JP4794301B2 - 抗体の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、複数の抗体または抗体断片を結合する多重特異性抗体の製造において目的とする型の抗体を優先的に製造する方法に関する。より詳細には、第一の重鎖と結合していない第一の軽鎖と第二の軽鎖と結合していない第二の重鎖の接触、及び、第一の軽鎖と結合していない第一の重鎖と第二の重鎖と結合していない第二の軽鎖の接触を阻害することを含む抗体の製造方法に関する。また、本発明は該方法を利用した抗体組成物の比活性を増加させる方法、該方法により得られる抗体組成物、並びに該方法において使用できるベクター、該ベクターを含むベクターキット、及び該ベクターまたはベクターキットを含有する細胞に関する。
抗体は一般的には、２つの重鎖（Ｈ鎖）と２つの軽鎖（Ｌ鎖）で形成されている。１つのＨ鎖と１つのＬ鎖がジスルフィド架橋によりＬ鎖−Ｈ鎖の対を形成し、２つのＬ鎖−Ｈ鎖対がＨ鎖間の２組のジスルフィド架橋により結合され、抗体が形成されている。二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＢｓＡｂ）は、二機能性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれることもあり、２つの抗原決定基に特異的な結合部位を有する２種類の抗原と反応することができる多価抗体である。ＢｓＡｂは、ハイブリッドハイブリドーマ、即ちクワドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）と呼ばれる２種類の異なるモノクローナル抗体産生細胞の融合体を用いて産生することができる（米国特許第４，４７４，８９３号公報；Ｒ．Ｂｏｓ ａｎｄ Ｗ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｔｚｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９９２，１１（１）：４１−５１）。また、２種類のモノクローナル抗体のＦａｂ（抗原結合性）断片、またはＦａｂ’断片を化学的（Ｍ．Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２９（１７０８）：８１−３）、または遺伝子操作により結合して作製することもできる。さらに、２つの完全なモノクローナル抗体を共有結合することで作製することもできる（Ｂ．Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８４，１６０（６）：１６８６−７０１）。
ＢｓＡｂ製造方法における問題点として、免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖が無作為に組み合わさるため、１０種類の異なる抗体分子が産生される可能性がある点が挙げられる（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：２１０−２８）。クワドローマにより産生される１０種類の抗体のうち、所望の二特異性を有する抗体は、正しいＬ鎖とＨ鎖が組合されており、且つ、異なる結合特性を有する２組のＬ鎖・Ｈ鎖ペアにより構成された１種類の抗体のみである。そこで、クワドローマにより産生される１０種類の抗体から所望の二重特異性を有する抗体を選択的に精製する必要がある。精製は、一般にアフィニティークロマトグラフィーを利用して行われるが、余計な手数を要し、またその収量も少なくなってしまうという問題点がある（Ｙ．Ｓ．Ｍａｓｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７，２０１：５７−６６）。
このような問題点を解消し、より大きな収量でＢｓＡｂを得る方法として、例えば、Ｆａｂ’−チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体とＦａｂ’−チオール（ＳＨ）等の抗体断片を化学的に連結する方法が知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２９：８１）。さらに、化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨ断片をより簡便に得るための方法として、大腸菌等の宿主から遺伝子組換技術により産生する方法が知られている（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７５：２１７−２５）。遺伝子組換技術を用いることにより、ヒト化抗体断片より構成されるＢｓＡｂを得ることもできる。また、ダイアボディ（Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築されたＬ鎖可変領域（ＶＬ）とＨ鎖可変領域（ＶＨ）が互いに結合できないくらいに短いリンカーによって結合されている２種類の断片からなるＢｓＡｂである（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０：６４４４−８；ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号）。このようなＤｂをさらに改良したものとして単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｄｂを挙げることができる（ＷＯ０３／０８７１６３号公報）。しかしながら、抗体断片は、完全長の抗体に比べ血清半減期が短く、完全抗体のようにエフェクター機能も有していない。そのため、完全長の抗体の方が、より診断や治療に適している場合があると考えられている。
産生された抗体Ｈ鎖をヘテロダイマーとして効率的に結合するための方法として、抗体Ｈ鎖のマルチマー化ドメインのＣＨ３（定常領域の一部）ドメインに立体的に相補的な変異を導入する方法が知られている（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６，９：６１７−２１）。この方法により製造されたＨ鎖も、依然として誤ったＬ鎖と対形成し得る。そこで、特表２００１−５２３９７１号公報には、抗体結合ドメインを有するヘテロマー性ポリペプチドと結合した共通のＬ鎖を有する多重特異性抗体を製造する方法が記載されている。しかしながら、任意の抗体を２つ選んだ場合、同じＬ鎖を含む可能性は低く、該方法の実施が困難であることから、任意の異なるＨ鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通Ｌ鎖をスクリーニングする方法も本発明者らの一人により提案されている（ＰＣＴ／ＪＰ０４／０００４９６）。
２つの異なる抗原に対する特異的結合能を有するＢｓＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断、治療及び免疫学的検定等の臨床分野において標的化薬剤として有用である。例えば、ＢｓＡｂの一方の腕を酵素免疫分析に使用する酵素上の酵素反応を阻害しない部分のエピトープと結合するように、そして他方の腕を固定化用担体に結合するように設計することで、担体上に酵素を結合する媒体として使用することができる（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６８，１２８：１４６１−７３）。その他、例えば、抗体ターゲティング化血栓溶解療法を挙げることができる。該療法として、血栓に含まれるフィブリン特異的に、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロウロキナーゼ等の酵素またはその前駆体等の蛋白を運搬する抗体を用いることが検討されている（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８９，７：１１６３；特開平５−３０４９９２号公報）。さらに、癌ターゲティングに応用可能なマウス・ヒト・キメラ二重特異性抗体（特開平２−１４５１８７号公報）、種々の腫瘍を対象とした癌治療及び診断（例えば、特開平５−２１３７７５号公報；特開平１０−１６５１８４号公報；特開平１１−７１２８８号公報；特表２００２−５１８０４１号公報；特表平１１−５０６３１０号公報；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９３，８１：３３４３；Ｔ．Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ １９９０，３３５：３６８−７１；Ｌ．ｄｅＬｅｉｊ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ Ｆｒａｎｃｅ １９９０，２４９−５３；Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９３，３４：１６６２−７１；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９１，５１：６６５０−５参照）、真菌治療（特開平５−１９９８９４号公報）、免疫応答誘導（特表平１０−５１１０８５号公報；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：９４−１００）、Ｔ細胞殺細胞作用の誘導（Ｋｒｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９４，７０：６５２−６１；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：２３８５）、免疫分析（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８６，８３：７９８９−９３；特開平５−１８４３８３号公報）、免疫組織化学（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ １９８３，３０５：５３７）等にＢｓＡｂを使用することが報告されている。
抗体の抗原特異性を決定するＨ鎖及びＬ鎖の可変領域塩基配列を取得することにより、特定の抗原に特異的な抗体を遺伝子工学的に作製することができる（Ｊ．Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，２７：８０９；Ｃ．Ｒ．Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０：１６９）。抗原特異的Ｈ及びＬ鎖を取得する方法として、大腸菌を宿主とし、ファージまたはファージミドを利用した方法が公知である（Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４６：１２７５；Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４８：５５２；Ａ．Ｓ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９１，８８：４３６３）。これらの方法ではＦａｂを産生させて抗体ライブラリーとするか、または、Ｆａｂ若しくは一本鎖Ｆｖとファージコート蛋白質との融合蛋白質を産生させて抗体ライブラリーとする。最終的に、抗原との結合性を調べることにより、それらの抗体ライブラリーから抗原特異的抗体及びその遺伝子を選択する。
ＢｓＡｂ製造方法における問題点として、免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖が無作為に組み合わさるため、１０種類の異なる抗体分子が産生される可能性がある点が挙げられる（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：２１０−２８）。クワドローマにより産生される１０種類の抗体のうち、所望の二特異性を有する抗体は、正しいＬ鎖とＨ鎖が組合されており、且つ、異なる結合特性を有する２組のＬ鎖・Ｈ鎖ペアにより構成された１種類の抗体のみである。そこで、クワドローマにより産生される１０種類の抗体から所望の二重特異性を有する抗体を選択的に精製する必要がある。精製は、一般にアフィニティークロマトグラフィーを利用して行われるが、余計な手数を要し、またその収量も少なくなってしまうという問題点がある（Ｙ．Ｓ．Ｍａｓｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７，２０１：５７−６６）。
このような問題点を解消し、より大きな収量でＢｓＡｂを得る方法として、例えば、Ｆａｂ’−チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体とＦａｂ’−チオール（ＳＨ）等の抗体断片を化学的に連結する方法が知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２９：８１）。さらに、化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨ断片をより簡便に得るための方法として、大腸菌等の宿主から遺伝子組換技術により産生する方法が知られている（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７５：２１７−２５）。遺伝子組換技術を用いることにより、ヒト化抗体断片より構成されるＢｓＡｂを得ることもできる。また、ダイアボディ（Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築されたＬ鎖可変領域（ＶＬ）とＨ鎖可変領域（ＶＨ）が互いに結合できないくらいに短いリンカーによって結合されている２種類の断片からなるＢｓＡｂである（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０：６４４４−８；ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号）。このようなＤｂをさらに改良したものとして単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｄｂを挙げることができる（ＷＯ０３／０８７１６３号公報）。しかしながら、抗体断片は、完全長の抗体に比べ血清半減期が短く、完全抗体のようにエフェクター機能も有していない。そのため、完全長の抗体の方が、より診断や治療に適している場合があると考えられている。
産生された抗体Ｈ鎖をヘテロダイマーとして効率的に結合するための方法として、抗体Ｈ鎖のマルチマー化ドメインのＣＨ３（定常領域の一部）ドメインに立体的に相補的な変異を導入する方法が知られている（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６，９：６１７−２１）。この方法により製造されたＨ鎖も、依然として誤ったＬ鎖と対形成し得る。そこで、特表２００１−５２３９７１号公報には、抗体結合ドメインを有するヘテロマー性ポリペプチドと結合した共通のＬ鎖を有する多重特異性抗体を製造する方法が記載されている。しかしながら、任意の抗体を２つ選んだ場合、同じＬ鎖を含む可能性は低く、該方法の実施が困難であることから、任意の異なるＨ鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通Ｌ鎖をスクリーニングする方法も本発明者らの一人により提案されている（ＰＣＴ／ＪＰ０４／０００４９６）。
２つの異なる抗原に対する特異的結合能を有するＢｓＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断、治療及び免疫学的検定等の臨床分野において標的化薬剤として有用である。例えば、ＢｓＡｂの一方の腕を酵素免疫分析に使用する酵素上の酵素反応を阻害しない部分のエピトープと結合するように、そして他方の腕を固定化用担体に結合するように設計することで、担体上に酵素を結合する媒体として使用することができる（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６８，１２８：１４６１−７３）。その他、例えば、抗体ターゲティング化血栓溶解療法を挙げることができる。該療法として、血栓に含まれるフィブリン特異的に、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロウロキナーゼ等の酵素またはその前駆体等の蛋白を運搬する抗体を用いることが検討されている（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８９，７：１１６３；特開平５−３０４９９２号公報）。さらに、癌ターゲティングに応用可能なマウス・ヒト・キメラ二重特異性抗体（特開平２−１４５１８７号公報）、種々の腫瘍を対象とした癌治療及び診断（例えば、特開平５−２１３７７５号公報；特開平１０−１６５１８４号公報；特開平１１−７１２８８号公報；特表２００２−５１８０４１号公報；特表平１１−５０６３１０号公報；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９３，８１：３３４３；Ｔ．Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ １９９０，３３５：３６８−７１；Ｌ．ｄｅＬｅｉｊ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ Ｆｒａｎｃｅ １９９０，２４９−５３；Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９３，３４：１６６２−７１；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９１，５１：６６５０−５参照）、真菌治療（特開平５−１９９８９４号公報）、免疫応答誘導（特表平１０−５１１０８５号公報；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：９４−１００）、Ｔ細胞殺細胞作用の誘導（Ｋｒｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９４，７０：６５２−６１；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：２３８５）、免疫分析（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８６，８３：７９８９−９３；特開平５−１８４３８３号公報）、免疫組織化学（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ １９８３，３０５：５３７）等にＢｓＡｂを使用することが報告されている。
抗体の抗原特異性を決定するＨ鎖及びＬ鎖の可変領域塩基配列を取得することにより、特定の抗原に特異的な抗体を遺伝子工学的に作製することができる（Ｊ．Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，２７：８０９；Ｃ．Ｒ．Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０：１６９）。抗原特異的Ｈ及びＬ鎖を取得する方法として、大腸菌を宿主とし、ファージまたはファージミドを利用した方法が公知である（Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４６：１２７５；Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４８：５５２；Ａ．Ｓ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９１，８８：４３６３）。これらの方法ではＦａｂを産生させて抗体ライブラリーとするか、または、Ｆａｂ若しくは一本鎖Ｆｖとファージコート蛋白質との融合蛋白質を産生させて抗体ライブラリーとする。最終的に、抗原との結合性を調べることにより、それらの抗体ライブラリーから抗原特異的抗体及びその遺伝子を選択する。
二特異性抗体（ＢｓＡｂ）発現の際、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術の利用によってＨ鎖については殆どがヘテロな組合せ（Ｈａ−Ｈｂ）になるが、一方それぞれのＨ鎖に対応するＬ鎖が必ずしもそれぞれ目的のＨ鎖へ結合したもののみにはならない。すなわち、考えられるＨ鎖、Ｌ鎖の組合せはＨａＬａ−ＨｂＬｂ（目的型）、ＨａＬｂ−ＨｂＬａ、ＨａＬａ−ＨｂＬａ、ＨａＬｂ−ＨｂＬｂの４通り存在する。従って、二特異性アゴニストＩｇＧをｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを採用した２種のＨ鎖と２種のＬ鎖を単に発現させた場合、生成するＩｇＧの見かけ上の比活性は非目的型ＩｇＧの存在により、期待されるよりも低減されたものになってしまうことが予想される。鎖によって発現量が異なる可能性があるため、また非目的型のＨ鎖とＬ鎖の親和性の強弱が異なる可能性があるため、目的型のＩｇＧの生成率は一定ではないと考えられる。また目的型ＩｇＧの生成ＩｇＧ全体に対する比を確認する手段も無い。これらのことはアゴニスト活性に基づく抗体のスクリーニングを困難なものにしている。この問題は、全てのＢｓＡｂを含む多特異性抗体の作成時に発生する可能性が高い。
上記課題を解決する方法として、本発明者らは、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによって一方のＨ鎖だけでは細胞より分泌されないことに着目し、一方のＨ鎖及びＬ鎖（Ｈａ及びＬａ）を発現させ、その発現を抑制した後もう一方のＨ鎖及びＬ鎖（Ｈｂ及びＬｂ）を発現させ、先に目的ＨＬ分子（ＨａＬａ及びＨｂＬｂ）を構築した後にＨ鎖同士を対合させる（Ｈ２Ｌ２）ことで目的型ＢｓＡｂの形成を優先させることができることを発見し、本発明を完成した。本発明により、二特異性ＩｇＧ等の多重特異性抗体の作製時に、例えば、抗体左腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｌｅｆｔ ＨＬ）、抗体右腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｒｉｇｈｔ ＨＬ）それぞれを発現制御ベクターにより時間差で発現させる等、対応しない重鎖と軽鎖の接触を阻害することにより目的とする抗体を効率的に産生することができる。
より詳細には本発明により、
（１）第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触を阻害し、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害することを特徴とする抗体の製造方法、
（２）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることを特徴とする抗体の製造方法、
（３）以下の工程を含む抗体の製造方法
（ａ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を発現させ、第一の対を作製する工程、
（ｂ）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖を発現させ、第二の対を作製する工程、及び
（ｃ）抗体の第一の対と第二の対を用いて抗体を作製する工程、
（４）以下の工程を含む抗体の製造方法
（ａ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖の発現を誘導して第一の対を作製する工程、
（ｂ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖の発現の誘導をとめる工程、
（ｃ）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖の発現を誘導して第二の対を作製する工程、及び
（ｄ）抗体の第一の対と第二の対を用いて抗体を作製する工程、
（５）第一のＨ鎖と第二のＨ鎖のアミノ酸配列が異なり、かつ第一のＬ鎖と第二のＬ鎖のアミノ酸配列が異なる抗体である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法、
（６）抗体が二特異性抗体である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法、
（７）第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい抗体であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法、
（８）第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい抗体が、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓが導入された抗体であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法、
（９）第一の発現調節因子により第一のＨ鎖及び第一のＬ鎖の発現が誘導されるベクター、および第二の発現調節因子により第二のＨ鎖及び第二のＬ鎖の発現が誘導されるベクターを用いることを特徴とする抗体の製造方法、
（１０）抗体組成物の、第一の対と第二の対を含む抗体の割合を高くすることにより、抗体組成物の比活性を増加させる方法、
（１１）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることにより、抗体組成物の比活性を増加させる方法、
（１２）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることにより、第一の対と第二の対を含む抗体以外の抗体の産生を抑制する方法、
（１３）異なる２種以上の発現誘導剤を用いることを特徴とする抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる方法、
（１４）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法により製造される抗体、
（１５）第一のＨ鎖、第二のＨ鎖、第一のＬ鎖、第二のＬ鎖を同時期に発現させて作製された抗体組成物と比較して、第一の対と第二の対を含む抗体の割合が高い抗体組成物、
（１６）抗体のＬ鎖とＨ鎖がペプチドリンカーで介されていないことを特徴とする上記（１５）記載の抗体組成物、
（１７）発現誘導剤により抗体のＬ鎖またはＨ鎖の発現が誘導されるベクター、
（１８）第一の発現調節因子により抗体の第一のＬ鎖及び第一のＨ鎖の発現が誘導されるベクターと、第二の発現調節因子により抗体の第二のＬ鎖及び第二のＨ鎖の発現が誘導されるベクターを含むベクターキット、
（１９）上記（１７）または（１８）に記載のベクターを含有する細胞、並びに
（２０）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞、
が提供される。
１．抗体の製造方法
本発明は、複数の抗体または抗体断片を結合する多重特異性抗体の製造において目的とする型の抗体を優先的に製造する方法に関する。より詳細には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）のような多重特異性抗体の製造においては、第一の重鎖（Ｈ鎖）と結合していない第一の軽鎖（Ｌ鎖）と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触、及び、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害することにより目的型のＢｓＡｂを優先的に製造することができる。本発明では、例えば、まず（１）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を発現させ、第一のＨ鎖・Ｌ鎖対を作製し、別に（２）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖を発現させ、第二のＨ鎖・Ｌ鎖対を作製した後、（３）（１）及び（２）の工程により作製された２つの対を用いて所望のＢｓＡｂを優先的に製造することができる。そして、三以上の特異性を有する抗体の製造を目的とする場合には、ＢｓＡｂを製造する場合と同様に第一〜所望の数までのＨ鎖・Ｌ鎖の対をそれぞれ発現し形成させた後に、作製された対を用いて所望の多重特異性抗体を製造することができる。以下、多重特異性抗体のうちＢｓＡｂを例として説明するが、本発明の方法はその他の多重特異性抗体にも同じように適用することができる。
本発明において、目的とする多重特異性抗体がＢｓＡｂであれば、「第一の重（Ｈ）鎖」とは抗体を形成する２つのＨ鎖のうちの一方のＨ鎖であり、第二のＨ鎖は第一のＨ鎖とは異なるもう一方のＨ鎖のことをいう。つまり、２つのＨ鎖のうち任意にどちらか一方を第一のＨ鎖とし、他方を第二のＨ鎖とすることができる。同様に、「第一の軽（Ｌ）鎖」とはＢｓＡｂを形成する２つのＬ鎖のうちの一方のＬ鎖であり、第二のＬ鎖は第一のＬ鎖とは異なるもう一方のＬ鎖のことを指し、２つのＬ鎖のうちどちらか一方を任意に第一のＬ鎖とし、他方を第二のＬ鎖とすることができる。通常、第一のＬ鎖と第一のＨ鎖は或る抗原（又はエピトープ）を認識する同一の抗体より由来し、第二のＬ鎖と第二のＨ鎖も或る抗原（又はエピトープ）を認識する同一の抗体より由来するが、これに限定されるわけではない。ここで、第一のＨ鎖・Ｌ鎖で形成されるＬ鎖−Ｈ鎖対を第一の対、第二のＨ鎖・Ｌ鎖で形成されるＬ鎖−Ｈ鎖対を第二の対と呼ぶ。第二の対の由来となる抗体を作製する際に用いられる抗原（又はエピトープ）は、第一の対の由来となる抗体を作製する際に用いられるものとは異なっていることが好ましい。即ち、第一の対と第二の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なる抗原（又はエピトープ）を認識する。この場合、第一の対及び第二の対のＨ鎖とＬ鎖は互いに異なるアミノ酸配列を有していることが好ましい。第一の対と第二の対が異なる抗原決定部位を認識する場合、該第一の対と第二の対は全く異なる抗原を認識してもよいし、同一抗原上の異なる部位（異なるエピトープ）を認識してもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。しかしながら、特定のＨ鎖とＬ鎖の組合せで形成される対を有する抗体を作製したいと考えた場合には、その特定のＨ鎖とＬ鎖を第一の対及び第二の対として任意に決定することができる。
抗体のＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５２：６２４−８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２２：５８１−９７、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２２６５−６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４，１３：３２４５−６０、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６，１４：３０９−１４、及び特表平２０−５０４９７０号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法（ＷＯ９５／１５３９３号パンフレット）やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結することにより得ることができる。
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、本発明のＨ鎖及びＬ鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる（ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１５：１４６−５６参照）。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６，５９−１０３）。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）から、抗体に特異的に結合し得るプローブ（例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を用いてクローニングすることができる。また、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２等）に分けられる。本発明において抗体の製造に使用するＨ鎖及びＬ鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであってもよく、特に限定されないが、ＩｇＧは特に好ましいものである。
ここで、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域とヒト抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００；ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｋ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：８５１−８５６）。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９７％、９８％、９９％等）のアミノ酸配列相同性及び／または類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び／または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同（同じ残基）または類似（一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基いて（１）疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；（２）中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；（３）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；（５）鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに（６）芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
通常、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域中に存在する全部で６つの相補性決定領域（超可変部；ＣＤＲ）が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち１つの可変領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力があることが知られている。従って、本発明のＨ鎖及びＬ鎖をコードする抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性を維持していればよく、Ｈ鎖及びＬ鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコードしていればよい。
さらに、本発明の方法においてＨ鎖をコードする遺伝子は、該遺伝子から発現される抗体が、第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成しにくいように工夫されていることが好ましい。例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ（特表２００１−５２３９７１）は、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補的な相互作用を導入する（例えば、非天然のジスルフィド結合が第一のポリペプチドと第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チオール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を導入する）当業者に公知の技術であり、該方法を用いることによりヘテロマルチマー形成が促進され、ホモマルチマー形成が抑制されたＨ鎖を発現させることができる。
第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触、及び、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害するためには、第一のＨ鎖と第二のＬ鎖を異なる時期に発現させ、第一のＬ鎖と第二のＨ鎖を異なる時期に発現させればよく、例えば、第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる方法を採用することができる。
上述の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させるのに対して、第一の対と第二の対を同時期に発現した場合には、通常、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触が阻害されず、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触が阻害されていないので、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の結合が抑制されず、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の結合が抑制されてない状態となる。本発明において「第一の対と第二の対を同時期に発現する」とは、第一の対と第二の対の発現時期の少なくとも一部が重なっていることを意味し、好ましくは、第一の対と第二の対の発現時期が一致していることを指す。
本発明において、第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる場合、第一の対が発現している時期と、第二の対が発現している時期が完全に異なっている、つまり、第一の対が発現している時は第二の対は発現しておらず、第二の対が発現している時は第一の対は発現していないことが好ましい。しかしながら、本発明はこれに限定されず、第一の対が発現している時期と第二の対が発現している時期の一部が重なっていても良い。第一のＨ鎖と第二のＬ鎖の結合を抑制し、第二のＨ鎖と第一のＬ鎖の結合を抑制するその他の方法としては、第一のＨ鎖と第二のＬ鎖を異なる時期に発現させ、第二のＨ鎖と第一のＬ鎖を異なる時期に発現させればよい。即ち、本発明の方法においては、第一のＨ鎖と第一のＬ鎖は同時期に発現させることが好ましいが、特に限定されず、第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を異なる時期に発現させてもよい（第二のＨ鎖と第二のＬ鎖についても同様）。その場合、例えば、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触を阻害し、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害すれば第一のＨ鎖と第二のＬ鎖、及び第一のＬ鎖と第二のＨ鎖の結合を阻害することができる。例えば、第一の対と第二の対を異なる場所で発現させ、それぞれの対を形成してから、第一の対と第二の対を接触させ、抗体を作製してもよい。そのような方法の一つとして、第一の対と第二の対を異なる細胞中で発現させ、対形成させた後に、第一の対と第二の対を発現する細胞を融合して抗体を作製させる方法が考えられる。
第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる為の具体的な方法としては、例えば、発現調節因子などを用いて第一の対と第二の対の発現を異なる時期に誘導する方法を挙げることができる。より具体的には、第一の発現調節因子により第一の対の発現が誘導されるベクターを構築し、第二の発現調節因子により第二の対の発現が誘導されるベクターを構築する。この際、第一の対と第二の対を一つのベクター上に構築してもよいし、異なる２つ以上のベクター上に構築してもよい。又、Ｈ鎖とＬ鎖を同一のベクター上に構築してもよいし、異なる２つ以上のベクターに構築してもよい。次に、構築したベクターを細胞に導入し、まず第一の発現調節因子により第一の対の発現を誘導する。その後、第二の発現調節因子により第二の対の発現を誘導する。この場合、第二の対の発現を誘導する前に、第一の対の発現を停止させておくことが好ましい。
発現調節因子は、宿主細胞中でのＨ鎖及びＬ鎖の発現を調節できるものであれば特に限定されず、どのような種類のものを用いてもよい。例えば、発現調節因子の不在下では発現が誘導されず、発現調節因子の存在下では発現が誘導されるものでもよいし、逆に、発現調節因子の存在下では発現が誘導されず、発現調節因子の不在下で発現が誘導されるものでもよい。発現調節因子は、発現誘導剤などの化合物でもよいし、又、温度（熱）などの物理的な要因であってもよい。発現誘導剤の具体的な例としては、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクダイソンアナログなどのホルモン、Ｃｒｅ（ｃａｕｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；相同組換え酵素）などの酵素、等を挙げることができる。また、誘導したＨ鎖及び／またはＬ鎖の発現をとめるためには、上述の発現調節因子として機能する発現誘導剤を除くことができる。温度（熱）等の物理的要因を発現調節因子とした場合には、発現が誘導されないような温度に戻すことにより誘導したＨ鎖及び／またはＬ鎖の発現をとめることができる。
発現調節因子により発現誘導されるベクターの構築は当業者に公知の方法で行うことができる。具体的な例としては、市販されている発現誘導剤により発現が誘導されるベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ、ｐＩＮＤ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に抗体の第一の対又は第二の対をコードする遺伝子を導入することにより作製することが可能である。通常、第一の対を構成するＨ鎖及びＬ鎖の発現を誘導する第一の発現調節因子と第二の対を構成するＨ鎖及びＬ鎖の発現を誘導する第二の発現調節因子は異なる発現調節因子である。また、場合により、第一のＨ鎖の発現を誘導する発現調節因子と第一のＬ鎖の発現を誘導する発現調節因子も異なるものであってもよい（第二のＨ鎖及びＬ鎖の発現調節因子についても同様）。このようにして構築された発現調節因子により抗体の第一または第二の対の発現が誘導されるベクターは、抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能となる。又、当該ベクターが導入された宿主細胞は、抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞となる。
本発明の各抗体断片を発現させるためのベクターの構築に当たっては、遺伝子情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、ターミネーター等のユニットが必要であり、さらに各抗体断片のＮ末端に適当なシグナル配列を配置することが好ましい。プロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λファージＰＬ、ＰＲ等に由来するプロモーターが利用可能である。ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ、ファージ、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のものを使用することができる。適当なシグナル配列としては、宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を可能にするリーダーペプチド配列が挙げられ、ｐｅｌ１Ｂ分泌シグナルを例示することができる（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４０：１０４１−３；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９，８６：５７２８参照）。
本発明の抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能なベクターを作製する為に用いられるベクターは特に限定されず、どのようなベクターを用いてもよい。ベクターの具体的な例としては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７）：５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）、大腸菌由来の発現ベクター（Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ）などが挙げられる。又、市販されている発現誘導剤により発現が誘導されるベクターを用いてもよい。
本発明の抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞を作製する為に用いられる細胞は特に限定されず、どのような細胞を用いてもよい。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、または（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞等）、糸状菌（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の細胞等）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌等が知られている。本発明においては、糖鎖の付加、立体構造の維持等の観点から、動物細胞を用いることが好ましく、特に哺乳動物細胞を用いることが好ましい。これらの細胞に、本発明の抗体の第一の対と第二の対（場合により、第一並びに第二の対の各々のＨ鎖及びＬ鎖）を異なる時期に発現することが可能なベクターを導入することにより本発明の細胞を作製することができる。
構築した各対を発現するベクターの所望の宿主細胞への導入は、用いるベクター及び宿主細胞の種類に依存する。原核細胞を宿主として使用する場合には、例えば、カルシウムイオンを用いた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７２，６９：２１１０）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８２９号公報）、エレクトロポレーション法（Ｇｅｎｅ １９８２，１７：１０７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９７９，１６８：１１１）等の方法により宿主細胞へ導入することができる。また、宿主細胞が酵母である場合には、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９０，１９４：１８２）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８４，８１：４８８９）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５３：１６３）等が挙げられ、植物細胞についてはアグロバクテリウム法（Ｇｅｎｅ １９８３，２３：３１５；ＷＯ８９／０５８５９等）、超音波処理による方法（ＷＯ９１／００３５８）等が公知である。また、動物細胞を宿主とした場合には、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０，３：１３３）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８７，８４：７４１３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２：４５６）、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法等が挙げられる。
上述のようにして取得された宿主細胞は、例えば、次のような方法で培養することができる。宿主が原核生物や真核微生物である場合は、培地は該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等の生育に必要な物質を含有し、形質転換体の効率的な培養を可能にするものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は好気的条件、嫌気的条件のいずれで行ってもよく、生育温度、培地のｐＨ、生育時間等の条件は、用いる形質転換体の種類に応じ適宜当業者により決定され得るものである。また、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターについては、必要に応じてインデューサーを培地に添加すればよい（例えば、ｌａｃプロモーターであればＩＰＴＧ、ｔｒｐプロモーターであればＩＡＡ等）。昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、培地としてはＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｘＣｅｌｌ４００及びＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ １９５：７８８（１９６２））等を用いることができ、必要に応じゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。宿主細胞が動物細胞である場合には、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １９９：５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２：５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７３：１（１９５０））、または、これらの培地にＢＳＡ等を添加した培地を使用することができる。培養は通常の条件、例えば、ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下で行うことができる。この際、必要に応じカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。
本発明の具体的な抗体の製造方法として、例えば、次のような方法が考えられる。最初に、抗体左腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｌｅｆｔ ＨＬ）をテトラサイクリン誘導型のｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへ、抗体右腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｒｉｇｈｔ ＨＬ）をエクダイソン誘導型のｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへ組み込む。全ての発現調節プラスミドを上述の適当な宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７等の動物細胞に形質導入する。その後、例えば、一次誘導としてテトラサイクリンを培地へ添加し、抗体左腕ＨＬ分子を細胞内で形成させる。１〜２日間の一次誘導発現後、一旦培地を洗浄することにより、最初の薬剤（ここではテトラサイクリン）を完全に除去する。次に、二次誘導用の薬剤エクダイソンアナログを含む新鮮な培地に置換し、二次誘導発現を例えば２〜３日間行う。その結果、抗体右腕ＨＬ分子が生成され、既に細胞中に存在していた左腕ＨＬ分子と会合し完全体ＢｓＡｂが形成され、培地中へ分泌される。
本発明の抗体の製造方法により、第一の対と第二の対の両方を含む抗体以外の産性を抑制し、製造される抗体組成物中に含まれる第一の対と第二の対の両方を含む抗体の割合を高めることができる。即ち、本発明の方法により、製造される抗体組成物の比活性を増加させることができる。
２．抗体
本発明により上述の方法で製造される抗体が提供される。必要に応じ、上記方法により製造された抗体組成物中の抗体を、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。精製は、例えば、抗体の抗原結合活性を指標として行うことができる。抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）または蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明で製造される多重特異性抗体は特に限定されないが、通常、第一のＨ鎖と第二のＨ鎖のアミノ酸配列が異なっており、第一のＬ鎖と第二のＬ鎖のアミノ酸配列が異なっている二特異性抗体（ＢｓＡｂ）である。以下、主としてＢｓＡｂについて述べるが、その他の多重特異性抗体にも同様に適用することができる。第一の対と第二の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なる抗原（又はエピトープ）を認識するＢｓＡｂである。本発明においては、全く異なる抗原を認識するＢｓＡｂでもよいし、同一抗原上の異なる部位（異なるエピトープ）を認識するＢｓＡｂでもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。
本発明で製造される抗体は、第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい工夫がされていることが好ましい。そのような工夫の具体例としては、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを挙げることができる。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓは、ヘテロマルチマー形成を促進し、ホモマルチマー形成を抑制するように、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補的な相互作用を導入する（例えば、非天然のジスルフィド結合が第一のポリペプチドと第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チオール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を導入する）方法である（特表２００１−５２３９７１）。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓは当業者に公知の技術であり、当業者は適宜、抗体に導入することが可能である。
又、本発明で製造される抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がリンカーなどで結合されていない抗体であることが好ましく、さらに好ましくはＨ鎖とＬ鎖間にジスルフィド結合以外の共有結合が存在しない抗体であることが好ましい。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体または抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｍ．Ｓ．Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：２９６８−２９７６；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｈ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｓｙｍｏｌ．１９８９，１７８：４７６−４９６；Ａ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９，１７８：４９７−５１５；Ｅ．Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：６５２−６６３；Ｊ．Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：６６３−６６９；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１，９：１３２−１３７参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に標識物質、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。特に標識抗体は有用であり、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、金属キレート等により抗体を標識し、検出する方法が公知である。抗体修飾物は、得られた抗体に架橋剤等を用いて化学的な修飾を直接的に施すことによって得ることができる。また、抗体に対して低分子ハプテン（例えば、ビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレサミン等）を結合し、低分子ハプテンを認識する結合成分により間接的な標識を施すこともできる。また、本発明においては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
本発明の抗体は、癌治療において使用することを目的とする場合には、例えば、抗体の一方の腕は腫瘍細胞抗原を認識するように調製し、他方の腕は細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計することができる。腫瘍細胞抗原としては、例えば、１Ｄ１０（悪性Ｂ細胞）、ＡＭＯＣ−１（ｐａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡＭＡ１、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦ受容体、Ｉｄ−１、Ｌ−Ｄ１（大腸癌）、ＭｏＶ１８、ｐ９７、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＯＶＣＡＲ−３、神経細胞接着分子（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＮＣＡＭ）、腎細胞癌、メラノサイト刺激ホルモンアナログ、葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）等が挙げられる。また、細胞傷害性を誘起する分子としては、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＦｃγＲＩが例示される。その他、ＩＦＮ−α、サポニン、ピンカアルカロイド、リシンのＡ鎖等の毒素と結合できるようＢｓＡｂを設計することもできる。
また、ヘテロ二量体を形成し、リガンドとの結合によりその鎖間の距離または角度等が変化することにより細胞内にシグナルを伝達する受容体（例えば、多くのサイトカイン受容体）に対して結合するように構築することにより、リガンドによる受容体の二量体化を模倣できるアゴニスト抗体として本発明の抗体を利用することができる。
その他にも、（１）ＣＤ３０及びアルカリホスファターゼに結合し、リン酸マイトマイシンをマイトマイシンアルコールに変換する等の、化学物質の変換を助ける酵素と相互作用する抗体、（２）繊維素溶解剤として使用できる、フィブリン、ｔＰＡ、ｕＰＡ等に結合する抗体、（３）ＬＤＬ及びＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導する抗体、（４）ＣＤ３等のＴ細胞上の抗原と、ＨＣＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ等の病原菌の抗原を認識する感染性の疾患に使用できる抗体、（５）腫瘍の検出に使用し得る腫瘍抗原と、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ハプテン等の検出可能な物質に結合性を有する抗体、（６）ワクチンアジュバントとして使用し得る抗体（Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１２：１０１−２４参照）、並びに（７）診断において使用し得るウサギＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ等の検出可能な物質と、ホルモン、フェリチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ＣＥＡ等を抗原とする抗体等が知られており、これらの公知の多重特異性抗体（ＷＯ８９／０２９２２号パンフレット、ＥＰ３１４、３１７号公報、ＵＳ５１１６９６４号公報参照）を含む様々な抗体を本発明の方法により製造することができる。
以上のように、本発明の抗体は、従来知られている多特異性抗体と同様に、免疫診断、治療及び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用である。例えば、腫瘍細胞を殺す等の細胞障害性を誘起するため、ワクチンアジュバントとして、血栓溶解剤等の薬剤を適切に生体内において標的に対して運搬するため、酵素により活性化されるプロドラッグを標的部位において確実に変換するため、感染性の疾患の治療用に、細胞表面受容体に対して免疫複合体を誘導するため、免疫毒素等を腫瘍細胞等の標的細胞に運搬するため等、様々な治療目的で使用することが考えられる。
本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。このような治療目的で使用される本発明の抗体を含む医薬組成物は、必要に応じ、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
また、必要に応じ本発明のＤｂをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．，１９８０等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明のＤｂに適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８１，１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１９８２，１２：９８−１０５；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９８３，２２：５４７−５５６；ＥＰ第１３３，９８８号）。
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。
本発明の抗体は酵素免疫分析に用いることもできる。このためには、抗体の一方の抗体可変領域は酵素上の酵素活性を阻害しないエピトープを、そして他方は担体に結合するような担体を認識するように設計する。例えば、ＩｇＧ、フェリチン、ＨＲＰ及びホルモン等を認識する抗体を挙げることができる。
また、本発明の抗体はｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける種々の疾病の免疫診断に用いることも可能である。例えば、抗体の一方の対の抗体可変領域を腫瘍細胞に特異的な抗原等を認識するようにし、他方は検出可能なマーカーに結合するように設計することができる。検出可能なマーカーとしては放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）、蛍光色素（フルオレセイン、ルシフェリン等）、化学ルミネセンス化合物（イソチオシアネート、ローダミン等）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰ等の汎用の酵素等を挙げることができ、抗体のこれらの物質との結合及び検出は公知の方法に従って行うことができる（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９６２，１４４：９４５；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３：１０１４；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９８１，４０：２１９；Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ １９８２，３０：４０７参照）。このように検出可能な物質に対して反応性を有する本発明の抗体は、拮抗的結合分析、直接的及び間接的なサンドイッチ免疫分析（ＥＬＩＳＡ等）、免疫沈降分析（Ｚｏｌａ，″Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９８７））等を含む、種々の分析において用いることもできる。
本発明の抗体を上述のような診断等において使用する場合、必要に応じ抗体を不溶性担体に結合することもできる。抗体を不溶性担体に結合する方法は周知であり、慣用の化学結合法または物理的吸着法により抗体を固相化することができる。不溶性担体としては例えば、種々の合成樹脂、多糖類、ガラス、金属等を素材とした球状、繊維状、棒状、トレイ等の容器状、盤状、セル及び試験管等の所望の形態の担体を挙げることができる。
３．抗体組成物
本発明において抗体組成物とは、複数種類の抗体を含む集団のことをいう。
抗体組成物において、目的型の抗体の割合を高くするとは、抗体組成物中に含まれる、第一の対と第二の対で形成される抗体の割合を高くすることを意味する。つまり、抗体組成物中の第一のＨ鎖と第二のＬ鎖で形成される対又は第二のＨ鎖と第一のＬ鎖で形成される対を含む抗体の割合を低くすることを意味する。即ち、本発明の抗体組成物は、一般的には、より高い比活性を有するものである。
抗体の比活性の指標としては、抗体の結合活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、中和活性などを挙げることができる。比活性を測定する為に用いる検出指標としては、抗体組成物中の目的とする抗体の量的および／又は質的な変化が測定可能である限りどのような指標をも使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による酵素反応またはタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的および／若しくは質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量体化、多量体化、分解、乖離等、さらにＤＮＡまたはＲＮＡの増幅、切断、伸長も指標として用いることができる。また、シグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることもできる。細胞系の指標としては、本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。細胞の形態の変化は、一般に顕鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋及びｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内蛋白質量等を用いることができる。また、受容体への本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータ又はプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時および／または連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
４．ベクター及び細胞
本発明により、本発明の抗体の製造方法において使用することができる、発現誘導剤により抗体のＬ鎖またはＨ鎖の発現が誘導されるベクターが提供される。本発明の抗体の製造方法において使用できるベクターは、好ましくは、一つの発現調節因子により対となるＬ鎖及びＨ鎖の両方が誘導されるものである。ここで、Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする遺伝子は同じベクター中に組み込まれていても、別々のベクター中に組み込まれていてもよい。本発明はまた、第一のＬ鎖及び第一のＨ鎖をコードするベクター、並びに、第二のＬ鎖及び第二のＨ鎖をコードするベクターを含むベクターキットに関する。該ベクターキットでは、好ましくは第一のＬ鎖・Ｈ鎖と第二のＬ鎖・Ｈ鎖は異なる発現調節因子により誘導される。さらに、必要に応じ、第一のＬ鎖、第一のＨ鎖、第二のＬ鎖、第二のＨ鎖の発現が各々別の発現調節因子により誘導されるように本発明のベクター及びベクターキットを構築してもよい。
本発明は上記ベクターまたはベクターキットを含有する細胞を提供する。該細胞は好ましくは、抗体の第一のＨ鎖及びＬ鎖からなる対と、抗体の第二のＨ鎖とＬ鎖からなる対を異なる時期に発現するものである。本発明のベクター及び細胞については、上記「１．抗体の製造方法」の項の記載を参照することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
上記課題を解決する方法として、本発明者らは、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓによって一方のＨ鎖だけでは細胞より分泌されないことに着目し、一方のＨ鎖及びＬ鎖（Ｈａ及びＬａ）を発現させ、その発現を抑制した後もう一方のＨ鎖及びＬ鎖（Ｈｂ及びＬｂ）を発現させ、先に目的ＨＬ分子（ＨａＬａ及びＨｂＬｂ）を構築した後にＨ鎖同士を対合させる（Ｈ２Ｌ２）ことで目的型ＢｓＡｂの形成を優先させることができることを発見し、本発明を完成した。本発明により、二特異性ＩｇＧ等の多重特異性抗体の作製時に、例えば、抗体左腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｌｅｆｔ ＨＬ）、抗体右腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｒｉｇｈｔ ＨＬ）それぞれを発現制御ベクターにより時間差で発現させる等、対応しない重鎖と軽鎖の接触を阻害することにより目的とする抗体を効率的に産生することができる。
より詳細には本発明により、
（１）第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触を阻害し、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害することを特徴とする抗体の製造方法、
（２）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることを特徴とする抗体の製造方法、
（３）以下の工程を含む抗体の製造方法
（ａ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を発現させ、第一の対を作製する工程、
（ｂ）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖を発現させ、第二の対を作製する工程、及び
（ｃ）抗体の第一の対と第二の対を用いて抗体を作製する工程、
（４）以下の工程を含む抗体の製造方法
（ａ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖の発現を誘導して第一の対を作製する工程、
（ｂ）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖の発現の誘導をとめる工程、
（ｃ）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖の発現を誘導して第二の対を作製する工程、及び
（ｄ）抗体の第一の対と第二の対を用いて抗体を作製する工程、
（５）第一のＨ鎖と第二のＨ鎖のアミノ酸配列が異なり、かつ第一のＬ鎖と第二のＬ鎖のアミノ酸配列が異なる抗体である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法、
（６）抗体が二特異性抗体である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法、
（７）第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい抗体であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法、
（８）第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい抗体が、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓが導入された抗体であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法、
（９）第一の発現調節因子により第一のＨ鎖及び第一のＬ鎖の発現が誘導されるベクター、および第二の発現調節因子により第二のＨ鎖及び第二のＬ鎖の発現が誘導されるベクターを用いることを特徴とする抗体の製造方法、
（１０）抗体組成物の、第一の対と第二の対を含む抗体の割合を高くすることにより、抗体組成物の比活性を増加させる方法、
（１１）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることにより、抗体組成物の比活性を増加させる方法、
（１２）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させることにより、第一の対と第二の対を含む抗体以外の抗体の産生を抑制する方法、
（１３）異なる２種以上の発現誘導剤を用いることを特徴とする抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる方法、
（１４）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法により製造される抗体、
（１５）第一のＨ鎖、第二のＨ鎖、第一のＬ鎖、第二のＬ鎖を同時期に発現させて作製された抗体組成物と比較して、第一の対と第二の対を含む抗体の割合が高い抗体組成物、
（１６）抗体のＬ鎖とＨ鎖がペプチドリンカーで介されていないことを特徴とする上記（１５）記載の抗体組成物、
（１７）発現誘導剤により抗体のＬ鎖またはＨ鎖の発現が誘導されるベクター、
（１８）第一の発現調節因子により抗体の第一のＬ鎖及び第一のＨ鎖の発現が誘導されるベクターと、第二の発現調節因子により抗体の第二のＬ鎖及び第二のＨ鎖の発現が誘導されるベクターを含むベクターキット、
（１９）上記（１７）または（１８）に記載のベクターを含有する細胞、並びに
（２０）抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞、
が提供される。
１．抗体の製造方法
本発明は、複数の抗体または抗体断片を結合する多重特異性抗体の製造において目的とする型の抗体を優先的に製造する方法に関する。より詳細には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）のような多重特異性抗体の製造においては、第一の重鎖（Ｈ鎖）と結合していない第一の軽鎖（Ｌ鎖）と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触、及び、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害することにより目的型のＢｓＡｂを優先的に製造することができる。本発明では、例えば、まず（１）抗体の第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を発現させ、第一のＨ鎖・Ｌ鎖対を作製し、別に（２）抗体の第二のＨ鎖と第二のＬ鎖を発現させ、第二のＨ鎖・Ｌ鎖対を作製した後、（３）（１）及び（２）の工程により作製された２つの対を用いて所望のＢｓＡｂを優先的に製造することができる。そして、三以上の特異性を有する抗体の製造を目的とする場合には、ＢｓＡｂを製造する場合と同様に第一〜所望の数までのＨ鎖・Ｌ鎖の対をそれぞれ発現し形成させた後に、作製された対を用いて所望の多重特異性抗体を製造することができる。以下、多重特異性抗体のうちＢｓＡｂを例として説明するが、本発明の方法はその他の多重特異性抗体にも同じように適用することができる。
本発明において、目的とする多重特異性抗体がＢｓＡｂであれば、「第一の重（Ｈ）鎖」とは抗体を形成する２つのＨ鎖のうちの一方のＨ鎖であり、第二のＨ鎖は第一のＨ鎖とは異なるもう一方のＨ鎖のことをいう。つまり、２つのＨ鎖のうち任意にどちらか一方を第一のＨ鎖とし、他方を第二のＨ鎖とすることができる。同様に、「第一の軽（Ｌ）鎖」とはＢｓＡｂを形成する２つのＬ鎖のうちの一方のＬ鎖であり、第二のＬ鎖は第一のＬ鎖とは異なるもう一方のＬ鎖のことを指し、２つのＬ鎖のうちどちらか一方を任意に第一のＬ鎖とし、他方を第二のＬ鎖とすることができる。通常、第一のＬ鎖と第一のＨ鎖は或る抗原（又はエピトープ）を認識する同一の抗体より由来し、第二のＬ鎖と第二のＨ鎖も或る抗原（又はエピトープ）を認識する同一の抗体より由来するが、これに限定されるわけではない。ここで、第一のＨ鎖・Ｌ鎖で形成されるＬ鎖−Ｈ鎖対を第一の対、第二のＨ鎖・Ｌ鎖で形成されるＬ鎖−Ｈ鎖対を第二の対と呼ぶ。第二の対の由来となる抗体を作製する際に用いられる抗原（又はエピトープ）は、第一の対の由来となる抗体を作製する際に用いられるものとは異なっていることが好ましい。即ち、第一の対と第二の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なる抗原（又はエピトープ）を認識する。この場合、第一の対及び第二の対のＨ鎖とＬ鎖は互いに異なるアミノ酸配列を有していることが好ましい。第一の対と第二の対が異なる抗原決定部位を認識する場合、該第一の対と第二の対は全く異なる抗原を認識してもよいし、同一抗原上の異なる部位（異なるエピトープ）を認識してもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。しかしながら、特定のＨ鎖とＬ鎖の組合せで形成される対を有する抗体を作製したいと考えた場合には、その特定のＨ鎖とＬ鎖を第一の対及び第二の対として任意に決定することができる。
抗体のＨ鎖又はＬ鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５２：６２４−８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２２：５８１−９７、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２２６５−６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４，１３：３２４５−６０、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６，１４：３０９−１４、及び特表平２０−５０４９７０号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法（ＷＯ９５／１５３９３号パンフレット）やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結することにより得ることができる。
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、本発明のＨ鎖及びＬ鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる（ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１５：１４６−５６参照）。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６，５９−１０３）。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）から、抗体に特異的に結合し得るプローブ（例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を用いてクローニングすることができる。また、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２等）に分けられる。本発明において抗体の製造に使用するＨ鎖及びＬ鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであってもよく、特に限定されないが、ＩｇＧは特に好ましいものである。
ここで、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域とヒト抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００；ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｋ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：８５１−８５６）。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９７％、９８％、９９％等）のアミノ酸配列相同性及び／または類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び／または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同（同じ残基）または類似（一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基いて（１）疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；（２）中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；（３）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；（５）鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに（６）芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
通常、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域中に存在する全部で６つの相補性決定領域（超可変部；ＣＤＲ）が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち１つの可変領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力があることが知られている。従って、本発明のＨ鎖及びＬ鎖をコードする抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性を維持していればよく、Ｈ鎖及びＬ鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコードしていればよい。
さらに、本発明の方法においてＨ鎖をコードする遺伝子は、該遺伝子から発現される抗体が、第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成しにくいように工夫されていることが好ましい。例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ（特表２００１−５２３９７１）は、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補的な相互作用を導入する（例えば、非天然のジスルフィド結合が第一のポリペプチドと第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チオール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を導入する）当業者に公知の技術であり、該方法を用いることによりヘテロマルチマー形成が促進され、ホモマルチマー形成が抑制されたＨ鎖を発現させることができる。
第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触、及び、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害するためには、第一のＨ鎖と第二のＬ鎖を異なる時期に発現させ、第一のＬ鎖と第二のＨ鎖を異なる時期に発現させればよく、例えば、第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる方法を採用することができる。
上述の第一の対と第二の対を異なる時期に発現させるのに対して、第一の対と第二の対を同時期に発現した場合には、通常、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触が阻害されず、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触が阻害されていないので、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の結合が抑制されず、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の結合が抑制されてない状態となる。本発明において「第一の対と第二の対を同時期に発現する」とは、第一の対と第二の対の発現時期の少なくとも一部が重なっていることを意味し、好ましくは、第一の対と第二の対の発現時期が一致していることを指す。
本発明において、第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる場合、第一の対が発現している時期と、第二の対が発現している時期が完全に異なっている、つまり、第一の対が発現している時は第二の対は発現しておらず、第二の対が発現している時は第一の対は発現していないことが好ましい。しかしながら、本発明はこれに限定されず、第一の対が発現している時期と第二の対が発現している時期の一部が重なっていても良い。第一のＨ鎖と第二のＬ鎖の結合を抑制し、第二のＨ鎖と第一のＬ鎖の結合を抑制するその他の方法としては、第一のＨ鎖と第二のＬ鎖を異なる時期に発現させ、第二のＨ鎖と第一のＬ鎖を異なる時期に発現させればよい。即ち、本発明の方法においては、第一のＨ鎖と第一のＬ鎖は同時期に発現させることが好ましいが、特に限定されず、第一のＨ鎖と第一のＬ鎖を異なる時期に発現させてもよい（第二のＨ鎖と第二のＬ鎖についても同様）。その場合、例えば、第一のＨ鎖と結合していない第一のＬ鎖と第二のＬ鎖と結合していない第二のＨ鎖の接触を阻害し、第一のＬ鎖と結合していない第一のＨ鎖と第二のＨ鎖と結合していない第二のＬ鎖の接触を阻害すれば第一のＨ鎖と第二のＬ鎖、及び第一のＬ鎖と第二のＨ鎖の結合を阻害することができる。例えば、第一の対と第二の対を異なる場所で発現させ、それぞれの対を形成してから、第一の対と第二の対を接触させ、抗体を作製してもよい。そのような方法の一つとして、第一の対と第二の対を異なる細胞中で発現させ、対形成させた後に、第一の対と第二の対を発現する細胞を融合して抗体を作製させる方法が考えられる。
第一の対と第二の対を異なる時期に発現させる為の具体的な方法としては、例えば、発現調節因子などを用いて第一の対と第二の対の発現を異なる時期に誘導する方法を挙げることができる。より具体的には、第一の発現調節因子により第一の対の発現が誘導されるベクターを構築し、第二の発現調節因子により第二の対の発現が誘導されるベクターを構築する。この際、第一の対と第二の対を一つのベクター上に構築してもよいし、異なる２つ以上のベクター上に構築してもよい。又、Ｈ鎖とＬ鎖を同一のベクター上に構築してもよいし、異なる２つ以上のベクターに構築してもよい。次に、構築したベクターを細胞に導入し、まず第一の発現調節因子により第一の対の発現を誘導する。その後、第二の発現調節因子により第二の対の発現を誘導する。この場合、第二の対の発現を誘導する前に、第一の対の発現を停止させておくことが好ましい。
発現調節因子は、宿主細胞中でのＨ鎖及びＬ鎖の発現を調節できるものであれば特に限定されず、どのような種類のものを用いてもよい。例えば、発現調節因子の不在下では発現が誘導されず、発現調節因子の存在下では発現が誘導されるものでもよいし、逆に、発現調節因子の存在下では発現が誘導されず、発現調節因子の不在下で発現が誘導されるものでもよい。発現調節因子は、発現誘導剤などの化合物でもよいし、又、温度（熱）などの物理的な要因であってもよい。発現誘導剤の具体的な例としては、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクダイソンアナログなどのホルモン、Ｃｒｅ（ｃａｕｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；相同組換え酵素）などの酵素、等を挙げることができる。また、誘導したＨ鎖及び／またはＬ鎖の発現をとめるためには、上述の発現調節因子として機能する発現誘導剤を除くことができる。温度（熱）等の物理的要因を発現調節因子とした場合には、発現が誘導されないような温度に戻すことにより誘導したＨ鎖及び／またはＬ鎖の発現をとめることができる。
発現調節因子により発現誘導されるベクターの構築は当業者に公知の方法で行うことができる。具体的な例としては、市販されている発現誘導剤により発現が誘導されるベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ、ｐＩＮＤ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に抗体の第一の対又は第二の対をコードする遺伝子を導入することにより作製することが可能である。通常、第一の対を構成するＨ鎖及びＬ鎖の発現を誘導する第一の発現調節因子と第二の対を構成するＨ鎖及びＬ鎖の発現を誘導する第二の発現調節因子は異なる発現調節因子である。また、場合により、第一のＨ鎖の発現を誘導する発現調節因子と第一のＬ鎖の発現を誘導する発現調節因子も異なるものであってもよい（第二のＨ鎖及びＬ鎖の発現調節因子についても同様）。このようにして構築された発現調節因子により抗体の第一または第二の対の発現が誘導されるベクターは、抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能となる。又、当該ベクターが導入された宿主細胞は、抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞となる。
本発明の各抗体断片を発現させるためのベクターの構築に当たっては、遺伝子情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、ターミネーター等のユニットが必要であり、さらに各抗体断片のＮ末端に適当なシグナル配列を配置することが好ましい。プロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λファージＰＬ、ＰＲ等に由来するプロモーターが利用可能である。ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ、ファージ、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のものを使用することができる。適当なシグナル配列としては、宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を可能にするリーダーペプチド配列が挙げられ、ｐｅｌ１Ｂ分泌シグナルを例示することができる（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４０：１０４１−３；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９，８６：５７２８参照）。
本発明の抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能なベクターを作製する為に用いられるベクターは特に限定されず、どのようなベクターを用いてもよい。ベクターの具体的な例としては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７）：５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）、大腸菌由来の発現ベクター（Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ）などが挙げられる。又、市販されている発現誘導剤により発現が誘導されるベクターを用いてもよい。
本発明の抗体の第一の対と第二の対を異なる時期に発現することが可能な細胞を作製する為に用いられる細胞は特に限定されず、どのような細胞を用いてもよい。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、または（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞等）、糸状菌（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の細胞等）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌等が知られている。本発明においては、糖鎖の付加、立体構造の維持等の観点から、動物細胞を用いることが好ましく、特に哺乳動物細胞を用いることが好ましい。これらの細胞に、本発明の抗体の第一の対と第二の対（場合により、第一並びに第二の対の各々のＨ鎖及びＬ鎖）を異なる時期に発現することが可能なベクターを導入することにより本発明の細胞を作製することができる。
構築した各対を発現するベクターの所望の宿主細胞への導入は、用いるベクター及び宿主細胞の種類に依存する。原核細胞を宿主として使用する場合には、例えば、カルシウムイオンを用いた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７２，６９：２１１０）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８２９号公報）、エレクトロポレーション法（Ｇｅｎｅ １９８２，１７：１０７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９７９，１６８：１１１）等の方法により宿主細胞へ導入することができる。また、宿主細胞が酵母である場合には、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９０，１９４：１８２）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８４，８１：４８８９）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５３：１６３）等が挙げられ、植物細胞についてはアグロバクテリウム法（Ｇｅｎｅ １９８３，２３：３１５；ＷＯ８９／０５８５９等）、超音波処理による方法（ＷＯ９１／００３５８）等が公知である。また、動物細胞を宿主とした場合には、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０，３：１３３）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８７，８４：７４１３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２：４５６）、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法等が挙げられる。
上述のようにして取得された宿主細胞は、例えば、次のような方法で培養することができる。宿主が原核生物や真核微生物である場合は、培地は該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等の生育に必要な物質を含有し、形質転換体の効率的な培養を可能にするものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は好気的条件、嫌気的条件のいずれで行ってもよく、生育温度、培地のｐＨ、生育時間等の条件は、用いる形質転換体の種類に応じ適宜当業者により決定され得るものである。また、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターについては、必要に応じてインデューサーを培地に添加すればよい（例えば、ｌａｃプロモーターであればＩＰＴＧ、ｔｒｐプロモーターであればＩＡＡ等）。昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、培地としてはＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｘＣｅｌｌ４００及びＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ １９５：７８８（１９６２））等を用いることができ、必要に応じゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。宿主細胞が動物細胞である場合には、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １９９：５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２：５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７３：１（１９５０））、または、これらの培地にＢＳＡ等を添加した培地を使用することができる。培養は通常の条件、例えば、ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下で行うことができる。この際、必要に応じカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。
本発明の具体的な抗体の製造方法として、例えば、次のような方法が考えられる。最初に、抗体左腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｌｅｆｔ ＨＬ）をテトラサイクリン誘導型のｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへ、抗体右腕Ｈ鎖およびＬ鎖（Ｒｉｇｈｔ ＨＬ）をエクダイソン誘導型のｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへ組み込む。全ての発現調節プラスミドを上述の適当な宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７等の動物細胞に形質導入する。その後、例えば、一次誘導としてテトラサイクリンを培地へ添加し、抗体左腕ＨＬ分子を細胞内で形成させる。１〜２日間の一次誘導発現後、一旦培地を洗浄することにより、最初の薬剤（ここではテトラサイクリン）を完全に除去する。次に、二次誘導用の薬剤エクダイソンアナログを含む新鮮な培地に置換し、二次誘導発現を例えば２〜３日間行う。その結果、抗体右腕ＨＬ分子が生成され、既に細胞中に存在していた左腕ＨＬ分子と会合し完全体ＢｓＡｂが形成され、培地中へ分泌される。
本発明の抗体の製造方法により、第一の対と第二の対の両方を含む抗体以外の産性を抑制し、製造される抗体組成物中に含まれる第一の対と第二の対の両方を含む抗体の割合を高めることができる。即ち、本発明の方法により、製造される抗体組成物の比活性を増加させることができる。
２．抗体
本発明により上述の方法で製造される抗体が提供される。必要に応じ、上記方法により製造された抗体組成物中の抗体を、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。精製は、例えば、抗体の抗原結合活性を指標として行うことができる。抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）または蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明で製造される多重特異性抗体は特に限定されないが、通常、第一のＨ鎖と第二のＨ鎖のアミノ酸配列が異なっており、第一のＬ鎖と第二のＬ鎖のアミノ酸配列が異なっている二特異性抗体（ＢｓＡｂ）である。以下、主としてＢｓＡｂについて述べるが、その他の多重特異性抗体にも同様に適用することができる。第一の対と第二の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なる抗原（又はエピトープ）を認識するＢｓＡｂである。本発明においては、全く異なる抗原を認識するＢｓＡｂでもよいし、同一抗原上の異なる部位（異なるエピトープ）を認識するＢｓＡｂでもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。
本発明で製造される抗体は、第一の対同士又は第二の対同士では抗体が形成されにくい工夫がされていることが好ましい。そのような工夫の具体例としては、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを挙げることができる。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓは、ヘテロマルチマー形成を促進し、ホモマルチマー形成を抑制するように、第一のポリペプチドの界面と第二のポリペプチドの界面で特異的かつ相補的な相互作用を導入する（例えば、非天然のジスルフィド結合が第一のポリペプチドと第二のポリペプチド間に形成されるように、第一のポリペプチドの界面に遊離チオール含有残基を、第二のポリペプチドの界面中に相当する遊離チオール含有残基を導入する）方法である（特表２００１−５２３９７１）。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓは当業者に公知の技術であり、当業者は適宜、抗体に導入することが可能である。
又、本発明で製造される抗体は、Ｈ鎖とＬ鎖がリンカーなどで結合されていない抗体であることが好ましく、さらに好ましくはＨ鎖とＬ鎖間にジスルフィド結合以外の共有結合が存在しない抗体であることが好ましい。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体または抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｍ．Ｓ．Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：２９６８−２９７６；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｈ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｓｙｍｏｌ．１９８９，１７８：４７６−４９６；Ａ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９，１７８：４９７−５１５；Ｅ．Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：６５２−６６３；Ｊ．Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１２１：６６３−６６９；Ｒ．Ｅ．Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１，９：１３２−１３７参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に標識物質、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。特に標識抗体は有用であり、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、金属キレート等により抗体を標識し、検出する方法が公知である。抗体修飾物は、得られた抗体に架橋剤等を用いて化学的な修飾を直接的に施すことによって得ることができる。また、抗体に対して低分子ハプテン（例えば、ビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレサミン等）を結合し、低分子ハプテンを認識する結合成分により間接的な標識を施すこともできる。また、本発明においては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
本発明の抗体は、癌治療において使用することを目的とする場合には、例えば、抗体の一方の腕は腫瘍細胞抗原を認識するように調製し、他方の腕は細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計することができる。腫瘍細胞抗原としては、例えば、１Ｄ１０（悪性Ｂ細胞）、ＡＭＯＣ−１（ｐａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡＭＡ１、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦ受容体、Ｉｄ−１、Ｌ−Ｄ１（大腸癌）、ＭｏＶ１８、ｐ９７、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＯＶＣＡＲ−３、神経細胞接着分子（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＮＣＡＭ）、腎細胞癌、メラノサイト刺激ホルモンアナログ、葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）等が挙げられる。また、細胞傷害性を誘起する分子としては、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＦｃγＲＩが例示される。その他、ＩＦＮ−α、サポニン、ピンカアルカロイド、リシンのＡ鎖等の毒素と結合できるようＢｓＡｂを設計することもできる。
また、ヘテロ二量体を形成し、リガンドとの結合によりその鎖間の距離または角度等が変化することにより細胞内にシグナルを伝達する受容体（例えば、多くのサイトカイン受容体）に対して結合するように構築することにより、リガンドによる受容体の二量体化を模倣できるアゴニスト抗体として本発明の抗体を利用することができる。
その他にも、（１）ＣＤ３０及びアルカリホスファターゼに結合し、リン酸マイトマイシンをマイトマイシンアルコールに変換する等の、化学物質の変換を助ける酵素と相互作用する抗体、（２）繊維素溶解剤として使用できる、フィブリン、ｔＰＡ、ｕＰＡ等に結合する抗体、（３）ＬＤＬ及びＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導する抗体、（４）ＣＤ３等のＴ細胞上の抗原と、ＨＣＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ等の病原菌の抗原を認識する感染性の疾患に使用できる抗体、（５）腫瘍の検出に使用し得る腫瘍抗原と、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ハプテン等の検出可能な物質に結合性を有する抗体、（６）ワクチンアジュバントとして使用し得る抗体（Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１２：１０１−２４参照）、並びに（７）診断において使用し得るウサギＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ等の検出可能な物質と、ホルモン、フェリチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ＣＥＡ等を抗原とする抗体等が知られており、これらの公知の多重特異性抗体（ＷＯ８９／０２９２２号パンフレット、ＥＰ３１４、３１７号公報、ＵＳ５１１６９６４号公報参照）を含む様々な抗体を本発明の方法により製造することができる。
以上のように、本発明の抗体は、従来知られている多特異性抗体と同様に、免疫診断、治療及び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用である。例えば、腫瘍細胞を殺す等の細胞障害性を誘起するため、ワクチンアジュバントとして、血栓溶解剤等の薬剤を適切に生体内において標的に対して運搬するため、酵素により活性化されるプロドラッグを標的部位において確実に変換するため、感染性の疾患の治療用に、細胞表面受容体に対して免疫複合体を誘導するため、免疫毒素等を腫瘍細胞等の標的細胞に運搬するため等、様々な治療目的で使用することが考えられる。
本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。このような治療目的で使用される本発明の抗体を含む医薬組成物は、必要に応じ、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
また、必要に応じ本発明のＤｂをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．，１９８０等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明のＤｂに適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８１，１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１９８２，１２：９８−１０５；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９８３，２２：５４７−５５６；ＥＰ第１３３，９８８号）。
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。
本発明の抗体は酵素免疫分析に用いることもできる。このためには、抗体の一方の抗体可変領域は酵素上の酵素活性を阻害しないエピトープを、そして他方は担体に結合するような担体を認識するように設計する。例えば、ＩｇＧ、フェリチン、ＨＲＰ及びホルモン等を認識する抗体を挙げることができる。
また、本発明の抗体はｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける種々の疾病の免疫診断に用いることも可能である。例えば、抗体の一方の対の抗体可変領域を腫瘍細胞に特異的な抗原等を認識するようにし、他方は検出可能なマーカーに結合するように設計することができる。検出可能なマーカーとしては放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）、蛍光色素（フルオレセイン、ルシフェリン等）、化学ルミネセンス化合物（イソチオシアネート、ローダミン等）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰ等の汎用の酵素等を挙げることができ、抗体のこれらの物質との結合及び検出は公知の方法に従って行うことができる（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９６２，１４４：９４５；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７４，１３：１０１４；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９８１，４０：２１９；Ｎｙｇｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ １９８２，３０：４０７参照）。このように検出可能な物質に対して反応性を有する本発明の抗体は、拮抗的結合分析、直接的及び間接的なサンドイッチ免疫分析（ＥＬＩＳＡ等）、免疫沈降分析（Ｚｏｌａ，″Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９８７））等を含む、種々の分析において用いることもできる。
本発明の抗体を上述のような診断等において使用する場合、必要に応じ抗体を不溶性担体に結合することもできる。抗体を不溶性担体に結合する方法は周知であり、慣用の化学結合法または物理的吸着法により抗体を固相化することができる。不溶性担体としては例えば、種々の合成樹脂、多糖類、ガラス、金属等を素材とした球状、繊維状、棒状、トレイ等の容器状、盤状、セル及び試験管等の所望の形態の担体を挙げることができる。
３．抗体組成物
本発明において抗体組成物とは、複数種類の抗体を含む集団のことをいう。
抗体組成物において、目的型の抗体の割合を高くするとは、抗体組成物中に含まれる、第一の対と第二の対で形成される抗体の割合を高くすることを意味する。つまり、抗体組成物中の第一のＨ鎖と第二のＬ鎖で形成される対又は第二のＨ鎖と第一のＬ鎖で形成される対を含む抗体の割合を低くすることを意味する。即ち、本発明の抗体組成物は、一般的には、より高い比活性を有するものである。
抗体の比活性の指標としては、抗体の結合活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、中和活性などを挙げることができる。比活性を測定する為に用いる検出指標としては、抗体組成物中の目的とする抗体の量的および／又は質的な変化が測定可能である限りどのような指標をも使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による酵素反応またはタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的および／若しくは質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量体化、多量体化、分解、乖離等、さらにＤＮＡまたはＲＮＡの増幅、切断、伸長も指標として用いることができる。また、シグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることもできる。細胞系の指標としては、本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。細胞の形態の変化は、一般に顕鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋及びｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内蛋白質量等を用いることができる。また、受容体への本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては本発明の抗体の結合、アゴニスト作用、アンタゴニスト作用、中和作用等による組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータ又はプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時および／または連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
４．ベクター及び細胞
本発明により、本発明の抗体の製造方法において使用することができる、発現誘導剤により抗体のＬ鎖またはＨ鎖の発現が誘導されるベクターが提供される。本発明の抗体の製造方法において使用できるベクターは、好ましくは、一つの発現調節因子により対となるＬ鎖及びＨ鎖の両方が誘導されるものである。ここで、Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする遺伝子は同じベクター中に組み込まれていても、別々のベクター中に組み込まれていてもよい。本発明はまた、第一のＬ鎖及び第一のＨ鎖をコードするベクター、並びに、第二のＬ鎖及び第二のＨ鎖をコードするベクターを含むベクターキットに関する。該ベクターキットでは、好ましくは第一のＬ鎖・Ｈ鎖と第二のＬ鎖・Ｈ鎖は異なる発現調節因子により誘導される。さらに、必要に応じ、第一のＬ鎖、第一のＨ鎖、第二のＬ鎖、第二のＨ鎖の発現が各々別の発現調節因子により誘導されるように本発明のベクター及びベクターキットを構築してもよい。
本発明は上記ベクターまたはベクターキットを含有する細胞を提供する。該細胞は好ましくは、抗体の第一のＨ鎖及びＬ鎖からなる対と、抗体の第二のＨ鎖とＬ鎖からなる対を異なる時期に発現するものである。本発明のベクター及び細胞については、上記「１．抗体の製造方法」の項の記載を参照することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
図１は、ルシフェラーゼ定量法によるＩＦＮアゴニスト活性の比較を示すグラフである。２−３：同時誘導，３−３：テトラサイクリンで１日誘導後、ムリステロンＡで２日誘導発現，４−４：テトラサイクリンで１日誘導後、ムリステロンＡで３日誘導発現，５−３：テトラサイクリンで２日誘導後、ムリステロンＡで１日誘導発現，７−４：ムリステロンＡで１日誘導後、テトラサイクリンで３日誘導発現。
図２は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による目的型抗体量の比較を示すグラフである。各抗体サンプル濃度における吸光度を参照波長６５５ｎｍにて４０５ｎｍで計測した。上段はＡＲ１−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎ、下段はＡＲ２−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎを示す。
黒丸：同時誘導発現サンプル，白四角：時間差誘導発現サンプル。
図２は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による目的型抗体量の比較を示すグラフである。各抗体サンプル濃度における吸光度を参照波長６５５ｎｍにて４０５ｎｍで計測した。上段はＡＲ１−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎ、下段はＡＲ２−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎを示す。
黒丸：同時誘導発現サンプル，白四角：時間差誘導発現サンプル。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明をいかなる意味でも限定するものではない。
１．ヒトＩＦＮヘテロ受容体（ＡＲ１／ＡＲ２）に結合する二特異性ＩｇＧ抗体発現用プラスミド構築
本抗体は２種のＨ鎖と共に抗ＡＲ１または抗ＡＲ２いずれかのＬ鎖だけを発現させ、Ｌ鎖を共通のものにした場合活性を失う為、逆に阻害に働くことが考えられる。つまり、両Ｌ鎖を発現させた際に目的の組合せのＩｇＧが優先的に発現すればＩｇＧの見かけ上の比活性が上昇することが期待される。
二特異性ＩｇＧ抗体を産生する際に、各Ｈ鎖のヘテロな組み合わせの分子を形成させるためにＩｇＧ１のｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ技術［Ｒｉｄｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９；６１７−２１（１９９６）］を参考に、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３部分へのアミノ酸置換体を作製した。ａタイプ（ヒトＩｇＧ４γａ）はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ置換体であり、ｂタイプ（ヒトＩｇＧ４γｂ）はＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの置換体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換（−ｐｐｃｐＳｃｐ− −＞ −ｐｐｃｐＰｃｐ−）を導入した。
ＡＲ１受容体を認識する抗体分子片腕（便宜上右腕ＨＬ分子と称する）の発現用として、テトラサイクリン誘導型ベクターｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。抗体右腕ＨＬ分子を構成するＨ鎖およびＬ鎖それぞれの発現ユニット、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ３ｓｓ）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１；１０７５（１９８４）］の下流にＡＲ１受容体を認識するマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γａ定常領域ないしκ定常領域、を組み込んだベクター（ｐｃＤＮＡ１−２４ＨないしｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ）を公知の遺伝子工学的手法に則り作製した。
ＡＲ２受容体を認識するもう一方の片腕（便宜上左腕ＨＬ分子と称する）はエクダイソン類似体誘導型ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。抗体左腕ＨＬ分子を構成するＨ鎖およびＬ鎖それぞれの発現ユニット、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ６ｓｓ）［ＥＭＢＯ．Ｊ．６；２９３９（１９８７）］の下流にＡＲ２受容体を認識するマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γｂ定常領域ないしκ定常領域、を組み込んだベクター（ｐＩＮＤ２−７ＨないしｐＩＮＤ２−７Ｌ）を同様に作製した。各々のプラスミドＤＮＡは市販プラスミド精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。各プラスミド溶液は、使用するまで４℃で保存した。
２．二特異性ＩｇＧ抗体の動物細胞での時間差ＨＬ発現
２−１．ＤＮＡ溶液の調製
抗体右腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ１−２４ＨそしてｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ）はテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しない状況下で発現を完全に抑制する為にＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。ここで、発現したＴｅｔＲは２量体でｐｃＤＮＡ４／ＴＯ上の２つのＴｅｔオペレーター配列（ＴｅｔＯ２）に結合し、目的遺伝子の転写を抑制する。そして、添加したテトラサイクリンがＴｅｔＲ２量体と結合し、構造変化によりＴｅｔＲがＴｅｔオペレーターから離れることにより、ＣＭＶ／ＴｅｔＯ２プロモーターによる目的遺伝子の転写が誘導される。また、抗体左腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐＩＮＤ２−７ＨそしてｐＩＮＤ２−７Ｌ）は、昆虫ホルモンであるエクダイソン類似化合物（ムリステロンＡあるいはポナステロンＡ）により発現誘導がかかる。このとき、エクダイソン類似化合物と反応し誘導を行なうエクダイソンレセプターとレチノイドＸレセプターを恒常的に発現するプラスミドｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。ここで、エクダイソンアナログの添加により、その類似体と、エクダイソンレセプターとレチノイドＸレセプターのヘテロ２量体がｐＩＮＤベクターのエクダイソン／グルココルチコイド（５ＸＥ／ＧＲＥ）プロモーターに結合して目的遺伝子発現が活性化する。従って、動物細胞のトランスフェクションの為にｐｃＤＮＡ１−２４Ｈ、ｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ、ｐＩＮＤ２−７Ｈ、ｐＩＮＤ２−７Ｌ、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲそしてｐＶｇＲＸＲからなる計６種類のプラスミドＤＮＡ混液を調製した。
２−２．動物細胞のトランスフェクション
アフリカミドリザル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ−７株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた場合には、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地へ懸濁し、１×１０５／ｍｌの細胞密度で接着細胞用６−ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）の各ｗｅｌｌへ１ｍｌずつ蒔きこみ、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。２−１で調製したプラスミドＤＮＡ混液をトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ ６（Ｒｏｃｈｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０μｌの混液へ加えて室温２０分間静置したものを各ｗｅｌｌの細胞へ投入し、４〜５時間３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。
ヒト胎児腎臓由来培養細胞ＨＥＫ２９３Ｈ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた場合には、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地へ懸濁し、５×１０５／ｍｌの細胞密度で接着細胞用１２−ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）の各ｗｅｌｌへ１ｍｌずつ蒔きこみ、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。２−１で調製したプラスミドＤＮＡ混液をトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０μｌの混液へ加えて室温２０分間静置したものを各ｗｅｌｌの細胞へ投入し、４〜５時間３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。
２−３．二特異性ＩｇＧ抗体の発現誘導
２−２の通りトランスフェクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン塩酸塩（和光純薬）を含む１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を投入し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で１日培養して、抗体右腕ＨＬ分子の第一次発現誘導を行なった。その後、培地を吸引除去し、一旦１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地にて洗浄した後、５μＭのムリステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ないしポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地を投入し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で２日ないし３日培養して、抗体左腕ＨＬ分子の第二次発現誘導を行ない、培地中へ二特異性ＩｇＧ抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、一旦遠心（約２０００ｇ、５分間、室温）して細胞を除去して、必要に応じマイクロコン−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮を行った。該サンプルは使用するまで４℃で保存した。
２−４．発現抗体の精製
２−３にて調製された抗体発現上清サンプルをプロテインＡ樹脂（ｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。すなわち、該上清４ｍｌに対しＴＢＳ緩衝液で置換した樹脂５０μｌを添加し、一晩４℃で転倒混和し、抗体を樹脂へ吸着させた。一旦遠心（３０００ｇ，１０分）して上清を除去した後、ＴＢＳ緩衝液５００μｌに懸濁し、０．２２μｍフィルターカップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移した。遠心（３０００ｇ，１分）とＴＢＳ緩衝液による洗浄を３回繰り返した後、溶出緩衝液（１０ｍＭ ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ａｎｄ ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）１００μｌにて溶出した。溶出液へ１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液５μｌを添加し中和した。該溶液は使用するまで４℃で保存した。
２−５．ヒトＩｇＧ濃度の定量
Ｇｏａｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ）をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて１μｇ／ｍＬに調製し、９６−ｗｅｌｌイムノプレートＭａｘｉＳｏｒｐ Ｓｕｒｆａｃｅ（ＮＡＬＧＥ ＮＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に固相化した。Ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ．Ｂ．）にてブロッキング処理した後、Ｄ．Ｂ．を用いて適当に希釈した培養上清サンプルないし精製抗体サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、１０００ｎｇ／ｍＬから２倍系列でＤ．Ｂ．にて１１段階希釈したＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１．１ｍｇ／ｍＬ）を同様に添加した。３回洗浄した後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を反応させた。５回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ １０４（Ｒ） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を基質として発色させ、吸光度リーダーＭｏｄｅｌ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、参照波長６５５ｎｍとして４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。
３．レポータージーンアッセイ法によるヒトＩＦＮアゴニスト活性測定
ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７（国立衛生試験所）にＩＦＮ刺激応答因子の下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を導入した形質転換細胞を用いて、未精製抗体のＩＦＮアゴニスト活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）を調査した。活性測定はルシフェラーゼ定量システムＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて添付マニュアル記載の方法に従い行なった。陽性対照として、ヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮ−αＡ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を用いた。結果を図１に示す。誘導型ベクターで時間差誘導発現をかけたもの（３−３，４−４，５−３，および７−４）は、誘導型ベクターで全てを同時に誘導発現かけたもの（２−３）に対し５倍から１０倍の比活性上昇が認められた。すなわち、時間差で各ＨＬ分子を発現させることで、目的外の組合せの余計なＩｇＧの生成割合が抑えられた結果、比活性が上昇した可能性が強く示唆された。
４．サンドイッチＥＬＩＳＡ法による目的抗体発現量の解析
９６−ｗｅｌｌ Ｎｉ−ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｐｌａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）へ、Ｈｉｓタグ標識された各受容体（ＡＲ１−ＨｉｓないしＡＲ２−Ｈｉｓ）をＤｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ．Ｂ．）にて５００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの１００μｌを添加し一晩４℃で吸着させた。一旦上清を吸引除去した後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＴＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ）２００μｌを添加し、室温６０分ブロッキング処理した。３回洗浄した後、Ｄ．Ｂ．で希釈した精製抗体（３１．２５〜５００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、室温６０分インキュベートした。抗体としては、一つはトランスフェクション後同時にテトラサイクリンとポナステロンＡにて誘導発現させたもの（同時誘導）、もう一つはテトラサイクリンで１日誘導かけた後にポナステロンＡで２日誘導発現させたもの（時間差発現）を用いた。３回洗浄した後、それぞれに対応するビオチン化２次抗原（すなわちＡＲ１−Ｈｉｓに対してはＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎ、ＡＲ２−Ｈｉｓに対してはＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎ）をＤ．Ｂ．にて５００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの１００μｌを添加し、室温６０分インキュベートした。３回洗浄した後、Ｄ．Ｂ．で３０００倍に希釈されたＡＰ−ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎｅ（ＺＹＭＥＤ）を添加し、室温６０分インキュベートした。５回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ １０４（Ｒ） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を基質として発色させ、吸光度リーダーＭｏｄｅｌ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、参照波長６５５ｎｍとして４０５ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ＥＬＩＳＡ２種類の方策（ＡＲ１−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎおよびＡＲ２−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎ）双方において時間差で各ＨＬ分子を発現誘導させた方が、両ＨＬ分子を同時に発現させる方法よりも単位抗体量あたり約２倍強高い結合度を示し、目的型抗体比率の優位性を示唆した（図２参照）。
産業上の利用の可能性
本発明は、複数の抗体または抗体断片を結合する多重特異性抗体の製造において目的とする型の抗体を優先的に製造する方法を提供するものである。より詳細には、例えば二特異性抗体（ＢｓＡｂ）の製造において、本発明の方法を採用することにより、第一の重鎖と結合していない第一の軽鎖と第二の軽鎖と結合していない第二の重鎖の接触、及び、第一の軽鎖と結合していない第一の重鎖と第二の重鎖と結合していない第二の軽鎖の接触を阻害し、目的型ＢｓＡｂを効率的に産生することができる。即ち、本発明の多重特異性抗体の製造方法により、製造される抗体組成物中に含まれる正しい重鎖と軽鎖の対から形成されている抗体の割合を高め、免疫診断、治療及び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用な多重特異性抗体の比活性を増加させることができる。
１．ヒトＩＦＮヘテロ受容体（ＡＲ１／ＡＲ２）に結合する二特異性ＩｇＧ抗体発現用プラスミド構築
本抗体は２種のＨ鎖と共に抗ＡＲ１または抗ＡＲ２いずれかのＬ鎖だけを発現させ、Ｌ鎖を共通のものにした場合活性を失う為、逆に阻害に働くことが考えられる。つまり、両Ｌ鎖を発現させた際に目的の組合せのＩｇＧが優先的に発現すればＩｇＧの見かけ上の比活性が上昇することが期待される。
二特異性ＩｇＧ抗体を産生する際に、各Ｈ鎖のヘテロな組み合わせの分子を形成させるためにＩｇＧ１のｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ技術［Ｒｉｄｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９；６１７−２１（１９９６）］を参考に、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３部分へのアミノ酸置換体を作製した。ａタイプ（ヒトＩｇＧ４γａ）はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ置換体であり、ｂタイプ（ヒトＩｇＧ４γｂ）はＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの置換体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換（−ｐｐｃｐＳｃｐ− −＞ −ｐｐｃｐＰｃｐ−）を導入した。
ＡＲ１受容体を認識する抗体分子片腕（便宜上右腕ＨＬ分子と称する）の発現用として、テトラサイクリン誘導型ベクターｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。抗体右腕ＨＬ分子を構成するＨ鎖およびＬ鎖それぞれの発現ユニット、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ３ｓｓ）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１；１０７５（１９８４）］の下流にＡＲ１受容体を認識するマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γａ定常領域ないしκ定常領域、を組み込んだベクター（ｐｃＤＮＡ１−２４ＨないしｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ）を公知の遺伝子工学的手法に則り作製した。
ＡＲ２受容体を認識するもう一方の片腕（便宜上左腕ＨＬ分子と称する）はエクダイソン類似体誘導型ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。抗体左腕ＨＬ分子を構成するＨ鎖およびＬ鎖それぞれの発現ユニット、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ６ｓｓ）［ＥＭＢＯ．Ｊ．６；２９３９（１９８７）］の下流にＡＲ２受容体を認識するマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γｂ定常領域ないしκ定常領域、を組み込んだベクター（ｐＩＮＤ２−７ＨないしｐＩＮＤ２−７Ｌ）を同様に作製した。各々のプラスミドＤＮＡは市販プラスミド精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。各プラスミド溶液は、使用するまで４℃で保存した。
２．二特異性ＩｇＧ抗体の動物細胞での時間差ＨＬ発現
２−１．ＤＮＡ溶液の調製
抗体右腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ１−２４ＨそしてｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ）はテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しない状況下で発現を完全に抑制する為にＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。ここで、発現したＴｅｔＲは２量体でｐｃＤＮＡ４／ＴＯ上の２つのＴｅｔオペレーター配列（ＴｅｔＯ２）に結合し、目的遺伝子の転写を抑制する。そして、添加したテトラサイクリンがＴｅｔＲ２量体と結合し、構造変化によりＴｅｔＲがＴｅｔオペレーターから離れることにより、ＣＭＶ／ＴｅｔＯ２プロモーターによる目的遺伝子の転写が誘導される。また、抗体左腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐＩＮＤ２−７ＨそしてｐＩＮＤ２−７Ｌ）は、昆虫ホルモンであるエクダイソン類似化合物（ムリステロンＡあるいはポナステロンＡ）により発現誘導がかかる。このとき、エクダイソン類似化合物と反応し誘導を行なうエクダイソンレセプターとレチノイドＸレセプターを恒常的に発現するプラスミドｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。ここで、エクダイソンアナログの添加により、その類似体と、エクダイソンレセプターとレチノイドＸレセプターのヘテロ２量体がｐＩＮＤベクターのエクダイソン／グルココルチコイド（５ＸＥ／ＧＲＥ）プロモーターに結合して目的遺伝子発現が活性化する。従って、動物細胞のトランスフェクションの為にｐｃＤＮＡ１−２４Ｈ、ｐｃＤＮＡ１−２４Ｌ、ｐＩＮＤ２−７Ｈ、ｐＩＮＤ２−７Ｌ、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲそしてｐＶｇＲＸＲからなる計６種類のプラスミドＤＮＡ混液を調製した。
２−２．動物細胞のトランスフェクション
アフリカミドリザル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ−７株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた場合には、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地へ懸濁し、１×１０５／ｍｌの細胞密度で接着細胞用６−ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）の各ｗｅｌｌへ１ｍｌずつ蒔きこみ、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。２−１で調製したプラスミドＤＮＡ混液をトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ ６（Ｒｏｃｈｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０μｌの混液へ加えて室温２０分間静置したものを各ｗｅｌｌの細胞へ投入し、４〜５時間３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。
ヒト胎児腎臓由来培養細胞ＨＥＫ２９３Ｈ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた場合には、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地へ懸濁し、５×１０５／ｍｌの細胞密度で接着細胞用１２−ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）の各ｗｅｌｌへ１ｍｌずつ蒔きこみ、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。２−１で調製したプラスミドＤＮＡ混液をトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０μｌの混液へ加えて室温２０分間静置したものを各ｗｅｌｌの細胞へ投入し、４〜５時間３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。
２−３．二特異性ＩｇＧ抗体の発現誘導
２−２の通りトランスフェクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン塩酸塩（和光純薬）を含む１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を投入し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で１日培養して、抗体右腕ＨＬ分子の第一次発現誘導を行なった。その後、培地を吸引除去し、一旦１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地にて洗浄した後、５μＭのムリステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ないしポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１ｍｌ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地を投入し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で２日ないし３日培養して、抗体左腕ＨＬ分子の第二次発現誘導を行ない、培地中へ二特異性ＩｇＧ抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、一旦遠心（約２０００ｇ、５分間、室温）して細胞を除去して、必要に応じマイクロコン−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮を行った。該サンプルは使用するまで４℃で保存した。
２−４．発現抗体の精製
２−３にて調製された抗体発現上清サンプルをプロテインＡ樹脂（ｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ，Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。すなわち、該上清４ｍｌに対しＴＢＳ緩衝液で置換した樹脂５０μｌを添加し、一晩４℃で転倒混和し、抗体を樹脂へ吸着させた。一旦遠心（３０００ｇ，１０分）して上清を除去した後、ＴＢＳ緩衝液５００μｌに懸濁し、０．２２μｍフィルターカップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移した。遠心（３０００ｇ，１分）とＴＢＳ緩衝液による洗浄を３回繰り返した後、溶出緩衝液（１０ｍＭ ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ａｎｄ ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）１００μｌにて溶出した。溶出液へ１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液５μｌを添加し中和した。該溶液は使用するまで４℃で保存した。
２−５．ヒトＩｇＧ濃度の定量
Ｇｏａｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ）をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて１μｇ／ｍＬに調製し、９６−ｗｅｌｌイムノプレートＭａｘｉＳｏｒｐ Ｓｕｒｆａｃｅ（ＮＡＬＧＥ ＮＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に固相化した。Ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ．Ｂ．）にてブロッキング処理した後、Ｄ．Ｂ．を用いて適当に希釈した培養上清サンプルないし精製抗体サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、１０００ｎｇ／ｍＬから２倍系列でＤ．Ｂ．にて１１段階希釈したＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１．１ｍｇ／ｍＬ）を同様に添加した。３回洗浄した後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を反応させた。５回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ １０４（Ｒ） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を基質として発色させ、吸光度リーダーＭｏｄｅｌ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、参照波長６５５ｎｍとして４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。
３．レポータージーンアッセイ法によるヒトＩＦＮアゴニスト活性測定
ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７（国立衛生試験所）にＩＦＮ刺激応答因子の下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を導入した形質転換細胞を用いて、未精製抗体のＩＦＮアゴニスト活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）を調査した。活性測定はルシフェラーゼ定量システムＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて添付マニュアル記載の方法に従い行なった。陽性対照として、ヒトＩＦＮα（ｒｈＩＦＮ−αＡ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を用いた。結果を図１に示す。誘導型ベクターで時間差誘導発現をかけたもの（３−３，４−４，５−３，および７−４）は、誘導型ベクターで全てを同時に誘導発現かけたもの（２−３）に対し５倍から１０倍の比活性上昇が認められた。すなわち、時間差で各ＨＬ分子を発現させることで、目的外の組合せの余計なＩｇＧの生成割合が抑えられた結果、比活性が上昇した可能性が強く示唆された。
４．サンドイッチＥＬＩＳＡ法による目的抗体発現量の解析
９６−ｗｅｌｌ Ｎｉ−ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｐｌａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）へ、Ｈｉｓタグ標識された各受容体（ＡＲ１−ＨｉｓないしＡＲ２−Ｈｉｓ）をＤｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ．Ｂ．）にて５００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの１００μｌを添加し一晩４℃で吸着させた。一旦上清を吸引除去した後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＴＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ）２００μｌを添加し、室温６０分ブロッキング処理した。３回洗浄した後、Ｄ．Ｂ．で希釈した精製抗体（３１．２５〜５００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、室温６０分インキュベートした。抗体としては、一つはトランスフェクション後同時にテトラサイクリンとポナステロンＡにて誘導発現させたもの（同時誘導）、もう一つはテトラサイクリンで１日誘導かけた後にポナステロンＡで２日誘導発現させたもの（時間差発現）を用いた。３回洗浄した後、それぞれに対応するビオチン化２次抗原（すなわちＡＲ１−Ｈｉｓに対してはＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎ、ＡＲ２−Ｈｉｓに対してはＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎ）をＤ．Ｂ．にて５００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの１００μｌを添加し、室温６０分インキュベートした。３回洗浄した後、Ｄ．Ｂ．で３０００倍に希釈されたＡＰ−ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎｅ（ＺＹＭＥＤ）を添加し、室温６０分インキュベートした。５回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ １０４（Ｒ） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を基質として発色させ、吸光度リーダーＭｏｄｅｌ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、参照波長６５５ｎｍとして４０５ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ＥＬＩＳＡ２種類の方策（ＡＲ１−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ２−ｂｉｏｔｉｎおよびＡＲ２−Ｈｉｓ＋抗体＋ＡＲ１−ｂｉｏｔｉｎ）双方において時間差で各ＨＬ分子を発現誘導させた方が、両ＨＬ分子を同時に発現させる方法よりも単位抗体量あたり約２倍強高い結合度を示し、目的型抗体比率の優位性を示唆した（図２参照）。
産業上の利用の可能性
本発明は、複数の抗体または抗体断片を結合する多重特異性抗体の製造において目的とする型の抗体を優先的に製造する方法を提供するものである。より詳細には、例えば二特異性抗体（ＢｓＡｂ）の製造において、本発明の方法を採用することにより、第一の重鎖と結合していない第一の軽鎖と第二の軽鎖と結合していない第二の重鎖の接触、及び、第一の軽鎖と結合していない第一の重鎖と第二の重鎖と結合していない第二の軽鎖の接触を阻害し、目的型ＢｓＡｂを効率的に産生することができる。即ち、本発明の多重特異性抗体の製造方法により、製造される抗体組成物中に含まれる正しい重鎖と軽鎖の対から形成されている抗体の割合を高め、免疫診断、治療及び免疫学的検定による診断等の臨床分野において有用な多重特異性抗体の比活性を増加させることができる。
Claims (7)
- 抗体の第一の重鎖と第一の軽鎖からなる第一の対と、第二の重鎖と第二の軽鎖からなる第二の対を、同一細胞内において異なる時期に発現させることを特徴とする抗体の製造方法であって、以下の工程を(a)から(d)の順番で行うことを含み、該抗体がknobs-into-holesが導入された抗体である方法。
(a)抗体の第一の重鎖と第一の軽鎖の発現を誘導して第一の対を作製する工程、
(b)抗体の第一の重鎖と第一の軽鎖の発現の誘導をとめる工程、
(c)抗体の第二の重鎖と第二の軽鎖の発現を誘導して第二の対を作製する工程、
(d)抗体の第一の対と第二の対を用いて抗体を作製する工程。 - 第一の重鎖と第二の重鎖のアミノ酸配列が異なり、かつ第一の軽鎖と第二の軽鎖のアミノ酸配列が異なる抗体である請求項1に記載の製造方法。
- 抗体が二特異性抗体である請求項1または2に記載の製造方法。
- 第一の発現調節因子により第一の重鎖及び第一の軽鎖の発現が誘導されるベクター、および第二の発現調節因子により第二の重鎖及び第二の軽鎖の発現が誘導されるベクターを用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 異なる2種以上の発現誘導剤を用いることを特徴とする、請求項4記載の製造方法。
- 抗体の軽鎖と重鎖がペプチドリンカーで介されていないことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- 第一の発現調節因子により抗体の第一の軽鎖及び第一の重鎖の発現が誘導されるベクターと、第二の発現調節因子により抗体の第二の軽鎖及び第二の重鎖の発現が誘導されるベクターを含む、請求項4または5に記載の方法に用いるためのキット。
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