JP2532858B2 - 形質転換したミエロ―マ細胞系 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組替えDNAバイオテクノロジーの分野に関す
る。特に、本発明は形質転換したミエローマ細胞系およ
び真核細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する
方法に関する。
る。特に、本発明は形質転換したミエローマ細胞系およ
び真核細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する
方法に関する。
発明の背景 近年バイオテクノロジーの進歩により、宿主細胞系の
細胞中における適当な遺伝子の発現によつて真核細胞ポ
リペプチドを工業的な規模で産生することができるよう
になつた。このような方法の商業的成功は所与の宿主細
胞系中において特定の遺伝子を発現しうる能率に依存す
る。高い発現能率を示す発現システムに対する継続的な
必要性が存在する。
細胞中における適当な遺伝子の発現によつて真核細胞ポ
リペプチドを工業的な規模で産生することができるよう
になつた。このような方法の商業的成功は所与の宿主細
胞系中において特定の遺伝子を発現しうる能率に依存す
る。高い発現能率を示す発現システムに対する継続的な
必要性が存在する。
初期の発現実験は細菌の細胞系を使用して行われた。
しかしこのような細胞環境と通常の真核細胞ポリペプチ
ドとの間の不均衡は望ましくない影響を生じかつ一般に
産生量が低い。これらの影響は真核細胞系特に哺乳動物
の細胞系を宿主として使用することによつてある程度は
改善された。種々の哺乳動物細胞系発現システムが知ら
れている（たとえばヒトインシユリンをコードする細胞
を含むベクターを用いるマウス繊維芽細胞の形質転換に
ついて記載した米国特許第4419446号（Howley,et al）
明細書参照）。
しかしこのような細胞環境と通常の真核細胞ポリペプチ
ドとの間の不均衡は望ましくない影響を生じかつ一般に
産生量が低い。これらの影響は真核細胞系特に哺乳動物
の細胞系を宿主として使用することによつてある程度は
改善された。種々の哺乳動物細胞系発現システムが知ら
れている（たとえばヒトインシユリンをコードする細胞
を含むベクターを用いるマウス繊維芽細胞の形質転換に
ついて記載した米国特許第4419446号（Howley,et al）
明細書参照）。
免疫グロブリンの発現に関する諸研究は、関連する遺
伝子をクローンし、このクローンした遺伝子で哺乳動物
の細胞を形質転換する組替えDNA技術の使用に関係する
（Morrison,S.L.およびOi,V.T.Ann Rev.Immunol.（198
4）２ 239−256頁）。ミエローマ細胞系が宿主として
使用され、ミエローマ細胞系を形質転換するため種々の
ベクターが作られた。これらのベクターは一般に免疫グ
ロブリンのプロモーターおよび遺伝子を運ぶものであ
る。またこれらのベクターは形質転換に成功した宿主ミ
エローマ細胞の選択を許容するための選択可能なマーカ
ーを含んでいる。これらのマーカーは形質転換された宿
主細胞に抗生物質耐性を与える非分泌産生物をコードす
る原核細胞遺伝子の発現を促進させるウイルスプロモー
ターを含んでいる。この産生物は抗生物質に対して触媒
的な不活性化効果を有するものであつて、低いレベルで
産生される。
伝子をクローンし、このクローンした遺伝子で哺乳動物
の細胞を形質転換する組替えDNA技術の使用に関係する
（Morrison,S.L.およびOi,V.T.Ann Rev.Immunol.（198
4）２ 239−256頁）。ミエローマ細胞系が宿主として
使用され、ミエローマ細胞系を形質転換するため種々の
ベクターが作られた。これらのベクターは一般に免疫グ
ロブリンのプロモーターおよび遺伝子を運ぶものであ
る。またこれらのベクターは形質転換に成功した宿主ミ
エローマ細胞の選択を許容するための選択可能なマーカ
ーを含んでいる。これらのマーカーは形質転換された宿
主細胞に抗生物質耐性を与える非分泌産生物をコードす
る原核細胞遺伝子の発現を促進させるウイルスプロモー
ターを含んでいる。この産生物は抗生物質に対して触媒
的な不活性化効果を有するものであつて、低いレベルで
産生される。
これらの研究は、ミエローマ細胞系は免疫グロブリン
遺伝子の発現に非常に特殊化した機能を果すことを示し
ている。ミエローマ細胞中でキメラマウス／ヒト免疫グ
ロブリンを産生しうることが示されている（Morrison,
S.L.et al、PNAS USA（1984）81 6851〜6588頁、Neub
erger,M.S.Natura（1985）341 268−270頁、Bouliann
e,G.L.Nature（1984）312 643−646）。またミエロー
マ細胞中でキメラ免疫グロブリン／酵素ポリペプチドお
よびキメラ免疫グロブリン／抗原ポリペプチドを産生し
うることが示されている。いずれの場合においても免疫
グロブリンプロモーターは少くとも一部に免疫グロブリ
ンを含む所望の産生物の発現を指示するために使用され
ている。
遺伝子の発現に非常に特殊化した機能を果すことを示し
ている。ミエローマ細胞中でキメラマウス／ヒト免疫グ
ロブリンを産生しうることが示されている（Morrison,
S.L.et al、PNAS USA（1984）81 6851〜6588頁、Neub
erger,M.S.Natura（1985）341 268−270頁、Bouliann
e,G.L.Nature（1984）312 643−646）。またミエロー
マ細胞中でキメラ免疫グロブリン／酵素ポリペプチドお
よびキメラ免疫グロブリン／抗原ポリペプチドを産生し
うることが示されている。いずれの場合においても免疫
グロブリンプロモーターは少くとも一部に免疫グロブリ
ンを含む所望の産生物の発現を指示するために使用され
ている。
驚くべきことに、ミエローマ細胞系において非免疫グ
ロブリンプロモーター（non−immunoglobulin pro−mot
er）から真核細胞遺伝子を高いレベルで発現させうるこ
とが判つた。この結果は、ミエローマ細胞の特殊化され
た性質および真核細胞遺伝子の発現が細胞型に依存する
ことが知られていることから見ても驚くべきことであ
る。
ロブリンプロモーター（non−immunoglobulin pro−mot
er）から真核細胞遺伝子を高いレベルで発現させうるこ
とが判つた。この結果は、ミエローマ細胞の特殊化され
た性質および真核細胞遺伝子の発現が細胞型に依存する
ことが知られていることから見ても驚くべきことであ
る。
発明を要約 本発明の第１の観点によれば、真核細胞ポリペプチド
をコードする遺伝子が非免疫グロブリンプロモーターの
指示により発現するように、該真核細胞ポリペプチドを
コードする遺伝子および該非免疫グロブリンプロモータ
ーを含むベクターで形質転換されたミエローマ細胞系が
提供される。
をコードする遺伝子が非免疫グロブリンプロモーターの
指示により発現するように、該真核細胞ポリペプチドを
コードする遺伝子および該非免疫グロブリンプロモータ
ーを含むベクターで形質転換されたミエローマ細胞系が
提供される。
本発明の第２の観点によれば、ベクターをミエローマ
細胞中にトランスフオームした時真核細胞ポリペプチド
をコードする遺伝子が非免疫グロブリンプロモータによ
つて指示されて発現するように、該真核細胞ポリペプチ
ドをコードする遺伝子と該非免疫グロブリンプロモータ
を含むベクターで形質転換したミエローマ細胞を培養す
る真核細胞ポリペプチドの調製方法が提供される。
細胞中にトランスフオームした時真核細胞ポリペプチド
をコードする遺伝子が非免疫グロブリンプロモータによ
つて指示されて発現するように、該真核細胞ポリペプチ
ドをコードする遺伝子と該非免疫グロブリンプロモータ
を含むベクターで形質転換したミエローマ細胞を培養す
る真核細胞ポリペプチドの調製方法が提供される。
ベクターはプラスミドでもよいしエピソームベクター
でもよいが、組込みベクターであることが望ましく、ま
た耐性マーカーのような選択可能なマーカーを含んでい
る。耐性マーカーは外来コード配列の挿入部位附近に位
置させることができ、たとえばSV40プロモーター等の別
のプロモーターの制御下にあることが好ましい。耐性マ
ーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）をコードす
る遺伝子等の増幅可能な遺伝子で置換または補充するこ
とができる。
でもよいが、組込みベクターであることが望ましく、ま
た耐性マーカーのような選択可能なマーカーを含んでい
る。耐性マーカーは外来コード配列の挿入部位附近に位
置させることができ、たとえばSV40プロモーター等の別
のプロモーターの制御下にあることが好ましい。耐性マ
ーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）をコードす
る遺伝子等の増幅可能な遺伝子で置換または補充するこ
とができる。
プロモーターはウイルスプロモーターが好ましく、た
とえばレトロウイルス由来ロングターミナルリピート
（LTR）等のレトロウイルスから得たプロモーターがも
つとも好ましい。適当なプロモーターの例としてSimian
ウイルス40（SV40）プロモーター（好ましくは後期（la
te）SV40プロモーター）、Rous sarcomaウイルスロング
ターミナルリピート（RSV LTR）がある。RSV LTRは繊
維芽細胞系等種々の真核細胞中に導入した時強力なプロ
モーターとして記載されているDNA配列である（Go−rma
n,et al（1982）PNAS 79 6777−6781頁）。しかしミ
エローマ細胞の特殊化された性質のために、RSV LTRが
ミエローマ細胞環境中で有効であるということはまつた
く予想されなかつたことである。
とえばレトロウイルス由来ロングターミナルリピート
（LTR）等のレトロウイルスから得たプロモーターがも
つとも好ましい。適当なプロモーターの例としてSimian
ウイルス40（SV40）プロモーター（好ましくは後期（la
te）SV40プロモーター）、Rous sarcomaウイルスロング
ターミナルリピート（RSV LTR）がある。RSV LTRは繊
維芽細胞系等種々の真核細胞中に導入した時強力なプロ
モーターとして記載されているDNA配列である（Go−rma
n,et al（1982）PNAS 79 6777−6781頁）。しかしミ
エローマ細胞の特殊化された性質のために、RSV LTRが
ミエローマ細胞環境中で有効であるということはまつた
く予想されなかつたことである。
またプロモーターはマウスメタロチオネインプロモー
ター等非ウイルス性のものでもよい。
ター等非ウイルス性のものでもよい。
「ミエローマ」という用語は本明細書においては哺乳
動物のミエローマ細胞および雑種細胞系等融合によつて
哺乳動物のミエローマ細胞から得た細胞を包含してい
る。
動物のミエローマ細胞および雑種細胞系等融合によつて
哺乳動物のミエローマ細胞から得た細胞を包含してい
る。
真核細胞ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチド、たと
えば酵素（たとえばチモシン）、酵素阻害剤、ホルモン
（たとえば成長ホルモン）、リンホカイン（たとえばイ
ンターフエロン）、または免疫グロブリンまたはその部
分（たとえばfabフラグメント）であることができる。
えば酵素（たとえばチモシン）、酵素阻害剤、ホルモン
（たとえば成長ホルモン）、リンホカイン（たとえばイ
ンターフエロン）、または免疫グロブリンまたはその部
分（たとえばfabフラグメント）であることができる。
真核細胞ポリペプチドは少くとも部分的に真核細胞ポ
リペプチドを含む融合ポリペプチドであつてもよい。ま
た真核細胞ポリペプチドは自然に生じる形態であつても
よいし、機能的に等価な誘導体であつてもよい。真核細
胞は宿主ミエローマ細胞からのポリペプチドの輸出を許
容するシグナル配列を含んでいてもよい。
リペプチドを含む融合ポリペプチドであつてもよい。ま
た真核細胞ポリペプチドは自然に生じる形態であつても
よいし、機能的に等価な誘導体であつてもよい。真核細
胞は宿主ミエローマ細胞からのポリペプチドの輸出を許
容するシグナル配列を含んでいてもよい。
以下に述べる実施例においては、真核細胞ポリペプチ
ドは、特に好ましい産生物である組織プラスミノーゲン
活性化因子（tPA）である。
ドは、特に好ましい産生物である組織プラスミノーゲン
活性化因子（tPA）である。
本発明の具体的な発現ベクターはp6、p3.16、pRSV3、
pZAP7、pAC1、pAC2、pAC5、p6GD、p6gpt、pR5D3、pAC6
およびpPRIであり、入手可能な材料からのそれらの構造
は以下詳述する。
pZAP7、pAC1、pAC2、pAC5、p6GD、p6gpt、pR5D3、pAC6
およびpPRIであり、入手可能な材料からのそれらの構造
は以下詳述する。
ミエローマ細胞系はラツトまたはマウスミエローマま
たはラツトYB2/3.0Ag20雑種細胞系、マウスNSO雑種細胞
系またはマウスSP2−OAg雑種細胞系等の雑種細胞系であ
ることができる。
たはラツトYB2/3.0Ag20雑種細胞系、マウスNSO雑種細胞
系またはマウスSP2−OAg雑種細胞系等の雑種細胞系であ
ることができる。
本発明者らは複数のミエローマ細胞系のある種の組合
せで特異的なプロモータを備えるベクターを有するもの
は有利な特性を示すことを発見した。細胞系がラツトYB
/3.0Ag20雑種細胞系等のラツト細胞系である場合、使用
されるプロモーターはRSV LTRであることが好ましい。
細胞系がマウスSP2−OAg雑種細胞系、マウスNSO雑種細
胞系またはNSO誘導雑種細胞系等のマウス細胞系である
場合、使用されるプロモーターはSV40後期プロモーター
であることが好ましい。
せで特異的なプロモータを備えるベクターを有するもの
は有利な特性を示すことを発見した。細胞系がラツトYB
/3.0Ag20雑種細胞系等のラツト細胞系である場合、使用
されるプロモーターはRSV LTRであることが好ましい。
細胞系がマウスSP2−OAg雑種細胞系、マウスNSO雑種細
胞系またはNSO誘導雑種細胞系等のマウス細胞系である
場合、使用されるプロモーターはSV40後期プロモーター
であることが好ましい。
真核細胞ポリペプチドが関連するシグナル配列を含む
場合（少くとも初期に翻訳される産生物において）、ポ
リペプチドの培養上澄みに対する輸出が起り、したがつ
て産生物を収穫するために細胞を破壊する必要がない改
良方法を許容する。
場合（少くとも初期に翻訳される産生物において）、ポ
リペプチドの培養上澄みに対する輸出が起り、したがつ
て産生物を収穫するために細胞を破壊する必要がない改
良方法を許容する。
真核細胞ポリペプチドを調製する方法は、遺伝子の発
現とポリペプチド産生物の分泌が生じるように、本発明
のベクターで形質転換したミエローマ細胞の培養の培養
上澄みからポリペプチドを単離する工程を含む。
現とポリペプチド産生物の分泌が生じるように、本発明
のベクターで形質転換したミエローマ細胞の培養の培養
上澄みからポリペプチドを単離する工程を含む。
ラツト雑種細胞系YB2/3.0Ag20は英国特許明細書20793
13号に記載されておりアメリカン、タイプ、カルチユ
ア、コレクシヨン（American Type Culture Collectio
n）に寄託番号CRL1662号（寄託日は1985年６月１日より
前）で寄託されている（YB2/OまたはAB2/3HL.P2.G11.16
Ag.20として）。
13号に記載されておりアメリカン、タイプ、カルチユ
ア、コレクシヨン（American Type Culture Collectio
n）に寄託番号CRL1662号（寄託日は1985年６月１日より
前）で寄託されている（YB2/OまたはAB2/3HL.P2.G11.16
Ag.20として）。
マウス雑種細胞系SP2−OAg14はアメリカン、タイプ、
カリチユア、コレクシヨンに寄託番号CRL1581（寄託日
は1985年６月１日より前）で寄託されている。
カリチユア、コレクシヨンに寄託番号CRL1581（寄託日
は1985年６月１日より前）で寄託されている。
マウス雑種細胞系P3/NS1/1Ag4.0（NS1細胞系）はアメ
リカン、カルチユア、コレクシヨンに寄託番号TIB18
（寄託日）で寄託されている。
リカン、カルチユア、コレクシヨンに寄託番号TIB18
（寄託日）で寄託されている。
図面の簡単な説明 本発明を添付図面について説明する。添付図面におい
て、 第１図はプラスミドpSV2βグロビン、pSV3Bne、pSV3m
mne、p6、p3.16、pRSV3、pZAP7、pAC1、pAC2、pAC5、pA
C6およびpPR1の制限地図を示す（tPA遺伝子およびPBV遺
伝子の転写方向は矢印で示す。EcoR I、BamH IおよびSa
l Iに対する制限酵素部位の位置はそれぞれＥ、Ｂ、Ｓ
で示す。各種配列の起源は次のとおり示す。−−BPV、 pBR322由来DNA、 マウスメタルチオネインプロモーター、 マウスモロニー（Moloney）白血病ウイルス（pAC1、pAC
3）またはRous Sarcomaウイルス（pAC4、pAC5、pAC6、p
PR1）からの後期プロモータ、 tPA cDNA遺伝子、 SV40ポリＡ部位、 SV40後期ペロモーター、 選択遺伝子、 SV40初期プロモーター、 SV40配列）。
て、 第１図はプラスミドpSV2βグロビン、pSV3Bne、pSV3m
mne、p6、p3.16、pRSV3、pZAP7、pAC1、pAC2、pAC5、pA
C6およびpPR1の制限地図を示す（tPA遺伝子およびPBV遺
伝子の転写方向は矢印で示す。EcoR I、BamH IおよびSa
l Iに対する制限酵素部位の位置はそれぞれＥ、Ｂ、Ｓ
で示す。各種配列の起源は次のとおり示す。−−BPV、 pBR322由来DNA、 マウスメタルチオネインプロモーター、 マウスモロニー（Moloney）白血病ウイルス（pAC1、pAC
3）またはRous Sarcomaウイルス（pAC4、pAC5、pAC6、p
PR1）からの後期プロモータ、 tPA cDNA遺伝子、 SV40ポリＡ部位、 SV40後期ペロモーター、 選択遺伝子、 SV40初期プロモーター、 SV40配列）。
第２図は、tPA遺伝子のプロモーターフラグメント
５′を除く、同一のプラスミド構造によりトランスフエ
クトした細胞（SP2/O−Ag14）を含むフイブリンアガロ
ーズプレートの写真で、トランスフエクシヨン開始24時
間後および48時間後のものを示す。
５′を除く、同一のプラスミド構造によりトランスフエ
クトした細胞（SP2/O−Ag14）を含むフイブリンアガロ
ーズプレートの写真で、トランスフエクシヨン開始24時
間後および48時間後のものを示す。
第３図はエアリフトフアーメンター（air lift ferme
nter）中でのpRI1/10細胞による増殖曲線およびtPA合成
曲線を示すグラフである（生存細胞△、ELISAによつて
決定されたtPA●、フイブリン寒天検定法によつて決定
されたtPA○）。
nter）中でのpRI1/10細胞による増殖曲線およびtPA合成
曲線を示すグラフである（生存細胞△、ELISAによつて
決定されたtPA●、フイブリン寒天検定法によつて決定
されたtPA○）。
実施例の説明 1. ベクターの構成 1.1 組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）cDNA発現
構造 これらの構造に使用された方法はManiatis et al（19
82年）によつて詳述されたとおりである。本研究で使用
したtPAに特異的なDNA配列はBowes黒色腫ライブラリ（H
arris et al 1986年）から単離した２つのcDNAクローン
から得た。プラスミドptPA A3はtPA cDNAの1200塩基対
（bp）フラグメント（ヌクレオチド９ないし1197、Pe−
nnica et al 1983年）に対しHind IIIリンカーを添加す
ることによつて構成した。次いでこのcDNAを単一のHind
III部位においてpAT153中にクローンした。プラスミド
ptPA21はBg1 II cDNAフラグメント（ヌクレオチド187な
いし2166）を単一のBg1 II部位を有するプラスミド中に
クローンすることによつて構成した。全長tPA cDNAはpt
PA21からのBg1 IIフラグメントをptPA A3のBg1 II部位
中にクローンすることによつて作つた。この結果できた
プラスミドptPA 3/21は、５′非コード配列、全tPAコー
ド領域、393bpの３′非コード配列およびtPAコード領域
（ヌクレオチド187ないし1197）の反復セグメントを一
つのHind IIIフラグメント上に含んでいる。また第２の
プラスミドP81/11を構成した。このプラスミドにおいて
は前記Hind IIIフラグメントはpTA153配列に対し反転さ
れている。
構造 これらの構造に使用された方法はManiatis et al（19
82年）によつて詳述されたとおりである。本研究で使用
したtPAに特異的なDNA配列はBowes黒色腫ライブラリ（H
arris et al 1986年）から単離した２つのcDNAクローン
から得た。プラスミドptPA A3はtPA cDNAの1200塩基対
（bp）フラグメント（ヌクレオチド９ないし1197、Pe−
nnica et al 1983年）に対しHind IIIリンカーを添加す
ることによつて構成した。次いでこのcDNAを単一のHind
III部位においてpAT153中にクローンした。プラスミド
ptPA21はBg1 II cDNAフラグメント（ヌクレオチド187な
いし2166）を単一のBg1 II部位を有するプラスミド中に
クローンすることによつて構成した。全長tPA cDNAはpt
PA21からのBg1 IIフラグメントをptPA A3のBg1 II部位
中にクローンすることによつて作つた。この結果できた
プラスミドptPA 3/21は、５′非コード配列、全tPAコー
ド領域、393bpの３′非コード配列およびtPAコード領域
（ヌクレオチド187ないし1197）の反復セグメントを一
つのHind IIIフラグメント上に含んでいる。また第２の
プラスミドP81/11を構成した。このプラスミドにおいて
は前記Hind IIIフラグメントはpTA153配列に対し反転さ
れている。
プラスミドp81/11をBa1 Iで消化し、116ヌクレオチド
の３′非コード配列、tPAコード領域の反復セグメント
および若干のpAT153配列Bal Iフラグメントをプラスミ
ドpBS Iを残して除去した。付着端をDNAポリメラーゼで
埋めておいたpAT153からの275bpのBamH I/Sal Iフラグ
メントをBal I部位に連結することにより単一のBamH I
およびSal I制限酵素部位をpBS Iに再導入した。フラグ
メントを挿入した方向に応じてSal I部位（pBS17）また
はBamH I部位（pBS18）のいずれかをtPA遺伝子の３′末
端に再構成した。プラスミドpBS18はすべてのtPA cDNA
発現構造に対する前駆体であつた。
の３′非コード配列、tPAコード領域の反復セグメント
および若干のpAT153配列Bal Iフラグメントをプラスミ
ドpBS Iを残して除去した。付着端をDNAポリメラーゼで
埋めておいたpAT153からの275bpのBamH I/Sal Iフラグ
メントをBal I部位に連結することにより単一のBamH I
およびSal I制限酵素部位をpBS Iに再導入した。フラグ
メントを挿入した方向に応じてSal I部位（pBS17）また
はBamH I部位（pBS18）のいずれかをtPA遺伝子の３′末
端に再構成した。プラスミドpBS18はすべてのtPA cDNA
発現構造に対する前駆体であつた。
1.2 マウスメタロチオネイン（MMT−１）プロモーター クローン28（D.Hamer博士、ナシヨナル、インスチチ
ユート、オブ、ヘルス、米国メリーランド州ベセスダ）
はBamH I部位にクローンした全SV40ゲノムおよびEcoR I
部位にクローンしたマウスメタロチオネインＩ（MMT−
Ｉ）遺伝子（HamerおよびWalling.1982年）を含む3.8kb
のEcoR Iフラグメントを有している。このプラスミドは
tPA発現構造におけるMMT−Ｉプロモーター（MMT）を提
供した。翻訳開始点の4bp上流の単一のBgl I部位（Glan
ville,et al、1981年）はオリゴヌクレオチドCCAAGCTTG
Gを使つてHind III部位に変換した。
ユート、オブ、ヘルス、米国メリーランド州ベセスダ）
はBamH I部位にクローンした全SV40ゲノムおよびEcoR I
部位にクローンしたマウスメタロチオネインＩ（MMT−
Ｉ）遺伝子（HamerおよびWalling.1982年）を含む3.8kb
のEcoR Iフラグメントを有している。このプラスミドは
tPA発現構造におけるMMT−Ｉプロモーター（MMT）を提
供した。翻訳開始点の4bp上流の単一のBgl I部位（Glan
ville,et al、1981年）はオリゴヌクレオチドCCAAGCTTG
Gを使つてHind III部位に変換した。
クローン28から得たMMTプロモーターを含む2.0kbpのH
ind IIIフラグメントをpBS18の単一のHind III部位にク
ローンし、その結果としてMMTプロモーターとtPAコード
配列との間の転写上の融合が形成された。このプラスミ
ドはpBS18M3と呼称された。クローン28から得られ、か
つSV40ポリアデニレーシヨン部位を含む2.43bpのBamH I
/Bcl IフラグメントをpBS18M3のBamH I部位に挿入し
た。このポリアデニレーシヨン部位は初期から後期の方
向に配向しており、したがつてtPA遺伝子に対し末端のB
amH I部位を再生した。このプラスミドはp3.16と呼称さ
れた。
ind IIIフラグメントをpBS18の単一のHind III部位にク
ローンし、その結果としてMMTプロモーターとtPAコード
配列との間の転写上の融合が形成された。このプラスミ
ドはpBS18M3と呼称された。クローン28から得られ、か
つSV40ポリアデニレーシヨン部位を含む2.43bpのBamH I
/Bcl IフラグメントをpBS18M3のBamH I部位に挿入し
た。このポリアデニレーシヨン部位は初期から後期の方
向に配向しており、したがつてtPA遺伝子に対し末端のB
amH I部位を再生した。このプラスミドはp3.16と呼称さ
れた。
1.3 Rous SarcomaウイルスおよびMoloneyマウス白血病
ウイルスのロングターミナルリピート Rous Sarcomaウイルス（RSV）およびMoloneyマウス白
血病ウイルスの各ロングターミナルリピート（LTR）をp
RSVcat（Gorman et al、1982年）およびp836（Hoffmann
et al、1982年）からそれぞれCla I/Hind IIIフラグメ
ントとして単離した。前者の場合はMbo II部位をオリゴ
ヌクレオチドGGATCGATCCを使つてCla I部位に変換し、
後者の場合はオリゴヌクレオチドCCAAGCTTGGを使つてSm
a I部位をHind III部位に変換した。各フラグメントを
それぞれ予めCla IおよびHind IIIで切断しておいたp3.
16にクローンすることによつてMMTプロモーターをレト
ロウイルスLTRプロモーターによつて置換することがで
きた。その結果生じたプラスミドはpRSV3（RSV LTRを
含む）およびpZAP7（MoMLV LTRを含む）と呼称された
（第１図参照）。
ウイルスのロングターミナルリピート Rous Sarcomaウイルス（RSV）およびMoloneyマウス白
血病ウイルスの各ロングターミナルリピート（LTR）をp
RSVcat（Gorman et al、1982年）およびp836（Hoffmann
et al、1982年）からそれぞれCla I/Hind IIIフラグメ
ントとして単離した。前者の場合はMbo II部位をオリゴ
ヌクレオチドGGATCGATCCを使つてCla I部位に変換し、
後者の場合はオリゴヌクレオチドCCAAGCTTGGを使つてSm
a I部位をHind III部位に変換した。各フラグメントを
それぞれ予めCla IおよびHind IIIで切断しておいたp3.
16にクローンすることによつてMMTプロモーターをレト
ロウイルスLTRプロモーターによつて置換することがで
きた。その結果生じたプラスミドはpRSV3（RSV LTRを
含む）およびpZAP7（MoMLV LTRを含む）と呼称された
（第１図参照）。
1.4 SV40後期プロモーター tPAを駆動するSV40後期プロモーターを含むプラスミ
ドをp3.16を基本ベクターとして使用することによつて
構成した。pvu IIによつて消化し、次いでHind IIIリン
カーを添加した後Hind IIIによつて消化することによつ
てSV40後期プロモーターをpSV2neoから単離した。こう
して作つたSV40後期プロモーターフラグメントをゲル電
気泳動により精製し、プラスミドp3.16からのMMTのHind
IIIプロモーターフラグメントを置換するために使用し
た。この作られたプラスミドはp6と呼称された（第１
図）。
ドをp3.16を基本ベクターとして使用することによつて
構成した。pvu IIによつて消化し、次いでHind IIIリン
カーを添加した後Hind IIIによつて消化することによつ
てSV40後期プロモーターをpSV2neoから単離した。こう
して作つたSV40後期プロモーターフラグメントをゲル電
気泳動により精製し、プラスミドp3.16からのMMTのHind
IIIプロモーターフラグメントを置換するために使用し
た。この作られたプラスミドはp6と呼称された（第１
図）。
1.5 比較例−免疫グロブリンプロモーター／エンハン
サー pTA153を基本ベクターとして使つて免疫グロブリンプ
ロモーター／エンハンサー組合せを含むプラスミドを構
成した（TwiggおよびSherratt、1980年）。EcoR Iリン
カーの添加によつてEcoR Iフラグメントに変換したxba
I−EcoR Iフラグメント（Gillies et al、1983年）上の
Ig H鎖エンハンサー（Ig en）によつてpAT153中EcoR I
−BamH I領域を置換した。Ig enを1.3kbのEcoR I−Nco
Iフラグメントとして単離したIg H鎖プロモーター（Ig
Pro）に対するセンス方向にクローンした。このプロモ
ーターフラグメントはフアージVNPB−186のNco I部位を
ポリメラーゼで埋めリンカーを添加してBgl II部位に変
換してベクターpM I205を生成することによつて、フア
ージVNPB−186から得られる（Bothwell et al、1981
年）。tPA遺伝子をBamH Iフラグメントとしてこのベク
ターに導入した。これをpBS18からpBS18として単離し、
次いでBamH Iリンカーを添加した。tPA BamH Iフラグメ
ントをpM I205のBg1 II部位に導入しpMI205tPAを作つ
た。
サー pTA153を基本ベクターとして使つて免疫グロブリンプ
ロモーター／エンハンサー組合せを含むプラスミドを構
成した（TwiggおよびSherratt、1980年）。EcoR Iリン
カーの添加によつてEcoR Iフラグメントに変換したxba
I−EcoR Iフラグメント（Gillies et al、1983年）上の
Ig H鎖エンハンサー（Ig en）によつてpAT153中EcoR I
−BamH I領域を置換した。Ig enを1.3kbのEcoR I−Nco
Iフラグメントとして単離したIg H鎖プロモーター（Ig
Pro）に対するセンス方向にクローンした。このプロモ
ーターフラグメントはフアージVNPB−186のNco I部位を
ポリメラーゼで埋めリンカーを添加してBgl II部位に変
換してベクターpM I205を生成することによつて、フア
ージVNPB−186から得られる（Bothwell et al、1981
年）。tPA遺伝子をBamH Iフラグメントとしてこのベク
ターに導入した。これをpBS18からpBS18として単離し、
次いでBamH Iリンカーを添加した。tPA BamH Iフラグメ
ントをpM I205のBg1 II部位に導入しpMI205tPAを作つ
た。
５つのプラスミドp3.16、pRSV3、pZA7、p6およびpMI2
05（第１図）はtPA発現構造の直接の前駆体であり、か
つtPA産生のための過渡的検査に使用するプラスミドで
ある。
05（第１図）はtPA発現構造の直接の前駆体であり、か
つtPA産生のための過渡的検査に使用するプラスミドで
ある。
1.6 選択マーカーおよび他の機能的要素 優勢な選択力の付与に寄与する遺伝子をpSV2neo（Sou
thernおよびBerg、1982年）、pSVdhfr（Subramani et a
l、1981年）およびpSV2gpt（MulliganおよびBerg、1981
年）から得た。
thernおよびBerg、1982年）、pSVdhfr（Subramani et a
l、1981年）およびpSV2gpt（MulliganおよびBerg、1981
年）から得た。
pSV2neo（「ネオ」）における転写ユニツトによつて
付与された抗生物質G418に対する耐性を本明細書記載の
構造の大部分において使用した。「ネオ」転写ユニツト
を使用するためにそれをBamH Iに再クローンし、またHi
nd IIIフラグメント中に再クローンした。
付与された抗生物質G418に対する耐性を本明細書記載の
構造の大部分において使用した。「ネオ」転写ユニツト
を使用するためにそれをBamH Iに再クローンし、またHi
nd IIIフラグメント中に再クローンした。
これらのベクター構造の開始点はpSV2βグロビン（第
１図）（SouthernおよびBerg、1982年）であつた。この
ベクターのHind III部位をBgl II部位に変換した後βグ
ロビンを含む生成Bgl IIフラグメントを除去した。その
結果生じたプラスミドpSV2 Bgl IIは、プラスミドpSV3M
を生じる次段階におけるpvu II部位のHind III部位への
変換の基礎を形成した。
１図）（SouthernおよびBerg、1982年）であつた。この
ベクターのHind III部位をBgl II部位に変換した後βグ
ロビンを含む生成Bgl IIフラグメントを除去した。その
結果生じたプラスミドpSV2 Bgl IIは、プラスミドpSV3M
を生じる次段階におけるpvu II部位のHind III部位への
変換の基礎を形成した。
pSV3Mへの「ネオ」遺伝子の導入はBgl II−BamH Iポ
リＡ−スプライス遺伝子フラグメントをpSV2neoから単
離したBgl II−BamH Iフラグメントによつて置換するこ
とにより行つた。その結果生じたプラスミドであるpSV3
Mneは、ポリＡ配列なしで「ネオ」遺伝子と発現を駆動
するSV40初期プロモーターをHind III−BamH Iフラグメ
ント中に含んでいた。pSV3MneのHind II部位およびBamH
I部位を別々にBamH I部位およびHIND III部位にそれぞ
れ変換し、プラスミドpSV3BneおよびpSV3MMne（第１
図）をそれぞれ生成した。
リＡ−スプライス遺伝子フラグメントをpSV2neoから単
離したBgl II−BamH Iフラグメントによつて置換するこ
とにより行つた。その結果生じたプラスミドであるpSV3
Mneは、ポリＡ配列なしで「ネオ」遺伝子と発現を駆動
するSV40初期プロモーターをHind III−BamH Iフラグメ
ント中に含んでいた。pSV3MneのHind II部位およびBamH
I部位を別々にBamH I部位およびHIND III部位にそれぞ
れ変換し、プラスミドpSV3BneおよびpSV3MMne（第１
図）をそれぞれ生成した。
ミコフエノール酸およびキサニチンの存在下で優勢な
選択力を付与する（MorrisonおよびOi、1984年）pSV2gp
tからのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フエラーゼ（gpt）を使用するための適当な遺伝子フラ
グメントを産生するために（MulliganおよびBerg、1981
年）、「ネオ」遺伝子を含むpSV3MneのBgl II−BamH I
フラグメントをgpt遺伝子を含むpSV2gptのBgl II−BamH
Iフラグメントで置換した。その結果生じたプラスミド
pSV3gptは、SV40からのポリＡ−スプライスをHind III
−BamH Iフラグメントの３′末端に有するgpt発現を駆
動するSV40初期プロモーターを含んでいる。次いでこの
ベクターのHind III部位をBamH I部位に変換しプラスミ
ドpSV3Bgptを生成せしめ、上記ベクターの使用に適した
BamH Iフラグメントを提供した。
選択力を付与する（MorrisonおよびOi、1984年）pSV2gp
tからのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フエラーゼ（gpt）を使用するための適当な遺伝子フラ
グメントを産生するために（MulliganおよびBerg、1981
年）、「ネオ」遺伝子を含むpSV3MneのBgl II−BamH I
フラグメントをgpt遺伝子を含むpSV2gptのBgl II−BamH
Iフラグメントで置換した。その結果生じたプラスミド
pSV3gptは、SV40からのポリＡ−スプライスをHind III
−BamH Iフラグメントの３′末端に有するgpt発現を駆
動するSV40初期プロモーターを含んでいる。次いでこの
ベクターのHind III部位をBamH I部位に変換しプラスミ
ドpSV3Bgptを生成せしめ、上記ベクターの使用に適した
BamH Iフラグメントを提供した。
ミエローマ細胞内での増幅の利用度を研究するため、
pSV2 dhfrに含まれるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
（dhfr）cDNA遺伝子を利用した（Subramani et al、198
1年）。
pSV2 dhfrに含まれるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
（dhfr）cDNA遺伝子を利用した（Subramani et al、198
1年）。
われわれのベクターによつて適当なSV40初期プロモー
ターとdhfrの遺伝子フラグメントを産生するため、pSV2
dhfrのPvu II部位をリンカーの添加によつてBamH I部
位に変換してプラスミドpDBを生成した。pDBは、SV40ポ
リＡ−スプライス配列を３′末端に有するdhfr駆動SV40
初期プロモーターを含むBamH Iフラグメント含んでい
る。
ターとdhfrの遺伝子フラグメントを産生するため、pSV2
dhfrのPvu II部位をリンカーの添加によつてBamH I部
位に変換してプラスミドpDBを生成した。pDBは、SV40ポ
リＡ−スプライス配列を３′末端に有するdhfr駆動SV40
初期プロモーターを含むBamH Iフラグメント含んでい
る。
プラスミドpBMTH I（G.N.Pavlakis博士、ナシヨナル
キヤンサー、インスチチユート、メリーランド州フレ
デリツク）はBamH I/Sal Iフラグメント上に全BPV−１
ゲノムと完全なMMT−Ｉ遺伝子を含んでいる。BamH I部
位がSal I部位に変換され、Sal I部位がBamH I部位に変
換された第２のプラスミドpBMT13をpBMTH Iから構成し
た。
キヤンサー、インスチチユート、メリーランド州フレ
デリツク）はBamH I/Sal Iフラグメント上に全BPV−１
ゲノムと完全なMMT−Ｉ遺伝子を含んでいる。BamH I部
位がSal I部位に変換され、Sal I部位がBamH I部位に変
換された第２のプラスミドpBMT13をpBMTH Iから構成し
た。
最初の各ベクターの潜在的価値を調べるため、最初の
ベクターはBPVベクターにもとずいて行つた。pBMT13に
ついての研究はミエローマ細胞中での重金属選択は有用
でないことを示した。このためBPV中での他の選択シス
テムの必要性が生じた。ミエローマ細胞中で優勢な選択
力を付与するBPVベクターを構成するため、pBMT13中でM
MT−Ｉ遺伝子の直接置換を可能にするHind IIIフラグメ
ントとして単離されたpSV3MMneからの「ネオ」遺伝子カ
セツトを導入した。このMMT−Ｉ遺伝子の置換は２つの
新しいBPVにもとずくプラスミドベクターであるp2012Sn
eRおよびP2012SneLを生成した。これらのベクターはBPV
に対する両方向において、Hind III挿入物として、「ネ
オ」遺伝子を駆動するSV40初期プロモーターを含んでい
た。これらのBPVベクターはミエローマ細胞中でテスト
された上記tPAプラスミドp6、p316、pRSV3およびpZAP7
を使用するベクターの基礎をなした。その結果生じたプ
ラスミドpAC1、pAC2、pAC3、pAC6は、BamH I−Sal I pA
T153配列をp6、p316、pRSV3およびpZAP7からのBamH I−
Sal Iフラグメントで置換することにより産生された。
ベクターはBPVベクターにもとずいて行つた。pBMT13に
ついての研究はミエローマ細胞中での重金属選択は有用
でないことを示した。このためBPV中での他の選択シス
テムの必要性が生じた。ミエローマ細胞中で優勢な選択
力を付与するBPVベクターを構成するため、pBMT13中でM
MT−Ｉ遺伝子の直接置換を可能にするHind IIIフラグメ
ントとして単離されたpSV3MMneからの「ネオ」遺伝子カ
セツトを導入した。このMMT−Ｉ遺伝子の置換は２つの
新しいBPVにもとずくプラスミドベクターであるp2012Sn
eRおよびP2012SneLを生成した。これらのベクターはBPV
に対する両方向において、Hind III挿入物として、「ネ
オ」遺伝子を駆動するSV40初期プロモーターを含んでい
た。これらのBPVベクターはミエローマ細胞中でテスト
された上記tPAプラスミドp6、p316、pRSV3およびpZAP7
を使用するベクターの基礎をなした。その結果生じたプ
ラスミドpAC1、pAC2、pAC3、pAC6は、BamH I−Sal I pA
T153配列をp6、p316、pRSV3およびpZAP7からのBamH I−
Sal Iフラグメントで置換することにより産生された。
その他の構成をBPVを使用しないで作つた。これら後
で作つた構成においては、プラスミドに優勢な選択マー
カーを付与するpSV3ne、pSV3BgptおよびpDBからのBmH I
フラグメントを使用した。
で作つた構成においては、プラスミドに優勢な選択マー
カーを付与するpSV3ne、pSV3BgptおよびpDBからのBmH I
フラグメントを使用した。
選択力を付与するBPVベクターの不存在下で安定的な
細胞系を生成するためにpRSV3を使用するために、選択
的マーカーをBamH I部位に導入した。使用した選択カセ
ツトはBamH Iフラグメントを両方向において含むプラス
ミドpPR IおよびpPR IIを産生するpSV3BneからのBamH I
フラグメントであつた。「ネオ」遺伝子に加えて、pSV3
BgptおよびpDBからのBamH I選択カセツトがBamH I部位
に導入され、その結果gpt遺伝子を含むpRSGおよび３つ
以上のdhfr遺伝子カセツトを含むpRSD3が産生された。
細胞系を生成するためにpRSV3を使用するために、選択
的マーカーをBamH I部位に導入した。使用した選択カセ
ツトはBamH Iフラグメントを両方向において含むプラス
ミドpPR IおよびpPR IIを産生するpSV3BneからのBamH I
フラグメントであつた。「ネオ」遺伝子に加えて、pSV3
BgptおよびpDBからのBamH I選択カセツトがBamH I部位
に導入され、その結果gpt遺伝子を含むpRSGおよび３つ
以上のdhfr遺伝子カセツトを含むpRSD3が産生された。
tPA発現を駆動するSV40後期プロモーターをBPVの不存
在下で使用するため、上記と同様の構成を使用した。pS
V3BgptからのBamH I gpt遺伝子カセツトを導入しp6gpt
を生成した。部分的にBamH I消化が行われたp6gptにdhf
r BamH I発現カセツトを導入しp6GDを生成することによ
つてp6gptベクターの利用度は一層増進された。
在下で使用するため、上記と同様の構成を使用した。pS
V3BgptからのBamH I gpt遺伝子カセツトを導入しp6gpt
を生成した。部分的にBamH I消化が行われたp6gptにdhf
r BamH I発現カセツトを導入しp6GDを生成することによ
つてp6gptベクターの利用度は一層増進された。
2. トランスフエクシヨン トランスフエクシヨンに使用した細胞系はSP2−OAG14
（Shulman et al、1978年）、NSO（これはp3×NS1/1Ag
4.1（Kohler et al、1976年）のサブ細胞系であり細胞
内Ｌ鎖を発現しない（M.Clark、B.W.WrightおよびC.Mil
stein））、001a BALB/c×NSO雑種細胞（Sherwood,M.未
刊行）およびYB2/3.0 Ag20（英国特許GB2079313）であ
つた。これらの細胞系はDulbecco修正Eagle培地（DME
M、Gibco Ltd.英国）ペニシリン（500U/ml）、ストレプ
トマイシン（50μg/Ml）、1mMピルビン酸、2mML−グル
タミンおよび熱不活性化子ウシ血清（10％）を添加した
ものの中で保存した。
（Shulman et al、1978年）、NSO（これはp3×NS1/1Ag
4.1（Kohler et al、1976年）のサブ細胞系であり細胞
内Ｌ鎖を発現しない（M.Clark、B.W.WrightおよびC.Mil
stein））、001a BALB/c×NSO雑種細胞（Sherwood,M.未
刊行）およびYB2/3.0 Ag20（英国特許GB2079313）であ
つた。これらの細胞系はDulbecco修正Eagle培地（DME
M、Gibco Ltd.英国）ペニシリン（500U/ml）、ストレプ
トマイシン（50μg/Ml）、1mMピルビン酸、2mML−グル
タミンおよび熱不活性化子ウシ血清（10％）を添加した
ものの中で保存した。
DNAをミエローマ細胞に導入するため、DEAE−デキス
トラン、CaPO4およびエレクトロポレーシヨンを使用す
る標準的な方法（Banerji et al、1983年、Crahamおよ
びVander Eb.1973年、Potter et al、1984年）を使用し
た。トランスフエクシヨンの大部分は、トランスフエク
シヨンを改良するためジメチルスルホキシド（DMSO）株
（Lopata et al、1984年）およびクロロキニーネ（Lath
manおよびMagnusson、1983年）を使用するDEAE−デキス
トラン法の修正方法によつて行つた。
トラン、CaPO4およびエレクトロポレーシヨンを使用す
る標準的な方法（Banerji et al、1983年、Crahamおよ
びVander Eb.1973年、Potter et al、1984年）を使用し
た。トランスフエクシヨンの大部分は、トランスフエク
シヨンを改良するためジメチルスルホキシド（DMSO）株
（Lopata et al、1984年）およびクロロキニーネ（Lath
manおよびMagnusson、1983年）を使用するDEAE−デキス
トラン法の修正方法によつて行つた。
トランスフエクシヨン後細胞の選択を行う前に通常24
時間静置した。pSV3BneまたはpSV3MMneのいずれかから
の「ネオ」遺伝子カセツトを含むプラスミド構成を有す
るトランスフエクシヨンを、抗生物質G418（Genenticin
Gibco Ltd.英国）（Schering Corp.米国特許明細書395
9254号,3997403号）を濃度1.4mg/mlで使用することによ
つて、選択した。
時間静置した。pSV3BneまたはpSV3MMneのいずれかから
の「ネオ」遺伝子カセツトを含むプラスミド構成を有す
るトランスフエクシヨンを、抗生物質G418（Genenticin
Gibco Ltd.英国）（Schering Corp.米国特許明細書395
9254号,3997403号）を濃度1.4mg/mlで使用することによ
つて、選択した。
培養培地に200μg/mlキサンチン、５μg/mlミコフエ
ノール酸（Gibco.英国）および13.6μg/mlヒポキサンチ
ンを補充することによつてpSV3Bgptからのgpt遺伝子カ
セツトを含むプラスミドを選択した。
ノール酸（Gibco.英国）および13.6μg/mlヒポキサンチ
ンを補充することによつてpSV3Bgptからのgpt遺伝子カ
セツトを含むプラスミドを選択した。
pDBからのdhfr遺伝子カセツトを含むプラスミドの選
択は150nMメトトレキセート（Paeg.1985年）によつて行
つた。
択は150nMメトトレキセート（Paeg.1985年）によつて行
つた。
p6GDによるトランスフエクシヨンの場合は、細胞系は
最初gpt遺伝子カセツトを使用して選択し、次いで増幅
のためdhfr遺伝子カセツトを使用した。
最初gpt遺伝子カセツトを使用して選択し、次いで増幅
のためdhfr遺伝子カセツトを使用した。
選択を行つた後細胞系をさらに24〜28時間インキユベ
ートし、次いでクローン選択のためマイクロ滴定皿に分
配した。最初のクローンが現れるまでにこれらのマイク
ロ滴定皿を通常２〜３時間インキユベートした。クロー
ンは、上澄みを検査する以前に、または24ウエル組織培
養皿に拡大する以前に飽和状態（培養培地のフエノール
レツドが黄色に変わる）まで増殖させた。有用なレベル
のtPA産生（100μ/ml以上）を示したこれらのトランス
フエクシヨンからの細胞系を培養培地に10％DMSOを補充
した後液体窒素中で凍結株として貯蔵した。またこれら
の細胞系を再クローンし、選択した高産生細胞系を上記
同様に貯蔵した。
ートし、次いでクローン選択のためマイクロ滴定皿に分
配した。最初のクローンが現れるまでにこれらのマイク
ロ滴定皿を通常２〜３時間インキユベートした。クロー
ンは、上澄みを検査する以前に、または24ウエル組織培
養皿に拡大する以前に飽和状態（培養培地のフエノール
レツドが黄色に変わる）まで増殖させた。有用なレベル
のtPA産生（100μ/ml以上）を示したこれらのトランス
フエクシヨンからの細胞系を培養培地に10％DMSOを補充
した後液体窒素中で凍結株として貯蔵した。またこれら
の細胞系を再クローンし、選択した高産生細胞系を上記
同様に貯蔵した。
tPAタンパク質の定量化 細胞系からのtPAを繊維素溶解による検定法または酵
素結合イムノソルベントアツセイ（ELISA）によつて検
査した。
素結合イムノソルベントアツセイ（ELISA）によつて検
査した。
培地中の活性tPAタンパク質をCederholm−Will−iams
によつて修正されたフイブリン−アガロースプレートア
ツセイを使用して検査した。0.1Mトリス（pH7.4）、0.1
5M NaClおよび2mM CaCl2中でLGTアガロース20mg/mlを溶
解し55℃に冷却した。0.9％（w/v）NaCl中2mg/mlの等量
のフイブリノーゲンおよび最終濃度10μg/mlのヒトプラ
スミノーゲンを添加した。フイブリンの重合はウシトロ
ンビンを0.12ユニツト/mlまで添加することによつて開
始された。混合物をポリエステルシート上に注ぎ硬化す
るまで静置した。試料の希釈液と既知濃度のウロキナー
ゼ標準溶液の希釈液（５μ容量）をゲル中に穿孔した
ウエルに加え、皿を加湿した室内で37℃で17時間ないし
20時間インキユベートした。分解の面積の径を測定し
た。濃度の対数に対する径の２乗の対数をプロツトする
ことによつてウロキナーゼのデータから標準曲線を画い
た。試料の活性量はこの標準曲線から決定した。10〜10
0ユニツト/mlの範囲内においてウロキナーゼはtPA活性
を評価するための適当な標準であることが示された。
によつて修正されたフイブリン−アガロースプレートア
ツセイを使用して検査した。0.1Mトリス（pH7.4）、0.1
5M NaClおよび2mM CaCl2中でLGTアガロース20mg/mlを溶
解し55℃に冷却した。0.9％（w/v）NaCl中2mg/mlの等量
のフイブリノーゲンおよび最終濃度10μg/mlのヒトプラ
スミノーゲンを添加した。フイブリンの重合はウシトロ
ンビンを0.12ユニツト/mlまで添加することによつて開
始された。混合物をポリエステルシート上に注ぎ硬化す
るまで静置した。試料の希釈液と既知濃度のウロキナー
ゼ標準溶液の希釈液（５μ容量）をゲル中に穿孔した
ウエルに加え、皿を加湿した室内で37℃で17時間ないし
20時間インキユベートした。分解の面積の径を測定し
た。濃度の対数に対する径の２乗の対数をプロツトする
ことによつてウロキナーゼのデータから標準曲線を画い
た。試料の活性量はこの標準曲線から決定した。10〜10
0ユニツト/mlの範囲内においてウロキナーゼはtPA活性
を評価するための適当な標準であることが示された。
トランスフエクトした細胞系からの培養培地中の全tP
Aタンパク質をELISAを用いて検査した。0.05M炭酸ナト
リウム（pH9.6）中の２μg/mlヤギポリクローナル抗tPA
（Biopool.スエーデン）を１時間37℃で塗布したNuncイ
ムノアツセイプレート（Nunc.デンマーク）中でELISAを
行つた。これらの皿は0.05M炭酸ナトリウム（pH9.6）中
の0.5％カセインHammerstemで１時間37℃でブロツクし
た。これらの塗布しブロツクしたマイクロ滴定皿および
他の洗浄工程における皿は0.02％Tween20を含むリン酸
緩衝食塩水で洗浄した。検査用の試料は試料緩衝液（0.
1MトリスHCl pH7.0、150mM NaCl、0.5％カセインおよび
0.02％Tween20）に希釈した。この検査で使用した標準
は２本鎖tPA（Biopool、スエーデン）であつた。試料は
ウエルあたり100μ入れ振とうしながら室温で１時間
インキユベートした。次いでプレートを洗い、試料緩衝
液中のマウスモノクローナル抗体である１μg/ml MAC01
0を各ウエルに加えた（100μ）。これらを振とうしな
がら室温で１時間インキユベートした。モノクローナル
抗体とともにインキユベートした後皿を洗い、次いで各
皿にヤギ抗マウスIgG Fc特異的プロキシダーゼコンジユ
ゲート100μを添加し、振とうしながら室温で１時間
インキユベートした。コンジユゲートとともにインキユ
ベートした後皿を洗い、次いで文献記載にしたがい展開
した（Bos et al、1981年）。
Aタンパク質をELISAを用いて検査した。0.05M炭酸ナト
リウム（pH9.6）中の２μg/mlヤギポリクローナル抗tPA
（Biopool.スエーデン）を１時間37℃で塗布したNuncイ
ムノアツセイプレート（Nunc.デンマーク）中でELISAを
行つた。これらの皿は0.05M炭酸ナトリウム（pH9.6）中
の0.5％カセインHammerstemで１時間37℃でブロツクし
た。これらの塗布しブロツクしたマイクロ滴定皿および
他の洗浄工程における皿は0.02％Tween20を含むリン酸
緩衝食塩水で洗浄した。検査用の試料は試料緩衝液（0.
1MトリスHCl pH7.0、150mM NaCl、0.5％カセインおよび
0.02％Tween20）に希釈した。この検査で使用した標準
は２本鎖tPA（Biopool、スエーデン）であつた。試料は
ウエルあたり100μ入れ振とうしながら室温で１時間
インキユベートした。次いでプレートを洗い、試料緩衝
液中のマウスモノクローナル抗体である１μg/ml MAC01
0を各ウエルに加えた（100μ）。これらを振とうしな
がら室温で１時間インキユベートした。モノクローナル
抗体とともにインキユベートした後皿を洗い、次いで各
皿にヤギ抗マウスIgG Fc特異的プロキシダーゼコンジユ
ゲート100μを添加し、振とうしながら室温で１時間
インキユベートした。コンジユゲートとともにインキユ
ベートした後皿を洗い、次いで文献記載にしたがい展開
した（Bos et al、1981年）。
ミエローマ細胞中のtPA産生の過渡的検査 われわれのプラスミド構造が真核細胞遺伝子の発現を
指示する能力を評価するため、プラスミノーゲン活性化
因子に対するフイブリンオーバーレイアツセイを好感度
でしたがつて強力な過渡的検定システムに修正した（Jo
nes et al、1975年、Kenten et al、1986年）。
指示する能力を評価するため、プラスミノーゲン活性化
因子に対するフイブリンオーバーレイアツセイを好感度
でしたがつて強力な過渡的検定システムに修正した（Jo
nes et al、1975年、Kenten et al、1986年）。
これらのpPA産生の過渡的検定に使用するプラスミド
は前記すなわち以下のものである。
は前記すなわち以下のものである。
p3.16 マウスメタロチオネインプロモーターを含む。
pRSV3 MoMLV LTRを含む。
pZAP7 MoMLV LTRを含む。
p6 SV40後期プロモーターを含む。
pMI205tPA 免疫グロブリンモーター／エンハンサー組
合せを含む。
合せを含む。
トランスフエクシヨンはDEAE−デキストラン法を記載
されたとおり使用することにより行い、細胞は直接以下
に述べるtPA検定に付した。
されたとおり使用することにより行い、細胞は直接以下
に述べるtPA検定に付した。
tPA検定のため、トランスフエクトした細胞を皿から
削り落とし（約５×106）、細胞の10％をとり、無血清D
MEM（Gibco）、1mMピルビン酸、50IU/mlペニシリン、50
μg/mlストレプトマイシン（P/S）、2mM L−グルタミン
（Gln）中で２度洗浄した。次いでこれらの細胞を上記
のような70％DMEM7ml中に懸濁し、10％（v/v）酸処理子
ウシ血清（FCS）および2.5％低ゲル化温度アガロース
（Sigma Ltd.）を42℃で補充した30％（v/v）Hanks平衡
塩（Gibco）を補充した。この懸濁液にトロンビン（ウ
シプラズマ500U/mlからのもの、Sigma Ltd.）0.5ユニツ
トを補充した。最後に、DMEM1.5ml、1mMピルビン酸、P/
S、Gln、10％（v/v）酸処理FCS、30mg/mlフイブリノー
ゲン（ウシの血清からのもの、タイプＩ−Ｓ、Sigma Lt
d.）を添加し、混合物を直ちに90mm皿に注いだ。
削り落とし（約５×106）、細胞の10％をとり、無血清D
MEM（Gibco）、1mMピルビン酸、50IU/mlペニシリン、50
μg/mlストレプトマイシン（P/S）、2mM L−グルタミン
（Gln）中で２度洗浄した。次いでこれらの細胞を上記
のような70％DMEM7ml中に懸濁し、10％（v/v）酸処理子
ウシ血清（FCS）および2.5％低ゲル化温度アガロース
（Sigma Ltd.）を42℃で補充した30％（v/v）Hanks平衡
塩（Gibco）を補充した。この懸濁液にトロンビン（ウ
シプラズマ500U/mlからのもの、Sigma Ltd.）0.5ユニツ
トを補充した。最後に、DMEM1.5ml、1mMピルビン酸、P/
S、Gln、10％（v/v）酸処理FCS、30mg/mlフイブリノー
ゲン（ウシの血清からのもの、タイプＩ−Ｓ、Sigma Lt
d.）を添加し、混合物を直ちに90mm皿に注いだ。
これらのトランスフエクシヨンから産生されるtPAの
レベルを決定するため、これらの皿を48時間までの種々
の時間の間インキユベートした。その結果を繊維素溶解
活性の相対レベルとして記録した。第２図はその典型的
な結果を示す。
レベルを決定するため、これらの皿を48時間までの種々
の時間の間インキユベートした。その結果を繊維素溶解
活性の相対レベルとして記録した。第２図はその典型的
な結果を示す。
これらのトランスフエクシヨンからの結果は、YB2/3.
0Ag20プロモーターとしてのランク付けは、活性が順次
下る順序にRSV LTR、SV40後期、MoMLV LTR、MMTの順で
ある。細胞系SP2/0−Ag14およびBALB/C×NSOマウス雑種
についてはプロモーターの格付けは活性が順次下る順序
にSV40後期、RSV LTR、MoMLV LTR、MMTである。
0Ag20プロモーターとしてのランク付けは、活性が順次
下る順序にRSV LTR、SV40後期、MoMLV LTR、MMTの順で
ある。細胞系SP2/0−Ag14およびBALB/C×NSOマウス雑種
についてはプロモーターの格付けは活性が順次下る順序
にSV40後期、RSV LTR、MoMLV LTR、MMTである。
一つの免疫グロブリンプロモーターを上記ベクター構
造の節で述べた部分的に特徴ずけたエンハンサーフラグ
メントと組合せたものもテストした。これはミエローマ
細胞系におけるMMTプロモーターに非常に類似したtPA発
現レベルを示した。
造の節で述べた部分的に特徴ずけたエンハンサーフラグ
メントと組合せたものもテストした。これはミエローマ
細胞系におけるMMTプロモーターに非常に類似したtPA発
現レベルを示した。
これらの検定の結果は、発現のために組込まれた遺伝
子を有する細胞系の最初の研究の基礎となる有益な枠組
を提供する。過渡的検定は単に通常の遺伝子環境（染色
体内の）から孤立したプロモーター能力の度合いを示す
ものである。したがつて、プロモーターの選択という点
で過渡的細胞系からの結果と安定な細胞系からの結果と
の間には相違があるかもしれない。
子を有する細胞系の最初の研究の基礎となる有益な枠組
を提供する。過渡的検定は単に通常の遺伝子環境（染色
体内の）から孤立したプロモーター能力の度合いを示す
ものである。したがつて、プロモーターの選択という点
で過渡的細胞系からの結果と安定な細胞系からの結果と
の間には相違があるかもしれない。
tPA産生細胞系 tPA産生細胞系はマウス雑種細胞SP2/0−Ag14、NSOお
よびラツト雑種細胞YB2/3.0−Ag20から得た。これらの
細胞系は、ウイルスプロモーターが雑種細胞およびミエ
ローマ細胞系における真核細胞遺伝子の発現を駆動する
能力を示している。
よびラツト雑種細胞YB2/3.0−Ag20から得た。これらの
細胞系は、ウイルスプロモーターが雑種細胞およびミエ
ローマ細胞系における真核細胞遺伝子の発現を駆動する
能力を示している。
マウス雑種細胞系SP2/0−Ag14は無血清培地において
懸濁液として良く増殖するので、産生細胞系として優れ
た候補として選んだ。この細胞系のプラスミドPAC1、PA
C2、PAC6、pPRIによるトランスフエクシヨンはSP2/0−A
g14からtPAを発現する細胞系を得る能力を示した。pAC
1、pAC2、pAC6およびpPRIによる結果はMMT、RSV LTRお
よびMoMLVLTR各プロモーターがこの細胞系において真核
細胞タンパク質の発現を駆動する能力を示す。
懸濁液として良く増殖するので、産生細胞系として優れ
た候補として選んだ。この細胞系のプラスミドPAC1、PA
C2、PAC6、pPRIによるトランスフエクシヨンはSP2/0−A
g14からtPAを発現する細胞系を得る能力を示した。pAC
1、pAC2、pAC6およびpPRIによる結果はMMT、RSV LTRお
よびMoMLVLTR各プロモーターがこの細胞系において真核
細胞タンパク質の発現を駆動する能力を示す。
SP2/0−Ag14についての結果（最大レベル）は次のと
おりである。
おりである。
プラスミド プロモーター 培養の最大U/ml pAC2 MMT 4U/ml pAC1 Mo MLV LTR 50U/ml pAC6 RSV LTR 約10U/ml pPRI RSV LTR 4U/ml 他のマウス雑種細胞系であるNSOもSP2/0−Ag14につい
て好ましい増殖特性を有している。細胞系を生成するた
め一つのプラスミドベクター（p6GD）をNSOにトランス
フエクトした。これらの細胞系はSV40後期プロモーター
の影響下にtPAを27U/mlまで合成することが示された。
て好ましい増殖特性を有している。細胞系を生成するた
め一つのプラスミドベクター（p6GD）をNSOにトランス
フエクトした。これらの細胞系はSV40後期プロモーター
の影響下にtPAを27U/mlまで合成することが示された。
研究したラツト雑種細胞はYB2/3.0−Ag20細胞系で、
これは高産生雑種細胞系を生成するため貴重であること
が判つた。この細胞系はpAC1、pAC6、pPRI、p6GD、pRSD
3およびp6gptで産生可能にトランスフエクトされ、MoML
V LTR、RSV LTRおよびSV40後期各プロモーターがこの細
胞系において発現を駆動する能力を有することを示し
た。
これは高産生雑種細胞系を生成するため貴重であること
が判つた。この細胞系はpAC1、pAC6、pPRI、p6GD、pRSD
3およびp6gptで産生可能にトランスフエクトされ、MoML
V LTR、RSV LTRおよびSV40後期各プロモーターがこの細
胞系において発現を駆動する能力を有することを示し
た。
トランスフエクシヨンによつて得られる細胞系に関す
る結果は次のとおりである。
る結果は次のとおりである。
増 幅 遺伝子コピー数の増幅は発現システムからタンパク質
を産生する確認された方法である。これは、主として種
々の特殊化した組織または種において自然に発見される
機構としての遺伝子増幅の認識によるものである（Schi
mke、1984年）。この機構は真核細胞の発現システムに
おいては利用されていたが、著るしく使われているのは
チセイニーズハムスター細胞系においてのみである（Ka
ufman et al、1984年）。最も特徴ずけられた増幅シス
テムはdhfrおよびメトトレキセートにもとずくものであ
る（Schimke、1984年）。したがつてこの背景において
遺伝子発現の共増幅（co−amplification）がマウス、
ラツト雑種細胞／ミエローマ各細胞系において有効に機
能するかどうかを観測することは興味深いことであつ
た。
を産生する確認された方法である。これは、主として種
々の特殊化した組織または種において自然に発見される
機構としての遺伝子増幅の認識によるものである（Schi
mke、1984年）。この機構は真核細胞の発現システムに
おいては利用されていたが、著るしく使われているのは
チセイニーズハムスター細胞系においてのみである（Ka
ufman et al、1984年）。最も特徴ずけられた増幅シス
テムはdhfrおよびメトトレキセートにもとずくものであ
る（Schimke、1984年）。したがつてこの背景において
遺伝子発現の共増幅（co−amplification）がマウス、
ラツト雑種細胞／ミエローマ各細胞系において有効に機
能するかどうかを観測することは興味深いことであつ
た。
実施された研究はプラスミド構成pRSD3および細胞系Y
B2/3.0−Ag20を使用した。このプラスミドベクターをYB
2/3.0−Ag20にトランスフエクトし、150nMメトトレキセ
ートを使つてクローンを選択した。これらの細胞系をス
クリーンし産生クローンを選択して、確認された方法
（Kaufman et al、1983年）を使用して順次より高いレ
ベルのメトトレキセートに対して増殖させた。細胞系は
増幅の開始時および増幅の合間に貯蔵した。tPA発現の
範囲は単離された初期細胞系において観測される広いス
ペクトルの活性について典型的なものであつた。
B2/3.0−Ag20を使用した。このプラスミドベクターをYB
2/3.0−Ag20にトランスフエクトし、150nMメトトレキセ
ートを使つてクローンを選択した。これらの細胞系をス
クリーンし産生クローンを選択して、確認された方法
（Kaufman et al、1983年）を使用して順次より高いレ
ベルのメトトレキセートに対して増殖させた。細胞系は
増幅の開始時および増幅の合間に貯蔵した。tPA発現の
範囲は単離された初期細胞系において観測される広いス
ペクトルの活性について典型的なものであつた。
われわれの結果は、メトトレキセートに対する抵抗が
増加するにつれtPA産生レベルも増加することを示し
た。これは雑種細胞／ミエローマ細胞系についての共増
幅が有効なことを示している。
増加するにつれtPA産生レベルも増加することを示し
た。これは雑種細胞／ミエローマ細胞系についての共増
幅が有効なことを示している。
この利用度は最良の例であるYO/pRSD3/2Dについて示
される。これは150nMメトトレキセート中での450U/ml t
PAの増殖で開始された。tPA産生レベルは５カ月後３μ
Ｍメトトレキセート中で5800U/mlに上昇した。
される。これは150nMメトトレキセート中での450U/ml t
PAの増殖で開始された。tPA産生レベルは５カ月後３μ
Ｍメトトレキセート中で5800U/mlに上昇した。
これらのトランスフエクトした細胞の大規模培養中で
の価値を実証するため、小さなエアリフトフアーメンタ
ー中での評価のため一種の細胞系を選択した。選択した
細胞系は静置培養pRI 1/10中で高レベルの産生を示した
クローンであるpPRIでトランスフエクトしたYB2/3.0Ag2
0であつた。
の価値を実証するため、小さなエアリフトフアーメンタ
ー中での評価のため一種の細胞系を選択した。選択した
細胞系は静置培養pRI 1/10中で高レベルの産生を示した
クローンであるpPRIでトランスフエクトしたYB2/3.0Ag2
0であつた。
エアリフトフアーメンター中での細胞系pPRI 1/10のフ
エツドバツチカルチユア（fed batch culture） この実験の目的は産生型細胞培養リアクターにおける
細胞系pPRI1/10による増殖とtPA合成を評価することで
ある。
エツドバツチカルチユア（fed batch culture） この実験の目的は産生型細胞培養リアクターにおける
細胞系pPRI1/10による増殖とtPA合成を評価することで
ある。
使用した細胞リアクターは溶解酸素テンシヨン（DO
T）、pHおよび温度を自動制御し作業容積５のエアリ
フトフアーメンター（ALF）であつた。DOTは窒素または
空気からなる散布したバラストガス中に空気または酸素
を調節しながら噴射することによつて制御された。pHは
このガス混合物中に二酸化炭素を調節しながら噴射する
か、培養にアルカリをポンプで供給することによつて制
御された。温度はリアクターのジヤケツトに温度調節し
た水を流すことによつて制御された。
T）、pHおよび温度を自動制御し作業容積５のエアリ
フトフアーメンター（ALF）であつた。DOTは窒素または
空気からなる散布したバラストガス中に空気または酸素
を調節しながら噴射することによつて制御された。pHは
このガス混合物中に二酸化炭素を調節しながら噴射する
か、培養にアルカリをポンプで供給することによつて制
御された。温度はリアクターのジヤケツトに温度調節し
た水を流すことによつて制御された。
細胞系pPRI1/10の細胞株をEagle培地のDulb−ecco修
正培地（DMEM）に熱不活性化子ウシ血清（FCS）を10％v
ol/vol補充してなる増殖培地中のローラーボトル培養で
常法により増殖させた。
正培地（DMEM）に熱不活性化子ウシ血清（FCS）を10％v
ol/vol補充してなる増殖培地中のローラーボトル培養で
常法により増殖させた。
ALF培養用培地はDMEMをベースとしてこれにアルブミ
ン、インシユリン、トランスフエリン、エタノールアミ
ン、コリン、ビタミン、微量の諸金属および切断保護ポ
リマーを補充した無血清処方であつた。
ン、インシユリン、トランスフエリン、エタノールアミ
ン、コリン、ビタミン、微量の諸金属および切断保護ポ
リマーを補充した無血清処方であつた。
ALF培養に対する細胞植込み物は血清を補充した培地
において増殖させた。細胞は遠心分離によつて沈降さ
せ、ALFに植える前に無血清増殖培地中で再懸濁させ
た。ALF培養中は補充栄養物を添加した。これらの栄養
物は次のものからなる。
において増殖させた。細胞は遠心分離によつて沈降さ
せ、ALFに植える前に無血清増殖培地中で再懸濁させ
た。ALF培養中は補充栄養物を添加した。これらの栄養
物は次のものからなる。
（ａ） 培養の最終濃度を2mM増加するためグルタミン
を一回噴射添加する。
を一回噴射添加する。
（ｂ） 「不溶性」アミノ酸であるトリプトフアン、チ
ロシンおよびシステインを一回噴射添加する。
ロシンおよびシステインを一回噴射添加する。
（ｃ） グルコースコリンおよび「可溶性」アミノ酸の
ポンプによる供給。
ポンプによる供給。
毎日の合間に培養から試料を取つた。修正Fuchs Rose
nthal計数チヤンバーを使つて細胞の計数を行い、細胞
の生存率をトリパンブルー染色による排除去によつて評
価した。培養上澄みのアリコツトを液体窒素で瞬時凍結
させ、次いでその後のtPA ELISAおよびフイブリン寒天
プレート検定によるtPAの定量のために−70℃で貯蔵し
た。
nthal計数チヤンバーを使つて細胞の計数を行い、細胞
の生存率をトリパンブルー染色による排除去によつて評
価した。培養上澄みのアリコツトを液体窒素で瞬時凍結
させ、次いでその後のtPA ELISAおよびフイブリン寒天
プレート検定によるtPAの定量のために−70℃で貯蔵し
た。
第３図はエアリフト培養におけるpPRI1/10細胞の増殖
と該細胞によるtPA合成の各曲線を示す。細胞は最大生
存数密度2.2×106/mlおよび最大全細胞数密度４×106/m
lに達した。tPAは培養の全期間を通じて合成され、最高
濃度はフイブリン寒天プレート検定によれば42μg/ml、
tPA ELISAによれば38μg/mlに達した。ELISA（活性tPA
および不活性tPAの双方を検出する）とフイブリン寒天
プレート検定の測定結果の近似は合成されたtPAは充分
な活性を有していたことを示すものである。
と該細胞によるtPA合成の各曲線を示す。細胞は最大生
存数密度2.2×106/mlおよび最大全細胞数密度４×106/m
lに達した。tPAは培養の全期間を通じて合成され、最高
濃度はフイブリン寒天プレート検定によれば42μg/ml、
tPA ELISAによれば38μg/mlに達した。ELISA（活性tPA
および不活性tPAの双方を検出する）とフイブリン寒天
プレート検定の測定結果の近似は合成されたtPAは充分
な活性を有していたことを示すものである。
上記は本発明の１例として記載されたものであり、本
発明の範囲内で細部の変更は可能である。
発明の範囲内で細部の変更は可能である。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．33，Ｎｏ．２ （1985．２）Ｐ．181−189
Claims (12)
- 【請求項１】真核細胞ポリペプチドをコードする遺伝子
がウイルスプロモーターまたはマウスメタロチオネイン
プロモーターの指示により発現するように、該真核細胞
ポリペプチドをコードする遺伝子および該ウイルスプロ
モーターまたは該マウスメタロチオネインプロモーター
を含むベクターで形質転換されたミエローマ細胞系。 - 【請求項２】該プロモーターはSV40プロモーターである
請求の範囲第１項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項３】該プロモーターはSV40後期プロモーターで
ある請求の範囲第２項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項４】該プロモーターはレトロウイルス由来ロン
グターミナルリピートである請求の範囲第１項によるミ
エローマ細胞系。 - 【請求項５】該プロモーターはRous sarcomaウイルスの
ロングターミナルリピートである請求の範囲第４項によ
るミエローマ細胞系。 - 【請求項６】該プロモーターはMoloneyマウスまたはラ
ット白血病ウイルスのロングターミナルリピートである
請求の範囲第４項によりミエローマ細胞系。 - 【請求項７】該ミエローマ細胞系はラット細胞系である
請求の範囲第１項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項８】該ミエローマ細胞系はラットYB2/3.0Ag 20
雑種細胞系である請求の範囲第７項によるミエローマ細
胞系。 - 【請求項９】該プロモーターはRous sarcomaウイルスの
ロングターミナルリピートである請求の範囲第７項また
は第８項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項１０】該ミエローマ細胞系はマウス細胞系であ
る請求の範囲第１項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項１１】該ミエローマ細胞系はマウスSP2−0Ag雑
種細胞系、マウスNOS雑種細胞系またはNSO由来雑種細胞
系である請求の範囲第10項によるミエローマ細胞系。 - 【請求項１２】該プロモーターはSV40後期プロモーター
である請求の範囲第10項または第11項によるミエローマ
細胞系。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8508442 | 1985-04-01 | ||
| GB858508442A GB8508442D0 (en) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | Expression vector |
| GB858521815A GB8521815D0 (en) | 1985-09-03 | 1985-09-03 | Expression process |
| GB8521815 | 1985-09-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62502377A JPS62502377A (ja) | 1987-09-17 |
| JP2532858B2 true JP2532858B2 (ja) | 1996-09-11 |
Family
ID=26289072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501959A Expired - Lifetime JP2532858B2 (ja) | 1985-04-01 | 1986-04-01 | 形質転換したミエロ―マ細胞系 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0216846B2 (ja) |
| JP (1) | JP2532858B2 (ja) |
| AU (1) | AU584417B2 (ja) |
| BG (1) | BG60107A3 (ja) |
| CA (1) | CA1319120C (ja) |
| DE (1) | DE3668186D1 (ja) |
| GB (1) | GB2183662B (ja) |
| WO (1) | WO1986005807A1 (ja) |
Families Citing this family (379)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| CA1297434C (en) * | 1986-04-14 | 1992-03-17 | Kenji Murakami | Method of producing peptides, recombinant plasmid for use in the same and animal cells transformed with the same |
| JP2585532B2 (ja) * | 1986-05-10 | 1997-02-26 | 三井東圧化学株式会社 | 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法 |
| AU7696087A (en) * | 1986-06-26 | 1988-01-29 | Damon Biotech Inc. | Recombinant human tissue plasminogen activator composition |
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| US6140111A (en) * | 1987-12-11 | 2000-10-31 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Retroviral gene therapy vectors and therapeutic methods based thereon |
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