KR100870123B1 - 저분자화 아고니스트 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포표면 분자를 가교하는 것에 의해 세표내에 신호전달하여 아고니스트로서 작용할 수 있는, 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체에 관한 것이다. 이 개변항체는 신호전달의 아고니스트로서 사용할 수 있고, 암, 염증, 호르몬 이상, 혈액질환 등의 다양한 질환의 예방 및/또는 치료제 등으로서 사용한다.

Description

저분자화 아고니스트 항체{DEGRADED AGONIST ANTIBODY}
본 발명은 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체에 관한 것이다. 상기 개변항체는, 세포표면 분자를 가교하는 것에 의해 세포내에 신호를 전달할 수 있는 아고니스트 작용을 갖고 있고, 여러 가지의 의약으로서 유용하다.
일본특허공개 평 9-295999호 공보는, 비장간질세포를 식별할 수 있는 특정의 항체를 개발하는 것을 목표로서 상기 비장간질 세포주를 감작항원으로 하는 모노크로날 항체의 제작을 시험하고, 항원으로서 마우스 Integrin Associated Protein(마우스 IAP)을 인식하는 신규 모노크로날 항체의 취득을 기재하고 있다. 또, 일본특허공개 평 9-295999호 공보는, 모노크로날 항체가 골수계 세포에 아폽토시스를 유발하는 특성을 갖는 것을 개시하고 있다.
WO99/12973은, 인간의 Intergrin Associated Protein(이하, 인간 IAP로 함; J.Cell Biol., 123, 485-496,1993에 아미노산 서열 및 염기 서열이 기재; Journal of Cell Science, 108, 3419-3425,1995)을 항원으로 하는 모노크로날 항체로서, 상기 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포(골수계 세포 및 림프구)에 아폽토시스를 유발시 키는 특성을 갖는 모노크로날 MABL-1항체, MABL-2항체, 이들을 생산하는 하이브리도마, MABL-1(FERM BP-6100) 및 MABL-2(FERM BP-6101)를 기재하고 있다.
일본특허출원 평 11-63557호는 인간 IAP를 항원으로 하는 모노크로날 항체로부터, 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하는 특성을 갖는 단일쇄의 Fv영역을 갖는 단일쇄 Fv를 얻는 것을 개시하고 있다.
그러나, IAP를 항원으로 하는 모노크로날 항체의 투여는, IAP를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하지만, in vitro에서 적혈구의 응집작용도 일으킨다. 이것은 IAP를 항원으로 하는 모노크로날 항체를 다량으로 생체내에 투여한 경우, 적혈구의 응집이라 하는 폐해가 발생할 가능성이 있는 것을 시사하는 것이다.
본 발명자들은, 인간 IAP를 항원으로 하는 모노크로날 항체를 사용하고, 상기의 혈액질환의 치료약 등으로 이용하기 위해서, 예의연구한 결과, 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하는 특성을 갖는 단일쇄의 Fv영역을 갖는 단일쇄 Fv를 얻었다.
한편, 개변항체 특히 저분자화 항체, 예컨대, 단일쇄 Fv는, 그 저분자화에 의해 조직, 종양 등으로의 이행성을 개선하고, 유전자 공학적으로 조제할 목적으로 개발된 것이지만, 최근, 단일쇄 Fv의 다이머, 특히, 이중 특이성[bispecific]의 다이머가 세포 끼리의 가교를 목적으로서 사용되고 있다. 이와 같은 다이머로서는, 대표적으로는 암세포 항원과 NK세포나 호중구 등 숙주세포 항원을 인식하는 단일쇄 Fv의 헤테로 다이머가 알려져 있다(Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998). 이들은 세포간 가교를 유도시키는 것에 의해, 암을 치료하기 위한 보 다 효율적인 개변항체로서, 단일쇄 Fv의 구축기술로부터 작성된 것이다. 이 때문에, 항체 및 그 단편(예컨대, Fab단편 등) 및 이중 특이성의 개변항체, 또는 단일 특이성인 단일쇄 Fv의 다이머이어도 세포간의 가교가 유도된다고 생각되고 있었다.
또, 세포표면 분자를 가교하여, 신호를 전달할 수 있는 모노크로날 항체로서, 예컨대 세포의 분화·증식에 관여하는 EPO수용체에 대한 항체(일본특허공개 2000-95800호 공보), MuSK수용체에 대한 항체(Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997)등이 알려져 있다. 그러나, 저분자화된 개변항체에 관한 보고는 없다.
그래서, 우선 본 발명자들은 상기 MABL-1 및 MABL-2항체로부터 제작된 단일쇄 Fv의 모노머는 세포에 아폽토시스를 유발시키지 않고, 단일쇄 Fv의 다이머가 IAP를 갖는 세포에 대해 아폽토시스를 유도하는 것에 주목하고, 이들이 세포표면 상의 IAP수용체를 가교(2량체화)하는 것에 의해 상기 세포에 신호가 전달되고, 그 결과 아폽토시스가 유도된 것을 밝혀냈다. 즉, 이들은 단일 특이성의 단일쇄 Fv다이머가 세포표면 상의 분자(예컨대, 수용체)를 가교하는 것에 의해, 리간드와 동일하게 신호를 전달하고, 이것에 의해 아고니스트 작용을 나타낼 수 있는 것을 시사하는 것이다.
다음에, 세포간의 가교형성에 주목하였더니, 상기 모노크로날 항체는 적혈구 응집을 일으키지만, 상기 단일쇄 Fv의 다이머는 적혈구 응집을 일으키지 않는 것을 발견했다. 동일한 결과는 단일쇄 2가 항체(2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드)에도 관찰되었다. 즉, 이것은 모노크로날 항체에서는 세포간에 가교가 형성될 가능성이 있는 데 대하여, 단일쇄 Fv다이머 또는 단일쇄 2가 항체 등의 개변항체에서는, 세포표면 상의 분자를 가교하지만, 세포간의 가교를 형성하지 않다는 것을 시사하는 것이다.
본 발명자들은, 이들의 결과로부터, 단일쇄 Fv의 다이머나 단일쇄 2가 항체 등의 개변항체가, 종래 알려졌던 세포간의 가교로의 사용에 한정되지 않고, 동일 세포의 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는, 상기 분자에 대한 리간드(특히, 천연의 리간드의 작용을 모방하는 바와 같은 리간드)로서 특히 적절하다는 것을 처음으로 알아냈다.
또한, 본 발명자는, 항체 분자(whole IgG)를 단일쇄 Fv다이머 또는 단일쇄 2가 항체 등의 개변항체에 의한 것에 의해, 세포간의 가교 등에 의한 부작용을 경감하고, 또 세포표면 상의 분자를 가교하여, 세포에 소망의 작용만을 유발할 수 있는 신규한 의약품을 제공할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다. 또, 본 발명의 개변항체는, TOP, EOP, G-CSF 등의 천연의 리간드 또는 상기 개변항체와 동일한 V영역을 갖는 whole의 항체(IgG)와 비교하여, 현저하게 높은 활성을 갖고 있고, 또 항체 분자에 비해 분자량이 적고, 정상영역을 갖고 있지 않다고 하는 특징으로부터, 조직 이행성이 향상하고 있다고 하는 특징을 갖고 있다.
본 발명의 과제는, 세포표면 분자 또는 세포내의 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 저분자화 아고니스트 개변항체를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은, 세포표면 분자 또는 세포내의 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 바람직하게는 각각 2∼6, 더욱 바람직하게는 각각 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 개변항체에 관한 것이다.
본 명세서에 있어서, 「개변항체」란, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하고, 이들 각 V영역을 직접적 또는 링커 등을 통하여, 공유 결합 및/또는 비공유결합에 의해 결합시킨 임의의 물질을 의미한다. 구체적으로는, 항체의 각 V영역을 펩티드 링커, 화학 가교제 등의 링커로 결합시킨 폴리펩티드 또는 화합물 등이 열거된다. 또, 본 발명의 개변항체에 있어서, 항체 유래의 2개 이상의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 각각, 동일 또는 다른 항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역이어도 좋다.
본 발명의 개변항체는, 바람직하게는 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 트리머, 테트라머 등의 멀티머이거나, 또는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 본 발명의 개변항체가 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 트리머, 테트라머 등의 멀티머인 경우, 동일 쇄상의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 서로 연합하여 1개의 항원결합 부위를 형성하지 않는 것이 바람직하다.
특히, 바람직하게는, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 또는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 상기 개변항체 중에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 바람직하게 는 링커를 통하여 연결되어 있다.
본 명세서에 있어서 「아고니스트 작용」이란, 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해, 세포내에 신호가 전달되어 상기 세포에서 생기는 생물학적 작용을 말하고, 구체적으로는, 아폽토시스 유도, 세포증식 유도, 세포분화 유도, 세포분열 유도, 세포주기 조절작용 등의 작용을 말한다.
본 발명에 있어서, 아고니스트 작용의 ED50 값은, 공지의 아고니스트 작용의 측정법으로부터 구할 수 있다. 구체적으로는, 아고니스트 특이적인 사포사, 세포증식, 세포분화 특이적인 단백질(예컨대, 특이적 항원)의 발현의 검출, 세포주기 특이적인 키나아제 활성의 측정 등이 열거되고, 반응용량 곡선의 최대활성을 100%로 하고, 그 반응율 50%가 되는 용량을 ED 50%값으로 한다.
본 발명의 개변항체는, 상기 개변항체와 동일의 항원결합 영역을 갖는 항체, 즉, 상기 개변항체의 항원결합 영역을 형성하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍과 동일의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍을 갖는 IaG 등의 whole의 항체(이하, 친항체라 함)와 비교하여 동등 이상의 아고니스트 작용(ED 50값)을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, 친항체와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상의 아고니스트 작용(ED 50값)을 나타내는 것이 바람직하다. 또, 표적의 세포표면 분자 또는 세포내 분자에는 결합하지만, 상기 분자에 대한 아고니스트 작용을 실질적으로 갖지 않는 친항체와 동일의 항원결합 영역을 형성하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍을 갖는 개변항체로서, 상기 개변항체는 아고니스트 작용을 갖는 것도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상, 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 화합물이란, 세포표면 분자 또는 세포내 분자에 결합하는 천연의 리간드와 비교하여 동일 이상의 아고니스트 작용(ED 50값)을 나타내고, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 화합물이면 어떤 것이어도 좋고, 상기 분자에 결합하는 천연의 리간드와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상의 아고니스트 작용(ED 50값)을 나타내는 화합물이 바람직하다.
여기서 말한「화합물」이란, 본 발명의 개변항체에 한정되지 않고, whole의 항체, F(ab')2 등, 2개 이상, 바람직하게는 2∼6, 더욱 바람직하게는 2∼4, 특히 바람직하게는 2개의 항원결합 부위를 갖는 것이면 모두 포함된다. 본 발명의 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체 또는 화합물은, 세포간 접착 작용을 실질적으로 갖지 않는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 개변항체의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역이 동일의 모노크로날 항체 유래인 경우, 원래의 모노크로날 항체와 비교하여, 1/10이하의 세포간 접착작용(ED 50값)을 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 세포간 접착작용의 ED 50값이란, 공지의 아고니스트 작용의 측정법으로부터 구할 수 있다. 구체적으로는, 상기 세포표면 분자를 발현하는 세포의 응집작용, 예컨대 적혈구 응집작용의 측정이 열거된다.
본 발명은 상기 개변항체를 코드하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 상기 개변항체를 생산하는 동물세포 또는 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 개변항체의 아고니스트로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 상기 개변항체를 사용하여 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 세포 내에 신호전달을 일으키고, 상기 세포에 아폽토시스 유도, 세포증식 유도, 세포분화 유도, 세포분열 유도, 세포주기 조절작용 등의 아고니스트 작용을 일으키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 상기 개변항체를 유효성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
본 발명은, 상기 개변항체의 의약으로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체의 스크리닝 방법 또는 측정방법으로서, 1) 상기 분자에 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하고, 2) 상기 분자를 발현하고 있는 세포와 상기 개변항체를 접촉시키고, 3) 상기 분자를 가교하는 것에 의해 상기 세포에 발생하는 아고니스트 작용을 측정하는, 공정을 포함하는 스크리닝 방법 또는 측정방법에 관한 것이다. 본 발명의 측정방법은, 본 발명의 개변항체를 의약품으로서 제조하는 경우의 품질관리 등에 사용할 수 있다.
상기 단일쇄 Fv의 다이머는, 비공유 결합에 의한 다이머, 가교기를 통한 공유결합에 의한 다이머, 또 상기 단일쇄 Fv와 결합할 수 있는 가교제(항체, 항체단편, 또는 2가의 개변항체)를 통한 다이머가 포함된다. 다이머를 형성시키는 가교기 는, 펩티드의 가교에 사용되고 있는 공지의 가교기를 사용할 수 있지만, 예컨대, 시스테인잔기에 의한 디술피드가교, 그 외 가교기, 예컨대, C4∼C10 알킬렌(예컨대, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌 및 옥타메틸렌 등) 또는 C4∼C10 알케닐렌(cis/trans-3-부테닐렌, cis/trans-2-펜테닐렌, cis/trans-3-펜테닐렌 및 cis/trans-3-헥세닐렌 등)이다.
또, 단일쇄 Fv와 결합할 수 있는 가교제는, 예컨대, Fv 중에 마음대로 도입할 수 있는 아미노산 서열, 예컨대, FLAG서열 등에 대한 항체 또는 그 단편, 또는 그 항체유래의 개변항체, 예컨대 단일쇄 Fv이다.
본 발명은 또, 세포표면 분자 또는 세포내 분자에 결합하는 제1의 리간드와 제2의 리간드를 투여하고, 또 제1 및 제2의 리간드에 결합하고, 상기 제1 및 제2의 리간드를 가교하는 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는, 세포에 아고니스트 작용을 유도하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 제1 및 제2의 리간드는, 상기 분자에 대한 결합 부위를 1개 갖고, 가교되는 것에 의해 아고니스트 작용을 유도할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 좋으나, 바람직하게는 동일 또는 다른 단일쇄 Fv모노머, 항체 단편 등의 일가의 개변항체이다. 또, 상기 리간드를 가교하는 물질은, 제1의 리간드와 제2의 리간드를 가교하여 세포에 아고니스트 작용을 유도하는 물질이면 어떠한 것이어도 좋으나, 바람직하게는 항체, 항체단편, F(ab)2 또는 2가의 개변항체이다. 여기서, 2가의 항체의 예로서는 F(ab)2, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머이거나, 또는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영 역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드가 열거된다. 본 방법은, 가교되어 신호를 세포에 전달하는 수용체의 탐색으로 유효할 뿐만 아니라, 약제의 타겟 분자로의 DDS으로의 응용도 기대할 수 있고, 부작용의 억제나, 소망의 기대에 소망의 시간 약제의 효력을 발휘시킬 수 있는 약제투여 시스템으로서 유용하다.
본 발명의 개변항체는 또, 항체(예컨대, MABL-1항체, MABL-2항체, 12B5항체, 12E10항체 등)의 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 함유하고, 세포표면 분자 또는 세포내 분자, 예컨대, 단백질(수용체 또는 신호전달에 관여하는 단백질), 또는 상기 단백질 또는 세포막 단백질의 당쇄를 특이적으로 인식하여 상기 분자를 가교하고, 이것에 의해, 세포내에 신호를 전달할 수 있는 것이면 어떤 것이어도 좋고, 또는, 이 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변한 개변항체도 포함된다.
본 발명의 개변항체는, 결합하는 세포표면 분자 또는 세포내 분자, 구체적으로는 개개의 세포표면 분자 또는 세포내 분자의 구조나 작용기 순서 등에 따라서, 단일 특이성(mono-specific)개변항체이어도, 이중 특이성(bi-specific)개변항체 등의 다중 특이성(multi-specific) 개변항체이어도 좋다. 결합하는 분자가 호모다이머화하여 신호가 세포내에 전달되는 수용체 분자(예를 들면, 에리트로포에틴 수용체, 트롬보포에틴 수용체, G-CSF수용체, SCF수용체, EGF수용체, IAP(CD 47) 등)의 경우는, 단일 특이성인 개변항체인 것이 바람직하고, 결합하는 분자가 헤테로다이머화하여 신호가 세포내에 전달되는 수용체 분자(예를 들면, IL-6수용체, LIF수용체, IL-11수용체)의 경우는, 이중 특이성인 개변항체가 바람직하다. 결합하는 분자가 헤테로트리머화하여 신호가 세포내에 전달되는 수용체 분자(예를 들면, IL-2수 용체, CNTF수용체, OSM수용체)의 경우는, 다중 특이성인 개변항체가 바람직하다. 이중 특이성의 단일쇄 Fv다이머의 제조방법은, 예를 들면 WO9413804호 등에 의해 알려져 있다.
본 발명은 또, 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간 항체 유래의 H쇄 V영역 및/또는 인간 항체 유래의 L쇄 V영역인 개변항체에 관한 것이다. 인간 항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 예컨대, WO99/10494호 공보에 기재된 방법과 같이, 인간 신호 항체의 라이브러리를 스크리닝 하는 것에 의해 얻을 수 있다. 또, 트랜스제닉 마우스 등으로부터 제작된 인간 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역도 포함된다.
또한, 본 발명은 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간형화 H쇄 V영역 및/또는 인간형화 L쇄 V영역인 개변항체에 관한 것이다. 상세하게는 인간 모노크로날 항체 L쇄 V영역의 프레임 워크 영역(FR)과 인간 이외의 표유동물(예컨대, 마우스(mouse), 레트(rat), 소, 양, 원숭이 등)의 모노크로날 항체의 L쇄 V영역의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; 이하, CDR이라고 함)을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역 및/또는 인간 모노크로날 항체 H쇄 V영역의 FR과 인간 이외의 포유동물(예컨대, 마우스, 레트, 소, 양, 원숭이 등)모노크로날 항체의 H쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 H쇄 V영역으로부터 구성된다. 이 경우, CDR 및 FR의 아미노산 서열을 일부 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)하여도 좋다.
본 발명은 또, 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이 인간 이외의 동물(예컨대, 마우스, 레트, 소, 양, 원숭이, 닭 등)의 모노크로날 항체 유래의 H 쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역도 포함된다. 이 경우, CDR 및 FR의 아미노산 서열을 일부 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)하여도 좋다.
본 발명은 또, 상기 여러가지의 개변항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터를 제조하는 유전자 공학적 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 숙주는 예컨대, 인간 세포, 마우스 세포 등의 동물세포, 또는 대장균, 고초균, 효모 등의 미생물이다.
본 발명은 또, 상기 숙주를 배양하고, 배양물로부터 개변항체를 채취하는 것을 특징으로 하는, 개변항체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 단일쇄 Fv를 생산하는 숙주 동물세포를 무혈청 배지에 배양하여 상기 배양 중에 단일쇄 Fv를 분비시키고, 상기 배지 중에서 형성된 단일쇄 Fv의 다이머를 함유하는 상기 배지 상청을 정제하는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv의 다이머의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또, 개변항체의 아고니스트로서의 사용에 관한 것이다. 즉, 상기 얻은 개변항체를 유효성분으로서 함유하는 신호전달 아고니스트에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 개변항체는 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하고, 이것에 의해, 신호전달을 유발할 수 있기 때문에, 상기 분자는 리간드와 결합하여, 올리고머화, 예컨대, 2량체화가 촉진되고, 그 결과 신호를 세포내에 전달할 수 있는 분자이면 어떤 것이어도 좋다.
그와 같은 세포표면 분자에는, 예컨대, 호르몬 수용체나 사이토카인 수용체 가 포함된다. 호르몬 수용체에는 예컨대, 에스트로겐 수용체 등이 포함된다. 사이토카인 수용체 등에는, 조혈인자 수용체, 림포카인 수용체, 증식인자 수용체 및 분화억제인자 수용체 등이 포함된다. 하이토카인 수용체의 예로서는, 에리트로포에틴 (EPO)수용체, 토롬보포에틴(TPO)수용체, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)수용체, 매크로파지콜로니 자극인자(M-CSF)수용제, 과립구매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF)수용체, 종양괴사인자(TNF)수용체, 인터로이킨-1(IL-1)수용체, 인터로이킨-2(IL-2)수용체, 인터로이킨-3(IL-3)수용체, 인터로이킨-4(IL-4)수용체, 인터로이킨 -5(IL-5)수용체, 인터로이킨-6(IL-6)수용체, 인터로이킨-7(IL-7)수용체, 인터로이킨-9(IL-9)수용체, 인터로이킨-10(IL-10)수용체, 인터로이킨-11(IL-11)수용체, 인터로이킨-12(IL-12)수용체, 인터로이킨-13(IL-13)수용체, 인터로이킨-15(IL-15)수용체, 인터페론-α(IFN-α)수용체, 인터페론-β(IFN-β)수용체, 인터페론-γ(IFN-γ)수용체, 성장호르몬(GH)수용체, 인슐린수용체, 혈액간세포 증식인자(SCF)수용체, 혈관내 피증식인자(VEGF)수용체, 상피세포 증식인자(EGF)수용체, 신경 성장인자(NGF)수용체, 선유아 세포 증식인자(FGF)수용체, 혈소판 유래 증식인자(PDGF)수용체, 트랜스포밍 증식인자-β(TGF-β)수용체, 백혈구 유주 저지인자(LIF)수용체, 모양체 신경 영양인자(CNTF)수용체, 온코스타틴M(OSM)수용체 및 Notch 패밀리수용체 등을 들 수 있다.
또, 세포내 분자로서는, 예컨대 TAK1과 TAB1이 열거된다. TAK1과 TAB1은, TGF-β의 신호전달 경로에서 작용하고, 헤테로 다이머를 형성하는 것에 의해 맵키나아제(MAPK)를 활성하고, 일련의 신호를 전달한다. 많은 암세포에서는, 그 증식을 억제하는 TGF-β의 수용체에 변이가 있고, TGF-β에 의한, 신호가 전달되지 않는다. 이 때문에, TAK1와 TAB1을 가교하는 것에 의해 신호를 전달할 수 있는 개변항체는, TAK1/TAB1에 결합하여 반발적(agonistic)으로 작용하여 TGF-β신호를 유도할 수 있다. 그와 같은 본 발명의 개변항체는 TGF-β 저항성의 암세포의 증식을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명에 의해 새로운 암의 치료법이 제공된다. 그 외 세포내 분자의 예로서, 세포증식에 작용하는 전사인자 E2F 호모다이머 및 E2F/DP1 헤테로다이머가 열거된다. 이와 같은 분자에 대해서도 본 발명의 개변항체는 아고니스트 작용을 유도할 수 있는 것이고, 세포증식에 관련하는 여러 가지의 질환의 치료에 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 개변항체를 사용하여, 아폽토시스 유도에 관계되는 신호전달에 관련하는 세포내 인자를 가교하여 아고니스트 작용을 유도하고, 암세포 또는 자기면역 질환에 관련되는 세포에 아폽토시스 세포사를 유도할 수 있다.
세포내 분자에 본 발명의 개변항체를 작용시키는 경우, 세포내에 상기 개변항체를 수송하는 수단으로서, 예컨대, 세포막 투과기능을 갖는 펩티드(예컨대, Pegelin 이나 Penetratin 등)를 부가하는 것(Martine Mazel etal., Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anti-cancer Drugs 2001, 12, Dcrossi D, et al., The third helix of the antennapedia homeodomain translocates through biological membranes, J. Biol. Chem. 1994, 269, 10444-10450)에 의해 본 발명의 개변항체를 세포내에 수송시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 아고니스트 개변항체를 유효성분으로서 함유하는 치료약제는 암, 염증, 호르몬 이상, 혈액 질환, 자기면역 질환 등의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
수용체 단백질이 형성할 수 있는 올리고머는, 호모올리고머이어도, 헤테로올리고머이어도 좋고, 다이머, 트리머, 테트라머 등 중 어느 하나의 올리고머이어도 좋다. 예컨대, 에리트로포에틴 수용체, 트롬보포에틴 수용체, G-CSF수용체, SCF수용체, EGF수용체 등은, 호모다이머를 형성하고, IL-6수용체, LIF수용체, IL-II수용체는 헤테로다이머를 형성하고, IL-2수용체, CNTF수용체, OSM수용체는 헤테로트리머를 형성하는 것이 알려져 있다.
본 발명의 개변항체는 모노크로날 항체에서 유래하는 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유한다. 상기 개변항체의 구성으로서는 바람직하게는 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머 또는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드로 할 수 있다. 상기 개변항체 중에 있어서, H쇄 및 L쇄의 V영역은, 1개 이상의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커를 통하여, 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이들의 개변항체는, 모노크로날 항체의 가변영역을 함유하고, 원래의 모노크로날 항체와 동일의 특이성으로 항원에 결합한다.
H쇄 V영역
본 발명에 있어서, 항체에 유래하는 H쇄 V영역에서는, 세포표면 분자 또는 세포내 분자, 예컨대, 단백질(수용체 또는 신호전달에 관여하는 단백질), 또는 상기 단백질 또는 세포막 상의 당쇄를 인식하고, 또한 상기 분자를 가교하여 올리고머화, 예컨대, 2량체화하는 것에 의해, 세포내에 신호를 전달할 수 있는, 항체의 H 쇄 V영역으로서, 포유동물(예컨대, 인간, 마우스, 레트, 소, 양, 원숭이 등)에서 유래하는 H쇄 V영역 또는 상기 H쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 개변한 H쇄 V영역도 본 발명에 있어서의 H쇄 V영역에 포함되지만, 인간 모노크로날 항체 H쇄 V영역의 FR과 마우스 모노크로날 항체의 H쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 H쇄 V영역이 바람직하다. 또, 재조합 기술을 사용하여 작성할 수 있는, 인간 유래의 아미노산 서열을 갖는 H쇄 V영역도 바람직하다. 또 본 발명의 H쇄 V영역에는, 상기 H쇄 V영역의 단편으로서, 항원 결합성을 유지하는 영역도 포함된다.
L쇄 V영역
본 발명에 있어서의 L쇄 V영역에는, 세포표면 분자 또는 세포내 분자, 예컨대, 단백질(수용체 또는 신호전달에 관여하는 단백질), 또는 상기 단백질 또는 세포막 상의 당쇄를 인식하고, 또한 상기 분자를 가교하여 올리고머화, 예컨대, 2량체화 하는 것에 의해, 세포내에 신호를 전달할 수 있는, 항체의 L쇄 V영역으로서, 포유동물(예컨대, 인간, 마우스, 레트, 소, 양, 원숭이 등)에서 유래하는 L쇄 V영역 또는 상기 L쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 개변한 L쇄 V영역도 본 발명에 있어서의 L쇄 V영역에 포함되지만, 인간 모노크로날 항체 L쇄 V영역의 FR과 마우스 모노크로날 항체의 L쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역이 바람직하다. 또, 재조합 기술을 사용하여 작성할 수 있는, 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 갖는 L쇄 V영역도 바람직하다. 또, 본 발명의 L쇄 V영역에는, 상기 L쇄 V영역의 단편으로서, 항원 결합성을 유지하는 영역도 포함된다.
상보성 결정영역(CDR)
L쇄 및 H쇄의 각 V영역은 항원결합 부위를 형성하고, L쇄 및 H쇄 상의 가변 영역은 공통성이 있는 비교적 보존된 4개의 프레임 워크와 3개의 초가변 또는 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다(Kabat, E.A. et al.,「Sequences of Protein of Immunological Interest」 US Dept. Health and Human Services, 1983).
상기 4개의 프레임워크 영역(FR)의 다수의 부분은 β-시트 구조를 형성하고, 그 결과 3개의 CDR은 루프를 형성하고, CDR은 경우에 따라서, β-시트 구조의 일부분을 형성할 수도 있다. 3개의 CDR은 FR에 의하여, 서로 입체적으로 대단히 가까운 위치에 유지되고, 그리고 쌍을 이루는 영역의 3개의 CDR과 함께 항원결합 부위의 형성에 기여한다.
이들의 CDR영역은, 얻어진 항체의 V영역의 아미노산 서열과 이미 알려진 항체의 V영역의 이미 알려진 아미노산 서열을 조합하는 것에 의하여, Kabat, E.A. et al., 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」의 경험칙으로부터 알아낼 수 있다.
단일쇄 Fv
단일쇄 Fv는 모노크로날 항체에 유래하는, 연결된 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드의 모노머이고, 얻어진 단일쇄 Fv는 원래의 모노크로날 항체의 가변 영역을 함유하고, 상보성 결정 영역을 유지하기 위해, 원래의 모노크로날 항체와 동일의 특이성으로 항원에 결합한다(일본특허출원 평 11-63557). 또, 본 발명의 단일쇄 Fv에 있어서, 상기 가변 영역 및/또는 CDR의 일부 또는 그 아미노산 서 열의 일부를 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)할 수 있다. 본 발명의 단일쇄 Fv를 구성하는 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 상술한 것이고, H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 직접 또는 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통하여 연결할 수 있고, 그 구성으로서는 [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역], [L쇄 V영역]-[H쇄 V영역] 중 어느 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서는, 이들 단일쇄 Fv는 다이머, 트리머 또는 테트라머를 형성시키고, 본 발명의 개변항체로 할 수 있다.
단일쇄 개변항체
본 발명의 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역, 바람직하게는 각각 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 단일쇄 개변항체는, 상술한 바와 같은 2개 이상의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 각각 함유한다. 이 폴리펩티드에 있어서 각 영역은 상기 단일쇄 개변항체가 특정의 입체구조, 구체적으로는 단일쇄 Fv의 다이머가 구성하는 입체구조를 모방할 수 있도록 배치시킬 필요가 있고, 예컨대,
[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]
또는
[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]
의 순서로 각 영역이 배치되고, 이들의 영역은 링커를 통하여 연결된다.
링커
본 발명에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커, 예컨대 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시된 링커를 이용할 수 있다. 이들 의 링커는 동일 분자내에서 동일 또는 다르게 있어도 좋다. 펩티드 링커를 소망하는 경우, 각각의 링커의 예로서는:
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n
[n은 1이상의 정수이다]를 들 수 있다. 바람직한 링커 펩티드의 길이는 항원이 되는 수용체에 의하여 달라지지만, 단일쇄 Fv에 있어서는 통상 1∼20아미노산인 것이 바람직하다. 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 개변항체에 있어서는, [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역](또는[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]) 으로 이루어지는 동일의 항원결합 부위를 형성하는 것끼리를 연결하기 위한 펩티드 링커의 길이는 1∼30아미노산, 바람직하게는 2∼12아미노산, 더욱 바람직하게는 3∼18아미노산이다. 또, [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역](또는[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역])으로 이루어지는 동일의 항원결합 부위를 형성하지 않는 것끼리를 연결하기 위한 펩티드 링커의 길이는 1∼40아미노산, 바람직하게는 3∼30아미노산, 더욱 바람직하게는 5∼20아미노산이다. 이들의 링커를 도입하는 방법은 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA의 구축방법의 설명에서 서술한다.
본 발명에 있어서의 화학합성물 링커(화학가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예컨대 N-히드록시 숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜 슈베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)슈베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS), 에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜 숙시네이트)(술포-EGS), 디숙신이미딜 주석산염(DST), 디술포숙신이미딜 주석산염(술포-DST), 비스[2-(숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(BSOCOES), 비스[2-(술포숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(술포-BSOCOES) 등이고, 이들의 가교제는 시판되고 있다. 또, 화학합성물 링커의 길이는, 상술의 펩티드 링커의 길이에 상당하는 길이인 것이 바람직하다.
특히, 단일쇄 Fv의 다이머를 형성시키는 경우, 숙주세포에서 생산된 단일쇄 모노머를 배지 등의 용액 중에서, 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 다이머화하는 데 적당한 링커를 선택하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 2∼12아미노산, 보다 바람직하게는 3∼10아미노산, 또는 이들에 상당하는 그 외 링커가 바람직하다.
개변항체의 제조
개변항체는, 세포표면 분자에 특이적으로 결합하는 이미 알려진 또는 신규한 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 상술의 링커를 통하여 연결하는 것에 의해 얻어진다. 단일쇄 Fv의 예로서, MABL-1항체, MABL-2항체에 유래하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 갖는 것을 MABL1-scFv, MABL2-scFv로 한다. 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드의 예로서는, 상기 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 갖는 것을 MABL1-sc(Fv)2, MABL2-sc(Fv)2로 한다.
이들 폴리펩티드를 제조하는데 있어서, 상기 폴리펩티드가 분비성인 것을 소망하는 경우는, 그 N-말단에 신호 펩티드를 부가할 수 있다. 또, 상기 폴리펩티드의 효율적 정제 등을 위해, 폴리펩티드 정제에 있어서 유용한 공지의 서열, 예컨대, FLAG서열 등을 삽입할 수 있다. 이 경우, 항FLAG항체를 사용하여 다이머 형성시킬 수도 있다.
본 발명의 개변항체를 제작하기 위해서는, 이들을 코드하는 DNA, 즉 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA 또는 재구성 단일쇄 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 필요가 있다. 이들의 DNA는 예컨대, MABL1-scFv, MABL2-scFv, MABL1-sc(Fv)2 및/또는 MABL2-sc(Fv)2의 경우에는 상기 Fv유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 사용하고, 또는 이들의 DNA를 주형으로 하고, 그 서열 내의 소망의 아미노산 서열을 코드하는 DNA부분을, 그 양쪽 말단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)법에 의해 증폭하는 것에 의해 얻을 수 있다.
각 V영역에 있어서, 아미노산 서열의 일부 개변을 소망하는 경우에는, PCR법을 사용하는 공지의 방법에 의하여, 1 또는 여러개의 아미노산이 개변된, 즉 1 또는 여러개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 V영역을 얻을 수 있다. 특정의 항원에 대하여 충분하게 활성이 있는 개변항체를 제작하기 위해, PCR법을 사용하는 공지의 방법에 의하여, 상기 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것이 바람직하다.
PCR에 사용하는 프라이머를 결정하는데 있어서, 소망의 모노크로날 항체 유래의 H쇄 및 L쇄의 타이핑을 하여 양쪽 쇄의 형을 결정할 필요가 있다. MABL-1항체, MABL-2항체의 경우, MABL-1항체는 κ형 L쇄 및 γ1형의 H쇄를 갖고, MABL-2항체는 κ형 L쇄 및 γ2a형의 H쇄를 갖는 것이 명백하게 되어 있다(일본특허출원 평 11-63557호). 상기 MABL-1항체 및/또는 MABL-2항체의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 PCR법을 사용하여 증폭하는 데는 Jones, S.T. et al.,Bio/Technology, 9, 88-89, 1991에 기재되어 있는 프라이머를 사용할 수 있다.
다음에, PCR법을 사용하여, MABL-1항체 및 MABL-2항체의 L쇄 V영역을 증폭하기 위한 5'-말단 올리고뉴클레오티드 프라미어 및 3'-말단 올리고뉴클레오티드 프 라이머를 상술한 바와 같이 결정한다. 동일하게, MABL-1항체의 H쇄 V영역 및 MABL-2항체의 H쇄 V영역의 증폭을 위해, 각각 5'-말단 프라이머 및 3'-말단 프라이머를 결정한다.
그 예로서, 본 발명에 있어서는 5'-말단 프라이머는 그 5'-말단 근방에서 제한효소 Hinf I 절단부위를 제공하는 서열 GANTC를 함유하고, 그리고 3'-말단 프라이머는 그 5'-말단 근방에 제한효소 Xma I 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열 CCCGGG를 함유하는 것을 사용하고 있다. 이들의 제한효소 절단부위는 가변영역을 코드하는 목적의 DNA단편을 클로닝 벡터에서 서브클로닝하기 위해 사용되는 한, 그 외 제한효소 절단부위이어도 좋다.
특히, 설계된 PCR프라이머를 사용하여, MABL-1, MABL-2항체의 각 V영역을 코드하는 cDNA를 그들의 5'- 및 3'-말단에 있어서 적당한 염기 서열을 도입하여, 그들이 발현벡터로 용이하게 삽입되도록, 또한 그들이 상기 발현벡터 중에서 적절하게 기능하도록 하였다.(예컨대, 본 발명에서는 Kozak 서열의 도입에 의해 번역효율을 높일 수 있도록 공부되어 있다). 다음에, 이들의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하여 얻은 MABL-1, MABL-2항체의 각 V영역을, 소망의 인간 C영역을 이미 함유하는 HEF발현벡터(WO92-19759 참조)에 삽입하였다. 클론화된 DNA의 서열결정은 임의의 통상의 방법, 예컨대, 자동 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제작)를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 개변항체에 있어서, 링커, 예컨대 펩티드 링커는 다음과 같이 도입할 수 있다. 즉, 상술의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 위한 프라이머와 일부 상보적 인 서열을 갖고, 또한 상기 링커의 N-말단 또는 C-말단을 코드하도록 프라이머를 설계하고, 이들을 이용하여, PCR을 수행하는 것에 의하여 소정의 아미노산 서열 및 길이를 갖는 펩티드 링커를 코드하는 DNA를 작성할 수 있다. 그리고, 상기 DNA를 통하여 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 연결시키면, 소망의 펩티드 링커를 갖는 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 또, 1개의 개변항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있으면, 상기 DNA를 주형으로 하고, 그리고 여러가지의 링커용의 프라이머를 설계하고, 이들을 사용하여 PCR을 실시시키면, 소망의 펩티드 링커를 갖는 개변항체 또는 링커를 갖지 않는 개변항체를 코드하는 DNA를 용이하게 얻을 수 있다.
또, 본 발명에 있어서의 개변항체의 각쇄 V영역은, 종래의 기술(예컨대, Sato, K.et al.,Cancer Res., 53, 1-6(1993)을 참조할 것)을 사용하는 것에 의하여, 인간형화 하는 것이 가능하고, 또 일단 인간형화된 각쇄 V영역을 코드하는 DNA가 제작되면, 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 단일쇄 Fv단편, 인간형화 모노크로날 항체 또는 인간형화 모노크로날 항체 단편은, 통상의 방법에 따라 용이하게 만드는 일이 가능하다. 또, 필요한 경우, 이들의 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것도 가능하다.
또한, 유전자 공학에 있어서의 관용 기술을 사용하여 상술의 마우스 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA와 동일하게, 이들에 상당하는 그 외 포유동물 유래의 DNA, 예컨대 인간 항체 유래의 각쇄 V영역을 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 얻어진 DNA를 사용하여, 그 외 포유동물, 특히 인간항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역, 인간 유래의 단일쇄 Fv 및 그 단편, 및 인간 유래의 모노크로날 항체 및 그 단편을 얻을 수 있다.
본 발명의 개변항체가, 이종 특이성(bi-specific) 개변항체인 경우, 공지의 방법(예컨대, WO9413804호 공보에 기재된 방법)에 의해 제작할 수 있다.
상기한 바와 같이, 목적으로 하는 개변항체의 각쇄 V영역, 인간형화 개변항체의 각쇄 V영역을 코드하는 DNA가 제작되면, 그들은 함유하는 발현벡터, 및 상기 발현 벡터에 의해, 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라서, 숙주를 배양하고, 생산된 재구성 단일쇄 Fv, 재구성 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 모노크로날 항체 및 인간형화 모노크로날 항체 단편은, 세포내 또는 세포외로부터 분리하여 균일할 때까지 제조할 수 있다. 이 경우, 통상의 단백질에서 사용되는 분리·정제방법, 예컨대, 각종 크로마토그래피, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당선택, 조합시켜, 본 발명의 개변항체를 분리·정제할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
재구성 단일쇄 Fv를 동물세포 예컨대, COS7 세포, CHO세포 등의 동물배양 세포, 바람직하게는 CHO세포에서 생성하는 경우, 무혈청 배지에서 상기 재구성 단일쇄 Fv를 생산시키면, 배지 중에서 형성된 상기 단일쇄 Fv의 다이머를 안정적으로 고수율로 회수·정제할 수 있다. 또한, 이와 같이 하여, 정제된 상기 다이머는 장시간, 안정하여 다이머의 상태로 보존할 수 있다. 이 경우에 사용할 수 있는 무혈청 배지는, 통상 재조합 단백질의 생산에 사용되고 있는 배지이면 어떤 것이어도 좋고, 특히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 개변 항체의 제조를 위해 임의의 발현계, 예컨대, 진핵세포, 예컨대 동물세포, 예컨대 수립된 포유류 세포계, 사상균세포 및 효모세포, 및 원핵세포, 예컨대 세균세포, 예컨대 대장균세포 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 개변항체는 포유류 세포, 예컨대 COS7세포 또는 CHO세포 중에서 발현된다.
이들의 경우, 포유류 세포에서의 발현을 위해, 유용한 상용의 프로모터를 사용할 수 있다. 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus: HCMV)전기(immediate early) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV프로모터를 함유하는 발현벡터의 예로는, HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK 등으로서, PSV2neo에서 유래하는 플라스미드 벡터(국제공개공보 WO92/19759참조)가 포함된다.
또한, 그 외에, 본 발명을 위해 사용할 수 있는 포유동물 세포에 있어서의 유전자 발현의 프로모터로서는 레트로 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터나 인간 폴리펩티드쇄 연신 인자-1α(HEF-1α)등의 포유동물 세포 유래의 프로모터를 사용하면 된다. 예컨대, SV40의 프로모터를 사용하는 경우는, Mulligan, R. C. et al.,의 방법(Nature, 277, 108-114(1979)), 또 HEF-1α프로모터를 사용하는 경우는, Mizushima, S. et al.,의 방법(Nucleic Acids Research, 18, 5322(1990))에 따르면, 용이하게 실시할 수 있다.
복제기원(ori)으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(BPA) 등의 유래의 ori를 사용할 수 있고, 또한 발현벡터는 선택지표로서, 포스포트랜스페라아제(phosphotransferase) APH(3')II 또는 I(neo)유전자, 티미딘키나아제(TK)유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라아제 (Ecogpt)유전자, 디히드로폴산 환원효소(DHFR)유전자 등을 함유할 수 있다.
상술한 바와 같이 작성된 개변항체의 항원 결합 활성은, 방사선 면역 측정법(RIA), 효소표식 고상면역 측정법(ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 기존의 방법으로 측정할 수 있다. 또, 원래의 모노크로날 항체의 결합저해 능력을 지표로하여, 구체적으로는 상기 모노크로날 항체의 그 항원으로의 농도 의존적 저해 작용의 유무를 지표로하여 평가할 수 있다.
상세하게는, 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 포유동물, 예컨대 COS7세포 또는 CHO세포를 배양하고, 상기 배양된 세포 및/또는 그 배양상청, 또는 이들로부터 정제된 개변항체를 사용하여 항원으로의 결합을 측정한다. 대조로서, 발현벡터만으로 형질전환된 세포의 배양 상청 등을 사용한다. 항원, 예컨대 MABL-1항체, MABL-2항체의 경우에는 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포에, 본 발명의 개변항체 등의 시험시료 또는 대조의 배양상청을 부가하고, 예컨대, 유동세포 분석법(flow cytometry)를 실시하여 항원결합 활성을 평가한다.
in vitro에서의 신호 전달 유발 효과(MABL-1항체, MABL-2항체의 경우는 아폽토시스 유도효과)는, 항원을 발현하는 세포 또는 상기 항원 유전자를 도입한 세포에, 상술의 개변항체의 시험시료를 첨가하고, 상기 세포에 있어서 신호전달에 의한 변화(예컨대, 인간 IAP항원 특이적으로 세포사를 유도하는지 안하는지)를 기존의 측정방법으로 평가할 수 있다.
in vivo에서의 평가시험은, 예컨대 개변항체가 인간 IAP를 인식하는 경우(예컨대, MABL-1항체, MABL-2항체 유래의 개변항체), 아폽토시스 유발 효과로서, 다음과 같이 행해진다. 우선 인간 골수종의 모델마우스를 작성하고, 상기 마우스에게 IAP를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체, 본 발명의 개변항체를 정맥 투여한다. 대조군에는 PBS만을 투여한다. 그리고, 아폽토시스 유발을 항종양 효과로서 마우스 혈청 중의 인간 IgG의 양의 변화 및 생존기간에 의하여 평가한다.
상술한 바와 같이, 표적인 세포표면 분자 또는 세포내 분자에 특이적으로 결합하는, H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하고, 예컨대, 상기의 In vitro 또는 In vivo에서의 평가시험에 의해 본 발명의 개변항체를 스크리닝 하는 것에 의하여, 본 발명의 개변항체를 취득할 수 있다.
본 발명의 개변항체는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역 바람직하게는 각각 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 것이고, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 또는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상 L쇄 V영역을 연결한 단일쇄 폴리펩티드이다. 이와 같은 구성을 갖는 것으로, 천연의 리간드의 입체구조를 모방하여, 우수한 항원결합성 및 아고니스트 활성을 유지한다고 생각된다.
본 발명의 개변항체는 항체분자(whole IgG)와 비교하여 현저한 저분자화가 달성되기 때문에, 조직, 종양으로서 이행성이 우수하고, 또한 원래의 아고니스트 항체 분자 보다도 높은 활성을 갖는다. 이 때문에, 본 발명의 개변항체의 친항체를 적당선택하는 것에 의하여, 다양한 신호를 세포내에 전달하고, 상기 세포에 있어서 여러가지의 작용, 예컨대 아폽토시스유도, 세포증식유도, 세포분화유도, 세포분열유도 또는 세포주기 조절작용을 유도하는 것이다. 따라서, 이것을 함유하는 의약제제는, 신호전달의 유발이 질병의 치료에 유효한, 예컨대 암, 염증, 호르몬이상, 자기면역질환 및 백혈명, 악성림프종, 재생불량성빈혈, 골수이형성 증후군 및 진성다혈증 등의 혈액질환의 치료제로서의 이용이 기대된다. 또한, RI표식에 의한 조영제로서의 이용도 기대되고, RI화합물이나 독소 등의 다른 화합물과 결합시키는 것에 의해, 효력을 증강시킬 수도 있다.
도 1은, 인간 IgG 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 결합하지 않는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 2는, 키메라 MABL-1항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 특이적으로 결합하는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 3은, 키메라 MABL-2항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 특이적으로 결합되는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 4는, 본 발명에 따른 단일쇄 Fv의 작성방법을 모식적으로 나타내는 도이다.
도 5는, 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를, 대장균에 발현시키기 위해 사용가능한 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 6은, 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를, 포유동물세포에 발현시키기 위해 사용하는 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 7은, 실시예 5.4에서 얻어진 웨스턴 블러팅의 결과를 나타내는 도이다. 좌측으로부터, 분자량 지표(위로부터 97.4, 66, 45, 31, 21.5, 14.5kDa를 나타냄), pCH01도입 COS7세포 배양상청, pCH0M2도입세포 배양상청. pCH0M2도입세포 배양상청에 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(화살표)가 명백하게 함유되어 있는 것을 나타낸다.
도 8은, 대조로서의 pCHO1/COS7세포 배양상청의 항체는, 대조로서의 pCOS1/ L1210세포에는 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 9는, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청의 항체는, 대조로서의 pCOS1/L1210세포에는 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 10은, 대조로서의 pCOS1/COS7세포 배양상청의 항체는, hIAP/L1210세포에 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 11은, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청의 항체는, hIAP/L1210세포에 특이적으로 결합하는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이다.
도 12는, 실시예 5.6에서 나타내는 Competitive ELISA의 결과를 나타내는 도이고, 본 발명의 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)의 항원결합 활성을, 대조로서의 pCHO1/ COS7세포 배양상청과 비교하여, 마우스 모노크로날 항체 MABL-2의 항원결합에 대한 저해를 지표로서 나타내는 도이다.
도 13은, 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, 대 조로서의 pCOS1/L1210세포에는, 대조로서의 pCHO1/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.
도 14는, 실시예 5.7의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, 대조로서의 pCOS1/L1210세포에는, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.
도 15는, 실시예 5.7의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에는, 대조로서의 pCH01/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.
도 16은, 실시예 5.7의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에 대해, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청 항체가 특이적으로 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다.
도 17은, 실시예 5.7의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, CCRF-CEM세포에는, 대조로서의 pCHO1/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 50%).
도 18은, 실시예 5.7의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, CCRF-CEM세포에 대해, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청 항체가 특이적으로 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 50%).
도 19는, 실시예 5.9의 CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제과정에 있어서, 블루세파로제(Blue-Sepharose) 칼럼에서 얻은 부분을 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 칼럼을 사용하여 정제될 때의 크로마토그램을 나타내는 도이고, 주요한 피크로서 부분A, 부분B가 얻어진 것을 나타낸다.
도 20은, 실시예 5.9(2)에서 얻어진 부분 A, 부분 B에 관해서 겔여과에 의해 정제된 결과를 나타내는 도이고, 부분 A에서는 외관상의 분자량 36kD, 부분 B에는 76kD의 위치에 주요피크가(각각 AI 및 BI) 용출된 것을 나타낸다.
도 21은, 실시예 5.9의 CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제과정에 있어서 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석한 도이고, 모두 분자량 약 35kD에 단일결합만인 것을 나타낸다.
도 22는, CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제에 있어서 얻어진 부분 AI 및 BI을 겔여과에 의해 분석한 결과를 나타내는 도이고, 부분 AI은 모노머로 이루어지고, 부분 BI은 다이머로 이루어지는 것을 나타낸다.
도 23은, 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를, 대장균의 균체내에 발현시키기 위해 사용가능한 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 24는, 실시예 5.12의 대장균세포 생성의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 정제에 있어서, 얻어진 조성물을 겔여과 칼럼을 사용하여 정제한 결과를 나타내는 도이고, 각 피크는 각각 대장균세포 생성의 단일쇄 Fv의 모노머, 다이머를 나타낸다.
도 25는, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에는, 대조로서의 마우스 IgG항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 26은, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에 대해, CHO세포 생산의 MABL2-scFv다이머가 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 27은, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에 대해, 대장균세포 생산의 MABL2-scFv다이머가 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 28은, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에는, CHO세포 생산의 MABL2-scFv모노머의 아폽토시스 유발작용이 대조와 동일한 정도인 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 29는, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에는, 대장균세포 생산의 MABL2-scFv모노머의 아폽토시스 유발작용이 대조와 동일한 정도인 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 30은, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에는, 대조로서의 마우스 IgG항체는, 항FLAG항체의 첨가에 의해서도, 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 31은, 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, hIAP/L1210세포에 대해, CHO세포 생성의 MABL2-scFv모노머가, 항FLAG항체의 첨가에 의하여 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/㎖).
도 32는, 인간 골수종세포주 KPMM2를 이식한 마우스의 혈청 중의 인간 IgG량을 정량한 것이고, 마우스에 있어서의 인간골수종에 의해 생산되는 인간 IgG의 양을 측정한 결과는 나타내는 도이고, scFv/CHO다이머가 KPMM2세포의 증식을 매우 강 하게 억제하고 있는 것을 나타낸다.
도 33은, 종양 이식 후의 마우스의 생존일수를 나타내고 있고, scFv/CHO다이머 투여군에 있어서 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내고 있다.
도 34는, MABL-2항체 유래의 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체[sc(Fv)2]를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 35는, [H쇄]-[L쇄]가 되도록 V영역을 연결하고, 또 펩티드 링커를 함유하지 않는 scFv(HL타입)를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 36은, HL타입의 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 링커의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 37은, [L쇄]-[H쇄]가 되도록 V영역을 연결하고, 또 펩티드 링커를 함유하지 않는 scFv(LH타입)를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타낸다.
도 38은, LH타입의 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 링커의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 39는, 실시예 6.4에 있어서의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도이고, 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 sc(FV)2 및 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2항체 scFv가 발현하고 있는 것을 나타낸다.
도 40a 및 b는, 실시예 6.3(1)에서 조제된 COS7세포 배양상청을 사용한 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도이고, 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL2-scFv 및 sc(FV)2 은, 인간 IAP에 대해 높은 친화성을 갖는 것을 나타낸다.
도 41a 및 b는, 실시예 6.6의 아폽토시스 유도효과의 결과를 나타내는 도이고, scFv < HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7 > 및 sc(FV)2 는 hIAP/L1210세포에 대하여 현저한 세포사를 유도하는 것을 나타낸다.
도 42는, 실시예 6.10의 항원결합 평가의 결과를 나타내는 도이고, scFv<HL5>의 다이머 및 sc(Fv)2이 인간 IAP에 대해 높은 친화성을 갖는 것을 나타낸다.
도 43은, 실시예 6.11의 in vitro 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도이고, MABL2-scFv<HL5>의 다이머 및 MABL2-sc(FV)2는 hIAP/L1210, CCRF-CEM의 이 둘의 세포에 대하여 농도의존적으로 세포사를 유도하는 것을 나타낸다.
도 44는, 인간 골수종세포주 KPMM2를 이식한 마우스에 있어서의 인간 골수종에 의해 생산되는 혈청 중의 M단백질의 양을 측정한 결과는 나타내는 도이고, scFv<HL-5> 및 sc(FV)2 가 KPMM2세포의 증식을 매우 강하게 억제하고 있는 것을 나타낸다.
도 45는, 종양 이식 후 마우스의 생존일수를 나타내고 있고, scFv<HL-5> 투여군에 있어서, 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내고 있다.
도 46은, 종양 이식 후의 마우스의 생존일수를 나타내고 있고, sc(Fv)2 투여군에 있어서, 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내고 있다.
도 47은, 15아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 함유하는 재구성 12B5 단 일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편의 구축방법과 그 구조를 개략적으로 나타낸다.
도 48은, 실시예 7.5(1)에서 얻어진 각 12B5 단일쇄 Fv를, 겔여과에 의해 정제된 결과를 나타내는 도이고, sc12B5에서는 2개의 피크(부분 A, B)로 구분된 결과를 나타낸다.
도 49는, 실시예 7.5(2)에 있어서, 각 부분 A 및 B를 SDS-PAGE에 의해 분석된 결과를 나타낸다.
도 50은, 실시예 7.5(2)에 있어서, 각 부분 A 및 B를 Superdex 200 칼럼에 의해, 분석된 결과를 나타내고, (a)부분 A에서는 외관상의 분자량 약 44kD에, (b)부분 B에는 22kD의 위치에 주요 피크가 용출된 것을 나타낸다.
도 51은, sc12B5 및 12B5항체(IgG, Fab)의 TOP형태 아고니스트 활성의 측정결과를 나타내고, 12B5 IgG 및 1가 단일쇄 Fv(sc12B5)는, 농도의존적으로 TOP형태의 아고니스트 활성을 갖는 것을 나타낸다.
도 52는, sc12B5 모노머 및 다이머의 TOP형태의 아고니스트 활성의 측정결과를 나타내고, 2가의 항원결합 부위를 지닌 단일쇄 Fv(sc12B5다이머)는 1가의 sc12B5 보다 약 400배 이상 강한 아고니스트 활성을 나타내고, 그 강도는 인간 TPO와 동등 또는 그 이상인 것을 나타낸다.
도 53은, 얻어진 sc12E10 단일쇄 항체를 Superdex 200HR 칼럼을 사용한 겔여과 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타내는 도이고, sc12E10에서는, 2개의 피크(부분 A, B)로 구분된 결과를 나타낸다.
도 54는, 얻어진 db12E10 단일쇄 항체를 Superdex 200HR 칼럼을 사용한 겔여 과 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타내는 도이고, db12E10에서는, 2개의 피크(부분 C, D)로 구분된 결과를 나타낸다.
도 55는, 부분 A, B(sc12E10) 및 부분 C, D(db12E10)를 환원, 비환원 조건 하에 있어서의 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸다.
도 56은, 부분 A, B를 Superdex 200HR 칼럼을 사용한 겔여과 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸다. (1)부분 A에서는, 외관상의 분자량 42kD에 (2)부분 B에는 20kD의 위치에, 주요피크가 용출된 것을 나타낸다.
도 57은, 부분 C, D를 Superdex 200HR 칼럼을 사용한 겔여과 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸다. (1)부분 C에서는 외관상의 분자량 69kD에 (2)부분 D에서는 41kD의 위치에, 주요 피크가 용출된 것을 나타낸다.
도 58은, 각 종 12E10항체 분자의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 나타내는 그래프이고, 단일쇄 Fv(sc12E10, db12E10)에서는 TOP형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 대해, 12E10 IgG 및 12E10 Fab에서는 전혀 활성이 확인되지 않았던 것을 나타낸다.
도 59는, sc12E10 모노머 및 다이머, 및 db12E10 다이머 및 트리머의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 나타내는 그래프이고, sc12E10 다이머, db12E10 다이머 및 트리머의 TOP형태의 아고니스트 활성이 TOP 보다도 강력한 것을 나타낸다.
다음에, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 이들에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 개변항체의 제조방법을, 하기의 단일쇄 Fv의 제작을 예로 하여 설명한다. 본 발명의 개변항체의 제조방법에 있어서 사용되는, 인간 IAP에 대한 마우스 MABL-1, MABL-2항체를 생산하는 하이브리도마 MABL-1 및 MABL-2는 공적미생물 기탁기관인 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 1-3 히가시 1초메)에, 1997년 9월 11일에 수탁번호 각각 FERM BP-6100 및 FERM BP-6101로서 국제 기탁되어 있다
실시예 1(인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체의 V영역을 코드하는 DNA의 클론화)
인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체 MABL-1 및 MABL-2의 가변영역을 코드하는 DNA를 하기와 같이 하여 클론하였다.
1.1 메신저 RNA(mRNA)의 조제
하이브리도마 MABL-1 및 MABL-2로부터의 mRNA를, mRNA Purification Kit(파마시아 바이오테크사 제작)를 사용하여 조제하였다.
1.2 이중쇄 cDNA의 합성
약 1㎍의 mRNA에서 Marathon cDNA Amplification Kit(CLONTECH사 제작)를 사용하여 이중쇄 cDNA를 합성하고, 어댑터를 연결하였다.
1.3 항체 가변영역을 코드하는 유전자의 PCR법에 의한 증폭
Thermal Cycler(PERKIN ELMER사 제작)를 사용하여 PCR법을 수행하였다.
(1) MABL-1 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 증폭
PCR법에 사용하는 프라이머는, 어댑터의 부분서열과 혼성화되는 서열번호:1 에 나타내는 어댑터 프라이머-1(CLONTECH사 제작), 및 마우스 카파형 L쇄 C영역 서열과 혼성화하는 서열번호:2에 나타내는 MKC(Mouse Kappa Constant)프라이머 (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.
PCR용액 50㎕는 5㎕의 10 ×PCR Buffer II, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 0.2μM의 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머와 0.2μM의 서열번호:2에 나타나는 MKC프라이머 및 MABL-1유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍을 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간, 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 더 가열하였다.
(2) MABL-1의 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
PCR을 위한 프라이머로서 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열번호:3에 나타내는 MHC-γ1(Mouse Heavy Constant)프라이머(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.
cDNA의 증폭은 0.2μM의 MKC 프라이머 대신에 0.2μM의 NHC-γ1프라이머를 사용하여 증폭한 점을 제외하고, 상기 1.3(1)에 있어서 L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재된 것과 동일한 방법에 의해 수행하였다.
(3) MABL-2 L쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
PCR을 위한 프라이머로서 서열번호:1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열 번호: 2에 나타내는 MKC프라이머를 사용하였다.
cDNA의 증폭은 MABL-1 유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍ 대신에 MABL-2 유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍을 사용하여 증폭시킨 점을 제외하고, 상기 1.3(1)에 있어서 MABL-1 L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재된 것과 동일한 방법에 의해 수행하였다.
(4) MABL-2의 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
PCR을 위한 프라이머로서, 서열번호:1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열번호: 4에 나타내는 MHC-γ2a프라이머 (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.
cDNA의 증폭은 0.2μM의 MKC 프라이머 대신에 0.2μM의 MHC-γ2a프라이머를 사용하여 증폭한 점을 제외하고, 상기 1.3(3)에 있어서, L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재한 것과 동일한 방법에 의해 수행하였다.
1.4 PCR생성물의 정제
상기와 같이 하여 PCR법에 의해 증폭된 DNA단편을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제하고, 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해하였다.
1.5 연결 및 형질전환
상기와 같이 하여 조제된 MABL-1유래 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하여 이루어지는 DNA단편 약 140ng을 pGEM-T Easy 벡터(Promega 사 제작)50ng, 30mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM 디치오스레이톨, 1mM ATP 및 3유닛 T4 DNA리가제(Promega사 제작)를 함유하는 반응혼합액 중에서, 15℃에서 3시간 반응시켜 연결하였다.
다음에, 1㎕의 상기 연결혼합액을 대장균 DH5α의 캄피턴트 세포(Toyobo Inc 제작)의 50㎕에 부가하고, 그리고 이 세포를 빙상에서 30분간, 42℃에서 1분간 그리고, 다시 빙상에서 2분간 정치(靜置)하였다. 이어서, 100㎕의 SOC배지(GIBCO BRL사 제작)를 부가하고, 100㎍/㎖의 앰피실린(SIGMA사 제작)을 함유하는 LB(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)한천배지 위에 이 대장균을 도포하고, 37℃에서 철야 배양하여, 대장균 형질전환체를 얻었다.
이 형질전환체를 50㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB배지 3㎖중에서 37℃로 철야 배양하고, 그리고 이 배양물로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 플라스미드 DNA를 조제하였다.
이렇게 하여 얻어진, 하이브리도마 MABL-1에서 유래하는 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pGEM-M1L으로 명명하였다.
상기와 동일한 방법에 따라서, 하이브리도마 MABL-1에서 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M1H로 명명하였다.
또, 하이브리도마 MABL-2에서 유래하는 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2L로 명명하였다.
또, 하이브리도마 MABL-2에서 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2H로 명명하였다.
실시예 2(DNA 염기 서열의 결정)
상기 플라스미드 중의 cDNA코드 영역의 염기 서열의 결정은, 자동 DNA 시퀀서(Applied Biosystem사 제작) 및 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystem사 제작)를 사용하고, 제조업자 지정의 프로토콜에 따라서 수행하였다.
플라스미드 pGEM-M1L에 함유되는 마우스 MABL-1항체의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기 서열을 서열번호:5에 나타낸다.
또, 플라스미드 pGEM-M1H에 함유되는 마우스 MABL-1항체의 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기 서열을 서열번호:6에 나타낸다.
또, 플라스미드 pGEM-M2L에 함유되는 마우스 MABL-2항체의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기 서열을 서열번호:7에 나타낸다.
또, 플라스미드 pGEM-M2H에 함유되는 마우스 MABL-2항체의 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기 서열을 서열번호:8에 나타낸다.
실시예 3(CDR의 결정)
L쇄 및 H쇄의 V영역의 전반적 구조는, 서로 유사성을 갖고 있고, 각각 4개의 프레임워크 부분이 3개의 초가변영역, 즉 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. 프레임워크의 아미노산 서열은 비교적 잘 보존되어 있으나, 한편 CDR영역의 아미노산 서열의 변이성은 극히 높다(Kabat, E.A.,et al., 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983).
이와 같은 사실에 기초하여, 인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체의 가변영역의 아미노산 서열을 Kabat et al.에 의해 제작된 항체의 아미노산 서열의 데이타베이스에 적용시키고, 상동성을 조사하는 것에 의해 CDR영역을 표 1에 나타낸 것과 같이 결정하였다.
플라스미드 서열번호 CDR(1) CDR(2) CDR(3)
pGEM-M1L 5 43-58 74-80 113-121
pGEM-M1H 6 50-54 69-85 118-125
pGEM-M2L 7 43-58 74-80 113-121
pGEM-M2H 8 50-54 69-85 118-125
실시예 4(클론화 cDNA의 발현의 확인(키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체의 제작))
4.1 키메라 MABL-1항체 발현벡터의 제작
키메라 MABL-1항체를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 각각 마우스 MABL-1 L쇄 및 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA클론 pGEM-M1L 및 pGEM-M1H를 PCR법에 의해 수식하였다. 그리고 HEF발현벡터(국제공개공보 WO92/19759참조)에 도입하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MLS(서열번호:9) 및 H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MHS(서열번호:10)는, 각각의 V영역의 리더 서열의 최초를 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또 Kozak 컨센서스 서열(J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987) 및 Hind III 제한효소부위를 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MLAS(서 열번호:11) 및 H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MHAS(서열번호:12)는, J영역의 말단을 코드하는 DNA 서열에 혼성화하고, 또한 스플라이스 도너(splice donor) 서열 및 BamHI 제한효소부위를 갖도록 설계하였다.
PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs(dATP , dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold, 0.4μM씩의 각 프라이머 및 8ng의 주형 DNA(pGEM-M1L 및 pGEM-M1H)를 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간, 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 더 가열하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제하고, Hind III 및 BamHI로 소화하고, 그리고 L쇄 V영역에 관해서는, HEF발현벡터 HEF-κ에, H쇄 V영역에 대해서는 HEF발현벡터 HEF-γ에 각각 클론닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M1L, HEF-M1H로 명명하였다.
4.2 키메라 MABL-2항체 발현벡터의 제작
cDNA의 수식 및 클로닝은, pGEM-M1L 및 pGEM-M1H 대신에 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H를 주형 DNA에 증폭한 점을 제외하고, 상기 4.1에 있어서 기재된 것과 동일한 방법에 의해 증폭 및 클로닝을 수행하여, DNA서열 결정 후, 조정 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M2L, HEF-M2H로 명명하였다.
4.3 COS7세포로의 유전자도입
키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체의 일과성 발현을 관찰하기 위해, 상기 발현벡터를 COS7세포에 있어서 시험하였다.
(1) 키메라 MABL-1항체의 유전자도입
HEF-M1L과 HEF-M1H벡터를, Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포에 동시 형질전환하였다. 각 DNA(10㎍)와, PBS 중 1×107세포/㎖의 0.8㎖를 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 가하였다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 γ-글루블린 프리 소태아 혈청을 함유하는 DMEM배양액(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 72시간 배양의 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수 배양상청을 얻었다.
(2) 키메라 MABL-2항체의 유전자도입
키메라 MABL-2항체 유전자의 도입은, HEF-M1L과 HEF-M1H벡터 대신에 HEF-M2L과 HEF-M2H벡터를 사용한 점을 제외하고, 상기 4.3(1)에 기재된 것과 동일한 방법에 의해 COS7세포에 동시형질 전환하고, 회수배양 상청을 얻었다.
4.4 유동세포 분석법(Flow Cytometry)
항원으로의 결합을 측정하기 위해서, 상기 COS7세포 배양상청을 사용하여 유동세포 분석법을 수행하였다. 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세 포 4×105개에 키메라 MABL-1항체를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 키메라 MABL-2항체를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 대조로서 인간 IgG1항체(SIGMA사 제작)를 부가하고, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, FITC표식된 항인간 IgG항체(Cappel사 제작)를 부가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.
그 결과, 키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체는, 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합한 것에 의해, 이들의 키메라 항체가 마우스 모노크로날 항체 MABL-1 및 MABL-2의 각각의 V영역의 올바른 구조를 갖는 것이 명백하게 되었다(도 1~3).
실시예5 (재구성 MABL-1항체 및 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(scFv)영역의 제작)
5.1 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 제작
재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 하기와 같이 제작하였다. 재구성 MABL-1항체 H쇄 V영역, 링커영역 및 재구성 MABL-1항체 L쇄 V영역을 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결하는 것에 의해, 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 제작하였다. 이 방법을 도 4에 모식적으로 나타낸다. 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 제작을 위해 6개의 PCR프라이머(A-F)를 사용하였다. 프라이머 A, C 및 E는 센스서열(sense sequence)을 갖고, 프라이머 B, D 및 F는 안티센스서열(antisense sequence)을 갖는다.
H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VHS(프라이머 A, 서열번호:13)는 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 Nco I 제한효소 인식부위를 갖도록 설계되었다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VHAS(프라이머 B, 서열번호: 14)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 링커와 오버랩하도록 설계하였다.
링커를 위한 전방 프라이머 LS(프라이머 C, 서열번호:15)는, 링커의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA와 오버랩하도록 설계하였다. 링커를 위한 후방 프라이머 LAS(프라이머 D, 서열번호:16)는, 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA와 오버랩하도록 설계하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VLS(프라이머 E, 서열번호:17)는 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 오버랩하도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VLAS-FLAG(프라이머 F, 서열번호:18)는 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또 FLAG펩티드를 코드하는 서열(Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), 2개의 전사정지 코돈 및 EcoRI 제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다.
제1PCR단계에 있어서 3개의 반응 A-B, C-D 및 E-F를 수행하고, 그리고 각 PCR생성물을 정제하였다. 제 1PCR로부터 얻어진 3개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 F를 부가하고, 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제 2PCR법). 또, 제 1PCR 에 있어서는 재구성 MABL-1항체 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M1H(실시예 2를 참조), Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호:19)로 이루어지는 링커 영역을 코드하는 DNA서열(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988)을 함유하여 이루어지는 플라스미드 pSC-DP1, 및 재구성 MABL-1항체 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M1L(실시예 2를 참조)를 각각 주형으로서 사용하였다.
제 1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA폴리머라제, AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 0.4μM씩의 각 프라이머 및 5ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 65℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 더 가열하였다.
PCR생성물 A-B(371bp), C-D(63bp) 및 E-F(384bp)를 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제품)을 사용하여 정제하고, 제 2PCR로 어셈블리하였다. 제 2PCR에 있어서, 주형으로서 120ng의 제 1PCR 생성물A-B, 20ng의 PCR 생성물 C-D 및 120ng의 PCR 생성물 E-F, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)를 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을, 94℃의 초기온도에서 8분간 그리고, 다음에 94℃에서 2분간, 65℃에서 2분간, 및 72℃에서 2분간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 2번 반복한 후, 각각 0.4μM의 프라이머 A 및 F 를 부가하였다. 그리고 94℃의 초기온도에서 1분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 65℃에서 1분간, 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하여 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 가열하였다.
제 2PCR에 의해 생성된 843bp의 DNA 단편을 정제하고, Nco I 및 EcoRI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7벡터에 클론닝하였다. 또, 본 발명의 벡터 pSCFVT7은 대장균 페리플라즘 분비 발현계에 적당한 pelB신호 서열(Lei,S.P.,et al.,J. Bacteriologγ, 169, 4379-4383, 1987)을 함유하고 있다. DNA서열 결정 후, 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pscM1이라 명명하였다(도5를 참조). 본 플라스미드 pscM1에 함유되는 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:20으로 나타낸다.
다음에, 포유동물 세포에서 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, pscM1벡터를 PCR법에 의해 수식하였다. 그래서 얻어진 DNA단편을 pCH01 발현벡터에 도입하였다. 또, 본 발명 벡터 pCH01은, DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759참조)로부터 EcoRI 및 Sma I소화에 의해, 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamHI어댑터를 연결하는 것에 의해 구축된 벡터이다.
PCR에 사용하는 프라이머는, 전방 프라이머로서, H쇄 V영역의 N-말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 SalI제한효소 인식부위를 갖는 서열번호:21에 나타낸 Sal-VHS프라이머 및 후방 프라이머로서, 제 1프레임 워크서열의 최후를 코드하는 DAN에 혼성하는 서열번호:22에 나타낸 FRH 1 anti 프라이머를 사용하였다.
PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold, 0.4μM씩의 각 프라이머 및 8ng의 주형 DNA (pscM1)를 함유하고, 95℃의 초기온도에서 9분간, 그리고 이어서 95℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 더 가열하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제품)를 사용하여 정제하고, SalI 및 Mbo II로 소화하고, N-말단측 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편을 얻었다. 또, pscM1벡터를 Mbo II 및 EcoRI로 소화하고, C말단측 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편을 얻었다. 그리고, SalI-Mbo II DNA단편 및 Mbo II-EcoRI DNA단편을 pCH01-Igs벡터에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHOM1이라 명명하였다(도6을 참조). 또, 본 발명의 벡터 pCH01-Igs는, 포유동물 세포 분비발현계에 적당한 마우스 IgG1 신호 서열(Nature, 322, 323-327, 1988)을 함유하고 있다. 본 플라스미드 pCHOM1에 함유되는 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아아미노산 서열을 서열번호:23에 나타낸다.
5.2 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 제작
재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 상기 5.1에 따라서 제작하였다. 제 1PCR에 있어서는 pGEM-M1H 대신에 재구성 MABL-2항체 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2H(실시예 2를 참조), 및 pGEM-M1L 대신에 재구성 MABL-2항체 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2L(실시예 2를 참조)을 사용하고, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드 pscM2를 얻었다. 본 플라스미드 pscM2에 함유되는 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:24에 나타낸다.
또, pscM2벡터의 수식에 의해 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 포유동물 세포 발현용 pCHOM2벡터를 얻었다. 본 플라스미드 pCHOM2에 함유되는 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:25에 나타낸다.
5.3 COS7세포로의 유전자도입
재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 일과성 발현을 관찰하기 위해, pCHOM2 벡터를 COS7세포에 있어서 시험하였다.
pCHOM2벡터를 Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포에 형질전환하였다. DNA(10㎍)와, PBS 중 1×107세포/㎖의 0.8㎖를 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부가하였다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를, 10%의 소태아 혈청을 함유하는 IMDM배양액(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 72시간 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수배양상청을 얻었다.
5.4 COS7세포 배양상청 중의 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 검출
pCHOM2벡터를 유전자도입한 COS7세포 배양상청 중에 있어서 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 웨스턴 블로팅 법(Western Blotting Method)에 의해 확인하였다.
pCHOM2벡터를 유전자도입한 COS7세포 배양상청 및 대조로서 pCHO1벡터를 유전자도입한 COS7세포 배양상청에 관해서 SDS전기영동을 수행하고, REINFORCED NC막(Schleicher&Schuell사 제작)에 전사하였다. 5%탈지우유(Morinaga Nyu-gyo사 제작)로 블로킹을 수행하고, 0.05% Tween 20-PBS로 세정 후, 항FLAG항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 알칼리포스파타제 결합 항마우스 IgG항체(Zymed사 제작)를 부가하고, 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 기질용액(Kirkegaard Perry Laboratories사 제작)을 첨가하여, 발색시켰다(도7).
그 결과, pCHOM2벡터 도입 COS7세포 배양상청 중에만 FLAG펩티드 특이적인 단백질이 검출되고, 이 배향상청 중에 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv가 분비되고 있는 것이 확실하게 되었다.
5.5 유동세포 분석법
항원으로의 결합을 측정하기 위해서, 상기 COS7세포 배양상청을 이용하여 유동세포 분석법을 수행하였다. 인간 Integrin Associated Protein(IAP)을 발현하는마우스 백혈병 세포주 L1210세포, 또는 대조로서 pCOS1벡터를 형질전환한 L1210세포 2×105개에, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 대조로서 pCHO1 벡터를 형질전환한 COS7세포의 배양상청을 부가하고, 빙상에서 인 큐베이션 및 세정 후, 마우스 항FLAG항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FITC표시한 항마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 부가하였다. 다시 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.
그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv는, 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합한 것에 의해, 이 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv가 인간 Integrin Associated Protein에 대한 친화성을 갖는 것이 명백하게 되었다(도 8∼11참고).
5.6 경쟁적 효소면역학적 검정법(Competitive ELISA)
마우스 모노크로날 항체의 항원결합에 대한 저해활성을 지표로, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 항원결합 활성을 측정하였다.
1㎍/㎖로 조정된 항FLAG항체를 96웰플레이트의 각 웰에 부가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트하였다. 세정 후, 1% BSA-PBS로 블로킹을 수행하였다. 실온에서, 인큐베이트 및 세정 후, 분비형 인간 IAP항원 유전자(서열번호:26)를 도입한 COS7세포 배양상청을 PBS로 2배 희석한 것을 각 웰에 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 100ng/㎖로 조정된 비오틴화 MABL-2항체 50㎕ 및 순차희석된 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv발현 COS7세포 배양상청 50㎕를 혼합한 것을 각 웰에 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 알카리포스파타제 결합 스트렙토아비딘(Zymed사 제작)을 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 기질용액(SIGMA 제작)을 부가하고, 다음에 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 대조의 pCHOI도입 COS7세포 배양상청에 비교하여, 명백하게 농도 의존적으로 마우스 MABL-2항체의 인간 IAP항원으로의 결합을 저해하였다(도 12). 이것으로부터, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv는, 마우스 모노크로날 항체 MABL-2의 각각의 V영역의 올바른 구조를 갖는 것이 시사되었다.
5.7 in vitro에서의 아폽토시스 유발효과
인간 IAP를 유전자도입한 L1210세포, 및 대조로서 pCOS1벡터를 유전자 도입한 L1210세포, 및 CCRF-CEM세포를 사용하고, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 아폽토시스 유발작용을 Annexin-V(Boehringer Mannheim사 제작)염색에 의해 검사하였다.
각 세포 1×105개에, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv 발현 COS7세포 배양상청 또는 대조로서 pCHO1벡터 도입 COS7세포 배양상청을 최종 농도 50%로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그런 후, Annexin-V염색을 수행하고, FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.
Annexin-V염색에 의한 해석의 결과를 도 13∼18에 각각 나타내었다. 여기서, 도의 왼쪽 아래 영역에 있는 도트는 살아있는 세포를, 오른쪽 아래 영역은 아폽토시스 초기의 세포를, 오른쪽 위의 영역은 아폽토시스 후기의 세포를 나타낸다. 그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 L1210세포에 있어서 인간 IAP항원 특이적으로 뚜렷한 세포사를 유도하였다(도13∼16). 또 CCRF-CEM세포에 있어서도, 대조에 비교하여 뚜렷한 세포사를 유도하였다(도 17∼18).
5.8 CHO세포에 있어서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현
MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해, pCHOM2벡터를 CHO세포에 유전자도입 하였다.
pCHOM2벡터를, Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 CHO세포에 형질전환하였다. DNA(10㎍)와 PBS에 현탁한 CHO세포(1×107세포/㎖)의 0.7㎖를 혼합한 것을 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소태아 혈청을 함유하는 무핵산 α-MEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여, 배양하였다. 얻어진 클론에 관해서, SDS-PAGE로 목적으로 하는 단백질의 발현을 확인하고, 발현량이 높은 클론을 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 생산 세포주로서 선택하였다. 10nM 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수배양상청을 얻었다.
5.9 CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제
5.8에서 얻은 단일쇄 Fv발현 CHO생산주의 배양상청을 인공투석용 카트리지 (PAN130SF, ASAHI MEDICALS)를 사용하여 약 20배까지 농축하였다. 농축액은 -20℃에서 보존하고, 정제시 해동하여 사용하였다.
CHO세포 배양상청으로부터 단일쇄 Fv의 정제는, Blue-sepharose, 하이드록시아파타이트 및 겔 여과의 3종의 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
(1) Blue-sepharose 칼럼 크로마토그래피
배양상청의 농축액을 20mM 초산 완충액(pH6.0)으로 10배 희석하고, 원심분리 (10000rpm ×30분)에 의해 불용물을 제거하였다. 상청을 동일한 완충액으로 평형화한 Blue-sepharose 칼럼(20㎖)에 첨가하고, 동일한 완충액으로 칼럼을 세정 후, 동일한 완충액 중 NaCl농도를 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 및 1.0M까지 단계적으로 높여, 칼럼에 흡착된 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE로 통과부분 및 각 용출부분을 분석하고, 단일쇄 Fv가 확인된 부분(0.1∼0.3M NaCl용출부분)을 채우고, Centriprep-10(AMICON사 제작)을 사용하여 약 20배 농축하였다.
(2) 하이드록시아파타이트
(1)의 농축액을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 10배 희석하고, 하이드록시아파타이트 칼럼(20㎖, BIOARD사 제작)에 첨가하였다. 60㎖의 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 칼럼을 세정 후, 인산 완충액 농도를 200mM까지 직선적으로 높여, 칼럼에 흡착한 단백질을 용출하였다(도 19참조). SDS-PAGE에 의해 각 부분을 분석한 결과, 부분 A 및 부분 B에 단일쇄 Fv가 확인되었다.
(3) 겔 여과
(2)의 부분 A 및 B를 각각 Centriprep-10을 사용하여 농축하고, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 TSKgelG3000SWG 칼럼(21.5 ×600mm)에 첨가하였다. 크로마토그램을 도 20에 나타낸다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 모든 주요피크(AI, BI)가 목적의 단일쇄 Fv이고, 겔 여과로 분석한 결과, 부분 A에서는 외관상의 분자량 약 36kD, 부분 B에서는 76kD에서 용출 되었다. 정제된 단일쇄 Fv(AI, BI)를 15%-SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분석하였다. 샘플을 환원제 첨가, 비첨가로 처리하고, Laemmli의 방법에 준하여 전기영동을 수행하고, 영동 후, 단백질을 Coomassie Brilliant Blue 염색하였다. 도 21에 나타내는 바와 같이, AI, BI 전부 환원제의 첨가의 유무에 관계없이, 외관상 분자량 약 35kD에 단일밴드를 부여하였다. 이상의 결과로부터, AI는 단일쇄 Fv의 모노머이고, BI는 단일쇄 Fv의 비공유결합성 다이머라 생각된다. 부분 AI 및 BI를 TSKgel G3000SW 칼럼(7.5 ×60mm)을 사용한 겔 여과에 의해 분석한 결과, 부분 AI은 모노머의 피크만, 부분 BI은 다이머의 피크만 검출되었다(도 22참조). 또, 다이머 부분(부분BI)은, 전체 단일쇄 Fv의 약 4%이었다. 상기 다이머 부분 중의 다이머는, 그 90%이상이 4℃에서 1개월 이상 안정적으로 유지되었다.
5.10 대장균 세포에서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드 발현 벡터의 구축
MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv를 대장균 균체내에서 효율적으로 발현하는 벡터를 제작하기 위해, pscM2벡터를 PCR법에 의해 수식하였다. 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7발현벡터에 도입하였다.
PCR에 사용하는 프라이머는, 전방 프라이머로서 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고 또한, 개시코돈 및 Nde I제한효소 인식부위를 갖는 서열번호:27에 나타내는 Nde-VHSm02프라이머 및 후방 프라이머로서, L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또 2개의 정지코돈 및 EcoRI제한효소 인식부위를 갖는 서열번호:28에 나타내는 VLAS프라이머를 사용하였다. 또, 전방 프라이머의 Nde-VHSm02는 대장균 균체내에서 효율적으로 발현하기 위해, H쇄 V영역의 N-말단을 코드하는 DNA에 혼성화되는 부분에 5지점 변이를 포함하고 있다.
PCR용액 100㎕는 10㎕의 10×PCR Buffer #1, 1mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 5유닛의 KOD DNA폴리머라제 (이상 TOYOBO사 제작), 1μM씩의 각 프라이머 및 100ng의 주형 DNA(pscM2)를 함유하고, 98℃에서 15초간, 65℃에서 2초간, 및 74℃에서 30초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 25회 반복하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제하고, NdeI 및 EcoRI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7벡터에 클론닝하였다. 또, 본 발명 벡터 pSCFVT7은 NdeI 및 EcoRI로 소화된 것에 의해 pelB신호 서열이 삭제되어 있다. DNA 서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유는 플라스미드를 pscM2DEm02라 명명하였다(도 23을 참조). 본 플라스미드 pscM2DEm02에 함유되는 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 29에 나타낸다.
5.11 대장균 세포에 있어서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현
MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드를 발현하는 대장균주를 얻기 위해, pscM2DEm02벡터를 대장균 BL21(DE3)pLysS(STRATAGENE사 제작)로 형질전화하였다. 얻어진 클론에 관해서, SDS-PAGE로 목적으로 하는 단백질의 발현을 검사하고, 발현량이 높은 클론을 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드의 생산주로서 선택하였다.
5.12 대장균 세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 정제
형질전환하여 얻어진 대장균의 단일 콜로니(single colony)를 LB배지 30㎖에서 28℃로 7시간 배양하고, 이것을 70㎖의 LB배지에 계속 배양하고, 28℃로 하룻밤 배양을 수행하였다. 이 예비배양(pre-culture)을 7L의 LB배지에 이어서 배양하고, 단지 발효기(Jar-fermenter)를 사용하여 28℃, 교반속도 300rpm으로 배양하였다. O.D.=1.5일 때, 1mM IPTG에서 유도를 시키고, 그 후 3시간 배양을 수행하였다.
배양액을 원심분리(10000×g, 10분)하고, 침전으로서 회수된 균체에 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 1% Triton X-100을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)을 부가하고, 초음파(out put:4, duty cycle:70%, 1분×10회)에 의해 균체를 파쇄하였다. 이 현탁액을 원심분리(12000×g, 10분)로 거르고, 침전으로서 회수된 봉입체(封入體)에 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 4% Triton X-100를 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)을 부가하고, 다시 초음파처리(out put:4, duty cycle:50%, 30초×2회)를 수행하고, 원심분리(12000×g, 10분)에 의해 목적 단백질을 침전으로서 회수하고, 상청에 생기는 내잡 단백질을 제거하였다.
목적 단백질을 함유한 봉입체를 6M Urea, 5mM EDTA 및 0.1M NaCl을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)에 용해하고, 4M Urea, 5mM EDTA, 0,1M Nacl, 10mM 메르캅토에탄올을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)으로 평형화된 Sephacryl S-300(5×90cm, Amersharm Pharmacia 제작)겔 여과 칼럼에 유속 5㎖/분으로 첨가하고, 회합하고 있는 고분자량의 단일쇄 Fv를 제거하였다. 각 부분을 SDS-PAGE로 분석하였고, 순도가 높은 부분에 대해서, O.D280=0.25가 되도록 겔 여과 에서 사용한 용매로 희석 후, 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.5M Arg, 2mM 환원형 글루타치온, 0.2mM 산화형 글루타치온을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)에 대해 투석을 3회 수행하는 것에 의해 회복조작을 수행하였다. 또한, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)에 대해 3회 투석하여, 용매교환을 수행하였다.
조금 함유되는 분자간에서 S-S결합으로 가교된 고분자를 분리제거하기 위해, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화된 Superdex 200pg(2.6×60cm, Amersharm Pharmacia사 제작)겔 여과 칼럼에 첨가하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 고분자량의 회합체라 생각되는 넓은 피크일 때, 주요피크와 서브피크의 2개의 피크가 검출된다. SDS-PAGE에 의한 분석(도 21참조) 및 겔 여과의 용출위치로부터, 주요 피크는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머이고, 서브 피크는 비공유 결합성의 다이머라 생각된다. 또, 형성된 비공유 결합성의 다이머는, 전체 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 약 4퍼센트이었다.
5.13 MABL-2항체 유래의 정제 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 in vitro에서의 아폽토시스 유발 효과
인간 IAP를 유전자 도입한 L1210세포(hIAP/L1210)를 사용하고, CHO세포 및 대장균세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드(MABL2-scFv)의 아폽토시스 유발작용을, 다음의 2개의 프로토콜로 Annexin-V(Boehringer Mannheim사 제작)염색에 의해 검사하였다.
제 1의 프로토콜은, hIAP/L1210세포 5×104개에, 항체시료를 최종농도 3㎍/ ㎖로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 항체시험으로서, 실시예 5.9에서 얻은 CHO세포 유래 MABL-2 단일쇄 Fv의 모노머 및 다이머, 또한 실시예 5.12에서 얻은 대장균 세포 유래의 동일 모노머 및 다이머, 그리고 대조로서, 마우스 IgG항체에 관해서 검사하였다. 배양 후, Annexin-V염색을 수행하고, FACScan장치(BECTON DICKINSON)로 형광강도를 측정하였다.
또, 제 2의 프로토콜은, hIAP/L1210세포 5×104개에, 항체시료를 최종농도 3㎍/㎖로 첨가하고, 2시간 배양 후에, 항FLAG항체(SIGMA사 제작)를 최종농도 15㎍ /㎖로 첨가하고, 22시간 더 배양하였다. 항체시료로서, 5.9에서 얻은 CHO세포 유래 MABL2 단일쇄 Fv의 모노머 및 대조로서 마우스 IgG항체에 관해서 검사하였다. 배양 후, Annexin-V 염색을 수행하고, FACScan장치로 형광강도를 측정하였다.
Annexin-V염색에 의한 분석의 결과를 도 25∼31에 각각 나타내었다. 그 결과 CHO세포 및 대장균 세포생산의 MABL-2항체 유래 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머는 대조(도25)와 비교하여 뚜렷한 세포사를 유도하였지만(도26, 27), CHO세포 및 대장균 세포생산의 단일쇄Fv 폴리펩티드의 모노머의 아폽토시스 유도작용은 확인되지 않았다(도 28, 29). 또, 항FLAG항체의 첨가에 의해, CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머는 대조(도 30)와 비교하여 뚜렷한 세포사를 유도하였다(도 31).
5.14 scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과
(1)마우스 혈청 인간 IgG 정량법
마우스 혈청 중에 있어서의, 인간 골수종 세포가 생산하는 인간 IgG(M단백질)의 정량은, 이하의 ELISA로 수행하였다. 0.1%중탄산 완충액(pH9.6)으로 1㎍/㎖에 희석한 염소 항인간 IgG항체(BIOSOURCE사 제작, Lot#7902) 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc사 제작)에 부가하고, 4℃에서 하루밤 인큐베이션하고, 항체를 고상화하였다. 블로킹 후, 단계 희석한 마우스 혈청 또는 표품으로서 인간 IgG(CAPPEL사 제작, LoT#00915) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 세정 후, 5000배 희석된 알칼리포스파타제 표식 항인간 IgG항체(BIOSOURCE사 제작, Lot#6202 ) 100㎕를 부가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션 하였다. 세정 후, 기질용액을 가하고, 인큐베이션 후, MICROPLATE READER Model 3550(BioRad사 제작)을 사용하여 405nm의 흡광도를 측정하고, 표품의 인간 IgG의 흡광도에서 얻어진 검량선으로부터, 마우스 혈청 중의 인간 IgG(M단백질)농도를 산출하였다.
(2)투여항체의 조제
scFv/CHO폴리펩티드의 모노머 및 다이머는, 투여당일, 여과멸균한 PBS(-)를 사용하고, 각각 0.4mg/㎖, 0.25mg/㎖로 되도록 조제하고, 투여시료로 하였다.
(3)인간 골수종 마우스 모델의 제작
인간 골수종 마우스 모델은 이하와 같이 제작하였다. SCID마우스(Japan Clare)를 사용하여 in vivo 계대(繼代)한 KPMM2세포(일본특허공개 평7-236475호 공보)를 10% 소태아 혈청(GIBCO BRL사 제작)을 함유하는 RPMI 1640배지(GIBCO BRL사 제작)에서 3×107개/㎖가 되도록 조제하였다. 하루 전에 항아시알로 GM1항체(WAKO JUNYAKU사 제작, 1바이알을 5㎖로 용해) 100㎕를 피하투여한 SCID마우스(수컷, 6주령)에 상기 KPMM2세포 현택액 200㎕(6×106개/마우스)(Japan Clare)를 꼬리 정맥으로부터 주입하였다.
(4)항체 투여
(3)에서 제작된 인간 골수종 마우스 모델에 대해, KPMM2세포 이식 후 3일로부터, 1일 2회, 3일간, 상기(2)에서 조제된 투여시료, 모노머는 250㎕, 다이머는 400㎕를 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 대조로서, 여과 멸균된 PBS(-)를 동일하게 1일 2회, 3일간, 200㎕, 꼬리 정맥으로부터 투여하였다. 이 두개의 군 모두, 1군 7마리로 수행하였다.
(5)scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 이식 마우스 모델에 대한 항종양 효과의 평가
scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 마우스 모델의 항종양 효과에 관해서는, 상기 골수종 세포가 생산하는 인간 IgG(M단백질)의 마우스 혈청 중의 양의 변화 및 생존시간으로 평가하였다. 마우스 혈청 중의 인간 IgG량의 변화에 관해서는, KPMM2세포 이식 후 24일째에 혈청을 채취하고, 상기 (1)에서 서술한 ELISA를 사용하여, 인간 IgG량을 측정하였다. 그 결과, PBS(-)투여군에서는 혈청 인간 IgG(M단백질)량이 약 8500㎍/㎖까지 상승하고 있는 데 대해, scFv/CHO다이머 투여군에서는 대조군의 1/10이하로 현저하게 낮은 값이고, scFv/CHO다이머가 KPMM2세포의 증식을 매우 강하게 억제하고 있다는 것이 나타났다(도32). 한편, 생존기간에 관해서도, 도 33에 나타낸 바와 같이, scFv/CHO다이머 투여군에서는 PBS(-)투여군과 비교하여, 현저한 생존기간의 연장이 확인되었다.
이상으로부터, scFv/CHO의 다이머가 인간 골수종 마우스 모델에 대해, 항종양 효과를 갖는 것이 확인되었다. 본 발명의 개변항체인 scFv/CHO 다이머의 항종양 효과는 상기 개변항체가 갖는 아폽토시스 유발작용에 기초한다고 생각되어진다.
5-15 적혈구 응집 시험
적혈구 응집 시험 및 적혈구 응집의 판정법은, 조쿠세이가가쿠지켄코자의 면역생화학 연구법(일본생화학회편, 도쿄가가쿠 도진 발행)에 준하여 실시하였다.
건강한 보통사람의 혈액을 헤파린 처리된 주사관에 의해 채혈하고, PBS(-)에 의해 3회 세정한 후, PBS(-)로 최종 농도가 2%의 적혈구 부유액을 조제하였다. 검사샘플은, 대조로서 마우스 IgG(ZYMED사 제작)를 사용하고, MABL-2항체, CHO세포 생산의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머, 다이머, 대장균 생산의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머와 다이머를 사용하였다. 적혈구의 응집작용을 검사하기 위해, 팔콘사 제작의 U바닥의 96웰플레이트를 사용하고, 상기의 항체 샘플을 50㎕/웰 첨가한 중에, 2%적혈구 부유액을 50μL 더 첨가, 혼합하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 4℃에서 하룻밤 보존하고, 응집을 판정하였다. 또, 대조로서, PBS(-)를 50㎕/웰 첨가하고, 항체 샘플과 동일하게 하여 응집시험을 수행하였다. 항체의 최종농도는 마우스 IgG, MABL-2항체는, 0.01, 0.1, 1, 10, 100㎍/㎖ 단일쇄 Fv는, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 또는 80㎍/㎖에서 대장균 생산의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 다이머 만 160㎍/㎖의 용량을 더 설정하였다. 그 결과는, 하기 표2에 나타낸 바와 같이, MABL-2항체에서는 0.1㎍/㎖이상으로 적혈구 응집이 관찰되는 데 대해, 단일쇄 Fv 폴리펩티드에서는 모노머, 다이머 모두에 적혈구 응집은 보이지 않았다.
적혈구 응집시험
mIgG MABL-2(intact) 대조 0.01 0.1 1 10 100 ㎍/㎖ - - - - - - - - + +++ +++ ++
scFv/CHO 모노머 scFv/CHO 다이머 대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 ㎍/㎖ - - - - - - - - - - - - - -
scFv/E.coli 모노머 scFv/E.coli 다이머 대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 160 ㎍/㎖ - - - - - - - - - - - - - - -
실시예 6 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 sc(Fv)2 및 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2항체 scFv
6.1 MABL-2항체 sc(Fv) 2 발현 플라스미드의 구축
MABL-2항체 유래의 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 [sc(Fv)2]를 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해, 상술 pCHOM2(MABL-2항체 유래의 scFv를 코드하는 DNA를 함유한다)를 이하에 나타낸 바와 같이 PCR법에 의해 수식하고, 얻어진 DNA단편을 pCHOM2에 도입하였다.
PCR에 사용하는 프라이머는, 센스 프라이머로서 EF1α를 코드하는 DNA에 혼성화하는 EF1프라이머(서열번호:30)를 사용하고, 안티센스 프라이머로서 L쇄 V영역의 C단말을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 연결기 영역을 코드하는 DNA서열(서열번호:19) 및 SalI제한효소 인식부위를 갖는 VLLAS프라이머(서열번호:31)를 사용 하였다.
PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer #1, 1mM MgCl2, 0.2mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 KOD DNA폴리머라제(이상 도요보사 제작), 1μM의 각프라이머 및 100ng의 주형 DNA(pCHOM2)를 함유한다. PCR용액을 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 및 74℃에서 1분간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 30회 반복하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제하고, SalI로 소화하여, 얻어진 DNA단편을 pBluescript KS+벡터(도요보사 제작)에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 SalI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 SalI로 소화한 pCHOM2에 Rapid DNA Ligation Kit(BOEHERINGER MANNHEIM사 제작)을 사용하여 연결하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHOM2(Fv)2로 명명하였다(도34를 참조). 본 플라스미드 pCHOM2(Fv)2에 함유되는 MABL-2항체 sc(Fv)2영역의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:32에 나타낸다.
6.2 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2항체 scFv발현 플라스미드의 제작
다양한 길이의 펩티드 링커를 갖고, 그리고 [H쇄]-[L쇄](이하, HL), [L쇄]-[H쇄](이하, LH)가 되도록 V영역을 연결한 scFv를, MABL-2 유래의 H쇄 및 L쇄 cDNA를 주형으로서 이하와 같이 제작하였다.
HL타입의 scFv를 제작하기 위해, 우선 pCHOM2(Fv)2를 주형으로서 CFHL-F1 (서열번호:33) 및 CFHL-R2(서열번호:34)프라이머, CFHL-F2(서열번호:35) 및 CFHL-R1 프라이머(서열번호:36)에 의해 KOD폴리머라제로 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하여 PCR반응을 수행하고, 5'측에 리더서열을 함유하는 H쇄 및 3'측에 FLAG서열을 함유하는 L쇄의 cDNA유전자를 제작하였다. 얻어진 H쇄 및 L쇄 cDNA를 주형으로서 혼합하고, KOD폴리머라제로 94℃ 30초간, 60℃ 30초간 및 72℃ 1분간의 반응을 5회 반복하여 PCR반응을 수행하고, CFHL-F1 및 CFHL-R1 프라이머를 가하여, 또 30사이클을 반응하는 것에 의해 링커를 함유하지 않는 HL-O타입의 cDNA를 제작하였다.
LH타입의 scFv를 제작하기 위해, 우선 MABL-2의 L쇄 및 H쇄 V영역의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H(일본특허출원 평11-63557참조)를 주형으로서 각각 T7(서열번호:37)및 CFLH-R2(서열번호:38)프라이머, CFLH-F2(서열번호: 39) 및 CFLH-R1(서열번호:40)프라이머를 사용하여 KOD폴리머라제(도요보사 제품)로 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하여 PCR법을 수행하여, 5'-측에 리더서열을 함유하는 L쇄, 및 3'-측에 FLAG서열을 함유하는 H쇄의 cDNA유전자를 제작하였다. 얻어진 L쇄 및 H쇄의 cDNA를 주형으로서 혼합하고, KOD폴리머라제로 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하여 PCR반응을 수행하고, 5'측에 리더서열을 함유하는 L쇄, 및 3'측에 FLAG서열을 함유하는 H쇄의 cDNA유전자를 제작하였다. 얻어진 L쇄 및 H쇄 cDNA를 주형으로 혼합한, KOD폴리머라제 에 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간의 반응을 5회 반복하는 PCR반응을 수행하고, T7 및 CFLH-R1프라이머를 가하여, 30사이클 반응을 더 하였다. 이 반응산물을 주형으로 하고, CFLH-F4(서열번호:41) 및 CFLH-R1프라이머를 사용하여, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 수행하는 것에 의해, 링커를 함유하지 않는 LH-O타입의 cDNA를 제작하였다.
이렇게 하여 제작된 LH-O, HL-O타입의 cDNA를 제한효소 EcoRI, BamHI(다카라 쇼조)처리하고, XhoI제한효소 절단부위를 함유하지 않는 포유동물 발현 플라스미드 INPEP4에 Ligation High(Toyobo Inc. 제작)를 사용하여 도입하고, Competent E. coli JM109(니폰진 제작)를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균에서 QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN사 제작)로 플라스미드를 정제하였다. 이렇게 하여, 플라스미드 pCF2LH-O 및 pCF2HL-O을 제작하였다.
다음에, 링커 사이즈가 다른 발현 플라스미드를 제작하기 위해 HL타입에서는 pCF2HL-O을 주형으로서 CFHL-X3(서열번호:42), CFHL-X4(서열번호:43), CFHL-X5(서열번호:44), CFHL-X6(서열번호:45) 또는 CFHL-X7(서열번호:46)의 센스프라이머 및 안티센스 프라이머로서, 벡터서열에 상보적인 BGH-1(서열번호:47) 프라이머를 사용하여, KOD폴리머라제로 94℃ 30초간, 60℃ 30초간, 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 수행하고, 얻어진 반응산물을 제한효소 XhoI, BamHI(다카라 슈조)로 처리하였다. 얻어진 단편을 pCF2HL-O의 Xhol, BamHI 부위에 Ligation High(도요보사 제품)를 사용하여 도입하고, Competent E. coli JM109를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이 렇게 하여, 발현 플라스미드 pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 및 pCF2HL-7을 제작하였다. 또, COS7세포에서의 일과적 발현에 사용하는 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6, 및 pCF2HL-7을 제한효소 EcoRI 및 BamHI(Takark Shuzo)로 처리하고, 약 800bp의 단편을 아가로스겔 전기영동에 의한 겔로부터의 회수에 의해 정제하였다. 얻어진 단편을 포유동물 세포발현 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 및 BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, Competent E. coli DH5α(Toyobo Inc. 제작)을 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이렇게 하여, 발현 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1, CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1, CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 및 CF2HL-7/pCOS1을 제작하였다. 대표적인 예로서, 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1의 구조를 도35에 나타내고, 이들에 함유되는 MABL2-scFv<HL-0>의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 48에 나타낸다. 또 각 플라스미드의 링커 부분의 염기 서열 및 아미노산 서열을 도36에 나타낸다.
또, 링커사이즈가 다른 LH타입의 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2LH-0를 주형으로서 CFLH-X3(서열번호:49), CFLH-X4(서열번호:50), CFLH-X5(서열번호: 51), CFLH-X6(서열번호:52) 또는 CFLH-X7(서열번호:53)의 센스프라미어 및 안티센스 프라이머로서 벡터 서열에 상보적인 BGH-1프라이머를 사용하여, KOD폴리머라제로 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 수행하고, 얻어진 반응산물을 제한효소 XhoI, BamHI로 처리하였다. 얻어진 단편을 pCF2LH-O의 XhoI, BamHI부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, Competent E. coli DH5α(Toyobo Inc. 제작)를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이렇게 하여, 발현 플라스미드 pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 및 pCF2LH-7을 제작하였다. 또한, COS7세포에서의 일과적 발현에 사용하는 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2LH-0, pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6, 및 pCF2LH-7을 제한효소 EcoRI 및 BamHI(다카라 쇼조사 제작)로 처리하고, 약 800bp의 단편을 아가로스겔 전기영동에 의한 겔로부터의 회수에 의해 정제하였다. 얻어진 단편을 포유동물 세포 발현 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 및 BamHI부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, Competent E. coli DH5α(Toyobo Inc. 제작)를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이렇게 하여, 발현 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1, CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1, CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 및 CF2LH-7/pCOS1을 제작하였다. 대표적인 예로서, 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1의 구조를 도37에 나타내고, 이들에 함유되는 MABL2-scFv<LH-0>의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:54에 나타낸다. 또, 각 플라스미드의 링커 부분의 염기 서열 및 아미노산 서열을 도38에 나타낸다.
6.3 COS7세포에 있어서의 scFv 및 sc(Fv) 2 의 발현
(1) 유혈청 배지에서의 배양상청의 조제
HL타입, LH타입 scFv 및 sc(Fv)2의 발현을 위해, COS7세포(JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation)에서의 일과적 발현을 수행하였다. COS7세포는 10%소 태아 혈청(HyClone사 제작)을 함유하는 DMEM배지(GIBCO BRL사 제작)에서, 37℃의 탄산가스 항온조 중에서 연속배양하였다. 6.2에서 구축한 CF2HL-0, 3∼7/pCOS1, 또는 CF2LH-0, 3∼7/pCOS1 또는 pCHOM2(Fv)2벡터를, Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포에 트렌스펙션하였다. DNA(10㎍)와 DMEM(10% FBS, 5mM BES(SIGMA사 제작)) 배지 중 2×107세포/㎖의 0.25㎖를 큐벳으로 부가하고, 10분간 정치 후에 0.17kV, 950μF의 용량으로 펄스를 부가하였다. 10분간 정치 후, 일렉트로포레이션된 세포를 DMEM배양액(10% FBS)배지에 혼합하고, 75cm3플라스크에 부가하였다. 72시간 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해, 세포파편을 제거하고, 또한, 0.22㎛ 보틀탑필터(bottle top filter,(FALCON사 제작))로 여과하고, 이것을 배양상청(CM)으로 하였다.
(2) 무혈청 배지에서의 배양상청의 조제
상기 (1)과 동일한 방법으로 트랜스펙션한 세포를 DMEM(10% FBS)배지에 부가하여, 75cm3플라스크에서 하룻밤 배양 한 후, 배양상청을 버리고, PBS로 세정 후, CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 72시간 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해, 세포 파편을 제거하고, 또 0.22㎛ 보틀탑필터로 여과하여, CM을 얻었다.
6.4 COS7 CM 중의 scFv 및 sc(Fv) 2 의 검출
상기 6.3(2)에서 조제된 COS7의 CM 중에 있어서의 다양한 MABL2-scFv 및 sc(Fv)2의 폴리펩티드를 하기와 같이 웨스턴 블로팅법에 의해 검출하였다.
각 COS7의 CM에 관해서 SDS-PAGE를 수행하고, REINFORCED NC막(Schleicher &Schuell사 제작)에 전사하였다. 5%탈지우유(Morinaga Nyu-gyo사 제작)로 블로킹을 수행하고, TBS로 세정 후, 항FLAG항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 퍼옥시다제 표식 항마우스 IgG항체(Jackson Immuno Research사 제작)를 부가하고, 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 기질용액을 첨가하여 발색시켰다(도39).
6.5 유동세포 분석법
MABL2-scFVs 및 sc(Fv)2의 인간 Integrin Associated Protein(IAP)항원으로의 결합을 측정하기 위해서, 상기 6.3(1)에서 조제된 COS7세포 배양상청을 사용하여유동세포 분석법을 수행하였다. 인간IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포 2×105개에, 실시예 6.3(1)에서 얻은 배양 상청 또는 대조로서 COS7세포의 배양상청을 부가하고, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, 10㎍/㎖의 마우스 항FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FITC표식 항마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 부가하였다. 다시 인큐베이션 및 세정의 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, 각 COS7배양상청 중의 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL2-scFv 및 sc(Fv)2은 인간 IAP에 대하여 높은 친화성을 갖는 것을 나타내었다(도 40a 및 b).
6.6 in vitro에서의 아폽토시스 유발 효과
상기 1.3에서 조제된 COS7세포 배양상청에 관해서, 인간 IAP를 유전자도입한 L1210세포(hIAP/L1210)에 대한 아폽토시스 유도작용을 Annexin-V(Boehringer Mannheim제작)염색에 의해 검사하였다.
hIAP/L1210세포 5×104개에 각 벡터를 형질전환한 COS7세포 배양상청 또는 대조로서 COS7세포 배양상청을 최종농도 10%로 첨가하여, 24시간 배양하였다. 그런 후, Annexin-V/PI 염색을 수행하고, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, COS7 CM 중의 scFv<HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> 및 sc(Fv)2는 hIAP/L1210세포에 대하여 현저한 세포사를 유도하였다. 얻어진 결과를 도 41에 각각 나타낸다.
6.7 MABL2-scFv 및 sc(Fv) 2 의 CHO세포용 발현벡터의 구축
상기 MABL2-scFv 및 sc(FV)2을 배양상청으로부터 정제하는 것을 목적으로서, 이들을 CHO세포로 발현시키기 위해 발현벡터를 이하와 같이 구축하였다.
상기 1.2로 조제한 pCF2HL-0, 3∼7, 및 pCF2LH-0, 3∼7의 EcoRI-BamHI단편을 CHO세포용 발현 벡터 pCH01의 EcoRI 및 BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, Competent E. coli DH5α로 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN)로 플라스미드를 정제하였다. 이와 같이 하여, 발현 플라스미드 pCHOM2HL-0, 3∼7, 및 pCHOM2LH-0, 3∼7을 제작하였다.
6.8 MABL2-scFv<HL-0, 3∼7>, MABL2-scFv<LH-0, 3∼7> 및 sc(Fv) 2 발현 CHO세포의 제작, 및 그 배양상청의 조제
상기 1.7에서 구축한 발현플라스미드 pCHOM2HL-0, 3∼7, 및 pCHOM2LH-0, 3∼7 및 pCHOM2(Fv)2 벡터를 이하와 같이 CHO세포에 형질전환하고, 각 개변항체를 항상적으로 발현하는 CHO세포를 제작하였다. 그 대표적인 예로서, MABL2-scFv<HL-5>, sc(Fv)2를 항상적으로 발현하는 CHO세포의 제작을 하기에 나타낸다.
발현 플라스미드 pCHOM2HL-5 및 pCHOM2(Fv)2를 제한효소 PvuI로 소화하여 직쇄상으로 하고, 이것을 Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 CHO세포에 트랜스펙션하였다. DNA(10㎍)와, PBS 중 1×107세포/㎖의 0.75㎖를 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 핵산 함유 α-MEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 배양상청을 제거하고, PBS로 린스한 후, 10% 소태아 혈청을 함유하는 무핵산α-MEM배지(GIBCO BRL사 제작)를 부가하여 배양하였다. 약 2주간 배양한 후, 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 최종농도 10nM로 함유하는 배지에 더 배양하고, 그 후 50nM, 그리고 100nM 농도를 차례로 높여서, 배양을 계속하였다. 이렇게 하여 얻은 세포를 롤러보틀 중에서 무혈청배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하고, 또, 0.20㎛ 필터로 여과하여, 각각의 CM을 얻었다.
동일하게 하여, MABL2-scFv<HL-0, 3, 4, 6, 7> 및 <LH-0, 3, 4, 5, 6, 7>을 항상적으로 발현하는 CHO세포 및 그들의 CM을 얻었다.
6.9 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) 2 의 정제
하기의 2종류의 정제법에 의해, 상기 6.8에서 얻은 CM으로부터 MABL2-scFv<HL-5> 및 sc(Fv)2의 정제를 수행하였다.
<정제법1> HL-5 및 sc(Fv)2를, 그 폴리펩티드의 C말단의 Flag서열을 이용한 항Flag 항체 친화성 칼럼 크로마토그래피 및 겔여과를 사용하여 정제하였다. 150mM NaCl을 함유하는 50mM Tris염산완충액, pH7.5(TBS)으로 평형화된 항Flag M2 Affinity 겔(SIGMA사 제작)로 작성된 칼럼(7.9㎖)에 상기 6.8에서 얻은 CM(1리터)을 첨가하고, TBS로 칼럼을 세정 후, 0.1M 글리신 염산완충액, pH 3.5에서 scFv를 칼럼으로부터 용출시켰다. 얻어진 부분을 SDS/PAGE로 분석하고, scFv의 용출을 확인하였다. scFv부분을 최종 농도가 0.01%가 되도록 Tween 20을 가하고, Centricon-10 (MILIPORE사 제작)으로 농축하였다. 농축액을 150mM NaCl 및 0.01%Tween20을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH 6.0으로 평형화한 TSKgel G3000SW칼럼(7.5×600mm)에 부가하였다. 유속 0.4㎖/분으로 scFv는 280nm의 흡수로 검출하였다. HL-5는 주요 피크로서 다이머의 위치에, sc(Fv)2는 모노머의 위치에서 각각 용출시켰다.
<정제법2> HL-5 및 sc(Fv)2를 이온교환크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 및 겔 여과의 3공정으로 정제하였다. 이온교환크로마토그래피에서는, HL-5에서는 Q sepharose fast flow칼럼(Pharmacia사 제작)을, sc(FV)2에서는 SP-sepharose fast flow칼럼을 사용하고, 제2공정 이후는 HL-5와 sc(Fv)2에서 동일한 조건을 사용하였다.
(제1공정) HL-5
HL-5의 CM은, 0.02% Tween 20을 함유하는 20mM Tris 염산완충액, pH 9.0으로 2배 희석한 후에, 1M Tris로 pH를 9.0으로 조정하였다. 이 후, 0.02% Tween 20을 함유하는 20mM Tris염산완충액, pH8.5로 평형화된 Q sepharose fast flow칼럼에 부가하고, 동일한 완충액 중 0.1M∼0.55M까지의 NaCl의 직선농도구배로 칼럼에 흡착된 폴리펩티드를 용출하였다. 얻어진 부분을 SDS/PAGE로 분석하고, HL-5를 함유하는 부분을 수집하고, 제 2공정의 하이드록시아파타이트에 부가하였다.
(제1공정) sc(Fv)2용
sc(Fv)2의 CM은, 0.02% Tween 20을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH 5.5으로 2배 희석한 후에, 1M초산으로 pH를 5.5로 조정하였다. 0.02% Tween20을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH5.5로 평형화된 SP-Sepharose fast flow칼럼에 부가하고, 동일 완충액 중, NaCl농도를 0∼0.5M까지 직선적으로 높여서, 칼럼에 흡착된 폴리펩티드를 용출시켰다. 얻어진 부분을 SDS/PAGE로 분석하고, sc(Fv)2을 함유하는 부분을 수집하고, 제 2공정의 하이드록시아파타이트에 부가하였다.
(제2공정) HL-5 및 sc(Fv)2의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피
제1공정에서 얻은 HL-5부분 및 sc(Fv)2의 부분을 각각 0.02% Tween 20을 함 유하는 10mM 인산 완충액, pH 7.0으로 평형화된 하이드록시아파타이트 칼럼(BioRad사 제작, 타입I)에 첨가하고, 동일한 완충액으로 칼럼을 세정 후, 인산 완충액 농도를 0.5M까지 직선적으로 높여서, 칼럼에 흡착된 폴리펩티드를 용출시켰다. 각 부분을 SDS/PAGE로 분석하고, 소망의 폴리펩티드가 함유되는 부분을 수집하였다.
(제3공정) HL-5 및 sc(Fv)2의 겔 여과
제2공정에서 얻은 각 부분을 각각 Centriprep-10(MILLIPORE사 제작)으로 농축하고, 0.02% Tween 20 및 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH 6.0로 평형화된 Superdex 200 칼럼(2.6×60cm, 파마시아사 제작)에 부가하였다. HL-5는 다이머의 위치에서, sc(Fv)HL-5 및 sc(Fv)2는 모노머의 위치에 각각 주요 피크로서 용출되었다.
어느 것의 정제법에 있어서도, HL-5의 모노머는 거의 검출되지 않았기 때문에, 단일쇄 Fv의 링커의 아미노산 잔기수가 5개 정도이면, 효율적으로 단일쇄 Fv의 다이머가 형성될 수 있는 것이 판명되었다. HL-5다이머 및 sc(Fv)2는 모두 정제된 후에도 4℃에서 1개월간 안정적으로 유지되었다.
6.10 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(FV) 2 의 항원결합 활성평가
정제된 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)2 의 인간 Integrin Associated Protein(IAP)항원으로의 결합을 측정하기 위해, 유동세포 분석법을 수행하였다. 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포(hIAP/L1210) 또는 대조로서 pCOS1벡터를 트랜스펙션한 L1210세포(pCOS1/L1210) 2×105개에, 10㎍/㎖의 정제 MABL2-scFv<HL5>의 다이머, MABL2-sc(Fv)2, 양성 대조로서 모노크로날 항체 MABL-2, 음성 대조로서 마우스 IgG(Zymed사 제작)을 가하여, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, 10㎍/㎖의 마우스 항FLAG항체(SIGMA사 제작)을 부가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FIFC표식 항마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 부가하였다. 다시 인큐베이션 및 세정 후, FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.
그 결과, 정제 MABL2-scFv<HL5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)2은 hIAP/L1210세포에 특이적으로 결합한 것에 의해, scFv<HL5>의 다이머 및 sc(Fv)2가 인간 IAP에 대해 높은 친화성을 갖는 것이 나타났다(도42).
6.11 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) 2 의 in vitro 아폽토시스 유발효과
정제된 MABL2-scFv<HL5>의 다이머 및 sc(Fv)2에 관해서, 인간 IAP를 유전자 도입시킨 L1210세포(hIAP/L1210) 및 인간 백혈병 세포주 CCRF-CEM에 대한 아폽토시스 유발 작용을 Annexin-V(BOEHRINGER MANNHEIM사 제작)염색에 의해 검사하였다.
hIAP/L1210세포 5×104개 또는 CCRF-CEM 세포 1×105개에, 정제 MABL2-scFv <HL5>의 다이머, MABL2-sc(Fv)2, 양성 대조로서 모노크로날 항체 MABL-2, 음성 대조로서 마우스 IgG를 다양한 농도로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 Annexin-V 염색을 수행하고, FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, MABL2-scFv<HL5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)2는 hIAP/L1210, CCRF-CEM이 두개의 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포사를 유도하였다(도43). 이 결과, MABL2-scFv<HL5>의 다이머 및 MABL2-sc<Fv>2은, 원래의 모노크로날 항체 MABL-2와 비교하여 개선된 아폽토시스 유도작용을 갖는 것이 나타났다.
6.12 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) 2 의 적혈구 응집시험
실시예 5.15를 따라서, 다양한 농도로 제조된 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)2의 혈액응집시험을 실시하였다.
모노크로날 항체 MABL-2(양성대조)에서는 혈액응집이 일어나는 데 대해, 단일쇄 항체의 MABL2-sc(Fv)2 및 MABL2-sc(Fv)<HL5>는 응집되지 않았다. 또, MABL-2항체를 사용한 완충액의 차도 거의 나타나지 않았다. 그 결과를 하기의 표 3에 나타낸다.
Figure 112003011358645-pct00001
6.13 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) 2 의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과
실시예 6.8 및 6.9에서 제작, 정제된 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)2에 관해서, 그 항종양효과를 시험하였다. 구체적으로는 실시예 5.14(3)에서 제작된 인간 골수종 마우스 모델을 사용하고, 마우스 혈청 중에 있어서의 인간 골수종 세포가 생산하는 M단백질을 ELISA에 의해 정량하고, 아울러 마우스의 생존일수를 기록하였다. 그리고, 혈청 중의 M단백질량의 변화 및 생존일수에 의해, scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)2의 항종양 효과를 평가하였다.
또, 본 시험에 있어서, HL-5 및 sc(Fv)2는 vehicle(150mM NaCl, 0.02% Tween 및 20mM 초산완충액, pH 6.0)중의 0.01, 0.1 또는 1mg/㎖의 용액으로서, 투여량이 0.1, 1 또는 10mg/kg이 되도록 마우스에게 투여하였다. 또, 대조는 vehicle만을 투여하였다.
인간 골수종 세포 이식 후 26일째에 혈청을 채취하여, 혈청 중의 M단백질량을 ELISA에 의해 실시예 5.14에 따라서 측정하였다. 그 결과, HL-5투여군 및 다이머 및 sc(Fv)2투여군 모두, 혈청 중의 M단백질량이 투여량 의존적으로 감소하고 있었다(도44를 참조). 또한, 그 생존시간에 대해서는, HL-5투여군(도45) 및 sc(Fv)2투여군(도46)과 함께 대조(vehicle 투여군)와 비교하여 유의한 생존시간의 연장이 관찰되었다. 이들의 결과는 본 발명의 HL-5 및 sc(Fv)2가 in vivo에 있어서도 우수한 항종양 작용을 갖는 것을 나타내고 있다.
실시예7 인간 MPL에 대한 인간 항체 12B5의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv
인간 MPL에 대한 인간 모노크로날 항체 12B5의 V영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 하여 구축하였다.
7.1 12B5 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 구축
인간 MPL에 결합하는 인간 항체12B5 H쇄 V영역을 코드하는 유전자는, 상기 유전자의 염기 서열(서열번호:55)을 사용하여, 그 5'말단에 인간 항체 유전자 유래의 리더서열(서열번호:56)(Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63-69)을 연결시키는 것으로 설계되었다. 설계된 염기 서열은 각각 15bp의 오버랩 서열을 지니도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12B5VH-1, 12B5VH-2, 12B5VH-3, 12B5VH-4)로 분할되고, 12B5VH-1(서열번호:57) 및 12B5VH-3(서열번호:59)은 센스방향으로, 12B5VH-2(서열번호:58) 및 12B5VH-4(서열번호:60)는 안티센스 방향으로 각각 합성되었다. 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 어셈블리시킨 후, 외측 프라이머(12B5VH-S 및 12B5VH-A)를 부가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또, 12B5VH-S(서열번호: 61)은 전방 프라이머 리더 서열의 5'말단에 혼성화되고, 또한, Hind III제한효소 인식서열 및 코작서열을 지니도록, 또, 12B5VH-A(서열번호:62)는 후방프라이머로 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기 서열에 혼성화하고, 또 스플라이스 도너 서열 및 BamHI제한효소 인식서열을 지니도록 각각 설계하였다.
PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 2.5피코몰(p mole)씩의 합성 올리고뉴클레오티드 12B5VH-1∼4를 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간, 그리고 다음에 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 100p mole씩의 외측 프라이머 12B5VH-S 및 12B5VH-A를 부가하고, 또한, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.
PCR생성물은 1.5% 저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한효소 BamHI 및 Hind III로 소화하고, 인간 H쇄 발현벡터 HEF-gγ1에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12B5H-gγ1이라 명명하였다.
또, HEF-12B5H-gγ1을 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 12B5VH를 코드하는 유전자를 조제한 후, 인간 Fab H쇄 발현 벡터 pCOS-Fd에 삽입하여, pFd-12B5H를 얻었다. 또, 인간 Fab H쇄 발현 벡터는 인간 항체 H쇄 V영역과 정상 영역을 코드하는 유전자간에 존재하는 인트론 영역 및 인간 H쇄 정상 영역의 일부를 코드하는 유전자를 함유하는 DNA(서열번호63)를 PCR법을 사용하여 증폭한 후, 동물세포 발현 벡터 pCOS1에 삽입하는 것으로 구축된 벡터이다. 인간 H쇄 정상영역은 HEF-gγ1을 주형으로 하고, 상기와 동일한 조건 하에서 유전자의 증폭을 수행하고, 전방 프라이머로서 인트론1의 5'단의 서열과 혼성화하고, 또 EcoRI 및 BamHI제한효소 인식서열을 갖도록 설계한 G1CH1-S(서열번호:64)를, 후방프라이머로서 인간 H쇄 정상영역 CH1 도메인의 3'단의 DNA에 혼성화하고, 또한, 힌지 영역의 일부를 코드하는 서열, 2개의 정지코돈 및 Bg1 II제한효소 인식부위를 갖도록 설계한 G1CH1-A(서열번호:65)를 사용하였다.
플라스미드 HEF-12B5H-gγ1 및 pFd-12B5H에 함유되는 재구성 12B5 H쇄 가변영역의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:66에 나타낸다.
7.2 12B5 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 구축
인간 MPL에 결합하는 인간 항체12B5 L쇄 V영역을 코드하는 유전자는, 상기 유전자의 염기 서열(서열번호:67)을 사용하고, 그 5'말단에 인간 항체 유전자 3D6(Nuc, Acid Res. 1990: 18; 4927)유래의 리더서열(서열번호:68)을 연결시키는 것으로 설계되었다. 설계된 염기 서열은 상기와 동일하게 각각 15bp의 오버랩 서열을 지니도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12B5VL-1, 12B5VL-2, 12B5VL-3, 12B5VL-4)로 분할되고, 각각 합성하였다. 12B5VL-1(서열번호 69) 및 12B5VL-3(서열번호:71)은 센스서열, 12B5VL-2(서열번호:70) 및 12B5VL-4(서열번호:72)는 안티센스 서열을 갖고, 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 어셈블리시킨 후, 외측 프라이머(12B5VL-S 및 12B5VL-A)를 부가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또, 12B5VL-S(서열번호:73)는 전방 프라이머에서 리더 서열의 5'말단에 혼성화되고, 또한, Hind III제한효소 인식서열 및 코작서열을 지니도록, 또, 12B5VL-A(서열번호:74)는 후방프라이머에서 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기 서열에 혼성화하 고, 또 스플라이스 도너서열 및 BamHI제한효소 인식서열을 지니도록 각각 설계하였다.
PCR반응은 상기와 동일하게 수행하고, PCR생성물은 1.5% 저융점 아가로스겔 (Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한효소 BamHI 및 Hind III로 소화하고, 인간 L쇄 발현벡터 HEF-gκ에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12B5L-gκ라 명명하였다. 본 플라스미드 HEF-12B5L-gκ에 함유되는 재구성 12B5 L쇄 V영역의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:75에 나타낸다.
7.3 재구성 12B5 단일쇄 Fv(scFv)의 제작
재구성 12B5항체 단일쇄 Fv는 12B5VH-링커-12B5VL의 순으로서, 그 C말단에는 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해, FLAG서열(서열번호:76)을 부가하는 것으로 설계되었다, 또, 링커서열은(Gly4Ser)3의 15아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용하고, 재구성 12B5 단일쇄 Fv(sc12B5)를 구축하였다.
(1) 15아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용한 재구성 12B5 단일쇄 Fv (sc12B5)의 제작
15아미드산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12B5항체 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자는 12B5 H쇄 V영역, 링커영역, 및 12B5 L쇄 V영역을 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결하는 것에 의해 구축하였다. 이 방법을 도47에 모식적으로 나타낸다. 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 제작을 위해 6개의 PCR 프라이머(A∼F)를 사용 하였다. 프라이머 A, C 및 E는 센스서열을 갖고, 프라이머 B, D 및 F는 안티센스서열을 갖는다.
H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 12B5-S(프라이머 A, 서열번호:77)는 H쇄 리더 서열의 5'말단에 혼성화되고, 또한 EcoRI제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 HuVHJ3(프라이머 B, 서열번호:78)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되도록 설계하였다.
링커를 위한 전방 프라이머 RHuJH3(프라이머 C, 서열번호:79)은, 링커의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA와 오버랩되도록 설계하였다. 링커를 위한 후방 프라이머 RHuVK1(프라이머 D, 서열번호: 80)은, 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA와 오버랩되도록 설계하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 HuVK1.2(프라이머 E, 서열번호:81)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 12B5F-A(프라이머 F, 서열번호:82)는, L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 FLAG펩티드를 코드하는 서열(Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), 2개의 전사정지코돈 및 NotI제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다.
제1PCR단계에 있어서 3개의 반응 A-B, C-D 및 E-F를 수행하고, 그리고 제 1PCR로부터 얻어진 3개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 F를 부가하고, 15아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12B5 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제 2PCR). 또, 제1PCR에 있어서는, 재구성 12B5 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12B5H -gγ1(실시예 7.1을 참조), Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser로 이루어지는 링커 영역을 코드하는 DNA서열(서열번호:83)(Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988)을 함유하여 이루어지는 플라스미드 pSCFVT7-hM21(인간형화 ONS-M21항체)(Ohtome, T. et al,. Anticancer Res. 18(1998), 4311-4316), 및 재구성 12B5 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12B5L-gκ(실시예 7.2를 참조)을 각각 주형으로서 사용하였다.
제 1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA폴리머라제, AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 100p mole씩의 각 프라이머 및 100ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간 그리고 다음에 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.
PCR생성물 A-B, C-D 및 E-F는 제 2PCR로 어셈블리시켰다. 제2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕의 제 1PCR반응물 A-D, 0.5㎕의 PCR반응물 C-D 및 1㎕의 PCR반응물 E-F, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)을 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고, 다음에 94℃에서 2분간, 65℃에서 2분간, 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 각각 100p mole씩의 프라이머 A 및 F 를 부가하였다. 그리고 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 및 72℃에서 1분의 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
제 2PCR에 의해 생성된 DNA단편을 1.5%저융점 아가로스겔을 사용하여 정제하고, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 및 pCOS1벡터(일본특허출원 평8-255196)에 클로닝하였다. 또, 본 발명 벡터 pCHO1은 DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO 92/19759참조)로부터, EcoRI 및 SmaI소화에 의해, 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamHI 어댑터를 제조하는 것에 의해 구축된 벡터이다. DNA서열 결정 후, 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHO-sc12B5 및 pCOS-sc12B5라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-sc12B5 및 pCOS-sc12B5에 함유되는 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 84에 나타낸다.
7.4 포유동물을 사용한 각 12B5항체(IgG, Fab) 및 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현
12B5항체(IgG, Fab) 및 12B5항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)는 COS-7세포 또는 CHO세포를 사용하여 발현시켰다.
COS-7세포를 사용한 일과적인 발현은 다음과 같이 하여 수행되었다. 즉, Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 유전자 도입하였다. 12B5항체(IgG)의 발현에는 상술의 발현벡터 HEF-12B5H-gγ1 및 HEF-12B5L-gκ각 10㎍씩을, 12B5 Fab단편의 발현에는 pFd-12B5H와 HEF-12B5L-gκ각 10㎍씩을, 단일쇄 Fv의 발현에는 pCOS-sc 12B5(10㎍)을 PBS에 현탁한 COS-7세포(1×107세포/ ㎖)0.8㎖에 혼합하고, 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소태아 혈청을 함유하는 DMEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여 배양하였다. 철야 배양 후, 세포를 PBS로 일회 세정하고, 또, 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지를 부가하고, 또, 2일간 배양하였다. 배양상청을 원심분리에 의해 세포 파쇄물을 제거한 후, 0.22㎛의 필터를 통과시키는 것으로 조제하였다.
또, 12B5항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해, pCHO-sc12B5발현 벡터를 하기와 같이 CHO세포에 유전자 도입하였다.
즉, Gene Pulser사 제작(BioRad사 제작)을 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 발현벡터를 CHO세포에 도입하였다. 제한효소 PvuI로 소화하고 직쇄상으로 한 DNA(100㎍)와 PBS에 현탁한 CHO세포(1×107세포/㎖)의 0.8㎖를 혼합한 것을 큐벳으로 가해 얼음 중에서 10분간 정치한 후, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소태아 혈청을 함유하는 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여 배양하였다. 배양 2일 후에 5nm 메토트렉세이트(SIGMA사 제작) 및 10% 소태아 혈청을 함유하는 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에 배양하였다. 얻어진 클론에 대해서, 발현량이 높은 클론을 12B5 단일쇄 Fv의 생산 세포주로서 선택하였다. 5nM메토트렉세이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여, 배양상청을 얻었다.
7.5 CHO세포생산의 12B5유래의 단일쇄 Fv의 정제
7.4에서 얻은 12B5 단일쇄 Fv발현 CHO생산주의 배양상청으로부터의 정제는, 항FLAG항체 칼럼 및 겔여과 칼럼에 의해 수행되었다.
(1) 항FLAG항체 칼럼
배양상청은 PBS로 평형화된 항FLAG M2어피니티 겔(SIGMA사 제작)에 첨가하였다. 동일 완충액으로 칼럼을 세정 후, 완충액을 0.1M 글리신 염산 완충액(pH3.5)에 칼럼에 흡착된 단백질을 용출하였다. 용출부분은, 용출 후 즉시 1M트리스 염산 완충액(pH 8.0)을 가하여 중화하였다. SDS-PAGE로 용출부분을 분석하고, 단일쇄Fv가 확인된 부분을 Centricon-10(MILLIPORE사 제작)을 사용하여 농축하였다.
(2) 겔여과
(1)의 농축액은, 0.01% Tween 20을 함유하는 PBS로 평형화된 Superdex 200칼럼(10×300mm, AMERSHAM PHARMACIA사 제작)에 첨가하였다.
sc12B5는 2개의 피크(A, B)로 구별되어 용출하였다(도48을 참조). 부분 A, B를 14%-SDS-폴리아크릴아미드겔을 사용하여 분석하였다. 샘플을 환원제 첨가, 비첨가로 처리하고, Laem㎖i의 방법에 준하여 전기영동을 수행하고, 영동 후 단백질을 Coomassie Brilliant Blue 염색하였다. 도49에 나타낸 바와 같이, 부분 A, B 모두 환원제의 첨가의 유무에 관계없이, 외관상의 분자량 약 31KD에 단일밴드를 부여하였다. 부분 A 및 B를 Superdex 200 PC 3.2/30(3.2×300mm, AMERSHAM PHARMACIA사 제작)을 사용한 겔여과에 의해 분석한 결과, 부분A에서는 외관상의 분자량 약 44KD, 부분 B에서는 22kD에서 용출되었다(도 50a 및 b를 참조). 이상의 결과로부터 부분 A는 sc12B5 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 다이머이고, B는 모노머이다.
7.6 각 종 단일쇄 Fv의 TPO형태 아고니스트 활성의 측정
인간 TPO수용체(MPL)를 발현하는 Ba/F3세포(BaF/mpl)에 대한 증식활성을 측정하는 것에 의하여, 항MPL 단일쇄 항체의 TPO형태 활성을 평가하였다. BaF/Mpl세포를 1% 소태아혈청(GIBCO사 제작)을 함유하는 RPMI 1640배지(GIBCO사 제작)로 2회 세정한 후, 5×105세포/㎖의 세포밀도가 되도록 배지에 현탁하였다. 항MPL 단일쇄 항체 또는 인간 TPO(R&D Systems사 제작)를 배지로 적당하게 희석하고, 세포현탁액 50㎕에 항체 또는 인간 TPO희석액 50㎕를 부가하여, 96구멍 마이크로웰 평저 플레이트(Falcon사 제작)에 분배하고, CO2인큐베이터(CO농도: 5%)에서 24시간 배양하였다. 배양 후, WST-8시약(살아있는 세포수 측정시약 SF: 나카라이테스크사 제작)을 10㎕부가하고, 직후에 형광흡광 광도계 SPECTRA Fluor(TECAN사 제작)를 사용하여, 측정파장 450nm, 대조파장 620nm의 흡광도를 측정하였다. CO2인큐베이터(CO농도:5%)로 2시간 인큐베이트한 후, SPECTRA Fluor를 사용하여 다시 측정파장 450nm, 대조파장 620nm의 흡광도를 측정하였다. WST-8시약은 살아있는 세포수에 따라서 파장 450nm의 발색반응을 나타내는 것으로부터, 2시간의 흡광도 변화 지표를 BaF/Mpl증식활성을 다음과 같이 산출한 ED 50값에 의해 평가하였다. 우선, 종축을 흡광도, 횡축을 항체농도로 하고, 그 증식반응 곡선이 평평하게 도달한 흡광도를 반응율 100%로 하였다. 반응율 50%부근의 수치에 기초하여 직선 근사에 의해 근사값을 얻고, 이것으로부터 반응율 50%가 되는 항체 농도를 산출하여, 이것을 ED 50값으로 하였다.
각 종 12B5항체 분자를 발현시킨 COS-7세포의 배양상청을 사용하고, MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과, 도 51에 나타낸 바와 같은 항원결합 부위가 이가인 12B5 IgG에서는 농도 의존적으로 흡광도의 상승이 확인되는 TPO형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 대해(ED 50;29nm), 항원결합 부위가 1가인 12B5Fab의 아고니스트 활성은 대단히 약한 것이었다(ED 50;34, 724nM). 그것에 대해, Fab와 동일하게 항원결합 부위가 1가인 단일쇄 Fv(sc12B5)에 있어서는 ED 50값이 75nM과 강한 아고니스트 활성이 확인되었다. 그러나, 단일쇄 Fv에서는 H쇄, L쇄 각 가변영역은 비공유 결합으로 결합하고 있기 때문에, 용액 중에서 각 가변영역이 해리하는 것 외의 분자의 가변영역과 결합하는 이량체 등의 멀티머를 형성하는 것이 알려져 있다. 그래서, 겔여과를 사용하여 정체 sc12B5의 분자량을 측정한 결과, 확실하게 단량체(모노머)와 이량체(다이머)라 생각되는 분자가 확인되었다(도48을 참조). 이어서, 모노머와 다이머의 sc12B5를 각각 단리하고(도50을 참조), 그들의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과, 도51 및 도52에 나타낸 바와 같이, sc12B5모노머에서는 ED 50값이 4438.7nM와 COS-7세포의 배양상청을 사용한 결과에 비해, 아고니스트 활성이 감소되고 약해지는 것이 확인되었다. 그것에 대해, 2가의 항원결합 부위를 지닌 단일쇄 Fv(sc12B5 다이머)에서는, 1가의 sc12B5에 대해 약 400배 강한 아고니스트 활성을 나타내었다(ED 50; 10.1nM). 또한, 2가의 단일쇄 Fv에서는 인간 TOP 및 12B5 IgG의 아고니스트 활성과 동등 또는 그 이상의 아고니스트 활성을 나타내었다.
실시예8 (인간 MPL에 대한 인간 항체 12E10 가변영역을 코드하는 유전자의 구축)
인간MPL에 대한 인간 모노크로날 항체 12E10의 가변영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이하여 구축하였다.
8.1 12E10 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자의 구축
인간 MPL에 결합하는 인간 항체 12E10 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자는 WO99/10409에 기재된 아미노산 서열(서열번호:85)을 기초로 서열번호 86에 나타내는 염기 서열을 설계하였다. 또, 그 5'말단에 인간 항체 유전자 유래의 리더서열(서열번호:87)(GenBank accession NO. AF062252)을 연결시키는 것으로 전체 길이의 염기 서열을 설계하였다. 설계된 염기 서열은 각각 15bp의 오버랩 서열을 지니도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12E10VH1, 12E10VH2, 12E10VH3, 12E10VH4)로 분할하고, 12E10VH1(서열번호:88) 및 12E10VH3(서열번호:90)은 센스방향으로, 12E10VH2(서열번호: 89) 및 12E10VH4(서열번호:91)은 안티센스 방향으로 각각 합성하였다. 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 어셈블리시킨 후, 외측 프라이머(12E10VHS 및 12E10VHA)를 부가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또, 12E10VHS(서열번호:92)은 전방 프라이머 리더 서열의 5'말단에 혼성화되고, 또한, Hind III제한효소 인식서열 및 코작크서열을 지니도록, 또, 12E10VHA(서열번호:93)는 후방프라이머로 H쇄 가변영역의 C말단을 코드하는 염기 서열에 혼성화하고, 또 스플라이스 도너 서열 및 BamHI제한효소 인식서열을 지니도록 각각 설계하였다.
PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 2.5피코몰(p 몰)씩의 합성 올리고뉴클레오티드 12E10VH-1∼4를 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간, 그리고 다음에 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 100p mole씩의 외측 프라이머 12E10VHS 및 12E10VHA를 부가하고, 또한, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.
PCR생성물은 1.5%저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한효소 BamHI 및 Hind III으로 소화하고, 인간 H쇄 발현벡터 HEF-gγ1에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12E10H-gγ1이라 명명하였다.
또, HEF-12E10H-gγ1을 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 12E10VH를 코드하는 유전자를 조제한 후, 인간 Fab H쇄 발현 벡터 pCOS-Fd에 삽입하고, pFd-12E10H를 얻었다. 또, 인간 Fab H쇄 발현 벡터는 인간 항체 H쇄 V영역과 정상 영역을 코드하는 유전자 간에 존재하는 인트론 영역 및 인간 H쇄 정상 영역의 일부를 코드하는 유전자를 함유하는 DNA(서열번호:63)관해서 PCR법을 사용하여 증폭한 후, 동물세포 발현용 벡터 pCOS1에 삽입하는 것으로 구축된 벡터이다. 인간 H쇄 정상영역은 HEF-gγ1을 주형으로 하고, 상기와 동일한 조건 하에서 유전자의 증폭을 수행 하고, 전방 프라이머로서 인트론1의 5'단의 서열과 혼성화하고, 또, EcoRI 및 BamHI제한효소 인식서열을 갖도록 설계한 G1CH1-S(서열번호:64)를, 후방프라이머로서 인간 H쇄 정상영역 CH1 도메인의 3'단의 DNA에 혼성화하고, 또한, 힌지 영역의 일부를 코드하는 서열, 2개의 정지코돈 및 Bg1 II제한효소 인식부위를 갖도록 설계한 G1CH1-A(서열번호:65)를 사용하였다.
플라스미드 HEF-12E10H-gγ1 및 pFd-12E10H에 함유되는 재구성 12E10H쇄 가변영역의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:94에 나타낸다.
8.2 12E10 L쇄 가변영역을 코드하는 유전자의 구축
인간 MPL에 결합하는 인간 항체 12E10 L쇄 가변영역을 코드하는 유전자는, WO99/10494에 기재된 아미노산 서열(서열번호:95)를 기초로 서열번호:96에 나타내는 염기 서열을 설계하였다. 또한, 그 5'단에 인간 항체 유전자 유래의 리더서열(서열번호:97)(Mol. Immunol. 1992; 29:1515-1518)을 연결시키는 것으로 설계되었다. 설계된 염기 서열은 상기와 동일하게 각각 15bp의 오버랩 서열을 지니도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3, 12E10VL4)로 분할하고, 각각 합성하였다. 12E10VL1(서열번호:98) 및 12E10VL3(서열번호:100)은 센스서열, 12E10VL2(서열번호:99) 및 12E10VL4(서열번호:101)는 안티센스 서열을 갖고, 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 어샘블리시킨 후, 외측 프라이머(12E10VLS 및 12E10VLA)를 부가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또, 12E10VLS(서열번호:102)는 전방 프라이머에서 리더 서열의 5'단에 혼성화되고, 또한, EcoRI제한효소 인식서열 및 코작서열을 지니도록, 또, 12E10VLA(서열번호: 103)는 후방프라이머로 L쇄 가변영역의 C말단을 코드하는 염기 서열에 혼성화하고, 또 BlnI제한효소 인식서열을 지니도록 각각 설계하였다.
PCR반응은 상기와 동일하게 수행하고, PCR생성물은 1.5%저융점 아가로스겔 (Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한효소 EcoRI 및 BlnI로 소화하고, 인간 람다쇄 정상영역 유전자를 함유하는 pUC19벡터에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 제한효소 EcoRI로 소화하고, 12E10L쇄 가변영역 및 인간 람다쇄 정상영역을 코드하는 유전자를 조제하고, 또, 발현벡터 pCOS1에 삽입하고, 12E10L쇄 유전자(서열번호:104)를 지닌 플라스미드를 pCOS-12E10L이라 명명하였다.
8.3 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작
재구성 12E10항체 단일쇄 Fv는 12E10VH-링커-12E10VL의 순으로 하고, 그 C말단에는 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해, FLAG서열(서열번호: 105)을 부가하는 것으로 설계되었다. 링커서열은(Gly4Ser)3의 15아미드산으로 이루어지는 링커 서열또는 (Gly4Ser)1의 5아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 사용하고, 재구성 12E10 쇄 Fv(sc12E10 및 db12E10)을 구축하였다.
(1) 5아미드산으로 이루어지는 링커 서열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작
5아미드산으로 이루어지는 링커 서열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자 12E10 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 3'단, 및 12E10 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 5'단에(G1y4Ser)1으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기 서열을 부가시킨 유전자에 관해서 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결하는 것에 의해 구축하였다. 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작을 위해 4개의 PCR 프라이머(A∼D)를 사용하였다. 프라이머 A 및 C는 센스서열을 갖고, 프라이머 B 및 D는 안티센스서열을 갖는다.
H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머는 12E10S(프라이머 A, 서열번호:106)를 사용하고, H쇄 V영역을 위한, 후방프라이머 DB2(프라이머B, 서열번호:107)는 사용하고, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y4Ser)1으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기 서열 및 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 염기 서열을 갖도록 설계하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 DB1(프라이머 C, 서열번호: 108)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y4Ser)1으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기 서열 및 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기 서열을 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방프라이머는 12E10FA(프라이머 D, 서열번호:109)는 L쇄 가변영역 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG를 코드하는 염기 서열을 갖고, 또한 NotI제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다.
제 1PCR단계에 있어서 2개의 반응 A-B 및 C-D를 수행하고, 그리고 제 1PCR로부터 얻어진 2개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 D를 부가하고, 5아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제 2PCR). 또, 제1PCR에 있어서는, 재구성 12E10 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12E10H-gγ1(실시예 8.1을 참조), 및 재구성 12E10 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pCOS-12E10L(실시예 8.2를 참조)을 각각 주형으로서 사용하였다.
제 1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 100피코몰씩의 각 프라이머 및 100ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도로 9분간 그리고 다음에 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.
PCR생성물 A-B(429bp) 및 C-D(395pb)는 제 2PCR로 어셈블리시켰다. 제 2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕의 제 1PCR 반응물 A-B 및 PCR반응물 C-D, 100피코몰 씩의 각 프라이머, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl2, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)를 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을 상기와 동일한 조건 하에서 반응시켰다.
제 2PCR에 의해 생성된 795pb의 DNA단편에 관해서, 1.5%저융점 아가로스겔을 사용하여 정제한 후, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 또는 pCOS1벡터에 클로닝하였다. 또, 본 발명 벡터 pCHO1은 DHFR-ΔE-RVH-PM1-f(WO 92/19759참조)로부터, EcoRI 및 SmaI소화에 의해, 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamHI 어댑터를 제조하는 것에 의해 구축된 벡터이다. DNA서열 결정 후, 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라 스미드를 pCHO-db12E10 및 pCOS-db12E10이라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-db12E10 및 pCOS-db12E10에 함유되는 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:110에 나타낸다.
(2) 15아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작
15아미노산으로 이루어지는 링커 배열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자는 12E10 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 3'단, 및 12E10 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 5'단에 각각(G1y4Ser)3로 이루어지는 링커를 코드하는 염기 서열을 부가시킨 유전자에 관해서, 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결하는 것에 의해 구축하였다. 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작을 위해 4개의 PCR 프라이머(A∼D)를 사용하였다. 프라이머 A 및 C는 센스서열을 갖고, 프라이머 B 및 D는 안티센스서열을 갖는다.
H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머는 12E10S(프라이머 A, 서열번호:106)를 사용하고, H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 sc4.3(프라이머 B, 서열번호:111)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 (Gly4Ser)3으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기 서열 및 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 염기 서열을 갖도록 설계하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 sc1.3(프라이머 C, 서열번호:112)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y4Ser)3으로 이루어지는 링커 를 코드하는 염기 서열 및 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기 서열을 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방프라이머는 12E10FA(프라이머 D, 염기 서열: 109)는 L쇄 가변영역 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG를 코드하는 염기 서열을 갖고, 또한 NotI제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다.
제 1PCR단계에 있어서 2개의 반응 A-B 및 C-D를 수행하고, 그리고 제 1PCR로부터 얻은 2개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 D를 부가하고, 15아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제 2PCR). 또, 제 1PCR에 있어서는, 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 플라스미드 pCOS-db12E10(실시예 8.3 (1)을 참조)를 주형으로서 사용하였다.
제 1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×ExTaq Buffer, 0.4mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA폴리머라제 TakaRa ExTaq(이상, 타카라 슈조사 제작), 100p mol씩의 각 프라이머 및 10ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도로 30초간, 그리고 다음에 94℃에서 15초간, 및 72℃에서 2분간의 사이클을 5회, 94℃에서 15초간 및 70℃에서 2분간의 사이클을 5회, 94℃에서 15초간 및 68℃에서 2분간의 사이클을 28회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.
PCR생성물 A-B(477bp) 및 C-D(447pb)는 제 2PCR로 어셈블리시켰다. 제 2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕씩의 제 1PCR 반응물 A-B 및 PCR반응물 C-D, 100피코몰 씩의 프라이머 A 및 D, 5㎕의 10×ExTaq Buffer, 0.4mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 ATakaRa ExTaq(이상, 타카라 슈조사 제작)을 혼합하고, 상기와 동일한 조건 하에서, 반응시켰다.
제 2PCR에 의해 생성된 825bp의 DNA단편에 관해서, 1.0%저융점 아가로스겔을 사용하여 정제하고, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 또는 pCOS1벡터에 클로닝하였다. DNA서열 결정 후, 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHO-sc12E10 및 pCOS-sc-12E10이라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-sc12E10 및 pCOS-sc12E10에 함유되는 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 염기 서열 및 아미노산 서열을 서열번호:113에 나타낸다.
8.4 포유동물을 사용한 각 12E10항체(IgG, Fab) 및 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현
12E10항체(IgG, Fab) 및 12E10항체 유래의 단일쇄 Fv(링커 서열 5아미노산, 15아미노산)는 COS-7세포 또는 CHO세포를 사용하여 발현시켰다.
COS-7세포를 사용한 일과적인 발현은 다음과 같이 하여 수행하였다. 즉, Gene PulserII장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 유전자 도입하였다. 12E10항체(IgG)의 발현에는 상술의 발현벡터 HEF-12E10H-gγ1 및 pCOS-12E10L 각 10㎍씩을, 12E10Fab단편의 발현에는 pFd-12E10H와 pCOS-12E10L 각 10㎍씩을, 단일쇄 Fv의 발현에는 pCOS-sc12E10(10㎍) 또는 pCOS-db12E10(10㎍)을 PBS에 현탁한 COS-7세포(1×107세포/㎖)0.8㎖에 혼합한 것을 큐벳으로 부가하고, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소태아 혈청을 함유하는 DMEM배지(GIBCO BRL사 제작) 에 부가하여 배양하였다. 철야 배양 후, 세포를 PBS로 일회 세정하고, 또, 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)를 부가하고, 또, 3일간 배양하였다. 배양상청을 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거한 후, 0.22㎛의 필터를 통과시키는 것으로 조제하였다.
또, 12E10항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해, pCHO-sc12E10 또는 pCHO-db12E10 발현 벡터를 각각 CHO세포에 유전자 도입하였다.
각 발현벡터를, Gene PulserII장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 CHO세포에 유전자 도입하였다. PvuI소화에 의해 직쇄상으로 한 DNA(100㎍)와 PBS에 현탁한 CHO세포(1×107세포/㎖)의 0.8㎖를 혼합한 것을 큐펫으로 가해, 얼음 중에서 10분간 정치한 후, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 가하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 투석 소태아 혈청 및 핵산을 함유하는 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여 배양하였다. 배양 2일 후에 10%의 투석 소태아 혈청을 함유하는 무핵산 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 배양하였다. 얻어진 클론에 대해서, 발현량이 높은 클론을 12E10 단일쇄 Fv의 생산세포주로서 선택하였다. 이 세포주를 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거 후, 0.22㎛의 필터를 통과시키는 것으로 배양상청을 조제하였다.
8.5 CHO세포 생산의 12E10유래의 단일쇄 Fv의 정제
실시예 8.4에서 얻은 단일쇄 Fv 발현 CHO생산주(sc12E10, db12E10)를, 각각 의 배양상청으로부터 항FLAG항체 칼럼 및 겔여과 칼럼을 사용하여 단일쇄 Fv를 정제하였다.
(1) 항FLAG항체 칼럼을 사용한 정제
배양상청(sc12E10, db12E10)을, 각각 150mM Nacl을 함유하는 50mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)으로 평형화된 항FLAG M2 어피니티 겔(SIGMA사 제작)칼럼에 첨가하여, 동일 완충액으로 칼럼을 세정 후, 100mM 글리신 완충액(pH3.5)으로 칼럼에 흡착된 단백질을 용출하였다. 용출부분은, 즉시 1M트리스 염산 완충액(pH 8.0)을 가하여 중화하였다. SDS-PAGE로 용출부분을 분석하고, 단일쇄 Fv가 확인된 부분을 각각 채우고, Centricon-10(아미콘사 제작)을 사용하여 약 20배 농축하였다.
(2) 겔여과
(1)의 부분을, 0.01% Tween 20을 함유하는 PBS로 평형화된 Superdex 200HR칼럼(10×300mm, AMERSHAM PHARMACIA사 제작)에 첨가하였다. 크로마토그래피를 도53 및 54에 나타낸다. 그 결과, sc12E10에 있어서는 2개의 피크(A, B) 검출되었다(도 53). 또, db12E10에서는, 2개의 피크(C, D)가 검출되었다(도 54). 각각의 피크 부분을 나누어 취하고, 환원제 첨가, 비첨가로 처리하여, Laem㎖i의 방법에 준하여 전기영동을 수행하고, 영동 후 단백질을 Coomassie Brilliant Blue 염색하였다. 도55에 나타낸 바와 같이, 부분 A, 부분 B, 부분 C, 부분 D 모두 환원제의 첨가의 유무에 관계없이 외관상의 분자량 약 31KD에 단일밴드를 부여하였다. 이들의 부분 을 상술의 Superdex 200 HR칼럼을 사용한 겔여과로 분석한 결과, 부분 A는 외관상의 분자량 약42KD, 부분 B는 동일한 20kD에서 용출되었다(도56을 참조). 한편, 부분 C는 외관상의 분자량 약69KD, 부분 D에는 41kD에서 용출되었다(도57을 참조). 이상의 결과로부터 sc12E10유래의 부분 A는 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 다이머이고, 부분 B는 단일쇄 Fv의 모노머이고, 또 db12E10유래의 부분 C는 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 트리머, 부분 D는 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 다이머인 것이 시사되었다.
8.6 각종 단일쇄 Fv의 TPO형태 아고니스트 활성의 측정
인간 TPO수용체(MPL)를 발현하는 Ba/F3세포(BaF/mpl)에 대한 증식활성을 측정하는 것에 의하여, 항mpl 단일쇄 항체의 TPO형태 활성의 평가를 수행하였다.
BaF/Mpl세포를 1%소태아혈청(GIBCO사 제작)을 함유하는 RPMI 1640배지(GIBC O사 제작)로 2회 세정한 후, 5×105세포/㎖의 세포밀도가 되도록 배지로 현탁하였다. 항MPL 단일쇄 항체 또는 인간 TPO(R&D Systems사 제작)를 배지로 적당하게 희석하고, 세포현탁액 50㎕에 항체 또는 인간 TPO희석액 50㎕를 부가하여, 96구멍 마이크로웰 평저 플레이트(Corning사 제작)에 분배하고, CO2인큐베이터(CO농도:5%)에서 24시간 배양하였다. 배양 후, WST-8시약(살아있는 세포수 측정시약 SF: 나카라이테스크사 제작)을 10㎕부가하고, 직후에 흡광 광도계 Benchmark Plus(BioRad사 제작)를 사용하여, 측정파장 450nm, 대조파장 655nm의 흡광도를 측정하였다. CO2인큐베이터(CO농도:5%)에서 2시간 인큐베이트한 후, Benchmark Plus를 사용하여 다시 측정파장 450nm, 대조파장 655nm의 흡광도를 측정하였다. WST-8시약은 살아있는 세포에 따라서 파장 450nm의 발색반응을 보이는 것으로부터, 2시간의 흡광도 변화를 지표로 BaF/mpl세포 증식활성을 평가하였다.
각종 12E10항체 분자를 발현시킨 COS-7세포의 배양상청을 사용하고, MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과를 도58에 나타낸다. 링커 서열 5아미노산 (db12E10) 및 15아미노산(sc12E10)의 단일쇄 Fv에서는 농도 의존적으로 흡광도의 상승이 확인되고, TPO형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 대해(ED 50; 각각 9pM 및 51pM), 12E10 IgG 및 12E10 Fab에서는 전혀 활성이 확인되지 않았다.
단일쇄 Fv는 링커 서열의 길이에 의해서는, H와 L쇄가 분자내 뿐 만 아니라, 분자간에도 결합하는 것에 의해 이량체 등의 멀티머를 형성하는 것이 알려져 있다. 그리고, 12E10 단일쇄 Fv를 발현시킨 CHO세포의 배양상청을 겔여과 부분으로 하고, MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정하였다. 그 결과를 도59에 나타낸다. sc12E10 중에 약간 함유되는 이량체(sc12E10다이머, ED 50; 1.9pM)은 단량체(sc12E10모노머, ED50;〉10nM)에 비하여, 500배 이상 강한 TPO형태 아고니스트 활성을 나타내고, 그 결과는 TPO(ED 50; 27pM) 보다도 강했다. 또, db12E10의 이량체(db12E10다이머, ED 50; 2.0pM)은 sc12E10다이머와 거의 동등의 강한 활성을 나타내었다. 겔여과 분자량으로부터 삼량체라 추정된 db12E10트리스(ED 50; 7.4pM)도 db12E10다이머에는 떨어지지만 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과로부터, 아고니스트 항체 12E10의 활성에는, 항원결합 부위가 2가(다이머)인 것이 중요하다고 생각되지만, 12E10 IgG에는 활성이 보이지 않는 것으로부터, 단지 2가일 뿐만 아니라, 항원결합 부위간의 거리나 각도라는 요소도 중요하다고 추측된다.
본 발명의 개변항체는, 세포표면 상의 분자를 가교하는 것에 의해, 상기 세포내에 신호를 전달할 수 있는 아고니스트 작용을 갖고 있고, 또 친항체(whole IgG)와 비교하여 저분자화가 달성되고 있기 때문에, 조직, 종향으로의 이행성이 우수하다고 하는 특징을 갖고 있다. 또, 본 발명에 의하면, TOP 등의 천연의 리간드나 친항체(whole IgG) 보다 현저하게 높은 아고니스트 활성을 갖는 개변항체가 제공된다. 특히, 친항체 분자에서 아고니스트 활성이 확인되지 않는 경우에 있어서도 천연의 리간드 보다 높은 아고니스트 활성을 갖는 개변항체를 제공할 수 있다. 이들은 본 발명의 개변항체가 항체 분자에 비해 보다 리간드에 가까운 형태이기 때문이라고 생각되어진다. 따라서, 상기 개변항체는 신호 전달 아고니스트로서 사용하고, 아폽토시스 유도, 세포증식 유도, 세포분화 유도, 세포분열 유도 또는 세포주기조절 작용을 이룰 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 항체분자를 본 발명의 개변항체로 하는 것에 의해, 세포간의 가교 등에 의한 부작용을 경감하고, 또한 세포표면 상의 분자를 가교하여 소망의 작용만을 유발할 수 있는 새로운 의약품이 제공된다. 본 발명의 개변항체를 유효성분으로 하는 의약제제는, 암, 염증, 호르몬 이상, 자기면역 질환 및 백혈명, 악성림프종, 재생불량성 빈혈, 골수이형성 증후군 및 진성다혈증 등의 혈액질환의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다.
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Small remodeling agonist antibody <130> PB7400 <150> JP2000-321821 <151> 2000-10-20 <150> JP2000-321822 <151> 2000-10-20 <150> PCT/JP01/01912 <151> 2001-03-12 <150> PCT/JP01/03288 <151> 2001-04-17 <150> JP2001-277314 <151> 2001-09-12 <160> 113 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ggatcccggg agtggataga ccgatg 26 <210> 5 <211> 394 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <223> pGEM-M1L. 1-57;signal peptide, 58-394;mature peptide <400> 5 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gcg 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac cta cag aag cca 192 Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa ata aaa c 394 Glu Ile Lys 130 <210> 6 <211> 409 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <223> pGEM-M1H. 1-57;signal peptide, 58-409;mature peptide <400> 6 atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser 85 90 95 gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g 409 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 7 <211> 394 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <223> pGEM-M2L. 1-57;signal peptide, 58-394;mature peptide <400> 7 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa ata aaa c 394 Glu Ile Lys 130 <210> 8 <211> 409 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <223> pGEM-M2H. 1-57;signal peptide, 58-409;mature peptide <400> 8 atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g 409 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cccaagcttc caccatgaag ttgcctgtta gg 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 cccaagcttc caccatggaa tggagctgga ta 32 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 cgcggatcca ctcacgtttt atttccagct tggt 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 cgcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt 34 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 catgccatgg cgcaggtcca gctgcagcag 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 accaccacct gaggagactg tgagagt 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 gtctcctcag gtggtggtgg ttcgggt 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cacaacatcc gatccgccac cacccga 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ggcggatcgg atgttgtgat gacccaa 27 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker amino acid sequence and nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 19 ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 20 <211> 828 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(822) <223> pscM1. MABL1-scFv <400> 20 atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp 20 25 30 ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192 Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly 50 55 60 cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr 65 70 75 80 aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa 288 Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys 85 90 95 tcc tcc agc gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336 Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp 100 105 110 tct gcg gtc tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac 384 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp 115 120 125 tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln 145 150 155 160 act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528 Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser 165 170 175 tgc aga tct agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta 576 Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu 180 185 190 caa tgg tac cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac 624 Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag 720 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 225 230 235 240 gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768 Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 245 250 255 tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816 Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 260 265 270 gat aaa taatga 828 Asp Lys <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 acgcgtcgac tcccaggtcc agctgcagca g 31 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 gaaggtgtat ccagaagc 18 <210> 23 <211> 819 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(813) <223> pCHOM1. MABL1-scFv <400> 23 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96 Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser 85 90 95 gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu 145 150 155 160 tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct 528 Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 165 170 175 agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac 576 Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr 180 185 190 cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 195 200 205 aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg 672 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 225 230 235 240 gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg 768 Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly 245 250 255 ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa 813 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 265 270 taatga 819 <210> 24 <211> 828 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(822) <223> pscM2. MABL2-scFv <400> 24 atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu 20 25 30 ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192 Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly 50 55 60 cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr 65 70 75 80 aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa 288 Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys 85 90 95 tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336 Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp 100 105 110 tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac 384 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp 115 120 125 tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln 145 150 155 160 agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528 Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser 165 170 175 tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta 576 Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu 180 185 190 cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac 624 His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag 720 Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 225 230 235 240 gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768 Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 245 250 255 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 260 265 270 gat aaa taatga 828 Asp Lys <210> 25 <211> 819 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(813) <223> pCHOM2. MABL2-scFv <400> 25 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96 Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu 145 150 155 160 tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca 528 Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 165 170 175 agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 576 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr 180 185 190 ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 195 200 205 aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg 672 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val 210 215 220 aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720 Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 225 230 235 240 gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg 768 Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa 813 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 265 270 taatga 819 <210> 26 <211> 456 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(450) <223> pCHO-shIAP. Soluble human IAP <400> 26 atg tgg ccc ctg gta gcg gcg ctg ttg ctg ggc tcg gcg tgc tgc gga 48 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 tca gct cag cta cta ttt aat aaa aca aaa tct gta gaa ttc acg ttt 96 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 tgt aat gac act gtc gtc att cca tgc ttt gtt act aat atg gag gca 144 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 caa aac act act gaa gta tac gta aag tgg aaa ttt aaa gga aga gat 192 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 att tac acc ttt gat gga gct cta aac aag tcc act gtc ccc act gac 240 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 ttt agt agt gca aaa att gaa gtc tca caa tta cta aaa gga gat gcc 288 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 tct ttg aag atg gat aag agt gat gct gtc tca cac aca gga aac tac 336 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 act tgt gaa gta aca gaa tta acc aga gaa ggt gaa acg atc atc gag 384 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 cta aaa tat cgt gtt gtt tca tgg ttt tct cca aat gaa aat gac tac 432 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Asp Tyr 130 135 140 aag gac gac gat gac aag tgatag 456 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 145 150 <210> 27 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ggaattccat atgcaagtgc aacttcaaca gtctggacct gaactg 46 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ggaattctca ttattttatt tccagcttgg t 31 <210> 29 <211> 741 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(735) <223> pscM2DEm02. MABL2-scFv <400> 29 atg caa gtg caa ctt caa cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg 48 Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc gct aac 96 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn 20 25 30 cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg 144 His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag 192 Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 50 55 60 ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc 240 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala 65 70 75 80 tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac 288 Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc 336 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg 384 Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg 432 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 130 135 140 cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag 480 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 145 150 155 160 agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag 528 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 165 170 175 aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 576 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 180 185 190 ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat 624 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp 195 200 205 ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat 672 Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 210 215 220 ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc 720 Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 aag ctg gaa ata aaa taatg a 741 Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 cagacagtgg ttcaaagt 18 <210> 31 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 cgcgtcgacc gatccgccac cacccgaacc accaccaccc gaaccaccac caccttttat 60 ttccagcttg gt 72 <210> 32 <211> 1605 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(1599) <223> pCHOM2(Fv)2. MABL2-sc(Fv)2 <400> 32 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96 Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu 145 150 155 160 tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca 528 Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 165 170 175 agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 576 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr 180 185 190 ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 195 200 205 aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg 672 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val 210 215 220 aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720 Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 225 230 235 240 gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg 768 Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 ggg acc aag ctg gaa ata aaa ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt 816 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 260 265 270 tcg ggt ggt ggc gga tcg gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct 864 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser 275 280 285 gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag 912 Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 290 295 300 gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag 960 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln 305 310 315 320 aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat 1008 Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn 325 330 335 gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act 1056 Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 340 345 350 tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc 1104 Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala 355 360 365 tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act 1152 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr 370 375 380 tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt 1200 Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly 385 390 395 400 ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg 1248 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val 405 410 415 atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc 1296 Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala 420 425 430 tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag 1344 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys 435 440 445 acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 1392 Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 450 455 460 ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc 1440 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 465 470 475 480 agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 1488 Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val 485 490 495 gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt 1536 Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val 500 505 510 ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa 1584 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys 515 520 525 gac gat gac gat aaa t aatga 1605 Asp Asp Asp Asp Lys 530 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 tgaggaattc ccaccatggg atg 23 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 cacgacgtca ctcgagactg tgagagtggt gccttggccc 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 agtctcgagt gacgtcgtga tgacccaaag tccactctcc 40 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt c 31 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 37 cgcgtaatac gactcactat ag 22 <210> 38 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 38 gcaattggac ctgttttatc tcgagcttgg tcccccctcc gaacgt 46 <210> 39 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 gctcgagata aaacaggtcc aattgcagca gtctggacct gaact 45 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt ctttgtagtc tgaggagact gtgagagtgg 60 60 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 41 gactgaattc ccaccatgaa gttgcctgtt ag 32 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 42 cagtctcgag tggtggttcc gacgtcgtga tgacccaaag 40 <210> 43 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 cagtctcgag tggtggtggt tccgacgtcg tgatgaccca aag 43 <210> 44 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 cagtctcgag tggtggtggt ggttccgacg tcgtgatgac ccaaag 46 <210> 45 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 cagtctcgag tggtggtggt ggtggttccg acgtcgtgat gacccaaag 49 <210> 46 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 cagtctcgag tggtggtggt ggtggtggtt ccgacgtcgt gatgacccaa ag 52 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 47 ggccgcatgt tgtcacgaat 20 <210> 48 <211> 780 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <223> CF2HL-0/pCOS1. MABL2-scFv<HL-0> <400> 48 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96 Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192 Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 115 120 125 ggc acc act ctc aca gtc tcg agt gac gtc gtg atg acc caa agt cca 432 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga 480 Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg 145 150 155 160 tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg 528 Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp 165 170 175 tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt 576 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 180 185 190 tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca 624 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg 672 Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 210 215 220 gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga 720 Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa 768 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 245 250 255 ta atgaggatcc 780 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 caagctcgag ataaaatccg gaggccaggt ccaattgcag cagtc 45 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 50 caagctcgag ataaaatccg gaggtggcca ggtccaattg cagcagtc 48 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 51 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg ccaggtccaa ttgcagcagt c 51 <210> 52 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 52 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggccaggtc caattgcagc agtc 54 <210> 53 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 53 caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggtggccag gtccaattgc agcagtc 57 <210> 54 <211> 780 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <223> CF2LH-0/pCOS1. MABL2-scFv<LH-0> <400> 54 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctc 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag ata aaa cag gtc caa ttg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 432 Glu Ile Lys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 130 135 140 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 480 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160 gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 528 Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 165 170 175 gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 576 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 180 185 190 gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 624 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr 195 200 205 aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 672 Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 210 215 220 tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 720 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln 225 230 235 240 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gac tac aaa gac gat gac gat aaa 768 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 245 250 255 ta atgaggatcc 780 <210> 55 <211> 351 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <223> 12B5HV. 1-351 peptide <400> 55 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cgg ccc ggg ggg 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga atc acc ctc agg acc tac 96 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Leu Arg Thr Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt tcc aag aac acc ctg tat 240 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc tgg ggc caa ggg aca atg 336 Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 gtc acc gtc tcg agt 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 57 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <223> reader sequence <400> 56 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt 57 Val Gln Cys <210> 57 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-1 <400> 57 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtccggcccg gggggtccct gagtc 115 <210> 58 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-2 <400> 58 aaggatatac ctgccaccca ctccagcccc ttgcctggag cctggcggac ccagtgcatg 60 ccgtaggtcc tgagggtgat tccagagact gcacaggaga gactcaggga ccccc 115 <210> 59 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-3 <400> 59 ggcaggtata tcctttgacg gaagaagtga atactatgca gactccgtgc agggccgatt 60 caccatctcc agagacagtt ccaagaacac cctgtatctg caaatgaaca gcctg 115 <210> 60 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-4 <400> 60 actcgagacg gtgaccattg tcccttggcc ccagatatcg aaaccataat gtgctcctct 60 cgcacagtaa tacacagccg tgtcctcggc tctcaggctg ttcatttg 108 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-S, PCR primer <400> 61 ttcaagcttc caccatggag tttgggctga gc 32 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VH-A, PCR primer <400> 62 ttgggatcca ctcaccactc gagacggtga ccat 34 <210> 63 <211> 558 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (235)..(558) <223> 1-234;intron, 235-558;Human IgG constant region (partial) <400> 63 gaattcgtga gtggatccca agctagcttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt 60 ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc 120 atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg 180 ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca caacctctct tgca 234 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 282 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 330 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 378 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 426 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 474 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 522 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca 558 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1CH1-S, PCR primer <400> 64 tgagaattcg tgagtggatc ccaagct 27 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1CH1-A, PCR primer <400> 65 aaaagatctt tatcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcaactt tcttgtccac 60 60 <210> 66 <211> 432 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (12)..(419) <223> HEF-12B5H-g gamma. 12-419 peptide <400> 66 aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt 44 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val 1 5 10 gct ctt tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg 92 Ala Leu Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 15 20 25 gga ggc ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc 140 Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val 30 35 40 tct gga atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct 188 Ser Gly Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala 45 50 55 cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga 236 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg 60 65 70 75 agt gaa tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga 284 Ser Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 80 85 90 gac agt tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc 332 Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 95 100 105 gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc 380 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe 110 115 120 gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt g gtgagtggat 430 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 125 130 135 cc 432 <210> 67 <211> 321 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> 12B5LV. 1-321 peptide <400> 67 gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 20 25 30 ttg gcc tgg tat cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aag gcc tct agt tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gat gat ttt gca act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc 288 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 66 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(66) <223> reader sequence <400> 68 atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc cca ggt gcc aaa tgt 66 Leu Pro Gly Ala Lys Cys 20 <210> 69 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-1 <400> 69 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 aaatgtgaca tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctat 110 <210> 70 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-2 <400> 70 ggagtttagg ggctttccct ggcttctgct gataccaggc caaccagtga taaataccct 60 cgctggcccg gcaggtgatg gtgactctgt ctccaataga tgcagacagg 110 <210> 71 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-3 <400> 71 aagcccctaa actcctgatc tataaggcct ctagtttagc cagtggggcc ccatcaaggt 60 tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 110 <210> 72 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-4 <400> 72 tttgatctcc agcttggtcc ctccgccgaa agtgagcgga taattactat attgttggca 60 gtaataagtt gcaaaatcat caggctgcag gctgctgatg gtg 103 <210> 73 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-S, PCR primer <400> 73 ttcaagcttc caccatggac atgagggtcc cc 32 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5VL-A, PCR primer <400> 74 tctaggatcc actcacgttt gatctccagc ttggt 35 <210> 75 <211> 415 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (12)..(398) <223> HEF-12B5H-g kappa. 12-398 peptide <400> 75 aagcttccac c atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg 44 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly 1 5 10 ctc ctg ctg ctc tgg ctc cca ggt gcc aaa tgt gac atc cag atg acc 92 Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr 15 20 25 cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc 140 Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile 30 35 40 acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag 188 Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln 45 50 55 cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt 236 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser 60 65 70 75 tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca 284 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 80 85 90 gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act 332 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr 95 100 105 tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga ggg 380 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 110 115 120 acc aag ctg gag atc aaa cg tgagtggatc ctaga 415 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 125 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 76 gac tac aag gat gac gac gat aag 24 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5-S, PCR primer <400> 77 atagaattcc accatggagt ttgggctgag c 31 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HuVHJ3, PCR primer <400> 78 tgaagagacg gtgaccattg tccc 24 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RhuJH3, PCR primer <400> 79 ggacaatggt caccgtctct tcaggtgg 28 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RhuVK1, PCR primer <400> 80 ggagactggg tcatctggat gtccgatccg cc 32 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HuVK1.2, PCR primer <400> 81 gacatccaga tgacccagtc tcc 23 <210> 82 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12B5F-A, PCR primer <400> 82 attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctttgatctc cagcttggt 59 <210> 83 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker amino acid sequence and nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 83 ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 84 <211> 823 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (12)..(809) <223> sc12B5, Single chain Fv <400> 84 aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt 44 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val 1 5 10 gct ctt tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg 92 Ala Leu Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 15 20 25 gga ggc ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc 140 Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val 30 35 40 tct gga atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct 188 Ser Gly Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala 45 50 55 cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga 236 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg 60 65 70 75 agt gaa tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga 284 Ser Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 80 85 90 gac agt tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc 332 Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 95 100 105 gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc 380 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe 110 115 120 gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggt ggt ggt 428 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 125 130 135 ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gac atc cag atg 476 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 140 145 150 155 acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc 524 Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr 160 165 170 atc acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat 572 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr 175 180 185 cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct 620 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser 190 195 200 agt tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg 668 Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 205 210 215 aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca 716 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala 220 225 230 235 act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga 764 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 240 245 250 ggg acc aag ctg gag atc aaa gac tac aag gat gac gac gat aag t 810 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 255 260 265 gataagcggc cgc 823 <210> 85 <211> 114 <212> PRT <213> Humen <400> 85 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 86 <211> 342 <212> DNA <213> Human <400> 86 caggtgcagc tgcagcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactact ggagctggat tcggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggcggtac 300 ttcgatgtct ggggccgtgg caccatggtc actgtctcct ca 342 <210> 87 <211> 57 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <223> reader sequence <300> <308> GenBank No. AF062252 <400> 87 atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtc ctg tcc 57 Val Leu Ser <210> 88 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VH1 <400> 88 atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc agcagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct 110 <210> 89 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VH2 <400> 89 acccaatcca ctccagtccc ttccctgggg gctgccgaat ccagctccag tagtaactac 60 tgatggagtc accagagaca gtgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc 110 <210> 90 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VH3 <400> 90 tggagtggat tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga 60 gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agagccagtt ctccctgaag 110 <210> 91 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VH4 <400> 91 tgaggagaca gtgaccatgg tgccacggcc ccagacatcg aagtaccgcc ctctcgcaca 60 gtaatacacg gccgtgtctg cggcggtcac agagctcagc ttcagggaga actg 114 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VHS, PCR primer <400> 92 ttcaagcttc caccatgaaa catctgtggt tc 32 <210> 93 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VHA, PCR primer <400> 93 ttgggatcca ctcacctgag gagacagtga ccat 34 <210> 94 <211> 426 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (12)..(410) <223> 12E10H, H chain V region <400> 94 aagcttccac c atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg 44 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val 1 5 10 gca gct ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc 92 Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 15 20 25 cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc 140 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 30 35 40 tct ggt gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc 188 Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro 45 50 55 cca ggg aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc 236 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 60 65 70 75 acc aac tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac 284 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 80 85 90 acg tcc aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca 332 Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 95 100 105 gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg 380 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp 110 115 120 ggc cgt ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggtgagtgga tcccaa 426 Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 125 130 <210> 95 <211> 110 <212> PRT <213> Mus <400> 95 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 96 <211> 330 <212> DNA <213> Mus <400> 96 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaaacggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccagaag cactcgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 97 <211> 57 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <223> reader sequence <400> 97 atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48 Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly 1 5 10 15 tct gtg acc 57 Ser Val Thr <210> 98 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VL1, PCR primer <400> 98 atggcctgga ccgttctcct cctcggcctc ctctctcact gcacaggctc tgtgacctcc 60 tatgtgctga ctcagccacc ctcggtgtca gggtctcctg gacagtcgat 110 <210> 99 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VL2, PCR primer <400> 99 tcatgagttt gggggctttg cctgggtgct gttggtacca ggagacatag ttataaccac 60 caacgtcact gctggttcca gtgcaggaga tggtgatcga ctgtccagga 110 <210> 100 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VL3, PCR primer <400> 100 cccccaaact catgatttat gagggcagta aacggccctc aggggtttct aatcgcttct 60 ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag 110 <210> 101 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VL4, PCR primer <400> 101 taggacggtc agcttggtcc ctccgccgaa cacccgagtg cttctggttg tatatgagct 60 gcagtaataa tcagcctcgt cctcagcctg gagcccagag at 102 <210> 102 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VLS, PCR primer <400> 102 atcaagcttc caccatggcc tggaccgttc t 31 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10VLA, PCR primer <400> 103 ctaggatccg ggctgaccta ggacggtcag cttggt 36 <210> 104 <211> 387 <212> DNA <213> Mus <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <223> 12E10L, L chain V region <400> 104 atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48 Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly 1 5 10 15 tct gtg acc tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct 96 Ser Val Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt 144 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val 35 40 45 ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc 192 Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala 50 55 60 ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct 240 Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser 65 70 75 80 aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc 288 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile 85 90 95 tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat 336 Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr 100 105 110 aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384 Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 cta 387 Leu <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG, reader sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 105 gac tac aag gat gac gac gat aag 24 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10S, PCR primer <400> 106 tatgaattcc accatgaaac atctgtggtt 30 <210> 107 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DB2, PCR primer <400> 107 taggagctac cgcctccacc tgaggagaca gtgaccat 38 <210> 108 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DB1, PCR primer <400> 108 gtctcctcag gtggaggcgg tagctcctat gtgctgactc agcc 44 <210> 109 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10FA, PCR primer <400> 109 attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctaggacggt cagcttggt 59 <210> 110 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12E10, Single chain Fv <220> <221> CDS <222> (11)..(778) <400> 110 gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc 52 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga ctg 100 Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu 15 20 25 30 gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt gac 148 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp 35 40 45 tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg aag 196 Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac 244 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 65 70 75 aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag 292 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 80 85 90 agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc 340 Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 95 100 105 110 gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt ggc 388 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly 115 120 125 acc atg gtc act gtc tcc tca ggt gga ggc ggt agc tcc tat gtg ctg 436 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu 130 135 140 act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc atc 484 Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile 145 150 155 tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tcc 532 Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 160 165 170 tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat gag 580 Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu 175 180 185 190 ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc aag 628 Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys 195 200 205 tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac 676 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp 210 215 220 gag gct gat tat tac tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg gtg 724 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val 225 230 235 ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac gac 772 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 240 245 250 gat aag tg ataagcggcc gc 792 Asp Lys 255 <210> 111 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sc4.3, PCR primer <400> 111 ggtggctgag tcagcacata ggacgatccg ccaccacccg aaccaccacc acccgaacca 60 cc 62 <210> 112 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sc1.3, PCR primer <400> 112 gcaccatggt cactgtctcc tcaggtggtg gtggttcggg tggtggtggt tcgggtggtg 60 g 61 <210> 113 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sc12E10, Single chain Fv <220> <221> CDS <222> (11)..(808) <400> 113 gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc 52 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga ctg 100 Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu 15 20 25 30 gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt gac 148 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp 35 40 45 tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg aag 196 Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac 244 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 65 70 75 aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag 292 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 80 85 90 agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc 340 Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 95 100 105 110 gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt ggc 388 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly 115 120 125 acc atg gtc act gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt 436 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 tcg ggt ggt ggc gga tcg tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg 484 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 145 150 155 tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc 532 Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser 160 165 170 agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac cca 580 Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro 175 180 185 190 ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc tca 628 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser 195 200 205 ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc 676 Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 210 215 220 ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc 724 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 agc tca tat aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag 772 Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 240 245 250 ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac gac gat aag tg ataagcggcc 820 Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 255 260 265 gc 822

Claims (54)

  1. 세포표면 분자 또는 세포내의 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 동일 또는 다른 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  2. 세포표면 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  3. 제1항에 또는 제2항에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역이 링커를 통하여 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 링커가 1개 이상의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 단일쇄 Fv의 테트라머, 트리머 또는 다이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머.
  7. 제6항에 있어서, 단일쇄 Fv의 다이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단일쇄 폴리펩티드.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드가, 정제를 위한 아미노산 서열을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드가, 정제된 것임을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간 항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간형화된 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자가, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 티로신 키나아제 수용체 또는 핵내 수용체인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포표면 분자 또는 세포내 분자가 에리트로포에틴(EPO)수용체, 토롬보포에틴(TPO)수용체, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)수용체, 매크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF)수용제, 과립구매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF)수용체, 종양괴사인자(TNF)수용체, 인터로이킨-1(IL-1)수용체, 인터로이킨-2(IL-2)수용체, 인터로이킨-3(IL-3)수용체, 인터로이킨-4(IL-4)수용체, 인터로이킨-5(IL-5)수용체, 인터로이킨-6(IL-6)수용체, 인터로이킨-7(IL-7)수용체, 인터로이킨-9(IL-9)수용체, 인터로이킨-10(IL-10)수용체, 인터로이킨-11(IL-11)수용체, 인터로이킨-12(IL-12)수용체, 인터로이킨-13(IL-13)수용체, 인터로이킨-15(IL-15)수용체, 인터페론-α(IFN-α)수용체, 인터페론-β(IFN-β)수용체, 인터페론-γ(IFN-γ)수용체, 성장호르몬(GH)수용체, 인슐린수용체, 혈액간세포 증식인자(SCF)수용체, 혈관내피증식인자(VEGF)수용체, 상피세포 증식인자(EGF)수용체, 신경성장인자(NGF)수용체, 선유아세포 증식인자(FGF)수용체, 혈소판유래 증식인자(PDGF)수용체, 트랜스포밍 증식인자-β(TGF-β)수용체, 백혈구유주 저지인자 (LIF)수용체, 모양체신경 영양인자(CNTF)수용체, 온코스타틴M(OSM)수용체, Notch 패밀리수용체, E2F, E2F/DP1 또는 TAK1/TAB1인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아고니스트 작용이 아폽토시스 유도, 세포증식 유도, 세포분화 유도, 세포분열 유도 또는 세포주기 조절작용인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드가, 단일 특이성(mono-specific)의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드가, 다가 특이성(multi-specific)의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드가, 이중 특이성(bi-specific)의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  21. 제 20항에 있어서, L쇄 V영역 및 H쇄 V영역이 동일한 모노크로날 항체 유래인 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드.
  22. 삭제
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  27. 삭제
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  31. 제1항 또는 제2항에 기재된 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  32. 제1항에 기재된 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 생산하는 것을 특징으로 하는 동물세포.
  33. 제1항에 기재된 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  34. 삭제
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  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
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  40. 제1항 또는 제2항에 기재된 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
  41. 삭제
  42. 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드의 스크리닝 방법으로서,
    (1) 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자에 특이적으로 결합하는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 제작하는 공정;
    (2) 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 발현하고 있는 세포에 상기 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 작용시키는 공정; 및
    (3) 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 상기 세포에 발생하는 아고니스트 작용을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  43. 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드의 아고니스트 활성의 측정방법으로서,
    (1) 세포표면 분자 또는 세포내 분자에 특이적으로 결합하는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 제작하는 공정;
    (2) 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 발현하고 있는 세포에 상기 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 작용시키는 공정; 및
    (3) 상기 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 상기 세포에 발생하는 아고니스트 작용을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 아고니스트 활성의 측정방법.
  44. 세포표면 분자 또는 세포내 분자를 가교하는 것에 의해 아고니스트 작용을 나타내는, 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드의 제조방법으로서,
    (1) 제32항에 기재된 동물세포 또는 제33항에 기재된 미생물을 배양하여 상기 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 생산하는 공정; 및
    (2) 상기 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 멀티머 또는 단일쇄 폴리펩티드를 정제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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