JPWO2005056602A1 - アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以上のようにアゴニスト活性を有する改変抗体は疾患の治療・診断などに非常に有用であると考えられており、そのような抗体を取得する為の効率的なスクリーニング方法が望まれている。
従って、改変前の段階ではアゴニスト活性を有していないが、潜在的にアゴニスト活性を有する抗体を、従来のスクリーニング方法で見出すことは不可能であった。
〔1〕以下の工程を含む、アゴニスト抗体のスクリーニング方法、
(a)被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b)(a)で選択された抗体を改変する工程、
(c)(b)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
〔2〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔1〕に記載のスクリーニング方法、
〔3〕低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、〔2〕に記載のスクリーニング方法、
〔4〕被験抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔5〕抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔6〕〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法により得られた抗体、
〔7〕以下の工程を含む、アゴニスト活性を有する抗体の製造方法、
(a)抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b)(a)で選択された抗体を改変する工程、
(c)(b)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する抗体を選択する工程、
(d)(c)で選択された抗体をコードするDNAを含むベクターを宿主細胞に導入する工程、
(e)(d)の宿主細胞を培養する工程
〔8〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔7〕に記載の製造方法、
〔9〕低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、〔8〕に記載の製造方法、
〔10〕抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔7〕〜〔9〕のいずれかに記載の製造方法、
〔11〕抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、〔7〕〜〔10〕のいずれかに記載の製造方法、
〔12〕以下の工程を含むアゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、(a)の工程の前に被験抗体のアゴニスト活性を測定しないことを特徴とする方法、
(a)被験抗体を改変する工程、
(b)(a)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程
〔13〕改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔12〕に記載のスクリーニング方法、
〔14〕低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、〔13〕に記載のスクリーニング方法、に関する。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato,K.etal.,CancerRes.(1993)53,851−856)。
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域とからなる。
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、さらに可変領域(例えば、FR)や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等することも可能である。
又、抗体の糖鎖を置換・付加・欠失させることにより改変することも可能であり、糖鎖改変技術は当業者に既に知られている(例えば、WO00/61739、WO02/31140など)
被験抗体は、その由来等で限定されず、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。
本発明において被験抗体は、非改変抗体(例えば、全長抗体)であることが好ましいが、改変された抗体を被験抗体としてもよい。改変抗体を被験抗体として用いる場合、本発明のスクリーニングの過程において、さらに他の改変が行われる。この場合、同じ種類の改変がおこなわれてもよいし、異なる種類の改変がおこなわれてもよい。
細胞表面抗原の例としては、例えば、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130などを挙げることができる。
例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することが可能である。より具体的には、アゴニスト依存性増殖を示す細胞にアゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、WST−8のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E.coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。
さらに本発明のスクリーニング方法又は製造方法は、アゴニスト活性を有する抗体のスクリーニング又は製造のみならず、中和活性、細胞傷害活性、結合活性、アンタゴニスト活性、酵素活性などの他の活性を有する抗体のスクリーニング又は製造に用いることも可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1.1 Mpl発現BaF3細胞株の樹立
TPO依存増殖性細胞株を得るために、全長Mpl遺伝子を発現するBaF3細胞株の樹立を行った。全長ヒトMpl cDNA(Palaciosら、Cell 1985;41:727−734)(GenBank#NM_005373)をPCRにより増幅し、pCHOI(Hirataら、FEBS Letter 1994;356:244−248)のDHFR遺伝子発現部位を除去し、HEF−VH−gγ1(Satoら、Mol Immunol.1994;31:371−381)のNeomycin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2にクローニングし、pCOS2−hMplfullを構築した。
Flow Cytometryを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長Mpl遺伝子を発現するCHO細胞株の樹立を行った。はじめに、pCXN2(Niwaら、Gene 1991;108:193−199)のHindIII部位にpCHOIのDHFR遺伝子発現部位を挿入して、発現ベクターpCXND3を作製した。pCOS2−hMplfull、pCOS2−monkeyMplfullおよびpCOS2−mouseMplfullを鋳型にして、His−tag配列を含むPrimerを用いてPCRにより増幅した各Mpl遺伝子をpCXND3にクローニングし、pCXND3−hMpl−HisおよびpCXND3−monkey Mpl−Hisを構築した。
可溶型ヒトMplタンパク質を調製するため、昆虫細胞Sf9細胞で分泌産生する発現系を以下のように構築した。
ヒトMpl−IgG Fc融合タンパク質遺伝子はBennettらの方法(Bennettら、J.Biol.Chem.1991;266:23060−23067)に従って作製した。ヒトMplの細胞外領域(Gln26からTrp491)をコードする塩基配列をヒトIgG−γ1のFc領域(Asp216よりの下流の領域)をコードする塩基配列に連結し、連結部にFusion LinkerとしてBstEII配列(アミノ酸Val−Thr)を付加した。シグナル配列は、ヒトIgG H鎖可変領域のシグナルペプチド19アミノ酸を使用した。得られたヒトMpl−IgG Fc融合タンパク質遺伝子をpCXND3にクローニングし、pCXND3−hMpl−Fcを構築した。
MRL/MpJUmmCrj−lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールス・リバーより購入)を用いて、8週令より免疫を開始した。初回免疫は100μg/匹のshMPL−FLAGにフロイント完全アジュバント(H37 Ra、ベクトン・ディッキンソン社製)を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は50μg/匹のshMPL−FLAGにフロイント不完全アジュバント(ベクトン・ディッキンソン社製)を加え、エマルジョン化したものを皮下に投与した合計6回免疫を行ったマウス3匹に対し、50μg/匹のshMPL−FLAGを尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞P3−X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)とマウス脾臓細胞を混合し、Polyethylene Glycol 1500(Roche Diagnostics社製)を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日よりHAT培地を用いて選抜を行い、培養上清を用いてshMpl−FLAGまたはhMpl−Fcを固相化したイムノプレートを用いたELISAおよびBaF3−hMplを用いた細胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノクローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。
抗体濃度はヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED社製)とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウスIgG(gamma)(ZYMED社製)を用いたマウスIgGサンドイッチELISAを行い、Isotypeの等しい市販抗体をスタンダードにして、GraphPad Prism(GraphPad Software,USA)を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。
ハイブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒトMpl抗体を精製した。培養上清をHiTrap proteinG HPカラム(Amersham Biosciences社製)に吸着させた後に、0.1M Glycine−HCl(pH2.7)を用いて溶出した。溶出後、1M Tris−Cl(pH9.0)により直ちに中和し、PBSで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。
取得した抗ヒトMpl抗体の中で、結合活性が高かった3種類の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。以下に抗ヒトMpl抗体VA130の一本鎖抗体作製例について示す。
2.1 抗ヒトMpl抗体可変領域のクローニング
抗ヒトMpl抗体を産生するハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いて、RT−PCR法によって増幅した。Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社製)を用いて1x107細胞のハイブリドーマより抽出した。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC−IgG1またはkappa
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
5アミノ酸からなるリンカー配列を用いたVA130一本鎖Fv(以下、VA130 Diabody)をコードする遺伝子は、VA130−VHをコードする遺伝子の3’末端およびVA130−VLをコードする遺伝子の5’末端に(Gly4Ser)1から成るリンカーをコードする塩基配列を付加させた遺伝子について、それぞれPCR法を用いて増幅し、連結することにより構築した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10ngのVA130−VHまたはVA130−VL遺伝子を含むpGEM−T Easyベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドVA264−feco、VA264−rL5またはVA264−fL5、VA264−rflag
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
1μLの第一PCR産物(2種類)、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドVA264−feco、VA264−rflag
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
VA130由来の2つのH鎖可変領域および2つのL鎖可変領域を含む改変抗体[sc(Fv)2]を発現するプラスミドを作製するために、前述のpCXND3−VA130 dbを用いて以下のようにPCR法により修飾した。sc(Fv)2遺伝子の構築過程について、図1に示した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10ngのpCXND3−VA130 db、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドVA264−feco(プライマーA)、sc−rL15またはsc−fL15、VA264−rflag(プライマーD)
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
1μLの第一PCR産物(2種類)、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドVA264−feco、VA264−rflag
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
5μLの10×PCR Buffer、
0.4mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
2.5ユニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製)、
10μgのpBacPAK9−scVA130、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドFv2−f、Fv2−r
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/15秒間、72℃/2分間のサイクルを5回反復
94℃/15秒間、70℃/2分間のサイクルを5回反復、
94℃/15秒間、68℃/2分間のサイクルを28回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
CHO−DG44細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。発現ベクター(25μg)とPBSに懸濁したCHO−DG44細胞(1×107細胞/mL)の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin(Invitrogen社製)を含むCHO−S−SFMII培地(Invitrogen社製)に加えて選抜し、発現CHO細胞株を樹立した。VA130 sc(Fv)2は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。
COS細胞に一過性発現させた抗ヒトMpl一本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわちBIAcore2000(Biacore社製)にSensor Chip CM5(Biacore社製)をセットし、ANTI−FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA−ALDRICH社製)を結合した。流速5mL/secで適濃度のサンプルを流し、50mMジエチルアミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。Diabodyについての標準品は、db12E10(WO 02/33072およびWO 02/33073参照)を使用し、sc(Fv)2についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ12E10 sc(Fv)2を使用した。
VA130 Diabody発現COS7細胞あるいはCHO細胞の培養上清を、50mM Tris−HCl(pH7.4),150mM NaCl,0.05% Tween20で平衡化したAnti−Flag M2 Affinity Gel(SIGMA−ALDRICH社製)カラムに吸着させ、100mM Glycine−HCl(pH3.5)で溶出させた。溶出画分は、直ちに1M Tris−HCl(pH8.0)で中和を行い、HiLoad 26/60 Superdex200pg(Amersham−Bioscience社製)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファーは、PBS、0.01% Tween20を使用した。
それぞれ、分取したピーク画分をLaemliの方法に準じて電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色した結果、Diabodyでは、見かけ上の分子量約28kDaに、またsc(Fv)2では、見かけ上の分子量約58kDaに、それぞれ単一のバンドが検出された。
CHO−human Mpl、CHO−monkey MplおよびCHO−mouse Mplを回収し、1x106cells/mLになるようにFACS Buffer(1% FBS/PBS)に懸濁した。100μL/wellとなるようにMultiscreen−HV Filter Plates(Millipore社製)に分注し、遠心操作にて上清を除去した。適濃度のDiabodyまたはsc(Fv)2を加え、氷上にて30分間反応させた。細胞を200μLのFACS bufferにて1回洗浄し、10μg/mLのANTI−FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA−ALDRICH社製)を添加し、氷上にて30分間反応させた。
ELISAにより抗ヒトMpl一本鎖抗体のhMPL−Fcに対する結合活性を評価した。精製したhMPL−Fcを0.5μg/mLになるようにコーティングし、Diluent bufferにてブロッキング処理を行った。適濃度に希釈したVA130精製品を加え、室温で1時間放置した後、Rinse bufferにて洗浄した後、1000倍希釈したANTI−FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA−ALDRICH社製)を加え、室温で1時間反応させた。さらにRinse bufferにて洗浄した後、1000倍希釈したAlkaline Phosphatase標識した抗マウスIgG抗体(Zymed社製)を加え、室温で1時間放置した。Rinse bufferにて洗浄した後、発色はSIGMA104(SIGMA−ALDRICH社製)を1mg/mLとなるようにSubstrate)に希釈したものを用い、室温で15分間発色させた後に405nmの吸光度をBenchmark Plusにて測定した。
TPO依存性増殖を示すBaF3−human Mplを用いてTPO用アゴニスト活性を評価した。各細胞を1% Fetal Bovine Serum(Invitrogen社製)を含むRPMI1640(Invitrogen社製)で2回洗浄した後、4x105cells/mLとなるように10% Fetal Bovine Serumを含むRPMI1640に懸濁し、60μL/wellで96well plateに分注した。rhTPO(R&D社製)、COS7培養上清または精製品の濃度を振り、各wellに40μL加え、37℃、5%CO2条件下で、24時間培養した。10μL/wellでWST−8試薬(Cell Count Reagent SF、ナカライテスク社製)を加え、直後にBenchmark Plusを用いて450nmの吸光度(対照655nm)を測定し、2時間培養後に、再度450nmの吸光度(対照655nm)を測定した。WST−8試薬は生細胞数に応じて450nmの発色反応を呈することから、2時間の吸光度変化を指標にTPO様アゴニスト活性を評価した。また、GraphPad Prismを用いてEC50値を算出した。
Claims (14)
- 以下の工程を含む、アゴニスト抗体のスクリーニング方法。
(a)被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b)(a)で選択された抗体を改変する工程、
(c)(b)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程 - 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、請求項2に記載のスクリーニング方法。
- 被験抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の方法により得られた抗体。
- 以下の工程を含む、アゴニスト活性を有する抗体の製造方法。
(a)抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b)(a)で選択された抗体を改変する工程、
(c)(b)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する抗体を選択する工程、
(d)(c)で選択された抗体をコードするDNAを含むベクターを宿主細胞に導入する工程、
(e)(d)の宿主細胞を培養する工程 - 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項7に記載の製造方法。
- 低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、請求項8に記載の製造方法。
- 抗体を改変する前に、アゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、請求項7〜9のいずれかに記載の製造方法。
- 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求項7〜10のいずれかに記載の製造方法。
- 以下の工程を含むアゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、(a)の工程の前に被験抗体のアゴニスト活性を測定しないことを特徴とする方法。
(a)被験抗体を改変する工程、
(b)(a)の改変抗体のアゴニスト活性を測定し、アゴニスト活性を有する改変抗体を選択する工程 - 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項12に記載のスクリーニング方法。
- 低分子化抗体がsc(Fv)2であることを特徴とする、請求項13に記載のスクリーニング方法。
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