JP6506024B2 - 抗体又は抗体組成物の製造方法 - Google Patents

Description

この発明は、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体、特に軽鎖−重鎖の組み合わせが限定された抗体と、対応する抗体組成物、あるいはそれらの製造方法に関する。

二つの異なる抗原認識部位を持つ二重特異性抗体などの多重特異性抗体は、二以上の異なる抗原に同時に結合が可能という特異な性質から医薬品もしくは診断薬剤としての開発が期待されているが、生産性の低さや精製の困難さが障害となり実用化が進んでいない。
また、多重特異性抗体の効率的な製造方法は幾つか知られているが、多くが抗体の重鎖−重鎖間の結合を限定することにより、効率的に多重特異性抗体の製造を図るものである（特許文献１〜６）。

なお、以下の特許文献の開示内容は全て、参照により本明細書に援用される。
国際公開第９８／５０４３１号公報 国際公開第２０１０／１５１７９２号公報 米国特許第７，１８３，０７６号公報 国際公開第２００９／０８９００４号公報 国際公開第２００７／１４７９０１号公報 国際公開第２０１１／０３４６０５号公報

本発明者らは、二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体；またはＦａｂ領域が少なくとも二つの抗体間で相違する組成物の製造の際の生産性の低さと精製の困難さを課題として鋭意研究し、非天然型ジスルフィド結合を用いることで、効率よくこれらを製造できることを見出した。すなわち、本発明によれば、軽鎖と重鎖の特定の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。

本発明によれば、（１）抗体；または（２）抗体含有組成物；の製造方法であって、非天然型ジスルフィド結合を利用する方法が提供される。
上記（１）抗体にはＦａｂ領域が少なくとも二つ含まれ、含まれるＦａｂ領域のうちの少なくとも二つは相違する。
また、上記（２）組成物には、Ｆａｂ領域を含む抗体が少なくとも二種含まれ、含まれる抗体の有するＦａｂ領域のうち、少なくとも二つは相違する。
この方法によれば、効率的に、上記抗体または組成物を製造することができる。

ある態様では、この方法は、抗体が発現するような条件下で抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含む。
また、ある態様では、この方法は、宿主細胞培養物から抗体を回収する工程を含む。
ある態様では、少なくとも一つのＦａｂ領域は、軽鎖と重鎖との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む。
また、ある態様では、ある軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置が、抗体または組成物に含まれる他の少なくとも一つの軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置と異なり；あるいは、あるＦａｂ領域は、抗体または組成物に含まれる他の少なくとも一つのＦａｂ領域と異なる位置にジスルフィド結合を形成する。
また、ある態様では、上記非天然型ジスルフィド結合および上記ジスルフィド結合は、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合である。

また、本発明によれば、第一のＦａｂ領域と第二のＦａｂ領域とを含む抗体の製造方法であって、非天然型ジスルフィド結合を利用する方法が提供される。
上記第一のＦａｂ領域を構成する軽鎖および重鎖は、上記第二のＦａｂ領域を構成する軽鎖および重鎖と、それぞれ相違する。
この方法によれば、上記抗体を効率的に製造することができる。

ある態様において、この方法は、目的の抗体に対応する親抗体において、第一のＦａｂ領域のＣＬ領域およびＣＨ１領域におけるシステイン以外のアミノ酸残基の少なくとも一つを、ジスルフィド結合を形成するまたは形成可能なシステイン残基に置換する工程を含む。
また、ある態様において、この方法は、ジスルフィド結合を形成するまたは形成可能なシステイン残基により、第一のＦａｂ領域に非天然型ジスルフィド結合を形成させる工程を含む。
また、ある態様において、第一のＦａｂ領域は、第二のＦａｂ領域とは異なる位置にジスルフィド結合を形成させる工程を含む。

また、本発明によれば、上記方法で製造される抗体が提供される。
また、本発明によれば、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体が提供される。
ある態様では、上記抗体中の少なくとも一つのＦａｂ領域は、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するまたは形成可能なシステイン残基を含み、それにより非天然型ジスルフィド結合が形成されている。
また、ある態様では、あるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置は、他の少なくとも一つのＣＬ領域とＣＨ１領域との間でのジスルフィド結合の位置と異なるか；あるいは、あるＦａｂ領域は、他の少なくとも一つのＦａｂ領域と異なる位置にジスルフィド結合を形成する。
また、ある態様では、抗体は、二つの相違するＦａｂ領域を含んでなる。

また、本発明によれば、上記方法で製造される組成物が提供される。
また、本発明によれば、Ｆａｂ領域を含む抗体を少なくとも二つ含む組成物が提供される。この組成物中の抗体のＦａｂ領域のうち、少なくとも二つのＦａｂ領域は相違する。
ある態様では、上記抗体中の少なくとも一つのＦａｂ領域は、軽鎖と重鎖との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するまたは形成可能なシステイン残基を含み、それにより非天然型ジスルフィド結合が形成されている。
また、ある態様では、ある抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置は、他の少なくとも一つの抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置と異なり；あるいは、ある抗体のＦａｂ領域は、他の少なくとも一つの抗体のＦａｂ領域と異なる位置にジスルフィド結合を形成する。
また、ある態様では、上記非天然型ジスルフィド結合および上記ジスルフィド結合は、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合である。

ある態様では、この抗体は多重特異性抗体である。ある態様では、この抗体は二重特異性抗体である。
ある態様では、この抗体は、少なくとも二つの抗体断片をリンカーで介するか又は直接的に連結したものである。
ある態様では、この抗体は抗体断片である。
ある態様では、この抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
ある態様では、この抗体はＦｃ領域が他の分子により置換されている抗体である。

また、本発明によれば、ａ）軽鎖１１６位−重鎖１３４位、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｄ）軽鎖１２１位−重鎖１２６位、ｅ）軽鎖１２１位−重鎖１２７位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成される、上記方法、抗体または組成物が提供される。

また、本発明によれば、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成される、上記方法、抗体または組成物が提供される。

また、本発明によれば、軽鎖がκ鎖の場合のｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位およびｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、並びに軽鎖がλ鎖の場合のｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成される、上記方法、抗体または組成物が提供される。

また、本発明によれば、ａ）Ｆ１１６Ｃ−Ｓ１３４Ｃ、ｂ）Ｆ１１６Ｃ−Ａ１４１Ｃ、ｃ）Ｆ１１８Ｃ−Ｌ１２８Ｃ、ｄ）Ｓ１２１Ｃ−Ｆ１２６Ｃ、ｅ）Ｓ１２１Ｃ−Ｐ１２７Ｃ、ｆ）Ｑ１２４Ｃ−Ｆ１２６Ｃ、ｇ）Ｓ１６２Ｃ−Ｆ１７０Ｃ、ｈ）Ｓ１６２Ｃ−Ｐ１７１Ｃ、ｉ）Ｓ１６２Ｃ−Ｖ１７３Ｃ、ｊ）Ｆ１１８Ｃ−Ｌ１２８Ｃ、ｋ）Ｅ１２４Ｃ−Ｆ１２６Ｃ、ｌ）Ｔ１６２Ｃ−Ｆ１７０Ｃ、ｍ）Ｔ１６２Ｃ−Ｐ１７１Ｃ、およびｎ）Ｔ１６２Ｃ−Ｖ１７３Ｃから選択される少なくとも一組の軽鎖システイン−重鎖システイン間に非天然型ジスルフィド結合が形成される、上記方法、抗体または組成物が提供される。
ある態様では、ｂ）Ｆ１１６Ｃ−Ａ１４１Ｃ、ｃ）Ｆ１１８Ｃ−Ｌ１２８Ｃ、ｆ）Ｑ１２４Ｃ−Ｆ１２６Ｃ、ｇ）Ｓ１６２Ｃ−Ｆ１７０Ｃ、ｈ）Ｓ１６２Ｃ−Ｐ１７１Ｃ、およびｉ）Ｓ１６２Ｃ−Ｖ１７３Ｃから選択される少なくとも一組の軽鎖システイン−重鎖システイン間に非天然型ジスルフィド結合が形成される。
また、別の態様では、軽鎖がκ鎖の場合のｂ）Ｆ１１６Ｃ−Ａ１４１Ｃ、ｆ）Ｑ１２４Ｃ−Ｆ１２６Ｃ、およびｇ）Ｓ１６２Ｃ−Ｆ１７０Ｃ、並びに軽鎖がλ鎖の場合のｍ）Ｔ１６２Ｃ−Ｐ１７１Ｃおよびｎ）Ｔ１６２Ｃ−Ｖ１７３Ｃから選択される少なくとも一組の軽鎖システイン−重鎖システイン間に非天然型ジスルフィド結合が形成される。

また、本発明によれば、少なくとも一つのＦａｂ領域のＣＬ領域とＣＨ１領域との間で、天然型ジスルフィド結合が形成されていない、上記方法、抗体または組成物が提供される。
また、本発明によれば、あるＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置が、他の少なくとも一つのＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置と全て異なる、上記方法、抗体または組成物が提供される。

また、本発明によれば、宿主細胞が、真核生物細胞、または大腸菌である、上記方法が提供される。
また、本発明によれば、重鎖−重鎖間の結合を限定する技術と組み合わせた上記方法、またはそれにより得られる抗体または組成物が提供される。

本発明（Ｃｙｓ１ｍ技術）の有用性を説明するための図である。 実施例で用いたプライマーの配列の一覧である。 実施例で用いたｃＤＮＡの配列の一覧である。 実施例で用いたｃＤＮＡ等の転写産物の配列の一覧である。 本発明の抗体（Ｃｙｓ１ｍ抗体（抗ＣＤ２０抗体））におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 本発明の抗体（Ｃｙｓ１ｍ抗体（抗ＣＤ３７抗体））におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 本発明の抗体（Ｃｙｓ１ｍ抗体）におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 本発明の抗体（Ｃｙｓ１ｍ抗体；抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ５２抗体）におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 ［軽鎖Ｃｙｓ１ｍ型−重鎖野生型］抗体（軽鎖がκ鎖）におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 ［軽鎖Ｃｙｓ１ｍ型−重鎖野生型］又は［軽鎖野生型−重鎖Ｃｙｓ１ｍ型］抗体（軽鎖がλ鎖）におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 ［軽鎖野生型−重鎖Ｃｙｓ１ｍ型］抗体（軽鎖がκ鎖）におけるＳＳ結合の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ２０抗体の抗原結合能（ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ２０抗体の抗原結合能（ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ２０抗体の抗原結合能（ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ２０抗体の抗原結合能（ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ２０抗体の抗原結合能（ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ３７抗体の抗原結合能（ＣＤ３７抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ３７抗体の抗原結合能（ＣＤ３７抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 非天然型ジスルフィド結合を導入した抗ＣＤ３７抗体の抗原結合能（ＣＤ３７抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果）を示す図である。 二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５のプロテインＡアフィニティー精製の結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５をＦ（ａｂ’）_２解析した結果を示す図である。 親抗体αＣＤ２０およびαＤＲ５をＦ（ａｂ’）_２解析した結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７をＦ（ａｂ’）_２解析した結果を示す図である。 親抗体αＣＤ２０およびαＣＤ３７をＦ（ａｂ’）_２解析した結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５をＦａｂ解析した結果を示す図である。 親抗体αＣＤ２０、αＤＲ５および軽鎖誤結合体をＦａｂ解析した結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７をＦａｂ解析した結果を示す図である。 親抗体αＣＤ２０、αＣＤ３７および軽鎖誤結合体をＦａｂ解析した結果を示す図である。 αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５におけるプロテインＡアフィニティー精製試料をＦａｂ解析した結果を示す図である。 αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７におけるプロテインＡアフィニティー精製試料をＦａｂ解析した結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７のＣＤ２０［＋］ＣＤ３７［−］細胞に対する抗原結合能を解析した結果を示す図である。 精製αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７のＣＤ２０［−］ＣＤ３７［＋］細胞に対する抗原結合能を解析した結果を示す図である。 精製αＤＲ５／αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）のＤＲ５［＋］ＣＤ２０［−］細胞に対する抗原結合能を解析した結果を示す図である。 精製αＤＲ５／αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）のＤＲ５［−］ＣＤ２０［＋］細胞に対する抗原結合能を解析した結果を示す図である。

〔用語および態様の説明〕
本明細書中においては、次の用語は以下に示す意味を有し、各用語は、以下に示す各態様を表すものとする。

「抗体」は、抗原抗体反応による抗原との結合性を示す分子のことをいい、一対または二対またはそれ以上の結合部位（Ｆｖ）を有する。抗体には、これに限定されるものではないが、例えば、軽鎖と重鎖とを含む一対または二対のポリペプチド鎖を有する全長抗体およびその一部分（断片）が含まれる。それぞれの軽鎖または重鎖は、可変領域（抗原に対する認識および結合に関係する）と定常領域（局在化、補体依存性細胞傷害活性および細胞間相互作用に関係する）を含み得る。最も一般的な全長抗体は、２箇所の軽鎖可変（ＶＬ）領域、２箇所の軽鎖定常（ＣＬ）領域、２箇所の重鎖可変（ＶＨ）領域、および２箇所の重鎖定常（ＣＨ）領域を含む。可変領域は、抗原特異性を抗体に付与する配列である相補性決定領域（ＣＤＲ）と、フレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。
上記の定義から明らかなように、本明細書における「抗体」には、特記しない限り、ニ又は三又はそれ以上の抗体（例えば、Ｆａｂ領域などの抗体断片）が、リンカーを介するか又は直接的に、連結したもの（複数の抗体断片を含んでなる抗体）が含まれる。このような抗体としては、これに限定されるものではないが、例えば、複数の抗体断片がリンカーで連結された抗体を挙げることができる。

抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、所望の生物学的活性を有する抗体断片、およびＦｃ領域が他の分子により置換された抗体等を含む。また、抗体は、キメラ抗体（例えばヒト化抗体）、（完全）ヒト抗体、多価抗体、改変抗体を含む。
「改変抗体」には、これに限定されるものではないが、結合能を維持したままアミノ酸配列を欠損（短く）または付加（長く）させたもの、アミノ酸配列の一部を置換したもの、糖鎖の一部または全長を欠損または付加させたもの、およびその他リンカー等が付加したもの、およびこれらの組み合わせが含まれる。

また、特に抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体は糖鎖を含み得る。哺乳動物細胞によって生産される天然抗体は典型的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合した分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright et al., (1997) Trends Biotechnol. 15: 26-32を参照のこと）。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。
また、抗体は、発明の効果を損なわない範囲で、何れのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、何れのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。

可変領域は、可変領域中で最も高頻度に変化している相補性決定領域（ＣＤＲ）または高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれるセグメントと、比較的高度に保持されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるセグメントとを含む。天然抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲは、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（あるいは「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」）とは、高頻度可変であり、ループを形成する抗体可変領域中の領域を指す。抗体は一般にＶＬに３つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）、ＶＨに３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）を含む。

ＣＤＲの定義としては、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の定義を用いることができる。ＣＤＲの定義としては、これに限定されるものではないが、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ等の、当該技術分野で用いられる通常のＣＤＲの定義を用いることができる。Ｋａｂａｔの定義は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置も考慮して定められたものである（例えば、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)を参照のこと）。ＡｂＭは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの中間の定義であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。ｃｏｎｔａｃｔは、複合体結晶構造の分析に基づく（例えば、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)を参照のこと）。これらＣＤＲのそれぞれの定義を以下に示す。

ＣＤＲは、以下のうちの少なくとも一つの「拡大ＣＤＲ」を含んでもよい。
Ｖ_Ｌの２４−３６または２４−３４（ＣＤＲＬ１）、４６−５６または５０−５６（ＣＤＲＬ２）、８９−９７または８９−９６（ＣＤＲＬ３）、Ｖ_Ｈの２６−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５または４９−６５（ＣＤＲＨ２）、９３−１０２、９４−１０２または９５−１０２（ＣＤＲＨ３）

抗体のアミノ酸残基の番号付けには、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」（Ｋａｂａｔによる可変領域残基番号付けあるいはＫａｂａｔのアミノ酸位番号付け）を用いることができる（例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと)。この番号付けでは、アミノ酸配列は、可変領域のＦＲまたはＣＤＲ内の挿入に相当する付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変領域には、重鎖ＦＲ残基８２の後（残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）ならびにＣＤＲＨ２の残基５２の後（残基５２ａ）にアミノ酸の挿入を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号は、標準的なＫａｂａｔ番号付け配列によって抗体の配列の相同領域で相互に比較することによって決定することができる。
また、別段明記する場合には、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付け等の、当業者に公知の他の番号付けを用いることもできる。
「ＥＵ番号付け」または「ＥＵインデックス」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域を指す場合に用いられる（例えば、国際免疫学情報提供ウェブサイト（www.imgt.org）；Edelman G. M. et al., The covalent structure of an entire γG immunoglobulin molecule., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969, 63(1), 78-85；Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと）。「ＫａｂａｔのＥＵ番号付け」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」は、上述したＫａｂａｔの番号付けとＥＵ番号付けとを組み合わせた番号付けで、ヒトＩｇＧ１の番号付けなどに広く用いられている。本明細書中では、特に明記しない限り、抗体のアミノ酸残基の番号付けには、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを用いる。

「Ｆａｂ領域」（あるいは、「Ｆａｂ部分」）とは、抗体をパパインで切断した際に得られる２種の断片のうち、抗原結合能を有する断片に相当する領域のことを言い、軽鎖由来の部分と重鎖由来の部分の双方を含んでいるものを言う。Ｆａｂ領域は、典型的には、軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ領域）を含み、且つ軽鎖の定常（ＣＬ）領域と重鎖の第一定常（ＣＨ１）領域を含む。Ｆａｂ領域は当該技術分野で周知の領域であり、常法により決定することができる。例えば、目的の領域がＦａｂ領域であるかどうかを、既知の抗体等との相同性を利用して決定することや、簡便にドメインの集合として表すこともできる。Ｆａｂ領域の境界は変化し得るため、これに限定されるものではないが、典型的には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭでは、Ｆａｂ領域は、軽鎖可変領域（抗体クローンによって長さは異なる）を含む軽鎖（κ鎖およびλ鎖）全長と、重鎖可変領域（抗体クローンによって長さは異なる）に第一定常（ＣＨ１）領域を加えた領域からなる。
「二つの相違するＦａｂ領域」とは、そのＦａｂ領域を構成する軽鎖部分及び重鎖部分の双方の一次配列、側鎖の修飾あるいは高次構造等において、それぞれ一ないし複数の相違点がある二つのＦａｂ領域のことをいう。

「リンカー」とは、ある分子と別の分子とを連結させる際に用いられる連結分子を意味し、様々なものが当該技術分野で公知である。連結の対象となる分子には、ポリペプチドや低分子化合物が含まれ、抗体断片同士、または抗体断片とその他の成分の連結などが例として挙げられる。具体的なリンカーとしては、以下のものに限定されるものではないが、例えば、ＧＳリンカー（（ＧＧＧＧＳ）３）などの、数残基〜数十残基の長さのペプチドや、Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （ＳＰＤＰ）；スクシニミジル ６−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド）ヘキサノエート （ＬＣ−ＳＰＤＰ） ；スルホスクシニミジル ６−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオンアミド）ヘキサノエート （Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ） ；Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート （ＳＰＤＢ）；スクシニミジロキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン （ＳＭＰＴ）；スクシニミジル ６−（α−メチル）−〔２−ピリジルジチオ〕トルアミド）ヘキサノエート （ＬＣ−ＳＭＰＴ） ；スルホスクシニミジロル ６−（α−メチル−〔２−ピリジルジチオ〕トルアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ） ；スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート （ＳＭＰＢ）；スルホ−スクシニミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート （Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ） ；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシスクシニミドエステル （ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシスルホスクシニミドエステル （Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ） ；Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド （ＳＡＭＳＡ） ；ジメチル ３，３−ジチオビスプロリオニミデート （ＤＴＢＰ）；２−イミノチオレーン；といった低分子化合物を挙げることができる。なお、リンカーと連結分子との間やリンカー内に、非共有結合的な結合が含まれていてもよい。

ペプチド等が「相違する」場合の相違点には、これに限定されるものではないが、アミノ酸配列の相違、付加する糖鎖の相違、化学的な修飾の相違、ジスルフィド結合の相違などが含まれる。
なお、本発明においては、好ましくは、本発明の目的のために用いられるシステイン残基および／またはジスルフィド結合の相違は、上記相違点に含めない（すなわち、好ましくは、本発明の目的のためのシステイン残基および／またはジスルフィド結合の相違以外に、少なくとも一つの相違点を有している）。

「（軽鎖）ＣＬ領域」とは、軽鎖の定常領域をいい、当該技術分野で周知の領域である。ＣＬ領域は常法により決定することもできるが、例えば、目的の領域がＣＬ領域であるかどうかを、既知の抗体等との相同性を利用して決定することができる。ＣＬ領域の境界は変化し得るため、これに限定されるものではないが、ヒトκ鎖では、ＣＬ領域は、典型的には、１０９〜２１４からなる。また、ヒトλ鎖では、ＣＬ領域は、典型的には、１０９〜２１３からなる。
「（重鎖）ＣＨ１領域」とは、重鎖の第一定常領域をいい、当該技術分野で周知の領域である。ここで定義するＣＨ１領域には、ＣＨ１領域に続くヒンジ領域の一部（Ｆａｂ領域に含まれ得るヒンジ領域）も含まれ得る。ＣＨ１領域は常法により決定することもできるが、例えば、目的の領域がＣＨ１領域であるかどうかを、既知の抗体等との相同性を利用して決定することもできる。ＣＨ１領域の境界は変化し得るため、これに限定されるものではないが、典型的には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖では、ここで定義するＣＨ１領域は、アミノ酸残基番号１１８〜２１５および付加的なヒンジ領域の一部（例えば、アミノ酸残基番号２１６〜２２４）からなり、ＩｇＭの重鎖では、ここで定義するＣＨ１領域は、アミノ酸残基番号１１８〜２１６からなる。

「Ｆｃ領域」とは、抗体をパパインで切断した際に得られる２種の断片のうち、抗原結合能を有しない断片に相当する領域のことを言う。Ｆｃ領域は、典型的には、一般にヒンジ領域の一部を含み、重鎖第二定常（ＣＨ２）領域ならびに同第三定常（ＣＨ３）領域からなる、抗体の重鎖のＣ末端領域を意味する。重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、一般には、Ｔｈｒ２２５のアミノ酸残基からＣＨ３領域のカルボキシル末端までからなる。
抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体には異なるクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つのクラス、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２等のサブクラスが割り当てられる。上述の５つのクラスに対応する重鎖定常領域はそれぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
また、抗体の軽鎖は、そのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）の何れかを取り得る。

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域の有する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わり得る。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合性；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細菌機能の障害・阻害；毒素の中和；および免疫担当細胞（例えばＢ細胞）活性化が含まれる。
上述したＦｃ領域は通常、好中球、マクロファージ、他の免疫補助細胞、補体複合体、および免疫系の受容体への結合部位となる。この部分も改変することができ、この改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列におけるアミノ酸の付加、欠失、一または複数のアミノ酸の置換、および（サブ）クラススイッチが含まれる。
また、抗体は、公知の任意の方法によって修飾が行われた修飾抗体も含む。例えば、糖鎖の修飾（ＷＯ００６１７３９など）やＦｃ領域のアミノ酸の変異（ＵＳ２００５００５４８３２Ａ１）などはＦｃ受容体等との結合を高め、より高い治療効果をもたらすことができる。

「天然抗体」のうち、ヒトＩｇＧは、二つの同一の軽鎖および二つの同一の重鎖からなる、分子量が約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つのジスルフィド結合により重鎖に結合している。一方、重鎖は複数のジスルフィド結合により互いに結合しており、その数はＩｇＧのサブクラスによって異なっている。サブクラスＩｇＧ１の場合、重鎖間には二つのジスルフィド結合が存在する。従って、鎖間結合に関わるジスルフィド結合数の合計は四つである。各鎖は、アミノ末端側に可変領域を、カルボキシル末端側に定常領域を有する。重鎖の中間部、即ちＣＨ１領域とＣＨ２領域の境界には可塑性に富んだヒンジ領域があり、そこに存在する二つのジスルフィド結合を介して重鎖同士が結合している。また、疎水的結合力によってＣＨ３領域同士が対合している。一方、ＣＬ領域はＣＨ１領域と疎水的結合力によって対合すると共に、ジスルフィド結合を介しても結合している。その結果、ＶＬ領域とＶＨ領域は近接して位置する。

「モノクローナル抗体」とは、ただ一組の抗体遺伝子（軽鎖１種と重鎖１種）に由来する、タンパク質レベルで実質的に均一な抗体の集団をいう。集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在する可能性がある突然変異（例えば自然に生じる突然変異など）を除いて同一である。また、モノクローナル抗体は、その作製方法に拠らず、様々な常法に従い作製することができる。それらの作製方法には、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ技術、ならびに、ヒト免疫グロブリン座の一部もしくは全部またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒトまたはヒト様抗体を生成させる技術、などが含まれる。

「キメラ抗体」とは軽鎖あるいは重鎖もしくはその両方の部分が特定の種に由来するアミノ酸配列を持ち、残りの部分は別の種に由来するアミノ酸配列からなる抗体をいう。例えば、ラットやマウスの抗体など、動物の抗体由来の可変領域が、別の分子（例えば、ヒト抗体由来の定常領域）と融合した抗体が含まれる。
「ヒト化抗体」は、キメラ抗体の一種であり、軽鎖および／または重鎖の可変領域配列が既知のヒト可変領域配列と大きく一致するよう変更された可変領域を有する抗体である。このような変更は従来技術で既知であり、これに限定されるものではないが、典型的には突然変異誘発またはＣＤＲ移植によってなされる。ＣＤＲ移植は、所望の特異性を有する抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワークに移植し、それによって大部分の非ヒト配列をヒト配列と交換することをいう。

例えば、ベストフィット法によれば、ドナー抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域配列のライブラリー全体に対して相同性検索し、ドナーの配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして用いる。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用することができる。

抗体は、抗原に対する親和性および／または所望の生物学的特性を保持してヒト化されることが好ましい。そのため、例えば、親抗体の配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親抗体配列および様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスが行われてもよい。
ヒト化抗体は、レシピエント抗体（ヒト抗体）にも、ドナー抗体（例えばマウス抗体）にも、見出されない残基を含んでいてもよい。マウスモノクローナル抗体をヒト化することにより、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が低減される。

「ヒト抗体」は、軽鎖および重鎖の両方の定常領域および可変領域がすべてヒト由来であるか実質的にそれと同一の抗体、および／またはここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造された抗体をいう。
ヒト抗体は、様々な従来技術により作製することができるが、例として以下の方法を挙げることができる。
ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変領域配列を既知のヒト定常領域配列と組み合わせることにより、ヒト抗体を作製することができる。

また、抗原刺激に応答して、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス；例えば免疫化ゼノマウス）に抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ技術に関する米国特許第６０７５１８１号および同第６１５０５８４号を参照のこと）。また、生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体を生産しないことが知られており、このマウスへヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列を導入した胚性幹細胞を移植したマウスでは、抗原の投与によってヒト抗体を生産する（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-2555 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33-40 (1993)を参照のこと）。

また、ヒト抗体は、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によっても作製することができる（例えば、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006)を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001-3005 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991)に記載されている。
また、ヒト抗体が、非ヒト親抗体（例えばマウス抗体）と類似した親和性および特性を有している場合、非ヒト親抗体からヒト抗体を得るために遺伝子シャッフリングを使用することもできる（エピトープインプリンティングとも称される；例えば、国際公開第９３／０６２１３号を参照のこと）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を全く有さないヒト抗体を得ることもできる。

「抗体断片」とは、抗原結合を付与するのに十分な可変領域配列を含む抗体の一部分をいう。本発明の対象として用いられる際の抗体断片とは、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との組み合わせを一対または二対以上含む抗体の一部分を意味する。そのような抗体の一部分には、これに限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２が含まれる。
これらの抗体断片は、常法に従って作製することができ、例えば、ペプシン消化などの抗体のタンパク分解切断法、抗体の軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを操作して、軽鎖および重鎖の断片を生成する組換え法などにより作製することができる。抗体のペプシン処理は「Ｆ（ａｂ’）_２」断片を生じ、それは二つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。例えば、これらの断片は、抗体のタンパク質分解（切断、消化）によって誘導することができる（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)；Brennan et al., Science, 229: 81-83 (1985)を参照のこと）。また、これらの断片は、組換え宿主細胞（例えば大腸菌）により直接産生することもできる。また、宿主細胞から回収したＦａｂ’−ＳＨ断片を化学的に結合させることでＦ（ａｂ’）_２断片を形成することもできる（例えば、Carter et al., Bio/Technology(NY) 10: 163-167 (1992)を参照のこと）。

「Ｆｖ」断片は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖Ｆｖは一般に、一つの軽鎖可変ドメインおよび一つの重鎖可変ドメインの二量体からなる。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ領域）を含み、軽鎖の定常（ＣＬ）領域と重鎖の第一定常（ＣＨ１）領域とを有する抗体断片である。また、「Ｆ（ａｂ’）_２」断片は、間にヒンジシステイン残基が形成するジスルフィド結合で結ばれたＦａｂ’断片の対である。
「多価抗体」は、３またはそれ以上の抗原結合部位を有する抗体をいう。多価抗体は、一般に、二量体化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域）と３またはそれ以上（例えば、３から８、特に４）の抗原結合部位とを有する（例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991)を参照のこと）。
「多重特異性抗体」は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体（抗体断片も含む）のことをいい、二重特異性抗体も含まれる。

二重特異性抗体は、既知の方法に従い、作製することができる。例えば、二重特異性抗体は、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン軽鎖−重鎖対の同時発現により作製することができる（例えば、Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)；国際公開第９３／０８８２９号；Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)を参照のこと）。この場合、軽鎖および重鎖が無作為に会合しているため、これらのハイブリドーマ（四つの雑種）は１０個の異なる抗体の混合物を産生し、そのうちの一つが正しい二重特異性構造を有し、アフィニティークロマトグラフィーなどにより分離・精製される。これについて、より好適にこのような組み合わせの二重特異性抗体を得る方法も知られており、それを用いることもできる（例えば、国際公開第９４／０４６９０号を参照のこと）。二重特異性抗体を産生するための更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210-228 (1986)を参照のこと。

「結合能がある」とは、分子（例えば抗体）が、その結合パートナー（例えば抗原）に対し、結合（主に非共有結合）する能力、特に特異的に結合する能力があることを意味する。
「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、結合親和性は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋ_ｄ）として表される。親和性は、当業者に公知の方法により測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により長く結合した状態をとる。

抗体には、一または複数の薬剤とコンジュゲートされた抗体も含まれる（このような抗体を特に「薬剤結合抗体」または「ＡＤＣ」と称すこともある）。また、抗体には、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とコンジュゲートされた抗体も含まれる。また、抗体には、一または複数の標識マーカー（放射性同位体など）とコンジュゲートされ、検出可能に標識された抗体も含まれる。なお、薬剤、標識マーカーまたはポリペプチド等とコンジュゲートしていない抗体を、特にネイキッド抗体と呼ぶ。
このようなコンジュゲート抗体において、抗体（Ａｂ）は、望ましくはリンカー（Ｌ）を介して、一または複数の薬剤部分（Ｄ）（あるいは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または標識マーカー部分）、例えば１抗体につき１から２０の薬剤部分にコンジュゲートされる。このようなコンジュゲート抗体は、公知の有機化学反応ならびに試薬を用いる手段によって作製することができる。
コンジュゲート抗体は上記の方法以外で作製してもよく、例えば、組換え技術による融合タンパク質として、あるいは多重特異性抗体を用いて、あるいはペプチド合成により作製してもよい。

「ポリペプチド」は一般に、約１０個よりも多いアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を意味する。
ポリペプチドは、抗体の抗原とすることができる。また、様々なポリペプチドに対する抗体が、医療などの多くの分野において有用であることが知られている。
ポリペプチドには、哺乳動物ポリペプチド（特にヒトポリペプチド）、原核生物ポリペプチドなどが含まれ、特に産業上有用なものとして、増殖因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの受容体、凝血因子および抗凝血因子などが挙げられる。
ポリペプチドには、これに限られるものではないが、レニン；成長ホルモン（ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなど）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１抗トリプシン；インスリン（Ａ鎖、Ｂ鎖）；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子；第ＩＸ因子；組織因子；フォンビルブランド因子；プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；ウロキナーゼ；ｔ−ｐＡ；ボンベシン；トロンビン；ＨＧＦ；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２など）；ＴＧＦ−α；ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５など）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；ＭＩＰＩ−１；血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラキシン（Ａ鎖、Ｂ鎖）；プロレラキシン；性腺刺激ホルモン；β−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ；インテグリン；プロテインＡ；プロテインＤ；リウマチ因子；ＢＤＮＦ；ニューロトロフィン（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６など）；ＮＧＦ−β；ＰＤＧＦ；繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦなど）；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＨＥＲ２；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩなど）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；細胞死受容体（ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５など）；Ｆａｓリガンド；Ｆａｓ受容体；ＣＤ−３；ＣＤ−４；ＣＤ−８；ＣＤ−１０；ＣＤ−１１；ＣＤ−１９；ＣＤ−２０；ＣＤ−２５；ＣＤ−３２；；ＣＤ−３０；ＣＤ−３３；ＣＤ−３７；ＣＤ−５２；ＨＬＡ−ＤＲ；ＧＰＩＩｂ；ＩｇＥ；Ｃ５；ＣＣＲ−４；α４−ｉｎｔｅｇｒｉｎ；ＲＡＮＫＬ；ＣＴＬＡ４；Ｂｌｙｓ；ＮＧＥＰ；ＭＵＣ−１；ＣＥＡ；ＥｐＣＡＭ；エリスロポエチン；ＢＭＰ；イムノトキシン；インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）；コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなど）；インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１３など）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；崩壊促進因子；ウイルス抗原（ＨＩＶエンベロープなど）；抗体；および上記のポリペプチドの断片が含まれる。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド）または塩基、および／またはそれらのアナログを含む。ヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは合成反応により連結される。ポリヌクレオチドまたは核酸は、ヌクレオチドの連結後になされる修飾（例えば標識または保護基との結合）を含んでもよい。また、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であるポリヌクレオチドを意味する。これに限定されるものではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの合成のポリヌクレオチドを意味し得る。

「ベクター」は、他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味する。ベクターには、プラスミド（付加的なＤＮＡが結合した環状の二本鎖ＤＮＡ）、ファージベクター（付加的なポリヌクレオチドが結合したファージ）、ウイルスベクター（付加的なポリヌクレオチドが結合したウイルス）などが含まれる。あるベクターは、それが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。更に、あるベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターを発現ベクターまたは組換え発現ベクターと称する。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはプラスミドの形をとることが多い。

一定の配列同一性を有するポリペプチドまたは核酸は、基となるアミノ酸／ヌクレオチド配列に対し、幾つかのアミノ酸／ヌクレオチドの変異（変更）を含み得る。このような修飾は、対象分子の特性（例えば、抗体の結合親和性および／または生物学的特性）を向上させることができるものであればより望ましい。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ポリペプチドの核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、またはペプチド合成により調製してよい。そのような変異は、アミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。対象分子が所望する特徴を保持する範囲内であれば、欠失、挿入および置換はどのように組合せてもよい。
ある配列に対し、変異を導入する方法としては、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸／ヌクレオチド配列変異体の場合）、部位特異的変異、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット変異導入を含むが、これらに限定されない。

ポリペプチドは、グリコシル化の程度を増加または減少させるために改変されていてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が存在することになる。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つが結合することを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンに結合することもある。

ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列を、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位のもの）の一または複数が作製されまたは取り除かれるように変化させることによって達成することができる。この変化は、基となるポリペプチドの配列への一または複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、欠失、または置換によってもなされる（Ｏ−結合グリコシル化部位の場合）。
また、ポリペプチドに結合したオリゴ糖（糖鎖）が天然体から変更されたものも、あるアミノ酸配列を有するポリペプチドに含まれ得る。

また、アミノ酸残基の好ましい置換は、保存的置換であり、その一例を表２に示す。このようなアミノ酸置換を、ポリペプチドに導入し、所望する活性／効果（例えば、抗原結合性、免疫原性、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ等）について置換体をスクリーニングすることができる。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することであり、所望の特徴を保持される範囲で、非保存的置換を行うこともできる。

抗体の変異体については、親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）および／またはフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸残基が変更されていてもよい。親抗体から変異体を作製する方法としては、これに限定されるものではないが、親和性成熟法（例えば、ファージディスプレイ法を用いたもの）が挙げられる。また、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、候補変異点を決定し、変異体を作製してもよい。

「天然型ジスルフィド結合」とは、野生型のポリペプチド（抗体等）に通常存在するシステイン−システイン間の共有結合のことをいう。
「非天然型ジスルフィド結合」とは、上記「天然型ジスルフィド結合」以外の位置に形成されるシステイン−システイン間の共有結合のことをいう。
したがって、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の一方が天然型システイン残基（野生型のポリペプチドに通常存在するシステイン残基）であり、他方が非天然型システイン残基（天然型システイン残基とは異なる位置に存在するシステイン残基）の場合も、ジスルフィド結合全体としては、非天然型ジスルフィド結合であるということができる。非天然型ジスルフィド結合は、好ましくは、ジスルフィド結合を形成する二つのシステイン残基の双方が非天然型システイン残基である。
なお、本明細書において、「ジスルフィド結合」との記載は、特記するか、本発明の目的に反しない限り、「天然型ジスルフィド結合」および「非天然型ジスルフィド結合」の双方を含む総称として用いられる。

非天然型システイン残基は、本発明の目的に反しない限り、目的の軽鎖又は重鎖に如何なる方法で導入してもよく、当分野で公知の全ての方法を使用することができる。具体的には、目的とする位置に存在するアミノ酸残基をシステイン残基へと置換することや、目的とする位置にシステイン残基を挿入することにより、システイン残基を導入することができる。このような置換又は挿入は、公知の遺伝子改変技術などのアミノ酸残基の改変方法を用いて行うことができる。

天然型ジスルフィド結合については、さらにその架橋様式から同一ポリペプチド鎖内で形成される「鎖内結合」と異種ポリペプチド鎖間で形成される「鎖間結合」に分けられる。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体の場合、前者は各ドメイン内に１本ずつあり、分子全体では合計１２本存在する。一方、後者は、重鎖−重鎖間に２本、軽鎖−重鎖間に１本ずつ存在する。従って、ヒトＩｇＧ１抗体の場合、天然型ジスルフィド結合は１分子あたり合計で１６本存在する。この天然型ジスルフィド結合の本数およびその位置は、抗体のクラスやサブクラスによって異なっており、それぞれにおいて固有である。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体の軽鎖−重鎖間の鎖間結合の場合、ＣＬ領域のアミノ酸位置２１４のシステイン残基とＣＨ１領域のアミノ酸位置２２０のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成し、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ抗体の軽鎖−重鎖間の鎖間結合の場合、ＣＬ領域のアミノ酸位置２１４のシステイン残基とＣＨ１領域のアミノ酸位置１３１のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成する。

「異なる位置にジスルフィド結合を形成する」（ジスルフィド結合の位置が異なる）とは、二つのポリペプチドまたはその部分に存在するジスルフィド結合を比較した際に、一方が他方とは異なるパターンでジスルフィド結合を形成する（一方には存在するが、他方には存在しないジスルフィド結合が存在する）ことを意味する。このとき、二つのポリペプチドまたはその部分の間には、一致（重複）するジスルフィド結合があってよい（特に鎖内結合は一致してよい）。二つのポリペプチドまたはその部分の交差の低減の観点から好ましくは、一致するジスルフィド結合の数（鎖内結合を除く）は、２、１または０であり、最も好ましくは０である。
なお、二つのジスルフィド結合の同異については、それぞれのジスルフィド結合を構成する二つのシステイン残基の双方ともに同一または対応する位置であるときに、「同一である」とし、少なくとも片方が実質的に異なる位置であるときに、「異なる」とする。交差の減少のため、双方の位置ともに異なることがより好ましいが、これに限定されるものではない。

また、「ジスルフィド結合を形成しないアミノ酸残基」としては、典型的には、システイン以外のアミノ酸残基、およびシステイン残基のＳＨ基をジスルフィド結合不可能な状態に化学修飾したものが挙げられる。ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基をこれらのアミノ酸残基に置換することで、ジスルフィド結合の形成を防止することができる。システイン残基をジスルフィド結合を形成しないアミノ酸残基に置換する場合に多く用いられるのは、アラニンまたはセリンへの置換である。
あるいは、目的とするポリペプチドの機能を維持できる場合は、システイン残基を欠失させることにより、ジスルフィド結合を形成させないようにしてもよく、この場合も、システイン残基の「ジスルフィド結合を形成しないアミノ酸残基」への変更ということができる。

「精製」とは、対象分子が、含まれる試料中の重量にして少なくとも９５％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％の濃度で試料中に存在するように、不純物を除去することを意味する。
「単離された」とは、対象分子が、自然環境に通常付随している少なくとも一の他の類似分子（ポリペプチド、核酸など）から分離されおよび／または回収されている状態にあることを意味する。通常は、単離された分子は、少なくとも一の精製工程を経て調製される。ポリペプチドについては、これに限定されるものではないが、例えば、（１）ローリー法で測定したときの純度が９５％または９９重量％を超えるまで、（２）アミノ酸配列決定装置を使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製された場合には十分に、単離されたものということができる。

「組成物」とは、本発明の文脈で用いられる場合には、ｉ）少なくとも二つの抗体を含む組成物、あるいはｉｉ）抗体とその他の成分とを含む組成物、の何れかを意味し、特に明記されなければ、何れの態様をも含む。ｉ）の意味で用いられる組成物としては、例えば、少なくとも二つの抗体を同一細胞中に共発現させた細胞や、当該細胞から調製される組成物などが挙げられる。その他の成分としては、組成物が用いられる目的に反しない範囲内で任意の成分を用いることができるが、特に好ましくは、薬学的に許容される担体が用いられる。

「薬学的に許容される担体」とは、これに限定されるものではないが、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸及びその塩等）、防腐剤、界面活性剤（ポリソルベート、ポリエチレングリコール等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤、ｐＨ調節剤、細胞（哺乳類の赤血球等）等を挙げることができる。また、蛋白質（低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、リシン等）及びその塩、単糖（グルコース、マンノース、ガラクトース等）や多糖（マルトース、トレハロース、マルトトリオース、デキストリン、デキストラン、ショ糖等）等の糖類、糖アルコール（マンニトールやソルビトール等）、炭水化物、合成高分子（ポリオレフィン、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレート、ポリアミド等）や天然高分子（セルロース、アガロース、キチン、キトサン等）及びこれらの架橋体、を含んでいても良い。
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を含む等張液、適当な溶解補助剤（例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート１２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等））等と併用してもよい。また、必要に応じて本発明の二重特異性抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリル酸等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる。

「少なくとも一」は、一又はそれ以上であることを意味し、二、三、四または五、あるいは組み合わせ上、形式的に取り得る上限値の約５％（またはそれ以上）、約１０％（またはそれ以上）、約２０％（またはそれ以上）、約５０％（またはそれ以上）、または約８０％（またはそれ以上）が含まれる。上限は、本発明の目的や、抗体等としての、その発明対象の効果を損なわない範囲で、当業者が適宜定めることができる。このような上限には、二、三、四または五、あるいは組み合わせ上、形式的に取り得る上限値の約５％（またはそれ以上）、約１０％（またはそれ以上）、約２０％（またはそれ以上）、約５０％（またはそれ以上）、約８０％（またはそれ以上）、または１００％が含まれる。「少なくとも二」は、「少なくとも一」の下限を一ではなく二としたものであり、他は同様である。

〔実施の形態〕
以下、本発明を実施するための形態を用いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
これらの態様は、単独でも、複数を組み合わせてもよい。また、各態様の定義や詳細については、前述の「用語および態様の説明」も参照のこと。

本発明は、ジスルフィド結合の形成位置を変化させることにより、軽鎖−重鎖間の結合を限定する方法に関するものであり、軽鎖と重鎖の組み合わせが複数通り存在する場合に、軽鎖および重鎖を含む抗体の効率的な製造を可能とする（図１を参照のこと）。

本発明のある態様は、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体；又は、Ｆａｂ領域を含む抗体を少なくとも二つ含み、該Ｆａｂ領域が少なくとも二つの抗体間で相違する組成物；の製造方法であって、
ｉ）前記抗体が発現するような条件下で前記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程、および
ｉｉ）宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程
を含み、
前記核酸は、前記Ｆａｂ領域の軽鎖と重鎖との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む領域を少なくとも一つコードし、
前記非天然型ジスルフィド結合の存在により、Ｆａｂ領域における軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置が、他の少なくとも一つのＦａｂ領域における軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置と異なる、方法である。
ある態様では、上記方法において、上記非天然型ジスルフィド結合および上記ジスルフィド結合は、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合である。

また、本発明のある態様は、第一の軽鎖および重鎖を含む第一のＦａｂ領域と、前記第一の軽鎖および重鎖とはそれぞれが異なる第二の軽鎖および重鎖を含む第二のＦａｂ領域とを含む抗体の製造方法であって、
ａ）前記抗体の親抗体の第一のＦａｂ領域のＣＬ領域およびＣＨ１領域におけるシステイン以外のアミノ酸残基の少なくとも一つを、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基に置換する工程、および
ｂ）前記ジスルフィド結合を形成するシステイン残基により、第一のＦａｂ領域に非天然型ジスルフィド結合を形成させる工程、
を含み、
前記非天然型ジスルフィド結合の存在により、第一のＦａｂ領域が、第二のＦａｂ領域と異なる位置にジスルフィド結合を形成する、方法である。

また、本発明の他の態様は、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体であって、
少なくとも一つのＦａｂ領域が、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、それにより非天然型ジスルフィド結合が形成されており、
前記非天然型ジスルフィド結合の存在により、Ｆａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置が、他の少なくとも一つのＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置と異なる、抗体である。
ある態様では、上記抗体は、二つの相違するＦａｂ領域を含む。

また、本発明の他の態様は、Ｆａｂ領域を含む抗体を少なくとも二つ含み、該Ｆａｂ領域が少なくとも二つの抗体間で相違する組成物であって、
少なくとも一つのＦａｂ領域は、軽鎖と重鎖との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、それにより非天然型ジスルフィド結合が形成されており、
前記非天然型ジスルフィド結合の存在により、Ｆａｂ領域における軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の位置が、他の少なくとも一つのＦａｂ領域における軽鎖と重鎖との間でのジスルフィド結合の位置と異なる、組成物である。
ある態様では、上記組成物において、上記非天然型ジスルフィド結合および上記ジスルフィド結合は、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合である。
上記抗体または組成物は、典型的には、前述した抗体または組成物の製造方法により製造することもできる。

本発明によれば、それぞれのＦａｂ領域における軽鎖−重鎖の組み合わせが限定されることにより、前述した組み合わせの無作為性に起因する所望しない組み合わせの抗体の産生量を減じ、以って、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体（第一のＦａｂ領域と第二のＦａｂ領域とを含む抗体）あるいは異なるＦａｂ領域を含む抗体を少なくとも二つ含む組成物を効率的に製造することができる。
本発明では、軽鎖−重鎖（特にＣＬ領域−ＣＨ１領域）間に非天然型のジスルフィド結合を形成させることにより、軽鎖−重鎖（特にＣＬ領域−ＣＨ１領域）間のジスルフィド結合の位置を、二つのＦａｂ領域間（第一の軽鎖および重鎖と第二の軽鎖および重鎖との間）で完全一致しないようにする。このことにより、好ましくは、ＣＬ領域−ＣＨ１領域間の結合が各Ｆａｂ領域に特異的なものとなる。ジスルフィド結合が二つのＦａｂ領域間で完全一致しないようにするためには、一方のＣＬ領域−ＣＨ１領域間ジスルフィド結合の一部を非天然型化する（一方は天然型ジスルフィド結合、他方は非天然型ジスルフィド結合）か、あるいは、一方の非天然型ジスルフィド結合とは異なる位置で他方に非天然型ジスルフィド結合を形成させる（双方とも非天然型ジスルフィド結合）。

また、少なくとも二つの相違するＦａｂ領域間で、ＣＨ１領域−ＣＬ領域間ジスルフィド結合が交差しないか、このような組み合わせでの交差が減少する位置でジスルフィド結合を形成することがより好ましい。
また、第一の軽鎖と第二の重鎖、第二の軽鎖と第一の重鎖との間でジスルフィド結合を形成しないか、このような組み合わせでの交差が減少する位置でジスルフィド結合を形成することがより好ましい。
本発明のある態様は、あるＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置は、他の少なくとも一つのＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置と全て異なる、上記何れかの方法、抗体もしくは組成物である。

システイン残基に置換することで非天然型ジスルフィド結合を形成可能なアミノ酸残基の位置や、交差の少ない非天然型ジスルフィド結合形成位置は、形成を試みる目的抗体の立体構造の情報に基づいて決定される。多くの場合、必要とする各々の原子の座標が記載された立体構造情報は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などの公的データベースから無償で入手可能である。入手した座標情報は、一般に計算化学ソフトと言われる専用ソフトを用いることにより立体構造が計算され、ＰＣモニター等へ擬似的に可視化投影が可能となっている。また、任意の原子間の距離や結合角度、更には結合エネルギーの計算なども、多くの場合、計算化学ソフトでは可能となっている。抗体分子内に存在する天然型ジスルフィド結合とは、システイン残基の側鎖末端に存在する硫黄原子同士が共有結合したものであり、鎖間結合を担っている場合、側鎖の向きは互いに向かい合っている傾向にあると予想される。これを構造計算に反映させるには、両システイン残基のβ炭素間の距離が同α炭素間の距離よりも小さいという条件で設定することが妥当である。

例えばヒトＩｇＧ１抗体の軽鎖−重鎖間の鎖間結合の場合、ＣＬ領域のアミノ酸位置２１４のシステイン残基とＣＨ１領域のアミノ酸位置２２０のシステイン残基との間で形成されているジスルフィド結合では、上記α炭素間距離（Ｃ_α−Ｃ_α’）は４．４４１Å、上記β炭素間距離（Ｃ_β−Ｃ_β’）は３．８３２Åと計算される（ＰＤＢエントリー：１Ｌ７Ｉ）。
これらの結果やジスルフィド結合に関する公知の情報を参照し、例えばＣ_α−Ｃ_α’を７．０Å以下、Ｃ_β−Ｃ_β’を５．５Å以下、且つβ炭素間距離＜α炭素間距離と設定し、この条件を満たすアミノ酸残基ペアを隣接するペプチド鎖に存在するアミノ酸残基群から計算により選出すれば、即ち、それらがシステイン残基への有力な置換候補ペアとなり得る。Ｃ_α−Ｃ_α’及びＣ_β−Ｃ_β’として計算に用いられる値は上記値に限定されるものではなく、例としては、それぞれ、７．５Å以下、８Å以下、８．５Å以下、９Å以下、９．５Å又は１０Å以下、及び、６Å以下、６．５Å以下、７Å以下、７．５Å以下、８Å以下又は８．５Å以下、といった値を組み合わせて使用することができる。

また、本発明の実施において用いられるアミノ酸残基の改変方法は、特に限定されるものではなく、目的を達成することのできる全ての手法を用いることができる。本発明におけるアミノ酸残基の改変は、典型的には、目的位置のアミノ酸をコードする核酸の改変により、システイン残基を置換・欠失・付加することにより行われるが、これに限られるものではなく、化学的な修飾などによるシステイン残基の改変などであってもよい。なお、「アミノ酸残基を置換する」ことには、アミノ酸残基をコードする核酸を置換し、それによって結果としてのアミノ酸残基を置換することも、当然のことながら含まれる。システイン残基がジスルフィド結合を形成しないアミノ酸残基に置換する場合に多く用いられるのは、アラニン残基またはセリン残基への置換である。
また、本発明は、特定のＣＤＲ配列などに限定されるものではないため、本発明の対象となる抗体は、何れの抗原に対する抗体に対応するＦａｂ領域を有していてもよい。

非天然型ジスルフィド結合を形成し易い位置としては、これに限定されるものではないが、（１）軽鎖１１６位−重鎖１２６位、軽鎖１１６位−重鎖１２７位、軽鎖１１６位−重鎖１２８位、軽鎖１１６位−重鎖１３４位、軽鎖１１６位−重鎖１４１位、軽鎖１１８位−重鎖１２６位、軽鎖１１８位−重鎖１２７位、軽鎖１１８位−重鎖１２８位、軽鎖１１８位−重鎖１３４位、軽鎖１１８位−重鎖１４１位、軽鎖１２１位−重鎖１２６位、軽鎖１２１位−重鎖１２７位、軽鎖１２１位−重鎖１２８位、軽鎖１２１位−重鎖１３４位、軽鎖１２１位−重鎖１４１位、軽鎖１２４位−重鎖１２６位、軽鎖１２４位−重鎖１２７位、軽鎖１２４位−重鎖１２８位、軽鎖１２４位−重鎖１３４位、又は軽鎖１２４位−重鎖１４１位間、および（２）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、軽鎖１６２位−重鎖１７１位、又は軽鎖１６２位−重鎖１７３位間を例示することができる。

更に具体的な非天然型ジスルフィド結合を形成し易い位置の組み合わせとしては、これに限定されるものではないが、ａ）軽鎖１１６位−重鎖１３４位、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｄ）軽鎖１２１位−重鎖１２６位、ｅ）軽鎖１２１位−重鎖１２７位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位間を例示することができる。これらの位置に導入されたシステイン残基は、比較的近接した位置と側鎖方向に存在し、ジスルフィド結合を形成することができる。より好ましくは、軽鎖がλ鎖の場合、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位間を例示することができる。

非天然型ジスルフィド結合は、より好ましくは、ａ）軽鎖１１６位−重鎖１３４位、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により形成される。これらの位置では、より確実に、軽鎖に導入されたシステイン残基が、重鎖の２２０位のシステイン残基と交差を示さない。軽鎖がλ鎖の場合、非天然型ジスルフィド結合は、さらに好ましくは、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位以外の位置に導入されたシステイン残基により形成され、さらにより好ましくは、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、またはｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位に導入されたシステイン残基により形成される。

非天然型ジスルフィド結合は、より好ましくは、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｄ）軽鎖１２１位−重鎖１２６位、ｅ）軽鎖１２１位−重鎖１２７位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により形成される。これらの位置では、より確実に、重鎖に導入されたシステイン残基が、軽鎖の２１４位のシステイン残基と交差を示さない。軽鎖がλ鎖の場合、さらにより好ましくは、非天然型ジスルフィド結合は、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、またはｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位に導入されたシステイン残基により形成される。

非天然型ジスルフィド結合は、さらにより好ましくは、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｃ）軽鎖１１８位−重鎖１２８位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により形成される。これらの位置に導入されたシステイン残基は、より確実に、天然型ジスルフィド結合と交差を示さない。軽鎖がλ鎖の場合、非天然型ジスルフィド結合は、さらにより好ましくは、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位間以外の位置に導入されたシステイン残基により形成される。

非天然型ジスルフィド結合は、さらにより好ましくは、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、ｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位間から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により形成される。これらの位置でシステイン残基を導入して本発明を実施すると、極めて優れた収量、交差性を達成できる。非天然型ジスルフィド結合は、さらにより好ましくは、軽鎖がκ鎖の場合、ｂ）軽鎖１１６位−重鎖１４１位、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位、またはｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位の位置に導入されたシステイン残基により形成され、軽鎖がλ鎖の場合、ｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成される。なお、精製の簡便性の観点からは、非天然型ジスルフィド結合は、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位間またはｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位間に形成されることが一層好ましく、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位間に形成されることが最も好ましい。
本段落の態様において、軽鎖がλ鎖の場合、非天然型ジスルフィド結合は、より好ましくは、ｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位間以外の位置に導入されたシステイン残基により形成される。

上記位置におけるシステイン残基の導入については、これに限定されるものではないが、以下の位置でのシステインの置換または挿入、又は以下のアミノ酸のシステインによる置換または挿入を例示することができる。
軽鎖（κ鎖）：１１６位（Ｆ１１６Ｃ）、１１８位（Ｆ１１８Ｃ）、１２１位（Ｓ１２１Ｃ）、１２４位（Ｑ１２４Ｃ）、１６２位（Ｓ１６２Ｃ）
軽鎖（λ鎖）：１１８位（Ｆ１１８Ｃ）、１２４位（Ｅ１２４Ｃ）、１６２位（Ｔ１６２Ｃ）
重鎖：１２６位（Ｆ１２６Ｃ）、１２７位（Ｐ１２７Ｃ）、１２８位（Ｌ１２８Ｃ）、１３４位（Ｓ１３４Ｃ）、１４１位（Ａ１４１Ｃ）、１７０位（Ｆ１７０Ｃ）、１７１位（Ｐ１７１Ｃ）、１７３位（Ｖ１７３Ｃ）

また、本発明の更なる態様は、少なくとも一つのＦａｂ領域のＣＬ領域とＣＨ１領域との間で、天然型ジスルフィド結合が形成されていないか、あるいは、少なくとも一つのＦａｂ領域が、軽鎖と重鎖との間で天然型ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基を含まない、上記何れかの方法、抗体もしくは組成物である。この態様では、少なくとも一つのＦａｂ領域において、天然型ジスルフィド結合が形成されず、代わりに非天然型ジスルフィド結合のみを介して軽鎖−重鎖間の結合が形成されることとなる。このとき、他のＦａｂ領域は天然型ジスルフィド結合を形成しても、別の非天然型ジスルフィド結合を形成してもよい。
天然型ジスルフィド結合の一例としては、これに限定されるものではないが、軽鎖のアミノ酸位置２１４のシステイン残基と重鎖のアミノ酸位置２２０のシステイン残基との間でのジスルフィド結合が挙げられる。

上記何れかの態様の方法、抗体または組成物は、更に、重鎖−重鎖間の組み合わせを限定するための技術を適用し、そのための工程を含む方法、あるいはそれによって製造された抗体または組成物であってよい。このような技術としては、これに限定されるものではないが、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術（例えば、米国特許第７，１８３，０７６号公報；国際公開第９８／５０４３１号公報（日本国特許第４３２４２３１号））、静電引力による異種間結合（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号公報、国際公開第２００７／１４７９０１号公報）、荷電付きロイシンジッパーによる異種間結合（例えば、国際公開第２０１１／０３４６０５号公報）、軽鎖重鎖交換発現による効率的生産法（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１３号公報）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製（国際公開第２０１０／１５１７９２号公報）が挙げられる。これら何れの技術も、本発明と組み合わせて用いることができ、この場合も、本発明の技術的範囲に含まれる。これらの技術と本発明とを組み合わせた場合には、極めて効率的に軽鎖−重鎖および重鎖−重鎖間が限定された抗体または組成物（例えば、多重特異性抗体など）を製造することが可能となる。

また、本発明の更なる態様は、抗体が多重特異性抗体（特に二重特異性抗体）である上記何れかの態様の方法、抗体または組成物である。
多重特異性抗体の製造方法として、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術（Milstein and Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)）が知られている。この方法では、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖が無作為に組み合わされるために、二重特異性抗体の場合、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種類の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性がある。これらのうちの１種のみが、正しい二重特異性構造を有するため、この方法による所望の多重特異性抗体の収率は低い（図１を参照のこと）。また、所望の多重特異性抗体の精製には、アフィニティークロマトグラフィーなどが用いられるが、一般に所望の多重特異性抗体の純度を高めることは容易ではない。
また、多重特異性抗体の製造において、軽鎖および重鎖の無作為の組み合わせに起因する困難性を克服することを目的とした技術が幾つか知られているが、その多くが重鎖−重鎖間の結合を限定するものである。

これに対し、本発明は、ジスルフィド結合を変化させることにより、軽鎖−重鎖間の結合を限定する方法に関するものであり、従来の改良技術とは異なる機構で、多重特異性抗体の効率的な製造を可能とする。それゆえに、重鎖−重鎖間の結合を限定する方法などの従来技術と組み合わせて使用することも可能であり、その場合は、さらに効率的な多重特異性抗体の製造が可能となる。
また、本発明の更なる態様は、抗体が、少なくとも二つの抗体断片のリンカーで介するか又は直接的に連結したものである上記何れかの態様の方法、抗体または組成物である。

また、本発明の更なる態様は、抗体が抗体断片である上記何れかの態様の方法、抗体または組成物である。単一抗体断片の製造に際して本発明を適用する場合には、軽鎖部分と重鎖部分との組み合わせを２対以上含む抗体断片が好ましく、そのような抗体断片には、これに限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）_２が含まれる。また、抗体断片を含む組成物の製造に際して本発明を適用する場合には、軽鎖部分と重鎖部分との組み合わせを１対以上含む抗体の組成物が好ましく、そのような組成物には、これに限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２を含む組成物が含まれる。
抗体が抗体断片であることにより、その生産性に優れ、また標的分子を発現している組織や病巣部への移行・浸透に優れる。

また、本発明の更なる態様は、抗体のＦｃ領域が他の分子により置換されている上記何れかの態様の方法、抗体または抗体組成物である。本発明の対象が抗体であるとき、抗体はＦｃ領域を有し得るが、そのＦｃ領域は、本発明の目的に反しない範囲で如何なる構造をも取ることができる。すなわち、本発明の抗体には、Ｆｃ領域が変異した抗体のみならず、Ｆｃ領域が通常のＦｃ領域以外の分子により置換された広義の抗体分子も含まれる。抗体の使用用途・目的に応じて、多数の分子を置換分子として用いることができることが知られているが、例えば、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、ポリエチレングリコール類、アミノ酸（例えばグリシン、ヒスチジンなど）、糖鎖、低分子化合物、脂質、リン脂質（例えばレシチンなど）、ビタミン（例えばビオチンなど）、酵素などを挙げることができる。

また、本発明の更なる態様は、抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ抗体である上記何れかの態様の方法、抗体または抗体組成物である。
また、本発明の更なる態様は、抗体の軽鎖がκ鎖である上記何れかの態様の方法、抗体または抗体組成物である。
本発明の更なる態様は、抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である上記何れかの態様の方法、抗体または組成物である。キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体は、発明の効果を損なわない範囲で、前述したキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の何れであってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体であることにより、抗原性の低減、体内動態の改善という効果を奏する。また、ヒト抗体を対象とすることにより、本明細書に記載された知見を最大限に活用することもできる。

本発明の更なる態様は、宿主細胞が真核生物細胞または大腸菌である上記何れかの態様の方法である。本発明は、宿主細胞に依存する方法ではないため、抗体製造に適する任意の宿主細胞を用いることができるが、抗体の製造に汎用される宿主細胞として、真核生物細胞または大腸菌を好適に用いることができる。真核生物細胞としては、これに限定されるものではないが、例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞が挙げられる。

抗体の一般的な製造方法の概略を下記に述べる。上記何れかの態様の方法は、以下に詳述する工程や実施態様等の、一または複数をさらに含んでもよい。
（１）免疫
得られた抗原を哺乳動物へ投与して免疫を行う。抗原は、アジュバントと混合して用いられてもよい。哺乳動物としては、マウスが好適に用いられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスがさらに好適に用いられる。免疫は、同一の哺乳動物に対し、単数回行われても、複数回行われてもよい。
（２）スクリーニング
脾細胞より常法によりハイブリドーマを作製し、抗体価等所望の活性を指標に、スクリーニングを行う。脾細胞を得る前に、免疫した哺乳動物単位で、血清抗体価などの血清中の活性を指標にプレスクリーニングを行ってもよい。スクリーニングは、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて行われる。

（３）大量調製
スクリーニングで選抜したハイブリドーマをマウス腹腔へ投与して腹水を産生させ、その抗体含有腹水を採取し、精製して、抗体を得る。好ましくは、マウスとしてはＳＣＩＤマウスが用いられる。精製には、好ましくはクロマトグラフィー、より好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーなどが用いられる。
（４）組換え生産
スクリーニングで得られた抗体については、その抗体を産生するハイブリドーマからｃＤＮＡを得るなどにより、他の細胞において組換え体を製造することができ、このような態様も上記製造方法に含まれる。
得られたｃＤＮＡを用い、他の細胞において組換え体を製造する方法の詳細は、後述する。

本発明のある態様は、上記何れかの態様の抗体をコードする核酸である。核酸は好ましくはＤＮＡである。
上記何れかの態様の核酸は、常法により、単離し、配列決定することができる。これに限定されるものではないが、例えば、軽鎖および／または重鎖等を特異的に増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定することができる。また、単離された核酸は、クローニングおよび発現させるために原核または真核細胞へ遺伝子導入することができる。そのような手順は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHL Press)、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)、Antibody Engineering (Springer)；Antibodies: A Laboratory Manual (CSHL Press)を参照することができる。

また、本発明のある態様は、上記何れかの態様の核酸を含むベクターである。典型的には、このベクターは、単離された上記何れかの態様の核酸を常法によりベクターに挿入することで得ることができる。ベクターは、好ましくは複製可能なベクターであり、さらに好ましくはプロモーターを有するベクター（発現ベクター）である。ベクターは、これに限定されるものではないが、一般に、シグナル配列、複製起点、一または複数の選択遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメント、および転写終結配列のうちの一または複数の成分を含む。各成分については、以下に述べる。

（１）シグナル配列
目的のポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列等との融合ペプチドとしても生産され得る。シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。原核生物宿主細胞では、シグナル配列として、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダー等の原核生物シグナル配列を用い得る。酵母では、シグナル配列として、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、酸性ホスファターゼリーダー、グルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナル等を用い得る。哺乳動物細胞では、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル等のウイルス分泌リーダーや、哺乳動物のシグナル配列を用い得る。

（２）複製起点
多くのベクター（例えば、発現ベクターおよびクローニングベクター）は一または複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点または自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母およびウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製起点は不要である（実際は、ＳＶ４０開始点が典型的には（プロモーターとして）用いられることが多い）。

（３）選択遺伝子
多くのベクター（例えば、発現ベクターおよびクローニングベクター）は、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子としては、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンのような抗生物質または他の毒素への耐性付与遺伝子、（ｂ）栄養要求性欠陥を補う遺伝子、あるいは（ｃ）（特定の）培地から得られない重要な栄養素を供給する遺伝子（例えばBacillusに対するＤ−アラニンラセマーゼ）が挙げられる。

（４）プロモーター
多くのベクター（例えば、発現ベクターおよびクローニングベクター）は一般に、宿主生物体によって認識され、目的とするポリペプチドをコードしている核酸の上流にプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター（例えばｔａｃプロモーター）が挙げられる。しかし、他の細菌プロモーターも好適である。例えば細菌系で使用するベクターでは、ポリペプチドをコードする核酸の上流にシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。また、真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。
大部分の真核生物遺伝子の３’末端には、ｍＲＮＡの３’末端へポリＡを付加するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は真核生物の発現ベクターに適切に挿入され得る。

（５）エンハンサーエレメント
ＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられることが多い。例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる（Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982)も参照のこと）。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５’または３’位でベクター中に挿入され得るが、好ましくは５’位に位置している。

（６）転写終結配列
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる多くのベクター（例えば、発現ベクター）は、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み得る。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。

通常は抗体を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞）に上記何れかの態様の核酸を形質移入し、適切な栄養培地中で培養することにより、その核酸によりコードされる抗体を産生させることもできる（例えば、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)；Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992)を参照のこと）。その後、例えば、宿主細胞ペーストから可溶性分画へと抗体を分離し、精製する（例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡまたはＧカラムを用いる）ことにより、抗体を製造することができる。

宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地では、例えば、ＨａｍＦ１０（シグマ）、ＭＥＭ（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）およびＤＭＥＭ（シグマ）が宿主細胞の培養に好適である。これらの培地には、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン、チミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物など）およびグルコースもしくは等価なエネルギー源を、必要に応じて補充することができる。他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適切な濃度で含むことができる。好適な培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、それぞれの宿主細胞について、当業者には明らかであり、また単純な条件検討の範囲内である。

組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生産されるか、あるいは培地中に直接分泌される。
抗体が細胞内に産生された場合、第１の工程として、不要物（細胞細片など）を例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。Carter et al., Bio/Technology(NY) 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間冷解凍を行う。細胞細片は遠心分離で除去できる。
抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系からの上清を、一般的にはタンパク質濃縮フィルター（例えばＡｍｉｃｏｎもしくはＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過フィルター）を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めることで、抗体の分解を阻害してもよく、また抗生物質を用いることで外来性の汚染生物の増殖を防止してもよい。

細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。典型的には、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製工程である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡ／Ｇの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（例えば、Lindmark et al., J. Immunol. Methods. 62: 1-13 (1983)を参照のこと）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３を含む全てのヒトγ重鎖に好適に用いることができる（例えば、Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)を参照のこと）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
上述した予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液に、例えば、ｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ ＮａＣｌ）の溶出緩衝液を用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよい。

〔その他の態様〕
上記何れかの態様の抗体は、場合によって薬学的に許容される担体などと共に、組成物や製剤などを構成してもよい。また、上記何れかの態様の抗体は、一般的に抗体が用いられる各種用途に用いることができる。

多重特異性抗体が用いられる代表的な用途を以下に例示する。
〔検出・診断〕
多重特異性抗体は、競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイッチアッセイ法、および免疫沈殿法など、既知のアッセイ法に有利に用いることができる。
また、酵素免疫アッセイで使用される酵素を固定化するために、多重特異性抗体を用いることもできる。多重特異性抗体のあるＦａｂ領域を、酵素阻害を生じないような酵素表面の特定のエピトープに結合するように設計し、他方のＦａｂ領域を、所望の部位において高い酵素密度を確実にする固定化マトリックスに結合することで、酵素免役アッセイを感度よく行うことができる。
多重特異性抗体はまた、腫瘍などの様々な疾患のｉｎ ｖｉｖｏ免疫診断またはｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫診断を行うために使用することができる(Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990))。この場合、多重特異性抗体のあるＦａｂ領域は、腫瘍関連抗原と結合し、他のＦａｂ領域は、放射性核種と結合するキレート化剤などの検出可能なマーカーと結合することができる。

〔疾患治療〕
多重特異性抗体は、標的細胞（例えば、特定の臓器など）と結合する一つのＦａｂ領域と、薬剤等（低分子薬剤、ポリペプチド等）と結合する他のＦａｂ領域とが提供されることによって、標的細胞に特異的に薬剤等を送達することにより、治療上有用となり得る。
また、多重特異性抗体は、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）と結合する一つのＦａｂ領域と、Ｔ細胞受容体またはＦｃγ受容体などの細胞傷害性誘引因子分子と結合する他のＦａｂ領域とが提供されることによって、細胞傷害性の対象を限定することにより、治療上有用となり得る。この場合、多重特異性抗体を使用して、対象の細胞性免疫防御機構を腫瘍細胞または感染性病原体に特異的に向けさせることが可能となる。
また、多重特異性抗体は、標的（例えば、病原体または腫瘍細胞）上のある抗原（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質など）と結合する一つのＦａｂ領域と、同一標的または同一種標的上の別の抗原と結合する他のＦａｂ領域とが提供されることによって、細胞傷害性の強度等を変えること（例えば、ＡＤＣＣ向上、アポトーシス誘導など）により、治療上有用となり得る。
また、多重特異性抗体は、フィブリン溶解剤またはワクチンアジュバントとして使用することができる。さらに、これらの抗体は、感染性疾患の処置において、（例えば、エフェクター細胞を、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスに感染した細胞あるいはToxoplasma gondiiなどの原生動物に対して標的化するために）使用することができ、あるいはイムノトキシンを腫瘍細胞に送達するために、あるいは免疫複合体を細胞表面レセプターに標的化するために使用することができる。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
例えば、本発明の条件を満たす構造を有するポリペプチド鎖を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、化学的に結合させる際に、特定の軽鎖−重鎖間の結合を増やしたい際（多重特異性抗体を製造する際）などにも、本発明は有用であり、このような方法も、本発明の態様に含まれる。

以下、実施例により、本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明もしくは定法に従い使用した。
当実施例では、まず初めに、非天然型ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１ｍ）を導入した変異体が分子量的にも機能的にも野生型抗体と同等であることを示す。次いで、非天然型ジスルフィド結合の結合選択性が高いこと、即ち天然型ジスルフィド結合と交差しないことを示す。最後に、Ｃｙｓ１ｍを利用することにより、ＩｇＧ型として完全な形態の二重特異性抗体が簡便に作製できることを、種々の解析結果から証明する。

〔実施例１〕
〔発現ベクターの構築〕
抗体分子各種を発現させるためのベクターには、市販されている発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。一つのベクター上に軽鎖の発現ユニット（プロモーター、目的遺伝子、ＰｏｌｙＡ配列）と重鎖の発現ユニット（同）を、タンデムに配置し、単一ベクターの遺伝子導入で抗体発現が可能となるようにした。用いたプライマーおよびクローニングで得たｃＤＮＡの塩基配列を図２と図３に、転写産物のアミノ酸配列を図４に一覧する。

（Ｉ−ｉ）非天然型ジスルフィド結合導入箇所の探索
構造探索は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社の計算化学ソフト「ＭＯＥ」を用いて行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）内のヒトＦａｂの立体構造データのうち、軽鎖がκ型であるＩｇＧ１抗体の初期構造には、重鎖がγ１型かつ軽鎖がκ型であり、解像度が１．８Åと最も高かったＰＤＢ ＩＤ：１Ｌ７Ｉのデータを使用し、軽鎖がλ型であるＩｇＧ１抗体の初期構造には、重鎖がγ１型かつ軽鎖がλ型であり、解像度が１．９Åと最も高かったＰＤＢ ＩＤ：２ＦＢ４のデータを使用した。
新たなジスルフィド結合を導入する際、変異元の残基同士のα炭素間距離、およびβ炭素間距離がある程度近いことが重要であるとの報告（Sowdhamini R. et al., Protein Eng., 95-103, 1989）を考慮し、κ鎖についてはα炭素間距離が７．０Å以下、β炭素間距離が５．５Å以下の残基対、λ鎖についてはα炭素間距離が１０Å以下、β炭素間距離が８Å以下の残基対を検索した。

（Ｉ−ｉｉ）ヒト軽鎖遺伝子の取得
ヒトκ型軽鎖遺伝子は、健常人（成人）の末梢血白血球由来ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリー（ＢｉｏＣｈａｉｎ社、Ｃ１２３４１４８−１０）を鋳型に、ＰＣＲクローニングを行って得た。その際のＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｊ００２４１を参照して設計した（図２の配列Ｐ０１およびＰ０２）。また、クローニングを容易にするため、両プライマーには予め制限酵素サイトを内包させておいた。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなど）にクローニング後、塩基配列を確認し、両認識配列間の配列がＪ００２４１と同一となるクローンを選抜した（野性型：図３の配列Ｎ０１、図４の配列Ａ０１）。これの上流部に連結する分泌シグナル配列（抗ＤＲ５抗体の配列に統一）を含む軽鎖可変領域の遺伝子（抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３７抗体または抗ＤＲ５抗体）をクローニングし、これとクロ−ニング済みのκ鎖定常領域とがこの順で連なるよう、発現ベクターのプロモーターの下流に配置した。
ヒトλ型軽鎖遺伝子は、ヒトκ型軽鎖遺伝子と同様の手順で得た。その際のＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｊ００２５２を参照して設計した（図２の配列Ｐ０３およびＰ０４）。また、クローニングを容易にするため、両プライマーには予め制限酵素サイトを内包させておいた。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなど）にクローニング後、塩基配列を確認し、両認識配列間の配列がＪ００２５２と同一となるクローンを選抜した。このλ鎖定常領域をクローニングしたベクターを鋳型に、軽鎖可変領域とλ鎖定常領域が繋がるよう設計したセンスプライマー（図２の配列Ｐ０５）およびλ鎖定常領域Ｃ末端のアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ０４）を使用して再度ＰＣＲを行い、可変領域連結用λ鎖定常領域を得た（野生型：図３の配列Ｎ０２、図４の配列Ａ０２）。これの上流部に連結する分泌シグナル配列（抗ＤＲ５抗体の配列に統一）を含む軽鎖可変領域の遺伝子（抗ＣＤ２０抗体）をクローニングし、これと可変領域連結用λ鎖定常領域とがこの順で連なるよう、発現ベクターのプロモーターの下流に配置した。

（Ｉ−ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ1遺伝子の取得
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＣＨ１領域〜ＣＨ３領域）の遺伝子は、健常人（成人）の末梢血白血球から抽出したＲＮＡを材料にｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲクローニングを行って得た。その際のＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｊ００２２８を参照して設計した（図２の配列Ｐ０６およびＰ０７）。また、クローニングを容易にするため、両ＰＣＲプライマーには予め制限酵素認識配列を内包させておいた。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなど）にクローニング後、塩基配列を確認し、両認識配列間の配列がＪ００２２８と同一となるクローンを選抜した（野生型：図３の配列Ｎ０３、図４の配列Ａ０３）。これの上流部に連結する分泌シグナル配列を含む重鎖可変領域の遺伝子（抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３７抗体または抗ＤＲ５抗体）をクローニングし、これとクローニング済みの重鎖定常領域とをこの順で連なるよう、発現ベクターのプロモーターの下流に配置した。

（Ｉ−ｉｖ）非天然型ジスルフィド結合抗体発現ベクターの取得
軽鎖−重鎖間の天然型ジスルフィド結合を無効化するため、担当ＣｙｓをＳｅｒへ置換すること（軽鎖：Ｃ２１４Ｓ、重鎖：Ｃ２２０Ｓ）を並行して行った。
κ鎖軽鎖においては、Ｃ２１４Ｓ変異を有するセンスプライマー（図２の配列Ｐ０８）およびアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ０９）を設計し、それらの上流側で設計したＣｙｓ変異導入用プライマー各種（図２の配列Ｐ１０〜Ｐ１８）、最も上流で設計したベクター配列に由来するセンスプライマー（図２の配列Ｐ１９）、および最も下流側で設計したベクター配列に由来するアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ２０）を適切な組み合わせを用いて、ヒトκ型軽鎖遺伝子（野生型）を鋳型にＰＣＲを行い、目的とする変異が導入された遺伝子断片群を得た。適宜、それらをＰＣＲにて連結し、クローニングした後、配列を確認した（図３の配列Ｎ０４〜Ｎ０８、図４のＡ０４〜Ａ０８）。続いて、各々を発現ベクター上の野生型遺伝子の相同領域と入れ換えて、目的とする変異導入軽鎖遺伝子群を得た。
λ型軽鎖においては、Ｃ２１４Ｓ変異を有するアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ２１）を設計し、それらの上流側で設計したＣｙｓ変異導入用プライマー各種（図２の配列Ｐ２２〜Ｐ２６）、および最も上流で設計したセンスプライマー（図２の配列Ｐ０５）を適切な組み合わせを用いて、ヒトλ型軽鎖遺伝子（野生型）を鋳型にＰＣＲを行い、目的とする変異が導入された遺伝子断片群を得た。適宜、それらをＰＣＲにて連結し、クローニングした後、配列を確認した（図３の配列Ｎ０９〜Ｎ１１および図４の配列Ａ０９〜Ａ１１）。続いて、各々を発現ベクター上の野生型遺伝子の相同領域と入れ換えて、目的とする変異導入軽鎖遺伝子群を得た。

重鎖においては、Ｃ２２０Ｓ変異を有するセンスプライマー（図２の配列Ｐ２７）、アンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ２８）、Ｃｙｓ変異導入用プライマー各種（図２の配列Ｐ２９〜Ｐ４３）、最も上流側で設計した抗ＣＤ２０抗体の重鎖可変領域の配列に由来するセンスプライマー、および最も下流側で設計したＣＨ２ドメインの配列に由来するアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ４４）を用いて、ヒトＩｇＧ１遺伝子を鋳型にＰＣＲを行い、目的とする変異が導入された遺伝子断片群を得た。適宜、それらは必要に応じてＰＣＲにて連結してクローニングした後、配列を確認した（図３および図４の配列Ｎ１２〜Ｎ１９およびＡ１２〜Ａ１９）。続いて、各々を発現ベクター上の野生型遺伝子の相同領域と入れ換えて、目的とする変異導入重鎖遺伝子群を得た。

（Ｉ−ｖ）プロテインＡ親和性欠失型抗体発現ベクターの取得
二重特異性抗体を調製する際、異なる配列の重鎖同士が結合した分子（ヘテロ体）をプロテインＡ結合能の差異を指標に、簡便、且つ効率的に精製できるよう、一方の重鎖のプロテインＡ結合能を欠失させておくことを考案した。即ち、ＩｇＧ１上の担当残基であるＨ４３５およびＹ４３６を、プロテインＡ結合能を有していないＩｇＧ３型へ置換（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）することである。野生型重鎖（［１］と表記）および当該変異型重鎖（［３］と表記）から成るヘテロ体（［１］／［３］）は、野生型のホモ体（［１］／［１］）および変異型ホモ体（［３］／［３］）との中間のプロテインＡ結合能を呈することとなり、その結果、プロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおいて、三者が分別精製可能となることを、これまでに確認済みである。
ヒトＩｇＧ３型重鎖に対するＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｘ０３６０４を参照してＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ変異を有するセンスプライマー（図２の配列Ｐ４５）およびアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ４６）を設計した。これらとベクター配列に由来するセンスプライマー（図２の配列Ｐ１９）およびアンチセンスプライマー（図２の配列Ｐ４７）を用いて、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を鋳型にＰＣＲを行い、変異上流側遺伝子断片と変異下流側遺伝子断片を得た。両断片をＰＣＲにて連結させた。更にこれを鋳型に、上流端と下流端のプライマー（図２の配列Ｐ１９、Ｐ４７）を用いてＰＣＲを行って目的とする遺伝子断片を得た後、クローニングを行い、配列を確認した（図３の配列Ｎ２０、図４の配列Ａ２０）。続いて制限酵素処理を経て、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ断片を調製した後、これを発現ベクター上の野生型遺伝子の相同領域と入れ換えて、目的とする変異導入重鎖遺伝子を発現するベクターを得た。

〔各種抗体の発現と精製〕
（ＩＩ−ｉ）遺伝子導入
市販のキットを用いて発現ベクター各種を遺伝子導入品質で精製した後、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１２３４７−０１９）を用いて、メーカー指図書に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｒ７９０−０７）に遺伝子導入した。
（ＩＩ−ｉｉ）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
培養上清から親抗体（多重特異性抗体を形成する元となった個々の抗体）などを精製する場合は、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ ＨＰカラムまたはＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用い、メーカー指図書に従ってバルク精製を行った。得られた精製分画は、ＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０７％のＴｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．０）に対して透析し、使用時まで４℃で保存した。

（ＩＩ−ｉｉｉ）強陽イオン交換クロマトグラフィーによる二重特異性抗体の精製
強陽イオン交換カラムＰＬ−ＳＣＸ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、４．６φ×１５０ｍｍ、１０００Å）を用いた。移動相Ａ液（１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０）、移動相Ｂ液（５００ｍＭ ＮａＣｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０）、および流速１ｍＬ／ｍｉｎにおいて、移動相Ｂ液の混合率を２％とした初期移動相をカラム体積換算で５倍量以上を送液し、予めカラムを平衡化しておく。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した０．２〜１ｍｇの弱結合分画（重鎖［１］［３］型ヘテロ体＝二重特異性抗体）をロードし（０ｍｉｎ）、カラムに電荷的に結合させた。上記初期移動相で５分間洗浄後（０→５ｍｉｎ）、Ｂ液の混合率を０．８％／ｍｉｎ増の直線勾配で４７．５分間流し（５→５２．５ｍｉｎ、２→４０％）、結合成分の回収を順次行った。その後、直ちにＢ液混合率を１００％とし、カラムの洗浄を行った。この間、２８０ｎｍにおける吸収を記録し、タンパク質の溶出挙動をモニターした。回収した二重特異性抗体（メインピーク）は、必要に応じて、ＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．０）に対して透析し、４℃で保存した。

〔抗体の特性解析〕
（ＩＩＩ−ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製した二重特異性抗体が設計通りの分子量であることの確認は、以下の手順で非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。また、その結果から軽鎖−重鎖間の結合限定化具合も確認した。
各試料はサンプル処理液（コスモバイオ製、４２３４２０：トリスＳＤＳサンプル処理液、など）を用いてＳＤＳ化した後、適当なアクリルアミド濃度のプレキャストゲル（マリソル製、ＧＭ−１０２０−３Ｎ：長生１０−２０％、など）に供して、ＳＤＳ含有、非還元条件下で泳動した。続いてゲルは、一般的に使用される染色方法、例えば、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液による染色を施し、タンパク質バンドの可視化を行った。

（ＩＩＩ−ｉｉ）Ｆ（ａｂ’） _２ 解析
二重特異性抗体は両方の親抗体に由来する２種のＦａｂを同時に有しているため、それからＦ（ａｂ’）_２を調製した場合、両方の親抗体由来のそれの中間的な性質を呈するという物理化学的特徴を有する。構造的に真に二重特異性であることの確認は、精製した二重特異性抗体を用いて、以下の手順でペプシン処理およびＦ（ａｂ’）_２解析を行った。
精製した二重特異性抗体（透析処理なし）５０μｇを、０．０７％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に対して終濃度で１０μｇ／１００μＬ前後となるよう溶解後、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で膨潤させた固相化ペプシン（シグマ社、Ｐｅｐｓｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ、など）を基質５０μｇあたり８．５Ｕ添加した。これを１２０ｒｐｍで振盪しつつ、３７℃で１時間、切断反応させた後、遠心分離型フィルター（宝酒造製、９０４０：ＳＵＰＲＥＣ−０１、など）で処理し、そのろ過液を回収した。直ちに３０％体積量の２．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加・撹拌して、反応液を中和させた。続いて、強陽イオン交換カラムＰＬ−ＳＣＸを用いたＨＰＬＣにおける移動相Ａ液に、０．０７％となるようＴｗｅｅｎ−８０を添加した緩衝液を用いて透析、または脱塩カラム処理を行った後、上記（ＩＩ−ｉｉｉ）に従って強陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行った。

（ＩＩＩ−ｉｉｉ）Ｆａｂ解析
二重特異性抗体は両方の親抗体に由来する２種のＦａｂを同時に有しているため、それからＦａｂを調製した場合、両方の親抗体に由来する２種のＦａｂが検出されるという物理化学的特徴を有する。構造的に真に二重特異性であることの確認は、精製した二重特異性抗体を用いて、以下の手順でパパイン処理およびＦａｂ解析を行った。
精製した二重特異性抗体６０μｇを、２００μＬのＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．０）に溶解後、３０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、３０μＬの１０ｍＭシステイン、および０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で膨潤させた固相化パパイン（シグマ社、Ｐ−４４０６：Ｐａｐａｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘ、など）を基質６０μｇあたり０．１２Ｕ添加した。これをＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．０）で３００μＬにメスアップした後、１２０ｒｐｍで振盪しつつ、３７℃で１６時間、切断反応させた。続いて、上記（ＩＩＩ−ｉｉ）と同様に遠心分離型フィルターで処理してろ過液を回収後、透析または脱塩カラム処理による緩衝液の交換を経て、上記（ＩＩ−ｉｉｉ）に従って強陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行った。

（ＩＩＩ−ｉｖ）抗原結合能解析
二重特異性抗体は両方の親抗体に由来する２種のＦａｂを同時に有しているため、対応する抗原を発現している標的細胞の両方に結合可能という生物学的特徴を有する。構造的に真に二重特異性であることの確認は、精製した二重特異性抗体を用いて、以下の手順で結合能解析を行った。
標的細胞を２ｘ１０_５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌディッシュに播いた後、５％のＦＢＳを含むＰＢＳ（５％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に溶解した各濃度の二重特異性抗体試料を５０μＬ添加し、細胞を分散させた。氷上で３０ｍｉｎ反応させた後、２００μＬの５％ＦＢＳ／ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。次いで、５％ＦＢＳ／ＰＢＳで希釈したＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識の抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（例えば、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、７０９−１８１７、１００倍希釈）を５０μＬ添加し、再度、細胞を分散させた。氷上で３０ｍｉｎ反応させた後、先と同様に２回洗浄した。最後に２００μＬの１％ホルマリンに分散させた後、フローサイトメーターにて個々の標的細胞が呈する蛍光量を測定し平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。

［非天然型ジスルフィド結合導入変異体候補の選定］
計算化学ソフト「ＭＯＥ」で探索した結果、κ鎖では野生型抗体に存在する既存のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を作る可能性が高い１組を除いて、９組の非天然型ジスルフィド結合を導入可能な残基対候補として見出した。それらの位置、α炭素間距離（Ｃα−Ｃα‘）およびβ炭素間距離（Ｃβ−Ｃβ’）を表３に示す。また、λ鎖では、５組の非天然型ジスルフィド結合を導入可能な残基対候補として見出した。それらの位置、α炭素間距離（Ｃα−Ｃα‘）およびβ炭素間距離（Ｃβ−Ｃβ’）を表４に示す。尚、軽鎖がλ鎖のアミノ酸残基の番号付けは、κ鎖との配列比較により定めた。

非天然型ジスルフィド結合導入箇所の探索結果の一覧

表３に記載の各変異体が軽鎖−重鎖間で非天然型ジスルフィド結合を形成するか実際に発現させて確認した。発現ベクター上の野生型抗ＣＤ２０抗体遺伝子および野生型抗ＣＤ３７抗体遺伝子に表３に記載のＣｙｓ１ｍ（ａ）〜（ｉ）の各変異を個別に導入後、各々をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞に遺伝子導入・発現させ、その培養上清から抗体成分をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにて簡易精製した。それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図５および図６に示す。Ｃｙｓ１ｍ（ｅ）を除く変異体では、野生型と同等な分子量を示す約１５０ｋＤａの位置にメインバンドが観察された。
また、表４に記載の各変異体についても軽鎖−重鎖間で非天然型ジスルフィド結合を形成するか実際に発現させて確認した。発現ベクター上の野生型抗ＣＤ２０抗体のＣＬ領域の遺伝子にλ１型ＣＬの遺伝子を移植し、λ１型ＣＬ遺伝子発現ベクターとした。このλ１型ＣＬ遺伝子発現ベクターに、表４に記載のＣｙｓ１ｍ（ｊ）〜（ｎ）の各変異を個別に導入後、上記と同様に、各々をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞に遺伝子導入・発現させ、その培養上清から抗体成分をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにて簡易精製した。それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図７に示す。全ての変異体において、野生型と同等な分子量が約１５０ｋＤａの位置にメインバンドが観察された。従って、Ｃｙｓ１ｍ変異の導入により、軽鎖−重鎖間で非天然型ジスルフィド結合を形成することができ、抗体の軽鎖のサブタイプに依存せず適用可能であることが確認された。

一方、発現ベクター上の野生型抗ＨＥＲ２抗体遺伝子、抗ＥＧＦＲ抗体遺伝子および抗ＣＤ５２抗体遺伝子に、表３記載のＣｙｓ１ｍ（ｆ）の変異を導入後、上記と同様にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞に遺伝子導入・発現させ、その培養上清から抗体成分をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにて簡易精製して、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図８に示す。Ｃｙｓ１ｍ（ｆ）型変異を導入したいずれの抗体も野生型と同等な分子量を示す約１５０ｋＤａの位置にメインバンドが観察され、Ｃｙｓ１ｍ変異の導入は抗体の可変部領域の配列に依存せず適用可能であることが確認された。

次に、軽鎖あるいは重鎖の各変異体が天然型の軽鎖あるいは重鎖とジスルフィド結合を形成しないかを確認した。発現ベクター上の野生型抗ＣＤ２０抗体の軽鎖遺伝子または重鎖遺伝子の一方に上記変異を導入し、それらを用いて上記と同様に発現実験とその確認のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。軽鎖に変異を導入した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９および図１０に示す。κ鎖Ｓ１２１Ｃ（Ｃｙｓ１ｍ（ｄ）と（ｅ）で使用）とλ鎖Ｅ１２４Ｃ（Ｃｙｓ１ｍ（ｋ）で使用）を除く軽鎖変異体では、重鎖二量体および軽鎖と思われる位置にバンドが観察され、野生型と同等な分子量が約１５０ｋＤａの位置にはバンドが見られなかった。一方、重鎖に変異を導入した場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０と図１１に示す。重鎖Ｓ１３４Ｃ（Ｃｙｓ１ｍ（ａ）で使用）を除く重鎖変異体では、軽鎖の単量体、ならびに重鎖の二量体および単量体と思われる位置にバンドが観察され、野生型と同等な分子量が約１５０ｋＤａの位置にはバンドが見られなかった。従って、軽鎖あるいは重鎖の各変異体が天然型の軽鎖あるいは重鎖とジスルフィド結合を形成しないことが明らかとなった。

最後に、定常領域に導入した非天然型ジスルフィド結合により抗原結合能が影響を受けていないかの確認を行った。ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにて簡易精製したＣｙｓ１ｍ型の抗ＣＤ２０抗体を用いて、ＣＤ２０抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞に対する抗原結合能を調べた結果を図１２〜図１６に示す。Ｃｙｓ１ｍ（ａ）〜（ｎ）変異体の抗原結合能は、野生型抗体（ｗｔ）のそれとほとんど差は見られなかった。
また、非天然型ジスルフィド結合を有する抗ＣＤ３７抗体（Ｃｙｓ１ｍ型抗ＣＤ３７抗体）に対し、ＣＤ３７抗原を発現しているＲａｍｏｓ細胞を用いて、抗ＣＤ２０抗体の実験と同様にＣｙｓ１ｍ（ａ）〜（ｉ）変異体の抗原結合能を調べたところ、抗ＣＤ２０抗体の場合と同様の結果を示した（図１７〜１９）。
以上の結果を総合すると、上記実験での非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、天然型ジスルフィド結合との交差が少なく、高い結合選択性を有していた。また、導入した非天然型ジスルフィド結合は抗原結合能に対して影響しなかった。

〔二重特異性抗体の調製〕
発現実験に用いた非天然型ジスルフィド結合を有する抗ＣＤ２０抗体（αＣＤ２０）の組み合わせ相手として、抗ＤＲ５抗体（αＤＲ５）および抗ＣＤ３７抗体（αＣＤ３７）を用いて、二重特異性抗体の調製を行った。実施例に用いたＣｙｓ１ｍは、（ｂ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）の５種類であり、αＣＤ２０に導入した。重鎖ヘテロ体（［１］［３］結合体）を精製するためのプロテインＡ親和性欠失変異はαＤＲ５、αＣＤ３７またはαＣＤ２０に導入した（［３］と表記）。
二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５の調製時におけるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの結果を図２０に示す。ロード直後の洗浄中に見られる最初の大きなピークはプロテインＡに結合できなかった重鎖［３］［３］型ホモ体（αＤＲ５に該当）である。その後の溶出操作により、３５〜４０分付近に弱結合性の重鎖［１］［３］型へテロ体（αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５、二重特異性抗体に該当）が、続いて５５〜６０分付近に強結合性の重鎖［１］［１］型ホモ体（αＣＤ２０に該当）が回収された。いずれの非天然型ジスルフィド結合導入変異体においても野生型（ｗｔ）と同一の溶出プロフィールであり、変異導入は当該精製法に悪影響を及ぼしていなかった。同じ組み合わせにおいてプロテインＡ親和性欠失変異［３］をαＣＤ２０に導入したαＤＲ５／αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）の場合であっても同様に３本のピークとなって溶出した（データ非掲載）。

もう一方の組み合わせである二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７の組み合わせについても同様の実験を行ったところ、同様に３本のピークとなって溶出され、溶出時間の早い方から、αＣＤ３７（重鎖［３］［３］型ホモ体）、αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７（重鎖［１］［３］型へテロ体）、αＣＤ２０（重鎖［１］［１］型ホモ体）に該当していた。
各々について重鎖［１］［３］型へテロ体（二重特異性抗体）分画を回収し、緩衝液の交換の後、強陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、そのメインピークを回収した。再度、緩衝液の交換を行い、二重特異性抗体の最終精製品とした。

〔二重特異性抗体の品質確認〕
異なった２種の抗原に同時に結合し得る二重特異性抗体では、各々の抗原を認識し得る２種の親抗体に由来するＦａｂを同時に有しているため、そのＦ（ａｂ’）_２解析では、理論上、両親抗体から調製したＦ（ａｂ’）_２の場合の中間的な溶出時間に１本のピークが検出される。精製した二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５を酵素ペプシンで処理し、Ｆ（ａｂ’）_２解析した結果を図２１に示す。本試料では、３３ｍｉｎ付近にメインピークが見られ、これが二重特異性抗体のＦ（ａｂ’）_２に該当する。その溶出時間は、図２２に示す別途解析した親抗体αＤＲ５（３０ｍｉｎ）およびαＣＤ２０（３６ｍｉｎ）の中間である。
もう一方の組み合わせである二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７の場合の結果を図２３に示す。当該組み合わせにおいては３０ｍｉｎ過ぎにＦ（ａｂ’）_２のピークが見られた。当該組み合わせにおいても先と同様に、親抗体αＣＤ３７（２５ｍｉｎ）およびαＣＤ２０（３６ｍｉｎ）の中間の溶出時間であった（図２４）。

異なった２種の抗原に同時に結合し得る二重特異性抗体では、各々の抗原を認識する２種の親抗体に由来するＦａｂを同時に有しているため、そのＦａｂ解析では、両親抗体から調製したＦａｂの場合のそれぞれと同一溶出時間に２本のピークが検出される。精製した二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５をパパインで処理し、Ｆａｂ解析した結果を図２５に示す。各試料で共通する１８ｍｉｎ付近のピークは、パパイン切断によって生じたＦｃである。一方、２５．５ｍｉｎ付近のピークはαＤＲ５特異的な、また、２９〜３０ｍｉｎのピークはαＣＤ２０特異的なＦａｂである（図２６）。別途調製した強制的に軽鎖誤結合させた抗体試料の解析結果から、当該組み合わせにおける軽鎖誤結合体のＦａｂは、αＤＲ５（軽鎖）−αＣＤ２０（重鎖）の場合では２２ｍｉｎ付近に、他方、αＣＤ２０（軽鎖）−αＤＲ５（重鎖）の場合では３７ｍｉｎ付近に溶出する（図２６）。これらの誤結合Ｆａｂなどの不純物に由来するピークは、本精製試料３種では全く検出されなかった。

二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７のＦａｂ解析の結果を図２７に示す。また、それぞれの親抗体を解析した結果を図２７に示す。いずれの二重特異性抗体試料においても上述と同様な結果であった。即ち、１８ｍｉｎ付近にＦｃのピークが、また２３ｍｉｎ付近にαＣＤ３７のＦａｂのピーク、２９〜３０ｍｉｎにαＣＤ２０のＦａｂのピークが検出された。別途調製した強制誤結合抗体を解析した結果、当該組み合わせにおける軽鎖誤結合体のＦａｂは、αＣＤ３７（軽鎖）−αＣＤ２０（重鎖）の場合では２２．５ｍｉｎ付近に、他方、αＣＤ２０（軽鎖）−αＣＤ３７（重鎖）の場合では２８ｍｉｎ付近と３１ｍｉｎ付近に溶出する（図２８）。これらの誤結合Ｆａｂなどの不純物に由来するピークは、本精製試料３種では、全く検出されなかった。

非天然型ジスルフィド結合の導入による軽鎖−重鎖間の結合限定化の効果を端的に明示できるよう、プロテインＡアフィニティー精製試料を用いたＦａｂ解析で示す。二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＤＲ５の結果を図２９に、同αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７の結果を図３０に示す。変異を導入していない野生型の場合、いずれの組み合わせ例とも、それぞれ２種の誤結合Ｆａｂが目立って検出された。一方、変異を導入した場合、それらは激減し、特にＣｙｓ１ｍ（ｆ）と同（ｇ）の場合では僅かに検出される程度であった。

二重特異性抗体αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７が機能的な二重特異性抗体であることを図３１および３２に示す。陰性対照である親抗体αＣＤ３７（ｗｔ）が結合できない状況において、αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７はＣＤ２０陽性ＣＤ３７陰性細胞（ＳＰ２／０細胞にＣＤ２０遺伝子を導入し、その発現をＦＡＣＳで確認したもの）に対して、明らかに結合能を有していた。もう一方の測定細胞であるＣＤ２０陰性ＣＤ３７陽性細胞（ＳＰ２／０細胞にＣＤ３７遺伝子を導入し、その発現をＦＡＣＳで確認したもの）に対しても、陰性対照である親抗体αＣＤ２０（ｗｔ）が結合できない状況において、αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）／αＣＤ３７は結合能を有していた。二重特異性抗体αＤＲ５／αＣＤ２０（Ｃｙｓ１ｍ）においても同様に機能的に二重特異性であるという結果が得られ（図３３および３４）、当該技術の有用性が普遍的であること示された。

以上で示した結果から、本発明の非天然型ジスルフィド結合を用いた鎖間結合限定化技術により、二重特異性抗体等の相違するＦａｂ領域を有する抗体を、効率良く簡便に作製できることが確認された。

以上、発明を実施するための形態の記載により説明される各種の形態は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
なお、本明細書に引用された特許、特許出願、および出版物の開示内容は全て、参照により本明細書に援用される。

Claims (7)

1. 少なくとも二つの相違するＦａｂ領域を含む抗体であって、
   少なくとも一つのＦａｂ領域が、ＣＬ領域とＣＨ１領域との間で非天然型ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、それにより非天然型ジスルフィド結合が形成されており、
   前記非天然型ジスルフィド結合の存在により、Ｆａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間のジスルフィド結合の位置が、他の少なくとも一つのＦａｂ領域におけるＣＬ領域とＣＨ１領域との間でのジスルフィド結合の位置と異なり、
   軽鎖１２４位−重鎖１２６位、軽鎖１６２位−重鎖１７０位、軽鎖１６２位−重鎖１７１位、及び軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成されている、抗体。
2. 二つの相違するＦａｂ領域を含む、請求項１に記載の抗体。
3. 抗体が二重特異性抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 抗体が、少なくとも二つの抗体断片を直接的に連結したものである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の抗体。
5. 抗体のＦｃ領域が他の分子により置換されている、請求項１ないし４の何れか一項に記載の抗体。
6. 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１ないし５の何れか一項に記載の抗体。
7. 軽鎖がκ鎖の場合のｆ）軽鎖１２４位−重鎖１２６位およびｇ）軽鎖１６２位−重鎖１７０位、並びに軽鎖がλ鎖の場合のｈ）軽鎖１６２位−重鎖１７１位、およびｉ）軽鎖１６２位−重鎖１７３位から選択される少なくとも一組の軽鎖−重鎖の位置に導入されたシステイン残基により非天然型ジスルフィド結合が形成されている、請求項６に記載の抗体。