JP7076571B2 - 細胞エンゲージ結合分子 - Google Patents

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Description

相互参照
本願は、2018年4月10日に出願した米国特許仮出願第62/655,762号および2018年8月17日に出願した米国特許仮出願第62/719,484号からの優先権の利益を主張するものである。本願は、さらに、2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,172号、2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,190号、および2019年4月1日に出願した米国特許出願第16/372,196号からの優先権の利益を主張するものである。上述の出願の各々は、それら全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願には、EFS-Web経由で提出したASCIIテキスト書式でのコンピュータ読み取り可能な形式(CRF)の配列表が参照により組み込まれる。14489-004-228_SEQ_LISTING.txtと題するEFS-Web経由で提出した前記配列表テキストファイルは、2019年4月2日に作成したものであり、サイズ140,862バイトである。
技術分野
本開示は、一般に、細胞エンゲージ結合分子(cell engaging binding molecule)、前記結合分子を作製する方法、前記結合分子を含む組成物、およびそれらの使用に関する。
抗体および/または抗体に基づく薬剤は、今や、多種多様な疾患および障害に対する治療の選択肢である。現在、米国および/または欧州連合において少なくとも70の抗体が承認されており、多数の新たな分子が前臨床研究および臨床試験中である。しかし、研究および臨床コミュニティ内では、新たな、より良好で、より安全な治療剤の探索が続いている。
天然に存在する抗体は、単一特異性であり、1つのエピトープまたは抗原に結合する。多重特異性抗体は、複数の抗体の特異性を併せ持ち、異なる抗原またはエピトープに結合する能力を有する。しかし、多くの技術的障害が、多重特異性抗体の開発を阻んできた。それ故、治療薬として承認されている多重特異性抗体は殆どない。したがって、より良好な多重特異性抗体、および機能的かつ安定な多重特異性抗体を効率的に産生する方法が、依然として必要とされている。
本開示は一部分において、複数の結合ドメインを有する細胞エンゲージ結合分子、前記結合分子を作製する方法、および前記結合分子を含む医薬組成物を提供する。前記結合分子を投与することを含む処置の方法も本明細書で提供される。
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域(variable heavy(VH)region)と第1の定常重鎖1(CH1)領域(constant heavy 1(CH1)region)と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域(variable light(VL)region)とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
細胞結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域(constant heavy 3(CH3)region)をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、結合分子が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、融合によってFv領域に連結されている。
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列の2つのタンデムコピーを含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、第1の抗原の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、第2の抗原は、免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球および単球からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫細胞は、エフェクター細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、顆粒細胞、自然リンパ系細胞、巨核球、単球、骨髄系由来サプレッサー細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、がん抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)または腫瘍特異的抗原(TSA)である。一部の実施形態では、第1の抗原は、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、CD3またはTNFアルファである。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、がん抗原は、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される。
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に形成された鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される。
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
医薬組成物が、提供される。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、プログラム死-リガンド1(PD-L1)に結合し、前記Fv領域が、表面抗原分類3(CD3)に結合する、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、融合によってFv領域に連結されている。
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号3のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号95のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドは、配列番号96のアミノ酸配列を含み、前記第4のポリペプチドは、配列番号97のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号95のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号98のアミノ酸配列を有し、前記第4のポリペプチドは、配列番号99のアミノ酸配列を有する。
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。
一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、
第1および第2のFab領域の各々のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、
第1および第2のFab領域の各々のVL領域が、配列番号8のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物が、提供される。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一態様では、細胞エンゲージ結合分子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20または上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記結合分子のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、EGFRに結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
結合分子が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
別の態様では、結合分子を製造する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、リンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
さらに別の態様では、結合分子を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物が、提供される。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
さらに別の態様では、結合分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法が、提供される。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側にアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、ABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドは、第2のVH領域のC末端側に定常重鎖3(CH3)領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第4のポリペプチドは、VL領域のC末端側にCH3領域およびABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの両方は、それぞれ、第2のVH領域およびVL領域のC末端側に、CH3領域およびABSをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第3のポリペプチドおよび/または第4のポリペプチドは、それぞれ、第2のVH領域および/またはVL領域のC末端側に、CH1領域とABSの両方をさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、ABSをさらに含む。一部の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端側にABSをさらに含む。特定の実施形態では、前記方法のいずれかに関して、第1および/または第2のポリペプチドは、抗体軽鎖のC末端にABSをさらに含む。
本開示は一部分において、複数の結合ドメインを有する細胞エンゲージ結合分子を提供する。一態様では、
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、前記2つの抗体Fab領域各々が抗原に結合する、
第1の抗体結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第2の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し;
前記第1の抗原結合ドメインと前記第2の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、第1の抗原結合ドメインの各Fab領域の第1の部分および第2の部分は、同じポリペプチド上にある。一部の実施形態では、少なくとも1つのFab領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されている:VH-CH1-VL-CL。他の実施形態では、少なくとも1つのFab領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されている:VL-CL-VH-CH1。
ある特定の実施形態では、各Fab領域の第1の部分および第2の部分は、別々のポリペプチド上に存在する。
ある特定の実施形態では、Fv領域のVH領域およびVL領域は、同じポリペプチド上にある。一部の実施形態では、Fv領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されている:VH-VL。他の実施形態では、Fv領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されている:VL-VH。
ある特定の実施形態では、Fv領域のVH領域およびVL領域は、別々のポリペプチド上にある。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインは、柔軟なペプチド領域により連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgGヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、Fv領域のVH領域に連結されている第1のCH3領域と、Fv領域のVL領域に連結されている第2のCH3領域とをさらに含む。
一部の実施形態では、結合分子は、1つまたは複数のアルブミン結合ドメインまたは部位(ABS)をさらに含む。一部の実施形態では、ABSは、Fv領域のVH領域のC末端に連結されている。他の実施形態では、ABSは、Fv領域のVL領域のC末端に連結されている。さらに他の実施形態では、Fv領域のVLおよびVH領域の各々のC末端は、ABSに連結されている。他の実施形態では、ABSは、Fab領域のうちの少なくとも1つのCL領域に連結されている。さらに他の実施形態では、結合分子は、1つまたは複数のアルブミンドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、2つのFab領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原でない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、同じCDRアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、同じCDRアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、同じCDRアミノ酸配列を含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、同じCDRアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、同じCDRアミノ酸配列を含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、同じCDRアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、異なるCDRアミノ酸配列を含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、EGFRであり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
別の態様では、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成する、
結合分子が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgGヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
ある特定の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、第1の抗原結合ドメインを形成し、Fv領域は、第2の抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原でない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号16、配列番号17および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、前記第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、EGFRであり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、1つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、
前記1つまたは複数のベクターが、
(a)各々が抗体軽鎖である第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができる、
方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgGヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
ある特定の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、第1の抗原結合ドメインを形成し、Fv領域は、第2の抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原でない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号22のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号20のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号21のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号36のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号34のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号35のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、EGFRであり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々は、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号50のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号48のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号49のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における疾患または状態の処置に使用するためのものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である。他の実施形態では、疾患または状態は、PD-L1陽性がんである。
さらに別の態様では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で提供される結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である。他の実施形態では、疾患または状態は、PD-L1陽性がんである。
本開示の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の選択肢集団によって記載されている場合、本開示は、挙げられている群全体を総じて包含するばかりでなく、個々に群の各構成員も包含し、主群の全ての可能なサブグループも包含し、群の構成員の1つまたは複数が非存在である主群も包含する。本開示は、特許請求の範囲に記載の開示における群構成員のいずれかの1つまたは複数の明示的除外も想定している。
例示的実施形態
1.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
結合分子。
2.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態1の結合分子。
3.第1のFab領域および第2のFab領域が、融合によってFv領域に連結されている、実施形態2の結合分子。
4.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態2の結合分子。
5.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態4の結合分子。
6.抗体ヒンジ領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態5の結合分子。
7.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態4の結合分子。
8.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態4の結合分子。
9.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態8の結合分子。
10.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列の2つのタンデムコピーを含む、実施形態9の結合分子。
11.第1のFab領域および第2のFab領域が、第1の抗原の同じエピトープに結合する、実施形態1の結合分子。
12.第2の抗原が、免疫細胞上に発現される、実施形態1の結合分子。
13.免疫細胞が、リンパ球および単球からなる群から選択される、実施形態12の結合分子。
14.免疫細胞が、エフェクター細胞である、実施形態12の結合分子。
15.免疫細胞が、T細胞、B細胞、樹状細胞、顆粒細胞、自然リンパ系細胞、巨核球、単球、骨髄系由来サプレッサー細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞からなる群から選択される、実施形態12の結合分子。
16.第1の抗原が、がん抗原である、実施形態1の結合分子。
17.がん抗原が、腫瘍関連抗原(TAA)または腫瘍特異的抗原(TSA)である、実施形態16の結合分子。
18.第1の抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態1の結合分子。
19.第2の抗原が、CD3またはTNFアルファである、実施形態12の結合分子。
20.第1の抗原が、がん抗原であり、第2の抗原が、CD3である、実施形態16の結合分子。
21.がん抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態20の結合分子。
22.以下のことを含む、結合分子を作製する方法:
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
ものである、こと;および
23.第1のFab領域および第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態22の方法。
24.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に形成された鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態23の方法。
25.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態23の方法。
26.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態25の方法。
27.第1の抗原が、がん抗原であり、第2の抗原が、CD3である、実施形態22の方法。
28.第1の抗原が、CD19、CD20、EGFR、Her2、およびPD-L1からなる群から選択される、実施形態22の方法。
29.結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
医薬組成物。
30.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原に結合し、前記Fv領域が、第2の抗原に結合し、前記第1の抗原が、前記第2の抗原と異なる、
方法。
31.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、プログラム死-リガンド1(PD-L1)に結合し、前記Fv領域が、表面抗原分類3(CD3)に結合する、
結合分子。
32.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態31の結合分子。
33.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態32の結合分子。
34.第1のFab領域および第2のFab領域が、融合によってFv領域に連結されている、実施形態33の結合分子。
35.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態33の結合分子。
36.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態35の結合分子。
37.抗体ヒンジ領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ヒンジ領域からなる群から選択される、実施形態36の結合分子。
38.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態35の結合分子。
39.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態35の結合分子。
40.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態39の結合分子。
41.リンカーが、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む、実施形態40の結合分子。
42.リンカーが、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む、実施形態40の結合分子。
43.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態32の結合分子。
44.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号3のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含む、実施形態32の結合分子。
45.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号95のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチドが、配列番号96のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチドが、配列番号97のアミノ酸配列を含む、実施形態32の結合分子。
46.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号95のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号98のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号99のアミノ酸配列を有する、実施形態32の結合分子。
47.結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、各々のポリペプチドが抗体軽鎖を含む、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法。
48.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態47の方法。
49.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態48の方法。
50.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態49の方法。
51.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態50の方法。
52.抗体ヒンジ領域が、免疫グロブリンG(IgG)ヒンジ領域である、実施形態50の方法。
53.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態20の方法。
54.リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、実施形態53の方法。
55.リンカーが、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む、実施形態54の方法。
56.リンカーが、GGSGGGGSGのアミノ酸配列を含む、実施形態54の方法。
57.第1および第2のFab領域の各々のVH領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、
第1および第2のFab領域の各々のVL領域が、配列番号8のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
Fv領域のVL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態48の方法。
58.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を有する、実施形態48に記載の方法。
59.結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物。
60.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、PD-L1に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法。
61.(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含む結合分子であって、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20または上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
結合分子。
62.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態61の結合分子。
63.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態62の結合分子。
64.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態63の結合分子。
65.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態64の結合分子。
66.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態64の結合分子。
67.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態62の結合分子。
68.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を有する、実施形態62の結合分子。
69.第1のFab領域および第2のFab領域が、EGFRに結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態61の結合分子。
70.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態69の結合分子。
71.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態70の結合分子。
72.抗体ヒンジ領域が、第3のポリペプチドと第4のポリペプチドの間に鎖間ジスルフィド結合を含む、実施形態71の結合分子。
73.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態70の結合分子。
74.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態69の結合分子。
75.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号38のアミノ酸配列を有する、実施形態69の結合分子。
76.結合分子を作製する方法であって、
(i)宿主細胞において1つまたは複数のベクターから前記結合分子を発現させることであって、
前記1つまたは複数のベクターは、
(a)第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、および第2のポリペプチドをコードする第2の核酸であって、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの各々が抗体軽鎖である、第1の核酸および第2の核酸と、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸と、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第4の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し、
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
ものである、こと;および
(ii)前記結合分子を精製すること
を含む方法。
77.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つの相補性決定領域(CDR)を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態76の方法。
78.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態77の方法。
79.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態78の結合分子。
80.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態79の結合分子。
81.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号26のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態77の方法。
82.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を有する、請求項77に記載の方法。
83.第1のFab領域および第2のFab領域が、CD20に結合し、
(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、第2のVH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
実施形態87の方法。
84.第1のFab領域および第2のFab領域が、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、実施形態83の方法。
85.柔軟なペプチド領域が、抗体ヒンジ領域を含む、実施形態84の方法。
86.柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、実施形態85の方法。
87.(a)第1および第2のポリペプチドの抗体軽鎖各々が、配列番号44のアミノ酸配列を含むVL領域を含み、
(b)第3のポリペプチドにおいて、第1のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、第2のVH領域が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、
(c)第4のポリペプチドにおいて、第3のVH領域が、配列番号40のアミノ酸配列を含み、VL領域が、配列番号16のアミノ酸配列を含む、
実施形態83の方法。
88.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド各々が、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドが、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドが、配列番号38のアミノ酸配列を有する、請求項83に記載の方法。
89.結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
医薬組成物。
90.対象における疾患または状態を処置する方法であって、
結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含み、
前記結合分子が、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)N末端からC末端に向かって順番に第1の可変重鎖(VH)領域と第1の定常重鎖1(CH1)領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)N末端からC末端に向かって順番に第3のVH領域と第2のCH1領域と可変軽鎖(VL)領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み;
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;
前記第1のFab領域および前記第2のFab領域各々が、CD20またはEGFRに結合し、前記Fv領域が、CD3に結合する、
方法。
図1Aは、本明細書で提供される結合分子(ALiCE)を例示する。図1Bは、CH3領域を含有する、本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。図1Cは、アルブミン結合部位(ABS)を含有する、本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。図1Dは、がん抗原を標的化する結合ドメインを有する本明細書で提供される例示的結合分子を例示し、本明細書で提供される可動性ペプチド領域のための例示的選択肢も例示する。図1Eは、がん抗原を標的化する結合ドメインおよびCD3標的化をする結合ドメインを有する本明細書で提供される例示的結合分子を例示する。 図2Aは、ACE-00のアセンブリーパターンを例示する。「BiP」は、露出されているACE-00のCH1またはVHドメインに結合する結合免疫グロブリン(immunoglobubin)タンパク質(BiP)を例示する。図2Bは、ACE-00のアセンブリーパターンを同定するために実施されたSDS-PAGEの結果を示す。矢印は、還元条件下での「ACE-00+軽鎖」試料中のACE-00-VLのバンドならびに「ACE-00-VH+ACE-00-VL+軽鎖」試料中のACE-00-VHおよびACE-00-VLの2つのバンドを示す。図2Cは、アダリムマブの野生型重鎖(HC)、CH1-切断型重鎖(ΔCH1)およびVH-CH1-切断型重鎖(ΔVH-CH1)の同時免疫沈降(co-IP)結果を示す。図2Dは、BiPが重鎖のVHおよび/またはCH1ドメインとの相互作用によって重鎖のアセンブリーおよび分泌を制御できることを例示する。「ERAD」は、小胞体関連タンパク質分解を表す。図2Eは、抗体アセンブリーへの抗体VHドメインの寄与およびACE-00分子の適切なアセンブリーへのACE-00-VH鎖の寄与を例示する。「X」はアセンブリーしないことを表す;「O」はアセンブリーすることを表す。図2Fは、ACE-00の構造を例示する。図2Gは、Hitrap(商標)KappaSelect(GE healthcare、USA)を使用するACE-00およびACE-00-VL2タンパク質についての親和性クロマトグラフィーの結果を示す。図2Hは、ACE-00-VL2とACE-00との間の分子サイズ区別を同定するために実施されたキャピラリー電気泳動の結果を示す。図2Iは、ACE-00およびACE-00-VL2分子のコンホメーションを示すキャピラリー電気泳動の結果を示す。実線矢印は、ACE-00の結果を示す;破線矢印は、ACE-00-VL2の結果を示す。図2Jは、ACE-00-VH鎖とACE-00-VL鎖との間のヘテロ二量体化を実証するために実施されたキャピラリー等電点電気泳動の結果を示す。図2Kは、ACE-00のアセンブリーパターンを同定するために実施されたSDS-PAGEおよびキャピラリー電気泳動の結果を示す。「R」は還元を表す;「NR」は非還元を表す。図2Lは、ACE-00のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。 図3は、ACE-02、ACE-02-VL2、ACE-03、ACE-03-VL2、ACE-00およびACE-01の発現およびアセンブリーを同定するために実施されたSDS-PAGE[還元(左)および非還元(右)条件下]の結果を示す。ACE-02はヒト化12F6(h12F6、抗CD3抗体)として第2の抗原を含有し、ACE-03は、ヒト化OKT3(hOKT3、抗CD3抗体)として第2の抗原を含有する。矢印は非還元条件下でのアセンブルしたACE-02、ACE-03およびACE-03-VL2のバンドをそれぞれ示す。 図4Aは、ACE-04の構造を例示する。「A」は、抗PD-L1を指す。UCHT1は、抗CD3抗体である。図4Bは、ACE-05の構造を例示する。「A」は、抗PD-L1を指す。OKT3は抗CD3抗体である。図4Cは、ACE-04、ACE-04-VL2、ACE-05およびACE-05-VL2のアセンブリーパターンを同定するために実施されたSDS-PAGEの結果を示す。矢印は、還元および非還元条件下でのACE-04およびACE-05のバンドを示す。図4Dは、ACE-05のアセンブリーパターン(上)を同定するために実施されたSDS-PAGEの結果を示し、ACE-05アセンブリー(下)における可能な制御機構を例示する。図4E~4Fは、ACE-05のコンホメーションおよび、ACE-05-VHとACE-05-VL鎖との間のヘテロ二量体化効率を同定するために実施されたSDS-PAGEおよびキャピラリー電気泳動の結果を示す。「M」はマーカーを表す;「R」は還元を表す;「NR」は非還元を表す;「IN」はインプットを表す;「FT」は素通りを表す;「W」は洗浄を表す;「Elu.」は溶出を表す。図4Gは、ACE-05の純度を同定するために実施されたサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図4Hは、ACE-05のゲル濾過分析のためのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。図4Iは、ACE-05の構造コンホメーションを同定するために実施された陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)の結果を示す。 図5は、ACE-09およびACE-05のアセンブリーパターンを同定するために37℃および32℃(上)で実施されたSDS-PAGEの結果を示し、ACE-09およびACE-05の特性を要約している(下)。上の図において「ACE-05」と表示されたレーンは、ACE-05の結果を示している;他のレーンは、ACE-09の結果を示している;「R」は還元を表す;「N.R」は「非還元」を表す;「IP」はインプットを表す;「F.T」は素通りを表す;「W」は洗浄を表す;「OP」はアウトプットを表す。 図6Aは、ACE-10の構造を例示する。図6B~6Cは、ACE-10分子[還元(左)および非還元(右)条件下]の発現およびアセンブリー分析を示す。図6Bでは、矢印は、還元および非還元条件下でのACE-10のバンドを示す。「ACE-10透析」は、透析されたDNAを用いたトランスフェクションを介して生成されたACE-10を表す。図6Cでは、抗Kappa条件からの結果における矢印は、非還元条件下のACE-10-VL/ACE-10-LC二量体およびACE-10-VH/ACE-10-LC二量体複合体を示し;抗CH1条件からの結果における矢印は、非還元条件下でアセンブルしたACE-10を示す。 図7Aは、ACE-11の構造を例示する。図7Bは、ACE-11およびACE-11-VL2の発現およびアセンブリーパターンを同定するために実施されたSDS-PAGEの結果を示す[クーマシーブルー染色(左)およびウエスタンブロット(右)による分析]。「M」はマーカーを表す。矢印は非還元条件下でアセンブルしたACE-11のバンドを示す。 図8はACE-12、ACE-05およびACE-09のアセンブリーパターンを同定するために実施されたSDS-PAGEの結果を示す。矢印はウエスタンブロットにおいて抗Kappa(左)および抗CH1(右)抗体を使用した非還元条件下でのACE-05-VH+LC二量体およびACE-05-VL+LC二量体のバンドを示す。 図9は、ACE-00およびACE-00-VL2のTNFアルファへの親和性を決定するための酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)の結果を示す。 図10A~10Cは、ELISAを使用したPD-L1(10A)およびCD3(10B~10C)へのACE-05の結合親和性の分析を示す。 図11は、ELISAを使用したCD3へのACE-05およびACE-09の結合親和性の分析を示す。 図12A~12Cは、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用するPD-L1(12A、12C)およびCD3(12B、12C)へのACE-05の結合動態の分析を示す。図12Dは、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用するPD-L1およびCD3に同時に結合するACE-05の動態分析を示す。 図13Aは、HEK293E-PD-L1細胞および親HEK293E細胞でのPD-L1発現レベル(右パネル)ならびに種々のCD3抗体によって測定されたジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞でのCD3発現レベル(左パネル)を示す。図13B~13Eは、ACE-05およびBiTE-05についてのT細胞再方向付け(活性)アッセイの結果を示す。図13Fは、さまざまなT細胞ステージにおけるACE-05、BiTE-05またはYBL-007の存在下でのT細胞活性化を示す。図13G~13Hは、ACE-05についてのPD-1/PD-L1遮断アッセイの結果を示す。図13I~13Jは、ACE-05、BiTE-05、UCHT1(抗CD3抗体、BioLegend、USAから)またはOKT3(抗CD3抗体、BioLegend、USAから)によるT細胞活性化を示す。図13Kは、ACE-05媒介T細胞細胞傷害性を決定するためのT細胞細胞傷害性アッセイの結果を示す。図13Lは、ACE-05、BiTE-05、YBL-007またはUCHT1によって媒介されるT細胞細胞傷害性の結果を示す。「IgG」は、陰性対照として使用される正常ヒトIgGを表す。図13Mは、ACE-05またはYBL-007の存在下でPBMC細胞と直接接触した場合の腫瘍細胞でのT細胞細胞傷害性を示す。矢印は、標的HCC827がん細胞を示す。図13Nは、同時培養されたPBMCおよびHCC827細胞におけるACE-05、BiTE-05またはYBL-007の存在下でのIL-2およびINF-γレベルを示す。「IgG」は、陰性対照として使用された正常ヒトIgGを表す。図13Oは、ACE-05、BiTE-05、YBL-007およびUCHT1の熱力学的安定性結果を示す。 図14A~14Bは、ACE-10媒介T細胞活性化を決定するために実施されたT細胞再方向付けアッセイの結果を示す。「hIgG」は、対照として使用された正常ヒトIgGを表す。 図15は、ACE-11媒介T細胞細胞傷害性を決定するためのT細胞細胞傷害性アッセイの結果を示す。 図16A~16Bは、スプラーグドーリー(SD)ラットにおけるACE-05薬物動態研究の結果を示す。 図17Aは、ヒト化マウスモデルにおけるHCC827(PD-L1陽性腫瘍)異種移植研究の結果を示す。図17Bは、PBMCドナーAおよびドナーBにおけるACE-05および他の被験物質の抗腫瘍効果を示す。図17Cは、ドナーAおよびドナーBの体重変化を示す。図17Dは、個々の抗腫瘍有効性応答を示す。図17Eは、個々の体重減少(%)(副作用)を示す。図17Fは、BiTEとACE-05との抗腫瘍有効性の比較、ならびに親PD-L1抗体とACE-05との比較を示す。 図18A~18Dは、HCC827(PD-L1陽性腫瘍)異種移植片を接種されたヒト化マウスモデルでの、PBMCドナーAおよびドナーBにおいてACE-05および他の被験物質の抗腫瘍効果を示す用量制限研究の結果を示す。図18Aは、ACE-05およびBiTE-05についての抗腫瘍有効性の用量応答を示す。図18Bおよび図18Cは、ACE-05およびBiTE-05について、各用量群における個々の(individual)マウスの抗腫瘍有効性をそれぞれ示す。図18Dは、ACE-05およびBiTE-05処置群の個体体重減少(副作用)(%)を示す。
本開示は、複数の結合ドメインを有する新規細胞エンゲージ結合分子を提供する。これらの結合分子は、本明細書において、「抗体様細胞エンゲージャー」(ALiCE)と呼ばれる。本明細書で提供されるALiCE分子は、2つの抗原結合ドメインを有する。第1の抗原結合ドメインは、2つのFab領域を有する。第2の抗原結合ドメインは、Fv領域を有する。通常のALiCE分子は、図1Aに表されている。一般的に、このような分子では、第1の抗原結合ドメインは、Fab領域を含み、第2の抗原結合ドメインは、一般的に、CH2およびCH3ドメインが、天然抗体構造において一般的に位置するであろう位置で、第1の抗原結合ドメインに付着される(直接的または間接的に)。例えば、示される実施形態では、重鎖のC末端は、CH2ドメインではなくVHドメインを含み、第2の重鎖のC末端は、ドメインではなくVLドメインを含む。
本明細書で開示される結合分子は、従来の抗体および既存の多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)を上回る多数の利点を提供する。本明細書で提供される結合分子は、その複数の抗原結合ドメインおよび全体的な立体配置設計のために、複数の細胞を互いに近づける細胞エンゲージャーとして使用できる。例えば、第1の抗原結合ドメインは、第1の細胞上に発現される抗原と結合でき、第2の抗原結合ドメインは、第2の細胞上に発現される抗原と結合でき、それによって、2つの細胞を互いに近づける。
ある特定の実施形態では、エンゲージされる細胞(engaged cells)の1種は、免疫細胞、例えば、細胞傷害性T細胞である。これらの実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、免疫細胞を方向付け、活性化するために特に有用である。例えば、ある特定の実施形態では、ALiCE分子の二価Fab部分が、従来の抗体の機能性を保持しながら、第2のFcを欠く一価抗原結合領域(すなわち、Fv領域)が、免疫系のエフェクター細胞、例えば、T細胞を認識し、エンゲージし(engage)、再度方向付け、および/または活性化できる。例えば、以下の実施例の節において実証されるように、抗PD-L1および抗CD3ドメインから構成されるALiCE分子であるACE-05は、PD-L1依存性(媒介性)T細胞活性化ならびにPD-1およびPD-L1遮断有効性の両方に対して相乗効果を示す。
ある特定の実施形態では、十分に機能的なFc領域がないことまたは完全CH2および/もしくはCH3領域がないことは、ある特定の望ましくないFc媒介性エフェクター細胞傷害性を無効にするかまたは低減する。ある特定の実施形態では、Fv部分のVH鎖とVL鎖の間の天然相互作用が、人工的な操作によって望ましくない免疫原性を付与することなくALiCE分子のヘテロ二量体化を促進する。
本明細書で提示される薬物動態(PK)研究は、ALiCE分子の、BiTE(二重特異性T細胞エンゲージャー)またはDART(二重親和性再標的化)などのその他の形態よりも高い安定性を示す(Campagne O. et al. Integrated Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model of a Bispecific CD3xCD123 DART Molecule in Nonhuman Primates: Evaluation of Activity and Impact of Immunogenicity. Clin Cancer Res. 2018 Jun 1;24(11):2631-2641; Moore P. A. et al. Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51; Moore P. A. et al. Development of MGD007, a gpA33 x CD3-Bispecific DART Protein for T-Cell Immunotherapy of Metastatic Colorectal Cancer. Mol Cancer Ther. 2018 Aug;17(8):1761-1772; Yuraszeck T. et al. Translation and Clinical Development of Bispecific T-cell Engaging Antibodies for Cancer Treatment. Clin Pharmacol Ther. 2017 May;101(5):634-645.これらの各々は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる)。さらに、例示的ALiCE分子のインビボ有効性研究は、有意な抗がん効果を示す。これらの結果は、ALiCEが、例えば、がん療法のための抗体工学における有利なプラットフォーム技術であることを実証する。
I.定義
本明細書で記載または参照される技術および手順は、当業者によって、一般的に十分に理解されているものおよび/または従来の方法論、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010);およびAntibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Duebel eds., 2d ed. 2010)に記載される広く利用される方法論を使用して一般に使用されるものを含む。
本明細書において別に定義されない限り、本記載において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書を解釈するという目的のために、以下の用語の説明は、適当な場合には常に当てはまり、単数形で使用される用語はまた、複数を含み、逆もまた同様である。示される用語の任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する事象では、以下に示される用語の説明が支配するものとする。
用語「結合分子」とは、標的または抗原と、適宜、結合部分が、結合タンパク質のポリペプチド、断片またはエピトープとの結合を促進するコンホメーションをとることを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分(例えば、1つまたは複数のスキャフォールドまたはフレームワーク領域)と結合する部分(例えば、1つまたは複数の結合領域、例えば、CDR)とを含むタンパク質を指す。本開示との関連で、結合分子は、例えば、解離定数(K)が≦10-7Mである場合に、抗原と特異的に結合する、または選択的に結合すると言われる。一部の実施形態では、結合分子は、約10-7M~約10-12MのKで抗原と特異的に結合し得る。ある特定の実施形態では、結合分子は、Kが≦10-8MであるかまたはKが≦10-9Mである場合に、高親和性で抗原と特異的に結合し得る。一実施形態では、結合分子は、OCTET(登録商標)によって測定されるような1×10-9M~10×10-9MのKで精製ヒト抗原と特異的に結合し得る。さらに別の実施形態では、結合分子は、0.1×10-9M~10×10-9MのKで、細胞上に発現されたヒト抗原と特異的に結合する。ある特定の実施形態では、結合分子は、約0.1×10-9M、約0.5×10-9M、約1×10-9M、約5×10-9M、約10×10-9Mまたはそれらの任意の範囲もしくは間隔で、細胞上に発現されたヒト抗原と特異的に結合する。用語「結合分子」は、抗体および抗体に由来する分子を含む。
用語「抗体」、「免疫グロブリン」または「Ig」は、本明細書において同義的に使用され、最も広い意味で使用され、例えば、以下に記載されるような、モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長または無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナルまたは一価抗体、多価抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限りの二重特異性抗体)、一本鎖抗体およびその断片を具体的に対象とする。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラおよび/または親和性成熟された抗体ならびにその他の種、例えば、マウスおよびウサギなどに由来する抗体であり得る。用語「抗体」は、特定の分子抗原と結合でき、ポリペプチド鎖の2つの同一対から構成されるポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のB細胞のポリペプチド産物を含むものとし、各対は、1つの重鎖(約50~70kDa)と、1つの軽鎖(約25kDa)を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約100~約130個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); および Kuby, Immunology (3d ed. 1997)を参照されたい。特定の実施形態では、特定の分子抗原には、ポリペプチドまたはエピトープを含む本明細書で提供される抗体が結合し得る。抗体はまた、それだけには限らないが、合成抗体、組換えによって産生された抗体、ラクダ化抗体、細胞内抗体、抗イディオタイプ(抗Id)抗体および断片が由来した抗体の結合活性の一部またはすべてを保持する抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの一部を指す上記のいずれかの機能性断片(例えば、抗原結合性断片)も含む。機能性断片(例えば、抗原結合性断片)の限定されない例として、一本鎖Fv(scFv)(例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、ジスルフィド連結されたFv(dsFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーが挙げられる。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原結合ドメインまたは抗原と結合する抗原結合部位を含有する分子(例えば、抗体の1つまたは複数のCDR)を含む。このような抗体断片は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Plueckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515;およびDay, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990)において見出すことができる。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA)または任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)のものであり得る。抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であり得る。
「抗原」は、抗体が選択的に結合できる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在する化合物もしくは合成化合物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連している、例えば、細胞、例えば、免疫細胞上またはその中に存在する。
用語「抗原結合性断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」および同様の用語とは、抗原と相互作用し、結合物質に、抗原(例えば、CDR)に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む結合分子のその部分を指す。
用語「結合する」または「結合」とは、例えば、複合体を形成することを含む、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用および/またはファンデルワールス相互作用をはじめとする非共有結合性相互作用であり得る。複合体はまた、共有結合性または非共有結合性結合、相互作用または力によって持ち寄られた2種またはそれより多い分子の結合を含み得る。抗体上の単一抗原結合部位と標的分子、例えば、抗原の単一エピトープの間の総非共有結合性相互作用の力は、抗体または機能性断片のそのエピトープに対する親和性である。結合分子(例えば、抗体)の一価抗原との会合速度(kon)に対する解離速度(koff)の比(koff/kon)は、解離定数Kであり、これは、親和性に対して逆相関する。K値が低いほど、抗体の親和性は高い。Kの値は、抗体および抗原の種々の複合体に対して変わり、konおよびkoffの両方に応じて変わる。本明細書で提供される抗体の解離定数Kは、本明細書で提供される任意の方法または当業者に周知の任意の他の方法を使用して決定できる。ある結合部位での親和性は、抗体および抗原の間の相互作用の真の力を常に反映するわけではない。複数の反復抗原決定基を含有する複合抗原、例えば、多価抗原が、複数の結合部位を含有する抗体と接触すると、ある部位での抗体の抗原との相互作用が、第2の部位での反応の可能性を増大する。多価抗体と抗原の間のこのような複数の相互作用の力は、結合力と呼ばれる。
本明細書に記載される結合分子に関連して、「と結合する」、「と特異的に結合する」などの用語および類似の用語はまた、本明細書において同義的に使用され、抗原、例えば、ポリペプチドと特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、関連抗原と交差反応性であり得る。ある特定の実施形態では、抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、他の抗原と交差反応しない。抗原と結合するかまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Octet(登録商標)、Biacore(登録商標)または当業者に公知のその他の技術によって同定できる。結合分子または抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ(RIA)および酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などの実験技術を使用して決定されるような、任意の交差反応性抗原とよりも高親和性で抗原と結合する場合に、抗原と結合するかまたは特異的に結合する。通常、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍となり、バックグラウンドの10倍超であり得る。例えば、結合特異性に関する考察については、Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed.、2d ed. 1989)を参照されたい。ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインの「非標的」タンパク質との結合の程度は、例えば、蛍光活性化セルソーター(FACS)解析またはRIAによって決定されるような、結合分子または抗原結合ドメインのその特定の標的抗原との結合の約10%未満である。「特異的結合」、「と特異的に結合する」または「に対して特異的である」などの用語に関して、非特異的相互作用とは測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般的に、結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定できる。例えば、特異的結合は、標的に対して同様である対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合によって決定できる。この場合には、特異的結合は、標識標的のプローブとの結合が、過剰の非標識標的によって競合的に阻害される場合に示される。抗原と結合する結合分子または抗原結合ドメインは、結合分子が、例えば、抗原の標的化において診断薬として有用であるような十分な親和性で抗原と結合可能であるものを含む。ある特定の実施形態では、抗原と結合する結合分子または抗原結合ドメインは、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM以下の解離定数(K)を有する。ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、異なる種に由来する抗原の間(例えば、ヒトおよびカニクイザル(cyno)種の間)で保存される抗原のエピトープと結合する。
「結合親和性」とは、一般的に、分子(例えば、抗体などの結合タンパク質)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)の間の非共有結合性相互作用の合計の力を指す。別に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体および抗原)の間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。用語「Bmax」とは、実験結果から推定された最大結合親和性を指す。Bmaxは、当技術分野で公知の曲線フィッティング法、例えば、GraphPad Prismソフトウェア7において提供される曲線フィッティングを使用して算出できる。結合分子Xのその結合パートナーYに対する親和性は、一般的に、解離定数(K)によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般的に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般的に、抗原と迅速に結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定するさまざまな方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも、本開示の目的のために使用できる。特定の例示的実施形態として、以下が挙げられる。一実施形態では、「K」または「K値」は、当技術分野で公知のアッセイによって、例えば、結合アッセイによって測定してもよい。Kは、例えば、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施されるRIAにおいて測定してもよい(Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81)。KまたはK値はまた、バイオレイヤー干渉法(BLI)または例えば、Octet(登録商標)QK384システムを使用するOctet(登録商標)による、もしくは例えば、Biacore(登録商標)TM-2000もしくはBiacore(登録商標)TM-3000を使用するBiacore(登録商標)による表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイを使用することによって測定してもよい。「結合速度(on-rate)」または「会合の速度」または「会合速度」または「kon」はまた、同じバイオレイヤー干渉法(BLI)または例えば、Octet(登録商標)QK384、Biacore(登録商標)TM-2000もしくはBiacore(登録商標)TM-3000システムを使用する上記の表面プラズモン共鳴(SPR)技術を用いて決定してもよい。
本明細書において使用される、用語「還元性」とは、例えば、2-メルカプトエタノール(2-ME)またはジチオトレイトール(DTT)の添加によって、タンパク質内の鎖間または鎖内ジスルフィド(S-S)橋が変性または還元され、その結果、複数のポリペプチド鎖をもたらす状態を指す。本明細書において使用される用語「非還元性」とは、タンパク質内の鎖間または鎖内ジスルフィド(S-S)橋が、変性剤または還元剤、例えば、2-メルカプトエタノール(2-ME)またはジチオトレイトール(DTT)の非存在下で無傷のままである状態を指す。
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、鎖(複数可)の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」配列ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を含み得る(米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、天然CDR残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種(例えば、ドナー抗体)、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の対応するCDRに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(例えば、レシピエント抗体)を含むキメラ抗体である非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態の部分を含み得る。一部の例では、ヒト免疫グロブリンの1つまたは複数のFR領域残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに規定するために行われる。ヒト化抗体重鎖または軽鎖は、少なくとも1つまたは複数の可変領域の実質的にすべてを含むことができ、CDRのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-29; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89;米国特許第6,800,738号、同6,719,971号、同6,639,055号、同6,407,213号および同6,054,297号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」の部分を含むことができ、この用語は、本明細書において同義的に使用され、ヒト可変領域、例えば、ヒト定常領域を含む抗体を指す。特定の実施形態では、この用語は、ヒト起源の可変領域および定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト」抗体はまた、ある特定の実施形態では、ポリペプチドと結合し、ヒト生殖系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変異体である核酸配列によってコードされる抗体も包含し得る。用語「完全ヒト抗体」は、Kabatらによって記載されるようなヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変および定常領域を有する抗体を含む(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)。「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、および/またはヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製されている抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581)および酵母ディスプレイライブラリー(Chao et al.、2006、Nature Protocols 1: 755-68)を含む当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95;およびvan Dijk and van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74に記載される方法は利用可能である。ヒト抗体は、抗原を、抗原投与に応じてこのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物、例えば、マウスに投与することによって調製できる(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関する、Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66; Brueggemann and Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58;および米国特許第6,075,181号および同6,150,584号を参照されたい)。また、例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体に関するLi et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62も参照されたい。
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「組換えヒト抗体」の部分を含むことができ、この語句は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されるヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックの、および/または導入染色体を有する動物(例えば、マウスまたはウシ)から単離された抗体(例えば、Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照されたい)またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のDNA配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製、発現、作出または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有し得る(Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)。しかし、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発(またはヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異誘発)に付され、したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、それに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しない可能性がある配列である。
ある特定の実施形態では、結合分子または抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の部分を含むことができ、この用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性ある天然に存在する突然変異を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、通常、抗原上の単一エピトープを認識する。特定の実施形態では、「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、単一ハイブリドーマまたは他の細胞によって産生される抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するための任意の特定の方法に制限されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., 1975, Nature 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製でき、または細菌もしくは真核生物動物もしくは植物細胞において組換えDNA法を使用して作製できる(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., 1991, Nature 352:624-28およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離できる。クローン細胞株を調製する、およびそれによって発現されるモノクローナル抗体を調製するその他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)を参照されたい。
通常の4鎖抗体ユニットは、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同じ重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgGの場合には、4鎖ユニットは、一般的に、約150,000ダルトンである。各L鎖は、1つの共有結合性ジスルフィド結合によってH鎖に連結され、一方で、2つのH鎖は、H鎖アイソタイプに応じて1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結している。各HおよびL鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド橋も有する。各H鎖は、N末端に、可変ドメイン(VH)と、それに続く、αおよびγ鎖の各々について3つの定常ドメイン(CH)、ならびにμおよびεアイソタイプについて4つのCHドメインを有する。各L鎖は、N末端に、可変ドメイン(VL)と、それに続く、その他の末端に定常ドメイン(CL)を有する。VLは、VHとアラインされ、CLは、重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)とアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。VHおよびVLの対合は、単一抗原結合部位を一緒に形成する。種々のクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed. 1994);およびImmunobiology (Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)を参照されたい。
用語「Fab」または「Fab領域」とは、抗原と結合する抗体領域を指す。従来のIgGは、普通、2つのFab領域を含み、各々は、Y型IgG構造の2つのアームのうち一方上に存在する。各Fab領域は、通常、重鎖および軽鎖の各々の1つの可変領域および1つの定常領域から構成される。より詳しくは、Fab領域中の重鎖の可変領域および定常領域は、VHおよびCH1領域であり、Fab領域中の軽鎖の可変領域および定常領域は、VLおよびCL領域である。Fab領域中のVH、CH1、VLおよびCLは、本開示に従って抗原結合能を付与するために種々の方法で配置され得る。例えば、従来のIgGのFab領域と同様に、VHおよびCH1領域は、1つのポリペプチド上にあってもよく、VLおよびCL領域は、別個のポリペプチド上にあってもよい。あるいは、VH、CH1、VLおよびCL領域は、すべて同じポリペプチド上にあり、以下の節により詳細に記載されるような種々の順序で配列されてもよい。
用語「可変領域」、「可変ドメイン」、「V領域」または「Vドメイン」とは、一般的に、軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖では約120~130個のアミノ酸および軽鎖では約100~110個のアミノ酸の長さを有し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。重鎖の可変領域は、「VH」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「VL」と呼ばれることがある。用語「可変」とは、可変領域のある特定のセグメントが、抗体間で配列において広範に異なるという事実を指す。V領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の110個のアミノ酸スパン中で均一に分布していない。代わりに、V領域は、各約9~12個のアミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる、より多い可変性(例えば、極度の可変性)のより短い領域によってわけられた、約15~30個のアミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる、あまり可変ではない(例えば、比較的不変の)ストレッチからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、βシート構造をつなぐ、一部の場合には、その一部を形成するループを形成する3つの超可変領域によってつながれた、大部分はβシート立体配置をとる4つのFRを含む。各鎖中の超可変領域は、FRによって、互いに近接するように保持され、他の鎖に由来する超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)を参照されたい)。定常領域は、抗体の抗原との結合において直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)および補体依存性細胞傷害性(CDC)における抗体の酸化を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列において広範に異なる。特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。
用語「Kabatによる可変領域残基番号付け」または「Kabatにおけるようなアミノ酸位置番号付け」およびその変形は、Kabatら、前掲において抗体の編集の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のために使用された番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮または挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、残基52の後に単一アミノ酸挿入部分(Kabatによる残基52a)および残基82の後に3個の挿入された残基(例えば、Kabatによる残基82a、82bおよび82cなど)を含み得る。残基のKabat番号付けは、「標準」のKabat番号付けされた配列との抗体の配列の相同性の領域でのアラインメントによって所与の抗体について決定され得る。Kabat番号付けシステムは、一般的に、可変ドメイン中の残基(およそ、軽鎖の残基1~107および重鎖の残基1~113)に言及する場合に使用される(例えば、Kabat et al.、前掲)。「EU番号付けシステム」または「EUインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を参照する場合に使用される(例えば、Kabat et al.、前掲において報告されたEUインデックス)。「KabatにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。その他の番号付けシステムは、例えば、AbM、Chothia、Contact、IMGTおよびAHonによって記載されている。
「無傷の」抗体は、抗原結合部位ならびにCLおよび少なくとも重鎖定常領域、CH1、CH2およびCH3を含むものである。定常領域は、ヒト定常領域またはそのアミノ酸配列変異体を含み得る。ある特定の実施形態では、無傷の抗体は、1つまたは複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、例えば、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例として、制限するものではないが、Fab、Fab’、F(ab’)およびFv断片、ダイアボディーおよびジダイアボディー(di-diabodies)(例えば、Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudson et al., 2003, Nat. Med. 9:129-34、WO93/11161および米国特許第5,837,242号および同6,492,123号を参照されたい)、一本鎖抗体分子(例えば、米国特許第4,946,778号、同5,260,203号、同5,482,858号および同5,476,786号を参照されたい)、二重可変ドメイン抗体(例えば、米国特許第7,612,181号を参照されたい)、単一可変ドメイン抗体(sdAb)(例えば、Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; および Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49を参照されたい)ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
用語「重鎖」は、抗体に関連して使用される場合、約50~70kDaのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約120~130個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)およびミュー(μ)と呼ばれる5つの別個の種類(例えば、アイソタイプ)のうちの1つであり得る。別個の重鎖は、大きさが異なる:α、δおよびγは、およそ450個のアミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、およそ550個のアミノ酸を含有する。重鎖のこれらの別個の種類は、軽鎖と組み合わされると、抗体の5つの周知のクラス(例えば、アイソタイプ)、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMを生じさせ、IgGの4つのサブクラス、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む。
用語「軽鎖」とは、抗体に関連して使用される場合、約25kDaのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約100~約110またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは、211~217個のアミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)またはラムダ(λ)と呼ばれる2つの別個の種類がある。
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」、「HVR」、「相補性決定領域」および「CDR」は、同義的に使用される。「CDR」とは、免疫グロブリン(Igまたは抗体)VH βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(H1、H2またはH3)のうちの1つまたは抗体VL βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(L1、L2またはL3)のうちの1つを指す。したがって、CDRは、フレームワーク領域配列内で散在する可変領域配列である。
CDR領域は、当業者にとって周知であり、周知の番号付けシステムによって規定されている。例えば、Kabat相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づいており、最もよく使用される(例えば、Kabat et al.、前掲を参照されたい)。Chothiaは、代わりに、構造的ループの位置を指す(例えば、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17を参照されたい)。Chothia CDR-H1ループの末端は、Kabat番号付け慣習を使用して番号付けされた場合、ループの長さに応じてH32からH34の間で変わる(これがKabat番号付けスキームがH35AおよびH35Bに挿入部分を位置づける理由であり、35Aも35Bも存在しない場合には、ループは32で終了し、35Aのみが存在する場合には、ループは、33で終了し、35Aおよび35Bの両方が存在する場合には、ループは、34で終了する)。AbM超可変領域は、Kabat CDRとChothia構造的ループの間の妥協点を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア(例えば、Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Duebel eds., 2d ed. 2010)を参照されたい)によって使用されている。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づいている。開発され、広く採用されている別のユニバーサル番号付けシステムとして、ImMunoGeneTics (IMGT) Information System(登録商標)(Lafranc et al., 2003、Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77)がある。IMGTは、ヒトおよび他の脊椎動物の免疫グロブリン(Ig)、T細胞受容体(TCR)および主要組織適合性複合体(MHC)に特化した総合情報システムである。本明細書において、CDRは、アミノ酸配列および軽鎖または重鎖内の位置の両方の点で言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のCDRの「位置」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造中に存在するので、構造的特徴に従って可変ドメイン配列をアラインする番号付けシステムを使用することによって、CDRおよびフレームワーク残基は容易に同定される。この情報は、ある種の免疫グロブリンに由来するCDR残基の、通常、ヒト抗体に由来するアクセプターフレームワークへのグラフトおよび置換において、使用できる。さらなる番号付けシステム(AHon)が、Honegger and Plueckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70によって開発されている。例えば、Kabat番号付けおよびIMGT特有番号付けシステムをはじめとする番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である(例えば、Kabat、前掲;Chothia and Lesk、前掲;Martin、前掲;Lefranc et al.、前掲を参照されたい)。これらの超可変領域またはCDRの各々に由来する残基を以下に記載する。
表1:超可変領域またはCDRの残基
Figure 0007076571000001


所与のCDRの境界は、同定に使用されるスキームに応じて変わり得る。したがって、特に断りのない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、可変領域ならびに抗体またはその領域の個々のCDR(例えば、「CDR-H1、CDR-H2)の、用語「CDR」および「相補性決定領域(complementary determining region)」は、本明細書において上記の公知のスキームのいずれかによって定義されるような相補性決定領域を包含すると理解されなくてはならない。一部の例では、Kabat、ChothiaまたはContact法によって定義されるようなCDRなど、特定のCDR(単数または複数)を同定するスキームは指定されている。その他の場合には、CDRの特定のアミノ酸配列は、示されている。
超可変領域は、以下のような「伸長された超可変領域」を含み得る:VLでは、24~36または24-~34(L1)、46~56または50~56(L2)および89~97または89~96(L3)およびVHでは、26~35または26~35A(H1)、50~65または49~65(H2)および93~102、94~102または95~102(H3)。
用語「定常領域」または「定常ドメイン」とは、抗体の抗原との結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Fc受容体との相互作用を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分、抗原結合部位を含有する可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のCH1、CH2およびCH3領域ならびに軽鎖のCL領域を含有し得る。
用語「フレームワーク」または「FR」とは、CDRの両端に位置する可変領域残基を指す。FR残基は、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディー、線形抗体および二重特異性抗体中に存在する。FR残基は、超可変領域残基またはCDR残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書において用語「Fc領域」は、例えば、天然配列Fc領域、組換えFc領域および変異体Fc領域を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は、変わり得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、位置Cys226のアミノ酸残基から、またはPro230からそのカルボキシル末端へ延びると定義されることも多い。Fc領域のC末端リシン(EU番号付けシステムによる残基447)が、例えば、抗体の製造または精製の際に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去されることもある。したがって、無傷の抗体の組成物は、すべてのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団ならびにK447残基を有するおよび有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」として、C1q結合、CDC、Fc受容体結合、ADCC、食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般的に、Fc領域が、結合領域または結合ドメイン(例えば、抗体可変領域またはドメイン)と組み合わされることを必要とし、当業者に公知の種々のアッセイを使用して評価され得る。「変異体Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾(例えば、置換、付加または欠失)によって、天然配列Fc領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、変異体Fc領域は、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Fc領域中または親ポリペプチドのFc領域中の、約1~約10個のアミノ酸置換または約1~約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書において、変異体Fc領域は、天然配列Fc領域と、および/もしくは親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%の相同性を、またはそれらと少なくとも約90%の相同性を、例えば、それらと少なくとも約95%の相同性を有し得る。
ポリペプチド「細胞外ドメイン」または「ECD」とは、膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないポリペプチドの形態または部分を指す。例えば、ECDは、このような膜貫通および/または細胞質ドメインの1%未満を有することがあり、このようなドメインの0.5%未満を有する場合もある。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当技術分野の用語であり、結合分子(例えば、抗体)が特異的に結合し得る、抗原の局在化領域を指す。エピトープは、線形エピトープまたはコンホメーション、非線形もしくは不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合には、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続アミノ酸(「線形」エピトープ)であり得る、またはエピトープは、ポリペプチドの2つまたはそれより多い非連続領域に由来するアミノ酸を含み得る(「コンホメーション」、「非線形」または「不連続」エピトープ)。一般に、線形エピトープは、二次、三次または四次構造に依存する場合も、依存しない場合もあるということは、当業者によって理解される。例えば、一部の実施形態では、結合分子は、アミノ酸の群と、それらが天然三次元タンパク質構造にフォールディングされているか否かに関わらず結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識し、結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定のコンホメーション(例えば、屈曲、ねじれ、ターンまたはフォールディング)を示すことを必要とする。
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線形である場合も、分岐している場合もあり、修飾されたアミノ酸を含むこともあり、また、非アミノ酸によって中断されている場合もある。用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意のその他の操作もしくは修飾によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、それだけには限らないが、非天然アミノ酸を含む、1つまたは複数のアミノ酸の類似体ならびに当技術分野で公知のその他の修飾を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体または免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づいたものであり得るので、ある特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、単一鎖として、または2つもしくはそれより多い会合した鎖として生じ得るということは理解される。
用語「ベクター」とは、核酸配列を宿主細胞に導入するために、例えば、本明細書に記載されるような結合分子(例えば、抗体)をコードする核酸配列を含む核酸配列を保持するかまたは含むために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターとして、例えば、宿主細胞の染色体への安定組込みのために作動可能な選択配列またはマーカーを含み得る発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられる。したがって、ベクターは、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子および適当な発現制御配列を含み得る。含まれ得る選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供し、栄養要求性の欠損を補完し、または培養培地中にない重大な栄養素を供給する。発現制御配列は、当技術分野で周知である、構成および誘導プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むことができる。2種またはそれより多い核酸分子が同時発現される予定である場合には(例えば、抗体重鎖および軽鎖または抗体VHおよびVLの両方)、両核酸分子を、例えば、単一発現ベクター中に、または別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現のために、コードする核酸を1つの共通発現制御配列に作動可能に連結することができる、または異なる発現制御配列、例えば、1つの誘導プロモーターおよび1つの構成プロモーターに連結することができる。核酸分子の宿主細胞への導入は、当技術分野で周知の方法を使用して確認できる。このような方法として、例えば、核酸解析、例えば、ノーザンブロットまたはmRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、遺伝子産物の発現のための免疫ブロット法または導入された核酸配列またはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適した解析方法が挙げられる。核酸分子が目的生成物を産生するのに十分な量で発現されることは、当業者によって理解され、また、当技術分野で周知の方法を使用して、十分な発現を得るために、発現レベルを最適化できることがさらに理解される。
用語「宿主」とは、本明細書で使用される場合、動物、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)を指す。
用語「宿主細胞」とは、本明細書で使用される場合、核酸分子を用いてトランスフェクトされ得る特定の対象細胞およびこのような細胞の後代または潜在的後代を指す。このような細胞の後代は、核酸分子を用いてトランスフェクトされた親細胞とは、その後の世代において起こり得る突然変異もしくは環境の影響または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みのために同一ではない場合もある。
「単離された核酸」は、他のゲノムDNA配列ならびに天然配列に天然に付随するタンパク質またはリボソームおよびポリメラーゼなどの複合体から実質的に分離されている核酸、例えば、RNA、DNAまたは混合核酸である。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、cDNA分子は、組換え技術によって産生される場合には、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような抗体をコードする1つまたは複数の核酸分子が、単離または精製される。用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、組換えまたはクローニングされたDNA単離物および化学合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含み得る。
本明細書において同義的に使用されるような「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基および/またはそれらの類似体、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、必ずしもそうではないが、一般的に、約200ヌクレオチドよりも少ない長さの、短い、一般的に、一本鎖合成ポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに等しく、十分に適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞は、抗体をコードする核酸が導入されている、親のハイブリドーマ細胞ならびに細菌および真核生物宿主細胞を含み得る。別に明記されない限り、本明細書で開示される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は、5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、5’方向と呼ばれる。新生RNA転写物の5’から3’への付加の方向は、転写方向と呼ばれ、RNA転写物の5’から5’末端であるRNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、RNA転写物の3’から3’末端であるRNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
「担体」は、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度で、それに曝露されている細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例として、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸をはじめとする抗酸化物質;低分子量(例えば、約10個より少ないアミノ酸残基)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸;グルコース、マンノースもしくはデキストリンをはじめとする単糖、二糖および他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成性対イオン;ならびに/またはTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)およびPLURONICS(商標)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。用語「担体」はまた、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全または不完全))、賦形剤または媒体を指すこともある。医薬品担体を含むこのような担体は、滅菌液体、例えば、水および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。水は、組成物(例えば、医薬組成物)が静脈内に投与される場合には例示的担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に、注射用溶液のための液体担体として使用できる。適した賦形剤(例えば、医薬品賦形剤)として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物もまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤を含有することができる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。製剤を含む経口組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準担体を含むことができる。適した医薬品担体の例は、Remington and Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)に記載されている。医薬品化合物を含む組成物は、結合分子(例えば、抗体)を、例えば、単離または精製された形態で、適した量の担体とともに含有し得る。
用語「薬学的に許容される」とは、本明細書で使用される場合、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されることまたは米国薬局方、欧州薬局方もしくは動物において、より詳しくは、ヒトにおいて使用するための他の一般に認識されている薬局方に列挙されることを意味する。
用語「有効量」とは、本明細書で使用される場合、所望のアウトカムをもたらすのに十分である、本明細書で提供される結合分子(例えば、抗体)または医薬組成物の量を指す。
用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され得る。本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)または霊長類(例えば、サルおよびヒト)である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、状態または障害を有すると診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、状態または障害を発生するリスクにある、哺乳動物、例えば、ヒトである。
「投与する」または「投与」とは、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内デリバリーおよび/または本明細書に記載される、もしくは当技術分野で公知の任意のその他の物理的デリバリー方法によって、物質を注入するまたはそうでなければ身体の外側に存在するので患者に物理的にデリバリーする行為を指す。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」とは、1つまたは複数の療法の投与に起因する疾患または状態の進行、重症度および/または持続期間の低減または改善を指す。
用語「約」および「およそ」とは、所与の値もしくは範囲の20%内、15%内、10%内、9%内、8%内、7%内、6%内、5%内、4%内、3%内、2%内、1%内またはそれより少ないものを意味する。
本開示および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、別に明確に示されない限り、複数形を含む。
実施形態が用語「含んでいる(comprising)」を用いて本明細書に記載される場合は常に、「からなる(consisting of)」および/または「から本質的になる(consisting essentially of)」に関して記載される他の類似の実施形態も提供されると理解される。実施形態が、語句「から本質的になる(consisting essentially of)」を用いて本明細書に記載される場合に常に、「からなる(consisting of)」に関して記載される他の類似の実施形態も提供されるということも理解される。
用語「および/または」は、本明細書において「Aおよび/またはB」などの語句において使用される場合、AおよびBの両方、AまたはB、A(単独)ならびにB(単独)を含むものとする。同様に、用語「および/または」は、「A、Bおよび/またはC」などの語句において使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するものとする:A、BおよびC、A、BまたはC、AまたはC、AまたはB、BまたはC、AおよびC、AおよびB、BおよびC、A(単独)、B(単独)およびC(単独)。
II.結合分子
複数の抗原結合ドメイン(例えば、2つの抗原結合ドメイン)を含む結合分子(ALiCE)が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の複数の抗原結合ドメインは、細胞をエンゲージする、細胞を免疫細胞に互いに近づける、または免疫細胞を再度方向付けするために有用である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、2つの抗原結合ドメインを含み、第1の抗原結合ドメインは、2つの抗体Fab領域を含み、第2の抗原結合ドメインは、抗体Fv領域を含む。2つのFab領域の各々は、2つの部分:抗体可変重鎖(VH)領域および抗体CH1領域を有する第1の部分ならびに抗体可変軽鎖(VL)領域および抗体軽鎖定常領域(CL)を含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分を有する第2の部分を含有する。2つのFab領域の各々は、抗原と結合する。第2の抗原結合ドメイン中のFv領域は、VH領域および抗体可変軽鎖(VL)領域を含む。2つのFab領域は、Fv領域に連結されている。
したがって、一態様では、本開示は、
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体重鎖可変(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
前記2つの抗体Fab領域が各々抗原に結合する、第1の抗体結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインと
を含む結合分子であって、
前記第2の抗原結合ドメインが、免疫細胞上に存在する抗原に結合し、
前記第1の抗原結合ドメインと前記第2の抗原結合ドメインが連結されている、
結合分子を提供する。
Fab領域(すなわち、抗原結合性断片)は、抗原と結合する抗体領域である。従来のIgGは、普通、2つのFab領域を含み、各々、Y型IgG構造の2つのアームの一方上にある。各Fab領域は、通常、重鎖および軽鎖の各々の1つの可変領域および1つの定常領域から構成される。より詳しくは、Fab領域中の重鎖の可変領域および定常領域は、VHおよびCH1領域であり、Fab領域中の軽鎖の可変領域および定常領域は、VLおよびCL領域である。Fab領域中のVH、CH1、VLおよびCLは、本開示に従って抗原結合能を付与するように種々の方法で配列できる。例えば、従来のIgGのFab領域と同様に、VHおよびCH1領域は、1つのポリペプチド上にあってもよく、VLおよびCL領域は、別々のポリペプチド上にあってもよい。あるいは、VH、CH1、VLおよびCL領域は、すべて同じポリペプチド上にあり、以下により詳細に記載されるように種々の順序で配列されてもよい。
Fv領域は、VH領域およびVL領域を含む抗原結合領域である。Fv領域中のVHおよびVL領域は、本開示に従って抗原結合能を付与するように種々の方法で配列できる。例えば、VHおよびVL領域は、同じまたは別々のポリペプチド上にあってもよい。VHおよびVL領域が同じポリペプチド上にある場合は、それらは以下により詳細に記載されるように種々の順序で配列されてもよい。
上記の節Iにおいて説明されるように、用語「可変領域」とは、一般的に、軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖では約120~130個のアミノ酸および軽鎖では約100~110個のアミノ酸の長さを有し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される抗体の軽鎖または重鎖の部分を指す。重鎖の可変領域は、「VH」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は、「VL」と呼ばれることがある。
用語「定常領域」とは、抗体の抗原との結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Fc受容体との相互作用を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分、抗原結合部位を含有する可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、抗原を破壊するために使用される機序を決定できる。抗体は、定常領域構造および免疫機能に基づいて5つの主要なクラス、IgM、IgG、Iga、IgDおよびIgEにわけられる。IgGは、γ重鎖を特徴とする免疫グロブリンのクラスである。それは、血漿において見出される免疫グロブリンの最も豊富なクラスである。軽鎖の定常領域は、「CL」と呼ばれる。複数の重鎖Cドメイン(CHドメイン)は、アミノ末端からカルボキシ末端に番号付けられる、例えば、CH1、CH2、CH3など。これらの抗体クラスの任意のCLおよびCH1領域を、本開示において使用できる。特定の実施形態では、本明細書で提供されるCLおよびCH1領域は、IgG種(例えば、IgG1)のものである。本明細書で提供されるFab領域の代表的なCL領域は、以下のアミノ酸配列を有する:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号59)
本明細書で提供されるFab領域の代表的なCH1領域は、以下のアミノ酸配列を有する:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(配列番号60)
「第1の部分は、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない」という文言は、第1の部分は、完全抗体CH2領域または完全CH3領域を含有しないということを意味するように本明細書において使用される。しかし、この文言は、CH2領域および/またはCH3領域の一部が第1の部分中に含まれる実施形態を排除しない。さらに、ある特定の実施形態では、完全CH2および/またはCH3活性(例えば、エフェクター機能)を示さないCH2および/またはCH3変異体または末端切断も含まれ得る。Fc受容体結合アッセイまたはADCC活性アッセイまたはFc領域関連機能を決定するための他の周知のアッセイなどのアッセイを、CH2および/またはCH3活性(またはFc領域活性)が十分に保持されているか否かを決定するために本明細書において使用できる。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分および第2の部分は、別々のポリペプチド上に存在する。2つのFab領域の各々はまた、単一鎖Fab領域であってもよい。したがって、他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインの両Fab領域の第1の部分および第2の部分は、同じポリペプチド上にある。他の実施形態では、2つのFab領域のうち一方の第1の部分および第2の部分は、同じポリペプチド上にある。Fab領域が単一鎖Fabである(すなわち、Fab領域の第1の部分および第2の部分が同じポリペプチド上にある)それらの実施形態では、Fab領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されてもよい:VH-CH1-VL-CL。あるいは、単一鎖Fab領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されてもよい:VL-CL-VH-CH1。
同様に、ある特定の実施形態では、Fv領域のVH領域およびVL領域は、別々のポリペプチド上にある。他の実施形態では、第2の抗原結合ドメインのFv領域は、単一鎖Fvである(すなわち、Fv領域のVH領域およびVL領域は、同じポリペプチド上にある)。このような単一鎖Fv実施形態では、Fv領域は、N末端からC末端に向かって次の順番で配列されてもよい:VH-VL、またはN末端からC末端に向かって次の順番で配列されてもよい:VL-VH。
一部の特定の実施形態では、各Fab領域の2つの部分は、別々のポリペプチド上にあり、Fv領域のVHおよびVL領域もまた、別々のポリペプチド上にある。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインは、柔軟なペプチド領域によって連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgGヒンジ領域である。本明細書で提供されるIgGヒンジ領域は、種々のIgGサブタイプの抗体ヒンジ領域から選択され得る。以下の表2には、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域中に含まれ得るコアヒンジ配列を有する例示的IgGサブタイプが列挙されている。
表2:例示的IgGサブタイプ
Figure 0007076571000002
したがって、一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号55のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号56のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号57のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2のFv抗原結合ドメインの間にリンカー(例えば、G4S)をさらに含む。抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインの間の柔軟なリンカーは、第2のFvドメインの結合親和性に影響を及ぼし得る。第2のFvドメインの結合親和性の改善は、免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)を標的細胞(例えば、がん細胞)へ再度方向付けする効率の増大につながり得る。ALiCEの第2のFvドメインのパラトープは、ALiCEの第1のFabドメインによって構造的にマスクされているので、第2のFvドメインは、免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)上に提示される表面抗原と相互作用し、結合できるように屈曲する必要がある。したがって、立体障害を低減し、第2のFvドメインの免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)との結合を最適化するために、G4Sなどの柔軟なリンカーを抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインの間に導入できる。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、(G4S)n(ここで、nは整数である)のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。種々の柔軟性を有するリンカーを設計および構築する他の方法は、例えば、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2014, 27(10): 325-330, および DiGiammarino et al., Landes Bioscience, 2011, 3(5): 487-494により詳細に記載されている。
本明細書で提供される結合分子は、CH3ドメインを含んでもよい。図1Bは、このような例示的結合分子を例示する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、Fv領域のVH領域に連結されている第1のCH3領域と、Fv領域のVL領域に連結されている第2のCH3領域とをさらに含む。一部の実施形態では、CH領域は、Fv領域のVHおよびVL領域のC末端に連結されている。CH3領域の存在は、本明細書で提供される結合分子のFc受容体結合能を提供する。一部の実施形態では、Fv領域に連結されるCH3領域は、ノブイントゥーホール(knobs-into-holes)(KiH)技術または静電的ステアリング(electrostatic steering)などの既存の技術を使用して、2つのCH3領域間の会合を促進または強制するように操作される。例えば、ノブイントゥーホールは、隣接するα-へリックス間のアミノ酸側鎖のパッキングのためのモデルとして元々提案され、ヘテロ二量体化のために抗体重鎖二量体を操作するための有効な設計戦略であると後に実証された。手短には、このアプローチのある特定の実施形態では、「ノブ(knob)」変異体を、1つのIgG CH3ドメイン中の小さいアミノ酸のより大きなものとの置換(例えば、TからYへの置換)によって最初に得ることができる。ノブは、大きな残基の、より小さいものとの置換(例えば、YからTへの置換)によって作出された別のIgG CH3ドメイン中の「ホール(hole)」中に挿入するように設計された。ノブイントゥーホール技術は、例えば、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、WO96/027011、Ridgway et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621, および Merchant et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681においていくつかの実施例を用いて詳細に記載されている。2つのCH3領域の間の会合を促進または強制するためにCH3領域を修飾する他の周知の技術も、本開示において企図される。
アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)は、生物学的製剤の血清半減期を増大するために使用されている。Dennis et al., The Journal of Biological Cheminstry, 2002, 277 (38): 35035-35043; Adams et al., MABS, 2016, 8(7): 1336-1346を参照されたい。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)が利用されてきた。HSAは、血液において最も豊富なタンパク質であり、組織において広く分布しており、非急性機能を有する。それは、19日の半減期(half like)を有する。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の半減期を増大するために、本明細書においてアルブミン(例えば、HSA)を使用できる。アルブミン(Alumin)はいくつかの方法で使用できる。1つの例示的アプローチは、アルブミンドメイン(例えば、HSA)を、遺伝子的にまたは化学的にのいずれかで本明細書で提供される結合分子に直接カップリングすることである。別の例示的アプローチは、アルブミン結合ドメインまたは部位(ABDまたはABS)を使用することである。
したがって、本明細書で提供される結合分子はまた、1つまたは複数のアルブミン結合ドメインまたはアルブミン結合部位(ABDまたはABS)を含んでもよい。図1Cは、このような例示的結合分子を例示する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子のABSは、内因性アルブミンとの結合を媒介し、それによって、本明細書で提供される結合分子の半減期を延長することおよび/またはその治療効果を増強することを補助する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子のABSはまた、アルブミンとの非共有結合性会合を介して薬物動態を改善するのに役立ち得る。一部の実施形態では、ABSは、Fv領域のVH領域のC末端に連結される。他の実施形態では、ABSは、Fv領域のVL領域のC末端に連結される。さらに他の実施形態では、Fv領域のVLおよびVH領域の各々のC末端は、ABSに連結される。他の実施形態では、ABSは、Fab領域の少なくとも1つのCL領域に連結される。
ある特定の実施形態では、結合分子は、1つまたは複数のアルブミンドメイン(例えば、HSA)をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、アルブミンドメインは、Fv領域のVH領域のC末端に連結される。他の実施形態では、アルブミンドメインは、Fv領域のVL領域のC末端に連結される。さらに他の実施形態では、Fv領域のVLおよびVH領域の各々のC末端は、アルブミンドメインに連結される。他の実施形態では、アルブミンドメインは、Fab領域の少なくとも1つのCL領域に連結される。
本明細書で提供される結合分子の2つのFab領域およびFv領域は、各々抗原に結合する。一部の実施形態では、2つのFab領域は、異なる抗原に結合する。
他の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、2つのFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
2つのFab領域が、同じ抗原-第1の抗原に結合する場合には、第1の抗原は、Fv領域が結合する抗原(第2の抗原)と同じであってもよく、異なっていてもよい。したがって、一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうちの少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。図1Eは、このようなALiCE分子の例示を提供し、第1の抗原結合ドメイン(2つのFab領域)は、がん抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、CD3のような抗原を介してT細胞などの免疫細胞に結合する。このようなALiCE分子は、免疫細胞(例えば、T細胞)をがん細胞にエンゲージでき、したがって、がん処置のための治療薬として使用できる。
したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、(a)第1の抗原に対する結合親和性を提供する2つのFab領域(第1の抗原結合ドメイン中)および(b)第2の抗原に対する結合親和性を提供するFv領域(第2の抗原結合ドメイン中)を含む二重特異性結合分子である。第1の抗原結合ドメインは、ある細胞上の表面タンパク質の細胞外ドメインと結合でき、第2の抗原結合ドメインは、免疫細胞上の表面タンパク質の細胞外ドメインと結合でき、それによって、2種の細胞を互いに近づける。
第1の抗原結合ドメイン(2つのFab領域を有する)は、がん細胞に結合できる。それは、非がん細胞にも結合できる。したがって、一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原(例えば、PD-L1)である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原ではない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、EGFRであり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
一部の特定の実施形態では、第1の抗原結合ドメインは、N末端にあり、N末端の天然抗体構造を維持し、一方で、第2の抗原結合ドメインは、C末端にあり、両重鎖のC末端CH2およびCH3ドメインは、それぞれ、単一VHおよびVLドメインで各々置換されている。図1Aは、このような例示的ALiCE分子の例示である。より詳しくは、各Fab領域の第1の部分および第2の部分は、別々のポリペプチド上にあり、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、Fv領域のVH領域およびVL領域は、別々のポリペプチド上にあり、第2の抗原結合ドメインは、免疫細胞上に存在する第2の抗原に結合し、第1の抗原と第2の抗原は、異なる抗原である。
したがって、特定の一実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
(a)2つの抗体Fab領域を含み、各々が、
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
前記第1の部分および第2の部分が、別々のポリペプチド上にあり、
第1の抗原に結合する、第1の抗原結合ドメインと、
(b)VH領域と抗体可変軽鎖(VL)領域とを含む抗体Fv領域を含む第2の抗原結合ドメインであって、VH領域およびVL領域は、別々のポリペプチド上にあり、免疫細胞上に存在する第2の抗原に結合する、第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1の抗原および第2の抗原は、異なる抗原である。
一部の実施形態では、1つのFab領域の第1の部分およびFv領域のVH領域が、同じポリペプチド上にあり、他のFab領域の部分およびFv領域のVL領域が、同じポリペプチド上にある。したがって、一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
(a)第1の抗体Fab領域および第2の抗体Fab領域を含み、各々が
(i)抗体可変重鎖(VH)領域と抗体CH1領域とを含む第1の部分であって、抗体CH2領域および抗体CH3領域を含有しない第1の部分と、
(ii)抗体可変軽鎖(VL)領域と抗体軽鎖定常領域(CL)とを含む抗体軽鎖(LC)を含む第2の部分と
を含み、
第1の抗原に結合する、第1の抗原結合ドメインと、
(b)VH領域および抗体可変軽鎖(VL)領域を含む抗体Fv領域を含み、免疫細胞上に存在する第2の抗原と結合する第、2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1の抗原および前記第2の抗原は、異なる抗原であり、
第1のFab領域の第1の部分およびFv領域のVH領域は、同じポリペプチド上にあり、第2のFab領域の第1の部分およびFv領域のVL領域は、同じポリペプチド上にある。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原(例えば、PD-L1)である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原ではない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、EGFRであり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
別の態様では、本明細書で提供される結合分子は、4つのペプチド(2つの抗体軽鎖および2つの重鎖様鎖)を含み、その全体構造は、IgGのFc領域がFv領域と置換されている点を除いて伝統的なIgGと同様である。この構造は、種々の特性を付与する変種を作製するためにさらに修飾され得る。より詳しくは、一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、
(a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドと、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドと
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの第1のVH領域および前記第1のCH1領域とは、第1の抗原結合Fab領域を形成し、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの第3のVH領域および前記第2のCH1領域とは、第2の抗原Fab領域を形成し、
前記第3のポリペプチドの第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドのVL領域とは、抗原結合Fv領域を形成する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、同じアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、2つの同一の軽鎖(第1および第2のポリペプチド)および2つの異なる重鎖様鎖(第3および第4のポリペプチド)を含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体は、IgGヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号55のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号56のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号57のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、本明細書で提供される柔軟なペプチド領域は、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、追加のアミノ酸を含む。例えば、一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2のFv抗原結合ドメインの間にリンカー(例えば、G4S)をさらに含む。抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインの間の柔軟なリンカーは、第2のFvドメインの結合親和性に影響を及ぼし得る。第2のFvドメインの結合親和性の改善は、免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)を標的細胞(例えば、がん細胞)へ再方向付けする効率の増大につながり得る。ALiCEの第2のFvドメインのパラトープは、ALiCEの第1のFabドメインによって構造的に(struructually)マスクされているので、第2のFvドメインは、免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)上に提示される表面抗原と相互作用し、結合できるように屈曲する必要がある。したがって、立体障害(streic hinderace)を低減し、第2のFvドメインの免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)との結合(binidng)を最適化するために、G4Sなどの柔軟なリンカー(liniker)を抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインの間に導入できる。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、(G4S)n(ここで、nは整数である)のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープと結合する。
ある特定の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、第1の抗原結合ドメインを形成し、Fv領域は、第2の抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうち少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原ではない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の実施形態では、第2の抗原は、エフェクター細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞、調節性T細胞、または細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、ヘルパーT細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、調節性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞傷害性T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD8+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、CD4+T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、細胞外ドメインを含む。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号16、配列番号17および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原はCD20であり、第2の抗原はCD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原はEGFRであり、第2の抗原はCD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
上記のように、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、2つの同一の軽鎖および2つの異なる重鎖様鎖を含む。CHOまたはHEK293のような哺乳動物細胞において組換えタンパク質を作製するために、ERにおいて生じた抗体アセンブリーおよび品質管理システムを理解することは極めて重要である。抗体は、四量体Hとしてアセンブルされ、分泌され、品質管理機構は、BiPおよびPDIによってERにおいて極めて厳重に調節されている。重鎖のフォールディングしていないCH1ドメインは、BiP依存性に抗体アセンブリーの調節の役割を有することはわかっていた。実施例の節において以下に記載されるように、本開示は、抗体VHドメインがまた、抗体アセンブリーの役割を有することを実証し、2つのVH領域(Fab領域中に1つおよびFv領域中に1つ)を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖が、結合分子の適切なアセンブリーに寄与することを示す。
C末端Fvはまた、2つの異なる重鎖様鎖(第3および第4のポリペプチド)のヘテロ二量体化の重要な役割を有する。VHとVL領域間の相互作用は、VL-VL相互作用よりも強力であるので、VH-VL相互作用は、2つの異なる重鎖様鎖(第3および第4のポリペプチド)間のヘテロ二量体化を作製するように選択された。ヘテロ二量体化の効率は、極めて高いと見出され、哺乳動物細胞において発現および精製された結合分子のほとんどは、ヘテロ二量体化形態であった(99%近くのヘテロ二量体化効率)。
さらに、この構造は、標的とエフェクター細胞の間に最適シナプス距離を提供する。N末端の2つのFab領域と、C末端Fv領域の距離は、40Åであると推定された。さらに、本明細書で提供される結合分子は、他の公知の二重特異性抗体、例えば、BiTE、DARTおよび他のScFvベースの二重特異性抗体形態よりも大きなフォールディング複雑性(分子の大きさ)を有し、したがって、改善された熱力学的安定性を有すると予測される。
さらに、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、2つのFab領域(N末端F(ab’))が、第1の抗原(例えば、がん抗原)に結合し、Fv領域が、免疫細胞(例えば、T細胞)に結合する二重特異性結合分子である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、例えば、最大抗腫瘍活性のために、抗体機能および免疫再方向付け(例えば、T細胞再方向付け)の相乗効果を提供するようにY型で設計および構築される。ALiCE分子(主に、Y型で存在する)の立体配置は、2つの抗原結合ドメイン(2つの標的パラトープ)間に最適免疫学的シナプス距離を付与し、細胞(例えば、T細胞)の他の細胞(例えば、腫瘍細胞)への機能的再方向付けを最大にするように設計される。さらに、高親和性および二価N末端(2つのFab領域)が提供され、同時に、免疫細胞抗原に対するFv領域の一価の低い親和性のために、望まれない標的依存性T細胞活性化は低減される。
結合分子は、異なる立体配置を有することができ、これは、結合分子中のドメイン間の距離に影響を及ぼし得るということが報告されている(両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Zhang X. et al. 3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed by IndividualParticle Electron Tomography. Scientific Reports 5, Article number: 9803 (2015); Klein J. S. et al. Examination of the contributions of size and avidity to the neutralization mechanisms of the anti-HIV antibodies b12 and 4E10. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 5;106(18):7385-90)。ある特定の実施形態では、ALiCE分子は、異なる立体配置を有し得る、例えば、ALiCE分子は、Y型で、またはT型で存在し得る。ある特定の実施形態では、ALiCE分子の異なる立体配置は、ALiCE分子中のN末端の2つのFab領域とC末端Fv領域間の異なる距離に寄与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のN末端の2つのFab領域とC末端Fv領域間の距離は、およそ40Åからおよそ70Åの間の範囲にあると推定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のN末端の2つのFab領域とC末端Fv領域間の距離は、およそ42Åであると推定され得る。一部の他の実施形態では、本明細書で提供される結合分子中のN末端の2つのFab領域とC末端Fv領域間の距離は、およそ60Åであると推定され得る。
したがって、本明細書で提供される種々の二重特異性結合分子では、第1の抗原に対する第1の抗原結合ドメインの結合親和性は、第2の抗原に対する第2の抗原結合ドメインの結合親和性よりも高い。例えば、以下の実施例3に示されるように、ACE-05のヒトPD-L1に対する結合動態は、親の抗PD-L1抗体(すなわち、Y-Biologics, Inc.製のYBL-007)に匹敵していた(図12A~12Cを参照されたい)。対照的に、ACE-05のCD3に対する結合親和性は、親の抗CD3抗体(BioLegend, USA製のUCHT1)よりもかなり低かった(図12A~12Cを参照されたい)。
一般的に言えば、抗原-抗体相互作用は、非共有結合性であり、可逆性であり、水素結合、疎水性相互作用、静電力およびファンデルワールス力の組合せによって形成される。抗原-抗体複合体の強度を説明する場合には、親和性および/または結合力が普通記載される。上記のように、抗体のその抗原との結合は、可逆的プロセスであり、結合の親和性は、通常、平衡解離定数(K)として報告される。Kは、抗体会合速度(konまたはk)(抗原に結合する速度)に対する抗体解離速度(koffまたはk)(抗原から解離する速度)の比である。一部の実施形態では、K値は、特定の抗体/抗原相互作用のkonおよびkoff速度を測定し、次いで、これらの値の比を使用して、K値を算出することによって決定される。K値は、個々の抗体/抗原相互作用の強度を評価し、ランク付けするために使用できる。抗体のKが低いほど、抗体のその標的に対する親和性は高い。結合力は、抗体-抗原複合体の全体的な力の尺度を与える。それは3つの主要なパラメータ:(i)抗体のエピトープに対する親和性、(ii)抗体と抗原療法の結合価および(iii)相互作用する部分の構造的配置に依存する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、1つまたは複数の標的、抗原またはエピトープに約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、約0.1nM以下、50pM以下、10pM以下または1pM以下の解離定数(K)で結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約20nM以下のKで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約10nM以下のKで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約1nM以下のKで結合する。一部の実施形態では、結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約0.5nM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約0.1nM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約50pM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約25pM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約10pM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに約1pM以下のKで結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の標的または抗原に対する解離定数は、Octet(登録商標)チップ上に固定化された標的タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質を使用して決定される解離定数である。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の標的または抗原に対する解離定数は、Octet(登録商標)チップ上の抗ヒトIgG抗体によって捕捉された結合物質および可溶性標的タンパク質を使用して決定される解離定数である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下または約0.1nM以下の半最大有効濃度(EC50)で結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、標的、抗原またはエピトープに、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下または約0.1nM以下のEC50で結合する。
ある特定の実施形態では、結合分子の第1の抗原に対するKは、結合分子の第2の抗原に対するKの約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、50倍またはそれより大きい。一部の実施形態では、結合分子の第1の抗原に対するKは、結合分子の第2の抗原に対するKの約10、10、10または10倍である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)は、1種または複数の「親」抗体の少なくとも部分を含む。一部の実施形態では、親抗体は、組換え抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ポリクローナル抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ヒト抗体または完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体は、IgG1抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体は、IgG2抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、IgG3抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、IgG4抗体である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)は、単離されている。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)は、実質的に純粋である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)またはその部分は、少なくとも1種のモノクローナル抗体に由来する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、当業者に公知のハイブリドーマ法を使用して調製する。例えば、免疫処置抗原に特異的に結合する抗体の産生を誘発するために、ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を、上記のように免疫処置する。一部の実施形態では、リンパ球をインビトロで免疫処置する。一部の実施形態では、免疫処置抗原は、ヒトタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、免疫抗原は、マウスタンパク質またはその断片である。
免疫処置後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適した骨髄腫細胞株と融合する。ハイブリドーマ細胞を当技術分野で公知のような特殊化培地を使用して選択し、非融合リンパ球および骨髄腫細胞は選択プロセスを生き残れない。選択された抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、それだけには限らないが、免疫沈降、免疫ブロット法およびインビトロ結合アッセイ(例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISAおよびラジオイムノアッセイ)をはじめとするさまざまな方法によって同定できる。ひとたび、所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定すると、クローンを、制限希釈技術によってサブクローニングできる。ハイブリドーマは、標準方法を使用してインビトロ培養で、または動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、それだけには限らないが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析をはじめとする当技術分野の標準方法に従って培養培地または腹水から精製できる。
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体を、当業者に公知の組換えDNA技術を使用して作製できる。例えば、ある特定の例では、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するRT-PCRなどによって成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から単離し、その配列は、標準技術を使用して決定する。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適した発現ベクターにクローニングし、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、これがモノクローナル抗体を産生する。
ある特定の他の実施形態では、組換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種の可変ドメインまたはCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離できる。ファージライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の種々の技術によって達成できる。
一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、例えば、組換えDNA技術を使用することによって修飾して、代替抗体を作製する。一部の実施形態では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えば、ヒト抗体の定常領域と置換して、キメラ抗体を作製できる、または非免疫グロブリンポリペプチドと置換して、融合抗体を作製できる。一部の実施形態では、定常領域は、末端切断型であるか、またはモノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製するように除去される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体の特異性および/または親和性を最適化するために、可変領域(複数可)の部位指定または高密度突然変異誘発が使用される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)またはその部分は、ヒト化抗体に由来する。ヒト化抗体を作製するための種々の方法が、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ヒト化は、1つまたは複数の非ヒトCDR配列をヒト抗体の対応するCDR配列と置換することによって実施される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体(例えば、げっ歯類)の6つのCDRすべてを、ヒト抗体の対応するCDR配列と置換することによって作製される。
ヒト化抗体の作製において使用されるべきヒト重鎖可変領域および軽鎖可変領域の選択は、さまざまな因子に基づいて、さまざまな方法によって行うことができる。一部の実施形態では、非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体の可変領域の配列が、既知ヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる「ベスト-フィット」法が使用される。非ヒト配列のものに最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のヒト可変領域骨格として選択される。一部の実施形態では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の可変領域骨格が選択される方法が使用される。一部の実施形態では、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスのコンセンサス配列に由来する。一部の実施形態では、ヒト生殖系列遺伝子は、可変領域フレームワーク配列の供給源として使用される。
ヒト化のための他の方法として、それだけには限らないが、CDRのヒト生殖系列フレームワークへの直接導入として記載される「スーパーヒト化」と呼ばれる方法、抗体「ヒト性」の計量に基づくヒトストリング含量(HSC)と呼ばれる方法、ヒト化変異体(ファージ、リボソーマルおよび酵母ディスプレイライブラリーを含む)の大きなライブラリーの作製に基づく方法およびフレームワーク領域シャッフリングに基づく方法が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)またはその部分は、ヒト抗体に由来する。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を使用して直接調製できる。一部の実施形態では、ヒト抗体は、インビトロで免疫処置された不死化ヒトBリンパ球から作製される。一部の実施形態では、ヒト抗体は、免疫処置された個体から単離されたリンパ球から作製される。任意の場合において、標的抗原に対する抗体を産生する細胞を作製し、単離できる。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して免疫処置していないドナーから得た免疫グロブリン可変領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生できる。抗体ファージライブラリーを作製および使用する技術は、当技術分野で周知である。ひとたび、抗体が同定されると、それだけには限らないが、鎖シャッフリングおよび部位特異的突然変異誘発をはじめとする当技術分野で公知の親和性成熟戦略を使用して、より高い親和性ヒト抗体を作製できる。
一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて産生される。これらのマウスは、免疫処置すると、内因性免疫グロブリン産生がなくとも、ヒト抗体の完全レパートリーを産生可能である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性結合分子)または本明細書に記載されるその部分は、少なくとも1つまたは複数の定常領域において修飾を含む抗体(例えば、全長抗体またはその断片)に由来する。一部の実施形態では、抗体は、3つの重鎖定常領域のうち1つまたは複数(例えば、CH1)への、および/または軽鎖定常領域(CL)への修飾を含む。一部の実施形態では、修飾された抗体の重鎖定常領域は、少なくとも1つのヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、修飾された抗体の重鎖定常領域は、1つより多いヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、定常領域への修飾は、1つまたは複数の領域における1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の領域が、修飾された抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失している。一部の実施形態では、全CH2ドメインが、抗体から除去されている(ΔCH2コンストラクト)。一部の実施形態では、全CH3ドメインが、抗体から除去されている(ΔCH3コンストラクト)。一部の実施形態では、省略された定常領域は、不在の定常領域によって通常付与される分子柔軟性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー(例えば、10個のアミノ酸残基)によって置き換えられる。
本明細書に記載される抗体(例えば、親抗体)および/または本明細書で提供される結合分子(例えば、二重特異性抗体)の定常領域への修飾は、周知の生化学または分子工学技術を使用して行うことができる。一部の実施形態では、変異体は、適当なヌクレオチド変化をコードするDNAに導入することによって、および/または所望のポリペプチドまたは物質の直接合成によって調製できる。この点において、修飾された結合物質の構造、結合活性および他の所望の特徴を実質的に維持しながら、特定の配列または領域によって提供される活性またはエフェクター機能を破壊することが可能であり得る。
本開示は、本明細書に記載される結合分子に対して実質的に相同である、追加の変異体および均等物をさらに包含する。一部の実施形態では、それだけには限らないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減または溶解度をはじめとする、結合分子の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい。当業者ならば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変更し得ることは理解されよう。
変動は、親結合物質の配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、多重特異性結合物質をコードする1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造および/または化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、例えば、ロイシンのセリンでの置き換え、例えば、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。一部の実施形態では、挿入または欠失は、約1~5個のアミノ酸の範囲にある。ある特定の実施形態では、置換、欠失または挿入は、親分子に対して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換または2個未満のアミノ酸置換を含む。生物学的に有用であるおよび/または関連しているアミノ酸配列における変動は、配列において挿入、欠失または置換を系統的に作製することおよび得られた変異体タンパク質を親タンパク質と比較して活性について試験することによって決定できる。
一部の実施形態では、変異体は、本明細書で提供される結合分子を構成する1つまたは複数のポリペプチドのアミノおよび/またはカルボキシル末端でのアミノ酸残基の付加を含み得る。追加のアミノ酸残基の長さは、1残基から数百個またはそれより多い残基の範囲であり得る。一部の実施形態では、変異体は、N末端メチオニル残基を含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチド/タンパク質を含む変異体、すなわち、融合タンパク質。ある特定の実施形態では、変異体は、検出可能であるように操作されており、検出可能な標識および/またはタンパク質(例えば、酵素)を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の適切なコンホメーションの維持に関与しないシステイン残基は、物質の特徴をモジュレートするために、例えば、酸化安定性を改善するためにおよび/または異常なジスルフィド架橋を防ぐために置換される、または欠失される。逆に、一部の実施形態では、1つまたは複数のシステイン残基は、安定性を改善するためにジスルフィド結合(複数可)を作出するように付加される。
一部の実施形態では、本開示の結合分子は「脱免疫処置」される。抗体などの物質の脱免疫処置は、一般に、物質の結合親和性または他の所望の活性を大幅に低減することなくT細胞エピトープを除去するために特定の突然変異を導入することからなる。
本明細書に記載される変異体結合分子またはポリペプチドは、それだけには限らないが、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング突然変異誘発およびPCR突然変異誘発をはじめとする当技術分野で公知の方法を使用して作製できる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、化学修飾される。一部の実施形態では、結合分子は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断および/または細胞性リガンドもしくは他のタンパク質との連結によって化学的に修飾されている二重特異性抗体である。多数の化学修飾のいずれも、既知技術によって実施できる。
本明細書に記載される多重特異性結合物質を構成するポリペプチドは、当技術分野で公知の、ならびに以下の節IIIおよび節IVにおいてより詳細に記載される任意の適した方法によって製造できる。
本開示はまた、本明細書に記載される結合分子(例えば、二重特異性抗体)のうちいずれか1つを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、追加の分子と結合される。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、細胞傷害性薬剤または部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされて、ADC(抗体-薬物コンジュゲート)を形成する。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、メトトレキサート、アドリアマイシン/ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、デュオカルマイシン、ダウノルビシン、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)または他のインターカレート剤をはじめとする化学療法薬である。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、アウリスタチン、マイタンシノイド(例えば、DM1およびDM4)およびツブリシン(tubulysins)をはじめとする微小管阻害剤である。一部の実施形態では、細胞傷害性部分は、それだけには限らないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒の非結合活性断片、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)およびトリコテセン(tricothecene)をはじめとする、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片である。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、1つまたは複数の小分子毒、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン(trichothenes)およびCC1065にコンジュゲートされる。誘導体が細胞傷害性活性を保持する限り、コンジュゲートにおいてこれらの毒素のうちいずれか1種の誘導体を使用できる。
本明細書で提供される結合分子を含むコンジュゲートは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して作製できる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール(pyridyidithiol))プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHClなど)、活性エステル(スベリン酸ジスクシンイミジルなど)、アルデヒド(グルタルアルデヒドなど)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート(トルエン2,6-ジイソシアネートなど)およびビス活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど)を使用して作製される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される結合分子(例えば、二重特異性抗体)は、抗体が診断および/または検出のために使用されることを可能にする検出可能な物質または分子にコンジュゲートされる。検出可能な物質として、それだけには限らないが、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ;補欠分子族、例えば、ビオチンおよびフラビン類;蛍光材料、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、シアニン(Cy3)およびフィコエリトリン;生物発光物質、例えば、ルシフェラーゼ;放射性物質、例えば、212Bi、14C、57Co、51Cr、67Cu、18F、68Ga、67Ga、153Gd、159Gd、68Ge、H、166Ho、131I、125I、123I、121I、115In、113In、112In、111In、140La、177Lu、54Mn、99Mo、32P、103Pd、149Pm、142Pr、186Re、188Re、105Rh、97Ru、35S、47Sc、75Se、153Sm、113Sn、117Sn、85Sr、99mTc、201Ti、133Xe、90Y、69Yb、175Yb、65Zn;ポジトロン放出金属;および磁性金属イオンを挙げることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される本明細書で提供される結合分子は、標的抗原(複数可)のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に付着される。このような固相支持体として、それだけには限らないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、医薬組成物に製剤化される。したがって、さらに別の態様では、本明細書で提供される結合分子の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。本明細書で提供される医薬組成物は、以下の節Vにより詳細に記載される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象における疾患または状態の処置において使用するためのものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、PD-L1陽性がんである。一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である。一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。
一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、疾患または状態の処置のために使用される。したがって、さらに別の態様では、対象における疾患または状態を処置する方法であって、本明細書で提供される結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんは、PD-L1陽性がんである、一部の実施形態では、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、がんは、非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である。一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。本結合分子を投与する方法のより詳細な説明は、以下の節VIに示されている。
III.ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される結合分子をコードするポリヌクレオチドを包含する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本開示のポリヌクレオチドは、RNAの形態である場合も、DNAの形態である場合もある。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含み、二本鎖である場合も一本鎖である場合もあり、一本鎖は、コーディング鎖である場合も、非コーディング(アンチセンス)鎖である場合もある。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌において補助するポリヌクレオチドと同じリーディングフレームに融合されたポリペプチドのコード配列を含む(例えば、ポリペプチドの輸送を管理するために分泌配列として機能するリーダー配列)。ポリペプチドは、ポリペプチドの「成熟した」形態を形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することもある。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マーカーまたはタグ配列と.同じリーディングフレームに融合されるポリペプチドのコード配列を含む。例えば、一部の実施形態では、マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合されたポリペプチドの効率的な精製を可能にするベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグである。一部の実施形態では、マーカーは、他の親和性タグとともに使用される。
本開示はさらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの変異体に関し、変異体は、例えば、ポリペプチドの断片、類似体および/または誘導体をコードする。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される結合分子を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約80%同一である、少なくとも約85%同一である、少なくとも約90%同一である、少なくとも約95%同一である、一部の実施形態では、少なくとも約96%、97%、98%または99%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
本明細書で使用される場合、語句「参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、95%「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり最大5点の突然変異を含み得る点を除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であることを意味するものとする。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大5%は、欠失または別のヌクレオチドと置換されてもよく、いくつかのヌクレオチド、参照配列中の総ヌクレオチドの最大5%が、参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端位置で、または参照配列においてヌクレオチドの間に個々に、もしくは参照配列内の1つもしくは複数の連続する基で散在するそれらの末端位置の間のどの場所でも生じ得る。
ポリヌクレオチド変異体は、コーディング領域、非コーディング領域または両方中に変更を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加または欠失をもたらすが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない(遺伝暗号の縮重のために)サイレント置換を含む。ポリヌクレオチド変異体は、さまざまな理由のために、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化するために(すなわち、ヒトmRNA中のコドンを、大腸菌などの細菌宿主によって好まれるものに変更する)製造され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、配列の非コーディングまたはコーディング領域中に少なくとも1つのサイレント突然変異を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現(または発現レベル)をモジュレートまたは変更するために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現を増大するために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの発現を減少させるために製造される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現を増大した。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現を減少させた。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離されている。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も、提供される。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、1つまたは複数のポリヌクレオチド分子を含む。
IV.結合分子を作製する方法
さらに別の態様では、本明細書で提供される種々の結合分子を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、1つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、結合分子を作製する方法であって、1つまたは複数のベクターが、
(a)各々が抗体軽鎖である第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
(b)第1のVH領域と第1のCH1領域と第2のVH領域とを含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
(c)第3のVH領域と第2のCH1領域とVL領域とを含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
を含み、
前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ、
前記第3のポリペプチドの第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドのVL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができる、
方法が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域を含む。一部の特定の実施形態では、抗体ヒンジ領域は、IgGヒンジ領域である。一部のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG1サブタイプのものである。他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG2サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG3サブタイプのものである。さらに他のより特定の実施形態では、IgGヒンジ領域は、IgG4サブタイプのものである。一部の実施形態では、柔軟なペプチド領域は、抗体ヒンジ領域と第2の抗原結合ドメインの間にリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、(G4S)n(ここで、nは整数である)のアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。一部のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。さらに他のより特定の実施形態では、リンカーは、(G4S)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、異なる抗原に結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の同じエピトープに結合する。他の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
ある特定の実施形態では、第1のFab領域および第2のFab領域は、第1の抗原結合ドメインを形成し、Fv領域は、第2の抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ抗原と結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合ドメインは、第1の抗原結合ドメインが結合するエピトープのうち少なくとも1つと同じエピトープに結合する。
他の実施形態では、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、第1の抗原結合ドメインは、第1の抗原に結合し、第2の抗原結合ドメインは、第2の抗原に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原である。他の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原ではない。
一部の実施形態では、第2の抗原は、リンパ球および単球をはじめとする免疫細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、T細胞上に発現される。一部の実施形態では、第2の抗原は、B細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、樹状細胞上に発現される。他の実施形態では、第2の抗原は、顆粒細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、自然リンパ系細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、巨核球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、単球上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現される。さらに他の実施形態では、第2の抗原は、NK細胞上に発現される。
一部の特定の実施形態では、第2の抗原は、CD3である。一部の実施形態では、第1の抗原は、がん抗原であり、第2の抗原は、CD3である。
一部のより特定の実施形態では、第1の抗原は、PD-L1であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号4のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号8のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号3のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号22のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号20のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号21のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、CD20であり、第2の抗原は、CD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号27、配列番号28、配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号26のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号30のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号25のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号36のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号34のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号35のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原はEGFRであり、第2の抗原はCD3である。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号41、配列番号42および配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVH領域は、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、Fv領域のVL領域は、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号40のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号44のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号12のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、各々、配列番号39のアミノ酸配列を有し、第3のポリペプチドは、配列番号37のアミノ酸配列を有し、第4のポリペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第1の核酸は、配列番号50のヌクレオチド配列を有し、第2の核酸は、配列番号48のヌクレオチド配列を有し、第3の核酸は、配列番号49のヌクレオチド配列を有する。
他のより特定の実施形態では、第1の抗原は、Her2であり、第2の抗原は、TNFアルファである。一部の実施形態では、各Fab領域の第1の部分のVH領域は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、各Fab領域の第2の部分のVL領域は、配列番号52のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVH領域は、配列番号53のアミノ酸配列を有し、Fv領域のVL領域は、配列番号54のアミノ酸配列を有する。
本明細書で提供される結合分子の組換え発現は、結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とし得る。ひとたび、本明細書で提供される結合分子、抗体重鎖または軽鎖またはその断片(例えば、必ずしもそうではないが、重鎖および/または軽鎖可変ドメインを含有する)をコードするポリヌクレオチドが得られると、当技術分野で周知の技術を使用する組換えDNA技術によって、結合分子を産生するためのベクターを製造できる。したがって、コードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して、コード配列と適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法として、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。また、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で提供される結合分子もしくはその断片または重鎖もしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば、国際公開番号WO86/05807およびWO89/01036ならびに米国特許第5,122,464号を参照されたい)、全重鎖、全軽鎖または全重鎖および全軽鎖の両方の発現のために、抗体の可変ドメインを、このようなベクターにクローニングできる。
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞は次いで、本明細書で提供される結合分子を産生するように従来の技術によって培養される。したがって、異種プロモーターに作動可能に連結された本明細書で提供される結合分子もしくはその断片またはその重鎖もしくは軽鎖もしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞も本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の種々の部分をコードするポリヌクレオチドを含む複数のベクターが、以下に詳述されるように、全結合分子の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。
本明細書で提供される結合分子を発現させるために、さまざまな宿主発現ベクター系を利用できる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい)。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後精製され得る媒体に相当するが、また、適当なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本明細書で提供される結合分子をインサイツで発現し得る細胞にも相当する。これらとして、それだけには限らないが、コード配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換された細菌(例えば、大腸菌および枯草菌(B.subtilis))などの微生物;コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)ピキア(Pichia));コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、もしくはコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)を用いて形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0および3T3細胞)が挙げられる。特に、組換え抗体分子全体の発現のための大腸菌または真核細胞などの細菌細胞を、組換え結合分子の発現のために使用できる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと協力して、抗体またはその変異体のための有効な発現系である(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2)。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、CHO細胞において産生される。特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーター、誘導プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。
細菌系では、発現されている結合分子に対して意図される使用に応じていくつかの発現ベクターが選択され得ることが有利である。例えば、結合分子の医薬組成物の作製のために大量のこのような結合分子が産生される予定である場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとして、それだけには限らないが、コード配列を、lac Zコーディング領域とインフレームでベクターに個々にライゲーションすることができ、その結果、融合タンパク質が産生される大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791);pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)などが挙げられる。pGEXベクターもまた、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用できる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、それに続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビンまたはファクターXaプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように設計される。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞において増殖する。コード配列を、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリへ?リンプロモーター)の制御下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的のコード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列にライゲーションできる。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノム(例えば、領域E1またはE3)の非必須領域への挿入は、感染宿主において生存可能であり、結合分子を発現可能である組換えウイルスをもたらすであろう(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照されたい)。挿入されたコード配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルも必要である場合がある。これらのシグナルとして、ATG開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。さらに、全挿入部分の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、さまざまな起源のもの、両方とも天然および合成であり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る(例えば、Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい)。
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートする、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択できる。タンパク質産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的な、特定の機序を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適当な細胞株または宿主系を選択できる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核細胞宿主細胞を使用できる。このような哺乳動物宿主細胞として、それだけには限らないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(免疫グロブリン鎖を内因性に全く産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が挙げられる。
組換えタンパク質の長期の、高収率産生のためには、安定な発現が利用され得る。例えば、結合分子を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーによって制御されたDNAを用いて、宿主細胞を形質転換できる。外来DNAの導入後、操作された細胞を濃縮培地で1~2日間増殖させることができ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込み、成長して病巣を形成し、次いで、クローニングされ、細胞株中に拡大され得ることを可能にする。この方法は、結合分子を発現する細胞株を操作するために使用され得ることが有利である。このような操作された細胞株は、結合分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
それだけには限らないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17)をはじめとするいくつかの選択系が使用されることができ、遺伝子は、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る:メトトレキサートに対する耐性を付与する、dhfr(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527);ミコフェノール酸に対する耐性を付与する、gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072);アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する、neo(Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15);およびハイグロマイシンに対する耐性を付与する、hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147)。組換えDNA技術の当技術分野で一般に公知の方法を、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、このような方法は、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されており、それらは、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
結合分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る(概要については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the の発現 cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい)。結合分子を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大が、マーカー遺伝子のコピー数を増大する。増幅された領域は、結合分子遺伝子と関連しているので、結合分子の産生も増大する(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
宿主細胞は、本明細書で提供される複数の発現ベクターを用いて同時トランスフェクトされ得る。ベクターは、それぞれのコードするポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有し得る。あるいは、複数のポリペプチドをコードし、発現することが可能である単一ベクターが使用され得る。コード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含み得る。
ひとたび、本明細書で提供される結合分子が組換え発現によって産生されると、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインA後特異的抗原に対する親和性によって、サイジングカラムクロマトグラフィーおよびカッパセレクト(kappa-select)親和性クロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質の精製のための任意のその他の標準技術によって精製され得る。特定の実施形態では、Fab(カッパ)断片またはFab断片を含有する結合分子の精製のために、カッパセレクト(例えば、GE Healthcare Life Scienceによって開発されたカッパセレクト(KappaSelect))が使用される。さらに、本明細書で提供される結合分子は、本明細書に記載される、またはそうでなければ、精製を促進するために当技術分野で公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得る。
V.医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示の少なくとも1つの結合分子を含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される結合分子の治療有効量および薬学的に許容される担体を含む。
結合分子を含む医薬組成物は、水溶液または凍結乾燥もしくは他の乾燥形態で、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤[例えば、Remington, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1980)を参照されたい]と望ましい程度の純度を有する結合分子とを混合することによって保存のために調製される。
本開示の結合分子は、標的細胞/組織へのデリバリーのために、例えば、マイクロカプセルまたはマクロエマルジョンとして(Remington、上記;Park et al., 2005, Molecules 10:146-61;Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51)、徐放性製剤として(Putney and Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57)またはリポソーム中に(Maclean et al., 1997, Int. J. Oncol. 11:325-32;Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45)任意の好適な形態で製剤化され得る。
本明細書で提供される結合分子は、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド性薬物デリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)に、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。そのような技術は、例えば、Remington,上記に開示されている。
種々の組成物およびデリバリーシステムは、周知であり、本明細書に記載の結合分子を含んで使用されてよく、これだけに限らないが、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、結合分子を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32を参照されたい)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸のコンストラクトなどが挙げられる。別の実施形態では、組成物は、放出制御または徐放システムとして提供され得る。一実施形態では、ポンプは、放出制御または徐放を達成するために使用され得る(例えば、Langer、上記;Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40;Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-16;およびSaudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー性材料は、予防剤または治療剤(例えば、本明細書に記載の結合分子)または本明細書で提供される組成物の放出制御または徐放を達成するために使用され得る[例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974);Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984);Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126;Levy et al., 1985, Science 228:190-92;During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-56;Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105-12;米国特許第5,679,377号;第5,916,597号;第5,912,015号;第5,989,463号;および第5,128,326号;PCT公開WO99/15154およびWO99/20253を参照されたい]。徐放性製剤において使用されるポリマーの例として、これだけに限らないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態では、徐放性製剤において使用されるポリマーは、不活性、溶出性不純物不含有、保存において安定、滅菌および生分解性である。
さらに別の実施形態では、放出制御または徐放システムは、具体的な標的組織、例えば、鼻腔または肺に近接するように位置させてよく、それにより全身用用量の一部だけを必要とする[例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)を参照されたい]。放出制御システムは、例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-33によって考察されている。当業者に周知の任意の技術は、1つまたは複数の本明細書に記載の結合分子を含む徐放性製剤を産生するために使用され得る(例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開WO91/05548およびWO96/20698、Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89;Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97;Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54;およびLam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60を参照されたい)。
VI.投与方法
具体的な実施形態では、本明細書で提供される結合分子を含む、疾患または状態の予防、管理、処置および/または改善における使用のための組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の予防における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。他の実施形態では、がんはPD-L1陽性がんである。一部の実施形態では、がんは肺がんである。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺癌(NSCLC)である。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)である。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。一部の実施形態では、がんは乳がんである。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。ある特定の実施形態では、対象はそれを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の予防、管理、処置または改善をもたらす。
一実施形態では、疾患または状態の症状の予防、管理、処置および/または改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の予防における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の管理における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の処置における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態の症状の改善における使用のための組成物であって、本明細書で提供される結合分子を含む組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患はがんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の症状の予防、管理、処置または改善をもたらす。
別の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を予防する、管理する、処置するおよび/または改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を予防する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を管理する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態はがんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の予防、管理、処置または改善をもたらす。
別の実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を予防する、管理する、処置するおよび/または改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を予防する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を管理する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態の症状を処置する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、本明細書で提供される結合分子の有効量を投与することを含む、対象における疾患または状態を改善する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、疾患または状態は、がんである。ある特定の実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患または状態を有するリスクがある。一部の実施形態では、投与は、疾患または状態の症状の予防、管理、処置または改善をもたらす。
同様に、本明細書で提供される結合分子または本明細書で提供される結合分子を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することによって、疾患または状態を予防する、管理する、処置するおよび/または改善する方法が本明細書で提供される。一態様では、結合分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。ある特定の実施形態では、結合分子は、1つまたは複数の完全なヒトモノクローナル抗体に由来する。治療を投与される対象は、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)または霊長類(例えば、カニクイザル(cynomolgous)などのサルもしくはヒト)などの哺乳動物であってよい。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は疾患または状態、例えばがんを有するヒトである。
種々のデリバリーシステムが周知であり、予防剤または治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子)を投与するために使用でき、これだけに限らないが、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、結合分子を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス[例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい]、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸のコンストラクションなどが挙げられる。予防剤もしくは治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子)または医薬組成物を投与する方法として、これだけに限らないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外ならびに粘膜(例えば、鼻腔内および経口経路)が挙げられる。具体的な実施形態では、予防剤もしくは治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子)または医薬組成物は、鼻腔内に、筋肉内に、静脈内にまたは皮下に投与される。予防剤もしくは治療剤または組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内膜(例えば、経口粘膜、鼻腔内粘膜、直腸内および腸管粘膜など)を通じた吸収によって投与されてよく、他の生物学的活性剤と共に投与されてよい。投与は、全身性または局所的であってよい。加えて、肺内投与も、例えば、吸入剤またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって使用され得る。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,019,968号,第5,985,320号,第5,985,309号,第5,934,272号,第5,874,064号,第5,855,913号,第5,290,540号および第4,880,078号;ならびにPCT公開WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346およびWO99/66903を参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または医薬組成物を処置を必要とする領域に局所的に投与することは望ましい場合がある。これは、例えば、限定の目的ではなく、局所注入によって、局所(topical)投与によって(例えば、鼻腔内スプレーによって)、注射によって、またはインプラントの手段によって達成でき、前記インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜または繊維などの膜が挙げられる多孔性、非多孔性またはゼラチン性材料である。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体を投与する場合、抗体を吸収しない材料を使用することに注意が払われるべきである。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または組成物は、小胞中、特にリポソーム中でデリバリーされ得る[Langer, 1990, Science 249:1527-1533;Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989);Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい;一般に同書を参照されたい]。
別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤または組成物は、放出制御または徐放システムにおいてデリバリーされ得る。一実施形態では、ポンプは、放出制御または徐放を達成するために使用され得る(Langer, 上記;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20;Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507;Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー性材料は、予防剤もしくは治療剤(例えば、本明細書で提供される抗体)または本明細書で提供される組成物の放出制御または徐放を達成するために使用され得る[例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974);Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい;Levy et al., 1985, Science 228:190;During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351;Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照されたい];米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;PCT公開WO99/15154;およびPCT公開WO99/20253。徐放性製剤において使用されるポリマーの例として、これだけに限らないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態では、徐放性製剤において使用されるポリマーは、不活性、溶出性不純物不含有、保存において安定、滅菌および生分解性である。さらに別の実施形態では、放出制御または徐放システムは、治療標的、すなわち、鼻腔または肺に近接するように位置させてよく、それにより全身用用量の一部だけを必要とする[例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 上記, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい]。放出制御システムは、Langerによる概説(1990, Science 249:1527-1533)において考察されている。当業者に周知の任意の技術は、1つまたは複数の本明細書で提供される結合分子を含む徐放性製剤を産生するために使用され得る。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,526,938号、PCT公開WO91/05548、PCT公開WO96/20698、Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854およびLam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物が予防剤または治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子)をコードする核酸である場合、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部としてコンストラクトし、例えばレトロウイルスベクターの使用によって(米国特許第4,980,286号を参照されたい)または直接注射によって、または微小粒子銃(例えば、遺伝子銃;Biolistic、Dupont)もしくは脂質を用いてコーティングすることもしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤の使用によって、または核に侵入することが周知であるホメオボックス様ペプチドとの関連でそれを投与することによって(例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照されたい)など、それが細胞内になるように投与することによって、そのコードされた予防剤または治療剤の発現を促進するようにインビボ(in vivo)に投与され得る。代替的に、核酸は、相同組換えによって発現のために、細胞内に導入され、宿主細胞DNA内に組み込まれ得る。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される1つ、2つまたはそれ以上の結合分子を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される1つ、2つまたはそれ以上の結合分子および本明細書で提供される結合分子以外の予防剤または治療剤を含む。一実施形態では、薬剤は、疾患または状態の予防、管理、処置および/または改善のために有用であることが周知である、または使用されているもしくは現在使用されている。予防剤または治療剤に加えて、本明細書で提供される組成物は、担体も含む場合がある。
本明細書で提供される組成物として、単位投与形態の調製において使用され得る医薬組成物(例えば、対象または患者への投与のために好適である組成物)の製造において有用なバルク薬物組成物を含む。一実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物である。かかる組成物は1つまたは複数の予防剤または治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子または他の予防剤もしくは治療剤)および薬学的に許容される担体の予防または治療有効量を含む。医薬組成物は、対象への投与の経路のために好適であるように製剤化され得る。
具体的な実施形態では、用語「担体」は、それと共に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント[例えば、フロイントのアジュバント(完全および不完全)]、賦形剤または媒体を指す。かかる医薬品担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む水および油などの滅菌液体であってよい。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の例示的担体である。生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセリン溶液も液体担体として、特に注射可能な溶液のために、使用され得る。好適な医薬品賦形剤として、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて少量の湿潤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤も含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放製剤などの形態をとる場合がある。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体も含む場合がある。好適な医薬品担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAに記載されている。かかる組成物は、精製された形態などでの本明細書で提供される結合分子の予防または治療有効量を、患者への適切な投与のための形態を提供するための好適な量の担体と共に含有する。製剤は、投与様式に適していなければならない。
一実施形態では、組成物は、日常的手順により、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるためにリグノカムン(lignocamne)などの局所麻酔も含む場合がある。しかし、かかる組成物は、静脈内以外の経路によって投与される場合もある。
一般に、本明細書で提供される組成物の成分は、別々にまたは単位投与形態中に合わせて混合されてのいずれかで、活性剤の量を表示しているアンプルまたはサシェ(sachette)などの密閉シールされている容器中に、例えば、乾燥した凍結乾燥粉剤または水不含有濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルに分注されていてもよい。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与の前に混合され得るように提供されてもよい。
本明細書で提供される結合分子は、抗体の量を表示しているアンプルまたはサシェなどの密閉シールされている容器に包装されてよい。一実施形態では、結合分子は、密閉シールされている容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉剤または水不含有濃縮物として供給され、対象への投与のために好適な濃度に、例えば、水または生理食塩水を用いて復元されてよい。凍結乾燥結合分子は、その元の容器中で2から8℃の間で保存されてよく、結合分子は、復元後6時間以内、5時間以内、3時間以内または1時間以内などの12時間以内に投与されてよい。代替的実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、抗体の量および濃度を表示している密閉シールされている容器に液体形態で供給される。
本明細書で提供される組成物は、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のものなどのアニオンと形成されたものおよびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどのカチオンと形成されたものが挙げられる。
疾患または状態の予防、管理、処置および/または改善において有効である、本明細書で提供される予防剤もしくは治療剤(例えば、本明細書で提供される結合分子)または組成物の量は、標準的臨床技術によって決定され得る。加えて、インビトロ(in vitro)アッセイは、最適な投与量範囲を決定することを助けるために使用されてもよい。製剤において使用される正確な用量は、投与の経路および疾患または状態の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の事情に応じて決められるべきである。
有効用量は、インビトロまたは動物モデル検査システム由来の用量応答曲線から外挿され得る。
ある特定の実施形態では、患者への本明細書で提供される結合分子の用量のための投与の経路は、鼻腔内、筋肉内、静脈内、またはこれらの組合せであるが、本明細書に記載の他の経路も許容される。各用量は、同一の投与の経路によって投与されてもされなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、複数の投与の経路を介して、本明細書で提供される同じもしくは異なる結合分子の他の用量と同時にまたは続いて投与されてよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される結合分子は、予防的にまたは治療的に対象に投与される。本明細書で提供される抗体は、疾患またはその症状を予防、和らげるまたは改善するために予防的にまたは治療的に対象に投与され得る。
簡潔さのために、ある特定の略号が本明細書において使用される。一例は、アミノ酸残基を表すための1文字略号である。アミノ酸およびそれらの対応する3文字および1文字略号は以下のとおりである:
Figure 0007076571000003


本発明は、一般に、多数の実施形態を記載するために肯定的な用語を使用して本明細書に開示されている。本発明は、物質または材料、方法ステップおよび条件(condition)、プロトコール、手順、アッセイまたは分析などの特定の対象物が完全にまたは部分的に除外されている実施形態も明確に含む。したがって、本発明は、本発明が含まないものに関して本明細書において一般に表されていないが、本発明に明確に含まれるとされていない態様は、しかしながら本明細書に開示されている。
本発明の多数の実施形態が記載された。しかしながら、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解される。したがって、以下の実施例は、例示の目的であり、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
例示的結合分子のコンストラクションおよび発現
本実施例は、本明細書で提供される例示的結合分子(図1A~1Eに例示する)、特に、結合分子ACE-00、ACE-02、ACE-03、ACE-04、ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11およびACE-12のコンストラクションおよび発現を例示する。例示的結合分子のそれぞれにおいて第1および第2の抗原を標的化する構成成分を下の表に要約する。
表3:例示的結合分子において第1および第2の抗原を標的化する構成成分
Figure 0007076571000004


アミノ酸配列において使用する形式:
太字:VHまたはVL;
太字および下線:CDR;
斜字体:抗体ヒンジ領域;
小文字:可動性リンカー;
[角括弧]:CH1;
[角括弧および下線]:CL
1.1.ACE-00のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、その第2の抗原結合Fv領域がTNFアルファに結合し、その第1の抗原結合ドメイン(Fab領域)がHer2抗原に結合するACE-00を発現させるために使用した(図2Fを参照されたい)。ACE-00は、図1Aに例示する例示的結合分子と同じ全体構造を有する。簡潔には、ACE-00は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-00-VHおよびACE-00-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-00-LC)を含有する。ACE-00の抗Her2ドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、トラスツズマブであり、ACE-00の抗TNFアルファドメインをコンストラクトするために使用した親抗体は、アダリムマブである。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-00-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000005
(配列番号115)
ACE-00-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000006
(配列番号116)
ACE-00-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
Figure 0007076571000007
(配列番号117)
Her2を標的化する二価Fab領域およびTNFアルファを標的化する一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列を下の表に列挙する:
表4:ACE-00のVHおよびVL
Figure 0007076571000008


ACE-00-VH、ACE-00-VLおよびACE-00-LCをコードするDNAのトリトランスフェクション(tri-transfection)を下に簡潔に記載のとおり実施した。ポリエチレンイミン(PEI)をトランスフェクション試薬として使用した(DNA:PEI=1:4(w/w)の比で使用)。トランスフェクション6から7日後、細胞生存率が約60%から70%であると測定された際に、バッチ培養を中止し、発現培地を回収し、デブリを除去するために遠心分離した(4,800rpm、30分間、4℃)。次いで上清を0.22μmTOP-filter(Millipore、USA)を使用して濾過した。続いて、ACE-00分子を含む濾過上清にHitrap(商標)KappaSelect(GE healthcare、USA)を使用して親和性クロマトグラフィー精製工程を行い、溶出緩衝剤変更のためにSlide-A LyzerDialysis Cassette(Thermo、USA)を使用し、pH7.4 PBSを用いた透析が続いた。精製したタンパク質をSDS-PAGE、キャピラリー電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析した。精製したACE-00分子をAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Germany)およびSEC-HPLC(ThermoFisher、USA)を使用してそれらの純度についても分析した。純度分析を製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
対照として、ACE-00-VLおよびACE-00-LCをコードするDNAのHEK-293細胞へのバイトランスフェクション(bi-transfection)を実施した。SDS-PAGEをACE-00(2つの異なる重鎖様鎖ACE-00-VHおよびACE-00-VLを含有する)とACE-00-VL2(2つの同一の重鎖様鎖ACE-00-VLを含有する)とのアセンブリーパターンの差異を同定するために実施した(図2A~2B)。
抗体は、四量体Hとしてアセンブルおよび分泌され、品質管理機構は、小胞体(ER)において、内腔結合タンパク質(luminal binding protein)(BiP)およびタンパク質ジスルフィド異性化酵素(PDI)などのERシャペロンによって非常にしっかりと制御されている。重鎖のフォールディングしていないCH1ドメインがBiP依存性様式で抗体アセンブリーの制御において役割を有することは周知である。BiPは、CH1およびCLのヘテロ二量体形成および、小胞体関連タンパク質分解(ERAD)の制御による抗体アセンブリーにおける品質管理機構において役割を演じている可能性がある[Lee Y. K. et al. BiP and immunoglobulin light chain cooperate to control the folding of heavy chain and ensure the fidelity of immunoglobulin assembly. Mol Biol Cell. 1999 Jul;10(7):2209-19;Feige M. J. et al. An unfolded CH1 domain controls the assembly and secretion of IgG antibodies. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569-79;Feige M. J. et al. How antibodies fold. Trends Biochem Sci. 2010 Apr;35(4):189-98、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる]。VHドメインとBiPとの間の可能性がある相互作用を、2つの異なるALiCE重鎖がVH-VLの特異的相互作用によってヘテロ二量体を形成できるかどうかを検討するために調査した。CH1またはVH-CH1切断型重鎖、ΔCH1もしくはΔVH-CH1をHEK293細胞にクローニングし、デリバリーした。野生型HCまたは切断型HCコンストラクトをHEK293細胞にデリバリーした。各トランスフェクタントから得られた細胞可溶化物を、抗Fc-HRP(Thermo Fisher)および抗BiP-HRP(R&D systems)を使用してBiPに結合できる抗体ドメインを同定するためにプロテインAビーズを用いて沈殿させた。
いかなる具体的な機構または理論にも束縛されることなく、次の結果が得られた。共沈殿BiPがΔCH1およびWT-HCクローントランスフェクトした可溶化物においてウエスタンブロットによって見出され、VHとBiPとの相互作用を示している(図2C)。さらに、分泌されたポリペプチドがΔVH-CH1トランスフェクトした発現培地において検出され、BiPが重鎖のVHおよび/またはCH1ドメインとの相互作用によって重鎖のアセンブリーおよび分泌を制御できることを示している(図2C~2E)。潜在的に、抗体VHドメインもこの研究のBiP依存性様式において抗体アセンブリーの役割を有することが見出された(図2C~2Eを参照されたい)。図2Fに示すとおり、2つのVH領域(Fab領域に1つおよびFv領域に1つ)を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖、すなわち、この研究でのACE-00-VHは、哺乳動物発現系において本明細書で提供される結合分子の適切なアセンブリーに寄与する。この品質管理システムがなければ、ポリペプチド鎖の多数の望ましくないさまざまな組合せが発現培地に見出されるであろう。
KappaSelectをACE-00およびACE-00-VL2タンパク質についての親和性クロマトグラフィーのために使用した。図2Gに示すとおり、素通り(F.T)レーンに未結合ACEは検出されなかった。
次にキャピラリー電気泳動をACE-00-VL2とACE-00との間の分子サイズの区別を同定するために実施した。図2Hでは、図(左)における各ピークのサイズは表(右)に示されている。ピーク7はACE-00-VL/ACE-00-LC二量体複合体を表し、ピーク8は、ACE-00-VH/ACE-00-LC二量体複合体を表す。ACE-00の分子量は、ACE-00-VL2(ピーク12)より4kDa高かった。
キャピラリー電気泳動結果もACE-00およびACE-00-VL2分子のコンホメーションを示した。図2Iに示すとおり、大部分(およそ99%)のACE-00分子は、ヘテロ二量体形態で存在する。次にキャピラリー等電点電気泳動を実施し、ACE-00-VH鎖とACE-00-VL鎖との間のヘテロ二量体化を実証した。pI値を、ACE-00およびACE-00-VL2のそれぞれについてcIEFによって測定した。結果を図2Jに示す。ACE-00-VHとACE-00-VL鎖との間の高効率のヘテロ二量体化は、図2Kに示すSDS-PAGEおよびキャピラリー電気泳動結果で実証された。図2Lに示すとおり、少量のタンパク質凝集物がACE-00のサイズ排除クロマトグラフィーにおいて見出され、大部分のACE-00は、可溶性で均一な構造にあり、ヘテロ二量体化の高効率をさらに実証した。
これらの結果は、ACE-00が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。これらの結果は、2つのVH領域(Fab領域に1つおよびFv領域に1つ)を含有する本明細書で提供される結合分子の重鎖様鎖が、哺乳動物発現系における本明細書で提供される結合分子の適切なアセンブリーに寄与し、Fv領域におけるVH-VL相互作用が2つの重鎖様鎖のヘテロ二量体化を促進する主な推進力であることも示している。同様の検査を下に記載する他の例示的結合分子(例えば、ACE-05、ACE-10およびACE-11)についても実施し、これらの分子について同じ結論に達した。
1.2.ACE-02のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-02を発現させるために使用した。ACE-02は、抗CD19およびヒト化抗CD3 12F6ドメインからなる。ACE-02は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-02-VHおよびACE-02-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-02-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ACE-02-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000009
(配列番号88)
ACE-02-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000010
(配列番号89)
ACE-02-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
Figure 0007076571000011
(配列番号90)
CD19を標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびヒト化12F6の第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表5:ACE-02のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000012


ACE-02-VH、ACE-02-VLおよびACE-02-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-02-VHヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTACACCAAGTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGCTTCACCATCAGCGCCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGCTGGCAGGACTACGACGTGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(配列番号100)
ACE-02-VLヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTTCTGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(配列番号101)
ACE-02-LCヌクレオチド配列(抗CD19抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号102)
図3では、SDS-PAGE結果は、ACE-02、ACE-03、ACE-00およびACE-01の発現を示している。ACE-02とACE-02-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにACE-03とACE-03-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異も示している。ACE-01は、第1の抗原を標的化する抗CD19 Abの親抗体および第2の抗原を標的化するマウスOKT3を有する。これらの結果は、ACE-02が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
1.3.ACE-03のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-03を発現させるために使用した。ACE-03は、抗CD19およびヒト化抗CD3 OKT3ドメインからなる。ACE-03は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-03-VHおよびACE-03-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-03-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-03-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000013
(配列番号91)
ACE-03-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000014
(配列番号92)
ACE-03-LCアミノ酸配列(抗CD19抗体軽鎖):
Figure 0007076571000015
(配列番号90)
CD19を標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびヒト化OKT3の第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表6:ACE-03のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000016


ACE-03-VH、ACE-03-VLおよびACE-03-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-03-VHヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACCGCTTCACCATCAGCACCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(配列番号103)
ACE-03-VLヌクレオチド配列:
CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(配列番号104)
ACE-03-LCヌクレオチド配列(抗CD19抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号102)
図3では、SDS-PAGE結果は、ACE-02、ACE-03、ACE-00およびACE-01の発現を示している。ACE-02とACE-02-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異およびACE-03とACE-03-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異も示している。これらの結果は、ACE-03が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
1.4.ACE-04のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供されるALiCE分子ACE-04を発現させるために使用した。ACE-04は、抗PD-L1およびキメラOKT3 Fabドメインからなる(図4Aを参照されたい)。ACE-04は、2つの異なる重鎖様鎖ACE-04-VH(VL-CL-VH-CH1)およびACE-04-VL(VH-CH1-VL-CL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-04-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである:
ACE-04-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000017
(配列番号93)
ACE-04-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000018
(配列番号94)
ACE-04-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
Figure 0007076571000019
(配列番号95)
PD-L1を標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびキメラOKT3 Fab領域の第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表7:ACE-04のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000020


ACE-04-VH、ACE-04-VLおよびACE-04-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-04-VHヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGAGCCGAGCTCGCCAGGCCAGGAGCCTCCGTCAAAATGTCATGCAAGGCCTCAGGGTACACATTTACGCGATATACCATGCACTGGGTGAAACAAAGACCAGGTCAGGGACTTGAATGGATCGGTTACATTAACCCCTCTAGAGGCTATACGAATTACAACCAGAAATTCAAAGACAAAGCAACACTTACGACTGACAAATCCAGTAGTACGGCTTACATGCAGCTCTCATCTTTGACTTCAGAAGACTCTGCTGTATATTATTGTGCCCGCTATTACGATGACCATTACTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGCACTACTGTTACCGTAAGTGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTTGA(配列番号105)
ACE-04-VLヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGATCGTCCTCACTCAAAGTCCTGCTATTATGTCCGCAAGCCCTGGTGAAAAGGTTACCATGACTTGCTCCGCATCTAGTTCTGTCTCTTACATGAACTGGTACCAGCAAAAGTCTGGAACGTCCCCGAAAAGGTGGATATATGATACGAGCAAATTGGCAAGCGGAGTACCCGCGCATTTTAGGGGTTCAGGCAGCGGTACGTCATATAGCCTGACTATTAGCGGAATGGAGGCGGAGGATGCTGCAACATATTATTGCCAACAATGGTCATCAAATCCTTTTACTTTCGGCTCAGGCACAAAACTTGAAATAAATAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGcTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号106)
ACE-04-LC(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
図4Cにおいて、SDS-PAGE結果は、ACE-04およびACE-05の発現、ACE-04とACE-04-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにACE-05とACE-05-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異を示している。結果は、ACE-04が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
1.5.ACE-05のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を本明細書で提供される別のALiCE分子ACE-05(抗PD-L1および抗CD3ドメインからなる結合分子;図4Bを参照されたい)を発現させるために使用した。ACE-05は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-05-VHおよびACE-05-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-05-LC)を含有する。ACE-05は、可動性ペプチド領域中にG4Sリンカー(GGGGSのアミノ酸配列、配列番号112)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-05-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000021
(配列番号1)
ACE-05-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000022
(配列番号2)
ACE-05-LCアミノ酸配列:
Figure 0007076571000023
(配列番号3)
PD-L1を標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびCD3を標的化する第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列およびそのCDR配列を下の表に列挙する:
表8:ACE-05のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000024


トリトランスフェクションをACE-05-VH、ACE-05-VLおよびACE-05-LCのDNAを用いて(0.5:0.5:1w/w比)宿主細胞をトランスフェクトするために実施した。ACE-05-VH、ACE-05-VLおよびACE-05-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-05-VHヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号20)
ACE-05-VLヌクレオチド配列:
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号21)
ACE-05-LCヌクレオチド配列:
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGAaccGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号22)
トランスフェクションを上のセクション1.1に記載のとおり実施した。さらに具体的には、ポリエチレンイミン(PEI)をトランスフェクション試薬として使用した(DNA:PEI=1:4(w/w)の比で使用)。トランスフェクション6から7日後、細胞生存率が約60%から70%であると測定された際に、バッチ培養を中止し、発現培地を回収し、デブリを除去するために遠心分離した(4,800rpm、30分間、4℃)。次いで上清を0.22μmTOP-filter(Millipore、USA)を使用して濾過した。続いてACE-05分子を含む濾過上清にHitrap(商標)KappaSelect(GE healthcare、USA)を使用する親和性クロマトグラフィー精製工程を行い、溶出緩衝剤交換のためにSlide-A Lyzer Dialysis Cassette(Thermo、USA)を使用し、pH7.4 PBSを用いた透析が続いた。精製したタンパク質をSDS-PAGE、キャピラリー電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析した。HEK-293F一過性発現系を使用した発現のレベルは、この実験ではおよそ50mg/Lであると判定された。Hitrap(商標)KappaSelectを使用する精製アッセイは、培地に発現された大部分の分子が回収されたことを示した。精製されたACE-05分子をAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Germany)およびSEC-HPLC(ThermoFisher、USA)を使用してそれらの純度についても分析した。純度分析を製造者によって提供されたプロトコールを使用して実施した。
図4Cにおいて、SDS-PAGE結果は、ACE-05およびACE-04の発現、ACE-05とACE-05-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異ならびにACE-04とACE-04-VL2とのアセンブリーパターンにおける差異を示している。図4Dは、ACE-05(上)のアセンブリーパターンを同定するために実施したSDS-PAGEの結果を示し、ACE-05アセンブリーにおける可能な制御機構を例示している。
図4E~4Fは、ACE-05のコンホメーションおよびACE-05-VHとACE-05-VL鎖との間のヘテロ二量体化効率を同定するために実施したSDS-PAGEおよびキャピラリー電気泳動を示している。図4E~4Fの左パネルは、精製されたACE-05のSDS-PAGE結果を示している。図4Eの左パネルは、KappaSelectを使用したACE-05およびACE-05-VL2タンパク質についての親和性クロマトグラフィーの結果を示している。図4E~4Fの右の4つのパネルは、ほとんど同じ量のACE-05-VHおよびACE-05-VL鎖、ACE-05-LCの量およびACE-05-VHとACE-05-VL鎖との間の高効率のヘテロ二量体化を示している。キャピラリー電気泳動結果も、ACE-05が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。図4Gは、ACE-05の純度を同定するために実施したサイズ排除クロマトグラフィーを示している。示すとおり、KappaSelect精製した試料は、遊離軽鎖を含有している。次いで第2のゲル濾過クロマトグラフィー(GFC)ステップを遊離軽鎖を除去するために適用し、純粋で適切にアセンブルされたACE-05分子を生じた。予測されたとおり、ACE-05-VHおよびACE-05-LCの二量体ならびにACE-05-VLおよびACE-05-LCの二量体がSDS-PAGE画像のNRレーンに観察された。ACE-05-VHとACE-05-VLとの間の疎水性相互作用は、SDS界面活性剤によって破壊された。
図4Hは、ACE-05のゲル濾過分析のためのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示している。ゲル濾過分析をkappaselect親和性精製後のACE-05コンホメーションを検討するために実施した。ACE-05の約19%凝集がSuperdex200Aカラムクロマトグラフィーによって検出された。図4Iは、ACE-05の構造的コンホメーションを同定するために実施した陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)の結果を示している。ゲル濾過から単離された主なピークをCEXカラムを通して分析し、2つのピークに分離した。高い方のピーク(67.87%)は、アセンブルしたACE-05であり、低い方のピーク(32%)は、ヒンジ領域に遊離チオール基を有するACE-05-VH鎖である。
1.6.ACE-09のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を上のセクションにおいて記載したのと同様の方法を使用して、ACE-09(抗PD-L1およびUCHT1ドメインからなる結合分子)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-09は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-09-VHおよびACE-09-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-09-LC)を含有する(図5下)。ACE-05と比較して、ACE-09は、ACE-05が可動性ペプチド領域に含有するG4Sリンカー(GGGGSのアミノ酸配列)を含有しない(図5下)。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は下のとおりである:
ACE-09-VHアミノ酸配列(G4Sリンカーを含まない):
Figure 0007076571000025
(配列番号96)
ACE-09-VLアミノ酸配列(G4Sリンカーを含まない):
Figure 0007076571000026
(配列番号97)
ACE-09-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
Figure 0007076571000027
(配列番号95)
PD-L1を標的化する二価Fab領域およびUCHT1についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表9:ACE-09のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000028


ACE-09-VH、ACE-09-VLおよびACE-09-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-09-VHヌクレオチド配列(G4Sリンカーを含まない):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号108)
ACE-09-VLヌクレオチド配列(G4Sリンカーを含まない):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号109)
ACE-09-LCヌクレオチド配列(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
図5は、KappaSelectを使用するACE-09の親和性クロマトグラフィーのSDS-PAGE結果ならびに37℃および32℃でのACE-09およびACE-05のSDS-PAGE結果を示す。結果は、ACE-09が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。さらに、ACE-09は、ACE-05と同じVHおよびVLをFabおよびFv領域中に有する(表8および9に示す)が、ACE-09は、ACE-05において抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインとの間にG4Sリンカー(GGGGSのアミノ酸配列)を含有しない(図5下)。G4S可動性リンカーは、立体障害を低減し、第2のFvドメインの免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)への結合を最適化でき、それにより免疫細胞の標的細胞(例えば、がん細胞)への再方向付け効率の増加をもたらす。予想外に、ACE-05およびACE-09は、同様のレベルの発現を示し、G4SリンカーがALiCE分子の活性に、それらの発現およびアセンブリーに影響を与えることなく、役立つ可動性を与え得ることを示唆している。
1.7.ACE-10のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)も上のセクション1.1およびセクション1.2に記載されたのと同様の方法を使用してACE-10(抗CD20および抗CD3ドメインからなる結合分子;図6Aを参照されたい)の適切な発現およびアセンブリーを実証するために使用した。ACE-10は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-10-VHおよびACE-10-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-10-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-10-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000029
(配列番号23)
ACE-10-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000030
(配列番号24)
ACE-10-LCアミノ酸配列:
Figure 0007076571000031
(配列番号25)
CD20を標的化する二価Fab領域およびCD3を標的化する一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表10:ACE-10のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000032


ACE-10-VH、ACE-10-VLおよびACE-10-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-10-VHヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号34)
ACE-10-VLヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号35)
ACE-10-LCヌクレオチド配列:
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCtGCtATCCTGAGCGCCAGCCCtGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号36)
図6B~6Cは、ACE-10分子の発現分析を示す。示されるとおり、ACE-10は、適切に発現され、アセンブルされた。加えて、結果は、ACE-10のアセンブリーがVH-BiP依存性様式で制御されることを示している。
1.8.ACE-11のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、上のセクション1.1およびセクション1.2に記載されたのと同様の方法を使用してACE-11(抗EGFRおよび抗CD3ドメインからなる結合分子;図7Aを参照されたい)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-11は、ACE-05およびACE-10と同じ全体構造を有し、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-11-VHおよびACE-11-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-11-LC)を含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-11-VHアミノ酸配列:
Figure 0007076571000033
(配列番号37)
ACE-11-VLアミノ酸配列:
Figure 0007076571000034
(配列番号38)
ACE-11-LCアミノ酸配列:
Figure 0007076571000035
(配列番号39)
EGFRを標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびCD3を標的化する第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表11:ACE-11のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000036


ACE-11-VH、ACE-11-VLおよびACE-11-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-11-VHヌクレオチド配列:
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号48)
ACE-11-VLヌクレオチド配列:
CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号49)
ACE-11-LCヌクレオチド配列:
GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(配列番号50)
図7Bは、ACE-11およびACE-11-VL2の発現およびアセンブリーを示す。矢印は、アセンブルしたACE-11のバンドを示す。結果は、ACE-11が適切に発現され、アセンブルされたことを示唆している。
1.9.ACE-12のコンストラクションおよび発現
HEK-293一過性発現系(Invitrogen、USA)を、上のセクションに記載したのと同様の方法を使用してACE-12(抗PD-L1およびUCHT1ドメインからなる結合分子)の適切な発現およびアセンブリーを実証するためにも使用した。ACE-12は、2つの異なる重鎖様鎖(ACE-12-VHおよびACE-12-VL)ならびに2つの同一の軽鎖(ACE-12-LC)を含有する。ACE-12は、GGGGSGGGGS(配列番号113)およびGGSGGGGSG(配列番号114)のアミノ酸配列を有するG4Sリンカーを含有する、一方でACE-05は、GGGGSのアミノ酸配列を可動性ペプチド領域に有するG4Sリンカーを含有する。これら3種類のポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである:
ACE-12-VHアミノ酸配列(10残基GGGGSGGGGSを含む):
Figure 0007076571000037
(配列番号98)
ACE-12-VLアミノ酸配列(9残基GGSGGGGSGを含む):
Figure 0007076571000038
(配列番号99)
ACE-12-LCアミノ酸配列(抗PD-L1抗体軽鎖):
Figure 0007076571000039
(配列番号95)
PD-L1を標的化する第1の抗原結合ドメイン二価Fab領域およびUCHT1の第2の抗原結合ドメイン一価Fv領域についてのVHおよびVLアミノ酸配列ならびにそのCDR配列を下の表に列挙する:
表12:ACE-12のVH、VLおよびCDR
Figure 0007076571000040


ACE-12-VH、ACE-12-VLおよびACE-12-LCをコードするDNA配列は以下のとおりである:
ACE-12-VHヌクレオチド配列(10残基GGGGSGGGGSを含む):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(配列番号110)
ACE-12-VLヌクレオチド配列(9残基GGSGGGGSGを含む):
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(配列番号111)
ACE-12-LCヌクレオチド配列(抗PD-L1抗体軽鎖ヌクレオチド配列):
CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(配列番号107)
図8は、ACE-12、ACE-05およびACE-09のアセンブリーを同定するために実施したSDS-PAGEの結果を示す。結果は、ACE-12が適切に発現され、アセンブルされたことを示している。さらに、ACE-12、ACE-05およびACE-09は、FabおよびFv領域中に同じVHおよびVLを有し(表8、9および12に示す)、それらの構造は抗体ヒンジ領域と第2のFvドメインとの間のG4Sリンカーの長さにおいて異なっている(図8下)。G4S可動性リンカーは、立体障害を低減でき、第2のFvドメインの免疫細胞(例えば、T細胞を含むエフェクター細胞)への結合を最適化でき、それにより免疫細胞の標的細胞(例えば、がん細胞)への再方向付け効率の増加をもたらす。予想外に、ACE-12、ACE-05およびACE-09は、同様のレベルの発現を示した。長さが異なるリンカーは、それらの発現およびアセンブリーに影響を与えることなくALiCE分子の活性に役立つ異なるレベルの可動性を与えることができる。
要約すると、上の実験は、本明細書で提供される例示的結合分子の良好なコンストラクションおよび発現を例示し、これらのALiCE分子が適切に発現され、アセンブルされ得ることを示している。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用する例示的結合分子の結合親和性の分析
ACE-00およびACE-00-VL2のTNFアルファへの親和性を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。Bmaxは、実験結果から外挿された最大結合親和性である(GraphPad Prism software7で提供されるカーブフィッティング法を使用した算出した)。図9に示すとおり、親抗体アダリムマブのTNFアルファへのKは、1.125nMであると判定され;TNFアルファに対して一価結合ドメインだけを有するACE-00のKは、30.03nMであると判定され;ACE-00-VLホモ二量体からなるACE-00-VL2は、TNFアルファに対して親和性を有さないことが決定された。
各抗原(例えば、ACE-05についてのPD-L1およびCD3)へのACE-05および対照抗体の親和性をELISAを使用して測定した。さらに詳細には、ヒトPD-L1(YBL-007、Y-Biologics、Inc.により作製)およびCD3(Sino Biological)などの抗原を免疫プレート(Thermo scientific、USA)に1から10μg/ml(100から1000ng/ウエル)の濃度でpH7.4 PBSをコーティング緩衝剤として使用して4℃、一晩固定した。翌日、プレートを200μlのPBSTを用いて1度洗浄し、次いで表面ブロッキングを室温で5%脱脂粉乳を用いて1~2時間実施した。続いて、各ウエルを200μlのPBSTを用いて2回洗浄後、ACE-05および対照抗体を1/2から1/5の比で希釈し、室温で1~2時間反応させた。次いで各ウエルを未結合試料を除去するために200μlのPBSTを用いて3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗ヒトIgG(Fab特異的)抗体(Sigma、USA)を室温での反応のためにウエルに1:1000の比で加えた。200ulのPBSTを用いた3回洗浄後、HRPの呈色反応を100μl/ウエルの容量でTMB溶液(GEhealthcare、USA)を使用して誘導した。反応を停止溶液(2.5M HSO、100μl/ウエル)を使用することによって終結させた。分光光度計を結合親和性を算出するためにA450の波長での吸光度を測定するために使用した。GraphPad Prism software7をACE-05および他の対照抗体とそれらそれぞれの標的との親和性を分析するために使用した。結果を図10A、10Bおよび10Cに示す。
ACE-09、ACE-05および対照抗体のCD3への親和性を上に記載のものと同様の方法を使用して測定した。図11に示すとおり、ACE-09は、ACE-05と同様のレベルの結合親和性を示した。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用するACE-05の結合動態の分析
ACE-05のヒトPD-L1およびCD3への結合動態を表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して測定した。OCTET(登録商標)QKe system(ForteBio、USA)を使用する標識フリー動態(タンパク質-タンパク質相互作用)の測定をヒトPD-L1について抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー(ForteBio、USA)、およびCD3εδ鎖についてアミン反応性(ARG2)バイオセンサーを使用して実施した。PD-L1およびCD3εδをそれらそれぞれのバイオセンサー表面に固定し、さまざまな濃度に動態緩衝剤を用いて希釈したACE-05を用いて連続的に反応させた。センサーグラムを経時的に回収した。ACE-05[すなわち、抗hPD-L1抗体(YBL-007、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生)を作製するために使用した親抗体と抗CD3抗体(UCHT1、BioLegend、USAから)]とを検査し、この実験においてACE-05と比較した。図12A~12Cに示すとおり、ACE-05のヒトPD-L1への結合動態は親抗PD-L1抗体(すなわちYBL-007、Y-Biologics、Inc.から)に匹敵し、Kは1.09×10-11未満であった(図12A~12Cを参照されたい)。対照的におよび予測されたとおり、ACE-05のCD3への結合親和性は、親抗CD3抗体(BioLegend、USAからのUCHT1)よりさらに低く、Kは6.82×10-9であると判定された(図5Cを参照されたい)。図12A~12Cに示すとおり、ACE-05の結合動態を二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、すなわち、BiTE-05とも比較した。BiTEは、異なる抗体の2つの一本鎖可変断片(scFv)または4つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質を、約55キロダルトンの単一ペプチド鎖上に生成する既存の二重特異性抗体技術である。BiTE技術のさらに詳細な記載は、例えば、Huehls et al., Immunol Cell Biol., 2015, 93(3): 290-296;Baeuerle et al., Drug Discovery Today, 2005, 10: 1237-1244;およびKufer et al., Trends in Biotechnology, 2004, 22(5): 238-244に見出すことができる。ACE-05は、BiTE-05よりもヒトPD-L1により高い親和性を有することが実証された。一方、ACE-05は、BiTE-05よりもCD3に低い親和性を有することが実証され、それによりBiTE-05よりも少ない細胞傷害性を有することが予測された。
図12Dでは、標識フリー動態OCTET(登録商標)system(ForteBio、USA)をACE-05のhPD-L1およびhCD3の同時結合を検討するために使用した。リガンドとして、ヒスチジン標識組換えリガンドタンパク質(例えば、hPD-L1-his、hCD3εδ-his)およびFc-標識組換えリガンドタンパク質(例えば、hPD-L1-Fc、hCD3εδ-Fc)を調製した。第1の抗原をバイオセンサーチップ上に捕捉(固定)するために、ヒスチジン捕捉NTAチップ(ForteBio、USA)を使用した。第1のリガンドがNTAチップ上に完全に捕捉された後、動態緩衝剤を用いて希釈したACE-05を分析した。続いて、動態緩衝剤に同様に希釈した第2のリガンドもACE-05の第2のリガンドへの同時結合を評価するために分析した。
T細胞再方向付け(活性)およびT細胞細胞傷害性
ACE-05をT細胞を再方向付けるおよび活性化するその活性について検査した。T細胞再方向付け(活性)アッセイにおいて、PD-L1を安定に発現するHEK293E-PD-L1細胞系を生成し、抗原ドナーとして使用した。NFATルシフェラーゼレポーターシステムを含有するように操作したCD3陽性ジャーカット細胞系をエフェクター細胞(ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞、当技術分野において周知の従来の方法を使用して所内で産生した)として使用した。
次いで、FACS解析を上に述べた細胞系でPD-L1およびCD3発現レベルを決定するために使用した。HEK293E-PD-L1細胞および親HEK293E細胞におけるPD-L1発現レベルを図13A(右パネル)に示す。種々のCD3抗体によって測定したジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞におけるCD3発現レベルも図13A(左パネル)に示す。
T細胞再方向付け(活性)アッセイを以下のとおり実施した:HEK293E細胞およびHEK293E-PD-L1細胞(細胞7×10個/ウエル)をポリ-L-リシン(Sigma)コート白底プレートに播種し、24時間インキュベートした。翌日、ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞(細胞1.4×10個/ウエル)をACE-05、UCHT1(親抗CD3抗体、BioLegend、USAから)および対照分子の系列希釈物を用いて処置し、次に37℃、7時間インキュベートした。Bio-Glo Luciferase assay(Promega、USA)をジャーカット活性化の程度を検出するために実施した。ACE-05の場合、PD-1/PD-L1相互作用遮断およびPD-L1標的化T細胞再方向付けの両方の相乗効果を同定するために、PD-1/PD-L1遮断アッセイをPD-1/PD-L1 Blockade Bioassay kit(Promega、USA)を使用して実施した。データをGraphPad Prism7 softwareを使用して処理し、分析した。
図13Bに示すとおり、PD-L1(HEK293E-PD-L1細胞)を発現する標的細胞を使用する場合、ACE-05はエフェクターT細胞(ジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞)を活性化できた一方で;PD-L1(HEK293E)を発現しない標的細胞を使用した場合、エフェクターT細胞は、ACE-05によって効果的に活性化され得なかった。これらの結果は、ACE-05がT細胞の標的細胞依存性活性化を実証することを示している。この研究ではACE-05をBiTE-05とも比較した。図13Bに示すとおり、ACE-05は、PD-L1の存在下でBiTE-05よりもさらに効率的なT細胞活性化を実証した。しかし、PD-L1の非存在下では、BiTE-05の存在でのT細胞活性化は、ACE-05より高かった。したがって、BiTE-05は、ACE-05よりも高い細胞非依存性T細胞活性化を示している。
図13Cは、図13Bと同じデータであり、それぞれPD-L1を含んでまたは含まずに、ACE-05(左パネル)およびBiTE-05(右パネル)について別々にプロットしており、ACE-05媒介T細胞活性化のダイナミックレンジがBiTE-05媒介T細胞活性化よりも十分高く(縦点線矢印によって示されている)、図13Bからの観察と一致することを示している。図13D~13Eは、図13Cに示した同じデータを使用して、ACE-05およびBiTE-05の標的媒介(PD-L1を発現するHEK)T細胞活性化だけを示している。
がんに対するT細胞応答は、がん免疫サイクルにおいて変動する。HCC827 PD-L1陽性非小細胞肺癌(NSCLC)および、PD-1発現を有するまたは有さないジャーカットルシフェラーゼレポーター細胞をがんに対するT細胞応答を測定するために使用した。図13Fにおいて、T細胞のプライミングおよび活性化段階をJurkat-PD-1[-]と表し、T細胞の休止およびトレランス段階をJurkat-PD-1[+]を表した。示すとおり、結果は、ACE-05の抗がん有効性がT細胞の両方の発達段階においてBiTE-05よりもさらに高いと予測されることを示している。
PD-1/PD-L1相互作用およびPD-L1標的化T細胞再方向付けの両方を遮断することの相乗効果を同定するために、PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay kit(Promega、USA)をACE-05の生物学的能力を測定するために使用した。PD-1/PD-L1遮断アッセイを製造者によって提供される次のプロトコールに従って実施した。ACE-05がPD-1/PD-L1相互作用およびT細胞再方向付けを遮断できることを実証している、PD-1/PD-L1遮断アッセイの結果を図13Gに示す。図13Hは、BiTE-05と並べて比較した場合に、同時のPD-L1遮断およびT細胞再方向付けの相乗効果のためにACE-05が最も高いT細胞活性化シグナルを示すことをさらに示している。YBL-007は抗PD-L1抗体であり、UCHT1は抗CD3抗体である。
加えて、図13Iに示すとおり、ACE-05は、抗CD3抗体よりも標的非依存性T細胞活性化をあまり示さない。この結果は、親抗CD3抗体と比較してCD3へのACE-05の低く観察された親和性と一致している。したがって、これらの結果は、一価抗CD3ドメイン単独がT細胞を活性化するために不十分であることから、ACE-05が抗CD3抗体よりも低い細胞傷害性を呈することを示している。図13Jは、ACE-05とBiTE-05とを並べて比較する同じアッセイからのデータを示し、BiTE-05のCD3に対する親和性がACE-05のものよりもさらに高いことからBiTE-05がPD-L1標的の非存在下で最も高いT細胞活性化シグナルを示し、高いレベルの細胞傷害性に関与することを示している。
ACE-05媒介T細胞細胞傷害性をLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)アッセイを使用して決定した。健康なドナー由来のPBMCをエフェクター細胞として使用し、PD-L1を過発現しているHCC827非小細胞肺がん細胞(ATCC)を標的細胞として使用した。死腫瘍細胞から放出されたLDHをLDHアッセイシステムによって測定し、さまざまな比のT:E(標的:エフェクター)をACE-05の存在下で検査した(図13K)。さらに、ACE-05は、健康なドナーから単離されたPBMCと同時インキュベートしたHCC827細胞(PD-L1陽性)に対して用量依存性殺腫瘍能力を示した(図13L)。図13Mは、ACE-05またはYBL-007の存在下でPBMCと直接接触した場合の腫瘍細胞でのT細胞細胞傷害性を示している。24時間で、標的HCC827がん細胞は、ACE-05の存在下で死滅した一方で、標的HCC827細胞は、無処置でまたはYBL-007の存在下で増殖した。
活性化白血球によって放出された免疫サイトカインのレベルは、オフターゲットT細胞活性化に関連する有害事象を反映している可能性がある。したがって、ACE-05またはBiTE-05の存在下でのIL-2およびINF-γレベルを健康なドナー由来のPBMCおよびHCC827細胞を同時培養しIL-2またはIFN-γアッセイキット(BioLegend、USA)を使用してモニターした。BiTE-5のものより低いレベルのIL-2がACE-05の存在下で観察され、ACE-05は、IL-2分泌の主な供給源であるCD3+T細胞をあまり活性化しないことを示唆している。したがって、ACE-05は、BiTE-05よりもT細胞のオフターゲット活性化をあまり誘導しない可能性がある。加えて、ACE-05およびBiTE-05の存在は、NKTまたはNK細胞によって放出されるのと同様のレベルのINF-γをもたらした(図13N)。
ACE-05の熱力学的安定性をCFX 96TM ORM system(BioRad、USA)と共にC1000 Thermal Cyclerを使用して評価した。3μM結合分子を10μlの1/25希釈CYPRO orange protein stain(Invitrogen、USA)と混合し、50μlの混合物を30分間、25℃でインキュベートした。試料を1℃/分で室温から99℃に加熱することによって変性させた。CYPRO染色変性タンパク質の量を記録し、融解温度(TM)をCFX manager softwareによって算出した。図13Oに示すとおり、ACE-05は、BiTE-05よりも高い熱力学的安定性を有した。
T細胞再方向付けアッセイをCD20を標的化を介するACE-10媒介T細胞活性化を決定するために実施した。CD20陽性Raji細胞を抗原ドナー標的細胞として使用し、Karpas-299細胞をCD20陰性対照として使用した。ACE-10は、BiTE-10のものよりさらに有効なT細胞活性化を示す。CD20陽性Raji細胞での結果とCD20陰性Karpas-299細胞での結果との比較は、T細胞活性化が標的細胞におけるCD20発現に依存していることを示唆している(図14A~14Bを参照されたい)。
ACE-11媒介T細胞細胞傷害性もLDHアッセイを使用して決定した。健康なドナー由来のPBMCをエフェクター細胞として使用し、EGFR陽性SW48、HT29およびHCT116結腸がん細胞を標的細胞として使用した。死腫瘍細胞から放出されるLDHをLDHアッセイシステムによって測定した。HT29およびHCT116がん細胞は、増殖シグナルの継続的活性化をもたらし得るRasおよびRaf突然変異を有する。ACE-11は、3種すべてのがん細胞系において細胞傷害性を示した。結果を図15に示す。
スプラーグドーリー(SD)ラットでの薬物動態研究
ACE-05および対照抗体の薬物動態研究をSDラットで実施した。研究は、the institutional animal care and use committeeによって承認された(Approval number:QBSIACUC-A17099)。
SDラットは、尾静脈を介して10mg/kgのACE-05または対照抗体(YBL-007もしくはアベルマブ)の単一静脈内用量を受けた(n=3 オスラット/群)。合計500μlの血清を各動物から次の時点:ACE-05または対照抗体の投与後10分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、3日、5日および9日で回収した。試料を10,000~13,000rpm、2分間遠心分離し、各試料から70μlの血漿を分け、さらなる分析まで-80℃で保存した。各試料の濃度をELISAによって決定した。96ウエル免疫プレート(Thermo Scientific、USA)をPD-L1(Y-Biologics、Inc.によって生成)を用いてコートした。1:1000、1:4000または1:8000に希釈したラット血漿試料をウエルに加えた。結合試料をHRPコンジュゲート抗ヒトIgG(Fab特異的)(Sigma、USA)を用いて検出した。ウエルをTMB基質(Sigma、USA)によって製造者のプロトコールに従って1:500の比で発色させた。次いでA450を測定した。ACE-05および対照抗体の濃度を既知の濃度の試料タンパク質を使用した標準曲線と比較することによって決定した。観察データをBA Calc 2007ソフトウェアによって分析した。薬物動態研究結果を図16Aに示す。示されたとおり、ACE-05の半減期は10.113時間と測定された。しかし、この実験において親抗体の半減期が、そのような抗体についての典型的な半減期(7または10日間)よりかなり短かった98および73時間と判定されたことから、ACE-05の実際の半減期は10時間より長い可能性がある。図16Bに示すとおり、ACE-05は、BiTE-05より長い半減期を示し、ACE-05がBiTEよりも高い血漿安定性を有することを示唆している。
ヒト非小細胞肺がんの処置におけるACE-05の有効性の評価
ヒト非小細胞肺がんの処置におけるACE-05の有効性を評価し、NCGマウス(CrownBio、USA)におけるHCC827細胞系を使用して他の抗体と比較した。研究は、下の表に示すとおり設計した:
表13:研究設計
Figure 0007076571000041
図17A~17Fは、ヒト化マウスモデルにおけるHCC827(PD-L1陽性腫瘍)異種移植片研究の結果を示す。6~8週齢メスNCGマウスをPBMC再構成のために選択した。表13に示すとおり、4つの研究群(マウス10匹/群)および2種のPBMCドナー(マウス5匹/ドナー)があった。被験体をACE-05、BiTE-05、IgGおよびYBL-007を用いて腫瘍接種(TVのサイズ=50mm)4日後に処置し、各ドナーから単離したPBMCを腫瘍接種の前日に再構成した。ACE-05およびBiTE-05を4日目、6日目、8日目(合計3回)注射した。IgGおよびYBL-007を4日目、7日目および10日目(合計3回)注射した。この研究の12日目に、10匹のマウスの内の9匹の腫瘍は、ACE-05処置後に完全に無くなった。BiTE処置群の体重減少(BWL)(%)は、ACE-05処置群よりも高かった。BiTE処置群の10匹のマウスの内の3匹は、この研究中の20%を超えるBWLのために打ち切られた。結果は、ACE-05が観察された肺がんの処置において有効であることを示し、ACE-05が、BiTE-05、BiTE技術を使用して生成された二重特異性抗体よりも大きな安全性を呈することも示している。
ACE-05およびBiTE-05の抗がん有効性についての用量制限研究
ACE-05の有効用量を見出すために、用量制限研究(dose limits study)をHCC827ヒト化異種移植モデルで実施した(図18A~18D)。NCGメスマウス(CrownBio、USA)6~8週齢をPBMC再構成ヒト化のために選択し、14の研究群(マウス6匹/群)に分けた。群分けおよび処置の前に、すべての動物の重量を量り、腫瘍体積をキャリパーを使用して測定した。腫瘍体積が任意の所与の処置の有効性に影響を与え得ることから、腫瘍体積を、選択した動物を特定の群に無作為化するための数値パラメータとして使用した。群分けをStudyDirector(商標)software(Studylog Systems、USA)を使用して実施した。腫瘍体積において最小の群間差異を示した「分布一致」無作為化法を群割り当てのために使用した。
2名のドナー由来のヒトPBMCを腫瘍細胞接種の3日前にi.v.を介してインプラントした。各マウスに腫瘍発達のための0.1mlのPBS中のHCC827腫瘍細胞(5×10)を右側腹領域に皮下接種した。0.5mpk(mg/kg)から0.0005mpk(0.5、0.1、0.05、0.005および0.0005mpk)の5種の異なる濃度のACE-05およびBiTE-05でHCC827接種の4日後に処置した。被験物質投与を図18Aにおいてx軸上の4本の縦矢印で示すとおり3日間ごと、すなわち、4日目、7日目、10日目および13日目(Q3d、合計4用量)にスケジュール化した。
腫瘍の大きさ(図18A~18C)および体重(図18D)を検査分子の初回投与後2または3日間ごとにスコア化した。各群についての腫瘍体積および体重の変化の平均値の標準誤差(SEM)を、図18Aにそれぞれ時間に対してプロットした。図18B~18Cは、それぞれACE-05およびBiTE-05を用いて処置した各用量群における個々のマウス抗腫瘍有効性を示している。BiTE-05処置群のマウス4匹は15日目に打ち切ったが、ACE-05処置群ではマウス1匹だけを打ち切った。BiTE-05を用いた処置群(図18C)とは対照的に、0.5mpk、0.1mpkおよび0.05mpkのACE-05を用いて処置した大部分の動物では、腫瘍は完全に消えた(図18B)。
表14は、ACE-05およびBiTE-05の抗腫瘍活性を要約している。15日目の平均腫瘍体積(TV)を平均値の標準誤差と共に示す。腫瘍成長阻害パーセンテージ(TGI%)は、検査群と対照群の平均腫瘍体積の間の差異であり、以下の式を使用して算出される:TGI(%)=(対照の平均TV-処置の平均TV)/対照の平均TV×100。T/C(%)を以下の式を使用して算出した:T/C(%)=処置の平均TV/対照の平均TV×100。結果は、ACE-05が、観察された肺がんの処置において、濃度範囲にわたってBiTE-05よりも有効であることを示している。
表14:ACE-05およびBiTE-05の抗腫瘍活性
Figure 0007076571000042
先の記述から、具体的な実施形態が例示の目的のために本明細書に記載されているが、種々の改変が本明細書で提供される精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解される。上に参照するすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

  1. (a)抗体軽鎖を各々が含む、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドと、
    (b)第1の可変重鎖(VH)領域、第1の定常重鎖1(CH1)領域および第2のVH領域を含む第3のポリペプチドと、
    (c)第3のVH領域、第2のCH1領域および可変軽鎖(VL)領域を含む第4のポリペプチドと
    を含む結合分子であって、
    前記結合分子は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含まず、
    前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成し;
    前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成し;
    前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成し;そして
    前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、
    結合分子。
  2. 前記柔軟なペプチド領域が、リンカーをさらに含む、請求項1に記載の結合分子。
  3. 前記リンカーが、GGGGS(G4S)のアミノ酸配列を含む、請求項に記載の結合分子。
  4. 前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、異なる抗原または同じ抗原に結合する、請求項1~3のいずれか一項に記載の結合分子。
  5. 前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、第1の抗原結合ドメインを形成し、前記Fv領域が、第2の抗原結合ドメインである、請求項4に記載の結合分子。
  6. 前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記第1の抗原結合ドメインが、第1の抗原に結合し、前記第2の抗原結合ドメインが、第2の抗原に結合する、請求項5に記載の結合分子。
  7. 前記第1の抗原が、がん抗原である、請求項6に記載の結合分子。
  8. 第2の抗原が、リンパ球および単球からなる群から選択される免疫細胞上に発現される、請求項7に記載の結合分子。
  9. 前記第2の抗原が、T細胞上に発現される、請求項6に記載の結合分子。
  10. 前記第2の抗原が、CD3である、請求項9に記載の結合分子。
  11. 前記第1の抗原が、がん抗原であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項6に記載の結合分子。
  12. 前記第1の抗原が、PD-L1であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
  13. 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号5、配列番号6および配列番号7のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    各Fab領域の前記VL領域が、配列番号9、配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
    請求項12に記載の結合分子。
  14. 前記第1の抗原が、CD20であり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
  15. 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    各Fab領域の前記VL領域が、配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
    請求項14に記載の結合分子。
  16. 前記第1の抗原が、EGFRであり、前記第2の抗原が、CD3である、請求項11に記載の結合分子。
  17. 各Fab領域の前記VH領域が、配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    各Fab領域の前記VL領域が、配列番号45、配列番号46および配列番号47のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VH領域が、配列番号13、配列番号14および配列番号15のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含み、
    前記Fv領域の前記VL領域が、配列番号17、配列番号18および配列番号19のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む、
    請求項16に記載の結合分子。
  18. 1つまたは複数のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項1に記載の結合分子を製造する方法であって、
    前記1つまたは複数のベクターが、
    (a)各々が抗体軽鎖を含む第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとをコードする第1の核酸と、
    (b)第1のVH領域、第1のCH1領域および第2のVH領域を含む第3のポリペプチドをコードする第2の核酸と、
    (c)第3のVH領域、第2のCH1領域およびVL領域を含む第4のポリペプチドをコードする第3の核酸と
    を含み;
    前記結合分子は、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含まず、
    前記第1のポリペプチドと、前記第3のポリペプチドの前記第1のVH領域および前記第1のCH1領域とが、第1の抗原結合Fab領域を形成することができ;
    前記第2のポリペプチドと、前記第4のポリペプチドの前記第3のVH領域および前記第2のCH1領域とが、第2の抗原結合Fab領域を形成することができ;
    前記第3のポリペプチドの前記第2のVH領域と、前記第4のポリペプチドの前記VL領域とが、抗原結合Fv領域を形成することができ;そして
    前記第1のFab領域および前記第2のFab領域が、抗体ヒンジ領域を含む柔軟なペプチド領域によってFv領域に連結されている、
    方法。
  19. 請求項1~17のいずれか一項に記載の結合分子の治療有効量と薬学的に許容される担体とを含む、対象における疾患または状態の処置に使用するための、医薬組成物。
  20. 前記疾患または状態が、がんである、請求項19に記載の医薬組成物。
  21. 前記がんが、肺がんまたはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である、請求項20に記載の医薬組成物。
  22. 前記疾患または状態が、PD-L1陽性がんである、請求項19に記載の医薬組成物。
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