JP7076571B2 - 細胞エンゲージ結合分子 - Google Patents
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Description
本願は、2018年4月10日に出願した米国特許仮出願第62/655,762号および2018年8月17日に出願した米国特許仮出願第62/719,484号からの優先権の利益を主張するものである。本願は、さらに、2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,172号、2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,190号、および2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,196号からの優先権の利益を主張するものである。上述の出願の各々は、それら全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本願には、EFS-Web経由で提出したASCIIテキスト書式でのコンピュータ読み取り可能な形式(CRF)の配列表が参照により組み込まれる。14489-004-228_SEQ_LISTING.txtと題するEFS-Web経由で提出した前記配列表テキストファイルは、2019年4月2日に作成したものであり、サイズ140,862バイトである。
本開示は、一般に、細胞エンゲージ結合分子(cell engaging binding molecule)、前記結合分子を作製する方法、前記結合分子を含む組成物、およびそれらの使用に関する。
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域(variable heavy(VH)region)と第1の定常重鎖1(CH1)領域(constant heavy 1(CH1)region)と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域(variable light(VL)region)とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
細胞結合分子が、提供される。
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
医薬組成物が、提供される。
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
方法が、提供される。
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、プログラム死-リガンド1(PD-L1)に結合し、前記Fv領域が、表面抗原分類3(CD3)に結合する、
結合分子が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
結合分子が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
方法が、提供される。
第1および第2のFab領域の各々のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、
第1および第2のFab領域の各々のVL領域が、配列番号8のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物が、提供される。
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法が、提供される。
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20または上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
結合分子が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物が、提供される。
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法が、提供される。
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、前記2つの抗体Fab領域各々が抗原に結合する、
第1の抗体結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第2の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し;
前記第1の抗原結合ドメインと前記第2の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子が、本明細書で提供される。
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成する、
結合分子が、本明細書で提供される。
前記1つまたは複数のベクターが、
(a)各々が抗体軽鎖である第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができる、
方法が、本明細書で提供される。
1.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
結合分子。
2.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態1の結合分子。
3.第1のFab領域および第2のFab領域が、融合によってFv領域に連結されている、実施形態2の結合分子。
4.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態2の結合分子。
5.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態4の結合分子。
6.抗体ヒンジ領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態5の結合分子。
7.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態4の結合分子。
8.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態4の結合分子。
9.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態8の結合分子。
10.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列の2つのタンデムコピーを含む、実施形態9の結合分子。
11.第1のFab領域および第2のFab領域が、第1の抗原の同じエピトープに結合する、実施形態1の結合分子。
12.第2の抗原が、免疫細胞上に発現される、実施形態1の結合分子。
13.免疫細胞が、リンパ球および単球からなる群から選択される、実施形態12の結合分子。
14.免疫細胞が、エフェクター細胞である、実施形態12の結合分子。
15.免疫細胞が、T細胞、B細胞、樹状細胞、顆粒細胞、自然リンパ系細胞、巨核球、単球、骨髄系由来サプレッサー細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞からなる群から選択される、実施形態12の結合分子。
16.第1の抗原が、がん抗原である、実施形態1の結合分子。
17.がん抗原が、腫瘍関連抗原(TAA)または腫瘍特異的抗原(TSA)である、実施形態16の結合分子。
18.第1の抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態1の結合分子。
19.第2の抗原が、CD3またはTNFアルファである、実施形態12の結合分子。
20.第1の抗原が、がん抗原であり、第2の抗原が、CD3である、実施形態16の結合分子。
21.がん抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態20の結合分子。
22.以下のことを含む、結合分子を作製する方法:
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
ものである、こと;および
23.第1のFab領域および第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態22の方法。
24.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に形成された鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態23の方法。
25.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態23の方法。
26.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態25の方法。
27.第1の抗原が、がん抗原であり、第2の抗原が、CD3である、実施形態22の方法。
28.第1の抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態22の方法。
29.結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
医薬組成物。
30.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
方法。
31.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、プログラム死-リガンド1(PD-L1)に結合し、前記Fv領域が、表面抗原分類3(CD3)に結合する、
結合分子。
32.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態31の結合分子。
33.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態32の結合分子。
34.第1のFab領域および第2のFab領域が、融合によってFv領域に連結されている、実施形態33の結合分子。
35.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態33の結合分子。
36.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態35の結合分子。
37.抗体ヒンジ領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態36の結合分子。
38.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態35の結合分子。
39.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態35の結合分子。
40.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態39の結合分子。
41.リンカーが、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む、実施形態40の結合分子。
42.リンカーが、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む、実施形態40の結合分子。
43.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態32の結合分子。
44.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号3のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含む、実施形態32の結合分子。
45.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号95のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドが、配列番号96のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチドが、配列番号97のアミノ酸配列を含む、実施形態32の結合分子。
46.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号95のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号98のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号99のアミノ酸配列を有する、実施形態32の結合分子。
47.結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法。
48.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態47の方法。
49.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態48の方法。
50.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態49の方法。
51.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態50の方法。
52.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態50の方法。
53.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態20の方法。
54.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態53の方法。
55.リンカーが、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む、実施形態54の方法。
56.リンカーが、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む、実施形態54の方法。
57.第1および第2のFab領域の各々のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、
第1および第2のFab領域の各々のVL領域が、配列番号8のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態48の方法。
58.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を有する、実施形態48に記載の方法。
59.結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物。
60.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法。
61.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20または上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
結合分子。
62.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態61の結合分子。
63.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態62の結合分子。
64.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態63の結合分子。
65.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態64の結合分子。
66.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態64の結合分子。
67.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態62の結合分子。
68.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を有する、実施形態62の結合分子。
69.第1のFab領域および第2のFab領域が、EGFRに結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態61の結合分子。
70.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態69の結合分子。
71.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態70の結合分子。
72.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態71の結合分子。
73.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態70の結合分子。
74.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態69の結合分子。
75.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号38のアミノ酸配列を有する、実施形態69の結合分子。
76.結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法。
77.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態76の方法。
78.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態77の方法。
79.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態78の結合分子。
80.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態79の結合分子。
81.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態77の方法。
82.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を有する、請求項77に記載の方法。
83.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態87の方法。
84.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態83の方法。
85.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態84の方法。
86.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態85の方法。
87.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態83の方法。
88.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号38のアミノ酸配列を有する、請求項83に記載の方法。
89.結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物。
90.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法。
本明細書で記載または参照される技術および手順は、当業者によって、一般的に十分に理解されているものおよび/または従来の方法論、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010);およびAntibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Duebel eds., 2d ed. 2010)に記載される広く利用される方法論を使用して一般に使用されるものを含む。
複数の抗原結合ドメイン(例えば、2つの抗原結合ドメイン)を含む結合分子(ALiCE)が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の複数の抗原結合ドメインは、細胞をエンゲージする、細胞を免疫細胞に互いに近づける、または免疫細胞を再度方向付けするために有用である。
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体重鎖可変(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
前記2つの抗体Fab領域が各々抗原に結合する、第1の抗体結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第2の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し、
前記第1の抗原結合ドメインと前記第2の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子を提供する。
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号59)
本明細書で提供されるFab領域の代表的なCH1領域は、以下のアミノ酸配列を有する:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(配列番号60)
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
前記第1の部分および第2の部分が、別々のポリペプチド上にあり、
第1の抗原に結合する、第1の抗原結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインであって、VH領域およびVL領域は、別々のポリペプチド上にあり、免疫細胞上に存在する第2の抗原に結合する、第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1の抗原および第2の抗原は、異なる抗原である。
(a)第1の抗体Fab領域および第2の抗体Fab領域を含み、各々が
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
第1の抗原に結合する、第1の抗原結合ドメインと、
(b)VH領域および抗体可変軽鎖(VL)領域を含む抗体Fv領域を含み、免疫細胞上に存在する第2の抗原と結合する第、2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1の抗原および前記第2の抗原は、異なる抗原であり、
第1のFab領域の第1の部分およびFv領域のVH領域は、同じポリペプチド上にあり、第2のFab領域の第1の部分およびFv領域のVL領域は、同じポリペプチド上にある。
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの第1のVH領域および前記第1のCH1領域とは、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの第3のVH領域および前記第2のCH1領域とは、第2の抗原Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドのVL領域とは、抗原結合Fv領域を形成する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される結合分子をコードするポリヌクレオチドを包含する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本開示のポリヌクレオチドは、RNAの形態である場合も、DNAの形態である場合もある。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含み、二本鎖である場合も一本鎖である場合もあり、一本鎖は、コーディング鎖である場合も、非コーディング(アンチセンス)鎖である場合もある。
さらに別の態様では、本明細書で提供される種々の結合分子を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、1つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、1つまたは複数のベクターが、
(a)各々が抗体軽鎖である第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドのVL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができる、
方法が、本明細書において提供される。
一態様では、本開示は、本開示の少なくとも1つの結合分子を含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される結合分子の治療有効量および薬学的に許容される担体を含む。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される結合分子を含む、疾患または状態の予防、管理、処置および/または改善における使用のための組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の予防における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんはPD-L1陽性がんである。一部の実施形態では、がんは肺がんである。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)である。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは乳がんである。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。ある特定の実施形態では、対象はそれを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の予防、管理、処置または改善をもたらす。
本実施例は、本明細書で提供される例示的結合分子(図1A~1Eに例示する)、特に、結合分子ACE-00、ACE-02、ACE-03、ACE-04、ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11およびACE-12のコンストラクションおよび発現を例示する。例示的結合分子のそれぞれにおいて第1および第2の抗原を標的化する構成成分を下の表に要約する。
太字:VHまたはVL;
太字および下線:CDR;
斜字体:抗体ヒンジ領域;
小文字:可動性リンカー;
[角括弧]:CH1;
[角括弧および下線]:CL
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、その第2の抗原結合Fv領域がTNFアルファに結合し、その第1の抗原結合ドメイン(Fab領域)がHer2抗原に結合するACE-00を発現させるために使用した(図2Fを参照されたい)。ACE-00は、図1Aに例示する例示的結合分子と同じ全体構造を有する。簡潔には、ACE-00は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-00-VHおよびACE-00-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-00-LC)を含有する。ACE-00の抗Her2ドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、トラスツズマブであり、ACE-00の抗TNFアルファドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、アダリムマブである。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-00-VHアミノ酸配列:
ACE-00-VLアミノ酸配列:
ACE-00-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-02を発現させるために使用した。ACE-02は、抗CD19およびヒト化抗CD3 12F6ドメインからなる。ACE-02は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-02-VHおよびACE-02-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-02-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ACE-02-VHアミノ酸配列:
ACE-02-VLアミノ酸配列:
ACE-02-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
ACE-02-VHヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTACACCAAGTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGCTTCACCATCAGCGCCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGCTGGCAGGACTACGACGTGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(配列番号100)
ACE-02-VLヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTTCTGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(配列番号101)
ACE-02-LCヌクレオチド配列(抗CD19抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号102)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-03を発現させるために使用した。ACE-03は、抗CD19およびヒト化抗CD3 OKT3ドメインからなる。ACE-03は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-03-VHおよびACE-03-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-03-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-03-VHアミノ酸配列:
ACE-03-VLアミノ酸配列:
ACE-03-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
ACE-03-VHヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACCGCTTCACCATCAGCACCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(配列番号103)
ACE-03-VLヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(配列番号104)
ACE-03-LCヌクレオチド配列(抗CD19抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号102)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-04を発現させるために使用した。ACE-04は、抗PD-L1およびキメラOKT3 Fabドメインからなる(図4Aを参照されたい)。ACE-04は、2つの異なる重鎖様鎖ACE-04-VH(VL-CL-VH-CH1)およびACE-04-VL(VH-CH1-VL-CL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-04-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ACE-04-VHアミノ酸配列:
ACE-04-VLアミノ酸配列:
ACE-04-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
ACE-04-VHヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGAGCCGAGCTCGCCAGGCCAGGAGCCTCCGTCAAAATGTCATGCAAGGCCTCAGGGTACACATTTACGCGATATACCATGCACTGGGTGAAACAAAGACCAGGTCAGGGACTTGAATGGATCGGTTACATTAACCCCTCTAGAGGCTATACGAATTACAACCAGAAATTCAAAGACAAAGCAACACTTACGACTGACAAATCCAGTAGTACGGCTTACATGCAGCTCTCATCTTTGACTTCAGAAGACTCTGCTGTATATTATTGTGCCCGCTATTACGATGACCATTACTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGCACTACTGTTACCGTAAGTGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTTGA(配列番号105)
ACE-04-VLヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGATCGTCCTCACTCAAAGTCCTGCTATTATGTCCGCAAGCCCTGGTGAAAAGGTTACCATGACTTGCTCCGCATCTAGTTCTGTCTCTTACATGAACTGGTACCAGCAAAAGTCTGGAACGTCCCCGAAAAGGTGGATATATGATACGAGCAAATTGGCAAGCGGAGTACCCGCGCATTTTAGGGGTTCAGGCAGCGGTACGTCATATAGCCTGACTATTAGCGGAATGGAGGCGGAGGATGCTGCAACATATTATTGCCAACAATGGTCATCAAATCCTTTTACTTTCGGCTCAGGCACAAAACTTGAAATAAATAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGcTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号106)
ACE-04-LC(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供される別のALiCE分子ACE-05(抗PD-L1および抗CD3ドメインからなる結合分子;図4Bを参照されたい)を発現させるために使用した。ACE-05は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-05-VHおよびACE-05-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-05-LC)を含有する。ACE-05は、可動性ペプチド領域中にG4Sリンカー(GGGGSのアミノ酸配列、配列番号112)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-05-VHアミノ酸配列:
ACE-05-VLアミノ酸配列:
ACE-05-LCアミノ酸配列:
ACE-05-VHヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号20)
ACE-05-VLヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号21)
ACE-05-LCヌクレオチド配列:
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGAaccGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号22)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を上のセクションにおいて記載したのと同様の方法を使用して、ACE-09(抗PD-L1およびUCHT1ドメインからなる結合分子)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-09は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-09-VHおよびACE-09-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-09-LC)を含有する(図5下)。ACE-05と比較して、ACE-09は、ACE-05が可動性ペプチド領域に含有するG4Sリンカー(GGGGSのアミノ酸配列)を含有しない(図5下)。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は下のとおりである:
ACE-09-VHアミノ酸配列(G4Sリンカーを含まない):
ACE-09-VLアミノ酸配列(G4Sリンカーを含まない):
ACE-09-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
ACE-09-VHヌクレオチド配列(G4Sリンカーを含まない):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号108)
ACE-09-VLヌクレオチド配列(G4Sリンカーを含まない):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号109)
ACE-09-LCヌクレオチド配列(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)も上のセクション1.1およびセクション1.2に記載されたのと同様の方法を使用してACE-10(抗CD20および抗CD3ドメインからなる結合分子;図6Aを参照されたい)の適切な発現およびアセンブリーを実証するために使用した。ACE-10は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-10-VHおよびACE-10-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-10-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-10-VHアミノ酸配列:
ACE-10-VLアミノ酸配列:
ACE-10-LCアミノ酸配列:
ACE-10-VHヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号34)
ACE-10-VLヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号35)
ACE-10-LCヌクレオチド配列:
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCtGCtATCCTGAGCGCCAGCCCtGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号36)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、上のセクション1.1およびセクション1.2に記載されたのと同様の方法を使用してACE-11(抗EGFRおよび抗CD3ドメインからなる結合分子;図7Aを参照されたい)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-11は、ACE-05およびACE-10と同じ全体構造を有し、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-11-VHおよびACE-11-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-11-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-11-VHアミノ酸配列:
ACE-11-VLアミノ酸配列:
ACE-11-LCアミノ酸配列:
ACE-11-VHヌクレオチド配列:
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号48)
ACE-11-VLヌクレオチド配列:
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号49)
ACE-11-LCヌクレオチド配列:
GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号50)
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、上のセクションに記載したのと同様の方法を使用してACE-12(抗PD-L1およびUCHT1ドメインからなる結合分子)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-12は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-12-VHおよびACE-12-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-12-LC)を含有する。ACE-12は、GGGGSGGGGS(配列番号113)およびGGSGGGGSG(配列番号114)のアミノ酸配列を有するG4Sリンカーを含有する、一方でACE-05は、GGGGSのアミノ酸配列を可動性ペプチド領域に有するG4Sリンカーを含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-12-VHアミノ酸配列(10残基GGGGSGGGGSを含む):
ACE-12-VLアミノ酸配列(9残基GGSGGGGSGを含む):
ACE-12-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
ACE-12-VHヌクレオチド配列(10残基GGGGSGGGGSを含む):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号110)
ACE-12-VLヌクレオチド配列(9残基GGSGGGGSGを含む):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号111)
ACE-12-LCヌクレオチド配列(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
ACE-00およびACE-00-VL2のTNFアルファへの親和性を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。Bmaxは、実験結果から外挿された最大結合親和性である(GraphPad Prism software7で提供されるカーブフィッティング法を使用した算出した)。図9に示すとおり、親抗体アダリムマブのTNFアルファへのKDは、1.125nMであると判定され;TNFアルファに対して一価結合ドメインだけを有するACE-00のKDは、30.03nMであると判定され;ACE-00-VLホモ二量体からなるACE-00-VL2は、TNFアルファに対して親和性を有さないことが決定された。
ACE-05のヒトPD-L1およびCD3への結合動態を表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して測定した。OCTET(登録商標)QKe system(ForteBio、USA)を使用する標識フリー動態(タンパク質-タンパク質相互作用)の測定をヒトPD-L1について抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(ForteBio、USA)、およびCD3εδ鎖についてアミン反応性(ARG2)バイオセンサーを使用して実施した。PD-L1およびCD3εδをそれらそれぞれのバイオセンサー表面に固定し、さまざまな濃度に動態緩衝剤を用いて希釈したACE-05を用いて連続的に反応させた。センサーグラムを経時的に回収した。ACE-05[すなわち、抗hPD-L1抗体(YBL-007、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生)を作製するために使用した親抗体と抗CD3抗体(UCHT1、BioLegend、USAから)]とを検査し、この実験においてACE-05と比較した。図12A~12Cに示すとおり、ACE-05のヒトPD-L1への結合動態は親抗PD-L1抗体(すなわちYBL-007、Y-Biologics、Inc.から)に匹敵し、KDは1.09×10-11未満であった(図12A~12Cを参照されたい)。対照的におよび予測されたとおり、ACE-05のCD3への結合親和性は、親抗CD3抗体(BioLegend、USAからのUCHT1)よりさらに低く、KDは6.82×10-9であると判定された(図5Cを参照されたい)。図12A~12Cに示すとおり、ACE-05の結合動態を二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、すなわち、BiTE-05とも比較した。BiTEは、異なる抗体の2つの一本鎖可変断片(scFv)または4つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質を、約55キロダルトンの単一ペプチド鎖上に生成する既存の二重特異性抗体技術である。BiTE技術のさらに詳細な記載は、例えば、Huehls et al., Immunol Cell Biol., 2015, 93(3): 290-296;Baeuerle et al., Drug Discovery Today, 2005, 10: 1237-1244;およびKufer et al., Trends in Biotechnology, 2004, 22(5): 238-244に見出すことができる。ACE-05は、BiTE-05よりもヒトPD-L1により高い親和性を有することが実証された。一方、ACE-05は、BiTE-05よりもCD3に低い親和性を有することが実証され、それによりBiTE-05よりも少ない細胞傷害性を有することが予測された。
ACE-05をT細胞を再方向付けるおよび活性化するその活性について検査した。T細胞再方向付け(活性)アッセイにおいて、PD-L1を安定に発現するHEK293E-PD-L1細胞系を生成し、抗原ドナーとして使用した。NFATルシフェラーゼレポーターシステムを含有するように操作したCD3陽性ジャーカット細胞系をエフェクター細胞(ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生した)として使用した。
ACE-05および対照抗体の薬物動態研究をSDラットで実施した。研究は、the institutional animal care and use committeeによって承認された(Approval number:QBSIACUC-A17099)。
ヒト非小細胞肺がんの処置におけるACE-05の有効性を評価し、NCGマウス(CrownBio、USA)におけるHCC827細胞系を使用して他の抗体と比較した。研究は、下の表に示すとおり設計した:
ACE-05の有効用量を見出すために、用量制限研究(dose limits study)をHCC827ヒト化異種移植モデルで実施した(図18A~18D)。NCGメスマウス(CrownBio、USA)6~8週齢をPBMC再構成ヒト化のために選択し、14の研究群(マウス6匹/群)に分けた。群分けおよび処置の前に、すべての動物の重量を量り、腫瘍体積をキャリパーを使用して測定した。腫瘍体積が任意の所与の処置の有効性に影響を与え得ることから、腫瘍体積を、選択した動物を特定の群に無作為化するための数値パラメータとして使用した。群分けをStudyDirector(商標)software(Studylog Systems、USA)を使用して実施した。腫瘍体積において最小の群間差異を示した「分布一致」無作為化法を群割り当てのために使用した。
Claims (22)
- (a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)第1の可変重鎖(VH)領域、第1の定常重鎖1(CH1)領域および第2のVH領域を含む第3のポリペプチドと、
(c)第3のVH領域、第2のCH1領域および可変軽鎖(VL)領域を含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記結合分子は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含まず、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;そして
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、
結合分子。 - 前記柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
- 前記リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の結合分子。
- 前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、異なる抗原または同じ抗原に結合する、請求項1~3のいずれか一項に記載の結合分子。
- 前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原結合ドメインを形成し、前記Fv領域が、第2の抗原結合ドメインである、請求項4に記載の結合分子。
- 前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第1の抗原結合ドメインが、第1の抗原に結合し、前記第2の抗原結合ドメインが、第2の抗原に結合する、請求項5に記載の結合分子。
- 前記第1の抗原が、がん抗原である、請求項6に記載の結合分子。
- 第2の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項7に記載の結合分子。
- 前記第2の抗原が、T細胞上に発現される、請求項6に記載の結合分子。
- 前記第2の抗原が、CD3である、請求項9に記載の結合分子。
- 前記第1の抗原が、がん抗原であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項6に記載の結合分子。
- 前記第1の抗原が、PD-L1であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
- 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
各Fab領域の前記VL領域が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
請求項12に記載の結合分子。 - 前記第1の抗原が、CD20であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
- 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
各Fab領域の前記VL領域が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
請求項14に記載の結合分子。 - 前記第1の抗原が、EGFRであり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
- 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
各Fab領域の前記VL領域が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
請求項16に記載の結合分子。 - 1つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項1に記載の結合分子を製造する方法であって、
前記1つまたは複数のベクターが、
(a)各々が抗体軽鎖を含む第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
(b)第1のVH領域、第1のCH1領域および第2のVH領域を含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
(c)第3のVH領域、第2のCH1領域およびVL領域を含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
を含み;
前記結合分子は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含まず、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができ;そして
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、
方法。 - 請求項1~17のいずれか一項に記載の結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む、対象における疾患または状態の処置に使用するための、医薬組成物。
- 前記疾患または状態が、がんである、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、肺がんまたはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記疾患または状態が、PD-L1陽性がんである、請求項19に記載の医薬組成物。
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