导调节活性的分子。在一些实施例中，调节分子可以与CAR在细胞中共表达以直接(例如，通过直接影响CAR的表达水平或功能性活性)或间接(例如，通过调节表达CAR的细胞的存活或活性)调节CAR的表达和/或活性。在一些实施例中，调节分子可用于诱导死亡，例如，诱导细胞的细胞凋亡，例如，表达CAR的细胞的细胞凋亡。在一些实施例中，调节分子可用于活化细胞，例如，表达CAR的细胞。在一些实施例中，调节分子是标记细胞，例如表达CAR的细胞的耗减的标志物，例如，细胞表面标志物。在一些实施例中，调节分子是半胱天冬酶，例如，诱导型半胱天冬酶9，例如，WO 2011146862、WO 2014164348或WO 2016100236中披露的诱导型半胱天冬酶9，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，调节分子是截短的EGFR，例如，WO2011056894或WO 2013123061中披露的截短的EGFR，将其通过引用以其全文并入本文。
术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
本披露的组合物和方法涵盖具有指定序列，或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％或95％同一性或更高同一性的序列的多肽和核酸。在氨基酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一氨基酸序列含有足够或最小数量的氨基酸残基，这些氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)是第二氨基酸序列中比对的氨基酸残基的保守取代，以使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同结构域和/或共同功能活性，例如含有与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构域的氨基酸序列。
在核苷酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够或最小数量的核苷酸，这些核苷酸与第二核酸序列中的比对核苷酸相同，以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽结构域或共同功能多肽活性，例如与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，变体是功能变体。
术语“功能变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考氨基酸序列的一种或多种活性的多肽。
术语细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或IL-6)包括天然存在的细胞因子(包括具有至少10％、30％、50％或80％的活性(例如天然存在的细胞因子免疫调节活性)的其片段和功能变体)的全长、片段或变体，例如功能变体。在一些实施例中，细胞因子具有与天然存在的细胞因子基本相同的氨基酸序列(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，或由与编码细胞因子的天然存在的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列编码(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在一些实施例中，如上下文所述，细胞因子进一步包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域(例如，IL-15/IL-15R)。
术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，CAR是CCAR，例如，本文披露的CCAR。
在一些实施例中，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些实施例中，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自共刺激分子的功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含CAR融合蛋白的氨基-末端(N-末端)处的任选前导序列。在一些实施例中，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N-末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR也称为XCAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMA CAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，该蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、骆驼科VHH结构域和由如二价片段的抗体片段形成的多特异性分子，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个或更多个(例如两个)Fab片段，或所连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其他表位结合片段。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、多抗体、微抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗体片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N-末端和C-末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。在一些实施例中，scFv可包含NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH的结构。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚”编号方案)、或其组合。在组合的卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为卡巴特CDR、乔西亚CDR或两者的一部分的氨基酸残基。
包含抗体或其抗体片段的本披露的CAR组合物部分可以多种形式存在，例如，其中抗原结合结构域表达为多肽链的一部分，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如，人或人源化抗体(Harlow等人,1999,Using Antibodies:A LaboratoryManual[使用抗体：实验室手册]中,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]中,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些实施例中，本披露的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在一些实施例中，CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(在本文中也称为“抗靶标结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“双特异性抗体(bispecific antibody/bispecific antibodies)”是指在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能够同时或依次结合两种不同的抗原。用于生产双特异性抗体的方法是本领域已知的。用于组合两种抗体的各种形式也是本领域已知的。如本领域技术人员已知的，本披露的双特异性抗体的形式包括但不限于双抗体、单链双抗体、Fab二聚化(Fab-Fab)、Fab-scFv和串联抗体。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本披露包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗肿瘤作用”和“抗癌作用”在本文中可互换使用，是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积或癌体积减少、肿瘤细胞或癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、肿瘤细胞增殖或癌细胞增殖减少、肿瘤细胞存活率或癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗肿瘤作用”或“抗癌作用”也可以通过本披露的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤或癌症发生的能力来表现。
术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些实施例中，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“单采(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，将供体或患者的血液从供体或患者移出并使血液穿过分离出一种或多种所选择的特定成分的装置，并使其余部分返回至该供体或患者的循环(例如，通过回输法)。因此，在“单采样品”的上下文中是指使用单采获得的样品。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些实施例中，通过本文所述的方法治疗的癌症包括多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
“源自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本披露的抗体或抗体片段中。保守取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本披露的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的CAR。
在刺激和/或共刺激分子刺激的上下文中，术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)和/或具有其同源配体的共刺激分子(例如，CD28或4-1BB)的结合诱导的应答，例如，首次或二次应答，由此介导信号转导事件，例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，和/或细胞骨架结构的重构等。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其针对T细胞信号传导途径的至少一些方面提供以刺激方式调节TCR复合物的初级活化的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一些实施例中，CAR内的含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现初级TCR的信号传导。在一些实施例中，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而引发，并且其导致T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本披露中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本披露的特定CAR中，本披露的任何一种或多种CARS中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突状细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在实施例中，细胞内信号结构域转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:9或10提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”是指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO:7提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在一些实施例中，表达包括被引入细胞的mRNA的翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的LENTIVECTOR
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基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间(例如，两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间、或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。
“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。
在本披露的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，该核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。在一些实施例中，“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”包括核苷酸/核苷衍生物或类似物。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代，例如保守取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代(例如，保守取代)可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”、“肿瘤抗原”、“过度增殖性障碍抗原”、和“与过度增殖性障碍相关的抗原”可互换地指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在一些实施例中，这些术语是指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本披露的过度增殖性障碍抗原源自癌症，这些癌症包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等)，或浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶液质、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。在一些实施例中，本披露的CAR包括包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher[基因疗法]20018(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，该细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上。
如在scFv的语境中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一些实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:41)。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5并且n＝6、n＝7、n＝8、n＝9并且n＝10。在一些实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。在一些实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。WO 2012/138475中所述的接头也包括在本披露的范围内，将其通过引用并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA。在一些实施例中，RNA是mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施例中，聚(A)在50和5000之间(SEQ ID NO:30)。在一些实施例中，聚(A)大于64个。在一些实施例中，聚(A)大于100个。在一些实施例中，聚(A)大于300个。在一些实施例中，聚(A)大于400个。聚(A)序列可以经化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'多聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将多聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本披露的CAR)引起。在特定实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，例如，人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施例中，在体外培养细胞。在一些实施例中，不在体外培养细胞。
如本文所用，术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用，术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质，但是其中抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供针对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的语境中定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如表达RCAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一些实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一些实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为表达RCAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。
当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜系链结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在存在二聚化分子的情况下与另一个开关结构域缔合。缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，该开关是细胞内的。在实施例中，该开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如雷帕霉素类似物(rapalogue))。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如RAD001。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指mTOR抑制剂部分但不是完全抑制mTOR活性的剂量，例如，如通过P70 S6激酶活性的抑制测量的。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70 S6激酶。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一些实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数目的减少和/或PD-1阴性T细胞数目的增加，或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率的增加。在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致初始T细胞的数目增加。在一些实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致以下中的一个或多个：
以下标志物中的一个或多个例如在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达增加：CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2；
KLRG1在例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达减少；以及
记忆T细胞前体，例如具有以下特征中的任一个或组合的细胞的数目增加：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、减少的KLRG1、和增加的BCL2；
其中，例如，如与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地发生上述任何变化。
如本文所用,“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
如本文所用,“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或响应期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返或再现。应答初始期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，如在B-ALL的上下文中，再现可能涉及例如在完全应答之后血液、骨髓(>5％)或任何髓外位点中的母细胞再现。在本上下文中，完全应答可能涉及<5％BM母细胞。更通常地，在一些实施例中，应答(例如，完全应答或部分应答)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一些实施例中，初始应答期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。
范围：贯穿本披露内容，能以范围形式呈现本披露的各个实施例。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本披露范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，如95％-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％、或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％、和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
当该术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。
如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在该病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合施用，该治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与该障碍相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加、或大于累加。该递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。
术语“耗减(depletion)”或“消耗(depleting)”在本文中可互换使用，是指在进行例如选择步骤(例如，阴性选择)的过程之后，样品中细胞、蛋白质或大分子的水平或量的降低或减少。耗减可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分耗减。在一些实施例中，耗减为与进行该过程之前样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，细胞、蛋白质或大分子的水平或量降低或减少至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
如本文所用，“初始T细胞”是指抗原缺乏经验的T细胞。在一些实施例中，抗原缺乏经验的T细胞在胸腺中而不在外周遇到其同源抗原。在一些实施例中，初始T细胞是记忆细胞的前体。在一些实施例中，初始T细胞表达CD45RA和CCR7，但不表达CD45RO。在一些实施例中，初始T细胞可以通过CD62L、CD27、CCR7、CD45RA、CD28和CD127的表达以及不存在CD95或CD45RO同种型来表征。在一些实施例中，初始T细胞表达CD62L、IL-7受体-α、IL-6受体和CD132，但不表达CD25、CD44、CD69或CD45RO。在一些实施例中，初始T细胞表达CD45RA、CCR7、和CD62L，但不表达CD95或IL-2受体β。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。
术语“中枢记忆T细胞”是指人类中CD45RO阳性并表达CCR7的T细胞亚群。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达CD95。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达IL-2R、IL-7R和/或IL-15R。在一些实施例中，中枢记忆T细胞表达CD45RO、CD95、IL-2受体β、CCR7和CD62L。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。
术语“干细胞记忆T细胞(stem memory T cell)”、“干细胞记忆T细胞(stem cellmemory T cell)”、“干细胞样记忆T细胞”、“记忆干细胞T细胞”、“T记忆干细胞”、“T干细胞记忆细胞”或“TSCM细胞”是指具有干细胞样能力的记忆T细胞的亚群，例如，自我更新的能力和/或重建记忆和/或效应子T细胞亚群的多潜能性能力。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞表达CD45RA、CD95、IL-2受体β、CCR7和CD62L。在一些实施例中，使用流式细胞术评估标志物的表面表达水平。在一些实施例中，示例性的干细胞记忆T细胞披露于Gattinoni等人,Nat Med.[自然医学]2017年1月06日；23(1):18-27，将其通过引用以其全文并入本文。
为清楚起见，除非另有说明，否则将细胞或细胞群体分类为“不表达”或具有“不存在”或对特定标志物“阴性”可能不一定意味着标志物的绝对缺失。本领域技术人员可以容易地将细胞与阳性和/或阴性对照进行比较，和/或设定预定阈值，并且当细胞具有表达水平低于预定阈值或细胞群体具有低于使用常规检测方法(例如，使用流式细胞术，例如，如本文实例中所述的)的预定阈值的总表达水平时，将细胞或细胞群体分类为不表达或对标志物呈阴性。例如，代表性的门控策略如图1G所示。例如，CCR7阳性、CD45RO阴性细胞显示在图1G的左上象限中。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)”是指反映细胞显示效应记忆T细胞(TEM)表型对比干细胞记忆T细胞(TSCM)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)表明TEM表型增加，而较低的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)表明TSCM表型增加。在一些实施例中，通过测量在TEM细胞中上调和/或在TSCM细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。在一些实施例中，使用RNA-seq确定每个细胞的基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图39A中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上Treg对比向下Teff)”是指反映细胞显示调节性T细胞(Treg)表型对比效应T细胞(Teff)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上Treg对比向下Teff)表明Treg表型增加，而较低的基因集评分(向上Treg对比向下Teff)表明Teff表型增加。在一些实施例中，通过测量Treg细胞中上调和/或在Teff细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上Treg对比向下Teff)，例如，选自下组的一种或多种基因，该组由以下组成：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向上Treg对比向下Teff)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图39B中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上Treg对比向下Teff)。
如本文所用，术语细胞的“基因集评分(向下干细胞性)”是指反映细胞显示干细胞性表型的程度的分数。较低的基因集评分(向下干细胞性)表明干细胞性表型增加。在一些实施例中，通过测量在分化干细胞中上调而在造血干细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向下干细胞性)，例如，选自由以下组成的组的一种或多种基因：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向下干细胞性)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图39C中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向下干细胞性)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上缺氧)”是指反映细胞显示高缺氧表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上缺氧)表明缺氧表型增加。在一些实施例中，通过测量在经历缺氧的细胞中上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上缺氧)，例如，选自由以下组成的组一种或多种基因：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向上缺氧)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图39D中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上缺氧)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上自噬)”是指反映细胞显示自噬表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上自噬)表明自噬表型增加。在一些实施例中，通过测量在经历自噬的细胞中上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上自噬)，例如，选自由以下组成的组的一种或多种基因：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向上自噬)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图39E中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上自噬)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上静息对比向下活化)”是指反映细胞显示静息T细胞表型对比活化T细胞表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明静息T细胞表型增加，而较低的基因集评分(向上静息对比向下活化)表明活化的T细胞表型增加。在一些实施例中，通过测量在静息T细胞中上调和/或在活化T细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上静息对比向下活化)，例如，选自由以下组成的组的一种或多种基因：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向上静息对比向下活化)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图38D中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上静息对比向下活化)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(记忆分化逐渐增加)”是指反映细胞在记忆分化中的阶段的分数。较高基因集评分(记忆分化逐渐增加)表明晚期记忆T细胞表型增加，而较低基因集评分(记忆分化逐渐增加)表明早期记忆T细胞表型增加。在一些实施例中，通过测量在记忆分化期间上调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上自噬)，例如，选自由以下组成的组的一种或多种基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(记忆分化逐渐增加)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图40B中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(记忆分化逐渐增加)。
如本文所用，细胞的术语“基因集评分(向上TEM对比向下TN)”是指反映细胞显示效应记忆T细胞(TEM)表型对比初始T细胞(TN)表型的程度的分数。较高的基因集评分(向上TEM对比向下TN)表明TEM表型增加，而较低的基因集评分(向上TEM对比向下TN)表明TN表型增加。在一些实施例中，通过测量在TEM细胞中上调和/或在TN细胞中下调的一种或多种基因的表达来确定基因集评分(向上TEM对比向下TN)，例如，选自由以下组成的组的一种或多种基因：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。在一些实施例中，使用RNA-seq确定基因集评分(向上TEM对比向下TN)，例如，单细胞RNA-seq(scRNA-seq)，例如，如实例10中结合图40C中例示的。在一些实施例中，通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(向上TEM对比向下TN)。
在基因集评分值(例如，中位数基因集评分值)的上下文中，当阳性基因集评分减少100％时，该值变为0。当阴性基因集评分增加100％时，该值变为0。例如在图39A中，第1天样品的中位数基因集评分是-0.084；第9天样品的中位数基因集评分是0.035；并且输入样品的中位数基因集评分是-0.1。在图39A中，输入样品的中位数基因集评分增加100％导致基因集评分值为0；并且输入样品的中位数基因集评分增加200％导致基因集评分值为0.1。在图39A中，第9天样品的中位数基因集评分降低100％导致基因集评分值为0；并且第9天样品的中位数基因集评分降低200％导致基因集评分值为-0.035。
如本文所用，术语“珠”是指具有固体表面的离散颗粒，其尺寸范围为直径从约0.1μm至数毫米。珠可以是球形的(例如，微球)或具有不规则的形状。珠可包括多种材料，包括但不限于顺磁性材料、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、SepharoseTM、纤维素、尼龙等。在一些实施例中，珠是相对均匀的、直径约4.5μm、球形、超顺磁性聚苯乙烯珠，例如，用抗CD3抗体(例如CD3ε)和CD28的混合物涂覆，例如，共价偶联。在一些实施例中，珠是
Figure BDA0003867148300001141
。在一些实施例中，抗CD3和抗CD28抗体都与相同的珠偶联，模拟抗原呈递细胞对T细胞的刺激。
Figure BDA0003867148300001142
的性质和
Figure BDA0003867148300001143
用于细胞分离和扩增的用途是本领域熟知的，例如，参见Neurauter等人,Cell isolation andexpansion using Dynabeads[使用Dynabeads进行细胞分离和扩增],Adv Biochem EngBiotechnol.[生物化学工程生物技术的进展]2007；106:41-73，将其通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“纳米基质”是指包含可移动聚合物链基质的纳米结构。纳米基质的尺寸为1至500nm，例如10至200nm。在一些实施例中，移动聚合物链的基质与一种或多种激动剂附接，该激动剂向T细胞提供活化信号，例如激动剂抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施例中，纳米基质包含附接的胶体聚合物纳米基质，例如共价附接至一种或多种刺激分子的激动剂和/或一种或多种共刺激分子的激动剂。在一些实施例中，一种或多种刺激分子的激动剂是CD3激动剂(例如，抗CD3激动性抗体)。在一些实施例中，一种或多种共刺激分子的激动剂是CD28激动剂(例如，抗CD28激动剂抗体)。在一些实施例中，纳米基质通过不存在固体表面来表征，例如，作为激动剂的附着点，例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施例中，纳米基质是WO2014/048920A1中披露的纳米基质或来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotcc GmbH)的
Figure BDA0003867148300001151
GMP T Cell TransActTM试剂盒中给出的纳米基质，其通过引用整体并入本文。
Figure BDA0003867148300001152
GMP T Cell TransActTM由共价附接至针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂抗体的胶体聚合物纳米基质组成。
如本文所用，“泛素化”是指添加泛素分子，例如，单一泛素(单泛素化)或多于一个泛素(例如，泛素分子的链，或多泛素化)。泛素化可以通过酶机制来进行，该酶机制包括泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素连接酶(E3)中的一种或多种。
如本文所用，术语“CRBN”是指在人中由CRBN基因编码的蛋白质，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。Swiss-Prot登录号Q96SW2提供了示例性人CRBN氨基酸序列。
如本文所用，“IKZF多肽”是指IKZF，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，术语“IKZF3”是指在人中由IKZF3基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9UKT9提供了示例性人IKZF3氨基酸序列。示例性人IKZF3氨基酸序列提供在SEQ IDNO:328中。术语“IKZF3多肽”是指IKZF3，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，术语“IKZF1”是指在人中由IKZF1基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q13422提供了示例性人IKZF1氨基酸序列。示例性人IKZF1氨基酸序列提供在SEQ IDNO:329中。术语“IKZF1多肽”是指IKZF1，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，术语“IKZF2”是指在人中由IKZF2基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9UKS7提供了示例性人IKZF2氨基酸序列。示例性人IKZF2氨基酸序列提供在SEQ IDNO:330中。术语“IKZF2多肽”是指IKZF2，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，术语“IKZF4”是指在人中由IKZF4基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9H2S9提供了示例性人IKZF4氨基酸序列。示例性人IKZF4氨基酸序列提供在SEQ IDNO:331中。术语“IKZF4多肽”是指IKZF4，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，术语“IKZF5”是指在人中由IKZF5基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号Q9H5V7提供了示例性人IKZF5氨基酸序列。示例性人IKZF5氨基酸序列提供在SEQ IDNO:332中。术语“IKZF5多肽”是指IKZF5，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。
如本文所用，“融合多肽”或“嵌合多肽”是指在单个、连续多肽中包括两个或更多个异源氨基酸序列和/或蛋白质结构域的多肽。在一些实施例中，这两个或更多个异源蛋白结构域直接或间接地(例如，经由接头)共价连接。
如本文所用，术语“雌激素受体(ER)”是指在人中由ESR1基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P03372提供了示例性人雌激素受体(ER)氨基酸序列。“雌激素受体(ER)结构域”是指雌激素受体，或其片段或变体(例如，与其基本上相同的氨基酸序列，例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)。示例性雌激素受体(ER)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:340、342和344中。示例性雌激素受体(ER)结构域核苷酸序列提供在SEQ ID NO:341、343和345中。
如本文所用，“FKB蛋白(FKBP)结构域”是指FKBP或其片段或变体。示例性FKB蛋白(FKBP)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:346中。
如本文所用，术语“二氢叶酸还原酶(DHFR)”是指在人中由DHFR基因编码的蛋白质。Swiss-Prot登录号P00374提供了示例性人二氢叶酸还原酶(DHFR)氨基酸序列。“二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域”是指DHFR或其片段或变体。示例性二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域氨基酸序列提供在SEQ ID NO:347中。
如本文所用，术语“降解结构域”是指当在存在稳定化合物的情况下表达时呈现稳定构象的融合多肽的结构域。当在目的细胞中表达时不存在稳定构象，大部分降解结构域(并且典型地是与它们融合的任何蛋白质)将通过内源性细胞机制降解。值得注意地，降解结构域不是蛋白质的天然存在的结构域，而是被工程改造成在不与稳定化合物接触的情况下是不稳定的。因此，可以通过以下特征来鉴定降解结构域：(1)它不是天然存在的；(2)通过增加或降低降解速率来共翻译地或翻译后地调节其表达；(3)在存在稳定化合物的情况下，降解率实质性降低。在一些实施例中，缺少稳定化合物情况下，融合多肽的降解结构域或其他结构域在细胞中或在细胞上是基本上不可检测的。在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，降解结构域处于不稳定状态。在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，降解结构域不自缔合，例如，不同源二聚化。在一些实施例中，降解结构域与异源蛋白酶切割位点融合，其中在存在稳定化合物的的情况下，异源蛋白酶切割位点的切割比在不存在稳定化合物的情况下更有效。
降解结构域不是如PCT申请号PCT/US 2017/027778中定义的聚集结构域。
“稳定化合物”或“稳定性化合物”是指如下化合物，当添加至表达降解结构域的细胞时，稳定降解结构域和与其融合的任何蛋白质，并降低其随后降解的速率。稳定化合物或稳定性化合物可以是天然存在的或合成的。
此外，“异源蛋白酶切割位点”表示相比与其融合的一个或多个蛋白质结构域具有不同起源的蛋白酶切割位点(例如，不与其他参考的结构域中的至少一个天然融合)。
“蛋白酶”表示基于待切割的蛋白质中切割位点的存在而切割另一种蛋白质的蛋白质。
“细胞内蛋白酶”表示在目的细胞内天然表达的蛋白酶。
“细胞外蛋白酶”是指在生物体(例如，哺乳动物)中天然表达并且分泌或暴露于细胞外部(例如，在血液中或皮肤表面)的蛋白酶。
如本文所用，术语“切割”是指共价键的断裂(例如在核酸分子的主链中共价键的断裂)或肽键的水解。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的。双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果。
以下更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据元素周期表,CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics[物理化学手册],第75版,内封面进行鉴定，并且特定官能团通常如其中所述被定义。另外，有机化学的一般原理以及特定功能性部分和反应性描述在Thomas Sorrell,Organic Chemistry[有机化学],University ScienceBooks[大学科学书籍出版社],索萨利托,1999；Smith和March,March’s Advanced OrganicChemistry[马奇氏高级有机化学]，第5版,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子出版社],纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[有机官能团转换],VCH Publishers,Inc.[VCH出版社有限公司],纽约,1989；以及Carruthers,Some ModernMethods of Organic Synthesis,3rd Edition[有机合成的一些现代方法],CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社],剑桥,1987中。
如本文所用的术语“烷基”是指一价饱和的直链或支链烃，如1-12、1-10或1-6个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别称为C1-C12烷基、C1-C10烷基和C1-C6烷基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基等。
如本文所用，术语“烯基”和“烷基”指的是相对于上述烷基在长度与相似且可能被取代的不饱和脂族基团，但分别含有至少一个双键或三键。示例性的烯基包括但不限于-CH＝CH2和-CH2CH＝CH2。
如本文所用，术语“烷氧基”是指含有1-12个碳原子的直链或支链饱和的烃，其在链中含有末端“O”，例如-O(烷基)。烷氧基基团的实例包括而不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、或戊氧基基团。
如本文所用，术语“芳基”是指单环、二环或多环烃环系统，其中至少一个环是芳香族的。代表性的芳基包括完全芳族的环系统，如苯基(例如(C6)芳基)、萘基(例如(C10)芳基)和蒽基(例如(C14)芳基)，以及如下环系统，这些环系统中芳族碳环融合至一个或多个非芳族碳环，如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基(naphthimidyl)或四氢萘基等。
如本文所用，术语“碳环基”是指含有3-18个碳原子的单环或稠合、螺-稠合和/或桥连的二环或多环烃环系统，其中每个环是完全饱和的或包含一个或多个不饱和的单元，但没有环是芳香族的。代表性的碳环基基团包括环烷基基团(例如，环戊基、环丁基、环戊基、环己基等)和环烯基基团(例如，环戊烯基、环己烯基、环戊二烯基等)。
如本文所用的术语“羰基”是指-C＝O。
如本文所用的术语“氰基”是指-CN。
如本文所用的术语“卤代(halo)”或“卤素(halogen)”是指氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)、或碘(碘代，-I)。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指单价饱和的直链或支链烷基链，其中该链中的至少一个碳原子被一个或多个卤素原子取代。在一些实施例中，卤代烷基基团可以包含例如，1-12、1-10、或1-6个碳原子，在本文中被称为C1-C12卤代烷基、C1-C10卤代烷基、以及C1-C6卤代烷基。卤代烷基基团的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
术语“卤代烷氧基”是指含有1-12个碳原子、在链中含有末端“O”的直链或支链饱和烃，其中链中的至少一个碳原子被一个或多个卤素取代。卤代烷氧基基团的实例包括但不限于三氟甲氧基、二氟甲氧基、五氟乙氧基、三氯甲氧基等。
如本文所用的术语“杂烷基”是指单价饱和直链或支链烷基链，其中链中的至少一个碳原子被杂原子(例如，O、S或N)置换，条件是在取代后，该链包含至少一个碳原子。在一些实施例中，杂烷基基团可以包含例如1-12、1-10或1-6个碳原子，在本文中称为C1-C12杂烷基、C1-C10杂烷基和C1-C6杂烷基。在某些实例中，杂烷基基团包含1、2、3或4个独立选择的杂原子代替烷基链中1、2、3或4个单独的碳原子。代表性的杂烷基包括-CH2NHC(O)CH3、-CH2CH2OCH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2CH2N(CH3)CH3等。
如本文所用，术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”和“杂亚烷基”分别指烷基、烯基、炔基或杂烷基基团的二价基团。通过从烷基、烯基、炔基或杂烷基基团中提取第二氢原子，单价烷基、烯基、炔基或杂烷基基团中的任一者可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基或杂亚烷基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指单环、二环或多环的环系统，其中至少一个环是芳香族环且包含杂原子；且其中没有其他环是杂环基(如下定义)。代表性的杂芳基基团包括环系统，其中(i)每个环包含杂原子，并且是芳香族的，例如，咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和喋啶基；(ii)每个环是芳族的或碳环基，至少一个芳族环包含杂原子并且至少一个其他环是烃环，或例如吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、肉桂啉基、酞菁基、喹唑啉基、喹喔啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、苯恶嗪基、吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮、噻唑并-[4,5-c]-吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、5,6-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡咯基、4,5,6,7,8-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基；以及(iii)每个环是芳族的或碳环基，并且至少一个芳族环与另一个芳族环例如4H-喹啉基共有桥头杂原子。在某些实施例中，杂芳基是单环或二环的环，其中每个所述的环包含5或6个环原子，其中所述环原子中的1、2、3或4个是独立地选自N、O和S的杂原子。
如本文所用，术语“杂环基”是指单环的或稠合的、螺-稠合的和/或桥连的二环和多环的环系统，其中至少一个环是饱和的或部分不饱和的(但不是芳香族的)，并且包含杂原子。杂环基可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处附接至其侧基，并且任何环原子可以任选地被取代。代表性的杂环基包括环系统，其中(i)每个环是非芳族的并且至少一个环包含杂原子，例如四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯烷基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、噻氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基；(ii)至少一个环是非芳族的并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳族碳环，例如1,2,3,4-四氢喹啉基；(iii)至少一个环是非芳族的并且包含杂原子，并且至少一个其他的环是芳族的并且包含杂原子，例如3,4-二氢-1H-吡喃并[4,3-c]吡啶基和1,2,3,4-四氢-2,6-萘啶基。在某些实施例中，杂环基是单环或双环，其中每个所述环含有3-7个环原子，其中1、2、3或4个所述环原子是独立地选自N、O和S的杂原子。
如本文所述，本披露的化合物可以包含“任选地取代的”部分。通常，术语“取代的”，无论术语“任选地”是否在其之前，表示指定部分的一个或多个氢被合适的取代基置换。除非另有说明，否则“任选地取代的”基团可以在该基团的每个可取代的位置处具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的一个以上位置可被选自指定基团的一个以上取代基取代时，该取代基在每个位置处可以是相同或不同的。在本披露中设想的取代基的组合优选是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。如本文所用，术语“稳定”是指如下化合物，在出于本文所披露的一个或多个目的而经历其制备、检测以及在某些实施例中经历其回收、纯化和使用的条件时，它们基本上不发生改变。
如本文所用，术语“氧代”是指＝O。
如本文所用，术语“硫代羰基”是指C＝S。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人或低级动物的组织接触，而没有不适当的毒性、刺激、过敏应答等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19(通过引用并入本文)中详细地描述了药学上可接受的盐。本披露的这些化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机酸和有机酸以及碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是用无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的具有氨基基团的盐，或通过使用本领域已知的其他方法(例如，离子交换)形成的具有氨基基团的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸钠、苯甲酸盐、硫酸氢钠、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸钠、柠檬酸盐、环戊酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸酯、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、碘化氢盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、氨酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐在适当时包括无毒性铵、季铵以及使用抗衡离子(例如，卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的胺阳离子。
术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物的形式。此物理缔合可以包括氢键合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚等。具有式(I)、式(I-a)和/或式(II)的化合物可以例如以结晶形式制备并且可以被溶剂化。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情况下，溶剂化物能够分离(例如当一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时)。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。
术语“水合物”是指与水缔合的化合物。典型地，化合物的水合物中包含的水分子的数目与水合物中化合物分子的数目具有确定的比率。因此，化合物的水合物可以由例如通式R·x H2O代表，其中R是化合物，并且其中x是大于0的数字。给定的化合物可以形成多于一种类型的水合物，包括例如，一水合物(x是1)、低级水合物(x是大于0且小于1的数字，例如，半水合物(R·0.5H2O))和多水合物(x是大于1的数字，例如，二水合物(R·2H2O)和六水合物(R·6H2O))。
应当理解，具有相同的分子式，但在它们原子的键合性质或顺序或它们的原子在空间中的排列方面不同的化合物被称为“异构体”。在它们的原子在空间中的排列方面不同的异构体被称为“立体异构体”。
不互为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，且互为非重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心时，例如，它会与四个不同的基团键合，并且可能有一对对映异构体。对映异构体的特征在于其不对称中心的绝对构型，并由Cahn和Prelog的R和S测序规则描述，或由分子旋转偏振光平面的方式描述，称为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单独的对映异构体或作为其混合物存在。包含等比例对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。
术语“互变异构体”是指具有可互换形式的特定化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为通过用酸或碱的处理它们快速地相互转化。互变异构的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸-和硝基-形式，它们同样是通过用酸或碱处理而形成的。
互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。
除非另有说明，否则本文所描绘的结构还意味着包括结构的所有异构体(例如，对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物都在本披露的范围内。除非另有说明，否则本披露化合物的所有互变异构形式都在本披露的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描绘的结构还意在包括仅在存在一个或多个同位素富集的原子的情况下不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物，包括用氘或氚替换氢，或用富含13C-或14C-的碳替换碳，都在本披露的范围内。在实施例中，存在于本文披露的任何一种化合物(例如，具有式(I)的化合物)中的氢原子在同位素方面富集氘。这样的化合物例如可用作分析工具，用作生物学测定中的探针或用作根据本披露的治疗剂。
在特定对映体是优选的情况下，在一些实施例中，它可以基本上不含相应的对映体，并且也可以称为“光学富集的”提供。如本文所用，“光学富集的”意指化合物由显著更大比例的一种对映异构体组成。在某些实施例中，化合物由按重量计至少约90％的优选的对映异构体组成。在其他实施例中，化合物由按重量计至少约95％、98％或99％的优选的对映异构体组成。优选的对映异构体可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从外消旋混合物中分离，或通过不对称合成制备。参见，例如Jacques等人.,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和分辨率](Wiley Interscience[威利国际科学出版社],纽约,1981)；Wilen,等人.,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of CarbonCompounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill[麦格劳希尔出版社],NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions[分辨剂和光学分辨率的表]第268页(E.L.Eliel,编辑,Univ.of Notre Dame Press[圣母大学出版社],巴黎圣母院(Notre Dame),IN 1972)。
本文的组合物和方法的各个实施例在下文进一步详细描述。另外的定义在整个申请书中陈述。
说明
本文提供了制造经工程化以表达CAR(例如本文所述的可控的CAR(CCAR))的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法、包含此类细胞的组合物、以及使用此类细胞治疗受试者的疾病(如癌症)的方法。在一些实施例中，本文披露的方法可以在不到24小时内制造经工程化以表达CAR的免疫效应细胞。不希望受理论束缚，本文提供的方法在制造过程中保留T细胞的未分化表型，例如初始T细胞。这些具有未分化表型的表达CAR的细胞在输注后可在体内持续更长时间和/或更好地扩增。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的干细胞记忆T细胞，例如，如使用scRNA-seq测量的(例如，如使用实例10中结合图39A中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的效应T细胞，例如，如使用scRNA-seq测量的(例如，如使用实例10中结合图39B中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞更好的保留T细胞的干细胞性，例如，如使用scRNA-seq测量的(例如，如使用实例10中结合图39C中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的缺氧，例如，如使用scRNA-seq测量的(例如，如使用实例10中结合图39D中所述的方法测量的)。在一些实施例中，与通过传统制造方法产生的CART细胞相比，通过在此提供的制造方法产生的CART细胞显示低水平的自噬，例如，如使用scRNA-seq测量的(例如，如使用实例10中结合图39E中所述的方法测量的)。
在一些实施例中，本文披露的方法不涉及使用珠，例如
Figure BDA0003867148300001261
(例如，CD3/CD28
Figure BDA0003867148300001262
)，并且不涉及去珠步骤。在一些实施例中，通过本文披露的方法制造的CART细胞可以以最小的离体扩增施用于受试者，例如，小于1天、小于12小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、或没有离体扩张。因此，本文描述的方法提供了制备改进的表达CAR的细胞产物的快速制造过程，这些细胞产物用于治疗受试者的疾病。
细胞因子过程
在一些实施例中，本披露提供了制备细胞(例如T细胞)群体的方法，该细胞群体表达嵌合抗原受体(CAR)，例如本文披露的CAR，例如本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体进一步表达调节分子。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。在一些实施例中，该方法包括：(1)使细胞群体与细胞因子(选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合)接触；(2)使细胞(例如，T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如，T细胞)群体；和(3)收获细胞(例如，T细胞)群体，以用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行，或在步骤(1)开始后不晚于5小时(例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时)进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时(例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时)进行；或(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％(例如，不超过10％)。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在病毒载体(例如选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(2)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(2)包括用包含编码CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001271
Figure BDA0003867148300001272
装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，在细胞因子过程结束时，将CAR T细胞冷冻保存，然后解冻并施用受试者。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜的产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001281
装置)。然后使用本文所述的细胞因子过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001282
装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的细胞因子过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，在细胞(例如，T细胞)接种后，将一种或多种细胞因子(例如选自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如IL-6/sIL-6R)中的一种或多种的细胞因子)以及编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中。孵育20-24小时后，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
与传统的CART制造方法不同，本文提供的细胞因子过程不涉及CD3和/或CD28刺激或离体T细胞扩增。与抗CD3和抗CD28抗体接触并且离体广泛扩增的T细胞倾向于显示向中枢记忆表型的分化。不希望受理论束缚，本文提供的细胞因子过程在CART制造期间保留或增加T细胞的未分化表型，产生可在输注入至受试者后持续更长时间的CART产物。
在一些实施例中，使细胞群体与一种或多种细胞因子接触(例如，一种或多种选自IL-2、IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)的细胞因子)。
在一些实施例中，使细胞群体与IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-2和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-21和IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)接触。在一些实施例中，使细胞群体与IL-7、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和IL-21接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与LSD1抑制剂接触。在一些实施例中，使细胞群体进一步与MALT1抑制剂接触。
在一些实施例中，使细胞群体与20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300U/ml的IL-2接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-7接触。在一些实施例中，使细胞群体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20ng/ml的IL-15接触。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。在一些实施例中，使细胞群体与编码CCAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CCAR的DNA分子转导细胞群体。在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR和调节分子的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR和调节分子的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触同时使细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与上述一种或多种细胞因子接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触，或如果进行接触，接触步骤少于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5小时。
在一些实施例中，细胞群体在体外与刺激CD3/TCR复合物的药剂(例如抗CD3抗体)和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如抗CD28抗体)接触20、21、22、23、24、25、26、27、或28小时。
在一些实施例中，与通过除进一步包括使细胞群体与例如，结合CD3/TCR复合物的药剂(例如，抗CD3抗体)和/或结合细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，抗CD28抗体)接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，使用本文提供的细胞因子过程制造的细胞群体显示出在表达CAR的细胞中更高百分比的初始细胞(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％)。
在一些实施例中，本文提供的细胞因子过程在包含不超过0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、或8％血清的细胞培养基中进行。在一些实施例中，本文提供的细胞因子过程在包含LSD1抑制剂、MALT1抑制剂或其组合的细胞培养基中进行。
活化过程
在一些实施例中，本披露提供了制备细胞(例如T细胞)群体的方法，该细胞群体表达嵌合抗原受体(CAR)，例如本文披露的CAR，例如本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体进一步表达调节分子。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，细胞群体表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。在一些实施例中，该方法包括：(i)使细胞(例如，T细胞，例如，从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触；(ii)使细胞(例如，T细胞)群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如，T细胞)群体；和(iii)收获细胞(例如，T细胞)群体，以用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、或24小时，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如，选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用包含编码CAR(例如CCAR)的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001341
Figure BDA0003867148300001342
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜的产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001343
装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冻融。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，
Figure BDA0003867148300001344
装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)并使用本文所述的活化过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，使细胞(例如，T细胞)与抗CD3和抗CD28抗体接触例如12小时，然后用编码CAR(例如CCAR)的载体(例如，慢病毒载体)转导。培养开始后24小时，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
不希望受理论束缚，简短的CD3和CD28刺激可以促进自我更新T细胞的有效转导。与传统的CART制造方法相比，本文提供的活化过程不涉及延长的离体扩增。与细胞因子过程类似，本文提供的活化过程还在CART制造期间保留未分化的T细胞。
在一些实施例中，使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗-CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，该基质包含聚合物或由其组成，例如，可生物降解或生物相容的惰性材料，例如，其对细胞无毒。在一些实施例中，该基质由亲水性聚合物链组成，由于链的水合作用，其在水溶液中获得最大的移动性。在一些实施例中，该移动基质可以是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯树胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或海藻酸盐。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵盐聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。在一些实施例中，移动基质是葡聚糖的聚合物。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR的DNA分子转导细胞群体。在一些实施例中，使细胞群体与编码CCAR的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CCAR的DNA分子转导细胞群体。在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR和调节分子的核酸分子接触。在一些实施例中，用编码CAR和调节分子的DNA分子转导细胞群体。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触同时使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于20小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于19小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于18小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于17小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于16小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于15小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于13小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于12小时，使细胞群体与编码CAR的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于11小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于10小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于9小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于8小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于7小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于6小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30分钟，使细胞群体与编码CAR(例如CCAR)的核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激如上所述的细胞表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上所述的细胞因子接触之前的细胞群体相比，细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，该活化过程在无血清细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含一种或多种选自以下的细胞因子的细胞培养基中进行：IL-2、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)。在一些实施例中，hetIL-15包含如下的氨基酸序列：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG(SEQ ID NO:309)。在一些实施例中，hetIL-15包含与SEQ ID NO:309具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化过程在包含LSD1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，该活化过程在包含MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，无血清细胞培养基包含血清替代物。在一些实施例中，血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。在一些实施例中，ICSR的水平可以是，例如，高达5％，例如，约1％、2％、3％、4％或5％。不希望受理论束缚，使用细胞培养基，例如，表21或表25中所示的快速培养基(Rapid Media)，包含ICSR，例如，2％ICSR，可以改进本文所述制造过程中的细胞活力。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(a)提供从受试者收集的单采样品(例如，新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品)；(b)从单采样品中选择T细胞(例如，使用阴性选择、阳性选择或无珠选择)；(c)将分离的T细胞接种，例如，1x106至1x107个细胞/mL；(d)使T细胞与刺激T细胞的药剂接触，例如，刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，使T细胞与抗CD3和/或抗CD28抗体接触，例如，使T细胞与TransAct接触)；(e)使T细胞与编码CAR的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触(例如，使T细胞与包含编码CAR的核酸分子的病毒接触)例如6-48小时，例如，20-28小时；以及(f)洗涤和收获T细胞用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制T细胞)或施用。在一些实施例中，步骤(f)在步骤(d)或(e)开始后不迟于30小时进行，例如在步骤(d)或(e)开始后不迟于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时。
其他示例性制造方法
在一些实施例中，将本文所述的CAR制造方法(例如，活化快速制造(ARM)过程)与称为“传统制造(TM)”过程的CAR制造过程进行比较。在传统制造过程中，在一些实施例中，将细胞(例如，T细胞或NK细胞)活化(例如，使用包被抗CD3/抗CD28抗体的
Figure BDA0003867148300001421
)，与编码CAR的一个或多个核酸分子接触，并在收获细胞之前，在体外扩增，例如7、8、9、10或11天。在一些实施例中，细胞(例如，T细胞或NK细胞)选自新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品，例如，使用阳性或阴性选择。
通过本文披露的过程制造的表达CAR的细胞群体
在一些实施例中，本披露的特征在于经工程化以表达CAR(例如CCAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如，通过本文所述的任何制造方法制备的，其中该工程化的免疫效应细胞表现出抗肿瘤特性。在一些实施例中，免疫效应细胞经工程化以表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，免疫效应细胞经工程化以表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。
在一些实施例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。示例性抗原是本文所述的癌症相关抗原。在一些实施例中，用CAR(例如CCAR)转化细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且CAR(例如CCAR)在细胞表面上表达。在一些实施例中，用编码CAR(例如CCAR)的病毒载体转导细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施例中，细胞可以稳定地表达CAR(例如CCAR)。在一些实施例中，用编码CAR(例如CCAR)的核酸(例如mRNA、cDNA或DNA)转染细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一些此类实施例中，细胞可以瞬时表达CAR(例如CCAR)。
在一些实施例中，本文提供的细胞群体是由本文所述的任何制造过程(例如，细胞因子过程或本文所述的活化过程)制备的细胞(例如，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)群体，经工程化以表达CAR。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)增加例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞)的百分比不少于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)减少例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如，至少低5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞的百分比不超过40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。
在一些实施例中，与通过除持续例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体持续，例如超过3天(例如，在体外扩增细胞群体持续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体在体内施用后体持续更长时间或以更高的水平(例如，至少高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％更高)扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法评估)。
在一些实施例中，在制造过程开始前(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始前)，已经富集了用于表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)的细胞群体。在一些实施例中，在制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)，细胞群体包括，例如，不少于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的表达IL6R的细胞(例如，IL6Rα和/或IL6Rβ阳性的细胞)。
药物组合物
此外，本披露提供表达CAR(例如CCAR)的细胞组合物及其在治疗癌症或任何恶性肿瘤或涉及表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞或组织的自身免疫疾病等疾病的药物或方法中的用途。在一些实施例中，本文提供了药物组合物，这些药物组合物包含通过本文所述的制造过程(例如，细胞因子过程，或本文所述的活化过程)制备的表达CAR(例如CCAR)的细胞，例如，多种表达CAR(例如CCAR)的细胞，与一个或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。在一些实施例中，表达CAR的细胞表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，表达CAR的细胞表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。
调节嵌合抗原受体的策略
可以通过多种方式调节CAR活性。在一些实施例中，希望CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。用于调节本披露的CAR疗法的可替代策略包括利用降解CAR(例如CCAR)或使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如通过使表达CAR的细胞缺失，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡的分子(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，该截短的表皮生长因子受体缺乏信号传导能力但保留了被能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗(cetuximab，ERBITUX
Figure BDA0003867148300001462
))识别的表位，以使得西妥昔单抗的施用诱导ADCC并且随后耗减表达CAR的细胞(参见例如，WO 2011/056894，和Jonnalagadda等人,Gene Ther.[基因疗法]2013；20(8)853-860)。另一种策略包括表达高度紧密的标志物/自杀基因，该基因将来自本文所述的表达CAR的细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，这些抗原结合利妥昔单抗(rituximab)，这导致表达CAR的细胞的选择性耗减，例如通过ADCC(参见例如，Philip等人,Blood.[血液]2014；124(8)1277-1287)。用于消耗本文所述的表达CAR的细胞的其他方法包括施用CAMPATH
Figure BDA0003867148300001461
(选择性结合和靶向成熟淋巴细胞(例如，表达CAR的细胞)的单克隆抗CD52抗体)以便例如通过诱导ADCC进行破坏。在其他实施例中，可以使用CAR配体(例如，抗独特型抗体)来选择性靶向表达CAR的细胞。在一些实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性(例如ADCC或ADC活性)，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其他实施例中，CAR配体(例如抗独特型抗体)可以与诱导细胞杀伤的药剂(例如毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。可替代地，CAR分子本身可以被配制成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
由降解多肽和降解化合物介导CCAR的降解
在一些实施例中，本文提供了融合多肽，该融合多肽包含降解多肽和异源多肽。在一些实施例中，降解多肽与异源多肽的C-末端或N-末端融合。在一些实施例中，降解多肽位于异源多肽的中部。在一些实施例中，异源多肽是CAR，例如本文披露的CAR，例如包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR。在一些实施例中，本文提供了包含降解多肽和CAR的可控CAR(CCAR)。
在一些实施例中，在存在本文披露的降解化合物，例如，COF1或COF2，例如，IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或COF3，例如，表29中披露的化合物(例如，表29中披露的化合物I-112)的情况下，降解多肽改变融合多肽(例如CCAR)的水平和/或活性。在一些实施例中，在存在本文披露的降解化合物的情况下，降解多肽增加融合多肽(例如CCAR)的翻译后修饰和/或降解。在一些实施例中，翻译后修饰可以包括融合多肽，例如，CCAR(例如，以下中的一个或多一种或全部：异源多肽(例如，CAR)和/或降解多肽的全部或部分)中一个或多个氨基酸残基(例如，赖氨酸或甲硫氨酸中的一个或多个)的泛素化(例如，单或多泛素化)。在一些实施例中，降解多肽是WO 2019079569中披露的降解多肽(将其通过引用以其全文并入本文)，例如，WO 2019079569，例如WO 2019079569第114-120页中披露的COF1/CRBN结合多肽、COF2/CRBN结合多肽或COF3/CRBN结合多肽。在一些实施例中，降解化合物是WO2019079569，例如WO 2019079569第120-216页中披露的降解化合物。
在一些实施例中，融合多肽(例如，CCAR(例如异源多肽(例如CAR)和/或降解多肽的全部或部分))的一个或多个赖氨酸残基被泛素化。在一些实施例中，融合多肽(例如，CCAR(例如异源多肽(例如CAR)和/或降解多肽的全部或部分))的一个或多个甲硫氨酸残基被泛素化(例如，单或多泛素化)。
不希望受理论的束缚,在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)的失活(例如降解)可以包括以下步骤的一个、两个、三个或全部，例如，在细胞或反应混合物中：
(1)在存在本文披露的降解化合物，例如COF1或COF2，例如IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物(例如，来那度胺))或COF3，例如表29中披露的化合物(例如，表29中披露的化合物I-112)的情况下，将包含降解多肽的融合多肽(例如CCAR)与泛素连接酶复合物(例如，E3泛素连接酶复合物)的一个或多个亚基(例如，CRBN)缔合；
(2)融合多肽，例如，CCAR的泛素化(例如，异源多肽(例如CAR)和/或降解多肽上的泛素化)，从而提供泛素化的融合多肽，例如CCAR；以及
(3)泛素化的融合多肽，例如CCAR的降解。
在一些实施例中，在存在本文披露的降解化合物(例如IMiD或化合物I-112)的情况下，本文所述的任何降解多肽例如，相对于在不存在本文披露的降解化合物(例如IMiD或化合物I-112)的情况下的修饰和/或降解增加了融合多肽(例如CCAR)的翻译后修饰和/或降解。在一个实施例中，在存在本文披露的降解化合物(例如IMiD或化合物I-112)的情况下，降解多肽例如，相对于在不存在本文披露的降解化合物(例如IMiD或化合物I-112)的情况下的泛素化，增加了融合多肽(例如CCAR)的选择性泛素化。
在一些实施例中，本文提供了编码融合多肽(例如，本文披露的CCAR)的核酸分子。在一些实施例中，本文提供了包含核酸分子的载体。在一些实施例中，本文提供了包含核酸分子或载体的细胞。
在一些实施例中，本文提供了选择性调节(例如，降解)融合多肽，例如CCAR(例如，融合多肽，例如包含降解多肽和异源多肽(例如CAR)的CCAR)的方法。此类方法可以包括使包含本文所述的任何融合多肽(例如CCAR)或编码这种融合多肽(例如CCAR)的核酸的细胞与本文所述的任何降解化合物接触。在一些实施例中，使细胞与降解化合物体内接触。在一些实施例中，使细胞与降解化合物离体接触。如本文所用，“选择性降解”融合多肽(例如CCAR)或靶多肽等是指相对于参考多肽(例如，不具有降解多肽的多肽)，增加该融合多肽(例如CCAR)或靶多肽的降解(例如，增加的降解水平和/或降解速率，例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、500％、10倍、100倍、1,000倍或更高)。
在一些实施例中，本披露提供了方法，这些方法包括作为疗法施用本披露的融合多肽(例如CCAR)。在一些实施例中，这种向受试者的施用为表达本披露的融合多肽(例如CCAR)的细胞(例如自体或同种异体宿主细胞)的形式。因此，通过施用降解化合物(体内或离体)，可以调节治疗性多肽(例如，异源多肽，例如CAR)的表达。因此，通过施用降解化合物(体内或离体)，可以调节治疗性多肽(例如，异源多肽，例如CAR)的表达。因此，可以调节已知的合成的治疗性蛋白质或跨膜受体(例如，融合多肽，例如CCAR，例如如本文所述的，例如，包含包括本文所述的CAR分子的结构域的)的表达。在一个实施例中，受试者患有本文描述的病症，例如受试者患有癌症，例如受试者患有表达本文描述的靶抗原的癌症。在一个实施例中，受试者是人。
降解多肽
在一些实施例中，在存在本文披露的降解化合物，例如，COF1或COF2、IMiD，例如沙利度胺类化合物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或COF3，例如表29中披露的化合物，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，降解多肽源自与泛素连接酶复合物(例如，E3泛素连接酶复合物)的一种或多种组分结合的氨基酸序列和/或结构基序(例如，结构域)。在一些实施例中，降解多肽包含锌指结构域(例如，锌指2结构域)或其部分。在一些实施例中，降解多肽包含β转角。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF多肽或其结构基序。在一些实施例中，IKZF多肽是IKZF1多肽、IKZF2多肽、IKZF3多肽、具有H141Q取代的IKZF2多肽(根据SEQ ID NO:330编号)、或具有H188Q取代的IKZF4多肽(根据SEQ ID NO:331编号)。
在一些实施例中，降解多肽包含Ikaros家族的转录因子(例如，IKZF1或IKZF3)，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的β转角。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF1或IKZF3，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的β发夹。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF1或IKZF3，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的β链。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF1或IKZF3，或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋。在一些实施例中，β发夹和第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
在一些实施例中，降解多肽包含IKZF1(例如，SEQ ID NO:329)或IKZF3(例如，SEQID NO:328)或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF1(例如，SEQ ID NO:329)或IKZF3(例如，SEQ ID NO:328)或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸、或至少95个氨基酸。在一些实施例中，降解多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:310-315、320-324、337-339、360-361、367-369和374(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)。在一些实施例中，降解多肽包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，例如，如本文所述，降解化合物是沙利度胺类化合物(例如，来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)。在一些实施例中，降解化合物是COF1或COF2。
在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的β转角。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的β发夹。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的β链。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋。在一些实施例中，降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋。在一些实施例中，β发夹和第二α螺旋被不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开。
在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(例如，SEQ ID NO:21)或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基或约55至约65个氨基酸残基。在一些实施例中，降解多肽包含IKZF2(例如，SEQ ID NO:21)或与其基本上相同的序列(例如，与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸或至少95个氨基酸。在一些实施例中，降解多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:375-377(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)。在一些实施例中，降解多肽包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，降解化合物是表29中披露的化合物，例如，表29中披露的化合物I-112。在一些实施例中，降解化合物是COF3。
在一些实施例中，示例性降解多肽披露于表30中。表31披露了IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4和IKZF5的示例性全长序列或其片段。
表30.示例性降解多肽
Figure BDA0003867148300001521
Figure BDA0003867148300001531
Figure BDA0003867148300001541
Figure BDA0003867148300001551
表31.示例性IKZF序列
Figure BDA0003867148300001552
Figure BDA0003867148300001561
降解化合物
本文披露了降解化合物，这些降解化合物可以例如，增加包含降解多肽的融合多肽(例如CCAR)的泛素化和/或降解。
在一些实施例中，降解化合物是免疫调节酰亚胺药物(IMiD)。在一些实施例中，降解化合物包含沙利度胺类化合物的成员。在一些实施例中，沙利度胺类化合物的成员包括但不限于来那度胺(CC-5013)、泊马度胺(CC-4047或ACTIMID)、沙利度胺或其盐或衍生物。在一些实施例中，降解化合物可以是沙利度胺类化合物的一、二、三或更多个成员的混合物。沙利度胺类似物和沙利度胺类似物的免疫调节剂特性描述于Bodera和Stankiewicz,Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov.[内分泌最新专利代谢免疫药物发现]2011年9月；5(3):192-6，将其通过引用以其整体特此并入。沙利度胺类似物和E3泛素的结构复合物描述于Gandhi等人,Br J Haematol.[英国血液病杂志]2014年3月；164(6):811-21，将其通过引用以其整体特此并入。通过沙利度胺类似物调节E3泛素连接酶描述于Fischer等人,Nature.[自然]2014年8月7日；512(7512):49-53，将其通过引用以其整体特此并入。
在一些实施例中，降解化合物是具有式(I)的化合物(COF1)，其中该COF1是：
Figure BDA0003867148300001571
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤素、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
n是0、1、2、3或4；并且
x是0、1、或2。
在一些实施例中，降解化合物是具有式(II)的化合物(COF2)，其中该COF2是：
Figure BDA0003867148300001581
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、互变异构体或前药，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自独立地且任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同它们所附接的碳原子一起形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R10独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)或-N(RC)S(O)xRE或L-标签；其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R11取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、C(O)RA、-C(O)ORB、ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R11独立地是C1-C6烷基、卤代、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤素、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA；
每个L独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、-C(O)RA1、-C(O)ORB1、-ORB1、-N(RC1)(RD1)、-C(O)N(RC1)(RD1)、-N(RC1)C(O)RA1、-S(O)xRE1、-S(O)xN(RC1)(RD1)或-N(RC1)S(O)xRE1，其中每个烷基、烯基、炔基和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个标签是能够与靶蛋白结合的靶向部分；
每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R12取代；
每个R12独立地是C1-C6烷基、卤代、氰基、碳环基或杂环基；
n是0、1、2、3或4；并且
x是0、1、或2。
在一些实施例中，降解化合物是具有式(III)的化合物(COF3)，其中该COF3是：
Figure BDA0003867148300001601
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或互变异构体，其中：
X1是CR3；
当X1是CR3并且R3不存在时，
Figure BDA0003867148300001602
任选地是双键；
每个R1独立地是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟基烷基或卤代，或
两个R1连同它们所附接的碳原子一起形成5元或6元杂环基环，或
当在相邻原子上时，两个R1连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基环；
R2是氢，C1-C6烷基，-C(O)C1-C6烷基，-C(O)(CH2)0-3-C6-C10芳基，-C(O)O(CH2)0-3-C6-C10芳基，C6-C10芳基，或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，C3-C8碳环基，或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中该烷基任选地被一个或多个R4取代；并且芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R5取代，或
当在相邻原子上时，R1和R2连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环基环；
R3是氢，或当
Figure BDA0003867148300001603
是双键时，R3不存在；
每个R4独立地选自-C(O)OR6、-C(O)NR6R6'、-NR6C(O)R6'、卤代、-OH、-NH2、氰基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至4个杂原子的5元或6元杂芳基、C3-C8碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中该芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选地被一个或多个R7取代；
每个R5独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2、氰基、C3-C7碳环基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
当在相邻原子上时，两个R5连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R6和R6'各自独立地是氢、C1-C6烷基或C6-C10芳基；
每个R7独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-C(O)R8、-(CH2)0-3C(O)OR8、-C(O)NR8R9、-NR8C(O)R9、-NR8C(O)OR9、-S(O)pNR8R9、-S(O)pR12、(C1-C6)羟基烷基、卤代、-OH、-O(CH2)1-3CN、-NH2、氰基、-O(CH2)0-3-C6-C10芳基、金刚烷基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的-O(CH2)0-3-5元或6元杂芳基、C6-C10芳基、包含选自O、N和S的1至3个杂原子的单环或二环5元至10元杂芳基、C3-C7碳环基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中所述烷基任选地被一个或多个R11取代，并且所述芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，这些取代基各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基和C1-C6烷氧基或
两个R7与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)，或
当在相邻原子上时，两个R7连同它们所附接的原子一起形成C6-C10芳基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元或6元杂芳基，其任选地被一个或多个R10取代，或
两个R7连同它们所附接的原子一起形成C5-C7碳环基或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其任选地被一个或多个R10取代；
R8和R9各自独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R10独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基或
两个R10与它们所附接的碳原子一起形成a＝(O)；
每个R11独立地选自氰基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基和包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基，其中每个芳基和杂环基任选地被一个或多个取代基取代，这些取代基各自独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6羟基烷基、卤代、-OH、-NH2和氰基；
R12是C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、或包含选自O、N和S的1至3个杂原子的5元至7元杂环基；
Rx是氢或氘；
p是0、1或2；
n是0、1、或2；
y是1或2，其中n+y≤3；并且
q是0、1、2、3或4。
另外的示例性降解化合物披露于表29中。
表29.示例性降解化合物
Figure BDA0003867148300001621
Figure BDA0003867148300001631
Figure BDA0003867148300001641
Figure BDA0003867148300001651
Figure BDA0003867148300001661
Figure BDA0003867148300001671
Figure BDA0003867148300001681
Figure BDA0003867148300001691
Figure BDA0003867148300001701
Figure BDA0003867148300001711
Figure BDA0003867148300001721
Figure BDA0003867148300001731
Figure BDA0003867148300001741
Figure BDA0003867148300001751
由降解结构域和稳定化合物介导CCAR的降解
在一些实施例中，本文提供了包含降解结构域和异源多肽(例如CAR)的融合多肽(例如CCAR)。在一些实施例中，降解结构域具有第一状态和第二状态，例如，稳定化/去稳定化的状态或折叠/错折叠的状态。第一状态按第一比率或水平与融合多肽(例如CCAR)的表达相关、引起或介导该融合多肽的表达，并且第二状态按第二比率或水平与融合多肽(例如CCAR)的表达相关、引起或介导该融合多肽的表达。在一些实施例中，第二状态具有比第一状态的比率或水平更高的(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30倍高)的水平或比率。在一些实施例中，第二状态与稳定化合物的存在相关、由稳定化合物的存在维持或引起。在一些实施例中，稳定化合物的存在可以与第一折叠状态向第二折叠状态的转换(例如在目的细胞中，例如，从错折叠至更适当的折叠状态，例如，易于降解的第一状态转换为相比第一状态不易于降解的第二状态；或从具有第一降解水平的第一折叠状态向具有第二、更少降解水平的第二折叠状态)相关、引起或介导第一折叠状态向第二折叠状态的转换。
不希望受理论的束缚，在一些实施例中，在不存在稳定化合物的情况下，降解结构域是不稳定的和/或不能折叠成稳定构象。此错折叠/解折叠的降解结构域可通过细胞内降解途径连同融合多肽(例如CCAR)的其余部分一起降解。在稳定化合物存在下，降解结构域呈现适当的构象，并且不易受细胞间降解途径的影响。因此，融合多肽(例如CCAR)的表达水平可以通过稳定化合物的存在或不存在来调节。在一些实施例中，在存在稳定化合物的情况下的融合多肽(例如CCAR)的表达水平与在不存在稳定化合物的情况下的融合多肽(例如CCAR)的表达水平相比增加至少例如1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，例如，如通过本文所述的测定例如蛋白质印迹分析或流式细胞术分析测量的。
在一些实施例中，降解结构域通过异源蛋白酶切割位点与异源多肽(例如CAR)分开。在一些实施例中，降解结构域的适当折叠暴露了异源蛋白酶切割位点，导致异源蛋白酶切割位点的切割以及降解结构域从融合多肽(例如CCAR)的其余部分的去除。
降解结构域和稳定化合物
本披露涵盖衍生自任何天然存在的蛋白质的降解结构域。优选地，本披露的融合多肽(例如CCAR)将包括降解结构域，对于该降解结构域，在目的细胞区室中缺少天然表达的配体。例如，如果融合多肽(例如CCAR)被设计用于在T细胞中表达，则优选选择对于在T细胞中不存在天然存在的配体的降解结构域。因此，当降解结构域在目的细胞中表达时，降解结构域仅在存在外源添加的化合物的情况下才稳定。值得注意地，此特性可以通过如下方法工程化：将降解结构域工程化以使其不再结合天然表达的配体(在这种情况下，降解结构域将仅在存在合成化合物的情况下才是稳定的)或通过在区室(不存在天然表达的配体)中表达降解结构域(例如，降解结构域可以衍生自除这些融合多肽(例如CCAR)将在其中表达的物种以外的物种)。
降解结构域-稳定化化合物对可以衍生自任何天然存在的或合成开发的蛋白质。稳定化合物可以是任何天然存在的合成的化合物。在某些实施例中，稳定化合物将是现有处方药或非处方药。可以经工程化以具有降解结构域特性的蛋白质的实例连同相应的稳定化合物一起列于下表32中。
在一些实施例中，降解结构域基于Banaszynski,等人,Cell[细胞],2006,126,995-1004中所述的FKBP(例如，使用“盾护物”稳定化合物)；基于Iwamoto,等人,Chemistry&Biology[化学和生物学],2010,17,981-988中所述的DHFR(例如，使用作为稳定化合物的甲氧苄啶)；或基于Miyazaki,等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]2012,134,3942-3945中所述的雌激素受体α(例如，其中4OHT用作稳定化合物)。这些参考文献中的每一个通过引用以其整体并入。
在一些实施例中，降解结构域衍生自在表32中列出的蛋白质。
在一些实施例中，降解结构域衍生自雌激素受体(ER)。在一些实施例中，降解结构域包含选自SEQ ID NO:342或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列、或SEQ ID NO:344或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，降解结构域包含SEQ ID NO:342或344的氨基酸序列。当降解结构域衍生自雌激素受体时，稳定化合物可以选自巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)。在一些实施例中，稳定化合物是巴多昔芬。他莫昔芬和巴多昔芬是FDA批准的药物，并因此在人中使用是安全的。
在一些实施例中，降解结构域衍生自FKB蛋白(FKBP)。在一些实施例中，降解结构域包含SEQ ID NO:346或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，降解结构域包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列。当降解结构域衍生自FKBP时，稳定化合物可以是盾护物-1。
在一些实施例中，降解结构域衍生自二氢叶酸还原酶(DHFR)。在一些实施例中，降解结构域包含SEQ ID NO:347或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，降解结构域包含SEQ ID NO:347的氨基酸序列。当降解结构域衍生自DHFR时，稳定化合物可以是甲氧苄啶。
在一些实施例中，降解结构域不是衍生自FKB蛋白、雌激素受体或DHFR。
表32.用于产生降解结构域的示例性蛋白质
Figure BDA0003867148300001781
Figure BDA0003867148300001791
Figure BDA0003867148300001801
Figure BDA0003867148300001811
Figure BDA0003867148300001821
Figure BDA0003867148300001831
Figure BDA0003867148300001841
Figure BDA0003867148300001851
Figure BDA0003867148300001861
表27.降解结构域的示例性序列
Figure BDA0003867148300001862
Figure BDA0003867148300001871
切割位点
在一些实施例中，本披露的融合多肽(例如，CCAR)包含降解结构域和通过异源切割位点分开的异源多肽(例如，CAR)。
切割位点可以是蛋白酶切割位点。可以将切割位点设计为被任何位点特异性蛋白酶切割，该蛋白酶在目的细胞中按足以切割开降解结构域的水平表达(通过重组表达或内源表达)。在一些实施例中，选择蛋白酶切割位点以对应于天然(或借助于细胞工程化)存在于与目的蛋白表达有关的细胞区室中的蛋白酶。蛋白酶的细胞内运输应与包含所用降解结构域的目的蛋白的细胞内运输重叠或部分重叠。例如，如果目的蛋白位于细胞表面上，则可以将切割它的酶外源添加至细胞。
如果目的蛋白质驻留在核内体/溶酶体系统中，则可以使用针对驻留在那些区室中的酶的蛋白酶切割位点。此类蛋白酶/共有基序包括，例如，
弗林蛋白酶：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)
PCSK1：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)
PCSK5：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)
PCSK6：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)
PCSK7：RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:349)
组织蛋白酶B：RRX(SEQ ID NO:350)
颗粒酶B：I-E-P-D-X(SEQ ID NO:351)
因子XA：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:352)
肠激酶：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:353)
普基酶：Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:354)
分选酶：LPXTG/A(SEQ ID NO:355)
切断前(PreScission)蛋白酶：Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:356)
凝血酶：Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)
TEV蛋白酶：E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:358)
弹性蛋白酶1：[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:359)
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括弗林蛋白酶切割位点。在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括表28中列出的弗林蛋白酶切割位点中的任一种。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括选自以下的弗林蛋白酶切割位点：RTKR(SEQ ID NO:378)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:383)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:385)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:387)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:389)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或CKINGYPKRGRKRR(SEQID NO:391)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括选自以下的弗林蛋白酶切割位点：RTKR(SEQ ID NO:378)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:383)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:385)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:387)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:389)；或CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:391)。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括选自以下的弗林蛋白酶切割位点：GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，或GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括选自以下的弗林蛋白酶切割位点：GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)或GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)。
在一些实施例中，本文所述的融合多肽(例如CCAR)包括GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)的弗林蛋白酶切割位点。
表28.示例性弗林蛋白酶切割位点
Figure BDA0003867148300001901
可调节的CAR(RCAR)
在一些实施例中，本文所述的CCAR可以是可调节的CAR(RCAR)。在一些实施例中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施例中典型地为两个，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域，被分配在分开的多肽或成员上。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，该二聚化开关在二聚化分子存在下可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。本文和国际公开号WO2015/090229中提供了此类可调节性CAR的另外的描述和示例性构型，将所述文献通过引用以其全文特此并入。
在实施例中，RCAR包含两个多肽或成员：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的初级细胞内信号传导结构域)和第一开关结构域；2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含例如如本文所述靶向本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域和第二开关结构域。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在实施例中，跨膜结构域可以布置在细胞内信号传导成员上、抗原结合成员上、或两者上。除非另有说明，否则当本文描述RCAR的成员或元件时，顺序可以如所提供的那样，但也包括其他顺序。换句话说，在实施例中，顺序如文中所述，但在其他实施例中，顺序可以不同。例如，跨膜区一侧上的元件的顺序可以与实例不同，例如，开关结构域相对于细胞内信号传导结构域的放置可以是不同的，例如，相反的。
在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域可以形成细胞内或细胞外二聚化开关。在实施例中，二聚化开关可以是同源二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域是相同的，或异源二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同。
在实施例中，RCAR可以包含“多开关”。多开关可以包括异源二聚化开关结构域或同源二聚化开关结构域。多开关在第一成员(例如，抗原结合成员)和第二成员(例如，细胞内信号传导成员)上独立地包括多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)开关结构域。在实施例中，第一成员可以包含多个第一开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域)，并且第二成员可以包含多个第二开关结构域(例如，基于FRB的开关结构域)。在实施例中，第一成员可以包含第一开关结构域和第二开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域)，并且第二成员可以包含第一开关结构域和第二开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域)。
在实施例中，细胞内信号传导成员包含一个或多个细胞内信号传导结构域(例如，初级细胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。
在实施例中，抗原结合成员可以包含一个或多个细胞内信号传导结构域，例如一个或多个共刺激信号传导结构域。在实施例中，抗原结合成员包含本文所述的多个(例如，2或3个)共刺激信号传导结构域，例如，选自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，并且在实施例中，没有初级细胞内信号传导结构域。在实施例中，抗原结合成员从细胞外到细胞内方向包含以下共刺激信号传导结构域：4-1BB-CD27；4-1BB-CD27；CD27-4-1BB；4-1BB-CD28；CD28-4-1BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-4-1BB；或4-1BB-CD28。在此类实施例中，细胞内结合成员包含CD3ζ结构域。在一个此类实施例中，RCAR包含(1)抗原结合成员，该抗原结合成员包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和两个共刺激结构域和第一开关结构域；和(2)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含跨膜结构域或膜系链结构域和至少一个初级细胞内信号传导结构域、和第二开关结构域。
实施例提供了RCAR，其中抗原结合成员不与表达CAR的细胞表面系接。这使得具有细胞内信号传导成员的细胞可以方便地与一个或多个抗原结合结构域配对，而不用编码抗原结合成员的序列来转化细胞。在此类实施例中，RCAR包含：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：第一开关结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域(例如，初级细胞内信号传导结构域)、和第一开关结构域；和2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含：抗原结合结构域、和第二开关结构域，其中抗原结合成员不包含跨膜结构域或膜系链结构域，并且任选地，不包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR可以进一步包含3)第二抗原结合成员，该第二抗原结合成员包含：第二抗原结合结构域，例如结合不同抗原的而不是由抗原结合结构域结合的第二抗原结合结构域；和第二开关结构域。
本文还提供了RCAR，其中抗原结合成员包含双特异性激活和靶向能力。在此实施例中，抗原结合成员可以包含多个(例如2、3、4或5个)抗原结合结构域，例如scFv，其中每个抗原结合结构域结合靶抗原，例如不同的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在实施例中，多个抗原结合结构域串联，并且任选地，在每个抗原结合结构域之间布置接头或铰链区。合适的接头和铰链区描述在本文中。
一个实施例提供了具有允许开关增殖的构型的RCAR。在此实施例中，RCAR包含：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：任选地，跨膜结构域或膜系链结构域；一个或多个共刺激信号传导结构域，例如，选自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，以及开关结构域；和2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含：抗原结合结构域、跨膜结构域、和初级细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ结构域)，其中抗原结合成员不包含开关结构域，或者不包含与细胞内信号传导结构域上的开关结构域二聚化的开关结构域。在实施例中，抗原结合成员不包含共刺激信号传导结构域。在实施例中，细胞内信号传导成员包含来自同源二聚化开关的开关结构域。在实施例中，细胞内信号传导成员包含异源二聚化开关的第一开关结构域，并且RCAR包含第二细胞内信号传导成员，该第二细胞内信号传导成员包含异源二聚化开关的第二开关结构域。在此类实施例中，第二细胞内信号传导成员包含与细胞内信号传导成员相同的细胞内信号传导结构域。在实施例中，二聚化开关是细胞内的。在实施例中，二聚化开关是细胞外的。
在本文所述的任何RCAR构型中，第一开关结构域和第二开关结构域包含如本文所述的基于FKBP-FRB的开关。
本文还提供包含本文所述RCAR的细胞。任何经工程化以表达RCAR的细胞都可以用作RCARX细胞。在实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。
本文还提供包含RCAR编码序列的核酸和载体。编码RCAR的各种元件的序列可以布置在相同的核酸分子上，例如相同的质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。在实施例中，(i)编码抗原结合成员的序列和(ii)编码细胞内信号传导成员的序列可以存在于相同的核酸例如载体上。可以通过例如使用单独的启动子或通过使用双顺反子转录产物(其可以通过裂解单个翻译产物或通过翻译两个分开的蛋白质产物来产生两个蛋白质产物)来实现相应蛋白质的产生。在实施例中，编码可裂解肽的序列(例如，P2A或F2A序列)布置在(i)与(ii)之间。在实施例中，编码IRES(例如，EMCV或EV71 IRES)的序列布置在(i)与(ii)之间。在这些实施例中，(i)和(ii)转录为单个RNA。在实施例中，第一启动子与(i)可操作地连接，并且第二启动子与(ii)可操作地连接，使得(i)和(ii)转录为单独的mRNA。
可替代地，编码RCAR的各种元件的序列可以布置在不同的核酸分子上，例如不同的质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。例如，(i)编码抗原结合成员的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii)编码细胞内信号传导成员的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。
二聚化开关
二聚化开关可以是非共价的或共价的。在非共价二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的共价相互作用。
在实施例中，RCAR包含基于FKBP/FRAP或基于FKBP/FRB的二聚化开关。FKBP12(FKBP或FK506结合蛋白)是丰富的胞质蛋白，该胞质蛋白充当天然产物免疫抑制药物(雷帕霉素)的初始细胞内靶标。雷帕霉素结合至FKBP和大型PI3K同源物FRAP(RAFT，mTOR)。FRB是FRAP的93个氨基酸部分，该氨基酸部分足以结合FKBP-雷帕霉素复合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.和Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associatedprotein and characterization of a critical serine residue[鉴定289-kDa FKBP12-雷帕霉素相关的蛋白内的11-kDa FKBP12-雷帕霉素结合结构域并表征关键的丝氨酸残基].Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊]92:4947-51)。
在实施例中，基于FKBP/FRAP(例如FKBP/FRB)的开关可以使用二聚化分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
FKBP的示例性氨基酸序列如下：
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:275)
在实施例中，FKBP开关结构域可以包含FKBP的片段，该FKBP的片段具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力。在一个实施例中，FKBP开关结构域包含以下的氨基酸序列：
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:276)
FRB的氨基酸序列如下：
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(SEQ ID NO:277)
如本文所用，术语“基于FKBP/FRAP(例如，FKBP/FRB)的开关”是指二聚化开关，该二聚化开关包含：第一开关结构域，该第一开关结构域包含FKBP片段或其类似物，该FKBP片段或其类似物具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如，RAD001)的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力，并且与SEQ ID NO:275或276的FKBP序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或相差不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基；和第二开关结构域，该第二开关结构域包含FRB片段或其类似物，该FRB片段或其类似物具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力，并且与SEQ ID NO:277的FRB序列具有至少70％、75％、80％、85、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或相差不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基。在实施例中，本文所述的RCAR包含一个含有SEQ ID NO:275(或SEQ ID NO:276)中披露的氨基酸残基的开关结构域和一个含有SEQID NO:277中披露的氨基酸残基的开关结构域。
在实施例中，FKBP/FRB二聚化开关包含经修饰的FRB开关结构域，该经修饰的FRB开关结构域在基于FRB的开关结构域(例如，经修饰的FRB开关结构域、基于FKBP的开关结构域)与二聚化分子(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如RAD001))之间表现出改变的(例如增强的)复合物形成。在实施例中，经修饰的FRB开关结构域包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)突变，这些突变选自一个或多个氨基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和F2108的突变，其中野生型氨基酸突变为任何其他天然存在的氨基酸。在实施例中，突变体FRB包含E2032处的突变，其中E2032突变为苯丙氨酸(E2032F)、甲硫氨酸(E2032M)、精氨酸(E2032R)、缬氨酸(E2032V)、酪氨酸(E2032Y)、异亮氨酸(E2032I)，例如SEQ ID NO:278、或亮氨酸(E2032L)，例如SEQ IDNO:279。在实施例中，突变体FRB包含T2098处的突变，其中T2098突变为苯丙氨酸(T2098F)或亮氨酸(T2098L)，例如SEQ ID NO:280。在实施例中，突变体FRB包含E2032和T2098处的突变，其中E2032突变为任何氨基酸，并且其中T2098突变为任何氨基酸，例如SEQ ID NO:281。在实施例中，突变体FRB包含E2032I和T2098L突变，例如SEQ ID NO:282。在实施例中，突变体FRB包含E2032L和T2098L突变，例如SEQ ID NO:283。
表18.对二聚化分子具有增加的亲和力的示例性突变体FRB。
Figure BDA0003867148300001961
Figure BDA0003867148300001971
其他合适的二聚化开关包括基于GyrB-GyrB的二聚化开关、基于赤霉素的二聚化开关、标签/粘合剂二聚化开关、和卤素标签/快速标签二聚化开关。按照本文提供的指导，此类开关和相关的二聚化分子对于普通技术人员将是显而易见的。
二聚化分子
通过二聚化分子来促进开关结构域之间的缔合。在二聚化分子存在下，开关结构域之间的相互作用或结合允许在与第一开关结构域缔合(例如，融合)的多肽和与第二开关结构域缔合(例如，融合)的多肽之间进行信号转导。在非限制性水平的二聚化分子存在下，例如，如在本文所述的系统中，信号转导增加了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物(rapamycin analog)(有时称为雷帕霉素类似物(rapalogue)，例如RAD001)可用作本文所述的基于FKBP/FRB的二聚化开关中的二聚化分子。在实施例中，二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司)、RAD001(依维莫司)、佐他莫司、替西罗莫司，AP-23573(地磷莫司)、拜耳莫司(biolimus)和AP21967。适用于与基于FKBP/FRB的二聚化开关一起使用的其他雷帕霉素类似物在标题为“组合疗法”的部分中或在标题为“与低(免疫增强)剂量的mTOR抑制剂组合”的小节中进一步描述。
用于耗减表达CAR的细胞的可诱导的半胱天冬酶
在一些实施例中，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶诱导的细胞凋亡(参见例如，Di等人,N Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本披露的CAR疗法中的安全开关。在一些实施例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(Bellicum制药公司(Bellicum Pharmaceuticals)))或AP20187(Ariad公司))时导致半胱天冬酶-9的活化和表达CAR的细胞的细胞凋亡。iCaspase-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在存在CID的情况下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。因此，iCaspase-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验标识号NCT02107963；Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83；以及Straathof等人,Blood.[血液]2005年6月1日；105(11):4247-54中，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文提供的细胞包含编码CAR的核酸分子和的编码iCaspase-9分子的核酸分子。在一些实施例中，iCaspase-9分子包含嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含(i)多聚体配体结合区和(ii)半胱天冬酶9分子。在一些实施例中，半胱天冬酶9分子是截短的半胱天冬酶9。在一些实施例中，半胱天冬酶9分子缺少半胱天冬酶募集结构域。在一些实施例中，半胱天冬酶9分子是WO 2011146862、WO 2014164348或WO 2016100236中披露的半胱天冬酶9多肽或经修饰的半胱天冬酶9多肽，将其通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“半胱天冬酶9分子”包括天然存在的半胱天冬酶9、半胱天冬酶9的截短形式(例如，缺少半胱天冬酶激活和募集结构域(CARD)结构域的截短的半胱天冬酶9)、以及半胱天冬酶9的变体(例如，在不存在多聚体配体的情况下包含一个或多个突变的半胱天冬酶9，这些突变降低其基础活性)。
如本文所用，术语“多聚体配体结合区”是指与多聚体配体结合的配体结合区。术语“多聚体配体”包括二聚体配体。二聚体配体具有能与配体受体结构域结合的两个结合位点。可以使用多种合成配体和受体对。例如，在涉及天然受体的一些实施例中，二聚体FK506可以与FKBP12受体一起使用，二聚化环孢菌素A可以与亲环蛋白受体一起使用，二聚化雌激素与雌激素受体一起使用，二聚化糖皮质激素与糖皮质激素受体一起使用，二聚化四环素与四环素受体一起使用，二聚化维生素D与维生素D受体一起使用等。对于涉及非天然受体，例如抗体亚基、经修饰的抗体亚基、由通过柔性接头结构域分开的串联重链和轻链可变区组成的单链抗体、或经修饰的受体、及其突变序列等的实施例，可以使用多种化合物中的任一种。这些配体单位的显著特征是每个结合位点能够以高亲和力结合受体以及它们能够化学二聚化。
在一些实施例中，多聚体配体与多聚体配体结合区的结合导致嵌合蛋白的寡聚化(例如，二聚化)，其诱导半胱天冬酶9分子的激活和细胞的细胞凋亡。在一些实施例中，多聚体配体结合区选自由以下组成的组：FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、由通过柔性接头结构域分开的串联重链和轻链可变区组成的单链抗体及其突变序列。在一些实施例中，多聚体配体结合区是FKBP12区。在一些实施例中，多聚体配体是FK506二聚体或二聚体FK506类似物配体。在一些实施例中，多聚体配体是AP1903。在一些实施例中，多聚体配体结合区是WO 2011146862、WO 2014164348或WO2016100236中披露的多聚体配体结合区。在一些实施例中，多聚体配体是WO2011146862、WO 2014164348或WO 2016100236中披露的多聚体配体。
在一些实施例中，iCaspase-9分子由与一种或多种编码CAR的载体分开的核酸分子编码。在一些实施例中，iCaspase-9分子由与编码CAR的载体相同的核酸分子编码。
用于耗减表达CAR的细胞的截短的EGFR
在一些实施例中，本文提供的细胞包含编码CAR的核酸分子和编码截短的表皮生长因子受体(EGFRt)的核酸分子。在一些实施例中，EGFRt缺少膜远端EGF结合结构域和细胞质信号传导尾，但保留细胞外表位。在一些实施例中，EGFRt包含EGFR结构域III和EGFR结构域IV的一者或两者。在一些实施例中，EGFRt不包含以下中的1个、2个、3个或所有：EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域、以及EGFR酪氨酸激酶结构域。在一些实施例中，EGFRt不是免疫原性的。在一些实施例中，EGFRt不介导信号传导或运输功能。在一些实施例中，EGFRt不结合内源性EGFR配体，例如，表皮生长因子(EGF)。在一些实施例中，EGFRt包含WO2011056894或WO 2013123061中披露的EGFRt序列，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，当在细胞(例如表达CAR的细胞)中表达时，EGFRt可用于介导细胞的耗减、追踪和/或纯化。在一些实施例中，EGFRt与抗EGFR抗体分子、EGFR特异性siRNA、或靶向EGFR的小分子结合。在一些实施例中，EGFRt与选自由以下组成的组的抗EGFR抗体结合：西妥昔单抗、马帕木单抗、耐昔妥珠单抗和帕尼单抗。
在一些实施例中，EGFRt由与一种或多种编码CAR的载体分开的核酸分子编码。在一些实施例中，EGFRt由与编码CAR的载体相同的核酸分子编码。
嵌合抗原受体(CAR)
本披露提供了免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，这些免疫效应细胞经工程化以含有一种或多种CAR(例如CCAR)，该一种或多种CAR将免疫效应细胞引导至癌症。在一些实施例中，免疫效应细胞经工程化以表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，免疫效应细胞经工程化以表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。
这通过CAR上的抗原结合结构域实现，抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。存在两类可以通过本文所述的CAR靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面上表达的癌症相关抗原；和(2)本身在细胞内的癌症相关抗原，然而，这种抗原的片段(肽)通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
因此，例如，通过本文所述的方法获得的免疫效应细胞可以经工程化以含有靶向以下癌症相关抗原(肿瘤抗原)之一的CAR：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白(prostein)、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶和mut hsp70-2。
可以作为本文所述的CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1中列出，其中aa代表氨基酸，na代表编码相应肽的核酸。
表1.CAR的各种组分的序列
Figure BDA0003867148300002011
Figure BDA0003867148300002021
Figure BDA0003867148300002031
Figure BDA0003867148300002041
Figure BDA0003867148300002051
Figure BDA0003867148300002061
在一些实施例中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的相反配体的分子的细胞外结构域、或其相反配体结合片段。
免疫效应细胞可包含重组DNA构建体，其包含编码CAR(例如CCAR)的序列，其中该CAR包含与肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)，和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。如其他地方所述，本文所述的方法可包括用编码CAR的核酸(例如本文所述的CCAR)转导例如来自T调节耗减的细胞群体的细胞。
在一些实施例中，CAR包含scFv结构域，其中scFv前面可以是任选的前导序列(如SEQ ID NO:1中提供的)、并且后面是任选的铰链序列(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38中提供的)、跨膜区(如SEQ ID NO:6中提供的)、包含SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:16的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ序列，例如，其中这些结构域是连续的并在相同的阅读框中以形成单一融合蛋白。
在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一些实施例中，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。
示例性前导序列提供为SEQ ID NO:1。示例性铰链/间隔子序列提供为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38。示例性跨膜结构域序列提供为SEQ ID NO:6。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列提供为SEQ ID NO:7。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列提供为SEQ ID NO:16。示例性CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO:9或SEQID NO:10。
在一些实施例中，免疫效应细胞包括重组核酸构建体，该重组核酸构建体包含编码CAR的核酸分子，其中核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列是连续的并在相同的阅读框中。可用于CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ、CD28、CD27、4-1BB等的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
编码所希望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达核酸分子的细胞中筛选文库，通过从已知包括该核酸分子的载体中获得核酸分子，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。可替代地，目的核酸可以合成产生，而不是克隆产生。
可以使用例如逆转录病毒或慢病毒载体构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。
也可以使用例如可以直接转染到细胞中的RNA构建体将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。用于产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)、然后添加聚(A)以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文描述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文描述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)、待表达的核酸和聚(A)尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(例如，实例中描述的，例如，SEQ ID NO:35)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一些实施例中，模板包含针对CAR的序列。在一些实施例中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到细胞中，例如，T细胞中。
抗原结合结构域
在一些实施例中，多种免疫效应细胞(例如T调节耗减的细胞群体)包括编码CAR(例如CCAR)的核酸，该CAR包含靶特异性结合元件(另外称为抗原结合结构域)。结合元件的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物的配体。因此，可以作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一些实施例中，包含抗原结合结构域的CAR(例如CCAR)的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的可替代支架(如重组纤连蛋白结构域等)、T细胞受体(TCR)或其片段(例如，单链TCR)等。在一些情况下，抗原结合结构域源自其中最终将使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可以是有益的。
CD19 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD19 CAR的细胞(例如，表达与人CD19结合的CAR的细胞)。
在一些实施例中，CD19 CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中，CD19CAR的抗原结合结构域包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些实施例中，CD19 CAR包括根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。WO2014/153270还描述了测定多种CAR构建体的结合和功效的方法。
在一些实施例中，亲本鼠scFv序列是在PCT公开WO2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体。在一些实施例中，抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv。
在一些实施例中，CAR分子包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供特异性结合至人CD19的鼠来源的scFv片段。
在一些实施例中，CD19 CAR包含在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。
在一些实施例中，氨基酸序列是：
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:292)，或与其基本同源的序列。
在一些实施例中，CD19 CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，CTL019通过用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自身失活型复制缺陷型慢病毒(LV)载体的转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Axicabtageneciloleucel。在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有USAN名称brexucabtagene autoleucel。在一些实施例中，Axicabtagene ciloleucel还称为YESCARTA
Figure BDA0003867148300002111
、Axi-cel或KTE-C19。在一些实施例中，brexucabtagene autoleucel还称为KTE-X19或TECARTUS
Figure BDA0003867148300002112
。
在一个实施例中，与CD19特异性结合的CAR T细胞具有INN名称Lisocabtagenemaraleucel。在一些实施例中，Lisocabtagene maraleucel还称为JCAR017。
在其他实施例中，CD19 CAR包括根据WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将其通过引用以其全文并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:293)
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:294)
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:400)
在一些实施例中，CAR分子是人源化的CD19 CAR，其包含以下的氨基酸序列：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:401)
可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am SocGen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日,盐湖城)2013,文摘10。
示例性CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR，或描述于以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，CD19 CAR包含以下序列，例如表2中披露的CDR、VH、VL、scFv、或全长CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。
表2.示例性抗CD19分子的氨基酸序列
Figure BDA0003867148300002141
Figure BDA0003867148300002151
Figure BDA0003867148300002161
Figure BDA0003867148300002171
Figure BDA0003867148300002181
Figure BDA0003867148300002191
Figure BDA0003867148300002201
Figure BDA0003867148300002211
Figure BDA0003867148300002221
Figure BDA0003867148300002231
Figure BDA0003867148300002241
Figure BDA0003867148300002251
BCMA CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达BCMA CAR的细胞(例如，表达与人BCMA结合的CAR的细胞)。示例性BCMA CAR可包括WO 2016/014565的表1或16中披露的序列，其通过引用并入本文。BCMA CAR构建体可包括任选的前导序列；任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域；细胞内结构域，例如，4-1BB细胞内结构域；和功能性信号传导结构域，例如CD3ζ结构域。在某些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。
在一些实施例中，BCMA CAR分子包括WO 2016/014565中披露的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列，或与其基本上(例如，95％-99％)相同的序列。
可以用于抗BCMA CAR构建体的另外的示例性BCMA靶向序列披露于WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，使用来自PCT公开WO 2012/0163805(将其内容通过引用以其全文特此并入)的VH和VL序列产生另外的示例性BCMA CAR构建体。
在一些实施例中，BCMA CAR包含以下序列，例如表3-15中披露的CDR、VH、VL、scFv、或全长CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，抗原结合结构域包含人抗体或人抗体片段。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表3-10和12-15中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表3-10和12-15中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表3、表7和表12中)所述的人VL和/或本文(例如，表3、表7和表12中)所述的人VH。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是scFv，该scFv包含表3、表7和表12的氨基酸序列的VL和VH。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含：包含具有提供于表3、7、和12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列、或与表3、7和12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列的VL，和/或包含提供于表3、7、和12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列、或与表3、7和12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列的VH。
表3：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003867148300002271
Figure BDA0003867148300002281
Figure BDA0003867148300002291
Figure BDA0003867148300002301
Figure BDA0003867148300002311
Figure BDA0003867148300002321
Figure BDA0003867148300002331
Figure BDA0003867148300002341
Figure BDA0003867148300002351
Figure BDA0003867148300002361
表4：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0003867148300002371
表5：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0003867148300002372
Figure BDA0003867148300002381
表6：示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0003867148300002382
Figure BDA0003867148300002391
表7：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003867148300002392
Figure BDA0003867148300002401
Figure BDA0003867148300002411
Figure BDA0003867148300002421
Figure BDA0003867148300002431
Figure BDA0003867148300002441
Figure BDA0003867148300002451
Figure BDA0003867148300002461
Figure BDA0003867148300002471
Figure BDA0003867148300002481
表8：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0003867148300002482
Figure BDA0003867148300002491
表9：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0003867148300002492
表10：示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0003867148300002493
Figure BDA0003867148300002501
表11：基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003867148300002502
Figure BDA0003867148300002511
Figure BDA0003867148300002521
表12：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003867148300002531
Figure BDA0003867148300002541
Figure BDA0003867148300002551
Figure BDA0003867148300002561
Figure BDA0003867148300002571
Figure BDA0003867148300002581
Figure BDA0003867148300002591
表13：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
Figure BDA0003867148300002592
表14：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
Figure BDA0003867148300002593
Figure BDA0003867148300002601
表15：示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
Figure BDA0003867148300002602
在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含scFv，该scFv包含VH(例如，本文所述的VH)和VL(例如，本文所述的VL)。在一些实施例中，VH通过接头(例如，本文所述的接头，例如表1中所述的接头)附接至VL。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n为1、2、3、4、5或6，优选地3或4(SEQ ID NO:26)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如处于以下方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一些实施例中，本披露的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合BCMA蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头方向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
CD20 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD20 CAR的细胞(例如，表达与人CD20结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，表达CD20 CAR的细胞包括根据WO2016164731和WO 2018067992(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD20结合序列或CD20 CAR序列披露于例如WO 2018067992的表1-5中。在一些实施例中，CD20 CAR包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD20 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
CD22 CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达CD22 CAR的细胞(例如，表达与人CD22结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，表达CD22 CAR的细胞包括根据WO2016164731和WO 2018067992(通过引用并入本文)的抗原结合结构域。示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于，例如，WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些实施例中，CD22 CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在实施例中，CAR分子包含结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中，抗原结合结构域包括如本文所述的单链Fv序列。
人CD22 CAR的序列在下文提供。在一些实施例中，人CD22 CAR是CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:285)
人CD22 CAR重链可变区
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 286)
人CD22 CAR轻链可变区
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO 287)
表16CD22 CAR的重链可变结构域CDR(CAR22-65)
Figure BDA0003867148300002661
表17CD22 CAR的轻链可变结构域CDR(CAR22-65)。该表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
Figure BDA0003867148300002662
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表17中列出的LC CDR1、LC CDR2、和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表17中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或其组合定义CDR。
VL和VH结构域在scFv中出现的顺序可以是变化的(即，VL-VH或VH-VL方向)，并且其中“G4S”亚基(SEQ ID NO:25)(其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:25)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:28)或(G4S)4)(SEQ ID NO:27))的一个、两个、三个或四个中任一种的拷贝可连接可变结构域以创建整个scFv结构域。可替代地，CAR构建体可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:43)的接头。可替代地，CAR构建体可以包含例如包含序列LAEAAAK(SEQ ID NO:308)的接头。在一些实施例中，CAR构建体不包括VL和VH结构域之间的接头。
这些克隆均含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
EGFR CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达EGFR CAR的细胞(例如，表达与人EGFR结合的CAR的细胞)。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达EGFRvIIICAR的细胞(例如，表达与人EGFRvIII结合的CAR的细胞)。示例性EGFRvIII CAR可包括WO2014/130657中披露的序列，例如WO 2014/130657的表2，将其通过引用并入本文。
示例性EGFRvIII结合序列或EGFR CAR序列可包含WO 2014/130657中披露的EGFRCAR的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列。
间皮素CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞是表达间皮素CAR的细胞(例如，表达与人间皮素结合的CAR的细胞)。示例性间皮素CAR可包括WO 2015090230和WO 2017112741中披露的序列，例如WO 2017112741的表2、3、4和5，将其通过引用并入本文。
其他示例性CAR
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列在WO 2014/130635中指定。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列在WO 2016/028896中指定。
在一些实施例中，CAR分子包含本文描述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以与CLL-1特异性结合，例如可以包括根据WO 2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/014535中指定。
在一些实施例中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。在其他实施例中，表达CAR的细胞可以与CD33特异性结合，例如可以包括根据WO 2016/014576(通过引用并入本文)的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一种)或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014576中指定。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如，WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO2015/090230(通过引用并入本文)中所述的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如，WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中所述的抗体)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的抗原结合结构域。
在实施例中，抗原结合结构域靶向BCMA并且描述于US-2016-0046724-A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD19并且描述于US-2015-0283178-A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD123并且描述于US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CLL1并且描述于US 2016/0051651 A1中。在实施例中，抗原结合结构域靶向CD33并且描述于US 2016/0096892 A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFRα-4等，描述于例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO2016/014535、和WO 2016/025880中，其各自通过引用以其全文并入本文。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以与GFR ALPHA-4特异性结合，例如可以包括根据WO 2016/025880(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码GFRα-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/025880中指定。
在一些实施例中，本文所述的任何CAR分子(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出的抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，即LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，即LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，肿瘤抗原是2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关蛋白(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，即HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，即LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，抗肿瘤抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一些实施例中，本披露的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合如本文描述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头方向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施例中，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369-1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487-496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其全文并入本文)。例如，scTCR可以经工程化为含有来自通过接头(例如柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR(例如CCAR)可以设计成包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与衍生跨膜的蛋白质细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一些实施例中，跨膜结构域是与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些实施例中，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞(例如，CART细胞)表面上的另一种CAR同源二聚化。在一些实施例中，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以使与相同的表达CAR的细胞(例如，CART)中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些实施例中，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本披露中特别有用的跨膜结构域可以包括至少以下一个或多个跨膜区：例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8(例如，CD8α、CD8β)，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包括共刺激分子的一个或多个跨膜区，该共刺激分子为例如MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(例如由其组成)。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:3的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ IDNO:15的核苷酸序列编码的铰链。
在一些实施例中，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:16的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
本披露的CAR(例如CCAR)的胞质结构域或区包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。
用于在本披露的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能性能力的重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞活化是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本披露中特别有用的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d的那些。在一些实施例中，本披露的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一些实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在本披露中特别有用的含有初级细胞内信号传导结构域的分子的另外实例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。
CAR的细胞内信号传导结构域可以单独包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导结构域)，或者它可以与在本披露的CAR的上下文中有用的任何其他所希望的一种或多种细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域(例如，CD3ζ链部分)和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体等等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。本披露的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施例中，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一些实施例中，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9(突变型CD3ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)的信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。
在一些实施例中，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施例中，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。
在一些实施例中，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一些实施例中，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施例中，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:39的核酸序列编码。
CAR构型
双重CAR
在实施例中，免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)表达两种CAR，例如与第一抗原结合的第一CAR和与第二抗原结合的第二CAR。在实施例中，第一抗原和第二抗原是不同的。在实施例中，第一或第二抗原选自在B细胞上表达的抗原、在急性髓性白血病细胞上表达的抗原或在实体瘤细胞上表达的抗原。在实施例中，第一或第二抗原选自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a、CD34、CLL-1、叶酸受体β、FLT3、EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。
在实施例中，第一CAR由第一核酸序列编码。在实施例中，第二CAR由第二核酸序列编码。在实施例中，第一和第二核酸序列布置在单个核酸分子上。在实施例中，第一和第二核酸序列布置在分开的核酸分子上。在实施例中，一种或多种核酸分子是DNA或RNA分子。在实施例中，第一和第二核酸序列以相同的定向定位，例如，第一和第二核酸序列以相同的方向进行转录。在实施例中，第一和第二核酸序列以不同的定向定位。在实施例中，单个启动子控制第一和第二核酸序列的表达。在实施例中，编码蛋白酶切割位点(例如，T2A、P2A、E2A或F2A切割位点)的核酸位于第一和第二核酸序列之间。在实施例中，以如下方式放置蛋白酶切割位点，这种方式使得细胞可以表达包含第一CAR和所述第二CAR的融合蛋白，并且融合蛋白随后通过蛋白水解切割而加工成两个肽。在一些实施例中，第一核酸序列在第二核酸序列的上游，或第二核酸序列在第一核酸序列的上游。在实施例中，第一启动子控制第一核酸序列的表达，并且第二启动子控制第二核酸序列的表达。在实施例中，核酸分子是质粒。在实施例中，核酸分子包含病毒包装元件。在实施例中，免疫细胞可以包含切割T2A、P2A、E2A或F2A切割位点的蛋白酶(例如，内源或外源蛋白酶)。
在实施例中，第一CAR包含第一抗原结合结构域，并且第二CAR包含第二抗原结合结构域。在实施例中，第一或第二抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL或scFv，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
多特异性CAR
在实施例中，本披露的CAR是多特异性CAR。在一个实施例中，多特异性CAR是双特异性CAR。在一个实施例中，双特异性CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在实施例中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在实施例中，第一表位和第二表位重叠。在实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在一些实施例中，本披露的CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案在本领域中是已知的；这些方案包括但不限于：“杵臼结构(knob in a hole)”途径，例如在US 5731168中所述；静电导向Fc配对，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；链交换工程化结构域(SEED)异源二聚体形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交换，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US 4433059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US4444878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C-末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US 5534254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，这些Fab片段通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，这些VH-CH1区通过在一个抗体的CH1区与另一个抗体的VH区(典型地具有相关联的轻链)之间的多肽间隔区连接，如例如在US 5591828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双抗体(也涵盖更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US5837821所述；用短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一取向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，这些VH和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；具有经肽接头连接的VH和VL结构域二者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法见于例如US 5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US6005079、US 6239259、US 6294353、US 6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US6743896、US 6809185、US 6833441、US 7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US7534866、US 7612181、US 2002004587 A1、US 2002076406 A1、US 2002103345 A1、US2003207346 A1、US 2003211078 A1、US 2004219643 A1、US 2004220388 A1、US2004242847 A1、US 2005003403 A1、US 2005004352 A1、US 2005069552 A1、US2005079170 A1、US 2005100543 A1、US 2005136049 A1、US 2005136051 A1、US2005163782 A1、US 2005266425 A1、US 2006083747 A1、US 2006120960 A1、US2006204493 A1、US 2006263367 A1、US 2007004909 A1、US 2007087381 A1、US2007128150 A1、US 2007141049 A1、US 2007154901 A1、US 2007274985 A1、US2008050370 A1、US 2008069820 A1、US 2008152645 A1、US 2008171855 A1、US2008241884 A1、US 2008254512 A1、US 2008260738 A1、US 2009130106 A1、US2009148905 A1、US 2009155275 A1、US 2009162359 A1、US2009162360A1、US 2009175851A1、US 2009175867 A1、US 2009232811 A1、US 2009234105 A1、US 2009263392 A1、US2009274649 A1、EP 346087 A2、WO 0006605 A2、WO 02072635 A2、WO 04081051 A1、WO06020258 A2、WO 2007044887 A2、WO 2007095338 A2、WO 2007137760 A2、WO 2008119353A1、WO 2009021754 A2、WO 2009068630 A1、WO 9103493 A1、WO 9323537 A1、WO 9409131A1、WO 9412625 A2、WO 9509917 A1、WO 9637621 A2、WO 9964460 A1中。上述申请的内容通过引用以其全文并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如VL1与VL2之间，如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选4(SEQID NO:26)。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头被布置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH和任选的一个或多个接头。
双抗体CAR
在一些实施例中，本披露的CAR是双特异性CAR。在一些实施例中，本披露的CAR是双抗体CAR。在一些实施例中，双抗体CAR包含与第一抗原和第二抗原结合的抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域包含VH1、VL1、VH2和VL2，其中VH1和VL1与第一抗原结合，并且VH2和VL2与第二抗原结合。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-任选地接头1(“L1”)-VH2-任选地接头2(“L2”)-VL2-任选地接头3(“L3”)-VL1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-任选地L1-VL2-任选地L2-VH2-任选地L3-VL1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-任选地L1-VH2-任选地L2-VL2-任选地L3-VH1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-任选地L1-VL2-任选地L2-VH2-任选地L3-VH1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-任选地L1-VH1-任选地L2-VL1-任选地L3-VL2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-任选地L1-VL1-任选地L2-VH1-任选地L3-VL2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-任选地L1-VH1-任选地L2-VL1-任选地L3-VH2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-任选地L1-VL1-任选地L2-VH1-任选地L3-VH2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-接头1(“L1”)-VH2-接头2(“L2”)-VL2-接头3(“L3”)-VL1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VL1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-L1-VH2-L2-VL2-L3-VH1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL1-L1-VL2-L2-VH2-L3-VH1。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VL2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VH2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VL2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-L1-VH1-L2-VL1-L3-VH2。在一些实施例中，抗原结合结构域从N-末端至C-末端具有如下排列：VL2-L1-VL1-L2-VH1-L3-VH2。在一些实施例中，可变区通过接头融合，该接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。在一些实施例中，可变区通过接头融合，该接头包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。在一些实施例中，L1包含SEQID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，L2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施例中，L3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，VH1、VL1、VH2或VL2包含本文披露的CDR、VH或VL序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文披露的双抗体包含经工程化的二硫键，例如以稳定双抗体和/或促进VH和VL的正确配对。在一些实施例中，经工程化的二硫键在最靠近铰链区的可变区(例如，最靠近所述铰链区的VH或VL区)与其对应的配对伴侣(例如，对应的VL或对应的VH)之间。
在一些实施例中，第一抗原和第二抗原是不同的。在一些实施例中，第一或第二抗原选自在B细胞上表达的抗原、在急性髓性白血病细胞上表达的抗原或在实体瘤细胞上表达的抗原。在一些实施例中，第一或第二抗原选自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、BCMA、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a、CD34、CLL-1、叶酸受体β、FLT3、EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。
嵌合TCR
在一方面，本披露的抗体和抗体片段可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文所披露的scFv可以接枝到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分)。作为另一个实例，抗体片段(例如，本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段(例如，本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或可替代地，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域，VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR(例如如本文所述的抗体或抗体片段的CDR)可以接枝到TCRα和/或TCRβ链中，以产生嵌合TCR。例如，本文披露的LCDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HCDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。这种嵌合TCR可以通过本领域已知的方法来产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487-496；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
其他实施例
在一个实施例中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一CAR和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如，作为片段，例如scFv)，该抗原结合结构域不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，该单结构域抗原结合分子包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术的、或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以源自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像源自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生源自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，源自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本披露的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，该嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受体的核酸，该嵌合膜包埋受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在实施例中，所述第一非天然存在的嵌合膜嵌入受体、所述第二非天然存在的嵌合膜包埋受体中的一者的抗原结合结构域包括scFv，而另一个包括单个VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。
在一些实施例中，本披露包含第一和第二CAR，其中所述第一CAR、所述第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，而另一个不是scFv。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包括scFv，并且另一个包括单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包括scFv，而另一者包括纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含scFv，而另一者包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面时，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不会因所述第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，在存在所述第二CAR的情况下，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是在不存在所述第二CAR的情况下所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合比两者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公开号WO 2014/145252中，所述专利的内容通过引用特此并入。
非抗体支架
在实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如，纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块免疫药物、大抗体(maxybody)、蛋白A或affilin。非抗体支架具有与细胞上的靶抗原结合的能力。在实施例中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区即可。
非抗体支架包括：纤连蛋白(诺华公司(Novartis)，马萨诸塞州)、锚蛋白(分子配偶体公司(Molecular Partners AG)，苏黎世，瑞士)、结构域抗体(Domantis公司(Domantis,Ltd.)，坎布里奇，马萨诸塞州，和Ablynx nv，津维纳拉德，比利时)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG，弗赖辛，德国)、小模块免疫药物(Trubion PharmaceuticalsInc.，西雅图，华盛顿州)、maxybody(Avidia,Inc.，山景城，加利福尼亚州)、蛋白质A(亲合体公司(Affibody AG)，瑞典)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，哈雷，德国)。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法在公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中更详细地描述，所述公开通过引用并入本文。简言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在的情况下完全活化。在实施例中，第一抗原结合结构域识别BCMA，例如包含本文所述的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别在急性髓性白血病细胞上表达的抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β。在实施例中，第一抗原结合结构域识别BCMA，例如包含本文所述的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别在B细胞上表达的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。
CAR与其他分子或药剂的共表达
第二CAR的共表达
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包含不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，CD19)或不同的靶标(例如，除CD19以外的靶标，例如，本文所述的靶标))的第二CAR。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，该第一CAR靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，该第二CAR靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以限制CAR对表达两个靶标的细胞的活性。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR(其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)、以及第二CAR(其靶向其他抗原，并包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的XCAR和抑制性CAR。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达X的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如，TGFβ)的细胞内结构域。
在一些实施例中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一CAR和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如，作为片段，例如scFv)，该抗原结合结构域不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，该单结构域抗原结合分子包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术的、或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施例中，SDAB分子可以源自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像源自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生源自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。
在一些实施例中，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，源自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本披露的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，所述嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码包含最小化这种相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一些实施例中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。
在一些实施例中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，存在第二CAR的情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是不存在CAR的情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况。在一些实施例中，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的药剂的共表达
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适合性的药剂。
例如，在一些实施例中，药剂可以是抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在实施例中，例如如本文所述的药剂(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)；或例如，抑制性蛋白质或系统(例如成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN))可以用于在表达CAR的细胞中抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的表达。在一些实施例中，药剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一些实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如，将抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一些实施例中，药剂包含例如抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ、或这些中的任一个的片段(例如这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如41BB、CD27、或CD28，例如如本文所述))和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一些实施例中，药剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体的CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。PD1的两个配体，PD-L1和PD-L2已证明在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000JExp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人癌症中很丰富(Dong等人2003J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一些实施例中，药剂包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也称为PD1 CAR)。在一些实施例中，PD1 CAR与本文所述的XCAR组合使用时，改善了T细胞的持久性。在一些实施例中，CAR是PD1 CAR，其包含PD1的细胞外结构域，如SEQ ID NO:24中加下划线所指示的。在一些实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一些实施例中，药剂包含编码PD1 CAR(例如，本文所述的PD1CAR)的核酸序列。在一些实施例中，PD1 CAR的核酸序列提供为SEQ ID NO:23，PD1 ECD以下划线标出。
在另一个实例中，在一些实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的实例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、和LIGHT。在实施例中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施例中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一些实施例中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一些实施例中，共刺激配体是CD80或CD86。在一些实施例中，共刺激分子配体是CD70。在实施例中，可以进一步工程化本文所述的表达CAR的免疫效应细胞以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)进一步包含趋化因子受体分子。T细胞中趋化因子受体CCR2b或CXCR2的转基因表达增强了向分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,J Immunother.[免疫疗法杂志]2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.[人基因疗法]2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论的约束，据信在识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体可以改善表达CAR的细胞向肿瘤的归巢，促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润，并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在或重组趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的表达CAR的细胞(例如CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)、或其趋化因子结合片段。在一些实施例中，基于由肿瘤分泌的一种或多种趋化因子选择有待用本文所述CAR表达的趋化因子受体分子。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包含(例如表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一些实施例中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在同一载体或在两个不同载体上。在其中本文所述CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施例中，所述CAR和趋化因子受体分子各自处于两个不同启动子的控制下或处于同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本披露还提供免疫效应细胞，例如，通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞，其包括编码本文所述的一种或多种CAR构建体(例如一种或多种CCAR构建体)的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子提供为信使RNA转录物。在一些实施例中，核酸分子提供为DNA构建体。
本文描述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一些实施例中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其他实施例中，核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
在一些实施例中，本披露的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，该核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施例中，本披露的整个CAR构建体由核酸分子编码，该核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。各种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
因此，在一些实施例中，例如通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中该CAR包含与本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)(包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如本文所述的ζ链))。
本披露还提供了载体，其中插入了编码CAR的核酸分子，例如本文所述的核酸分子。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713。
在一些实施例中，包含编码所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在一些实施例中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子如睡美人系统、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成。参见下文June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，将其通过引用并入本文。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY[纽约冷泉港出版社]中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR编码核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已经显示出可有效地从克隆到慢病毒载体中的核酸分子驱动CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一些实施例中，EF1a启动子包含实例中提供的序列。
启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本披露不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本披露的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。
以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:190)
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:198)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:191)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:192)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:193)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在一些实施例中，选择标志物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标志物和报告基因二者都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因，所述基因缺少于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，所述多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施例中，载体可包含两种或多种编码CAR的核酸序列，例如本文所述的CAR，例如CD19 CAR，和第二CAR，例如，抑制性CAR或特异性结合CD19以外的抗原的CAR。在此类实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在一些实施例中，两种或更多种CAR可以例如通过一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括T2A、P2A、E2A或F2A位点。
将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过例如本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆实用指南],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约。将多核苷酸引入到宿主细胞中的适合的方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内的递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在一些实施例中，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&KLaboratories)(普莱恩维尤(Plainview)，纽约)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从阿凡提极地脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本披露的抑制剂，为了证实重组核酸序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本披露范围内的药剂。天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一些实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公开号WO 2014/145252中，所述专利的内容通过引用特此并入。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中。简而言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都的情况下完全活化。
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。RNA CAR及其使用方法描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第553-570段中，将其通过引用以其全文并入本文。
免疫效应细胞可包括由信使RNA(mRNA)编码的CAR。在一些实施例中，将编码本文所述CAR的mRNA导入免疫效应细胞(例如，通过本文所述的方法制备的)用于产生表达CAR的细胞。
在一些实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有对本文所述的肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一些实施例中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一些实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一些实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在一些实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(开放阅读框)，包括5'和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一些实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。实施例中的RNA具有5'和3’UTR。在一些实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。
在一些实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的开放阅读框上游。在一些实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一些实施例中，mRNA具有5'端帽和3'聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003))。
将聚(A)/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚(A)/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有聚(A)/T 3'伸展段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚(A)/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚T尾(例如100T尾)(SEQ ID NO:31)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:32))的反向引物产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一些实施例中，聚(A)尾在100和5000个腺苷之间(例如SEQ ID NO:33)。
在使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌聚(A)聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的聚(A)尾。在一些实施例中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:34)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到聚(A)尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一些实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文所述的技术获得5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生物化学科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯],330:958-966(2005))。
通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞渗透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany)))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。
非病毒递送方法
在一些实施例中，可以使用非病毒方法将编码本文所述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。
在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBacTM(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961-2971；Huang等人Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人Blood.[血液学].122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy[分子疗法],16.9(2008):1515-16；Bell等人Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；和Ding等人Cell[细胞].122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶标DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如，Aronovich等人，同上。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见例如，Grabundzija等人Nucleic AcidsRes.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有这些文献均通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过引用并入本文。
SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。
根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。
在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述的CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
制造/生产方法
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括在用细胞处理后施用T细胞消耗剂(例如，如本文所述的免疫效应细胞)，从而减少(例如，消耗)表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)。此类T细胞消耗剂可用于有效消耗表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施例中，表达CAR的细胞根据本文的方法制造，例如，根据本文的方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施例中，在施用细胞后一周、两周、三周、四周或五周施用T细胞消耗剂，例如本文所述的免疫效应细胞群体。
在一些实施例中，T细胞消耗剂是消耗表达CAR的细胞的药剂，例如，通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如靶抗原)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如受体)。此类靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
在一些实施例中，表达CAR的细胞共表达CAR和靶蛋白，例如，天然表达靶蛋白或经工程化以表达靶蛋白。例如，细胞(例如免疫效应细胞群体)可包括含有CAR核酸(例如，如本文所述的CAR核酸)的核酸(例如，载体)和编码靶蛋白的核酸。
在一些实施例中，T细胞消耗剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗体分子，例如阿仑单抗。
在其他实施例中，细胞，例如免疫效应细胞群体，表达如本文所述的CAR分子(例如，CD19CAR)和由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一些实施例中，靶蛋白是CD20。在实施例中，其中靶蛋白是CD20，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何上述方法的另外的实施例中，这些方法进一步包括将细胞(例如造血干细胞)或骨髓移植到哺乳动物中。
在一些实施例中，本披露的特征在于在细胞移植前调节哺乳动物的方法。该方法包括给哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽的细胞，例如CD19 CAR核酸或多肽。在一些实施例中，细胞移植是干细胞移植(例如造血干细胞移植)或骨髓移植。在其他实施例中，在细胞移植前调节受试者，包括减少受试者中表达靶细胞的数量，例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞。
淘洗
在一些实施例中，本文描述的方法的特征在于淘洗方法，其去除不需要的细胞，例如单核细胞和胚细胞，从而导致适合CAR表达的所需免疫效应细胞的富集改进。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法针对从先前冷冻的样品(例如，解冻的样品)富集适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞进行了优化。在一些实施例中，与从本领域已知的淘洗方案收集的细胞制剂相比，本文所述的淘洗方法提供了具有改进的纯度的细胞制剂。在一些实施例中，本文所述的淘洗方法包括使用起始样品(例如，细胞样品，例如，解冻的细胞样品)优化的粘度，通过用某些等渗溶液(例如，PBS)稀释，并使用流速的优化组合并通过淘洗装置收集的每个级分的收集体积。可应用于本披露的示例性淘洗方法描述于WO2017/117112的第48-51页，将其通过引用以其全文并入本文。
密度梯度离心
过继性细胞治疗产品的制造需要使所希望的细胞(例如，免疫效应细胞)远离外周血单采血起始材料中存在的血细胞和血液成分的复杂混合物。通过Ficoll溶液使用密度梯度离心成功分离了外周血衍生的淋巴细胞样品。然而，Ficoll不是用于分离治疗用细胞的优选试剂，因为Ficoll不适合临床使用。此外，Ficoll含有乙二醇，它对细胞有潜在毒性。此外，冷冻保存后解冻的单采血产物的Ficoll密度梯度离心产生次优的T细胞产物，例如，如本文实例中所述。例如，在通过Ficoll溶液的密度梯度离心分离的细胞制剂中观察到最终产物中T细胞的损失，伴随非T细胞的相对增加，尤其是不希望的B细胞、胚细胞和单核细胞。
不希望受理论束缚，据信免疫效应细胞(例如T细胞)在冷冻保存期间脱水，变得比新鲜的细胞更稠密。不希望受理论束缚，还据信免疫效应细胞(例如T细胞)比其他血细胞保持密集更久，因此与其他细胞相比，在Ficoll密度梯度分离期间更容易丢失。因此，不希望受理论束缚，与Ficoll或具有与Ficoll相同密度(例如，1.077g/mL)的其他培养基相比，认为密度大于Ficoll的培养基提供了所希望的免疫效应细胞的改进的分离。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度培养基。在一些实施例中，密度梯度培养基包含约60％的碘克沙醇于水中的溶液。
在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用具有密度大于Ficoll的密度梯度培养基。在一些实施例中，本文所述的密度梯度离心方法包括使用密度梯度培养基，该密度梯度培养基具有大于1.077g/mL，例如，大于1.077g/mL、大于1.1g/mL、大于1.15g/mL、大于1.2g/mL、大于1.25g/mL、大于1.3g/mL、大于1.31g/mL的密度。在一些实施例中，该密度梯度培养基具有约1.32g/mL的密度。
密度梯度离心的另外的实施例描述于WO 2017/117112的第51-53页，将其通过引用以其全文并入本文。
通过选择富集
本文提供了选择特定细胞以改进适合CAR表达的所希望的免疫效应细胞富集的方法。在一些实施例中，选择包含阳性选择，例如，选择所需的免疫效应细胞。在一些实施例中，选择包含阴性选择，例如，选择不需要的细胞，例如，去除不需要的细胞。在实施例中，本文所述的阳性或阴性选择方法在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，例如本文所述的流通装置。示例性的阳性和阴性选择描述于WO 2017/117112的第53-57页，将其通过引用以其全文并入本文。选择方法可以在流动条件下进行，例如，通过使用流通装置，也称为细胞加工系统，以进一步富集所希望的免疫效应细胞(例如，适合用于CAR表达的T细胞)的细胞制剂。示例性的流通装置描述于WO 2017/117112的第57-70页，将其通过引用以其全文并入本文。示例性细胞分离和去珠方法描述于WO 2017/117112的第70-78页，将其通过引用以其全文并入本文。
选择程序不限于WO 2017/117112的第57-70页所述的程序。可以使用经由CD19、CD14和CD26 Miltenyi珠与柱技术(
Figure BDA0003867148300003171
Plus或
Figure BDA0003867148300003172
)组合去除不需要的细胞进行阴性T细胞选择，或可以使用CD4和CD8 Miltenyi珠与柱技术的组合进行阳性T细胞选择(
Figure BDA0003867148300003181
Plus或
Figure BDA0003867148300003182
)。可替代地，可以使用具有可释放CD3珠的无柱技术(GE医疗集团(GE Healthcare))。
此外，还可以使用诸如ThermoGenesis X系列装置的无珠技术。
临床应用
本文的所有过程均可根据临床优质生产规范(cGMP)标准进行。
这些过程可用于细胞纯化、富集、收获、洗涤、浓缩或用于细胞培养基交换，特别是在制造过程开始时以及制造过程中收集原始起始原料(特别地细胞)用于选择或扩增用于细胞疗法的细胞。
这些细胞可包括任意多个细胞。这些细胞可以是相同的细胞类型，或混合的细胞类型。此外，这些细胞可以来自一个供体，例如用于细胞疗法的自体供体或单个异体供体。可以通过例如白细胞单采或单采从患者获得细胞。这些细胞可以包括T细胞，例如可以包括具有大于50％T细胞、大于60％T细胞、大于70％T细胞、大于80％T细胞、或90％T细胞的群体。
选择过程在培养和扩增前选择细胞时特别有用。例如，用抗CD3和/或抗CD28涂覆的顺磁性颗粒可用于选择T细胞用于扩增或用于引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其他蛋白质的核酸。此类过程用于产生CTL019 T细胞用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
本文披露的去珠过程和模块可特别用于制造用于细胞疗法的细胞，例如在培养和扩增之前或之后纯化细胞。例如，涂覆有抗CD3和/或抗CD28抗体的顺磁性颗粒可用于选择性扩增T细胞，例如通过引入编码嵌合抗原受体的核酸(CAR)或其他蛋白质被修饰的或将要被修饰的T细胞，使得CAR由T细胞表达。在制造此类T细胞期间，可以使用去珠过程或模块将T细胞与顺磁性颗粒分离。这种去珠过程或模块用于产生例如用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的CTL019 T细胞。
在这里举例说明的一个此类过程中，经由单采(例如，白细胞单采)从供体(例如，用自体嵌合抗原受体T细胞产物治疗的患者)收集细胞(例如T细胞)。然后可以任选地纯化收集的细胞，例如，通过淘洗步骤、或经由靶细胞(例如，T细胞)的阳性或阴性选择。然后可以将顺磁性颗粒，例如抗CD3/抗CD28涂覆的顺磁颗粒添加到细胞群体中，以扩增T细胞。该过程还可包括转导步骤，其中将编码一种或多种所希望的蛋白质的核酸，例如CAR，例如靶向CD19的CAR，引入细胞中。可以将核酸引入慢病毒载体中。然后可以将细胞(例如，慢病毒转导的细胞)扩增数天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天，例如在存在合适的培养基的情况下。在扩增之后，本文披露的去珠过程/模块可用于将所希望的T细胞与顺磁性颗粒分离。该过程可包括根据本披露的过程的一个或多个去珠步骤。然后可以配制去珠细胞用于施用给患者。CAR T细胞的实例及其制造进一步描述于例如WO 2012/079000中，其通过引用以其全文并入本文。本披露的系统和方法可以用于WO 2012/079000中描述的或与WO 2012/079000相关的任何细胞分离/纯化/去珠过程。另外的CAR T制造过程描述于例如WO2016109410和WO 2017117112中，其通过引用以其全文并入本文。
与常规系统和方法相比，本文的系统和方法可以类似地有益于其他细胞疗法产品，其浪费较少的所希望的细胞，引起较少的细胞损伤，并且更可靠地从细胞中去除磁性和任何非顺磁性颗粒，且较少的暴露于化学药剂或不暴露。
尽管上文仅特定描述了本披露的示例性实施例，但是应当理解，在不脱离本披露的精神和预期范围的情况下，这些实例的修改和变化是可能的。例如，除了所描述的那些之外，磁性模块和包含它们的系统可以以各种配制来布置和使用。此外，也可以使用非磁性模块。此外，这些系统和方法可以包括未在本文特别描述的另外的组件和步骤。例如，方法可以包括预注，其中首先将流体引入组件中以去除气泡并降低对细胞悬浮液或缓冲液移动的阻力。此外，实施例可以仅包括本文描述的系统的一部分以与本文所述的方法一起使用。例如，实施例可涉及可在非一次性设备中使用的一次性模块、软管等，以形成能够分离或去珠细胞以产生细胞产物的完整系统。
在本领域中已经描述了可以与本披露结合的另外的制造方法和过程。例如，WO2017/117112的第86-91页描述了改进的洗涤步骤和改进的制造过程。
免疫效应细胞的来源
该部分提供了另外的方法或步骤，用于获得包含所希望的免疫效应细胞的输入样品；分离和加工所希望的免疫效应细胞(例如T细胞)；并去除不需要的物质(例如不需要的细胞)。可以将在该部分中描述的另外的方法或步骤与以下各项中的任何一种组合使用：淘洗、密度梯度离心、流动条件下的选择、或在前述部分中描述的经改进的洗涤步骤。
可以从受试者中获得细胞(例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞)来源。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。
在本披露的一些实施例中，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，和本文披露的任何方法，按其步骤的任何组合，从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞(例如T细胞)。在一些实施例中，通过单采获得来自个体的循环血液的细胞。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆部分，并且任选地将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。在一些实施例中，使用本文所述的经改进的洗涤步骤洗涤细胞。
在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMateTM、或血液细胞回收仪(Haemonetics Cell Saver)5)、高级血液细胞回收仪(Haemonetics CellSaver Elite)(通用电气医疗集团赛分科技(GE Healthcare Sepax)或赛菲尔公司(Sefia))、或利用旋转膜过滤技术的装置(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)LOVO)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyteA、补充有人血清白蛋白(HSA)的PBS-EDTA、或含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施例中，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和消耗单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离所希望的免疫效应细胞(例如T细胞)。
本文所述的方法可以包括例如使用例如(如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节性细胞耗减的细胞(例如CD25+耗减的细胞或CD25高耗减的细胞)群体。在一些实施例中，T调节性细胞耗减的细胞群体包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞或CD25高细胞。
在一些实施例中，使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体(例如IL-2)，从群体中去除T调节性细胞(例如CD25+T细胞或CD25高T细胞)。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合，或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些实施例中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。
在一些实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25消耗试剂从群体中去除T调节性细胞(例如CD25+T细胞或CD25高T细胞)。在一些实施例中，细胞与CD25耗减试剂的比率是1e7个细胞至20μL、或1e7个细胞至15μL、或1e7个细胞至10μL、或1e7个细胞至5μL、或1e7个细胞至2.5μL、或1e7个细胞至1.25μL。在一些实施例中，例如对于T调节性细胞，使用大于5亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用6亿、7亿、8亿、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+T细胞。在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一些实施例中，所得T调节性细胞耗减的细胞群体具有2x109个T调节性细胞，例如CD25+细胞或CD25高细胞，或更少(例如1x109、5x108、1x108、5x107、1x107个、或更少的T调节性细胞)。
在一些实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从群体中去除T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像耗减2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如Treg细胞)的数量)可以显著降低受试者复发的风险。例如，消耗Treg细胞的方法是本领域已知的。减少Treg细胞的方法包括但不限于，环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25-耗减、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，消耗)Treg细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减Treg细胞。
不希望受特定理论的束缚，在单采之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如Treg细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少Treg细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，减少Treg细胞的方法包括但不限于，向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。在一些实施例中，减少Treg细胞的方法包括但不限于，向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，消耗)Treg细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗减Treg细胞。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一些实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，修饰表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)制造过程以耗减Treg细胞。在一些实施例中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，将CD25耗减用于耗减Treg细胞。
在一些实施例中，有待去除的细胞群体既不是调节性T细胞或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或在所述耗减之后，或以另一种顺序去除。
本文所述的方法可以包括多余一个的选择步骤，例如多余一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体中去除细胞，从而提供T调节性细胞耗减的(例如CD25+耗减的或CD25高耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，所述细胞群体适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一些实施例中，将肿瘤抗原表达细胞与T调节(例如CD25+细胞或CD25高细胞)同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段以及抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于去除细胞的同一底物(例如，珠)上；或者抗CD25抗体或其片段或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至其混合物可以用于去除细胞的分开的珠上。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)的去除和肿瘤抗原表达细胞的去除是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群体中去除细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性细胞耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)群体。例如，如本文所述示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGFβ)。在一些实施例中，将检查点抑制剂表达细胞与T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)同时去除。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如CD25+细胞或CD25高细胞)的去除和表达检查点抑制剂的细胞的去除是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
本文所述的方法可以包括阳性选择步骤。例如可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)-缀合的珠(例如
Figure BDA0003867148300003251
M-450CD3/CD28 T)孵育持续足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，时间段是约30分钟。在一些实施例中，时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在一些实施例中，时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在一些实施例中，时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。
在一些实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号：WO 2013/126712。
为了通过阳性或阴性选择分离所希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在一些实施例中，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)以确保细胞和珠的最大接触。例如在一些实施例中，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一些实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒，如珠)，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+ T细胞更有效地捕获。在一些实施例中，所使用的细胞浓度是5x106/ml。在一些实施例中，所使用的浓度可以是从约1x105/ml至1x106/ml，以及其间的任何整数值。
在一些实施例中，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达甘油二酯激酶(DGK)，例如是DGK缺陷型。在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达Ikaros(例如是Ikaros缺陷型)。在一些实施例中，群体的多个免疫效应细胞不表达DGK和Ikaros，例如是DGK和Ikaros缺陷型。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在一些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并允许在使用本披露的方法活化之前在室温下静置一小时。
在本披露的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(如T细胞)以便后续用于免疫效应细胞疗法中，以用于将受益于免疫效应细胞疗法的任意数目的疾病或病症，如本文所述的那些。在一些实施例中，血液样品或单采取自基本健康的受试者。在一些实施例中，血液样品或单采取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在一些实施例中，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在一些实施例中，在诊断如本文描述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在一些实施例中，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制性剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本披露的一些实施例中，在使受试者离开功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改进的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本披露的上下文中考虑了在所述恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞、或造血谱系的其他细胞。此外，在一些实施例中，动员(例如用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。说明性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞和其他细胞。
在一些实施例中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一些实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平、或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。
在其他实施例中，已经被或将经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群体可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，该mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。
应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTSTM Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTSTM免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一些实施例中，本申请的方法可利用包含至少约0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％或10％血清的培养基条件。在一些实施例中，培养基包含约0.5％-5％、约0.5％-4.5％、约0.5％-4％、约0.5％-3.5％、约0.5％-3％、约0.5％-2.5％、约0.5％-2％、约0.5％-1.5％、约0.5％-1.0％、约1.0％-5％、约1.5％-5％、约2％-5％、约2.5％-5％、约3％-5％、约3.5％-5％、约4％-5％、或约4.5％-5％血清。在一些实施例中，培养基包含约0.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约0.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约1％血清。在一些实施例中，培养基包含约1.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约2％血清。在一些实施例中，培养基包含约2.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约3％血清。在一些实施例中，培养基包含约3.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约4％血清。在一些实施例中，培养基包含约4.5％血清。在一些实施例中，培养基包含约5％血清。在一些实施例中，血清包含人血清，例如人AB血清。在一些实施例中，血清是在收集后允许自然凝固的人血清，例如，非凝块(OTC)血清。在一些实施例中，血清是血浆来源的血清人血清。血浆来源的血清可以通过将在存在抗凝血剂(例如柠檬酸钠)的情况下收集的混合的人血浆脱纤维来产生。
在一些实施例中，本申请的方法可利用包含无血清培养基的培养基条件。在一些实施例中，无血清培养基是OpTmizerTM CTSTM(美国生达医药集团(LifeTech))、ImmunocultTM XF(干细胞技术公司(Stemcell technologies))、CellGroTM(CellGenix)、TexMacsTM(美天旎公司(Miltenyi))、StemlineTM(西格玛公司(Sigma))、Xvivo15TM(瑞士龙沙集团(Lonza))、
Figure BDA0003867148300003301
(欧文科技公司(Irvine Scientific))、或
Figure BDA0003867148300003302
(RandD系统)。无血清培养基可以补充有血清置换物，例如来自美国生达医药集团(LifeTech)的ICSR(免疫细胞血清替代物)。血清置换物(例如ICSR)的水平可以是例如高达5％、例如约1％、2％、3％、4％、或5％。在一些实施例中，无血清培养基可补充有血清，例如人血清，例如人AB血清。在一些实施例中，血清是在收集后允许自然凝固的人血清，例如，非凝块(OTC)血清。在一些实施例中，血清是血浆来源的人血清。血浆来源的血清可以通过将在存在抗凝血剂(例如柠檬酸钠)的情况下收集的混合的人血浆脱纤维来产生。
在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros、或者具有降低、或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一些实施例中，从受试者获得NK细胞。在一些实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
同种异体表达CAR的细胞
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如经工程化以使其在其表面上不表达任何功能性TCR、工程化使得其不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基(例如，工程化使得其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)、或工程化以使其在其表面上产生非常少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如经工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以经工程化，使得细胞表面表达HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)下调。在一些实施例中，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现HLA的下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指内切核酸酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文所述的任何方法不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGF(例如TGFβ)。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA(如siRNA或shRNA)、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，在细胞(例如T细胞)中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)来抑制TCR表达和/或HLA表达。
siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第649和650段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指源自CRISPR和Cas的系统，所述系统可以用于在细胞(例如T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第651-658段中，将其通过引用以其全文并入。抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化因子样效应核酸酶，可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段中，该文献通过引用以其全文并入。
端粒酶表达
端粒在体细胞持久性中起关键作用，其长度由端粒酶(TERT)维持。CLL细胞中的端粒长度可能非常短(Roth等人,“Significantly shorter telomeres in T-cells ofpatients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia[患有ZAP-70+/CD38慢性淋巴细胞白血病的患者T细胞中显著更短的端粒]”British Journal of Haematology[英国血液学杂志],143,383-386.,2008年8月28日)，并且在制造的表达CAR的细胞(例如CART19细胞)中可能甚至更短，限制了它们在过继转移至患者后其扩增的可能性。端粒酶表达可以从复制耗竭中拯救表达CAR的细胞。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在一些实施例中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位表达端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)。在一些实施例中，本披露提供了产生表达CAR的细胞的方法，该方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与核酸接触。
端粒酶表达可以是稳定的(例如，核酸可以整合到细胞的基因组中)或瞬时的(例如，核酸不整合，并且表达在一段时间后降低，例如几天)。通过用编码端粒酶亚基和选择标志物的DNA转染或转导细胞，并选择稳定的整合子，可以实现稳定的表达。替代性地或组合地，例如使用Cre/Lox或FLP/FRT系统可以通过位点特异性重组来完成稳定表达。
瞬时表达可以涉及用核酸(例如DNA或RNA，如mRNA)转染或转导。在一些实施例中，瞬时mRNA转染避免了有时与TERT稳定转染相关联的遗传不稳定性。外源端粒酶活性的瞬时表达描述于例如国际申请WO 2014/130909中，该申请通过引用以其全文并入。在实施例中，根据由现代化疗法公司(Moderna Therapeutics)商业化的信使RNA TherapeuticsTM平台进行端粒酶亚基的基于mRNA的转染。例如，该方法可以是在美国专利号8710200、8822663、8680069、8754062、8664194、或8680069中所述的方法。
在一些实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO:284)
在一些实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:284的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:284的序列。在一些实施例中，hTERT在N-末端、C-末端、或两者处包含缺失(例如不超过5、10、15、20、或30个氨基酸)。在一些实施例中，hTERT在N-末端、C-末端、或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不超过5、10、15、20、或30个氨基酸)。
在一些实施例中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)。
免疫效应细胞(例如T细胞)的活化和扩增
通过本文所述的方法产生或富集的免疫效应细胞(例如T细胞)通常可以使用如例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
通常，免疫效应细胞群体可以通过与表面接触而扩增，该表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化因子(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司(Diaclone,
Figure BDA0003867148300003361
France))，还可以使用本领域公知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.[移植学会会报]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一些实施例中，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级活化信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在一些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在一些实施例中，这些药剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这点上，参见例如，美国专利申请公布号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，考虑将其用于活化和扩增本披露内容中的T细胞。
在一些实施例中，将两种药剂固定在珠上，或者在相同的珠上(即“顺式”)，或者在分离的珠上(即“反式”)。通过举例，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一些实施例中，使用针对CD4+ T细胞扩增和T细胞生长的与珠结合的每种抗体的1:1的比率。在本披露的一些实施例中，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一些实施例中，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一些实施例中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在一些实施例中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即，CD3:CD28的比率小于1。在一些实施例中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在一些实施例中，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在一些实施例中，范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在一些实施例中包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些适合的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个适合的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一些实施例中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一些实施例中，适合的颗粒与细胞的比率为1:5。在一些实施例中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一些实施例中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外的颗粒在之后每天或每隔一天加入到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一些实施例中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一些实施例中，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以适用于本披露内容。特别地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一些实施例中，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在一些实施例中，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将这些珠和这些细胞分离，并且然后培养细胞。在一些实施例中，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在一些实施例中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28附着的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一些实施例中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的
Figure BDA0003867148300003391
M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子，如钙和镁))中组合。同样，本领域的普通技术人员可易于理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶标细胞在样品中可以非常稀少，仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含所关注的靶标细胞。因此，任何细胞数量均在本披露内容的上下文中。在一些实施例中，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一些实施例中，使用约100亿个细胞/ml、90亿个细胞/ml、80亿个细胞/ml、70亿个细胞/ml、60亿个细胞/ml、50亿个细胞/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且在一些实施例中是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，例如通过本文所述的方法扩增用编码CAR(例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR)的核酸转导的细胞。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更短(例如7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、表面CAR表达、CAR定量PCR、或其组合。在一些实施例中，与在相同的培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示抗原刺激后细胞倍增方面至少一倍、两倍、三倍或四倍的增加。在一些实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述的CD19 CAR细胞)显示促炎细胞因子产生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml增加至少一、二、三、四、五、十倍或更多。
还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低基础培养基(Minimal Essential Media)、α-MEM、RPMI培养基1640、AIM-V、DMEM、F-12、或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza))、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM)，该培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFNγ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNFα或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括但不限于RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo 20、OpTmizer、和IMDM，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
在一些实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当培养基(例如本文描述的介质)中扩增，该白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一些实施例中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施例中，本文所述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体，IL-2从细胞群体中去除T调节性细胞(例如CD25+T细胞或CD25高T细胞)。从细胞群体中去除T调节性细胞(例如CD25+T细胞或CD25高T细胞)的方法是本文所述的。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群体(例如，其中T调节性细胞，如CD25+T细胞或CD25高T细胞已经被耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体其片段，或CD25结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25结合配体)在存在IL-15和/或IL-7的情况下扩增。
在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一些实施例中，在离体扩增过程中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一些实施例中，接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+ T细胞)的存活和增殖。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程期间，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标记物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一旦构建本文描述的CAR，可以使用各种测定来评价分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞、在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价本披露的CAR的作用的测定进一步详细描述于下文。
可以将原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析用于检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第695段，将其通过引用以其全文并入本文。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR+ T细胞的体外扩增。例如，将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术，在培养的第6天在CD4+和/或CD8+ T细胞亚群中评估GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。替代性地，在第0天将CD4+和CD8+ T细胞的混合物用被αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用CAR转导，使用表达CAR连同eGFP(使用2A核糖体跳跃序列)的双顺反子慢病毒载体。在存在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)的情况下，将培养基用如本文所述的癌症相关抗原+K562细胞(表达与如本文所述的癌症相关联的抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激。每隔一天以100IU/ml向培养基中添加外源IL-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计算GFP+ T细胞。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+ T细胞扩增。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III颗粒计数器或更高版本、耐克龙细胞计数仪(Nexcelom Cellometer Vision)、密理博赛普特计数器(Millipore Scepter)或其他细胞计数器在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
还可以将动物模型用于测量表达CAR的细胞活性，例如如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第698段，将其通过引用以其全文并入。
例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第699段所描述，可以评估剂量依赖性CAR治疗应答，将其通过引用以其全文并入。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第700段中，将其通过引用以其全文并入本文。
通过标准51Cr释放测定可以评估细胞毒性，例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第701段所述，将其通过引用以其全文并入本文。也可以使用替代性的非放射性方法。
例如使用xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)，还可以通过测量贴壁细胞的电阻抗中的变化来评估细胞毒性。在一些实施例中，在多个时间点处测量细胞毒性。
在携带肿瘤的动物模型中可以将成像技术用于评估CAR的特定运输和增殖，例如如在2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第702段所述，将其通过引用以其全文并入本文。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
可替代地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或涉及使用CAR配体的CAR特异性选择。在一些实施例中，CAR配体是与CAR分子结合的抗体，例如与CAR的细胞外抗原结合结构域结合的抗体(例如，与抗原结合结构域结合的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如本文所述的CAR抗原分子)。
在一些实施例中，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；
获得表达CAR的细胞(例如，获得含有表达CAR的细胞的样品，如制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。
在一些实施例中，披露了扩增和/或活化细胞(例如免疫效应细胞)的方法。该方法包括：
提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生活化的和/或扩增的细胞群体。
在某些实施例中，CAR配体存在于底物(例如，固定或附接至底物上，如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一些实施例中，CAR配体与珠附接(例如共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在存在CAR分子的配体的情况下培养免疫细胞的群体，例如，使用本文所述的任何方法。
在其他实施例中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
在一些实施例中，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。
在其他实施例中，提供了用于消耗、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一些实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在一些实施例中，抗独特型抗体可以导致效应细胞活性(例如ADCC或ADC活性)。
可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，将其内容通过引用并入。
在一些实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US 2015/043219中所述，将其内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群显示了增强的持久性。
在一些实施例中，CD4+ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD4+ T细胞(例如ICOS结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CD8+ T细胞包含本文所述的CAR，该CAR包含适合于(例如，优化，例如，导致增强的持久性)CD8+ T细胞(例如，4-1BB结构域、CD28结构域，或ICOS结构域以外的其他共刺激结构域)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一些实施例中，本文描述了治疗受试者的方法，例如患有癌症的受试者。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS结构域；以及
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，如4-1BB结构域、CD28结构域、或除ICOS结构域的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法进一步包括施用：
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+ T细胞，该CAR包含：
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，不存在于CARCD8+上，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
生物聚合物递送方法
在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO 2015/142675的第1004-1006段中，将其通过引用以其全文并入。
药物组合物和治疗
在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括施用如本文所述产生的表达CAR的细胞(任选地与一种或多种其他的疗法的组合)。在一些实施例中，表达CAR的细胞表达本文披露的CCAR。在一些实施例中，表达CAR的细胞表达本文披露的CAR和本文披露的调节分子。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括施用包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物(任选地与一种或多种其他的疗法的组合)。在一些实施例中，本披露提供了运送或接收反应混合物的方法，该反应混合物包含如本文所述的表达CAR的细胞。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括接收如本文所述产生的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞(任选地与一种或多种其他的疗法的组合)。在一些实施例中，本披露提供了治疗患者的方法，该方法包括产生如本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞(任选地与一种或多种其他的疗法的组合)。其他的疗法可以是例如癌症疗法(例如化疗)。
在一些实施例中，与降低Treg细胞群体的分子组合向受试者施用表达本文所述CAR的细胞。减少(例如耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25耗减、环磷酰胺施用、调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。
在一些实施例中，将本文所述的疗法(例如表达CAR的细胞)与靶向GITR和/或调整GITR功能的分子组合施用于受试者，如耗减调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一些实施例中，GITR结合分子和/或调整GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或Treg消耗GITR抗体)在表达CAR的细胞之前施用。例如在一些实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采之前施用。在实施例中，在施用(例如输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采之前向受试者施用环磷酰胺。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采之前，向受试者施用环磷酰胺和抗GITR抗体。在一些实施例中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液学癌症，如ALL或CLL)。在一些实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有ALL。在实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价体抗GITR抗体)，例如像描述于以下中的GITR融合蛋白：美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、美国专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或所述抗GITR抗体，例如在美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726。
在一些实施例中，将本文所述的CAR表达细胞与GITR激动剂(例如本文所述的GITR激动剂)组合施用受试者。在一些实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如在一些实施例中，可以在细胞的单采之前施用GITR激动剂。在一些实施例中，受试者患有CLL。
本文所述的方法可以进一步包括在药物组合物中配制表达CAR的细胞。药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文所述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。可以配制组合物，例如，用于静脉内施用。
在一些实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
当指示“免疫有效量”、“抗癌症有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物以104至109个细胞/kg体重、在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。还可以将T细胞组合物以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括约1.1x106-1.8x107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19CAR细胞)的剂量包括约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括至少约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包括高达约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。
在一些实施例中，可能希望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且然后随后重抽血液(或进行单采)，从其活化免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并用这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在一些实施例中，可以将来自从10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)活化。在一些实施例中，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)活化。
可以按任何方便的方式进行受试者组合物的施用。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内(例如，通过皮内或皮下注射)施用本文描述的组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
给药方案
在一些实施例中，表达CAR的活细胞(例如表达CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活细胞)的剂量包括约0.5x106个表达CAR的活细胞至约1.25x109个表达CAR的活细胞(例如0.5x106个表达CAR的活细胞至1.25x109个表达CAR的活细胞)。在一些实施例中，表达CAR的活细胞(例如表达CD19、BCMA、CD20、或CD22 CAR的活细胞)的剂量包括约1x106、约2.5x106、约5x106、约1.25x107、约2.5x107、约5x107、约5.75x107、或约8x107个表达CAR的活细胞。
患者选择
在本文披露的治疗受试者的任何方法或使用的组合物的一些实施例中，受试者患有癌症(例如血液癌)。在一些实施例中，癌症选自淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结节性边缘区淋巴瘤、小儿结节性边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是复发性和/或难治性癌症。
在本文披露的治疗受试者的任何方法或所使用的组合物的一些实施例中，受试者患有CLL或SLL。在一些实施例中，患有CLL或SLL的受试者先前已经被施用BTK抑制剂疗法(例如依鲁替尼)持续至少1-12个月(例如6个月)。在一些实施例中，BTK抑制剂疗法(例如依鲁替尼疗法)是第二线疗法。在一些实施例中，受试者具有部分应答，或响应于BTK抑制剂疗法患有稳定的疾病。在一些实施例中，受试者对BTK抑制剂疗法不应答。在一些实施例中，受试者产生抗性，例如产生依鲁替尼抗性突变。在一些实施例中，依鲁替尼抗性突变包括在编码BTK的基因和/或编码PLCg2的基因中的突变。在一些实施例中，受试者是成人，例如至少18岁。
在本文披露的治疗受试者的任何方法或所使用的组合物的一些实施例中，受试者患有DLBCL，例如复发性和/或难治性DLBCL。在一些实施例中，患有DLBCL(例如复发性和/或难治性DLBCL)的受试者先前已经被施用至少2线化疗，例如抗CD20疗法和/或基于蒽环类的化疗。在一些实施例中，受试者先前已经接受干细胞疗法(例如自体干细胞疗法)并对所述干细胞疗法免疫有响应。在一些实施例中，受试者不适合进行干细胞疗法(例如自体干细胞疗法)。在一些实施例中，受试者是成人，例如至少18岁。
用于评估CAR有效性的生物标志物
在一些实施例中，本文披露了在受试者(例如患有癌症的受试者，例如血液癌)中评估或监测表达CAR的细胞疗法(例如CD19或BCMA CAR疗法)的有效性的方法。该方法包括获得CAR疗法有效性的值，其中所述值指示表达CAR的细胞疗法的有效性或适合性。
在实施例中，在患有CLL或SLL的受试者中对CAR疗法具有有效性的值包括以下参数中的一、二、三种或全部的测量值：
(i)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中编码BTK的基因的突变；
(ii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中编码PLCg2的基因的突变；
(iii)例如如通过CD8、CD4、CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD43、CD79b、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、Tim-3、和/或CD81的水平和/或活性评估的微小残留病；或如通过免疫球蛋白深度测序评估；在样品中(例如来自受试者的单采样品或肿瘤样品)；或
(iv)样品(例如来自受试者的单采样品)中选自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部的细胞因子的水平或活性。
在实施例中，在患有DLBCL(例如复发性和/或难治性DLBCL)的受试者中对CAR疗法具有有效性的值包括以下参数中的一种或两种的测量值：
(i)例如如通过CD8、CD4、CAR19、CD3、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、和/或Tim-3的水平和/或活性评估的微小残留病；或如通过免疫球蛋白深度测序评估；在样品中(例如来自受试者的单采样品或肿瘤样品)；或
(ii)样品(例如来自受试者的单采样品)中选自IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1a的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或全部的细胞因子的水平或活性。
在其他实施例中，对CAR疗法具有有效性的值进一步包括以下参数中的一、二、三、四、五、六或更多种(全部)的测量值：
(i)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中，静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞(例如初始T细胞(例如初始CD4或CD8 T细胞、初始γ/δT细胞))、或干细胞记忆T细胞(例如干细胞记忆CD4或CD8 T细胞、或干细胞记忆γ/δT细胞)、或早期记忆T细胞中的一、二、三种或更多种(全部)、或其组合的水平或活性；
(ii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)、或晚期记忆T细胞中的一、二、三种、或更多种(例如全部)、或其组合的水平或活性；
(iii)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中免疫细胞耗竭标志物，例如免疫检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3)中的一、二、或更多种的水平或活性。在一些实施例中，免疫细胞具有耗竭表型，例如共表达至少两种耗竭标志物，如共表达PD-1和TIM-3。在其他实施例中，免疫细胞具有耗竭表型，例如共表达至少两种耗竭标志物，如共表达PD-1和LAG-3；
(iv)样品(例如单采样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中CD27和/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞，例如CD4+活CD8+ T细胞群体中的水平或活性；
(v)选自CCL20、IL-17a、IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1的生物标志物中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一种或全部的水平或活性；
(vi)表达CAR的细胞产物样品，例如表达CLL-1的细胞产物样品中的细胞因子水平或活性(例如细胞因子谱系的质量)；或
(vii)制造的表达CAR的细胞产物样品中表达CAR的细胞的转导效率。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，表达CAR的细胞疗法包括多个(例如，一个群体)表达CAR的免疫效应细胞，例如多个(例如，一个群体)T细胞或NK细胞或其组合。在一些实施例中，表达CAR的细胞疗法是CD19 CAR疗法。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值从得自受试者的单采样品获得。可以在输注或再输注之前评估单采样品。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值从得自受试者的肿瘤样品获得。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值获得自制造得表达CAR的细胞产物样品(例如CD19CAR-表达细胞产物样品)。可以在输注或再输注之前评估制造的表达CAR的细胞产物。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受表达CAR的细胞疗法之前、期间或之后评估受试者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，本文披露的参数中的一种或多种的测量值评估基因表达、流式细胞术或蛋白质表达中的一种或多种的特征。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括基于本文披露的参数中的一种或多种的测量值，将受试者鉴定为反应者、无反应者、复发者或无复发者。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者CD8+ T细胞的百分比)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的(例如，统计学上显著更高的)CD8+ T细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者数量的CD27+CD45RO-免疫效应细胞)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的CD27+CD45RO-免疫效应细胞(例如在CD8+群体中)百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者CD4+ T细胞的百分比)相比，反应者(例如完全反应者或部分反应者)具有或被鉴定为具有更高的(例如统计学上显著更高的)CD4+ T细胞百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如无反应者数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞、或早期记忆T细胞)相比，反应者(例如完全反应者)具有或被鉴定为具有更高的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、较年轻的T细胞、或早期记忆T细胞中的一、二、三种或更多种(例如全部)或其组合的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如反应者数量的活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的活化TEFF细胞、活化TREG细胞、较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞中一、二、三种或更多种(例如全部)、或其组合的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高免疫细胞耗竭标志物(例如一、二、或更多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT和/或LAG-3))的百分比。在一些实施例中，与来自反应者的表达PD-1或LAG-3的免疫效应细胞的百分比相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的表达PD-1、PD-L1、或LAG-3的免疫效应细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)(例如表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+ T细胞)的百分比。
在一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如共表达至少两种耗竭标志物(例如共表达PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫细胞)的百分比。在其他实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如共表达至少两种耗竭标志物(例如共表达PD-1和LAG-3)的免疫细胞)的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群体(例如CLL-1CAR+细胞群体)中，与表达CAR的细胞疗法的反应者(例如完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。
在本文披露的任何方法的一些实施例中，反应者(例如，完全或部分反应者)具有以下特征中的一、二、三或更多种(或全部)：
(i)与参考值(例如无反应者数量的CD27+免疫效应细胞)相比，具有更多数量的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值(例如无反应者数量的CD8+ T细胞)相比，具有更多数量的CD8+ T细胞；
(iii)与参考值(例如无反应者数量的表达一种或多种检查点抑制剂的细胞)相比，具有更少数量的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、或KLRG-1、或其组合的检查点抑制剂)的免疫细胞；或
(iv)与参考值(例如无反应者数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞、或早期记忆T细胞的)相比，具有更多数量的静息TEFF细胞、静息TREG细胞、初始CD4细胞、未刺激的记忆细胞、或早期记忆T细胞中的一、二、三、四种或更多种(全部)、或其组合。
在实施例中，受试者是可以根据临床标准进一步评估由本文的方法鉴定的反应者、无反应者、复发者或无复发者。例如，完全应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的完全应答，例如完全缓解。例如，使用NCCN指南(NCCN
Figure BDA0003867148300003581
)、或如在Hallek M等人,Blood[血液](2018)131:2745-2760“iwCLLguidelines for diagnosis,indications for treatment,response assessment,andsupportive management of CLL[针对诊断、治疗适应症、应答评估和CLL的支持性管理的iwCLL指南],”中披露的国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(International Workshop onChronic Lymphocytic Leukemia(iwCLL))2018指南可以鉴定完全应答，将其完整内容通过引用以其全文特此并入。部分应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的部分应答，例如部分缓解。例如使用如本文所述的NCCN指南(NCCN
Figure BDA0003867148300003582
)或iwCLL 2018标准可以鉴定部分应答。无应答者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者未表现出对治疗的反应，例如患者病情稳定或疾病进展。例如使用如本文所述的NCCN指南(NCCN
Figure BDA0003867148300003583
)或iwCLL 2018标准可以鉴定无反应者。
可替代地，或与本文披露的方法组合，响应于所述值，执行以下一者、二者、三者或更多者：
例如向反应者或无复发者施用表达CAR的细胞疗法；
施用改变剂量的表达CAR的细胞疗法；
改变表达CAR的细胞疗法的排程或时程；
例如，将另外的药剂与表达CAR的细胞疗法(例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用于无反应者或部分反应者；
在用表达CAR的细胞疗法治疗之前，将增加受试者中的较年轻的T细胞的数量的疗法施用于无反应者或部分反应者；
修改表达CAR的细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如针对被鉴定为无反应者或部分反应者的受试者而言，增加转导效率；
例如针对无反应者或部分反应者或复发者，施用替代疗法；或
如果受试者为或被鉴定为无反应者或复发者，则例如通过CD25耗减、施用环磷酰胺、抗GITR抗体中的一者或多者或它们的组合来减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
实例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
实例1：具有细胞因子刺激的CART的生成
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“细胞因子过程”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)接种在培养基(例如含血清的培养基，例如含有2％血清的培养基)中。将一种或多种细胞因子(例如选自IL-2、IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、或IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)的一种或多种细胞因子)以及编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中。孵育20-24小时后，将细胞进行洗涤、配制、和冷冻保存。示例性细胞因子过程显示在图1A中。
与传统的CART制造过程相比，该修订过程消除了CD3/CD28刺激以及离体T细胞扩增。不希望受理论束缚，抗CD3/抗CD28珠驱动分化成中枢记忆细胞；并相反，细胞因子(例如IL-15、IL-21、和IL-7)可以帮助保留转导的CD3+ T细胞的未分化表型。因此，与使用传统方法产生的CART细胞相比，不涉及CD3/CD28活化的细胞因子可以产生具有更高初始/干细胞T细胞百分比的CART细胞。
方法
在收集后24小时内获得单采，纯化T细胞并通过流式细胞术评估获得的T细胞纯度。将T细胞冷冻并置于液氮中直至需要使用。
替代性地，使用
Figure BDA0003867148300003601
仪制备冷冻保存的单采样品并富集CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
按所需的最终浓度的1,000倍制备IL-7和IL-15。通过在培养基中稀释10倍来制备IL-2。
表19：细胞因子条件
条件
1. IL2
2. IL-7
3. IL-15
4. IL2+IL7
5. IL-7+IL-15
6. IL2+IL-15
7. 珠+IL2
8. 珠+IL15
在扩珠刺激的条件下，进行计算来铺板细胞，其中珠与细胞的最终浓度比率为3:1。使用
Figure BDA0003867148300003602
将
Figure BDA0003867148300003603
磁珠洗涤两次，并重悬浮于用于实验的所需体积的培养基中。将经洗涤的珠添加至含有特定细胞因子和细胞的管中。
在铺板时，将细胞用具有感染复数(MOI)为1的慢病毒载体转导。基于所使用的载体批次的感染复数(MOI)和浓度(滴度)计算有待转导的载体的比容。基于原代T细胞系测量滴度和MOI。
在仅使用细胞因子进行刺激的条件下，将细胞在洗涤后按1E7/ml的浓度重悬浮，并根据条件添加至已经包含细胞因子的锥形管中(表19)。添加细胞和细胞因子后，添加慢病毒载体，随后添加培养基。
在所有的条件下，将细胞混合，并将1ml铺板于24孔板的14个孔中。将细胞置于在37℃和5％CO2下的培养箱中。
在第二天收获细胞，记录这些细胞的浓度和活力。使用细胞毒性和增殖(EDU)掺入测定法测量它们的功能。这些细胞被称为“第1天CART”。
将细胞针对T细胞分化状态进行免疫表型化，并使用流式细胞术评估CAR的转导。将细胞洗涤，添加活力染料，随后添加抗体混合物(表20)，并将板在室温下孵育20分钟。孵育后，在BD fortessa上进行分析之前，将细胞洗涤两次并固定。
表20：将抗体组的抗原用于确定T细胞的分化状态
抗原
活力
CD3
CD4
CD8
HLADR
CD28
CD45RO
CD95
CCR7
抗独特型
为确定第1天CART是否仍保持扩增收获后的能力，在T25烧瓶中使用CD3/CD28珠，按3:1的比率(珠与细胞)扩增5e6个细胞/条件。如先前所述洗涤
Figure BDA0003867148300003611
磁珠。该培养基不包含细胞因子。将细胞置于在37℃和5％CO2下的培养箱中。
在每2天用CD3/CD28珠扩增T细胞的情况下，对细胞计数，并在培养基中溢出长达10天。在第10天，收获细胞，计数，使用分化组免疫表型化(表20)并在Cryostor 10TM中冷冻。将这些细胞解冻用于功能性测定，包括细胞毒性测定、增殖测定和细胞因子分泌测定。
在存在CD3/CD28珠的情况下，将体外扩增10天的细胞称为“第10天CART”。
结果
当纯化的T细胞与细胞因子在不存在任何其他的活化刺激的情况下一起孵育时，从第1天至第4天转导增加(图1B)。独立于时间点和细胞因子条件，CAR阳性群体中的主要群体是初始的(图1D、1E、和1F)。消除活化剂导致原始群体的转导增强。值得注意的是，暴露于IL-2或IL-15在体外维持自我更新的T细胞(图1G)。在其他测试的细胞因子(IL-7；IL2+IL7；IL-7+IL-15；和IL2+IL-15)治疗下观察到类似的现象(数据未显示)。细胞因子过程(在该特定实例中使用IL2或IL-15)维持或略微增加CD45RO-CCR7+细胞的百分比(图1G)。对于IL-2、IL-15以及IL-7和IL-15的组合，类似的数据显示在图1H和1I中。用指定的细胞因子将T细胞培养24小时，维持CD3+ T细胞的初始表型，并降低中枢记忆T细胞的百分比(图1H和1I)。
为确保在24小时内观察到的转导稳定，将24小时内产生的CART洗涤以去除任何残留的病毒，并使用CD3/D28扩增珠在10天内扩增。扩增的细胞显示出与第1天CART几乎相当的转导，表明转导是稳定的(图2A)。
使用细胞毒性、细胞因子释放、和增殖测定来测试第1天CART和第10天CART的功能性。靶细胞是Nalm6细胞，表达CD19的B细胞ALL细胞系。细胞毒性测定表明，如与第10天CART相比，扩增后第1天CART在杀伤方面是相当的(图2B)，尽管第1天CART具有更少的转导细胞。针对IFN-γ分泌，比较已经扩增的相同的第1天CART，并且发现如与第10天CART相比，发现具有IFN-γ的更少的分泌(图2C)，这可能是由于经转导的细胞的数量的差异。在单独的研究(其中第1天CART具有更高水平的转导)中，它们分泌更高水平的IFN-γ(数据未显示)。此外，来自除了仅IL7条件之外的全部治疗条件的第1天CART显示出相比第10天CART的相似或更高的增殖(图2D)。图2D中所示的数据未针对转导水平进行标准化。
尽管在第10天CART中观察到稳定的转导，但效率始终较低。在四种细胞因子条件下测试慢病毒载体的增加的感染复数(MOI)的滴定，并且在所有经测试的条件下观察到与转导的线性关系(图3A)。
此外，比较不同的培养基组合物(主要是血清浓度从5％降低至2％至无血清)以确定它们是否影响转导效率。血清减少至2％人血清导致最高的转导效率(图3B)。单独添加Glutamax也被认为对转导效率具有显著影响。
接下来，使用小鼠ALL模型检查第1天CART和第10天CART的体内抗肿瘤活性。简言之，如上所述制造第1天CART和第10天CART，其中活力高于80％(图4A和4B)。在携带肿瘤的小鼠中施用CART，并监测体内扩增。如图4C所示，第1天CART显示出比第10天对应物更高水平的体内扩增。特别地，在存在IL-2的情况下制造的CART显示出体内扩增的最高水平(图4C)。所有经测试的CART抑制体内的肿瘤生长，尽管与如第10天CART相比，第1天CART显示出延迟的动力学(图4D)。在该特定供体中，IL2条件证明了体内消除肿瘤的最大能力(图4D)。
此外，还测试了该制造过程是否可量化。在存在IL2或hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)的情况下，富集后在24孔板或PL30袋中用CAR19转导来自冷冻的单采样品的T细胞。hetIL-15已经被描述于WO2014/066527中，将其通过引用以其全文并入本文，并包含与人IL-15Ra的可溶形式复合的人IL-15。24小时后收获细胞并测试CAR的表达。如图5B所示，在存在IL2或hetIL-15的情况下，当将该过程在24孔板和PL30袋之间缩放时，观察到对转导无影响。
实例2：具有TCR刺激的CART的生成
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“活化过程”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)接种在包含IL-2的培养基(例如无血清培养基，例如OpTmizerTM培养基)中(例如含有OpTmizerTM补充剂、GlutaMAX和100IU/ml的IL-2的OpTmizerTM培养基)，置于细胞培养装置中，并与抗CD3/抗CD28(例如TransAct)接触。12小时后，将编码CAR的载体(例如慢病毒载体)添加至细胞中，并且将这些细胞放回到培养箱中。在开始细胞培养24小时后，收获细胞，取样并配制。不希望受理论束缚，例如使用抗CD3/抗CD28(例如TransAct)，简短的CD3和CD28活化促进自我更新T细胞的有效转导。
在该实例和其他实例中，将被称为“传统制造(TM)”的CART制造过程用作对照。在一些实施例中，T细胞选自新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品(例如使用阳性或阴性选择)，活化(例如使用抗CD3/抗CD28抗体包被的
Figure BDA0003867148300003641
)，与编码CAR分子的核酸分子接触(例如用包含编码CAR分子的核酸分子的慢病毒载体转导)，并在体外扩增例如7、8、9、10、或11天。在该实例中提供了示例性TM过程，作为用于从d9对照组制造CAR细胞的方法。
方法
在一些实施例中，在此提供的活化过程以冷冻的或新鲜的白细胞单采产物开始。在获得用于计数和QC的样品之后，将产品与细胞分选机(例如，安装的
Figure BDA0003867148300003642
装置试剂盒)附接并且开始程序。将细胞洗涤并与所希望的表面标志物或标志物(例如CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22、和/或CD56)结合的微珠孵育。通过使细胞通过磁柱来选择珠标记的细胞。如果希望，可以通过将阴性部分与结合第二组表面标志物(例如CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22、和/或CD56)的珠孵育来进一步分离细胞，并再次使细胞通过磁分离柱。将分离的细胞再次洗涤，并将分离缓冲液交换为细胞培养基。然后将纯化的细胞进行培养或冷冻保存以备后用。可以将冷冻保存的细胞解冻，在预热的细胞培养基中洗涤，并重悬浮于细胞培养基中。可以直接将新鲜的细胞添加至培养物中。将细胞按0.4-1.2e6个细胞/cm2的膜接种到膜生物反应器中，添加活化试剂，例如抗CD3/抗CD28珠/聚合物，纳米颗粒或纳米胶体(和/或单独的或组合的以下任何共活化剂：刺激ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、或CD226的试剂)，并将细胞培养基添加至最终体积为0.25-2ml/cm2的膜中。将编码CAR的载体(例如慢病毒载体)立即添加或在培养开始后18小时添加。在培养开始后，将细胞与上述载体和活化试剂一起孵育总共24小时。一旦培养已经进行了24小时，通过旋转或移液或以其他方式搅动将细胞重悬浮，并用适当的缓冲液溶解模拟试剂支架。洗涤细胞以去除不需要的试剂，并在冷冻保存培养基中重新配制。将细胞冷冻保存直至需要进行施用。
对于与图6A-6C相关的研究，使用以下方案。
使用自动化的淋巴分离液(ficoll)(Sepax 2，百思福生物公司(BioSafe))，从新鲜1/4的leukopack中纯化细胞以产生外周血单核细胞(PBMC)。使用免疫磁性阴性选择(泛T阴性选择试剂盒，美天旎公司)进一步纯化这些PBMC，以产生高纯度(98％-100％)的CD3 T细胞。将这些细胞与OpTmizerTM(赛默公司(Thermo))完全培养基(按每个包装插入物配制并补充有100IU/ml的IL-2(阿地白介素，普罗米修斯公司(Prometheus)))置于培养基中，并且在膜生物反应器中抗CD3/CD28活化试剂呈推荐的剂量(TransAct，美天旎公司)。然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育12小时以进行活化。从培养箱中取出细胞，并以2.5tu/细胞的感染复数(MOI)将新鲜解冻的慢病毒载体添加到培养物中。将细胞返回培养箱中用于另外转导12小时。收获细胞，用培养基洗涤两次，并直接配制到无菌PBS(英杰公司(Invitrogen))中，并通过尾静脉注射到NSG小鼠中。使用补充有10％胎牛血清(Seradigm公司)(完全培养基，又称为“R10”)和抗CD3/28Expander
Figure BDA0003867148300003651
(赛默公司(Thermo))按3个珠/T细胞的RPMI培养基(赛默公司)，使来自d9对照组的细胞在烧瓶(T25-T225，康宁公司(Corning))中生长。然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育24小时以进行活化。从培养箱中取出细胞，并以2.5tu/细胞的MOI将新鲜解冻的慢病毒载体添加到培养物中。将细胞放回培养箱中再培养7天，每2天分裂一次以维持5e5个细胞/ml的浓度。将扩增的细胞转移到50ml离心管(康宁公司(Corning))中，并使用静置磁体(Dynamag-50，赛默公司)进行两轮珠去除。然后用培养基将去珠后的细胞洗涤两次，并配制成CryoStor10冷冻培养基(干细胞技术公司(STEMCELLTechnologies))，使用冷冻细胞装置(CoolCell device)(百思顺生物公司(BioCision))冷冻保存，并在气相液氮中保持最少48小时。将细胞解冻成预热的R10培养基，用培养基洗涤两次，然后配制到无菌PBS(英杰公司)中，并通过尾静脉注射到NSG小鼠中。
在没有预处理的情况下，在CART注射前4天，按1e6个细胞/小鼠向6-8周龄NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl，杰克逊实验室(Jackson Labs))注射荧光化的NALM6肿瘤细胞(ATCC CRL-3273，ATCC)。按2e6、5e5、或2e5个CAR+细胞/NSG或匹配剂量的未转导的扩增T细胞或PBS媒介物对照注射PBS配制的CART细胞。通过每周抽血，双周荧光素酶成像(Xenogen IVIS，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))和每两周体重测量来监测小鼠。监测所有动物的毒性迹象(体重减轻，垂死)并且如果有症状则实施安乐死。在研究终止时(第5周)对所有存活的小鼠实施安乐死，并获得末梢血液、骨髓和脾脏样品。根据IACUC和所有其他适用的指南进行研究。
结果
使用上述活化过程产生CART细胞，并在小鼠ALL模型中表征它们的体内的抗肿瘤活性。如图6A-6C所示，使用活化过程制造的CART细胞在体内显示出强的抗肿瘤活性。
实例3：IL6R在T细胞上的表达和细胞因子对T细胞扩增的影响
材料和方法
T细胞培养
将先前冷冻的T细胞解冻，并在存在第0天在指定的细胞因子的情况下与αCD3/αCD28 dynal珠接触(细胞与珠的比率为1比3)。自第3天，在第3、5、6、9、12、15、和18天，将T细胞生长培养基(RPMI1640、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM Hepes、55μMβ-巯基乙醇、10％FBS、和100U/ml的青霉素-链霉素)多于两次添加至具有指定的细胞因子(不含细胞因子、rhIL2(50IU/ml，诺华公司(Novartis))、IL6(10ng/ml、R&D系统)、IL7(10ng/ml、派普泰克公司(Peprotech))、IL15(10ng/ml，派普泰克公司)、和IL21(10ng/ml，派普泰克公司))的板中。将未用细胞因子，IL6或IL21处理的细胞培养直至第18天，并将用IL2、IL7或IL15处理的细胞培养直至第25天。
Cell表面染色
在指定的时间点处收获细胞，并然后用活/死染料(eFluro780，eBioscience公司)、CD3(生物传奇公司(BioLegend)，克隆号：OKT3)、CD4(生物传奇公司，克隆号：OKT4)、CD8(BD生物科学公司(BD Bioscience)，克隆号：RPA-T8)、CD45RO(生物传奇公司，克隆号：UCHL1)、CCR7(生物传奇公司，克隆号：G043H7)、CD27(BD Horizon公司，克隆号：L128)、CD127(生物传奇公司，克隆号：A019D5)、CD57(生物传奇公司，克隆号：HCD57)、CD126(生物传奇公司，克隆号：UV4)、和CD130(R&D系统公司，克隆号：28126)抗体染色。通过FACSFortessa获得细胞，并然后使用FlowJo程序进行数据分析。
细胞内细胞因子染色
为检验产生细胞因子的细胞的百分比，在第25天，收获T细胞，并然后在存在布雷菲德菌素A(生物传奇公司)的情况下在37℃下在培养箱中用PMA(50ng/ml，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和离子霉素(1μM，西格玛-奥德里奇公司)短暂活化4小时。然后用活/死染料(eFluro780，eBioscience公司)、CD3(生物传奇公司，克隆号：OKT3)、CD4(生物传奇公司，克隆号：OKT4)、CD8(BD生物科学公司(BD Bioscience)，克隆号：RPA-T8)抗体对T细胞染色，随后固定并透化。然后，用针对IFN-γ(生物传奇公司，克隆号：4S.B3)、IL-2(生物传奇公司，MQ1-17H12)、和TNF-a(生物传奇公司，Mab11)的抗体对T细胞进一步染色。通过FACS Fortessa获得细胞，并然后使用FlowJo程序进行数据分析。
结果
IL6Rα和/或IL6Rβ表达细胞富集在CD4和CD8 T细胞二者的分化程度较低的T细胞亚群中。如图7A和7B所示，与相应的记忆T细胞相比，初始CD4和CD8 T细胞表达更高水平的IL6Rα和IL6Rβ。表达IL6Rα和IL6Rβ二者的T细胞主要是CD45RA+CD45RO-CD27+CD28+细胞(图8A和8B)。在TCR刺激后，IL6Rα而非IL6Rβ表达被下调(图11)。
接下来，比较不同细胞因子对T细胞扩增的影响。在所测试的细胞因子中，IL15、IL2、和IL7增强T细胞扩增，其中IL15显示出最大的增强(图12)。细胞因子治疗不影响细胞大小(图13A)或活力(图13B)。IL15治疗还增强表达IL6Rβ的细胞的扩增(图14)。表达IL6Rβ的细胞在TCR结合后第15天主要在CD4和CD8二者的CD27+(图16)或CD57-(图17)T细胞亚群中，并在TCR活化后在第25天产生IL2、IFNγ、和TNFα细胞因子(图18)。
实例4：具有TCR刺激的CART用于临床前研究的生成
用于临床前研究的第0天的单元操作开始于第0天使用的以下培养基的制造：快速缓冲液(Rapid Buffer)和快速培养基(表21)。快速缓冲液(RB)包含具有0.5％HSA的
Figure BDA0003867148300003682
缓冲液(美天旎公司)。快速培养基(表21)在制造的第0天配制，并且基础培养基包含现成的培养基(称为OpTmizerTM)，该培养基具有Glutamax、IL-2、CTSTM补充物、和ICSR。
Figure BDA0003867148300003683
仪在第0天启动用于使用。
表21：CART制造过程中的培养基类型和使用点
Figure BDA0003867148300003681
Figure BDA0003867148300003691
当
Figure BDA0003867148300003692
仪在第0天启动时，将健康供体的白细胞单采材料解冻，并且将单采材料合并到600-mL转移袋中，随后可接合到
Figure BDA0003867148300003693
上。从600mL转移袋中提取IPC样品，并通过NC200测量以获得活细胞计数和起始单采材料的活力百分比。在完成
Figure BDA0003867148300003694
的启动后，将单采材料转移至应用袋中。在启动TCT程序后，在单采进入
Figure BDA0003867148300003695
仪后，程序运行3小时45分钟至4小时15分钟，具体取决于进行的阳性选择分离的数量。在第0天，TCT程序用快速缓冲液冲洗森切卡特公司(Centricult)的DMSO，进行血小板洗涤，体积减少，将单采与森切卡特公司的CD4和CD8微珠孵育，并然后通过阳性选择，使用
Figure BDA0003867148300003696
上的磁体，用微珠选择T细胞。用CD4和CD8试剂选择的T细胞用快速培养基洗脱到再应用袋中。从再应用袋中取出过程控制(IPC)样品，以确定可用于在培养容器(G-Rex500MCS)中接种的总活细胞数。
首先用快速培养基启动G-Rex培养装置，并然后将来自再应用袋的靶细胞体积添加到培养容器中。然后将活化试剂(TransACT)添加至培养容器中。在引入TransACT后，然后将慢病毒载体添加至培养容器中，并使用MOI为1.0进行载体添加。然后用快速培养基冲洗G-Rex500MCS培养容器至最终的培养基体积为250mL加上载体添加量的体积。然后将G-Rex培养容器置于培养箱中以使培养物孵育目标范围为20-28小时的24小时。
在目标孵育24小时后，将CART培养物从培养箱中取出，并在收获洗涤之前提取样品以获得活细胞计数和细胞培养物的活力。在收获前取出的样品是IPC，并被用作进入LOVO洗涤装置中的输入，以确定细胞进入旋转过滤膜的流速。LOVO使用活的WBC浓度作为IPC。用于CART制造过程的程序被描述为用一种溶液洗涤4次并使用收获缓冲液(PBS+2.0％HSA)。在LOVO洗涤期间，将IPC袋用于减少体积并用收获缓冲液洗涤细胞，最后将其洗脱到输出袋中。然后对来自LOVO洗涤液的输出袋取样以获得活细胞计数和活力，以便用sanisure瓶进行手动离心，并用冷冻缓冲液进行最终配制的最终步骤。
实例5：使用活化快速制造(ARM)过程的BCMA CART的生成
概述
该实例描述了CART制造过程(称为“活化快速制造(ARM)”)。在一些实施例中，将细胞(例如T细胞)在含有培养基(例如无血清培养基，例如OpTmizerTM培养基)、重组人IL-2(例如含有OpTmizerTM补充物、GlutaMAX和100IU/ml的IL-2的OpTmizerTM培养基)、抗CD3/抗CD28(例如TransAct)和编码BCMA CAR的载体(例如慢病毒载体)的细胞培养装置中培养。24小时后，将细胞(被称为“第1天CART产物”)收获、取样、并配制。不希望受理论束缚，例如使用抗CD3/抗CD28(例如TransAct)，简短的CD3和CD28活化促进自我更新T细胞的有效转导。在一些情况下，在培养后48小时、72小时和96小时或7天收获一些细胞用于测量体外BCMACAR表达动力学。第1天CART应答包括但不限于，体内细胞溶解活性和扩增。
使用ARM过程的第1天BCMA CART的生成
在一些实施例中，在此提供的活化过程以冷冻的或新鲜的白细胞单采产物开始。在获得用于计数和QC的样品之后，将产品与细胞分选机(例如，安装的
Figure BDA0003867148300003701
装置试剂盒)附接并且开始程序。将细胞洗涤并与微珠一起孵育，这些微珠结合所希望的表面标志物(例如CD4和CD8)。通过使细胞通过磁柱来选择珠标记的细胞。将分离的细胞再次洗涤，并将分离缓冲液交换为细胞培养基。然后将纯化的T细胞进行培养或冷冻保存以备后用。通过流式细胞术评估，分离的T细胞的纯度将通过QC步骤。可以将冷冻保存的细胞解冻，在预热的细胞培养基中洗涤，并重悬浮于细胞培养基中。可以直接将新鲜的细胞添加至培养物中。将细胞按0.4-1.2e6个细胞/cm2的膜接种到膜生物反应器上，添加活化试剂(例如抗CD3/抗CD28珠/聚合物、纳米颗粒、或纳米胶体)，并且将细胞培养基添加至最终体积为0.25-2ml/cm2的膜中。在铺板时，按不同的感染复数(MOI)将细胞用编码BCMA CAR的慢病毒载体转导。基于细胞系(例如SupT1)测量滴度和MOI。在24小时，在染色之前将细胞洗涤以去除不需要的试剂，从而通过流式细胞术测量CAR表达并在冷冻保存培养基中重新配制为用于体内研究的“第1天CART产物”。
在该实施例中描述了使用ARM过程制造的表达BCMA CAR R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、或Hy03的T细胞的产生和表征。R1B6、R1F2、和R1G5的序列披露于表3-6中。PI61、B61-02、和B61-10的序列披露于表7-11中。Hy03的序列披露于表12-15中。
在使用编码BCMA CAR的慢病毒载体按MOI为2.5转导T细胞后24小时，使用rBCMA_Fc通过流式细胞术测量CAR的表达。如图19A所示，观察到活的CD3+ T细胞的整个群体以不同程度向右移动。转导以表达R1G5、R1B6或PI61的细胞显示出最高的CAR表达(图19A)。如通过流式细胞术测量的表达模式不同于转导表达CAR的细胞的典型流式细胞术直方图，其中CAR阳性群体与阴性群体明显分离。图19A表明通过rBCMA_Fc检测到可能存在“假转导或瞬时表达”，并不总是表示真实的基因表达。先前已经报道，在载体添加开始时观察到慢病毒假转导，并且在CD34+细胞中持续长达24小时，并且在293细胞中持续长达72小时(Haas DL,等人Mol Ther.[分子疗法]2000.291:71-80)。整合酶缺陷型慢病毒载体在CD34+细胞中引起瞬时eGFP表达持续长达10天，并且在293细胞中持续长达14天。尽管在T细胞中尚未广泛研究慢病毒假转导，但不能排除在如此短的时间内瞬时表达的这种可能性。因此，进行体外动力学研究以测量使用如下指定的ARM制造的细胞的CAR表达。
使用ARM过程制造的细胞的体外CAR表达动力学研究
在此描述的研究检验了使用ARM过程制造的细胞如何随时间表达CAR分子。简言之，使用ARM过程按MOI为1，制造来自健康供体的T细胞以表达BCMA CAR，并且在培养基中保持不同的时间段，并且通过流式细胞术，使用AF647标记的rBCMA_Fc，在24小时、48小时、72小时、96小时和第7天收获用于评估CAR表达动力学。了解CAR表达动力学有助于发现用于体内分类或临床给药策略的真实和稳定表达的替代时间点。
在第1天，按MOI为1转导的细胞的CAR表达模式(图20A)类似于按MOI为2.5转导的细胞的CAR表达模式(图19A)。两种MOI条件显示出在第1天假表达模式或瞬时表达模式(图19A和20A)。然而，在第2天，rBCMA_Fc阳性群体开始与UTD阴性对照组分离(图20A)。在第3和4天，代表表达BCMA CAR的细胞并且在UTD组中缺失的rBCMA_Fc阳性群体清楚地显示在转导细胞以表达BCMA CAR的所有组中。从第3天至第4天，CAR+％对于每种CAR构建体是相对稳定的(图20B)，其中在第3天观察到最高的MFI(图20C)(细胞在该时间点处是最大的)。与图19A中所示的数据一致，被转导以表达PI61、R1G5和R1B6的细胞是最高的CAR表达者(图20A)。值得注意的是，用编码R1F2或Hy03的载体转导的细胞在第1天未显示瞬时CAR表达，但在第3天和第4天后明显表达BCMA CAR分子(图20A)。总之，编码不同CAR的载体可能随时间具有不同的CAR表达动力学，并且选择第3天作为CAR表达的替代时间点。
评估第1天ARM加工的BCMA CART的体内功能性
使用散播的KMS-11-luc多发性骨髓瘤异种移植小鼠模型检验第1天CART在体内的抗肿瘤活性。荧光素酶报告基因允许通过定量生物发光成像(BLI)监测疾病负担。简言而之，在携带肿瘤的小鼠中施用如上所述制造的第1天CART。在第一次体内研究中(图21A和21B)，每只小鼠接受按1.5E6个细胞剂量的最终CART产物。在第1天和第7天分析CAR表达(图21A)。在体内功效研究中，表达PI61、R1G5或R1B6的细胞显示出有效的抗肿瘤活性(图21B)。表达R1F2的细胞显示出延迟的功效(图21B)。在CART注射后14天，UTD组也显示出部分抗肿瘤活性，这可能是由于同种异体反应(图21B)。第二个体内研究测试了CAR+T细胞的剂量调整。CAR+T细胞的剂量基于第3天的CAR+％(图22A)。通过BLI测量每周两次监测肿瘤摄入动力学。图22A显示在第1天和第3天检测的CAR表达。如图22B所示，体内结果表明在1.5e5个CAR+ T细胞和5e4个CAR+ T细胞的两种剂量下，所有三个克隆PI61、R1B6和R1G5都能够排斥和清除肿瘤。图22C显示了在该研究过程中体重变化，未显示GVHD的迹象。
实例6：在12-24小时之间收获的快速CART的动力学
介绍
为确定是否可以在不到24小时内产生快速CART产物，表征了培养12-24小时后用于产生快速CART的动力学。使用从冷冻保存的健康供体单采中富集的T细胞，并且在接种时同时添加TransAct活化试剂和技术级CTL019载体，按小规模进行该评估。初步读数是新鲜收获的CART产品的活力、扩增后活细胞回收、白细胞和T细胞亚群组成以及转导效率(如通过表面免疫表型分析测定)。
方法
慢病毒产生和滴度测定：用基于HEK293T的qPCR滴度为4.7×107TU/mL和基于近似的T细胞的滴度为1.88×107TU/mL制备编码CTL019的慢病毒载体。
T细胞分离：从Hemacare获得健康供体单采的冷冻保存的leukopak(LKPK)并储存在液氮中直至需要。在第0天，将单采解冻直至保留小的冰晶，然后用
Figure BDA0003867148300003731
加工的缓冲液稀释。然后在具有TS 520管组和T细胞转导(TCT)程序软件版本1.0的
Figure BDA0003867148300003732
上进行自动化的CD4/CD8阳性选择。将最终的
Figure BDA0003867148300003733
产物在OpTmizerTM完全T细胞培养基中洗脱，并且通过如由Cellometer Vision(Nexcelom公司)枚举的AO/PI染色测定细胞浓度和活力。
培养起始和转导：将来自
Figure BDA0003867148300003734
产物的细胞立即接种到总共七个容器中：用于转导培养物的五个容器和用于未转导(UTD)培养物的两个容器。在时间点0处，将每个容器按0.6×106个活细胞/cm2膜的密度接种，加上GMP级TransAct，并用含有IL-2的OpTmizerTM完全T细胞培养基达到终浓度为1.2×106个活细胞/mL。将载体在室温下解冻，并基于近似的T细胞滴度按MOI为0.45添加到每种转导的培养物中。UTD对照中没有添加病毒。一旦接种，将培养物在37℃和5％CO2下孵育直至准备收获。
收获：培养开始后，在12至24小时的每个时间点处选择一种转导的培养物用于收获。通过旋转容器收获细胞以将细胞轻轻地从膜上重悬，然后将完整的培养物体积重悬浮并通过血清学移液管转移至锥形管。取少量等分试样用于进行预洗涤计数、活力测定和流动染色。将每种培养物的剩余部分在50mL中洗涤两次(针对UTD容器，在100mL中洗涤两次)，重悬浮，并在洗涤后取等分试样以检查计数和活力。
CART制造过程中的白细胞组成的流式细胞术和CD19-CAR表达：在适用的情况下，对培养之前和之后的过程中针对白细胞组成、T细胞表型和CAR表达的对样品进行染色。使用常规有序的荧光团标记的抗独特型抗体(eBioscience公司)评估转导的T细胞上的CTL019-CAR表达。在每个收获的时间点处，立即用活力染料(生物传奇公司(Biolegend))对培养物的等分试样进行染色，洗涤，然后用含有CD3染色和抗独特型抗体的两个流动板染色，并固定在多聚甲醛中用于获取。在流式细胞仪(BD LSRFortessa；将单色对照用于补偿)上测量样品，并用FlowJo软件分析数据。为了分析，将针对白细胞组成染色的所有样品都在活的CD45+单重态事件上预先门控，并且将针对T细胞亚群染色的所有样品都在活CD3+单重态事件上预先门控。使用荧光减一(FMO)对照建立CD45RO和CCR7的门控。
结果
在第0天和每个收获时间点处，使用流式细胞术表征在培养前LKPK，
Figure BDA0003867148300003741
产物以及培养后的CART产物的白细胞组成。鉴定的细胞类型是T细胞(CD3+)、单核细胞(CD14+)、B细胞(CD19+)、天然杀伤(NK)细胞(CD3-56+)和其他细胞(表22)。
Figure BDA0003867148300003752
富集产生第0天高度存活的(92.9％)的起始材料，并且富集T细胞(从48％至92％)，同时减少污染B细胞(6％至0.10％)，并将单核细胞和NK细胞各自降至4％以下。培养12-24小时后，活细胞的纯度另外增加3％-4.4％，与12小时后单核细胞和B细胞的立即减少以及在12小时和24小时之间的NK细胞逐渐减少相对应。在通过流式细胞术表达细胞外CAR的白细胞中，少于3％的是污染的细胞(即，不是T细胞)，其中在接种后15和18小时之间发生CAR纯度的最大跳跃(96.6％至99.2％)。
表22：CART产物的总白细胞组成
Figure BDA0003867148300003751
在培养18小时后表达CAR的细胞的纯度增加(表22)与具有CAR表面表达的T细胞百分比的增加同时发生(图23A和23C)。如先前在培养24小时后通过流式细胞术评估的快速CART产物所观察到的(参见实例5)，CAR表面表达不会形成明显的阳性和阴性群体。因此，使用UTD样品作为下限建立了对CAR阳性的门控。表达细胞外CAR的CD3+细胞的比例在接种后15小时仍然低于1％；并然后CAR表达每3小时增加3％-4％，至最大为11.8％而没有饱和(图23A)。如通过MFI测定的CAR表达强度在培养中也略微增加>18小时，但在24小时内保持暗淡(图23B)。
使用CD4、CD8、CD45RO、和CCR7的组合，在每个时间点处还评估了T细胞亚群(CD4:CD8比率和记忆亚群组成)(图24A和24B)；其中未分化的初始样T细胞被定义为CCR7+CD45RO-；中枢记忆细胞被定义为CCR7+CD45RO+；效应记忆细胞被定义为CCR7-CD45RO+；并且高度分化的效应T细胞被定义为CCR7-CD45RO-。在评估的所有时间点(包括UTD)中，与初始起始材料(分别为23％和52％)相比，培养物含有较大比例的初始细胞(40％-47％)和较低比例的中枢记忆细胞(33％-39％)。有趣的是，尽管在总组成中初始或中枢记忆T细胞的频率在12至24小时之间没有变化，之后的收获与更高频率的细胞外表达CAR的初始细胞和更低频率的细胞外表达CAR的中枢记忆细胞相关(在18小时，表达CAR的细胞中16％初始/63％中枢记忆相比在24小时时，表达CAR的细胞中24％初始/54％中枢记忆)。类似地，当总CD4:CD8比率没有显著变化时，CAR+细胞的CD4部分在18-24小时之间下降了10％(66％至56％)。将这些频率转换为总细胞数(图25)显示，最早表达CAR的T细胞亚群大多是在培养15-18小时之间的初始CD4细胞；然后初始CD8 CAR和中枢记忆CD8 CAR频率迅速增加。
在每个收获时间点处测定活细胞回收率(或倍数扩增)以及洗涤前和洗涤后的活力(图26和27)。活细胞的回收率在接种后18小时降低13％(最低46％，与细胞外CAR表达的增加速率一致)，然后在之后的时间点处收获的培养物略微增加至52％(图26)。洗涤后产物活力增加至71％-77％，其中生活力在15-24小时之间降低(图27)。
结论
在12-24小时之间测试的时间点中，与TransAct和技术级CTL019载体同时接种的快速CART显示24小时处的最高CAR表面表达。极少数细胞是CAR+(如在收获时测量)直到接种后15小时，之后％CAR增加得更快。CAR表达的强度是暗淡的，但在接种后18小时后缓慢增加。
由于前12小时内单核细胞损失，在接种后快速CART产品在12至24小时内的所有点处都变得比起始材料更纯(更高％T细胞)，随后NK细胞轻微损失并且通过
Figure BDA0003867148300003771
富集去除任何残留B细胞。
尽管在接种后18小时收获时总细胞回收率最低(24小时略微改善)，但整个T细胞组成在接种后12和24小时之间没有变化。首先表达细胞外CAR的T细胞在接种后15和18小时之间主要是中枢记忆CD4，然后初始和中枢记忆CD8显示CAR表达。
实例7：活化的快速制造(ARM)过程的说明
在一些实施例中，使用连续活化快速制造(ARM)过程超过近似2天制造CART细胞，这将潜在地允许更多数量的较低分化的T细胞(T初始和TSCM(干细胞中枢记忆T)细胞)返回患者用于进行体内细胞扩增。较短的制造时间允许早期分化的T细胞特征在体内增殖以达到其所希望的末端分化状态，而不是在离体培养容器中。
在一些实施例中，使用冷冻保存的白细胞单采来源材料(例如非动员的自体外周血白细胞单采(LKPK)材料)制造CART细胞。冷冻保存的来源材料通过抗CD4/抗CD8免疫磁系统在生产的第一天(第0天)经历T细胞富集的加工步骤。然后将阳性部分接种在G-rex培养容器中，用抗CD3/CD28系统(TransACT)活化，并在同一天用编码CAR的慢病毒载体(LV)转导。在第二天，在转导20-28小时后，收获T细胞，洗涤四次，在冷冻培养基中配制，并然后通过控速冷冻仪(Controlled Rate Freezer(CRF))冷冻。从第0天的过程开始到第二天收获开始，在第0天接种后用目标为24小时将细胞培养20-28小时。
根据表21制备第0天的培养基。将冷冻保存的白细胞单采材料解冻。用快速缓冲液(表21)稀释解冻细胞，并在
Figure BDA0003867148300003772
装置上洗涤。通过
Figure BDA0003867148300003773
CD4和CD8微珠选择T细胞。一旦程序完成T细胞选择(大约3小时40分钟至4小时40分钟)，将包含悬浮在快速培养基中的细胞的再应用袋转移到转移包中(表21)。获取样品用于活力和细胞计数。将来自阳性部分袋的细胞计数和活力数据用于确定当接种培养容器用于活化和载体转导时的细胞浓度。
在通过
Figure BDA0003867148300003781
微珠(CD4和CD8)阳性选择T细胞后，将细胞接种在培养容器G-Rex中。一旦接种细胞，就将活化试剂(TransACT)添加至培养容器中。在目标MOI为1.0(0.8-1.2)时，然后用编码CAR的慢病毒载体转导细胞。载体添加后，将培养容器转移至培养箱中，在标称温度为37℃(操作范围36℃-38℃)，其中标称5％CO2(操作范围4.5％-5.5％)下降培养容器孵育目标为24小时(操作范围20-28小时)。孵育后，将细胞用收获洗涤溶液(表21)洗涤四次，以去除任何未整合的载体和残留的病毒颗粒，以及任何其他与过程相关的杂质。然后，将细胞洗脱下来，并且取出用于细胞计数和活力的样品用于测试，并且将结果用于确定重悬浮细胞用于与
Figure BDA0003867148300003782
CS10最终配制品中需要的体积。然后将细胞离心以去除收获洗涤溶液并进行冷冻保存。
在一些实施例中，在CART细胞中表达的CAR结合CD19。在一些实施例中，快速培养基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
在一些实施例中，在CART细胞中表达的CAR结合BCMA。在一些实施例中，快速培养基(RM)中使用的IL-2(表21)可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
实例8：使用活化快速制造(ARM)过程制造的CD19 CART细胞的表征
本文披露了使用活化快速制造(ARM)过程制造的抗CD19 CAR-T细胞产物。与传统制造(TM)过程相比，ARM过程缩短了周转时间，前瞻性地允许向患者及时输注抗CD19 CAR-T细胞产物。此外，ARM过程还保留了推定的干细胞记忆T(T干细胞)细胞(一种与改善的抗肿瘤功效相关的细胞亚群)。制造的主要区别在于TM过程包括扩增阶段，其中抗CD19 CAR T细胞在配制前与白介素(IL-)2在体外培养9天，该ARM过程仅允许24小时培养后配制。这可以通过使用与单克隆抗体(mAb)偶联的完全生物相容性纳米基质来实现，这些单克隆抗体具有针对CD3和CD28的激动剂活性(与TM过程中使用的CD3/CD28顺磁珠不同)可以在转导后立刻用残留的慢病毒载体洗掉。来自异种移植小鼠模型的结果，以及T干细胞的最终产物富集，与增加的持久性和长期抗肿瘤作用相关的亚群表明如与使用TM过程制造的抗CD19 CAR T细胞相比，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞的整体改善的治疗潜力。由异种移植小鼠模型揭示的另一个重要差异是与使用TM过程制造的对应物相比，使用ARM过程制造的抗CD19 CART细胞的潜在延迟细胞动力学扩增大约一周。这种延迟被估计为大约1周，这使得如使用TM过程制造的抗CD19 CAR T细胞，用于仔细监测3周的潜在毒性的窗口相应延长至4周。相反，来自体外细胞因子释放模型的非临床安全性数据表明，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞和使用TM过程制造的那些细胞可能具有在体内诱导IL-6产生的相似潜力，并因此携带类似的细胞因子释放综合征(CRS)风险。基于这一证据，使用ARM过程制造的抗CD19 CAR T细胞将在患有晚期小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)/慢性淋巴细胞白血病(CLL)与布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)，依鲁替尼(Imbruvica)(一种在该适应症中已经批准的药物，并且作为DLBCL中的单一药物)组合治疗的I期开放标签临床研究中进行研究。
产生和体外分析
为在临床规模上测试抗CD19 CAR T细胞制造的ARM过程，将冷冻的健康供体白细胞单采产物(Leukopak，LKPK)用作起始材料，如图28A所述作为代表性实例。LKPK包含37％T细胞、4％NK细胞、37％单核细胞和15％B细胞(图28A)。解冻后，使用抗CD4和抗CD8微珠阳性选择T细胞。在阳性T细胞选择后产物的组成是95.4％T细胞、1.9％NK细胞、1.7％单核细胞、和0.1％B细胞(图28A)。
使用与抗CD3和抗CD28激动剂单克隆抗体缀合的聚合物纳米基质活化阳性选择的T细胞，并用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体转导。培养24小时后，收获细胞并冷冻保存(在该实例中，此类细胞被称为“ARM-CD19 CAR”)。并行地，使用相同的供体T细胞和慢病毒载体，用传统制造(TM)过程产生CAR-T细胞(在该实例中此类细胞被称为“TM-CD19 CAR”)。TM过程利用与抗CD3和抗CD28抗体偶联的顺磁珠和在组织培养烧瓶中的9天培养期，然后进行相同的收获和冷冻程序。通过流式细胞术分析每个过程产生的CAR-T细胞，以评估解冻后的CAR表达，以及T细胞表型(图28B-28D)。对T细胞表型的分析显示，ARM过程在CD8和CD4区室中保留了初始样T细胞(45.1％CD45RO-/CCR7+)，而TM过程主要产生中枢记忆T(TCM)细胞(与针对ARM-CD19 CAR的43.6％相比，68.6％CD45RO+/CCR7+)(图28C和28D)。重要的是，与TM过程相比，ARM过程更好地维持了原始初始样CD45RO-/CCR7+ T-细胞群体，同样在CAR+群体(起始材料中28.6％，对于ARM-CD19 CAR为37.5％，并且对于TM-CD19 CAR为4.5％)(图28C和28D)。该T细胞群体与由Fraietta,等人(2018)Nat Med[自然医学],24(5)；563-571描述的CD45RO-/CD27+T干细胞大部分重叠；并且与CLL I期临床试验中的持续缓解相关联。
除了其表型外，还评估了最终的ARM-CD19 CAR细胞产物的体外功能。将ARM-CD19CAR和TM-CD19 CAR解冻，并与表达CD19的细胞系NALM6(ALL)或TMD-8(DLBCL)共培养。共培养48小时后上清液中细胞因子水平的比较显示，取决于刺激性癌细胞(NALM6或TMD-8，图29A和29C)，如与TM-CD19 CAR相比，由ARM-CD19CAR分泌的IFN-γ水平增加11至17倍，并且由ARM-CD19 CAR分泌的IL-2水平增加3.5至10倍。用经历ARM或TM过程的未转导的(UTD)细胞(图29C)或用CD19-阴性NALM6(NALM6-19KO)靶细胞(图29D)的实验证实了由ARM-CD19CAR和TM-CD19 CAR的CD19特异性识别。在不存在CD19特异性刺激的情况下，由ARM-UTD和ARM-CD19 CAR的IFN-γ分泌的较高背景(分别为图29A和29B)可能是由于这些产物的活化性质。该背景分泌减少了48小时的共培养(图29B和29D)。在与靶细胞共培养的第一个24小时后，进行细胞的中间洗涤，然后再共培养24小时(24小时+24小时)，进一步增强了背景和CD19特异性细胞因子分泌之间的差异。这24小时+24小时的情况突出显示了由ARM-CD19CAR分泌的背景IFN-γ在最初的24小时后消失。
总之，用于产生ARM-CD19 CAR的ARM过程产生具有与TM-CD19CAR相似或更高的CAR表达的T细胞。重要的是，ARM过程保持与输入材料类似的T细胞表型。ARM-CD19 CAR在体外表现出CD19特异性活化，并且如与TM-CD19 CAR相比分泌更高水平的IL-2，与其T干细胞表型相关。
体内功效
将体内功效研究用于指导ARM过程的发展，最终导致将该过程用于临床抗CD19CAR T细胞制造。对于此处描述的实验，在临床规模上产生ARM-CD19 CAR。并行地，使用相同的慢病毒载体和来自相同供体的T细胞产生TM-CD19 CAR。在免疫缺陷型NSG小鼠(NOD-scidIL2Rg-null)中评估使用不同的过程产生的CAR-T细胞的功效，该小鼠用B ALL细胞系NALM6接种。这种肿瘤细胞系在骨髓中移植，但在肿瘤负荷高的情况下还可以在循环中检测到。白血病接种后7天，小鼠组接受单次输注CAR+ T细胞(图30A)。在第0天，基于TM-CD19 CAR和ARM-CD19 CAR的解冻后流分析确定0.2×106、0.5×106和2×106个活的CAR+ T细胞的计划剂量。
由于担心在第0天解冻后ARM-CD19 CAR的假转导，将哨兵小瓶(sentinel vial)解冻并培养长达5天，并在不同的时间点通过流式细胞术分析CAR表达(百分比和平均荧光强度)(图30B)。如与第0天解冻后样品相比，之后时间点处的阳性细胞百分比较低。同时，每个细胞的CAR平均荧光强较高，反映了稳定转导的CAR-T细胞。将第3天的测量用于确定ARM-CD19 CAR的实际剂量，该剂量被测定为0.1×106、0.25×106和1×106个活的CAR+ T细胞。TM-CD19 CAR剂量保持不变(0.2×106、0.5×106和2×106个活的CAR+ T细胞)，因为解冻后样品的流分析在静息的、完全整合的CART细胞上进行。
ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR均以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退(图30C)。用0.5×106或2×106个TM-CD19 CAR细胞或0.25×106或1×106个ARM-CD19 CAR细胞处理的小鼠经历可持久的肿瘤消退。有趣的是，在所测试的相应最低剂量(0.2×106个TM-CD19 CAR细胞或0.1×106个ARM-CD19 CAR细胞)中，对TM-CD19 CAR应答不持续，并且所有小鼠最终在初始部分白血病控制后复发。相反，在最低剂量(0.1x106个)ARM-CD19 CAR处理的小鼠显示肿瘤负荷的稳定下降，持续到研究结束。肿瘤消退的动力学表明ARM-CD19 CAR的延迟活化约1周，表明T干细胞需要增殖并分化成效应细胞以便于发挥其抗肿瘤活性。
用通过两种制造过程产生的CAR-T细胞和UTD细胞处理的小鼠被每周放血两次以测量细胞因子水平(图31A-31D)。输注了CAR-T细胞(ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR)的小鼠中循环IFN-γ水平显示出双相模式(图31A)。在CAR-T细胞输注后4-7天观察到早期IFN-γ峰，并且可能与肿瘤识别后的CD19特异性活化有关，因为该峰在输注TM-UTD或ARM-UTD的小鼠中不明显(图31B)。早期CD19介导的活化通过体内IL-2水平的伴随升高来证实(图31C)，然而其在稍后的时间点减少。
体内细胞动力学
作为评估NSG小鼠中ARM-CD19 CAR的功效的药理学研究的一部分，在体内评估CAR+ T细胞的扩增(图32)。在输注后直至4周，通过流式细胞术分析血液中的CD3+/CAR+ T细胞浓度。可以推断CAR-T细胞扩增。然而，由于X-GVHD发作所限制的研究时间，无法评估长期持续性。在所有剂量下均观察到ARM-CD19 CAR和TM-CD19 CAR的细胞扩增，除了最低剂量为0.2×106个细胞的TM-CD19 CAR。暴露(细胞注射后21天内的Cmax和AUC)随着TM-CD19 CAR和ARM-CD19CAR的剂量增加而增加。为比较在相同剂量水平的ARM-CD19 CAR与TM-CD19 CAR的扩增，将TM-CD19 CAR的暴露插补相当剂量的ARM-CD19 CAR(0.25×106和1×106个细胞)。与剂量为0.25×106和1×106个细胞的TM-CD19 CAR相比，Cmax高24至46倍，并且AUC0-21d高18至33倍。与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR峰扩增(Tmax)的时间延迟至少1周。
总之，在体外评估ARM-CD19 CAR的药理学研究表明，ARM-CD19CAR具有早期分化的表型，并且具有分泌更多IFN-γ和IL-2的潜力。在体内，如与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19CAR表现出延迟但更高的细胞扩增，诱导更多的IL-2分泌，并且在较低剂量下控制肿瘤生长。所讨论的ARM-CD19 CAR的其他特征，例如在较晚时间点血浆IFN-γ水平升高和X-GVHD的早期发生均见于ARM-CD19 CAR以及ARM-UTD，是在此使用的异种移植小鼠模型的潜在限制。总之，这些结果支持以下假设：ARM-CD19 CAR包含具有更多干细胞性特征的T细胞，使得ARM-CD19 CAR能够有效地植入、扩增和排斥肿瘤。
体外IL-6释放测定
用于体外研究CART细胞的IL-6诱导潜力的三方共培养模型首先由Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748发表，并且在此应用了一些改编。该模型由CAR-T细胞、白血病靶细胞和旁观者THP-1单核细胞组成，作为骨髓细胞的来源，用于最大化IL-6产生。在该体外细胞模型中，通过与表达CD19的靶标和THP-1细胞共培养，单独的ARM-CD19 CAR或TM-CD19 CAR的IL-6分泌增加(图33A和33B)。重要的是，由ARM-CD19 CAR诱导的时间依赖性CD19特异性IL-6分泌可与TM-CD19 CAR诱导的分泌重叠。在相同的体外模型中，在ARM-CD19 CAR条件下的CD19特异性IFN-γ分泌比在TM-CD19CAR条件下高10倍(数据未显示)。
概述
这些结果表明，如与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR可能具有更高的抗肿瘤潜力和类似的安全性特征。由按所测试的最低剂量和通过更高的体内细胞扩增中更好的肿瘤控制来推断更大的抗肿瘤潜力。然而，这样的计算可能低估了ARM-CD19 CAR的总体治疗潜力，因为这是在ALL模型(NALM6)中测定的，这种模型比CLL和DLBCL这两种疾病适应症(其中最初研究ARM-CD19 CAR)更具攻击性。特别地，在CLL中，体内CAR-T细胞扩增与肿瘤消退强烈相关(Mueller,等人(2017)Blood.[血液]130(21)；2317-2325；Fraietta,等人(2018)NatMed[自然医学],24(5)；563-571)，与TM-CD19 CAR相比，ARM-CD19 CAR的显著更高的增殖潜力(高达20倍)可能导致有意义的优越功效。
在小鼠中，与CAR介导的肿瘤消退相关联的、由ARM-CD19 CAR诱导的IFN-γ和IL-2的早期全身释放分别比由传统制造的CAR-T细胞诱导的IFN-γ和IL-2的早期全身释放高3倍和10倍。没有在体内研究IL-6水平，因为在该菌株中缺乏功能性骨髓细胞导致不能产生炎性细胞因子(Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748；Giavridis,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；731-738)。为了避免这种情况并评估由ARM-CD19 CAR诱导的体内IL-6释放的可能性，采用体外三方共培养系统，其中添加旁观者单核细胞作为炎性细胞因子的来源(Norelli,等人(2018)Nat Med.[自然医学],6月；24(6)；739-748)。在该系统中，ARM-CD19 CAR与传统制造的CAR-T细胞之间的IL-6产生相似，表明CRS具有相似的风险。相反，ARM-CD19 CAR细胞扩增的延迟动力学将需要将CRS监测期从TM-CD19 CAR典型的3周延长至4周。用ARM-CD19 CAR的体外实验还揭示了在解冻后培养的前3天内通过ARM-CD19 CAR的瞬时、非CAR介导的IFN-γ和IL-2分泌的可能性。基于接受重组人IL-2(阿地白介素)和重组人IFN-γ(ACTIMMUNE)的患者的数据进行全面的风险评估，并考虑到ARM-CD19 CAR输注后的预计暴露，表明如这些患者所描述体质症状(发烧、寒战、红斑)的风险会非常低。为进一步降低这种风险，接受ARM-CD19 CAR的患者将在输注细胞产物后住院至少72小时。
最后，在非GLP兼容性毒理学研究中，当通过血液或淋巴器官免疫表型分析评估以及相关器官组织学评估时，与传统制造的CAR-T细胞和经历ARM过程的未转导的细胞相比，植入ARM-CD19 CAR的NSG小鼠没有出现意外行为。
实例9：使用ARM过程制造的BCMA CART细胞
方法
T细胞分离
从Hemacare获得健康供体单采血液成分术的新鲜leukopak，并储存在气相液氮(LN2)中直至需要。在第0天，从LN2中取出两个四分之一的leukopak，在Plasmatherm(博科公司(Barkey)，里奥波尔德绍赫(
Figure BDA0003867148300003851
)，德国)中加热直至留下小的冰晶，并用
Figure BDA0003867148300003855
过程缓冲液稀释。然后在具有TS 520管组和T细胞转导(TCT)程序软件版本1.0的
Figure BDA0003867148300003852
上进行自动化的CD4/CD8阳性选择。通过由Cellometer Vision(Nexcelom公司，罗伦斯，马萨诸塞州)枚举的AO/PI染色测定每种
Figure BDA0003867148300003853
输出(产物、废物和非靶细胞)的细胞计数和活力，以评估总细胞回收率和T细胞回收率。将CD4/CD8富集的产物在OpTmizerTM完全T细胞培养基中洗脱，并使用24小时或传统的9天过程(TM)分开用于进一步培养。将剩余的T细胞在LN罐中冷冻。通过流式细胞术分析评估T细胞纯度。
使用ARM过程产生CAR-T细胞
将由
Figure BDA0003867148300003854
纯化的T细胞接种到不同规格的容器中(例如板、烧瓶、G-REX管)或森切卡特公司(centricult)的完整临床量表。接种后，除了临床级慢病毒载体，添加TransAct(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))(一种与抗CD3和抗CD28激动剂缀合的聚合物纳米基质)。在收获和冷冻保存之前，将细胞在含有100IU/mL人重组IL-2(普罗米修斯公司(Prometheus)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、2％ICRS(生命技术公司(LifeTechnologies))的OpTmizerTM完全T细胞培养基中孵育24小时。
将等分试样的冷冻保存的CAR-T细胞解冻到预热的OpTmizerTM完全培养基中，在培养和流式细胞术分析之前用20倍体积的预热的培养基洗涤两次，用于在解冻后的不同时间点处评估BCMA-CAR表达和干细胞性特征。将等分试样的细胞产物与靶细胞系共培养以评估响应于特异性抗原刺激的细胞因子释放。
使用TM过程产生CAR-T细胞
将
Figure BDA0003867148300003861
加工的T细胞重悬浮于温热的RPMI完全T细胞培养基中，并铺板于24孔板中。在37℃下将T细胞与人T-Expander CD3/CD28珠按珠与细胞的3:1比率孵育过夜。
在第1天，基于SUP-T1滴度，添加MOI为2的慢病毒。未向未转导的对照(UTD)中添加病毒。将T细胞在37℃下孵育过夜，然后添加1mL完全T细胞培养基/孔，之后将它们在37℃下孵育过夜。对于培养扩增的剩余7天，将T细胞转移到组织培养烧瓶中，并每两天用完全T细胞培养基稀释。
在第8天至第9天之间，将T细胞去珠，收获并在CryoStor CS10冷冻培养基中冷冻保存，在-80℃下在酷赛细胞冷冻仪(CoolCell Cell Freezing Containers)(百思顺生物公司Biocision)中冷冻，并在第二天转移至LN2。将T细胞的小的等分试样染色用于CAR表达。包括单色控制以进行补偿。在流式细胞仪(BD LSRFortessa公司)上测量样品，并用FlowJo软件分析数据。
靶细胞系和培养物
用慢病毒萤火虫荧光素酶报告基因构建体转染Nalm6细胞以产生Nalm6-luc细胞系。使细胞在37℃，5％CO2下的培养箱中生长。在使用前将等分试样的细胞用于检测肿瘤抗原BCMA表达。
在体外细胞因子分泌测定
在96孔平底板中，通过将CAR-T细胞与靶细胞按2.5倍的E:T比率孵育20小时，评估响应于表达BCMA的靶细胞的抗BCMA CAR-T(被称为效应细胞)的细胞因子分泌。使用ARM或TM过程产生PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞的效应细胞。使用ARM过程制造的CART细胞被铺板持续24小时冲洗条件以使细胞静置并使非特异性活性最小化。靶细胞包括BCMA阳性KMS11-luc或BCMA阴性NALM6-luc。将这些靶细胞添加至新鲜铺板的T细胞中或来自24小时冲洗条件(仅ARM细胞)的T细胞中。对于该测定，通过向BCMA CAR-T中添加UTD来标准化CAR-T细胞的％转导。这允许比较每个样品中相同数量的CAR-T和相同的总T细胞数。从每个孔收获从效应物到靶标的20小时共培养时间点的上清液，并在-20℃下冷冻以用于MSD细胞因子分析。将常规的MSD V-PLEX人IFN-γ、IL-2试剂盒(#K151A0H-4A)用于定量每种上清液样品中的分泌细胞因子。
结果
ARM过程保留了T细胞的干细胞性
通过流式细胞术分析使用ARM过程产生的CAR-T细胞以评估解冻时和解冻后48小时的CAR表达，以及T细胞表型(图34A、34B和34C)。对于使用TM过程制造的CAR-T细胞，在收获前第9天评估CAR表达(图35A)。BCMA-CAR在图34A所示的解冻时几乎检测不到。然而，在解冻后48小时，BCMA-CAR被明显表达为：对于PI61为32.9％、对于R1G5为35.9％、和对于BCMA10为17.4％。使用TM过程产生的第9天的细胞显示BCMA-CAR表达为：对于PI61为36％、对于R1G5为40％、和对于BCMA10为7％(图35A)。对CAR+T细胞表型的风险显示，ARM过程保留了初始样T细胞(对于PI61和R1G5为约60％的CD45RO-/CCR7+，对于BCMA10为32％的CD45RO-/CCR7+)(图34C)。TM过程主要产生中枢记忆T细胞(TCM)(对于所有三种BCMA CAR-T，72％至81％的CD45RO+/CCR7+)，而初始样T细胞群体几乎在使用TM过程制造的CAR+T细胞中消失(图35B)。总体而言，初始T-细胞群体与先前报道(Cohen AD,等人(2019).J ClinInvest.[临床研究杂志]130.pii:126397.doi:10.1172/JCI126397；Fraietta,JA,等人(2018).Nat Med[自然医学],24(5)；563-571)所描述的CD45RO-/CD27+T干细胞大部分重叠，并且与应答和CAR-T扩增相关联。
除了其表型外，还评估了最终的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞产物的体外功能。将PI61、R1G5和BCMA10细胞产物解冻，并与BCMA-表达细胞系KMS-11按1:1的比率共培养。在共培养建立之前，将解冻后的ARM加工的细胞静置24小时。共培养24小时后对上清液中细胞因子水平的比较显示，如与图36A-36D所示的TM产品相比，由ARM产物分泌的IL-2增加约5至25倍，并且IFN-γ水平增加约3至7倍。使用经历ARM或TM过程的未转导的(UTD)细胞的实验证实了PI61、R1G5和BCMA10的BCMA特异性识别。
总之，使用ARM过程产生的PI61、R1G5和BCMA10 CART细胞表明体外BCMA特异性活化，并如与TM加工的产物相比分泌更高水平的IL-2和IFN-γ，与使用ARM过程产生的CART细胞的T干细胞表型相关。
实例10：使用ARM过程制造的CART细胞的基因特征分析
方法
单细胞RNAseq
使用10倍基因组学铬控制器和支持文库构建试剂盒生成单细胞RNAseq文库。
将冷冻保存的细胞解冻，计数并流式分选(如果研究问题需要)，然后加载到10倍基因组学仪器上。将各个细胞加载到液滴中，并经由GemCode珠对各个液滴内的RNA进行条形码化。条形码RNA从液滴中释放并转化为整个转录组Illumina相容的测序文库。
在Illumina HiSeq仪器上对生成的文库进行测序，并使用10倍基因组学分析过程和Loupe Cell Browser软件进行分析。
单细胞免疫细胞分析
使用整个转录组10倍基因组学单细胞文库作为模板材料以产生免疫细胞谱和谱系分析。从Chromium Single Cell 5'文库中PCR扩增T细胞受体序列，并在Illumina测序仪器上分析。
分析过程
单细胞RNAseq数据通过Cell Ranger分析过程从FASTQ文件开始处理。有关CellRanger分析过程的详细说明，请访问：https:support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/lat est/what-is-cell-ranger。一般过程包括比对、过滤、条形码计数和UMI计数。细胞条形码用于产生基因条形码矩阵、确定簇，并进行基因表达分析。使用Seurat Bioconductor包将基因表达计数数据归一化。丢弃来自具有少于200个表达基因的分析的细胞。丢弃来自仅在2个细胞或更少的细胞中表达的分析的基因。使用比例因子10,000，使用Seurat对数归一化方法对剩余数据进行归一化。通过回归每个细胞检测到的分子数来缩放数据。通过获取基因集中所有基因的平均对数归一化基因表达值来计算基因集评分(基因集评分)。每个基因的z评分归一化，使得基因在样品上的平均表达为0，标准差为1。然后将基因集评分计算为基因集中基因归一化值的平均值。以下描述示例性基因集评分计算。
对于该基因集评分计算的实例，表23中提供了六(6)个基因的两(2)个样品的归一化基因表达。出于该示例性计算的目的，基因集由基因1-4组成。因此，样品1和2的基因集评分均为0。
表23：用于基因集评分计算的示例性数据集
样品1 样品2
基因1 -3 0
基因2 3 0
基因3 1 0
基因4 -1 0
基因5 10 4
基因6 -5 3
基因集“向上TEM对比向下TSCM”包括以下基因：MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY、和GFPT2。
基因集“向上Treg对比向下Teff”包括以下基因：C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3、和FOXP3。
基因集“向下干细胞性”包括以下基因：ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1、和XRCC5。
基因集“向上缺氧”包括以下基因：ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11、和XRCC6。
基因集“向上自噬”包括以下基因：ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593、和ZNF681。
基因集“向上静息对比向下活化”包括以下基因：ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862、和ZNF91。
基因集“记忆分化逐渐增加”包括以下基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、和KLRB1。
基因集“向上TEM对比向下TN”包括以下基因：MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK、和KLRB1。
描述相似过程和/或特征的其他基因集也可用于表征上述细胞表型。
细胞Ranger VDJ用于为每个单细胞5'文库产生单细胞VDJ序列和注释。LoupeCell Browser软件和Bioconductor软件包用于数据分析和可视化。
结果
该实施例旨在使用单细胞RNA-seq(scRNA-seq)比较用作输入细胞的纯化T细胞、使用ARM过程制造的CART细胞(标记为“第1天”细胞)和使用TM过程制造的CART细胞(标记为“第9天”)之间的T细胞状态。此外，进行单细胞TCR-seq(scTCR-seq)以研究克隆性并跟踪从输入到制造后材料的细胞分化。
如图37A-37C中所示，输入细胞具有最少的表达基因和UMI，表明这些细胞不具有转录活性并处于静止状态。第1天和第9天细胞表达更多基因，第9天细胞是最具转录活性的。类似的结果显示在图38A-38D中。输入细胞不表达增殖基因(图38A和38D)。
另外的基因集分析数据显示在图39A-39E中。使用中位数基因集评分比较不同的细胞群体。第1天细胞和输入细胞处于更年轻、更像干细胞的记忆状态(图39A-39C)。在图39A中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)值分别为-0.084、0.035和-0.1。在图39B中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)值分别为-0.082、0.087和-0.071。在图39C中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向下干细胞性)值分别为-0.062、0.14和-0.081。
另外，与第9天细胞相比，第1天细胞处于更理想的代谢状态(图39D和39E)。在图39D中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上缺氧)值分别为0.019、0.11和-0.096。在图39E中，第1天细胞、第9天细胞和输入细胞的中位数基因集评分(向上自噬)值分别为0.066、0.11和-0.09。
基于基因表达，输入细胞包含四个簇。簇0的特征在于LMNA、S100A4等的高表达。簇1的特征在于RP913、PRKCQ-AS1等的高表达。簇2的特征在于PR11-291B21.2、CD8B等的高表达。簇3的特征在于NKG7、GZMH、CCL5、CST7、GNLY、FGFBP2、GZMA、CCL4、CTSW、CD8A等的高表达。在输入细胞的T分布随机邻域嵌入(TSNE)图中，簇3从其他细胞中脱颖而出，并且簇1和簇2难以区分。
根据图40A-40C中所示的基因集分析，与簇1和簇2富集T效应表型相比，簇0和簇3富集T调节表型。簇3由晚期记忆/效应记忆(TEM)细胞支配，簇1和簇2由早期记忆和幼稚细胞支配，群集0在中间。大多数输入细胞处于早期记忆、初始状态。不希望受理论束缚，这些细胞在制造过程中可以做到最好。
在第1天细胞和第9天细胞中观察到较少的转录异质性(数据未显示)。
与输入群体一样，第1天细胞在TSNE图中显示出大的早期记忆细胞簇和较小的晚期记忆细胞簇。类似于输入细胞的簇3所见的。相反，第9天细胞在TSNE图中未显示出明显的早期记忆细胞簇。这意味着到第9天，细胞变得更均匀。
对TCR进行测序并测量克隆型多样性。总体而言，种克隆型谱非常平坦-大多数克隆仅被挑选一次(图41A-41C和表24)。表24中的香农熵测量分布的平坦度。输入细胞中的显性克隆是晚期记忆细胞。第1天的细胞看起来与输入细胞相似，但开始均匀。到第9天，主导克隆基本上已经均匀，分布更加平坦。多样性测量在第9天是最高的，因为在第9天细胞中比在输入细胞或第1天细胞中具有更均匀和平坦的分布。
表24：TCR多样性的测量
输入 第1天产物 第9天产物
每个克隆型的平均克隆 1.10 1.05 1.07
估计的细胞数量 7344 7687 7233
克隆型的总数 5325 7403 6736
多样性 342.27 802.94 3382.62
归一化的香农熵 9.98E-01 9.95E-01 9.96E-01
概述
第1天和第9天产物之间存在显著的T细胞状态差异。第1天细胞与输入细胞更相似，并且具有干细胞性特征的富集，表明产物更有效。实例11：I期、开放标签、B细胞成熟抗原(BCMA)定向CAR-T细胞在患有复发和/或难治性多发性骨髓瘤(MM)成人患者中的研究
本研究评估抗BCMA CART-T细胞疗法在对至少两种既往治疗方案复发和/或难治的成人MM受试者的安全性和耐受性，这些治疗方案包括IMiD(例如来那度胺或泊马度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米、卡非佐米)和批准的抗CD38抗体(如达雷木单抗)(如果有的话)，并且有证据证明疾病进展(IMWG标准)。
抗BCMA CAR包含PI61抗BCMA scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在该研究中，抗BCMA CAR-T细胞产品使用活化的快速制造(ARM)过程制造。此类细胞被称为“ARM-BCMA CAR”。特别地，使用可商购的磁珠捕获T细胞表面上的CD4和CD8共受体，从受试者的白细胞单采单位富集T细胞。然后用共价附接至针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂抗体的胶体聚合物纳米基质刺激富集的T细胞。接种、活化和转导后24小时，收获CAR-T细胞并洗涤以除去残留的未整合的载体和未结合的活化基质。洗涤后，将BCMA CART细胞疗法浓缩并冷冻保存。在释放用于施用的产品之前，需要来自释放测试程序的结果。
与用于CAR-T细胞的TM过程(其依赖于在用慢病毒载体转导后持续7-8天的离体T细胞扩增期)相比，ARM过程不包括离体T细胞扩增。相反，ARM产生的T细胞在基因转移后24小时收获，允许它们在患者体内扩增。预测用ARM过程实现的更大的体内T细胞扩增导致分化程度较低的T细胞表型，在最终细胞产物中保留更大部分的记忆干T细胞。存在分化程度较低的记忆CAR-T细胞与临床研究中抗肿瘤功效的改善相关(Fraietta JA等人,(2018)NatMed[自然医学],24(5)；563-71)。不希望受理论束缚，由较大部分记忆T干细胞组成的BCMACART细胞导致患者中CAR-T细胞增殖增强，从而克服效应T细胞耗竭并且与在传统制造过程下产生的BCMA CART相比导致在MM患者中更持久的功效。
与使用传统制造(TM)过程制造的CART细胞相比，ARM过程生产的CAR-T细胞在整体产品和CAR阳性部分中由显著更大比例的初始样记忆T细胞(CCR7+/CD45RO-)组成。ARM-BCMA CAR已经以剂量反应的方式显示了临床前MM模型中的肿瘤清楚。与使用TM过程产生的BCMA CAR-T细胞相比，ARM-BCMA CAR的效力至少高5倍，并且导致体内CAR-T扩增，具有更高水平的全身细胞因子。总之，这些结果支持这样的假设：用ARM过程制造的抗BCMA CAR-T细胞产品含有具有明显记忆干细胞表型的T细胞，导致具有增强的植入、扩增和抗-MM特性的BCMA CAR-T细胞产物。
在该I期研究中，首先在筛选期间评估每个受试者的临床资格。有资格入选本研究的受试者必需满足以下所有标准：(1)ICF特征的时间的年龄≥18岁；(2)在筛选时ECOG的表现状态为0或1；(3)患有对至少2种既往治疗方案复发和/或难治的MM的受试者，这些治疗方案包括IMiD(例如来那度胺或泊马度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米、卡非佐米)和批准的抗CD38抗体(如达雷木单抗)(如果有的话)，并且有证据证明疾病进展(IMWG标准)；(4)受试者必须患有由以下3项测量中的至少1项定义的可测量疾病：血清M-蛋白≥1.0g/dL，尿M-蛋白≥200mg/24小时，或无血清轻链(sFLC)>100mg/L的相关FLC；(5)根据机构的指导所有患者必须适于系列骨髓活检和/或抽吸采集，并愿意按照本研究所述的重复程序进行；(6)受试者在筛查时必须符合以下血液学值：绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1,000/mm3(≥1×109/L)，测试前7天内无生长因子支持，CD3+ T细胞绝对数>150/mm3(>0.15×109/L)，测试前7天内无输血支持，血小板≥50 000/mm3(≥50×109/L)，血红蛋白≥8.0g/dl(≥4.9mmol/L)；(7)患者必须由研究者认为适合接受氟达拉滨/环磷酰胺LD方案；以及(8)必须具有可接受用于制造的非流动细胞的白细胞单采材料。如果符合条件，受试者将进行白细胞单采产物收集并提交用于CAR-T制造。该受试者参加了他们的白细胞单采产物的接受，以便开始制造。
受试者仅在确认最终产品可用后才接受淋巴细胞清除(LD)化疗。LD化疗后，在解冻后90分钟内经由静脉内(i.v.)注射施用受试者单剂量的抗BCMA CAR-T细胞产物(图42)。ARM-BCMA CAR的起始剂量是1×107个活的CAR阳性T细胞。还测试了5×107个活的CAR阳性T细胞的剂量。每个受试者在抗BCMA CAR-T细胞施用后的前72小时住院。
对于药代动力学分析，在不同时间点收集系列血液样品，通过流式细胞术和qPCR测量外周血中ARM-BCMA CAR细胞动力学，通过流式细胞术和qPCR测量骨髓中的ARM-BCMACAR细胞动力学，以测量细胞和体液免疫原性，并通过ELISA测量在外周血中包括sBCMA、BAFF和APRIL在内的潜在的药效标志物。特别地，分析受试者外周血、骨髓或其他相关组织中CAR转基因的量；CAR阳性T细胞在外周血或骨髓中的表面表达；血清中的抗mCAR抗体；PBMC中IFN-γ阳性CD4/CD8T细胞的百分比；免疫细胞活化标志物；可溶性免疫因子和细胞因子(例如sBCMA、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-α)，CAR-T克隆性；以及血清中可溶性BCMA、APRIL和BAFF的水平。
实例12：使用活化快速制造(ARM)过程制造BCMA CART细胞
如表25所示，BCMA CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
表25：在BCMA CART制造过程中培养基和缓冲液类型和使用时间点
Figure BDA0003867148300004021
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
Figure BDA0003867148300004022
微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
Figure BDA0003867148300004023
上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-2和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将BCMA CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
Figure BDA0003867148300004024
上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配制品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
实例13：使用活化快速制造(ARM)过程制造的BCMA CART细胞的表征
概述
该实例描述了使用ARM过程制造的BCMA CART细胞的表征。与传统制造(TM)产物相比，ARM过程生产的CAR-T细胞由显著更大比例的初始样记忆T细胞(CCR7+/CD45RO-)组成。在多发性骨髓瘤(MM)的临床前模型中，使用ARM过程制造的BCMA CART细胞以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退，与使用TM过程制造的BCMA CART细胞相比，杀死肿瘤的效率高达5倍。此外，与TM制造的细胞相比，ARM制造的细胞在体内显示出延长的CART扩增(比Cmax和AUC0-21d高高达3倍)并且诱导更高的全身细胞因子(IFN-γ增加3.5倍)。总之，这些结果支持这样的假设：用ARM过程制造的BCMA CART细胞含有具有明显记忆干细胞表型和增强的体内扩增潜力的T细胞。
使用ARM过程，CAR可以在病毒添加后96小时稳定表达(也可称为在产品解冻后72小时)。因此，病毒添加后96小时或解冻后72小时被认为是体外和体内活性的CAR表达的替代时间点。当与使用TM过程制造的BCMA CART细胞相比，使用ARM过程制造的BCMA CART细胞保留了分化程度较低的细胞群，并且在体外显示出更高的靶特异性细胞因子产生。
使用ARM过程制造的BCMA CART细胞使用可商购人质膜蛋白测定证明了对BCMA的高度特异性。该测定检测到与BCMA(TNFRSF17)的结合，但没有检测到其他强、中或弱结合物。筛选没有高度置信地鉴定BCMA CART产物中表达的抗人BCMA单链抗体可变片段(scFv)(PI61)的交叉反应蛋白的存在。进行靶分布研究以确定潜在的肿瘤外靶向毒性。利用免疫组织化学(IHC)、原位杂交(ISH)和聚合酶链反应(PCR)测定来检查正常人组织中BCMA的分布。这些分析表明BCMA表达仅限于含有正常浆细胞(PC)的部位，例如次级淋巴器官、骨髓和粘膜相关淋巴组织。由于中枢神经系统(CNS)的神经毒性一直是其他基于细胞的疗法的关注点，因此检查了脑中的表达。通过免疫组织化学，使用显示对BCMA特异的可商购抗体，或使用含有靶向scFv的BCMA的人-兔嵌合工具抗体的结合测定，未观察到CNS染色。通过原位杂交和基于PCR的剪接变体分析测量，这些组织中缺乏BCMA mRNA证实了这些发现。BCMACART靶向正常PC和表达BCMA的浆细胞样树突状细胞可能导致它们的耗减；然而，预计不会靶向其他细胞类型。
结果
下面描述的研究比较了使用ARM过程制造的BCMA CART细胞(称为“ARM-BCMACAR”)和使用TM过程制造的BCMA CART细胞(称为“TM-BCMA CAR”或“TM-BCMA CAR*”)。在ARM-BCMA CAR中表达的CAR和在TM-BCMA CAR*中表达的CAR具有相同的序列，包含PI61scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在TM-BCMA CAR中表达的CAR包含BCMA10 scFv、CD8铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。ARM-BCMA CAR体外表达动力学
与在8-9天后测量CAR转基因的慢病毒整合的TM对比，在ARM过程中，慢病毒转基因可能不会在慢病毒添加后24小时内完全整合并真正表达，因为可能发生慢病毒假转导(Haas DL等人,(2000)Mol Ther[分子疗法]；2(1):71-80；Galla M,等人,(2004)Mol Cell[分子细胞]；16(2):309-15)。因此，通过在存在或不存在3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)的情况下在体外延长培养ARM-BCMA CAR来评估BCMA-CAR表达模式，以评估CAR转基因的潜在的假转导与稳定整合和表达。进行流式细胞术(FACS)分析以检测T细胞活化后24h、48h、72h、96h和168h的CAR表面表达以及用慢病毒载体转导。在一些情况下，ARM-BCMA CAR和该产物的等分试样在收获后立即冷冻，以在其他测定中进行另外的表征。
如图43所示，FACS分析表明BCMA-CAR在添加慢病毒载体后24小时几乎没有表达。然而，CAR+群体最初出现在48小时。病毒添加后48h至168h，CAR+群体在每个时间点轻微增加。CAR似乎从96h开始稳定表达。这与未转导(UTD)和AZT处理的样品形成对比，其在48小时的任何时间点都未显示CAR+群体(图43)。AZT能够在30μM和100μM剂量下有效抑制CAR表达，表明BCMA-CAR表达是由于病毒基因整合到宿主细胞基因组中，并且不太可能是慢病毒假转导的结果。ARM-BCMA CAR保留T细胞干细胞性
通过FACS分析ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR以评估解冻时CAR表达以及解冻后48小时的T细胞表型(图44A和44B)。在两个供体中观察到BCMA-CAR几乎检测不到(图44A)，这与图43中所示的CAR表达动力学研究中的观察结果一致。然而，在解冻后48小时，ARM-BCMACAR的BCMA-CAR表达为32.9％。相反，TM-BCMA CAR显示BCMA-CAR表达为7％(图44B)。对CAR+T细胞表型的分析显示，ARM过程保留了初始样T细胞(60％CD45RO-/CCR7+)，证明其比效应记忆T细胞群(CD45RO+/CCR7-)多26倍。TM过程主要在CAR+ T细胞内产生中枢记忆T细胞(81％CD45RO+/CCR7+)。TM过程几乎不存在初始样T细胞群。这种初始的T细胞群与CD45RO-/CD27+T干细胞大部分重叠(由Cohen AD等人,(2019)J Clin Invest[临床研究杂志]；129(6):2210-21；和Fraietta等人(2018)Nat Med[自然医学],24(5)；563-571所述)并且与增强的CAR-T扩增和临床应答相关。
除了其表型外，还评估了最终的ARM-BCMA CAR细胞产物的体外活化。将ARM-BCMACAR和TM-BCMA CAR解冻，并与表达BCMA的细胞系KMS-11共培养。在共培养建立之前，将解冻后的ARM-BCMA CAR细胞静置24小时。共培养24小时后对上清液中细胞因子水平的比较显示，如与图45A和45B所示的TM-BCMA CAR相比，由ARM-BCMA CAR分泌的IL-2增加约5倍，并且IFN-γ水平增加约2倍。使用经历ARM或TM过程的UTD细胞的实验证实了ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR的BCMA特异性识别。然而，在不存在BCMA特异性刺激的情况下由ARM-UTD的IFN-γ分泌的较高背景(图45B)可能是由于ARM产物的活化性质。
总之，用于产生BCMA CART细胞的ARM过程比TM过程产生具有更高的CAR表达的T细胞。ARM-BCMA CAR在体外表现出BCMA特异性活化，并且如与TM-BCMA CAR相比分泌更高水平的IL-2，与其T干细胞表型相关。
ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR在异种移植模型中的功效
体内药理学研究用于指导ARM-BCMA CAR的开发。对于图46中描述的实验，ARM-BCMA CAR是用GMP材料生成的。并行地，使用相同批次的T细胞但使用TM制备TM-BCMA CAR。对于使用ARM-BCMA CAR的剂量计算，在产物解冻后72小时测量％CAR+用于计算剂量；而对于TM-BCMA CAR，使用第9天％CAR+ TM产品计算剂量。在免疫缺陷型NSG小鼠(NOD-scidIL2Rg-null)中评估使用不同的过程产生的CAR-T细胞的功效，该小鼠用MM细胞系KMS-11-Luc接种。这种肿瘤细胞系在骨髓中移植。MM接种后8天，小鼠组接受单次输注CAR+ T细胞。将剂量标准化为匹配剂量组的总CAR-T细胞。类似地制备UTD T细胞并作为独立组给予以控制对肿瘤的同种异体应答。UTD剂量反映了我们可以为TM和ARM实现的相应过程的最高总T细胞剂量。
表26：不同剂量组的研究设计，以及血液药代动力学(PK)和血浆细胞因子测量的时间点的总结。
Figure BDA0003867148300004061
图47是所有组的肿瘤回归曲线。BCMA CAR-T产品(ARM-BCMA CAR和TM-BCMA CAR)均能够在测试剂量水平下消除肿瘤，即使在最低剂量组也是如此。以剂量依赖性方式诱导肿瘤消退。与高剂量组相比，低剂量组的肿瘤杀伤效果延迟了约一周。ARM-BCMA CAR在比TM-BCMA CAR低3-5倍的剂量下诱导相似的肿瘤消退，表明与肿瘤杀伤中的TM-BCMA CAR相比，ARM-BCMA CAR的效力是3-5倍。
此外，在该研究中，还评估了TM-BCMA CAR*的功效。TM-BCMA CAR*和ARM-BCMA CAR表达了相同的抗BCMA CAR，但是使用不同的过程制造：分别是TM过程和ARM过程。结果表明，ARM-BCMA CAR在比TM-BCMA CAR*低1-5倍的剂量下诱导相似的肿瘤消退。
在CAR-T疗法后第2、7、14和21天对所有小鼠放血以测量血浆IFN-γ(图48A-48C)。没有观察到早期峰值，并且所有组在第2天显示非常低水平的循环IFN-γ(<10pg/ml)。在CAR-T剂量后14天内观察到所有组的峰。然而，与TM-BCMA CAR相比，ARM-BCMA CAR的IFN-γ水平高3.5倍。ARM-UTD组在研究终止前第2天和第7天产生很少或不产生IFN-γ。当与ARM-BCMA CAR 1e4和TM-BCMA CAR 5e4组相比时，在第21天较高剂量组中IFN-γ下降，因为在这两组中CAR+ T细胞仍在扩增，肿瘤抑制延迟。
体内ARM-BCMA CAR细胞动力学
作为评估NSG小鼠功效的该药理学研究的一部分，在输注后3周通过FACS分析外周血CAR-T细胞的扩增。在所有CAR-T处理组中均观察到CD3+ T细胞和CAR+ T细胞扩增。对于Cmax或AUC 0-21d，ARM-BCMA CAR或TM-BCMA CAR没有明显的剂量依赖性扩增。ARM-BCMACAR或MTV273的细胞扩增峰值未在21天内达到。然而，剂量组为5e5的TM-BCMA CAR和剂量组为0.5e5的ARM-BCMA CAR在第14天达到明显的峰值扩增(图49)。比较ARM-BCMA CAR与TM-BCMA CAR在21天内的扩增，ARM-BCMA CAR的Cmax和AUC0-21d均高2至3倍。
实例14：使用IL-15或hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)使用活化快速制造(ARM)过程制造BCMA CART细胞
如表25所示，BCMA CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
Figure BDA0003867148300004081
微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
Figure BDA0003867148300004082
上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-15或hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将BCMA CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
Figure BDA0003867148300004083
上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配制品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
在一些实施例中，基于OpTmizerTM CTSTM的培养基中使用的IL-15或hetIL-15可以用IL-6或IL-6/sIL-6Ra代替。
实例15：使用活化快速制造(ARM)过程制造CD19 CART细胞
如表25所示，CD19 CART细胞的ARM过程随着培养基的制备而开始。
将冷冻保存的白细胞单采产物用作起始材料并加工用于T细胞富集。如果可行，利用单采文件来定义T细胞百分比。在单采文件上没有T细胞百分比数据的情况下，对进入的冷冻保存的白细胞单采产物进行哨兵小瓶测试以获得用于单采的T细胞百分比目标。T细胞百分比的结果确定了ARM过程第0天解冻的袋数。
将冷冻保存的白细胞单采解冻、洗涤，然后使用
Figure BDA0003867148300004091
微珠技术进行T细胞选择和富集。用TransACT(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))活化活的有核细胞(VNC)，并用编码CAR的慢病毒载体转导。将用Miltenyi微珠选择的活细胞接种到
Figure BDA0003867148300004092
上的中心室(centricult)中，其是非湿润的孵育室。在培养过程中，将细胞悬浮在快速培养基中，这是一种基于OpTmizerTM CTSTM的培养基，这种培养基在其成分中含有CTSTM补充剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、Glutamax、IL-2和2％免疫细胞血清替代品，以促进T细胞活化和转导。在将TransACT添加到培养基中的稀释细胞后，在接种当天进行一次慢病毒转导。慢病毒载体将在接种当天使用前即刻解冻，在室温下最多30分钟。
从第0天的过程开始到培养物洗涤和收获的开始，将CD19 CART细胞从接种后培养20-28小时。培养后，细胞悬浮液在中心室(美天旎公司生物技术公司(Miltenyi Biotec))内进行两次培养洗涤和一次收获洗涤。
在第1天在
Figure BDA0003867148300004101
上收获洗涤后，对细胞悬浮液进行取样以确定活细胞计数和活力。然后将细胞悬浮液转移到离心机中以手动沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于CS10(BioLife溶液)中，得到最终DMSO浓度为约10.0％的产物配制品。在收获结束时配制活细胞计数用于给药。然后将剂量分配到各个冷冻袋中并分析取样到冷冻瓶中。
冷冻保存的产品储存在受监控的安全、出入受限的区域的LN2储罐中直至最终释放和运输。
在一些实施例中，基于OpTmizerTM CTSTM的培养基中使用的IL-2可以用IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6、或IL-6/sIL-6Ra代替。
实例16：使用活化的快速制造(ARM)过程制造表达CAR19.HilD的T细胞
此实例描述了使用ARM过程制造表达CAR19.HilD的T细胞。CAR19是抗CD19 CAR。CAR19.HilD是指其中CAR19与HilD标签融合的构建体。HilD标签(也称为“IKZF3 136-180和236-249”)是基于IKZF3的降解标签，该降解标签可以介导靶蛋白的来那度胺依赖性降解。HilD标签包括人IKZF3的氨基酸残基136-180和236-249，并且包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列。
方法
将两个供体的人原代T细胞解冻，并在锥形管中用TransAct制备。以两个不同的MOI(感染复数)添加CAR19和CAR19.HilD载体：1和2。还培养了未转导的T细胞以作为对照。将细胞在有或没有1μM的来那度胺的情况下培养。
孵育24小时后，将细胞使用含有1％HSA(人血清白蛋白)的PBS洗涤，并且然后重悬在预热的Optimizer培养基中。将收获的细胞计数，并使用Cellaca系统测量活力。为了确定转导效率，将细胞重新铺板至新鲜的24孔板上，并且在37℃下、在潮湿室中、在5％CO2气氛下孵育。
在载体洗涤后第6天结束时，收获所有细胞，并用PBS洗涤。对细胞进行活死染色(live dead stain)，然后使用抗CD3抗体(T细胞染色)和抗ID抗体(CAR表达染色)进行表面染色。然后，将细胞用PBS洗涤两次，并在室温下，在2％多聚甲醛固定缓冲液中重悬10分钟。将固定的细胞用PBS洗涤，并且然后在Fortessa仪器中获得。使用Flow Jo软件分析这些结果。
为了进行分析，将细胞预门控在单个、活的、CD3阳性细胞上，然后使用未转导的细胞作为对照，门控这些细胞以进行CAR表达。
结果
CAR19.HilD细胞显示出与CAR19细胞和未转导细胞(UTD)相似的活力，其中在与病毒载体和TransAct孵育24小时后，活力百分比约为40％-50％(图50A)。24小时时，使用ARM过程制造的CART19.HilD细胞的回收率为约50％(图50B)。用未标记的CART19细胞获得类似结果(图50B)。因此，在CAR19上附加HilD标签不会影响使用ARM过程制造的细胞的活力或回收率。
在CAR表达方面，在载体洗涤后6天，CART19.HilD细胞显示出14％的CAR表达。在存在来那度胺的情况下，此CAR表达降至1％以下，表明该药物对CAR19-HilD表达的调节作用(图51C和51D)。来那度胺的这种作用对CAR19-HilD是特异的，因为向未标记的CART19细胞中添加来那度胺对CAR表达没有影响(获得的转导效率约为29％-30％)(图51A和51B)。
等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过引用以其全文特此并入。虽然已经参照某些实施例披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的另外的实施例以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类实施例以及等同变化。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（NOVARTIS AG）
<120> 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
<130> N2067-7169WO
<140>
<141>
<150> 62/982,698
<151> 2020-02-27
<160> 420
<170> PatentIn 3.5版
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
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Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
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<221> 来源
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<213> 智人（Homo sapiens）
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gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
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gacttcgcct gtgat 135
<210> 14
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 14
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
<210> 15
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 15
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 16
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 17
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 18
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 18
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 19
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 19
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 20
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 22
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 22
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195 200 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210 215 220
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
225 230 235 240
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260 265 270
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275 280 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290 295 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325 330 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
340 345 350
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355 360 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 23
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 23
atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga 60
ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg 120
gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc 180
tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc 240
gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa 300
ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg 360
acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420
gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480
cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540
actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600
gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660
gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720
aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780
accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840
gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900
cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960
cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020
tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080
gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140
gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182
<210> 24
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro
20 25 30
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
35 40 45
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
85 90 95
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
100 105 110
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
115 120 125
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
130 135 140
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
145 150 155 160
Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala
165 170 175
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
180 185 190
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
195 200 205
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
210 215 220
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
225 230 235 240
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
245 250 255
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
260 265 270
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
275 280 285
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
305 310 315 320
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
325 330 335
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
340 345 350
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
355 360 365
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
370 375 380
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385 390
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“取代和优选实施例的详细描述参见提交的说明书”
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(30)
<223> /注释=“此序列可以涵盖1-6个“Gly Gly Gly Gly Ser”重复单元”
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5000
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5000)
<223> /注释=“此序列可以涵盖50-5000个核苷酸”
<400> 30
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 31
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100
<210> 32
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5000)
<223> /注释=“此序列可以涵盖50-5000个核苷酸”
<400> 32
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980
tttttttttt tttttttttt 5000
<210> 33
<211> 5000
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(5000)
<223> /注释=“此序列可以涵盖100-5000个核苷酸”
<400> 33
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000
<210> 34
<211> 400
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(400)
<223> /注释=“此序列可以涵盖100-400个核苷酸”
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“取代和优选实施例的详细描述参见提交的说明书”
<400> 34
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400
<210> 35
<211> 2000
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(2000)
<223> /注释=“此序列可以涵盖50-2000个核苷酸”
<400> 35
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000
<210> 36
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 36
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 37
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 37
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 38
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 39
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 39
acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 60
gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta 105
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 40
ggtggcggag gttctggagg tgggggttcc 30
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“取代和优选实施例的详细描述参见提交的说明书”
<400> 41
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 42
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(40)
<223> /注释=“此序列可以涵盖1-10个“Gly Gly Gly Ser”重复单元”
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 43
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 44
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 46
Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 48
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 50
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 51
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 53
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360
gtgtcctcc 369
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 55
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 56
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 57
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 58
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 58
Ala Ala Ser
1
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 59
Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 60
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 62
gacattcaaa tgactcagtc cccgtcctcc ctctccgcct ccgtgggaga tcgcgtcacg 60
atcacgtgca gggccagcca gagcatctcc agctacctga actggtacca gcagaagcca 120
gggaaggcac cgaagctcct gatctacgcc gctagctcgc tgcagtccgg cgtcccttca 180
cggttctcgg gatcgggctc aggcaccgac ttcaccctga ccattagcag cctgcagccg 240
gaggacttcg cgacatacta ctgtcagcag tcatactcca cccctctgac cttcggccaa 300
gggaccaaag tggagatcaa g 321
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 64
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
165 170 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 65
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 65
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360
gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga 420
ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat 480
cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag 540
cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc 600
gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc 660
ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc 720
ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag 750
<210> 66
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
165 170 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
260 265 270
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
275 280 285
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
290 295 300
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
305 310 315 320
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
325 330 335
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
340 345 350
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355 360 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370 375 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 67
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 67
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360
gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga 420
ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat 480
cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag 540
cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc 600
gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc 660
ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc 720
ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag accactaccc cagcaccgag gccacccacc 780
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 840
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 900
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 960
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1020
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1080
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct accagcaggg gcagaaccag 1140
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1260
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1320
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1380
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1419
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 68
Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 69
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 71
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tcc 363
<210> 72
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 73
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 73
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720
caagggacca aagtggagat caag 744
<210> 74
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 75
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 75
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720
caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct 780
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 840
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg 900
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 960
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1020
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 1080
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac 1140
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1380
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 76
Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 77
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 79
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tcc 363
<210> 80
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 81
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 81
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720
caagggacca aagtggagat caag 744
<210> 82
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 82
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 83
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 83
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720
caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct 780
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 840
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg 900
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 960
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1020
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 1080
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac 1140
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1380
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换=“Tyr”或“Asp”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Asp”或“Val”
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换=“Asp”
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> /替换=“Leu”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(14)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 84
Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换=“Tyr”或“Asp”
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> /替换=“Asp”或“Val”
<220>
<221> 变体
<222> (11)..(11)
<223> /替换=“Asp”
<220>
<221> 变体
<222> (13)..(13)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (14)..(14)
<223> /替换=“Leu”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(16)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 85
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 86
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 87
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 88
Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 89
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1 5
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 90
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 91
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 92
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 93
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 94
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360
gtgtccagc 369
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 95
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 96
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 97
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 98
Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 99
Asp Val Ser
1
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 100
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 101
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 102
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 102
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 103
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 103
cagagcgcac tgactcagcc ggcatccgtg tccggtagcc ccggacagtc gattaccatc 60
tcctgtaccg gcacctcctc cgacgtggga gggtacaact acgtgtcgtg gtaccagcag 120
cacccaggaa aggcccctaa gttgatgatc tacgatgtgt caaaccgccc gtctggagtc 180
tccaaccggt tctccggctc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat tagcgggctg 240
caagccgagg atgaggccga ctactactgc tcgagctaca catcctcgag caccctctac 300
gtgttcggct cggggactaa ggtcaccgtg ctg 333
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 105
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys
145 150 155 160
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser
180 185 190
Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe
225 230 235 240
Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 106
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 106
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360
gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc 420
gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt 480
accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca 540
ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac 600
cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc 660
gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc 720
ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctg 747
<210> 107
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys
145 150 155 160
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser
180 185 190
Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe
225 230 235 240
Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
305 310 315 320
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
325 330 335
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
340 345 350
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
355 360 365
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
385 390 395 400
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
405 410 415
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
420 425 430
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
435 440 445
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
450 455 460
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 108
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 108
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360
gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc 420
gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt 480
accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca 540
ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac 600
cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc 660
gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc 720
ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctgacc actaccccag caccgaggcc acccaccccg 780
gctcctacca tcgcctccca gcctctgtcc ctgcgtccgg aggcatgtag acccgcagct 840
ggtggggccg tgcatacccg gggtcttgac ttcgcctgcg atatctacat ttgggcccct 900
ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc 960
ggtcggaaga agctgctgta catctttaag caacccttca tgaggcctgt gcagactact 1020
caagaggagg acggctgttc atgccggttc ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg 1080
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctc 1140
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 1200
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 1260
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 1320
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 1380
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 1416
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 109
Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 110
Ser Tyr Lys Gly Ser Asn
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 111
Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 112
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 113
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 113
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360
gtgtcctct 369
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 114
Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg
1 5
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 115
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr Val
1 5 10
<210> 116
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 116
Glu Val Ser
1
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 117
Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr
1 5
<210> 118
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 118
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 119
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 119
cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt 60
tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag 120
catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc 180
tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc 240
caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc cgccctctac 300
gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg 333
<210> 120
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180 185 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 121
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 121
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420
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attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540
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gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg 762
<210> 122
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180 185 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260 265 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275 280 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290 295 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
325 330 335
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
355 360 365
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
370 375 380
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
385 390 395 400
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
405 410 415
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
420 425 430
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
435 440 445
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
450 455 460
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 123
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 123
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720
gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg 780
aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca 840
tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc 900
tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact 960
ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg 1020
cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa 1080
ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag 1140
gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg 1200
gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa 1260
gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt 1320
atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc 1380
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<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 124
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 125
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 125
cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt 60
tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag 120
catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc 180
tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc 240
caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc caccctctac 300
gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg 333
<210> 126
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180 185 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 127
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 127
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720
accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg 762
<210> 128
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180 185 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260 265 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275 280 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290 295 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
325 330 335
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
355 360 365
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
370 375 380
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
385 390 395 400
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
405 410 415
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
420 425 430
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
435 440 445
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
450 455 460
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 129
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 129
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720
accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg 780
aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca 840
tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc 900
tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact 960
ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg 1020
cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa 1080
ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag 1140
gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg 1200
gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa 1260
gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt 1320
atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc 1380
gccaccaagg acacctatga cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg g 1431
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Lys”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(17)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 130
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Glu”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Leu”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换=“Arg”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 131
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Ala”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(11)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 132
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val
1 5 10
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Lys”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(6)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 133
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1 5
<210> 134
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Glu”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 134
Asp Val Ser
1
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Ala”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(8)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 135
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr
1 5
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Lys”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(8)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 136
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 137
Gly Phe Trp Met Ser
1 5
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 138
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 139
Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 140
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
1 5
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 141
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 142
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp
1 5
<210> 143
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 143
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 144
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 145
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 146
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 146
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc 354
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 147
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Asp
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 148
Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
1 5
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 149
Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr
1 5 10
<210> 150
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 150
Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 151
Thr Leu Ser
1
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 152
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile
1 5
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 153
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 154
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 154
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 155
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 155
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc 60
atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac 120
tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cgcctgctga tctataccct gtcataccgg 180
gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa 240
atttcccgag tggaagccga ggacgtcgga ctgtactact gcacccagcg cctcgaattc 300
ccgtcgatta cgtttggaca gggtacccgg cttgagatca ag 342
<210> 156
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser
225 230 235 240
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 157
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 157
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca 600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc 660
cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg 720
attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaag 756
<210> 158
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser
225 230 235 240
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260 265 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275 280 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
325 330 335
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
340 345 350
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
355 360 365
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
370 375 380
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
385 390 395 400
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
405 410 415
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
420 425 430
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
435 440 445
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
450 455 460
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 159
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 159
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca 600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc 660
cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg 720
attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaagacca ctaccccagc accgaggcca 780
cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga 840
cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt 900
tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac 960
tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg 1020
cagactactc aagaggagga cggctgttca tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc 1080
tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc gcagatgctc cagcctacca gcaggggcag 1140
aaccagctct acaacgaact caatcttggt cggagagagg agtacgacgt gctggacaag 1200
cggagaggac gggacccaga aatgggcggg aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc 1260
ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa 1320
ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac ggactgtacc agggactcag caccgccacc 1380
aaggacacct atgacgctct tcacatgcag gccctgccgc ctcgg 1425
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 160
Ser Phe Arg Met Asn
1 5
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 161
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 162
Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 163
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
1 5
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 164
Ser Ser Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 165
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 165
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg
1 5
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 166
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 167
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 168
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 169
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 169
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc 354
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 170
Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 171
Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 172
Arg Ile Gly Phe Pro Ile
1 5
<210> 173
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 174
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 174
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc 60
atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac 120
tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cagctgctga tctataccct gtcattccgg 180
gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa 240
attaggcgag tggaagccga ggacgtcgga gtgtactact gcatgcagcg catcggcttc 300
ccgattacgt ttggacaggg tacccggctt gagatcaag 339
<210> 175
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 175
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 176
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 176
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca 600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg 660
cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt 720
acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aag 753
<210> 177
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
260 265 270
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
275 280 285
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
290 295 300
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
305 310 315 320
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
325 330 335
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
340 345 350
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
385 390 395 400
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
405 410 415
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
420 425 430
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
435 440 445
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
450 455 460
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 178
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 178
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca 600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg 660
cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt 720
acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aagaccacta ccccagcacc gaggccaccc 780
accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc 840
gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg 900
gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt 960
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 1020
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 1080
gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca gatgctccag cctaccagca ggggcagaac 1140
cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 1200
agaggacggg acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg 1260
tacaacgagc tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg 1320
gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag 1380
gacacctatg acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gg 1422
<210> 179
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Arg”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Asn”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(5)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 179
Gly Phe Trp Met Ser
1 5
<210> 180
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换=“Ile”
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> /替换=“Ala”
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> /替换=“Lys”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(17)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 180
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Trp”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(9)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 181
Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Phe”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 182
Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
1 5
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Met”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Ile”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Gly”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(10)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 183
Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr
1 5 10
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 184
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
1 5
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(6)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 185
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换=“Ile”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Gly”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“ ”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 186
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile
1 5
<210> 187
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Arg”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(8)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 187
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp
1 5
<210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> /替换=“Tyr”
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换=“Ile”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(8)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 188
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Trp”
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Ser”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(11)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 189
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 190
<211> 521
<212> DNA
<213> 未知序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“未知序列的描述：PGK启动子序列”
<400> 190
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420
cgcggcgacg caaagggcct tggtgcgggt ctcgtcggcg cagggacgcg tttgggtccc 480
gacggaacct tttccgcgtt ggggttgggg caccataagc t 521
<210> 191
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 191
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g 221
<210> 192
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 192
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300
ttccttggaa gggctgaatc cccg 324
<210> 193
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 193
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420
cg 422
<210> 194
<400> 194
000
<210> 195
<400> 195
000
<210> 196
<400> 196
000
<210> 197
<400> 197
000
<210> 198
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 198
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg 118
<210> 199
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 199
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 200
<400> 200
000
<210> 201
<400> 201
000
<210> 202
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 202
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 203
<400> 203
000
<210> 204
<400> 204
000
<210> 205
<400> 205
000
<210> 206
<400> 206
000
<210> 207
<400> 207
000
<210> 208
<400> 208
000
<210> 209
<400> 209
000
<210> 210
<400> 210
000
<210> 211
<400> 211
000
<210> 212
<400> 212
000
<210> 213
<400> 213
000
<210> 214
<400> 214
000
<210> 215
<400> 215
000
<210> 216
<400> 216
000
<210> 217
<400> 217
000
<210> 218
<400> 218
000
<210> 219
<400> 219
000
<210> 220
<400> 220
000
<210> 221
<400> 221
000
<210> 222
<400> 222
000
<210> 223
<400> 223
000
<210> 224
<400> 224
000
<210> 225
<400> 225
000
<210> 226
<400> 226
000
<210> 227
<400> 227
000
<210> 228
<400> 228
000
<210> 229
<400> 229
000
<210> 230
<400> 230
000
<210> 231
<400> 231
000
<210> 232
<400> 232
000
<210> 233
<400> 233
000
<210> 234
<400> 234
000
<210> 235
<400> 235
000
<210> 236
<400> 236
000
<210> 237
<400> 237
000
<210> 238
<400> 238
000
<210> 239
<400> 239
000
<210> 240
<400> 240
000
<210> 241
<400> 241
000
<210> 242
<400> 242
000
<210> 243
<400> 243
000
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<400> 245
000
<210> 246
<400> 246
000
<210> 247
<400> 247
000
<210> 248
<400> 248
000
<210> 249
<400> 249
000
<210> 250
<400> 250
000
<210> 251
<400> 251
000
<210> 252
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 252
atggccctcc ctgtcaccgc tctgttgctg ccgcttgctc tgctgctcca cgcagcgcga 60
ccg 63
<210> 253
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 253
caggtacaat tgcaggagtc tggaggcggt gtggtgcaac ccggtcgcag cttgcgcctg 60
agttgtgctg cgtctggatt tacattttca tcttacggaa tgcattgggt acgccaggca 120
ccggggaaag gccttgaatg ggtggctgta atttcatacg atggttccaa caaatactat 180
gctgactcag tcaagggtcg atttacaatt agtcgggaca actccaagaa caccctttat 240
cttcaaatga attcccttag agcagaggat acggcggtct attactgtgg tggcagtggt 300
tatgcacttc atgatgatta ctatggcttg gatgtctggg ggcaagggac gcttgtaact 360
gtatcctctg gtggtggtgg tagtggtggg ggaggctccg gcggtggcgg ctctcaatct 420
gctctgactc aaccagcaag cgtatcaggg tcaccgggac agagtattac cataagttgc 480
acggggacct ctagcgatgt aggggggtat aattatgtat cttggtatca acaacacccc 540
gggaaagccc ctaaattgat gatctacgac gtgagcaatc gacctagtgg cgtatcaaat 600
cgcttctctg gtagcaagag tgggaatacg gcgtccctta ctattagcgg attgcaagca 660
gaagatgagg ccgattacta ctgcagctcc tatactagct cttctacatt gtacgtcttt 720
gggagcggaa caaaagtaac agtactc 747
<210> 254
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 254
acaacaacac ctgccccgag accgcctaca ccagccccga ctattgccag ccagcctctg 60
agcctcaggc ctgaggcctg taggcccgca gcgggcggcg cagttcatac acggggcttg 120
gatttcgctt gtgatattta tatttgggct cctttggcgg ggacatgtgg cgtgctgctt 180
ctgtcacttg ttattacact gtactgt 207
<210> 255
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 255
aaacgcgggc gaaaaaaatt gctgtatatt tttaagcagc catttatgag gcccgttcag 60
acgacgcagg aggaggacgg ttgctcttgc aggttcccag aagaggaaga agggggctgt 120
gaattg 126
<210> 256
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 256
cgggttaaat tttcaagatc cgcagacgct ccagcatacc aacagggaca aaaccaactc 60
tataacgagc tgaatcttgg aagaagggag gaatatgatg tgctggataa acggcgcggt 120
agagatccgg agatgggcgg aaaaccaagg cgaaaaaacc ctcaggaggg actctacaac 180
gaactgcaga aagacaaaat ggcggaggct tattccgaaa taggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcgaggga aagggcacga cggactgtat caaggcctct caaccgcgac taaggatacg 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgcct ccgaga 336
<210> 257
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 257
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr
115 120 125
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
165 170 175
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
180 185 190
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
195 200 205
Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
225 230 235 240
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
245 250 255
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 258
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 258
atggccctcc ctgtcaccgc tctgttgctg ccgcttgctc tgctgctcca cgcagcgcga 60
ccgcaggtac aattgcagga gtctggaggc ggtgtggtgc aacccggtcg cagcttgcgc 120
ctgagttgtg ctgcgtctgg atttacattt tcatcttacg gaatgcattg ggtacgccag 180
gcaccgggga aaggccttga atgggtggct gtaatttcat acgatggttc caacaaatac 240
tatgctgact cagtcaaggg tcgatttaca attagtcggg acaactccaa gaacaccctt 300
tatcttcaaa tgaattccct tagagcagag gatacggcgg tctattactg tggtggcagt 360
ggttatgcac ttcatgatga ttactatggc ttggatgtct gggggcaagg gacgcttgta 420
actgtatcct ctggtggtgg tggtagtggt gggggaggct ccggcggtgg cggctctcaa 480
tctgctctga ctcaaccagc aagcgtatca gggtcaccgg gacagagtat taccataagt 540
tgcacgggga cctctagcga tgtagggggg tataattatg tatcttggta tcaacaacac 600
cccgggaaag cccctaaatt gatgatctac gacgtgagca atcgacctag tggcgtatca 660
aatcgcttct ctggtagcaa gagtgggaat acggcgtccc ttactattag cggattgcaa 720
gcagaagatg aggccgatta ctactgcagc tcctatacta gctcttctac attgtacgtc 780
tttgggagcg gaacaaaagt aacagtactc acaacaacac ctgccccgag accgcctaca 840
ccagccccga ctattgccag ccagcctctg agcctcaggc ctgaggcctg taggcccgca 900
gcgggcggcg cagttcatac acggggcttg gatttcgctt gtgatattta tatttgggct 960
cctttggcgg ggacatgtgg cgtgctgctt ctgtcacttg ttattacact gtactgtaaa 1020
cgcgggcgaa aaaaattgct gtatattttt aagcagccat ttatgaggcc cgttcagacg 1080
acgcaggagg aggacggttg ctcttgcagg ttcccagaag aggaagaagg gggctgtgaa 1140
ttgcgggtta aattttcaag atccgcagac gctccagcat accaacaggg acaaaaccaa 1200
ctctataacg agctgaatct tggaagaagg gaggaatatg atgtgctgga taaacggcgc 1260
ggtagagatc cggagatggg cggaaaacca aggcgaaaaa accctcagga gggactctac 1320
aacgaactgc agaaagacaa aatggcggag gcttattccg aaataggcat gaagggcgag 1380
cggaggcgag ggaaagggca cgacggactg tatcaaggcc tctcaaccgc gactaaggat 1440
acgtacgacg ccctgcacat gcaggccctg cctccgaga 1479
<210> 259
<400> 259
000
<210> 260
<400> 260
000
<210> 261
<400> 261
000
<210> 262
<400> 262
000
<210> 263
<400> 263
000
<210> 264
<400> 264
000
<210> 265
<400> 265
000
<210> 266
<400> 266
000
<210> 267
<400> 267
000
<210> 268
<400> 268
000
<210> 269
<400> 269
000
<210> 270
<400> 270
000
<210> 271
<400> 271
000
<210> 272
<400> 272
000
<210> 273
<400> 273
000
<210> 274
<400> 274
000
<210> 275
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 275
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr
35 40 45
Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg
50 55 60
Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile
100 105 110
Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu
115 120 125
Glu Thr Ser Tyr
130
<210> 276
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 276
Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys
1 5 10 15
Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly
20 25 30
Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met
35 40 45
Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln
50 55 60
Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu
85 90 95
Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser
100 105
<210> 277
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 277
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 278
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 278
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 279
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 279
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 280
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 280
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 281
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (78)..(78)
<223> 任何氨基酸
<400> 281
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 282
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 282
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 283
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 283
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 284
<211> 1132
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 284
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 285
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 285
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Met Leu Ser Asn
20 25 30
Ser Asp Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr His Arg Ser Thr Trp Tyr Asp Asp Tyr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Arg Gly Arg Val Ser Ile Asn Val Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Tyr Ser Leu Gln Leu Asn Ala Val Thr Pro Glu Asp Thr Gly Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Gln Asp Gly Asn Ser Trp Ser Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile
180 185 190
Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr
225 230 235 240
Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 286
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 286
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Met Leu Ser Asn
20 25 30
Ser Asp Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr His Arg Ser Thr Trp Tyr Asp Asp Tyr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Arg Gly Arg Val Ser Ile Asn Val Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Tyr Ser Leu Gln Leu Asn Ala Val Thr Pro Glu Asp Thr Gly Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Gln Asp Gly Asn Ser Trp Ser Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 287
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 287
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 288
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 288
Gly Asp Ser Met Leu Ser Asn Ser Asp Thr Trp Asn
1 5 10
<210> 289
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 289
Ser Asn Ser Asp Thr Trp Asn
1 5
<210> 290
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 290
Arg Thr Tyr His Arg Ser Thr Trp Tyr Asp Asp Tyr Ala Ser Ser Val
1 5 10 15
Arg Gly
<210> 291
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 291
Val Arg Leu Gln Asp Gly Asn Ser Trp Ser Asp Ala Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 292
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 292
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 293
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 293
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 294
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 294
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 295
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 295
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 296
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 296
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 297
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 297
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 298
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 299
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 300
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 301
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 301
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
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Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
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Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 302
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 302
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgc 1458
<210> 303
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 303
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 304
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 304
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 305
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 305
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
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cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
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ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
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gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagcc accaccatca tcaccatcac cat 813
<210> 306
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 306
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 307
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 307
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactaccaat catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380
gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440
caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 308
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 308
Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 309
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 309
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile
115 120 125
Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn
130 135 140
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val
145 150 155 160
Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
165 170 175
Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser
180 185 190
Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro
195 200 205
Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala
210 215 220
Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys
225 230 235 240
Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His
245 250 255
Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser
260 265 270
Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly
275 280
<210> 310
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 310
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Lys Ala Glu Met Gly
50 55 60
<210> 311
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 311
Met His Arg Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Arg Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Arg
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Arg Cys His Leu Cys Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Arg Ala Glu Met Gly
50 55 60
<210> 312
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 312
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala Ser
35 40 45
Ala Glu Ala Arg His Ile Lys Ala Glu Met Gly
50 55
<210> 313
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 313
His Arg Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Arg Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Arg Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Arg Cys His Leu Cys Asn Thr Ala Ser
35 40 45
Ala Glu Ala Arg His Ile Arg Ala Glu Met Gly
50 55
<210> 314
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 314
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn
35 40 45
<210> 315
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 315
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly
35
<210> 316
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 316
His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10 15
Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly
20 25 30
<210> 317
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 317
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg
20
<210> 318
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 318
Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly
20 25
<210> 319
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 319
Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10
<210> 320
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 320
Thr Ala Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Lys Ala Glu Met Gly
1 5 10
<210> 321
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 321
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Arg Ala Glu Met Gly
50 55 60
<210> 322
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 322
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Ser Ala Glu Met Gly
50 55 60
<210> 323
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 323
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Met Ala
35 40 45
Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
50 55 60
<210> 324
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 324
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala
35 40 45
Leu Glu
50
<210> 325
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 325
Met His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser
1 5 10 15
Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly
20 25 30
Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
35 40 45
<210> 326
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 326
Met Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10 15
Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu
20 25 30
Glu Lys Met Ala Leu Glu
35
<210> 327
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 327
Met Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Met Ala Leu Glu
1 5 10 15
Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
20 25
<210> 328
<211> 509
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 328
Met Glu Asp Ile Gln Thr Asn Ala Glu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Gln
1 5 10 15
Ser Val Pro Ala Glu Ser Ala Ala Val Leu Asn Asp Tyr Ser Leu Thr
20 25 30
Lys Ser His Glu Met Glu Asn Val Asp Ser Gly Glu Gly Pro Ala Asn
35 40 45
Glu Asp Glu Asp Ile Gly Asp Asp Ser Met Lys Val Lys Asp Glu Tyr
50 55 60
Ser Glu Arg Asp Glu Asn Val Leu Lys Ser Glu Pro Met Gly Asn Ala
65 70 75 80
Glu Glu Pro Glu Ile Pro Tyr Ser Tyr Ser Arg Glu Tyr Asn Glu Tyr
85 90 95
Glu Asn Ile Lys Leu Glu Arg His Val Val Ser Phe Asp Ser Ser Arg
100 105 110
Pro Thr Ser Gly Lys Met Asn Cys Asp Val Cys Gly Leu Ser Cys Ile
115 120 125
Ser Phe Asn Val Leu Met Val His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg
130 135 140
Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn
145 150 155 160
Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys
165 170 175
His Leu Cys Asn Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Asp Ala Leu Thr Gly His
180 185 190
Leu Arg Thr His Ser Val Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Glu Phe Cys Gly
195 200 205
Arg Ser Tyr Lys Gln Arg Ser Ser Leu Glu Glu His Lys Glu Arg Cys
210 215 220
Arg Thr Phe Leu Gln Ser Thr Asp Pro Gly Asp Thr Ala Ser Ala Glu
225 230 235 240
Ala Arg His Ile Lys Ala Glu Met Gly Ser Glu Arg Ala Leu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Leu Ala Ser Asn Val Ala Lys Arg Lys Ser Ser Met Pro Gln
260 265 270
Lys Phe Ile Gly Glu Lys Arg His Cys Phe Asp Val Asn Tyr Asn Ser
275 280 285
Ser Tyr Met Tyr Glu Lys Glu Ser Glu Leu Ile Gln Thr Arg Met Met
290 295 300
Asp Gln Ala Ile Asn Asn Ala Ile Ser Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu
305 310 315 320
Arg Pro Leu Val Gln Thr Pro Pro Ala Pro Thr Ser Glu Met Val Pro
325 330 335
Val Ile Ser Ser Met Tyr Pro Ile Ala Leu Thr Arg Ala Glu Met Ser
340 345 350
Asn Gly Ala Pro Gln Glu Leu Glu Lys Lys Ser Ile His Leu Pro Glu
355 360 365
Lys Ser Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Ser Pro Asn Asn Ser Gly His
370 375 380
Asp Ser Thr Asp Thr Asp Ser Asn His Glu Glu Arg Gln Asn His Ile
385 390 395 400
Tyr Gln Gln Asn His Met Val Leu Ser Arg Ala Arg Asn Gly Met Pro
405 410 415
Leu Leu Lys Glu Val Pro Arg Ser Tyr Glu Leu Leu Lys Pro Pro Pro
420 425 430
Ile Cys Pro Arg Asp Ser Val Lys Val Ile Asn Lys Glu Gly Glu Val
435 440 445
Met Asp Val Tyr Arg Cys Asp His Cys Arg Val Leu Phe Leu Asp Tyr
450 455 460
Val Met Phe Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe
465 470 475 480
Glu Cys Asn Met Cys Gly Tyr Arg Ser His Asp Arg Tyr Glu Phe Ser
485 490 495
Ser His Ile Ala Arg Gly Glu His Arg Ala Leu Leu Lys
500 505
<210> 329
<211> 519
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 329
Met Asp Ala Asp Glu Gly Gln Asp Met Ser Gln Val Ser Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ser Pro Pro Val Ser Asp Thr Pro Asp Glu Gly Asp Glu Pro Met Pro
20 25 30
Ile Pro Glu Asp Leu Ser Thr Thr Ser Gly Gly Gln Gln Ser Ser Lys
35 40 45
Ser Asp Arg Val Val Ala Ser Asn Val Lys Val Glu Thr Gln Ser Asp
50 55 60
Glu Glu Asn Gly Arg Ala Cys Glu Met Asn Gly Glu Glu Cys Ala Glu
65 70 75 80
Asp Leu Arg Met Leu Asp Ala Ser Gly Glu Lys Met Asn Gly Ser His
85 90 95
Arg Asp Gln Gly Ser Ser Ala Leu Ser Gly Val Gly Gly Ile Arg Leu
100 105 110
Pro Asn Gly Lys Leu Lys Cys Asp Ile Cys Gly Ile Ile Cys Ile Gly
115 120 125
Pro Asn Val Leu Met Val His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro
130 135 140
Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu
145 150 155 160
Leu Arg His Ile Lys Leu His Ser Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His
165 170 175
Leu Cys Asn Tyr Ala Cys Arg Arg Arg Asp Ala Leu Thr Gly His Leu
180 185 190
Arg Thr His Ser Val Gly Lys Pro His Lys Cys Gly Tyr Cys Gly Arg
195 200 205
Ser Tyr Lys Gln Arg Ser Ser Leu Glu Glu His Lys Glu Arg Cys His
210 215 220
Asn Tyr Leu Glu Ser Met Gly Leu Pro Gly Thr Leu Tyr Pro Val Ile
225 230 235 240
Lys Glu Glu Thr Asn His Ser Glu Met Ala Glu Asp Leu Cys Lys Ile
245 250 255
Gly Ser Glu Arg Ser Leu Val Leu Asp Arg Leu Ala Ser Asn Val Ala
260 265 270
Lys Arg Lys Ser Ser Met Pro Gln Lys Phe Leu Gly Asp Lys Gly Leu
275 280 285
Ser Asp Thr Pro Tyr Asp Ser Ser Ala Ser Tyr Glu Lys Glu Asn Glu
290 295 300
Met Met Lys Ser His Val Met Asp Gln Ala Ile Asn Asn Ala Ile Asn
305 310 315 320
Tyr Leu Gly Ala Glu Ser Leu Arg Pro Leu Val Gln Thr Pro Pro Gly
325 330 335
Gly Ser Glu Val Val Pro Val Ile Ser Pro Met Tyr Gln Leu His Lys
340 345 350
Pro Leu Ala Glu Gly Thr Pro Arg Ser Asn His Ser Ala Gln Asp Ser
355 360 365
Ala Val Glu Asn Leu Leu Leu Leu Ser Lys Ala Lys Leu Val Pro Ser
370 375 380
Glu Arg Glu Ala Ser Pro Ser Asn Ser Cys Gln Asp Ser Thr Asp Thr
385 390 395 400
Glu Ser Asn Asn Glu Glu Gln Arg Ser Gly Leu Ile Tyr Leu Thr Asn
405 410 415
His Ile Ala Pro His Ala Arg Asn Gly Leu Ser Leu Lys Glu Glu His
420 425 430
Arg Ala Tyr Asp Leu Leu Arg Ala Ala Ser Glu Asn Ser Gln Asp Ala
435 440 445
Leu Arg Val Val Ser Thr Ser Gly Glu Gln Met Lys Val Tyr Lys Cys
450 455 460
Glu His Cys Arg Val Leu Phe Leu Asp His Val Met Tyr Thr Ile His
465 470 475 480
Met Gly Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe Glu Cys Asn Met Cys Gly
485 490 495
Tyr His Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His Ile Thr Arg Gly
500 505 510
Glu His Arg Phe His Met Ser
515
<210> 330
<211> 526
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 330
Met Glu Thr Glu Ala Ile Asp Gly Tyr Ile Thr Cys Asp Asn Glu Leu
1 5 10 15
Ser Pro Glu Arg Glu His Ser Asn Met Ala Ile Asp Leu Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Pro Asn Gly Gln His Ala Ser Pro Ser His Met Thr Ser Thr Asn
35 40 45
Ser Val Lys Leu Glu Met Gln Ser Asp Glu Glu Cys Asp Arg Lys Pro
50 55 60
Leu Ser Arg Glu Asp Glu Ile Arg Gly His Asp Glu Gly Ser Ser Leu
65 70 75 80
Glu Glu Pro Leu Ile Glu Ser Ser Glu Val Ala Asp Asn Arg Lys Val
85 90 95
Gln Glu Leu Gln Gly Glu Gly Gly Ile Arg Leu Pro Asn Gly Lys Leu
100 105 110
Lys Cys Asp Val Cys Gly Met Val Cys Ile Gly Pro Asn Val Leu Met
115 120 125
Val His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln
130 135 140
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
145 150 155 160
Leu His Ser Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys Pro Phe Cys Ser Tyr Ala
165 170 175
Cys Arg Arg Arg Asp Ala Leu Thr Gly His Leu Arg Thr His Ser Val
180 185 190
Gly Lys Pro His Lys Cys Asn Tyr Cys Gly Arg Ser Tyr Lys Gln Arg
195 200 205
Ser Ser Leu Glu Glu His Lys Glu Arg Cys His Asn Tyr Leu Gln Asn
210 215 220
Val Ser Met Glu Ala Ala Gly Gln Val Met Ser His His Val Pro Pro
225 230 235 240
Met Glu Asp Cys Lys Glu Gln Glu Pro Ile Met Asp Asn Asn Ile Ser
245 250 255
Leu Val Pro Phe Glu Arg Pro Ala Val Ile Glu Lys Leu Thr Gly Asn
260 265 270
Met Gly Lys Arg Lys Ser Ser Thr Pro Gln Lys Phe Val Gly Glu Lys
275 280 285
Leu Met Arg Phe Ser Tyr Pro Asp Ile His Phe Asp Met Asn Leu Thr
290 295 300
Tyr Glu Lys Glu Ala Glu Leu Met Gln Ser His Met Met Asp Gln Ala
305 310 315 320
Ile Asn Asn Ala Ile Thr Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu His Pro Leu
325 330 335
Met Gln His Pro Pro Ser Thr Ile Ala Glu Val Ala Pro Val Ile Ser
340 345 350
Ser Ala Tyr Ser Gln Val Tyr His Pro Asn Arg Ile Glu Arg Pro Ile
355 360 365
Ser Arg Glu Thr Ala Asp Ser His Glu Asn Asn Met Asp Gly Pro Ile
370 375 380
Ser Leu Ile Arg Pro Lys Ser Arg Pro Gln Glu Arg Glu Ala Ser Pro
385 390 395 400
Ser Asn Ser Cys Leu Asp Ser Thr Asp Ser Glu Ser Ser His Asp Asp
405 410 415
His Gln Ser Tyr Gln Gly His Pro Ala Leu Asn Pro Lys Arg Lys Gln
420 425 430
Ser Pro Ala Tyr Met Lys Glu Asp Val Lys Ala Leu Asp Thr Thr Lys
435 440 445
Ala Pro Lys Gly Ser Leu Lys Asp Ile Tyr Lys Val Phe Asn Gly Glu
450 455 460
Gly Glu Gln Ile Arg Ala Phe Lys Cys Glu His Cys Arg Val Leu Phe
465 470 475 480
Leu Asp His Val Met Tyr Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Tyr Arg
485 490 495
Asp Pro Leu Glu Cys Asn Ile Cys Gly Tyr Arg Ser Gln Asp Arg Tyr
500 505 510
Glu Phe Ser Ser His Ile Val Arg Gly Glu His Thr Phe His
515 520 525
<210> 331
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 331
Met His Thr Pro Pro Ala Leu Pro Arg Arg Phe Gln Gly Gly Gly Arg
1 5 10 15
Val Arg Thr Pro Gly Ser His Arg Gln Gly Lys Asp Asn Leu Glu Arg
20 25 30
Asp Pro Ser Gly Gly Cys Val Pro Asp Phe Leu Pro Gln Ala Gln Asp
35 40 45
Ser Asn His Phe Ile Met Glu Ser Leu Phe Cys Glu Ser Ser Gly Asp
50 55 60
Ser Ser Leu Glu Lys Glu Phe Leu Gly Ala Pro Val Gly Pro Ser Val
65 70 75 80
Ser Thr Pro Asn Ser Gln His Ser Ser Pro Ser Arg Ser Leu Ser Ala
85 90 95
Asn Ser Ile Lys Val Glu Met Tyr Ser Asp Glu Glu Ser Ser Arg Leu
100 105 110
Leu Gly Pro Asp Glu Arg Leu Leu Glu Lys Asp Asp Ser Val Ile Val
115 120 125
Glu Asp Ser Leu Ser Glu Pro Leu Gly Tyr Cys Asp Gly Ser Gly Pro
130 135 140
Glu Pro His Ser Pro Gly Gly Ile Arg Leu Pro Asn Gly Lys Leu Lys
145 150 155 160
Cys Asp Val Cys Gly Met Val Cys Ile Gly Pro Asn Val Leu Met Val
165 170 175
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln Cys
180 185 190
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
195 200 205
His Ser Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys Pro Phe Cys Asn Tyr Ala Cys
210 215 220
Arg Arg Arg Asp Ala Leu Thr Gly His Leu Arg Thr His Ser Val Ser
225 230 235 240
Ser Pro Thr Val Gly Lys Pro Tyr Lys Cys Asn Tyr Cys Gly Arg Ser
245 250 255
Tyr Lys Gln Gln Ser Thr Leu Glu Glu His Lys Glu Arg Cys His Asn
260 265 270
Tyr Leu Gln Ser Leu Ser Thr Glu Ala Gln Ala Leu Ala Gly Gln Pro
275 280 285
Gly Asp Glu Ile Arg Asp Leu Glu Met Val Pro Asp Ser Met Leu His
290 295 300
Ser Ser Ser Glu Arg Pro Thr Phe Ile Asp Arg Leu Ala Asn Ser Leu
305 310 315 320
Thr Lys Arg Lys Arg Ser Thr Pro Gln Lys Phe Val Gly Glu Lys Gln
325 330 335
Met Arg Phe Ser Leu Ser Asp Leu Pro Tyr Asp Val Asn Ser Gly Gly
340 345 350
Tyr Glu Lys Asp Val Glu Leu Val Ala His His Ser Leu Glu Pro Gly
355 360 365
Phe Gly Ser Ser Leu Ala Phe Val Gly Ala Glu His Leu Arg Pro Leu
370 375 380
Arg Leu Pro Pro Thr Asn Cys Ile Ser Glu Leu Thr Pro Val Ile Ser
385 390 395 400
Ser Val Tyr Thr Gln Met Gln Pro Leu Pro Gly Arg Leu Glu Leu Pro
405 410 415
Gly Ser Arg Glu Ala Gly Glu Gly Pro Glu Asp Leu Ala Asp Gly Gly
420 425 430
Pro Leu Leu Tyr Arg Pro Arg Gly Pro Leu Thr Asp Pro Gly Ala Ser
435 440 445
Pro Ser Asn Gly Cys Gln Asp Ser Thr Asp Thr Glu Ser Asn His Glu
450 455 460
Asp Arg Val Ala Gly Val Val Ser Leu Pro Gln Gly Pro Pro Pro Gln
465 470 475 480
Pro Pro Pro Thr Ile Val Val Gly Arg His Ser Pro Ala Tyr Ala Lys
485 490 495
Glu Asp Pro Lys Pro Gln Glu Gly Leu Leu Arg Gly Thr Pro Gly Pro
500 505 510
Ser Lys Glu Val Leu Arg Val Val Gly Glu Ser Gly Glu Pro Val Lys
515 520 525
Ala Phe Lys Cys Glu His Cys Arg Ile Leu Phe Leu Asp His Val Met
530 535 540
Phe Thr Ile His Met Gly Cys His Gly Phe Arg Asp Pro Phe Glu Cys
545 550 555 560
Asn Ile Cys Gly Tyr His Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Phe Ser Ser His
565 570 575
Ile Val Arg Gly Glu His Lys Val Gly
580 585
<210> 332
<211> 419
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 332
Met Gly Glu Lys Lys Pro Glu Pro Leu Asp Phe Val Lys Asp Phe Gln
1 5 10 15
Glu Tyr Leu Thr Gln Gln Thr His His Val Asn Met Ile Ser Gly Ser
20 25 30
Val Ser Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Leu Gln Gly Ala Gly Thr Asp
35 40 45
Gly Asp Gln Asn Gly Leu Asp His Pro Ser Val Glu Val Ser Leu Asp
50 55 60
Glu Asn Ser Gly Met Leu Val Asp Gly Phe Glu Arg Thr Phe Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Lys Cys Arg Tyr Cys Asn Tyr Ala Ser Lys Gly Thr Ala Arg
85 90 95
Leu Ile Glu His Ile Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro His Arg Cys
100 105 110
His Leu Cys Pro Phe Ala Ser Ala Tyr Glu Arg His Leu Glu Ala His
115 120 125
Met Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Glu Leu Cys Ser
130 135 140
Phe Arg Cys Ser Asp Arg Ser Asn Leu Ser His His Arg Arg Arg Lys
145 150 155 160
His Lys Met Val Pro Ile Lys Gly Thr Arg Ser Ser Leu Ser Ser Lys
165 170 175
Lys Met Trp Gly Val Leu Gln Lys Lys Thr Ser Asn Leu Gly Tyr Ser
180 185 190
Arg Arg Ala Leu Ile Asn Leu Ser Pro Pro Ser Met Val Val Gln Lys
195 200 205
Pro Asp Tyr Leu Asn Asp Phe Thr His Glu Ile Pro Asn Ile Gln Thr
210 215 220
Asp Ser Tyr Glu Ser Met Ala Lys Thr Thr Pro Thr Gly Gly Leu Pro
225 230 235 240
Arg Asp Pro Gln Glu Leu Met Val Asp Asn Pro Leu Asn Gln Leu Ser
245 250 255
Thr Leu Ala Gly Gln Leu Ser Ser Leu Pro Pro Glu Asn Gln Asn Pro
260 265 270
Ala Ser Pro Asp Val Val Pro Cys Pro Asp Glu Lys Pro Phe Met Ile
275 280 285
Gln Gln Pro Ser Thr Gln Ala Val Val Ser Ala Val Ser Ala Ser Ile
290 295 300
Pro Gln Ser Ser Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Arg Pro Ser His Ser
305 310 315 320
Gln Arg Asn Tyr Ser Pro Val Ala Gly Pro Ser Ser Glu Pro Ser Ala
325 330 335
His Thr Ser Thr Pro Ser Ile Gly Asn Ser Gln Pro Ser Thr Pro Ala
340 345 350
Pro Ala Leu Pro Val Gln Asp Pro Gln Leu Leu His His Cys Gln His
355 360 365
Cys Asp Met Tyr Phe Ala Asp Asn Ile Leu Tyr Thr Ile His Met Gly
370 375 380
Cys His Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Gln Cys Asn Ile Cys Gly Cys Lys
385 390 395 400
Cys Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Ala Cys His Phe Ala Arg Gly Gln His
405 410 415
Asn Gln His
<210> 333
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 333
His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10 15
Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr
20 25 30
<210> 334
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 334
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn
35 40 45
<210> 335
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 335
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 336
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 336
Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg
1 5
<210> 337
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 337
His Arg Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Arg Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Arg Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Arg Cys His Leu Cys Asn
35 40 45
<210> 338
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 338
His Arg Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Arg Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Arg Leu
20 25 30
His Thr Gly
35
<210> 339
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 339
Thr Ala Ser Ala Glu Ala Arg His Ile Arg Ala Glu Met Gly
1 5 10
<210> 340
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 340
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
20 25 30
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
35 40 45
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
50 55 60
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
65 70 75 80
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
85 90 95
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
100 105 110
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
115 120 125
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
130 135 140
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
145 150 155 160
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
165 170 175
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
180 185 190
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
195 200 205
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met
210 215 220
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
225 230 235 240
Asp Ala His Arg Leu
245
<210> 341
<211> 735
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 341
tcgttggcac tttccctgac tgccgaccag atggtgtccg cccttctgga cgccgagcct 60
ccaattctgt actcggagta cgatccgact cgcccgttct ccgaagccag catgatgggc 120
ctgttgacta acctggcgga ccgcgagttg gtgcacatga ttaactgggc taagcgggtg 180
ccgggcttcg tggacctgac tctgcacgac caagtgcacc tcctggaatg cgcctggctg 240
gaaatcctca tgatcggcct cgtgtggaga tccatggagc atcccggaaa gctcctgttt 300
gcacccaacc tcctgcttga tcgcaaccag ggaaaatgcg tggaagggat ggtcgagatt 360
ttcgacatgc tgctcgccac ctcttcccgg ttccggatga tgaatctgca gggagaagag 420
ttcgtgtgtc tgaagtcaat catcctgctg aactccgggg tctatacctt cctgagctcg 480
accctcaagt cactggagga aaaagaccac atccatcgcg tgctcgataa gatcaccgac 540
acccttatcc atctcatggc gaaggctgga ctgaccctgc aacagcagca ccagaggctg 600
gcccagttgc tgctgattct gagccacatc cggcacatgt cgaacaaggg gatggaacac 660
ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtcgtg cctctgtacg atctgctcct ggaaatgctg 720
gacgcgcaca gactc 735
<210> 342
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 342
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
20 25 30
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
35 40 45
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
50 55 60
Asp Leu Ala Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Met
65 70 75 80
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
85 90 95
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
100 105 110
Cys Val Glu Gly Gly Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
115 120 125
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
130 135 140
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
145 150 155 160
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
165 170 175
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
180 185 190
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
195 200 205
His Ile Arg His Met Ser Ser Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met
210 215 220
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Ser Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
225 230 235 240
Asp Ala His Arg Leu
245
<210> 343
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 343
tcgttggcac tttccctgac tgccgaccag atggtgtccg cccttctgga cgccgagcct 60
ccaattctgt actcggagta cgatccgact cgcccgttct ccgaagccag catgatgggc 120
ctgttgacta acctggcgga ccgcgagttg gtgcacatga ttaactgggc taagcgggtg 180
ccgggcttcg tggacctggc cctgcacgac caagtgcacc tcctggaatg cgcctggatg 240
gaaatcctca tgatcggcct cgtgtggaga tccatggagc atcccggaaa gctcctgttt 300
gcacccaacc tcctgcttga tcgcaaccag ggaaaatgcg tggaaggggg tgtcgagatt 360
ttcgacatgc tgctcgccac ctcttcccgg ttccggatga tgaatctgca gggagaagag 420
ttcgtgtgtc tgaagtcaat catcctgctg aactccgggg tctatacctt cctgagctcg 480
accctcaagt cactggagga aaaagaccac atccatcgcg tgctcgataa gatcaccgac 540
acccttatcc atctcatggc gaaggctgga ctgaccctgc aacagcagca ccagaggctg 600
gcccagttgc tgctgattct gagccacatc cggcacatgt cgtccaagag gatggaacac 660
ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtcgtg cctctgtccg atctgctcct ggaaatgctg 720
gacgcgcaca gactc 735
<210> 344
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 344
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
20 25 30
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
35 40 45
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
50 55 60
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Met
65 70 75 80
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
130 135 140
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
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Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
165 170 175
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
180 185 190
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
195 200 205
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met
210 215 220
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Ser Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
225 230 235 240
Asp Ala His Arg Leu
245
<210> 345
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 345
tcgttggcac tttccctgac tgccgaccag atggtgtccg cccttctgga cgccgagcct 60
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ctgttgacta acctggcgga ccgcgagttg gtgcacatga ttaactgggc taagcgggtg 180
ccgggcttcg tggacctgac cctgcacgac caagtgcacc tcctggaatg cgcctggatg 240
gaaatcctca tgatcggcct cgtgtggaga tccatggagc atcccggaaa gctcctgttt 300
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ttcgacatgc tgctcgccac ctcttcccgg ttccggatga tgaatctgca gggagaagag 420
ttcgtgtgtc tgaagtcaat catcctgctg aactccgggg tctatacctt cctgagctcg 480
accctcaagt cactggagga aaaagaccac atccatcgcg tgctcgataa gatcaccgac 540
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ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtcgtg cctctgtccg atctgctcct ggaaatgctg 720
gacgcgcaca gactc 735
<210> 346
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 346
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
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Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
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Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
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100 105
<210> 347
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 347
Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Tyr Val Ile Gly Met Glu
1 5 10 15
Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys Arg
20 25 30
Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu Ser
35 40 45
Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser Gln
50 55 60
Pro Ser Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu Ala
65 70 75 80
Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly Gly
85 90 95
Arg Val Ile Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu Thr
100 105 110
His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr Glu
115 120 125
Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp Ala
130 135 140
Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg
145 150 155
<210> 348
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换=“Arg”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(4)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 348
Arg Xaa Lys Arg
1
<210> 349
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (2)..(4)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Arg”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(6)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 349
Arg Xaa Xaa Xaa Lys Arg
1 5
<210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 350
Arg Arg Xaa
1
<210> 351
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(5)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 351
Ile Glu Pro Asp Xaa
1 5
<210> 352
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换=“Asp”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(4)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 352
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 353
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 354
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 354
Pro Gly Ala Ala His Tyr
1 5
<210> 355
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> /替换=“Ala”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(5)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 355
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 356
Leu Glu Val Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 357
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 357
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 358
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 358
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 359
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换=“Gly”或“Ser”或“Val”
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(2)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于变体位置注释中的那些残基没有偏好”
<400> 359
Ala Xaa
1
<210> 360
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 360
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn
35 40 45
<210> 361
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 361
Met His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys
20 25 30
Leu His Thr Gly
35
<210> 362
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 362
Met His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser
1 5 10 15
Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly
20 25 30
<210> 363
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 363
Met His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser
1 5 10 15
Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr
20 25 30
<210> 364
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 364
Met Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10 15
Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg
20
<210> 365
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 365
Met Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly
1 5 10 15
Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly
20 25
<210> 366
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 366
Met Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10
<210> 367
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 367
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala Ser
35 40 45
Ala Glu Ala Arg His Ile Arg Ala Glu Met Gly
50 55
<210> 368
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 368
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Met Ala Leu
35 40 45
Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
50 55
<210> 369
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 369
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu
35 40 45
Glu
<210> 370
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 370
His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe
1 5 10 15
Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu His Thr Gly Met
20 25 30
Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
35 40 45
<210> 371
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 371
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Thr
1 5 10 15
Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
20 25 30
Lys Met Ala Leu Glu
35
<210> 372
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 372
Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys Gly Ala Ser Phe Met Ala Leu Glu Lys
1 5 10 15
Met Ala Leu Glu Lys Met Ala Leu Glu
20 25
<210> 373
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 373
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn
35 40 45
<210> 374
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 374
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asn Thr Ala Ser
35 40 45
Ala Glu Ala Arg His Ile Ser Ala Glu Met Gly
50 55
<210> 375
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 375
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Ser Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys Pro Phe Cys Ser Ala Gly Gln
35 40 45
Val Met Ser His His Val Pro Pro Met Glu Asp
50 55
<210> 376
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 376
His Lys Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro Phe His Cys Asn Gln Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ser Phe Thr Gln Lys Gly Asn Leu Leu Arg His Ile Lys Leu
20 25 30
His Ser Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys Pro Phe Cys Ser
35 40 45
<210> 377
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 377
Ala Gly Gln Val Met Ser His His Val Pro Pro Met Glu Asp
1 5 10
<210> 378
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 378
Arg Thr Lys Arg
1
<210> 379
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 379
Gly Thr Gly Ala Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Val Gly
20
<210> 380
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 380
ggaaccggcg cggaagaccc ccggccctcc aggaagcgaa ggtccctcgg agacgtgggt 60
<210> 381
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 381
Gly Thr Gly Ala Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg
1 5 10
<210> 382
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 382
ggaaccggcg cggaagaccc ccggccctcc aggaagcgaa gg 42
<210> 383
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 383
Leu Gln Trp Leu Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg
1 5 10 15
<210> 384
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 384
ctgcaatggc tggagcagca ggtggcgaag cggagaacta agcgg 45
<210> 385
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 385
Gly Thr Gly Ala Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 386
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 386
ggcacaggtg ccgaggaccc tcggccaagc cgcaaaagga ggtcacttgg cggc 54
<210> 387
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 387
Gly Thr Gly Ala Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 388
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 388
ggaaccggag cagaagatcc cagaccaagc cggaaaaggc ggtccctggg t 51
<210> 389
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 389
Ser Leu Asn Leu Thr Glu Ser His Asn Ser Arg Lys Lys Arg
1 5 10
<210> 390
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 390
agtctcaatt tgactgagtc acacaattcc aggaagaaaa gg 42
<210> 391
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 391
Cys Lys Ile Asn Gly Tyr Pro Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg
1 5 10
<210> 392
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 392
tgcaagatca acggctaccc taagaggggc agaaagcggc gg 42
<210> 393
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 393
cgtactaaaa ga 12
<210> 394
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 394
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 395
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 395
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 396
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 396
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccc 66
<210> 397
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 397
gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60
ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120
ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180
aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240
gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300
ggcaccaagc tcgagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360
ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420
tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480
cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctctga gactacttac 540
taccaatcat ccctcaagtc acgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600
tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660
tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720
tccagcacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 780
cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 840
ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 900
ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 960
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1020
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 1080
gcagatgctc cagcctacaa gcaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 1140
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 1200
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 1260
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1320
ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1380
gccctgccgc ctcgg 1395
<210> 398
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 398
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc agagactact 600
tactaccaat catccctcaa gtctcgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380
gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440
caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 399
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 399
gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60
ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120
ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180
aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240
gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300
ggcaccaagc tcgagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360
ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420
tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480
cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctcaga gactacttac 540
taccaatcat ccctcaagtc tcgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600
tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660
tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720
tccagcacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 780
cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 840
ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 900
ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 960
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1020
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 1080
gcagatgctc cagcctacaa gcaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 1140
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 1200
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 1260
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1320
ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1380
gccctgccgc ctcgg 1395
<210> 400
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 400
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 401
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 401
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
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130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
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Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 402
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 402
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactaccaat catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta ccagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380
gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440
caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 403
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 403
gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60
ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120
ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180
aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240
gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300
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ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420
tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480
cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctctga gactacttac 540
taccaatcat ccctcaagtc acgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600
tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660
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tccagcacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 780
cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 840
ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 900
ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 960
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1020
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gcagatgctc cagcctacca gcaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 1140
cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 1200
aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 1260
gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1320
ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1380
gccctgccgc ctcgg 1395
<210> 404
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 404
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
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ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
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agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc agagactact 600
tactaccaat catccctcaa gtctcgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
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cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
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caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 405
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 405
gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60
ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120
ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180
aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240
gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300
ggcaccaagc tcgagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360
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tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480
cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctcaga gactacttac 540
taccaatcat ccctcaagtc tcgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600
tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660
tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720
tccagcacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 780
cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 840
ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 900
ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 960
atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1020
tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 1080
gcagatgctc cagcctacca gcaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 1140
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gccctgccgc ctcgg 1395
<210> 406
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 406
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
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tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
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gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900
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<210> 407
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 407
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
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Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
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Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
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Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu
260 265 270
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
275 280 285
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
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465 470 475 480
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485
<210> 408
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 408
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc a 801
<210> 409
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 409
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
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<210> 410
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 410
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
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gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
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<210> 411
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 411
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
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Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
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Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
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Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro
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Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
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Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
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Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
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Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 412
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 413
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<210> 414
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 414
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<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 415
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
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Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
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<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 416
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 417
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 418
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
420 425 430
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 420
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735

Claims (113)

1.一种制备细胞(例如T细胞)群体的方法，所述细胞群体包含：
编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或
编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子，
所述方法包括：
(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；
(ii)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及
(iii)收获所述细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时进行，
(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行，例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，或
(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；
任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用包含所述第一或第二核酸分子的病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂不包含珠；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂和所述刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的细胞的百分比，例如，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比增加例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；
(c)所述细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比在步骤(ii)的持续时间期间增加，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间增加例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比不降低，或降低不超过5％或10％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中
(a)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)；
(b)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)；
(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)；
(d)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)；
(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)；或
(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；
(c)包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+细胞的百分比在步骤(ii)的持续时间期间降低，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间降低例如至少8％、10％、12％、14％、16％、18％、或20％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比不增加或增加不超过5％或10％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中
(a)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)；
(b)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)；
(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％或40％更低)；
(d)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)；
(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)；或
(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％或40％更低)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中
(a)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比增加；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比增加；
(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；或
(d)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；
(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；或
(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；
(b)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与以下的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比更低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％、或300％)：
通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或
通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；
(c)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；
(d)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与以下的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比更低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)：
通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或
通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；
(e)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；
(f)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与以下的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比更低(例如，至少低约50％、100％、或125％)：
通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或
通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；
(g)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；
(h)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与以下的中位数基因集评分(向上缺氧)相比更低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)：
通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或
通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；
(j)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％；或
(k)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与以下的中位数基因集评分(向上自噬)相比更低(例如，至少低约20％、30％、或40％)：
通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或
通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中例如，如使用实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CCAR或CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个包含所述第一或第二核酸分子的活细胞的剂量)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))，以及
(v)从新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))，以及
(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括步骤(vi)：
将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR(例如CCAR)表达水平(例如测量所述部分中活的表达CAR的细胞(例如表达CCAR的细胞)的百分比)，任选地其中：
步骤(iii)包括收获和冷冻所述细胞(例如T细胞)群体，并且步骤(vi)包括将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分解冻，将所述部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR(例如CCAR)表达水平(例如测量所述部分中活的表达CAR的细胞(例如表达CCAR的细胞)的百分比)。
22.一种制备细胞(例如T细胞)群体的方法，所述细胞群体包含：
编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或
编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子，
所述方法包括：
(1)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与细胞因子接触，所述细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合；
(2)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及
(3)收获所述细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行或在步骤(1)开始后不晚于5小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行，并且
步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时进行，或
(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；
任选地其中步骤(2)中的所述第一或第二核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用包含所述第一或第二核酸分子的病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体。
23.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-2接触。
24.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7接触。
25.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
26.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-21接触。
27.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。
28.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
29.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7和IL-21接触。
30.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))和IL-21接触。
31.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-7、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、和IL-21接触。
32.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)和IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))接触。
33.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL-2和IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)接触。
34.如权利要求22-33中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括使细胞群体与例如抗CD3抗体接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在包含所述第一或第二核酸分子的细胞中更高百分比的初始细胞(例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)。
35.如权利要求22-34中任一项所述的方法，其中来自步骤(3)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比：
(a)与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％，或
(b)如与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比增加，例如增加至少10％或20％。
36.如权利要求22-35中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。
37.如权利要求22-36中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。
38.如权利要求22-37中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
39.如权利要求22-38中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
40.如权利要求22-39中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(3)细胞群体中的活细胞数目较步骤(1)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
41.如权利要求22-40中任一项所述的方法，其中与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
42.如权利要求22-41中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时，例如不超过1小时或1.5小时。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂，任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。
44.如权利要求22-43中任一项所述的方法，其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含：
不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清，任选地其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含约2％血清、或
LSD1抑制剂或MALT1抑制剂。
45.如权利要求22-44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于50％、60％、或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))的细胞培养基中进行。
49.如权利要求48所述的方法，其中例如10、15、20、或25天后，IL-15增加所述细胞群体扩增的能力。
50.如权利要求48所述的方法，其中IL-15增加所述细胞群体中表达IL6Rβ的细胞的百分比。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述CCAR或CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和/或细胞内信号传导结构域。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述抗原结合结构域与选自以下的抗原结合：CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL或scFv序列，任选地其中：
(a)所述抗原结合结构域与BCMA结合，并且包含表3-15中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；
(b)所述抗原结合结构域与CD19结合，并且包含表2中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；
(c)所述抗原结合结构域与CD20结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；或
(d)所述抗原结合结构域与CD22结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。
54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VH和VL通过接头连接，任选地其中所述接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。
55.如权利要求51-54中任一项所述的方法，其中
(a)所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域；
(b)所述跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域；
(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(d)所述第一或第二核酸分子包含编码所述跨膜结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
56.如权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接，任选地其中：
(a)所述铰链区包含SEQ ID NO:2、3、或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(b)所述第一或第二核酸分子包含编码所述铰链区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
57.如权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，任选地其中所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、或CD66d的功能性信号传导结构域，任选地其中：
(a)所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ的功能性信号传导结构域；
(b)所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(c)所述第一或第二核酸分子包含编码所述初级信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
58.如权利要求51-57中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，任选地其中所述共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB、或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域，任选地其中：
(a)所述共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域；
(b)所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或
(c)所述第一或第二核酸分子包含编码所述共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。
59.如权利要求51-58中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域和源自CD3ζ的功能性信号传导结构域，任选地其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列)，任选地其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。
60.如权利要求51-59中任一项所述的方法，其中所述CCAR或CAR进一步包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的前导序列。
61.一种细胞群体，所述细胞群体包含通过如权利要求1-60中任一项所述的方法制备的第一或第二核酸分子(例如，包含所述第一或第二核酸分子的自体或同种异体T细胞或NK细胞)。
62.一种细胞群体，所述细胞群体经工程化以包含：
编码CCAR的第一核酸分子，或
编码CAR和调节分子的第二核酸分子，
所述群体包含：
(a)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，约相同百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+ T细胞；
(b)例如，如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+ T细胞；
(c)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，百分比增加的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RO-CCR7+ T细胞，例如增加至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；
(d)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，约相同百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞；
(e)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％内的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞；
(f)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，百分比降低的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞，例如降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；
(g)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，约相同百分比的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞；
(h)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，变化在约5％至约10％的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞；或
(i)如与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，百分比增加的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞。
63.一种细胞群体，所述细胞群体经工程化以包含：
编码CCAR的第一核酸分子，或
编码CAR和调节分子的第二核酸分子，
其中：
(a)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的相同细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；
(b)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；
(c)所述细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；
(d)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；或
(e)所述细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与经工程化以包含所述第一或第二核酸分子之前的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％。
64.如权利要求1-60中任一项所述的方法或如权利要求61-63中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包含编码CCAR的第一核酸分子。
65.如权利要求64所述的方法或如权利要求64所述的细胞群体，其中所述CCAR是融合多肽，所述融合多肽包含降解多肽(例如，本文披露的降解多肽)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)。
66.如权利要求65所述的方法或如权利要求65所述的细胞群体，其中
(i)所述降解多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:310-315、320-324、337-339、360-361、367-369和374(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)，任选地其中所述降解多肽包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β转角，任选地其中所述降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β发夹或β链；
(iii)所述降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的α螺旋；
(iv)所述降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋；
(v)所述降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋，任选地其中所述β发夹和所述第二α螺旋通过不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开；
(vi)所述降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基；
(vii)所述降解多肽包含IKZF1或IKZF3(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸、或至少95个氨基酸；
(viii)在不存在COF1或COF2，例如免疫调节酰亚胺药物(IMiD)，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽与小脑蛋白(CRBN)的关联度不超过在存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、或20％；
(ix)在不存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的泛素化不超过在存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；
(x)在不存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的降解不超过在存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；和/或
(xi)与在不存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的表达水平相比，在存在COF1或COF2，例如IMiD，例如来那度胺、泊马度胺或沙利度胺的情况下，所述融合多肽的表达水平降低，例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、或99％。
67.如权利要求65所述的方法或如权利要求65所述的细胞群体，其中
(i)所述降解多肽包含选自由SEQ ID NO:375-377(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)组成的组的氨基酸序列或由其组成，任选地其中所述降解多肽包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β转角，任选地其中所述降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的β发夹或β链；
(iii)所述降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的α螺旋；
(iv)所述降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链以及第一α螺旋；
(v)所述降解多肽从N-末端至C-末端包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的第一β链、β发夹、第二β链、第一α螺旋以及第二α螺旋，任选地其中所述β发夹和所述第二α螺旋通过不超过60、50、40或30个氨基酸残基分开；
(vi)所述降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的约10至约95个氨基酸残基、约15至约90个氨基酸残基、约20至约85个氨基酸残基、约25至约80个氨基酸残基、约30至约75个氨基酸残基、约35至约70个氨基酸残基、约40至约65个氨基酸残基、约45至约65个氨基酸残基、约50至约65个氨基酸残基、或约55至约65个氨基酸残基；
(vii)所述降解多肽包含IKZF2(或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列)的至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少80个氨基酸、至少85个氨基酸、至少90个氨基酸、至少90个氨基酸、或至少95个氨基酸；
(viii)在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽与小脑蛋白(CRBN)的缔合不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽与CRBN的缔合的例如0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、或20％；
(ix)在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的泛素化不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的泛素化的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；
(x)在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的降解不超过在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的降解的例如0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％；和/或
(viii)与在不存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的表达水平相比，在存在COF3，例如表29中披露的化合物I-112的情况下，所述融合多肽的表达水平降低例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、或99％。
68.如权利要求65-67中任一项所述的方法或如权利要求65-67中任一项所述的细胞群体，其中
(i)所述降解多肽与所述CAR多肽融合；
(ii)所述降解多肽和所述CAR多肽通过肽键连接；
(iii)所述降解多肽和所述CAR多肽通过除肽键以外的键连接；
(iv)所述降解多肽与所述CAR多肽直接连接；
(v)所述降解多肽与所述CAR多肽间接连接；
(vi)所述降解多肽与所述CAR多肽经由接头，例如甘氨酸-丝氨酸接头，例如包含GGGGSGGGGTGGGGSG的氨基酸序列(SEQ ID NO:335)的接头可操作地连接；
(vii)所述降解多肽与所述CAR多肽的C-末端或N-末端连接；或
(viii)所述降解多肽位于所述CAR多肽的中部。
69.如权利要求64所述的方法或如权利要求64所述的细胞群体，其中所述CCAR是包含降解结构域(例如，本文披露的降解结构域)和CAR多肽(例如，本文披露的CAR多肽)的融合多肽，任选地其中所述降解结构域与所述CAR多肽通过异源蛋白酶切割位点分开，任选地其中所述CCAR从N-末端至C-末端包含所述降解结构域、所述异源蛋白酶切割位点以及所述CAR多肽。
70.如权利要求69所述的方法或如权利要求69所述的细胞群体，其中
(i)所述降解结构域具有与所述融合多肽表达的第一水平相关联的第一状态和与所述融合多肽表达的第二水平相关联的第二状态，其中在存在稳定化合物的情况下，所述第二水平比所述第一水平增加例如，至少2、3、4、5、10、20或30倍，任选地其中：
(a)在不存在所述稳定化合物的情况下，所述融合多肽通过细胞降解途径降解，例如，降解至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述融合多肽；
(b)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，在存在所述稳定化合物的情况下，所述降解结构域呈现对细胞降解更具抗性的构象；和/或
(c)相对于在不存在所述稳定化合物的情况下的构象，在存在所述稳定化合物的情况下，所述融合多肽的构象在所述异源蛋白酶切割位点处更容易切割；
(ii)所述降解结构域选自雌激素受体(ER)结构域、FKB蛋白(FKBP)结构域、或二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，任选地其中：
(a)所述降解结构域是雌激素受体(ER)结构域，例如，包含SEQ ID NO:342或344的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中所述稳定化合物是巴多昔芬或4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或其药学上可接受的盐；
(b)所述降解结构域是FKB蛋白(FKBP)结构域，例如，包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中所述稳定化合物是盾护物-1或其药学上可接受的盐；或
(c)所述降解结构域是二氢叶酸还原酶(DHFR)结构域，例如，包含SEQ ID NO:347的氨基酸序列或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的降解结构域，任选地其中所述稳定化合物是甲氧苄啶或其药学上可接受的盐。
71.如权利要求69或70所述的方法或如权利要求69或70所述的细胞群体，其中
(i)所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞内蛋白酶切割，任选地其中：
(a)所述异源蛋白酶切割位点被选自由以下组成的组的蛋白酶切割：弗林蛋白酶、PCSK1、PCSK5、PCSK6、PCSK7、组织蛋白酶B、颗粒酶B、因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1；
(b)所述异源蛋白酶切割位点包含具有选自由以下组成的组的切割基序的序列：RX(K/R)R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:348)、RXXX[KR]R共有基序(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:349)、RRX共有基序(SEQ ID NO:350)、I-E-P-D-X共有基序(SEQ ID NO:351)、Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:352)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:353)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:354)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:355)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:356)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:358)和[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:359)；或
(c)所述异源蛋白酶切割位点包含选自由以下组成的组的弗林蛋白酶切割位点：RTKR(SEQ ID NO:378)；GTGAEDPRPSRKRRSLGDVG(SEQ ID NO:379)；GTGAEDPRPSRKRR(SEQ ID NO:381)；LQWLEQQVAKRRTKR(SEQ ID NO:383)；GTGAEDPRPSRKRRSLGG(SEQ ID NO:385)；GTGAEDPRPSRKRRSLG(SEQ ID NO:387)；SLNLTESHNSRKKR(SEQ ID NO:389)；CKINGYPKRGRKRR(SEQ ID NO:391)；以及SARNRQKR(SEQ ID NO:336)；或
(iii)所述异源蛋白酶切割位点被哺乳动物细胞外蛋白酶切割，任选地其中：
(a)所述异源蛋白酶切割位点被选自由以下组成的组的蛋白酶切割：因子XA、肠激酶、普基酶、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、TEV蛋白酶和弹性蛋白酶1；或
(b)所述异源蛋白酶切割位点包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg(SEQ ID NO:352)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:353)、Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:354)、LPXTG/A共有基序(SEQ ID NO:355)、Leu-Glu-Val-Phe-Gln-Gly-Pro(SEQ ID NO:356)、Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、E-N-L-Y-F-Q-G(SEQ ID NO:358)、以及[AGSV]-X(X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:359)。
72.如权利要求64所述的方法或如权利要求64所述的细胞群体，其中所述CCAR是可调节的CAR(RCAR)(例如，本文披露的RCAR)。
73.如权利要求72所述的方法或如权利要求72所述的细胞群体，其中所述RCAR包含：
(i)细胞内信号传导成员，所述细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；
(ii)抗原结合成员，所述抗原结合成员包含：抗原结合结构域和第二开关结构域；以及
(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将所述跨膜结构域布置在所述细胞内信号传导成员和/或所述抗原结合成员上。
74.如权利要求72所述的方法或如权利要求72所述的细胞群体，其中所述RCAR包含：
(i)细胞内信号传导成员，所述细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；
(ii)抑制性细胞外结构域成员，所述抑制性细胞外结构域成员包含：抑制性细胞外结构域(例如，包含B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA、LAIR1或TGF-β受体的细胞外结构域或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的抑制性细胞外结构域)，和第二开关结构域；以及
(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将所述跨膜结构域布置在所述细胞内信号传导成员和/或所述抑制性细胞外结构域成员上。
75.如权利要求72所述的方法或如权利要求72所述的细胞群体，其中所述RCAR包含：
(i)细胞内信号传导成员，所述细胞内信号传导成员包含：细胞内信号传导结构域，例如，初级细胞内信号传导结构域，和第一开关结构域；
(ii)共刺激细胞外结构域成员，所述共刺激细胞外结构域成员包含：共刺激细胞外结构域(例如，包含ICOS、CD28、VEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226的细胞外结构域或与其具有至少85％、87％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列的共刺激细胞外结构域)，和第二开关结构域；以及
(iii)跨膜结构域，任选地其中可以将所述跨膜结构域布置在所述细胞内信号传导成员和/或所述共刺激细胞外结构域成员上。
76.如权利要求73-75中任一项所述的方法或如权利要求73-75中任一项所述的细胞群体，其中所述第一和第二开关结构域可以形成二聚化开关，例如，在存在二聚化分子的情况下，任选地其中：
(i)所述二聚化开关是细胞内二聚化开关或细胞外二聚化开关；
(ii)所述二聚化开关是同源二聚化开关或异源二聚化开关；
(iii)所述二聚化开关包含基于FKBP-FRB的开关，例如，包含含有FRB结合片段或FKBP的类似物的开关结构域和含有FKBP结合片段或FRB的类似物的开关结构域的二聚化开关，任选地其中所述FKBP结合片段或FRB的类似物包含本文披露的一种或多种突变(例如，选自E2032突变、T2098突变或E2032以及T2098突变的一种或多种突变)，任选地其中所述二聚化分子是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素类似物，例如RAD001；和/或
(iv)所述抗原结合结构域与靶抗原结合，但不促进T细胞的免疫效应子应答，直到存在所述二聚化分子。
77.如权利要求73-76中任一项所述的方法或如权利要求73-76中任一项所述的细胞群体，其中
(i)所述细胞内信号传导成员包含初级细胞内信号传导结构域，例如本文披露的初级细胞内信号传导结构域，例如CD3ζ结构域；
(ii)所述细胞内信号传导成员包含共刺激信号传导结构域，例如本文披露的共刺激信号传导结构域，例如4-1BB结构域或CD28结构域；
(iii)所述抗原结合成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如所述抗原结合成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域；
(iv)所述抑制性细胞外结构域成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如所述抑制性细胞外结构域成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域；和/或
(v)所述共刺激细胞外结构域成员不包含初级细胞内信号传导结构域，例如所述共刺激细胞外结构域成员包含共刺激信号传导结构域并且不包含初级细胞内信号传导结构域。
78.如权利要求1-60中任一项所述的方法或如权利要求61-63中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包含编码CAR和调节分子的第二核酸分子。
79.如权利要求78所述的方法或如权利要求78所述的细胞群体，其中所述第二核酸分子包含编码所述CAR的核酸序列和编码所述调节分子的核酸序列，任选地其中所述编码CAR的核酸序列和所述编码调节分子的核酸序列：
(i)被布置在单个核酸分子上，例如，其中所述编码CAR的核酸序列和所述编码调节分子的核酸序列通过编码自切割位点的核酸序列分开；或
(ii)被布置在分开的核酸分子上。
80.如权利要求78或79所述的方法或如权利要求78或79所述的细胞群体，其中所述调节分子包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含(i)多聚体配体结合区和(ii)半胱天冬酶9分子。
81.如权利要求80所述的方法或如权利要求80所述的细胞群体，其中所述半胱天冬酶9分子是截短的半胱天冬酶9，任选地其中所述半胱天冬酶9分子缺少半胱天冬酶募集结构域。
82.如权利要求80或81所述的方法或如权利要求80或81所述的细胞群体，其中所述多聚体配体结合区选自由以下组成的组：FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、由通过柔性接头结构域串联分开的重链和轻链可变区组成的单链抗体及其突变序列，任选地其中所述多聚体配体结合区是FKBP12区。
83.如权利要求78或79所述的方法或如权利要求78或79所述的细胞群体，其中所述调节分子包含截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。
84.如权利要求83所述的方法或如权利要求83所述的细胞群体，其中所述EGFRt具有以下性质中的1种、2种、3种、4种或所有：
(i)所述EGFRt包含EGFR结构域III和EGFR结构域IV中的一者或两者；
(ii)所述EGFRt不包含以下中的1个、2个、3个或所有：EGFR结构域I、EGFR结构域II、EGFR近膜结构域、以及EGFR酪氨酸激酶结构域；
(iii)所述EGFRt不介导信号传导或运输；
(iv)所述EGFRt不结合内源性EGFR配体，例如表皮生长因子(EGF)；以及
(v)所述EGFRt与抗EGFR抗体分子(例如，西妥昔单抗、马帕木单抗、耐昔妥珠单抗和帕尼单抗)、EGFR特异性siRNA、或靶向EGFR的小分子结合。
85.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求61-84中任一项所述的细胞群体以及药学上可接受的载剂。
86.一种增加受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求61-84中任一项所述的细胞群体或如权利要求85所述的药物组合物，从而增加所述受试者的免疫应答。
87.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求61-84中任一项所述的细胞群体或如权利要求85所述的药物组合物，从而治疗所述受试者的癌症。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述癌症是实体癌，例如选自：间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、食管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑素瘤、肾癌(renal cancer)、肝癌、脑癌、胸腺瘤、肉瘤、癌(carcinoma)、子宫癌、肾癌(kidneycancer)、胃肠癌、尿路上皮癌、咽癌、头颈癌、直肠癌、食道癌、或膀胱癌、或其转移癌中的一种或多种。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述癌症是液体癌，例如选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、滤泡性淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤(黏膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变异、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链疾病、浆细胞性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、结节性边缘区淋巴瘤、小儿结节性边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、或无法分类的淋巴瘤。
90.如权利要求86-89中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
91.如权利要求86-90中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体按基于权利要求21中测量的表达CAR的细胞(例如，表达CCAR的细胞)的百分比确定的剂量施用。
92.如权利要求86-91中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在施用所述细胞群体或所述药物组合物后，
向所述受试者施用有效量的IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112，任选地其中：
a)在施用所述细胞群体或所述药物组合物后，所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用，
任选地其中，所述细胞群体是如权利要求65-68中任一项所述的细胞群体。
93.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
i)使如权利要求65-68中任一项所述的细胞群体与IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112离体接触，任选地其中：
在存在IMiD或化合物I-112的情况下，所述CCAR的表达水平相对于在所述细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之前的所述CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，以及
ii)向所述受试者施用有效量的所述细胞群体，任选地其中所述方法进一步包括在步骤i)之后和在步骤ii)之前：
减少与所述细胞群体接触的，例如所述细胞群体内和/或所述细胞群体周围的IMiD或化合物I-112的量，
从而治疗所述癌症。
94.如权利要求93所述的方法，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)向所述受试者施用有效量的IMiD或化合物I-112，任选地其中施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平相对于在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的所述CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
95.如权利要求94所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)中止施用IMiD或化合物I-112，任选地其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平相对于在步骤iii)之后和在步骤iv)之前的所述CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平恢复至在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)中止施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者的肿瘤复发，或响应于所述受试者的预期复发，和/或
c)中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
96.如权利要求95所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤iii)和/或iv)，
从而治疗所述癌症。
97.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的如权利要求65-68中任一项所述的细胞群体，任选地其中在施用之前，使所述细胞群体与IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112离体接触，任选地其中：
在存在IMiD或化合物I-112的情况下，所述CCAR的表达水平相对于在细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之前的所述CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中在所述细胞群体与IMiD或化合物I-112离体接触之后且在向所述受试者施用所述细胞群体之前，与所述细胞群体接触的，例如在所述细胞群体内和/或在所述细胞群体周围的IMiD或化合物I-112的量减少，
从而治疗所述癌症。
98.如权利要求97所述的方法，其中在施用之前，所述细胞群体不与IMiD或化合物I-112离体接触。
99.如权利要求97或98所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)向所述受试者施用有效量的IMiD或化合物I-112，任选地其中施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前的所述CCAR的表达水平降低例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
100.如权利要求99所述的方法，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)中止施用IMiD或化合物I-112，任选地其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平相对于在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的所述CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平恢复至在步骤i)之后和在步骤ii)之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)中止施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者的肿瘤复发，或响应于所述受试者的预期复发，和/或
c)中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
101.如权利要求100所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iii)之后：
iv)重复步骤ii)和/或iii)，
从而治疗所述癌症。
102.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用有效量的IMiD(例如，沙利度胺及其衍生物，例如来那度胺、泊马度胺和沙利度胺)或化合物I-112，其中所述受试者包含如权利要求65-68中任一项所述的细胞群体，任选地其中施用IMiD或化合物I-112使CCAR的表达水平相对于施用IMiD或化合物I-112之前的所述CCAR的表达水平降低了例如，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)施用IMiD或化合物I-112减少或预防不良作用。
103.如权利要求102所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止施用IMiD或化合物I-112，任选地其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平相对于在步骤ii)之后和在步骤iii)之前的所述CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍(例如，其中中止施用IMiD或化合物I-112使所述CCAR的表达水平恢复至在施用IMiD或化合物I-112之前的表达水平)，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)中止施用IMiD或化合物I-112响应于所述受试者的肿瘤复发，或响应于所述受试者的预期复发，和/或
c)中止施用IMiD或化合物I-112治疗或预防肿瘤复发。
104.如权利要求103所述的方法，所述方法进一步包括在步骤ii)之后：
iii)重复步骤i)和/或ii)，
从而治疗所述癌症。
105.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者施用：
(1)稳定化合物，和
(2)有效量的如权利要求69-71中任一项所述的细胞群体，任选地其中：
在存在所述稳定化合物的情况下的所述CCAR的表达水平比在不存在所述稳定化合物的情况下的所述CCAR的表达水平高例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，
从而治疗所述癌症。
106.如权利要求105所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
ii)中止施用所述稳定化合物，任选地其中中止施用所述稳定化合物使所述CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前的所述CCAR的表达减少例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者应答步骤i)的治疗(例如，所述受试者对所述步骤i)的治疗具有完全响应，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)，和/或
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者对步骤i)的治疗的应答(例如，所述受试者对步骤i)的治疗具有完全应答，所述受试者显示肿瘤团块缩小，所述受试者显示肿瘤细胞减少，或步骤i)的治疗在所述受试者中是有效的)。
107.如权利要求105所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之后：
iii)中止施用所述稳定化合物，任选地其中中止施用所述稳定化合物使所述CCAR的表达水平相对于在步骤i)之后和在步骤ii)之前的所述CCAR的表达减少例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经发展、正在发展或预期发展不良反应，
b)所述稳定化合物的施用的中止响应于所述受试者中不良反应的发生，或响应于所述受试者中不良反应的预期发生，和/或
c)所述稳定化合物的施用的中止减少或预防不良作用。
108.如权利要求106或107所述的方法，所述方法进一步包括在步骤ii)或iii)之后：
iv)施用有效量的稳定化合物，任选地其中施用所述稳定化合物使所述CCAR的表达水平相对于在步骤ii)或iii)之后和在步骤iv)之前的所述CCAR的表达水平增加例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍，任选地其中：
a)所述受试者已经复发、正在复发或预期复发，
b)所述稳定化合物的施用响应于所述受试者的肿瘤复发，或响应于所述受试者的预期复发，和/或
c)所述稳定化合物的施用治疗或预防肿瘤复发。
109.如权利要求108所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iv)之后：
v)重复步骤ii)、iii)、或iv)，
从而治疗所述癌症。
110.如权利要求105-109中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之前：
vi)使所述细胞群体与稳定化合物离体接触，任选地其中在存在所述稳定化合物的情况下的所述CCAR的表达水平比在不存在所述稳定化合物的情况下的所述CCAR的表达水平高例如至少约1.5、2、3、4、5、10、20、30、40或50倍。
111.如权利要求105-109中任一项所述的方法，其中在施用之前，所述细胞群体不与所述稳定化合物离体接触。
112.如权利要求61-84中任一项所述的细胞群体或如权利要求85所述的药物组合物，用于在增加受试者的免疫应答的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述细胞群体或有效量的所述药物组合物。
113.如权利要求61-84中任一项所述的细胞群体或如权利要求85所述的药物组合物，用于在治疗受试者的癌症的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述细胞群体或有效量的所述药物组合物。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AU2017341047A1 (en) 2016-10-07 2019-05-02 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CN116640122A (zh) * 2022-02-16 2023-08-25 苏州国匡医药科技有限公司 Ikzf2降解剂及包含其的药物组合物和用途
CN117881668A (zh) * 2022-08-10 2024-04-12 标新生物医药科技(上海)有限公司 基于异吲哚啉取代戊二酰亚胺骨架的化合物及其应用
CN115044548B (zh) * 2022-08-11 2022-10-25 北京原生元生物科技有限公司 一种无血清培养基及其应用

Family Cites Families (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US46724A (en) 1865-03-07 Improved apparatus for filtering liquids
US2016A (en) 1841-03-26 Mode of constructing fireplaces and chimney-staoks ii
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4433059A (en) 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
EP0090505B1 (en) 1982-03-03 1990-08-08 Genentech, Inc. Human antithrombin iii, dna sequences therefor, expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby, a process for expressing human antithrombin iii, and pharmaceutical compositions comprising it
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JPH021556A (ja) 1988-06-09 1990-01-05 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ハイブリッド抗体及びその作製方法
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5273743A (en) 1990-03-09 1993-12-28 Hybritech Incorporated Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
JP3490437B2 (ja) 1992-01-23 2004-01-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 単量体および二量体抗体フラグメント融合タンパク質
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE165113T1 (de) 1992-05-08 1998-05-15 Creative Biomolecules Inc Mehrwertige chimäre proteine anologe und verfahren zu deren anwendungen
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
ATE427968T1 (de) 1992-08-21 2009-04-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichtkette
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
WO1994007921A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Target binding polypeptide
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
GB9323648D0 (en) 1992-11-23 1994-01-05 Zeneca Ltd Proteins
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
WO1996013583A2 (en) 1994-10-20 1996-05-09 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
ATE274064T1 (de) 1995-05-23 2004-09-15 Morphosys Ag Multimere proteine
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6239259B1 (en) 1996-04-04 2001-05-29 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent and multispecific antigen-binding protein
JP4440344B2 (ja) 1996-08-16 2010-03-24 シェーリング コーポレイション 哺乳動物細胞表面抗原；関連試薬
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
EP0981548A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU736707B2 (en) 1997-06-11 2001-08-02 Anaphore, Inc. Trimerising module
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
AU1102399A (en) 1997-10-21 1999-05-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2
US6670453B2 (en) 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
CA2317727C (en) 1998-01-23 2013-01-08 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Multipurpose antibody derivatives
CA2319236A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Genentech, Inc. Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
CZ121599A3 (cs) 1998-04-09 1999-10-13 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO2000006605A2 (en) 1998-07-28 2000-02-10 Micromet Ag Heterominibodies
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
EP1196186B1 (en) 1999-07-12 2007-10-31 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
ES2302726T3 (es) 2000-02-24 2008-08-01 Invitrogen Corporation Estimulacion y concentracion simultanea de celulas.
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
JP2004511430A (ja) 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20040220388A1 (en) 2000-06-30 2004-11-04 Nico Mertens Novel heterodimeric fusion proteins
CN1461344A (zh) 2000-07-25 2003-12-10 免疫医疗公司 多价靶结合蛋白
KR100870123B1 (ko) 2000-10-20 2008-11-25 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 저분자화 아고니스트 항체
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2002066516A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
AU2002247826A1 (en) 2001-03-13 2002-09-24 University College London Specific binding members
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
EP2277914A3 (en) 2001-08-10 2012-08-08 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
WO2003049684A2 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US8030461B2 (en) 2002-04-15 2011-10-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for constructing scDb libraries
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
EP1618181B1 (en) 2003-04-22 2014-10-15 IBC Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
EP1631588A2 (en) 2003-05-23 2006-03-08 Wyeth Gitr ligand and gitr ligand-related molecules and antibodies and uses thereof
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
WO2005007190A1 (en) 2003-07-11 2005-01-27 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
US7696322B2 (en) 2003-07-28 2010-04-13 Catalent Pharma Solutions, Inc. Fusion antibodies
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1692318A4 (en) 2003-12-02 2008-04-02 Genzyme Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF LUNG CANCER
EP1697748A4 (en) 2003-12-22 2007-07-04 Centocor Inc METHODS FOR GENERATING MULTIMEDIA MOLECULES
GB0329825D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20050266425A1 (en) 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
US8383575B2 (en) 2004-01-30 2013-02-26 Paul Scherrer Institut (DI)barnase-barstar complexes
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
ES2653570T3 (es) 2004-05-27 2018-02-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Células presentadoras de antígeno artificiales novedosas y usos de las mismas
EP1765402A2 (en) 2004-06-04 2007-03-28 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
CN101484182B (zh) 2005-04-06 2014-06-11 Ibc药品公司 由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DE602005018477D1 (de) 2005-08-26 2010-02-04 Pls Design Gmbh Bivalente IgY Antikörperkonstrukte für diagnostische und therapeutische Anwendungen
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
EP1981969A4 (en) 2006-01-19 2009-06-03 Genzyme Corp ANTI-GITRANT ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
BRPI0707824A2 (pt) 2006-02-15 2011-05-10 Imclone Systems Inc proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno
CN103073639A (zh) 2006-03-17 2013-05-01 比奥根艾迪克Ma公司 稳定的多肽组合物
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
US8946391B2 (en) 2006-03-24 2015-02-03 The Regents Of The University Of California Construction of a multivalent scFv through alkyne-azide 1,3-dipolar cycloaddition
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
JP5189082B2 (ja) 2006-05-25 2013-04-24 バイエル・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト 二量体分子複合体
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
SG172698A1 (en) 2006-06-12 2011-07-28 Trubion Pharmaceuticals Inc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US7741446B2 (en) 2006-08-18 2010-06-22 Armagen Technologies, Inc. Fusion antibodies that cross the blood-brain barrier in both directions
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
SG176476A1 (en) 2006-11-02 2011-12-29 Daniel J Capon Hybrid immunoglobulins with moving parts
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CN101801413A (zh) 2007-07-12 2010-08-11 托勒克斯股份有限公司 采用gitr结合分子的联合疗法
CN101952312A (zh) 2007-07-31 2011-01-19 米迪缪尼有限公司 多特异性表位结合蛋白及其应用
JP5485152B2 (ja) 2007-08-15 2014-05-07 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 単一特異性および多特異性抗体ならびに使用方法
EP2215123A1 (en) 2007-11-27 2010-08-11 Ablynx N.V. Immunoglobulin constructs
UY31504A1 (es) 2007-11-30 2009-07-17 Construcciones de union de antigenos
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
CA2729810A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Emergent Product Development Seattle, Llc Tgf-.beta. antagonist multi-target binding proteins
WO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2010-03-18 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
WO2010104949A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-bcma antibodies
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
AU2010289677B2 (en) 2009-09-03 2014-07-31 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-GITR antibodies
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
ES2911246T3 (es) 2009-11-03 2022-05-18 Hope City Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRT) para selección de células T transducidas
CN103124743A (zh) 2009-12-29 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 Ron结合构建物及其使用方法
KR101930964B1 (ko) 2010-04-20 2018-12-19 젠맵 에이/에스 이종이량체 항체 ｆｃ-함유 단백질 및 그의 생산 방법
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP2014500879A (ja) 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
DK3214091T3 (en) 2010-12-09 2019-01-07 Univ Pennsylvania USE OF CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR MODIFIED T CELLS FOR TREATMENT OF CANCER
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2832540C (en) 2011-04-08 2020-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
PE20141045A1 (es) 2011-05-27 2014-09-10 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a bcma (cd269/tnfrsf17)
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
WO2013039954A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
CN104114579B (zh) 2011-10-27 2020-01-24 健玛保 异二聚体蛋白的生成
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013090648A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
ES2774160T3 (es) 2012-02-13 2020-07-17 Seattle Childrens Hospital D/B/A Seattle Childrens Res Institute Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos
EA201491572A1 (ru) 2012-02-22 2014-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Композиции и способы получения устойчивой популяции t-клеток, используемых для лечения злокачественного новообразования
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US10202452B2 (en) 2012-04-20 2019-02-12 Aptevo Research And Development Llc CD3 binding polypeptides
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP3508503B1 (en) 2012-11-01 2022-11-02 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Antibody against cd269 (bcma)
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
US10077315B2 (en) 2013-02-05 2018-09-18 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3 and BCMA
CA2901115A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Heterodimeric conditionally active chimeric antigen receptor and methods of use thereof
EP2958942B1 (en) 2013-02-20 2020-06-03 Novartis AG Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US9394368B2 (en) 2013-02-20 2016-07-19 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor
RU2766120C2 (ru) 2013-02-22 2022-02-08 Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
SG11201509609SA (en) 2013-05-24 2015-12-30 Univ Texas Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
TWI672379B (zh) 2013-12-19 2019-09-21 瑞士商諾華公司 人類間皮素嵌合性抗原受體及其用途
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
KR20220119176A (ko) 2014-02-04 2022-08-26 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
ES2876263T3 (es) 2014-04-07 2021-11-12 Novartis Ag Tratamiento del cáncer usando receptor de antígeno quimérico anti-cd19
CA2945620C (en) 2014-04-14 2022-12-06 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
DK3689899T3 (da) 2014-04-25 2021-11-22 2Seventy Bio Inc Kimære mnd-promotor-antigenreceptorer
JP6817069B2 (ja) 2014-04-25 2021-01-20 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド 養子細胞療法薬を製造するための改善された方法
IL248257B1 (en) 2014-04-30 2024-04-01 Max Delbruck Centrum Fur Molekulare Medizin In Der Helmholtz Gemeinschaft Human antibodies against CD269(BCMA)
JP2017521998A (ja) 2014-05-12 2017-08-10 ヌマブ アクチェンゲゼルシャフト 新規多重特異性分子及びかかる多重特異性分子に基づく新規治療方法
CN111394317A (zh) 2014-06-06 2020-07-10 蓝鸟生物公司 改善的t细胞组合物
AU2015292811B2 (en) 2014-07-21 2019-12-19 Novartis Ag Treatment of cancer using a CLL-1 chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
EP3712171A1 (en) 2014-08-19 2020-09-23 Novartis AG Treatment of cancer using a cd123 chimeric antigen receptor
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EP3227432B1 (en) 2014-12-05 2023-10-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
SI3226897T1 (sl) 2014-12-05 2021-08-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Protitelesa, ki ciljajo na B-celični maturacijski antigen, in postopki uporabe
EA036379B1 (ru) 2014-12-12 2020-11-02 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
EP3234144B1 (en) 2014-12-15 2020-08-26 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
CA3197849A1 (en) 2014-12-29 2016-07-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US10647778B2 (en) 2015-02-09 2020-05-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2016154055A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Bluebird Bio, Inc. Vector formulations
JP6961490B2 (ja) 2015-04-08 2021-11-05 ノバルティス アーゲー Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法
CA2925329C (en) 2015-04-13 2024-01-02 Pfizer Inc. Anti-bcma antibodies, anti-cd3 antibodies and bi-specific antibodies binding to bcma and cd3
KR102349475B1 (ko) 2015-04-13 2022-01-11 화이자 인코포레이티드 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
EP3313872A4 (en) 2015-06-25 2019-03-20 iCell Gene Therapeutics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARS) COMPOSITIONS AND METHOD FOR USE THEREOF
EP3757129A1 (en) 2015-07-10 2020-12-30 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
PT3331910T (pt) 2015-08-03 2020-03-24 Engmab Sarl Anticorpos monoclonais contra o antigénio de maturação de células b (bcma) humano
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
ES2814550T3 (es) 2015-08-17 2021-03-29 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos
JP7082055B2 (ja) 2015-12-22 2022-06-07 ノバルティス アーゲー 抗癌治療における組み合わせ使用のためのメソテリンキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびｐｄ－ｌ１阻害剤に対する抗体
CA3009852A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
AU2017341047A1 (en) 2016-10-07 2019-05-02 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
CN107384963A (zh) * 2017-07-31 2017-11-24 山东兴瑞生物科技有限公司 一种可控型cd20嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법

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