CN103906535B - 与葡萄球菌蛋白a的抗体相关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

实施方案涉及用于处理或预防细菌感染、特别是由葡萄球菌细菌感染引起的感染的方法和组合物。方面包括用于提供对细菌的被动免疫应答的方法和组合物。在一些实施方案中，方法和组合物涉及结合葡萄球菌蛋白A(SpA)的抗体。

Description

与葡萄球菌蛋白A的抗体相关的组合物和方法
本发明是在国家变态反应和传染病研究院(NIAID)的AI52747和AI92711和由国家卫生研究院资助的1-U54-AI-057153的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定权利。
本申请要求2011年8月15日提交的美国临时专利申请61/523,751号、2012年3月23日提交的61/615,083号、2012年3月30日提交的61/618,417号和2012年7月20日提交的61/674,135号的优先权，其均通过引用完整地并入本文中。
I.技术领域
本发明一般性地涉及免疫学、微生物学和病理学的领域。更具体地，其涉及与细菌蛋白的抗体和用于引发这类抗体的细菌肽有关的方法和组合物。蛋白质包括葡萄球菌蛋白A(SpA)。
II.背景技术
社区获得性感染和医院获得性感染两者的数量在最近几年随着血管内器械增多的使用都在增加。医院获得性(医院内)感染是发病和死亡的主要原因，更具体地，在美国每年感染超过两百万患者。最频繁的医院内感染是尿路感染(33%的感染)，其次是肺炎(15.5%)、手术部位感染(14.8%)和原发性血流感染(13%)(Emorl和Gaynes，1993)。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、凝固酶阴性葡萄球菌(主要是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、肠球菌种(enterococcus spp)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是主要的医院病原体。尽管这些病原体几乎导致相同数量的感染，但是它们可以产生的疾病的严重性结合耐抗生素隔离群的频率使该排名朝着金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)作为最重要的医院内病原体的方向平衡。
葡萄球菌可以通过毒素生成或入侵导致人类和其他动物的各种各样的疾病。葡萄球菌毒素是食物中毒的常见原因，这是因为细菌可以在不当储存的食物中生长。
表皮葡萄球菌是普通的皮肤共生体，其还是引起受损的医疗器械的感染和手术部位的感染的重要的机会性病原体。由表皮葡萄球菌感染的医疗器械包括心脏起搏器、脑脊髓液分流器、持续性非卧床腹膜透析导管、整形外科器械和人工心瓣。
金黄色葡萄球菌是具有明显的发病率和死亡率的医院内感染的最常见的原因。其是以下一些病症的原因：骨髓炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、脓肿和中毒性休克综合征。
金黄色葡萄球菌可以存活在干燥的表面上，增加传播的机会。任何金黄色葡萄球菌感染都可以导致葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征，一种对吸收到血流中的外毒素的皮肤反应。金黄色葡萄球菌还可以导致会威胁生命的被称为脓血症的一种败血症。耐甲氧西林(Methicillin)的金黄色葡萄球菌(MRSA)已经成为医院获得性感染的主要原因。
金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染一般用抗生素来处理，其中盘尼西林(penicillin)为选择的药物，而万古霉素(vancomycin)用于耐甲氧西林的隔离群。对抗生素表现出广谱抗性的葡萄球菌菌株的百分比正在增加，对有效的抗菌疗法构成威胁。另外，耐万古霉素的金黄色葡萄球菌菌株最近的出现已经引起以下恐慌：对其没有有效疗法可以使用的MRSA菌株正开始出现和蔓延。
在葡萄球菌感染的处理中抗生素的可替代的方法一直是在被动免疫疗法中使用抗体来对抗葡萄球菌抗原。该被动免疫疗法的实例涉及多克隆抗血清的施用(WO00/15238、WO00/12132)以及利用脂磷壁酸的单克隆抗体的处理(WO98/57994)。
将金黄色葡萄球菌或其产生的外蛋白作为目标的第一代疫苗已经取得有限的成功(Lee，1996)，但是仍然需要开发用于处理葡萄球菌感染的另外的治疗组合物。
发明内容
金黄色葡萄球菌在美国是菌血症和医院获得性感染的最常见的原因。预防由葡萄球菌引起的疾病的经FDA认证的疫苗目前难以获得。
在一些实施方案中，有抑制、减轻和/或预防葡萄球菌感染的抗体组合物。在具体的实施方案中，有能够结合葡萄球菌SpA蛋白的多肽。术语多肽应理解为表示一个或更多个氨基酸或多肽链。例如，术语多肽可以指包含重链或轻链或相连的重链和轻链的单个多肽链。术语多肽也可以指免疫球蛋白(Ig)单体，其包含四个多肽链：两个重链和两个轻链。术语多肽也可以指二聚、三聚、四聚或五聚的Ig分子。
此外，在一些实施方案中，该SpA结合多肽不同于其他SpA抗体，这是因为其具有基于作为使用SpA变异体而不是SpA野生型蛋白作为抗原产生的抗体或来源于使用SpA变异体而不是SpA野生型蛋白作为抗原产生的抗体的性能。SpA突变体具有在A、B、C、D和/或E域中的1、2、3、4和/或5个中的1、2、3、4、5或更多个变化。此外，如本文中所讨论的，这些SpA结合多肽能够特异性结合这类SpA变异体，包括但不限于如以下所讨论的在所有五个域中的KKAA域变异。
一些实施方案针对重组的肽，所述肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸节段，所述氨基酸节段在长度上包含大约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25到25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸，包括所有值和其间的范围，且所述氨基酸节段至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与葡萄球菌SpA的氨基酸节段(SEQ ID NO:1)相同。例如，来自葡萄球菌SpA的氨基酸节段可以来自不产生毒性的SpA突变体多肽(例如SpAKKAA)。各自通过引用并入本文中的PCT公开WO2011/005341号和PCT申请PCT/US11/42845号提供大量的不产生毒性的SpA突变体多肽及其使用方法。在另外的方面，有特异性结合一个或更多个这些特定氨基酸节段的抗体。
实施方案还提供SpA抗体在用于处理细菌和/或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。在一些实施方案中，组合物在用于治疗性和/或预防性处理细菌感染、尤其是葡萄球菌感染的药物的制造中使用。此外，在一些实施方案中，有可以用于处理(例如限制受试者中的葡萄球菌脓肿形成和/或持续)或预防细菌感染的方法和组合物。
一些方面涉及降低葡萄球菌感染或脓肿形成的方法，包括对具有或疑似具有葡萄球菌感染的患者施用有效量的一种或更多种经纯化的特异性结合葡萄球菌SpA多肽的多肽或蛋白质。预期该多肽(或蛋白质)由于其为具有抗体的一个或更多个CDR区域的氨基酸序列或来源于抗体的一个或更多个CDR区域的氨基酸序列的多肽或蛋白质而可以被称为抗体。在抗体的情况下本文中所讨论的任何实施方案可以关于多肽或蛋白质实施，只要多肽和蛋白质具有一个或更多个在来自能够特异性结合缺乏特异Ig结合活性的SpA变异体的抗体的CDR的整个区域上具有至少60%同一性或同源性的氨基酸区域。SpA结合多肽可以是经纯化的多克隆抗体、经纯化的单克隆抗体、重组的多肽或其片段。在一些方面，多肽是人源化的抗体，其表示抗体的未变异部分已经改变以模拟人类抗体中所发现的恒定区。因此，预期人源化的抗体是具有非人类抗体的CDR序列(或至少来源于这类序列，即至少80%相同的氨基酸序列)的抗体。
在一些其他实施方案中，抗体是人类抗体。在仍另外的方面，抗体是重组的抗体节段。在一些方面，单克隆抗体包括在以下表1到2中和在表5中所述的5A10、8E2、3A6、7E2、3F6、1F10、6D11、3D11、5A11、1B10、4C1、2F2、8D4、7D11、2C3、4C5、6B2、4D5、2B8或1H7中的一种或更多种，通过引用并入此处。抗体或多肽可以以0.1、0.5、1、5、10、50、100mg或μg/kg到5、10、50、100、500mg或μg/kg的剂量来施用。重组的抗体节段可以有效地连接到第二重组抗体节段。在一些方面，第二重组抗体节段结合第二葡萄球菌蛋白。方法还可以包括施用结合第二葡萄球菌蛋白的第二抗体。在一些方面，方法还包括施用抗生素。
实施方案涉及单克隆抗体多肽，具有其一个或更多个节段的多肽和对其编码的多核苷酸。在一些方面，多肽可以包含SpA特异抗体的重链可变区和/或轻链可变区的全部或部分。在一个另外的方面，多肽可以包含对应于来自抗体、例如SpA特异抗体的轻可变链和/或重可变链的第一互补决定区(CDR)、第二互补决定区和/或第三互补决定区的氨基酸序列。另外，抗体或结合多肽可以具有结合区域，其包含与1、2、3、4、5或6个本文中所讨论的CDR序列具有、具有至少或具有至多70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性或同源性(用保守的氨基酸替换)(或其中可推出的任意范围)的氨基酸序列，所述CDR序列包括任意的SEQ ID NO:11-13、21-23、31-33、41-43、51-53、61-63、71-73、81-83、91-93、96-98、111-113、116-118、126-128、131-133、16-18、26-28、36-38、46-48、56-58、66-68、76-78、86-88、101-103、106-108、121-123、136-138、141-143。在具体的实施方案中，具有本文中所公开的一个或更多个CDR的全部或部分的抗体已经在非CDR区域人源化。在另外的实施方案中，本文中所公开的CDR区域可以每CDR改变1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，这可以取代人源化或在人源化以外进行。在一些实施方案中，改变可以是删除或添加1、2或3个氨基酸，或者其可以是任意氨基酸的替换，这可以用或可以不用为保守氨基酸的氨基酸。
在一些实施方案中，SpA结合多肽或抗体具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个与对CDR所确定的共有序列具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的CDR，例如表7到17中所示的。预期在一些实施方案中，SpA结合多肽或抗体具有对应于轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。如本文中所讨论的，对应于CDR的氨基酸序列可以具有与本文中所讨论的CDR一定百分比的同一性或同源性。在一些实施方案中，共有序列为SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:159。在具体的实施方案中，SpA结合多肽或抗体具有来自轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的单克隆抗体的共有序列。可替代地或另外地，SpA结合多肽或抗体具有来自重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的单克隆抗体的共有序列。还预期SpA结合多肽或抗体可以具有基于共有序列和/或与特定CDR有同一性或同源性的序列的CDR的混合。
在一些实施方案中，SpA结合多肽或抗体具有一个或更多个关于3F6的共有序列。在具体的实施方案中，SpA结合多肽或抗体具有来自轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的3F6的共有序列。可替代地或另外地，SpA结合多肽或抗体具有来自重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的3F6的共有序列。
在一些实施方案中，SpA抗体或结合多肽包含至少40%与一个或更多个来自SpA结合抗体的抗体CDR域相同的氨基酸序列，其中该多肽特异性结合缺乏非特异性Ig结合活性的葡萄球菌蛋白A的至少两个SpA Ig结合域A、B、C、D和E。以下预期该方面的另外的实施方案。
在另外的实施方案中，预期了经纯化的特异性结合缺乏特异Ig结合活性的SpA变异体多肽的多肽，其中所述多肽对至少两个且最多五个SpA IgG结合域AKKAA、BKKAA、CKKAA、DKKAA和EKKAA具有0.5×109M-1或更大的缔合常数。以下预期该实施方案的另外的实施方案。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3D11可变(VDJ)重链氨基酸序列QSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTSYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARYGYDGTFYAMDYWGQGTSVTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。CDR是抗体内抗体与抗原的形状互补的区域。因此，CDR决定蛋白质对特定抗原的亲和性和特异性。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3D11的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和/或SEQID NO:83。在另外的实施方案中，抗体可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3D11可变(VJ)轻链氨基酸序列RIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKPWIYEISKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQQWSYPFTFGSGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3D11的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87和/或SEQ ID NO:88。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb3D11的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb3D11的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3F6可变(VDJ)重链氨基酸序列EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFSISRDDSQNMLSLQMNNLKTEDTAIYYCVTEHYDYDYYVMDYWGQGTSVXSPQ的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3F6的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和/或SEQID NO:53。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，另外地或可替代地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3F6可变(VJ)轻链氨基酸序列IVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYSGASLMQWYQHKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3F6的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和/或SEQ ID NO:58。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb3F6的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb3F6的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb5A10可变(VDJ)重链氨基酸序列EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSNYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYPYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARGGFLITTRDYYAMDYWGQGTSVTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb5A10的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和/或SEQID NO:13。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb5A10可变(VJ)轻链氨基酸序列TIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb5A10的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb5A10的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb5A10的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb2F2可变(VDJ)重链氨基酸序列VKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASRFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVASIGSGGTTYYPDTVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSDDTAMYYCTRGRGYGFAWYFDVWGAGTTVTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb2F2的可变重链的CDR，例如SEQID NO:96、SEQ ID NO:97和/或SEQ ID NO:98。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb2F2可变(VJ)轻链氨基酸序列TIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb2F2的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102和/或SEQ ID NO:103。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb2F2的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb2F2的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb4C5可变(VJ)轻链氨基酸序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGASLMQWYQQKSGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPNTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb4C5的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137和/或SEQ ID NO:138。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb4C5的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb4C5的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb4D5可变(VJ)轻链氨基酸序列EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVSYMHWYHQKSGTSPKPWIYETSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQQWSYPFTFGSGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb4D8的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142和/或SEQ ID NO:143。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb5A11可变(VDJ)重链氨基酸序列EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDRDDYDEGPYFDYWGQGTTLTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb5A11的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92和/或SEQID NO:93。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb6B2可变(VJ)轻链氨基酸序列DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYSGASLMQWYQHKPGQPPRLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb6B2的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122和/或SEQ ID NO:123。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb8E2可变(VDJ)重链氨基酸序列KVQLQQSGAGLVKPGASVKLSCKASGYTFTEYSIHWVKQSSGQGLEWIGWFYPGSGYIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMEFSRLTSEDSAVYFCARHGYGNYVGYAMDYWGQGTSVTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb8E2的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和/或SEQ IDNO:23。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb8E2可变(VJ)轻链氨基酸序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASEIIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYFAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGIYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb8E2的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和/或SEQ ID NO:28。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb8E2的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb8E2的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3A6可变(VDJ)重链氨基酸序列QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYNFTDYSMHWVKQAPGKGLKWVGWINTETAESTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKDEDTATFFCAHFDCWGQGTTLTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3A6的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和/或SEQ ID NO:33。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb3A6可变(VJ)轻链氨基酸序列DVVMTQISLSLPVTLGDQASISCRASQSLVHSNGNTYLNWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQITYVPWTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb3A6的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:38。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb3A6的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb3A6的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb6D11可变(VDJ)重链氨基酸序列QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGNAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGITNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLSSDDSAVYFCSGSANWFAYWGQGTLVTVSA的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb6D11的可变重链的CDR，例如SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72和/或SEQ ID NO:73。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb6D11可变(VJ)轻链氨基酸序列HCAHPSPASLAVSLGQRASISCRASESVEYSGASLMQWYQHKPGQPPKLLIYAASNVESGVPVRFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb6D11的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和/或SEQ ID NO:78。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb6D11的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb6D11的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb8D4可变(VDJ)重链氨基酸序列QVQLQQSGAELVRPGASVKISCKAFGSTFTNHHINWVKQRPGQGLDWIGYLNPYNDYTNYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYLELSSLTSEDSAVYYCATITFDSQXQ的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb8D4的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和/或SEQ ID NO:113。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb1F10可变(VDJ)重链氨基酸序列KELISSKSEEEKWPGTSVKVSCKASGNAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVINPGSGITNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLSSDDSAVYFCSGSANWFAYWGQGTLVTVSA的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb1F10的可变重链的CDR，例如SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:63。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb1F10可变(VJ)轻链氨基酸序列的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明CSPSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYSGASLMQWYQHKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb1F10的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:66、SEQID NO:67和/或SEQ ID NO:68。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb1F10的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb1F10的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在一些方面，多肽包含对应于MAb4C1可变(VJ)轻链氨基酸序列的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明VLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYSGASLMQWYQHKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb4C1的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:106、SEQID NO:107和/或SEQ ID NO:108。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb2B8可变(VJ)轻链氨基酸序列FFGVSLGQRASISCRASESVEYSGASLIQWYQHKPGQPPKLLIYAASNVESGVPVRFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPSTFGGGTKLEIK的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb2B8的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127和/或SEQ ID NO:128。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb2C3可变(VDJ)重链氨基酸序列EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYPYYPDSVKGRFTISRDNAENTLYLQLSSLRSEDTALYYCARGGFLITTRDYYAMDYWGQGTSVTVSS的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb2C3的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和/或SEQ ID NO:133。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb7E2可变(VDJ)重链氨基酸序列QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSVHWVKQAPGKGLKWMAWINTATGEPTFADDFKGRFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDTATYFCAPQLTGPFAYWGHGTLVTVSA的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。CDR是抗体内抗体与抗原的形状互补的区域。因此，CDR决定蛋白质对特定抗原的亲和性和特异性。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb7E2的可变重链的CDR，例如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和/或SEQID NO:43。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在一些方面，多肽包含对应于MAb7E2可变(VJ)轻链氨基酸序列DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLTDGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQAGDFGSYYCQHSWSIPYTFGGGTRLQIRR的氨基酸序列的全部或部分。CDR以黑体加下划线指明。从氨基到羧基末端，CDR为CDR1、CDR2和CDR3。在一些方面，多肽可以包含1、2和/或3个来自MAb7E2的可变轻链的CDR，例如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和/或SEQ ID NO:48。在另外的实施方案中，多肽可以具有相对于这些1、2或3个CDR有1、2和/或3个氨基酸改变的CDR(添加1或2个氨基酸、删除1或2个氨基酸或替换)。在另外的实施方案中，可替代地或另外地，抗体可以在CDR和/或可变区外部的区域中人源化。在一些方面，可替代地或另外地，多肽包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与非CDR序列的可变区、即可变区框架的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。
在其他实施方案中，多肽或蛋白质包含1、2、3、4、5或6个来自mAb7E2的轻可变区和重可变区中之一或两者的CDR，且1、2、3、4、5或6个CDR相对于这些CDR可以具有1、2和/或3个氨基酸改变。在一些实施方案中，可变区外部的抗体序列的全部或部分已经人源化。蛋白质可以包含一个或更多个多肽。在一些方面，蛋白质可以含有一个或两个与重链多肽相似的多肽和/或1或2个与轻链多肽相似的多肽。在另外的实施方案中，多肽可以是单链抗体或本文中所讨论的其他抗体，只要其与mAb7E2的1、2、3、4、5或6个CDR具有至少70%的序列同一性或同源性。
在仍另外的方面，实施方案的多肽包含本文中所公开的任何氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸节段。例如，多肽可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸节段，其在长度上包含大约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25到25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个氨基酸，包括所有值和其间的范围，且所述氨基酸节段至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%与本文中所公开的任意的氨基酸序列相同。在一些方面，氨基节段选自如表5中所提供的SpA结合抗体的氨基酸序列中之一。
在仍另外的方面，实施方案的多肽包含本文中所公开的任何氨基酸序列的氨基酸节段，其中所述节段在本文中所提供的任何序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25到25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200位氨基酸处开始，并在相同的所提供序列中的的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25到25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200位氨基酸处结束。在一些方面，氨基节段或其部分选自如表5中所提供的SpA结合抗体的氨基酸序列中之一。
在仍另外的方面，实施方案的多肽包含至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与(如表5中所提供的)SpA结合抗体的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR域相同的氨基酸节段。例如，多肽可以包含1、2或3个至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与如表5中所提供的SpA结合抗体的CDR1、2和/或3相同的氨基酸节段。
在另外的方面，实施方案的核酸分子包含本文中所公开的任何核酸序列中的一个或更多个核酸节段。例如，核酸分子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸节段，其在长度上包含大约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25到25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或更多个核酸，包括所有值和其间的范围，且所述核酸节段至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与本文中所公开的任意的核酸序列相同。在一些方面，核酸节段选自对如表5中所提供的SpA结合抗体的部分编码的核酸序列中之一。
在仍另外的方面，实施方案的核酸分子包含至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与对如表5中所提供的SpA结合抗体的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR域编码的序列相同的核酸节段。例如，核酸分子可以包含1、2或3个至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与对如表5中所提供的SpA结合抗体的CDR1、2和/或3编码的序列相同的核酸节段。
在仍另外的方面，一些实施方案提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，杂交瘤细胞系是产生5A10、8E2、3A6、7E2、3F6、1F10、6D11、3D11、5A11、1B10、4C1、2F2、8D4、7D11、2C3、4C5、6B2、4D5、2B8或1H7单克隆抗体的系，其中的一种或更多种可以沉积。在另一方面，1、2和/或3个来自MAb的轻链可变区和/或重链可变区的CDR可以包含在人源化的抗体或其变异体中。在其他实施方案中，预期其中结合多肽能够结合至少两种不同抗原的双特异性抗体。
一些方面涉及处理具有或疑似具有葡萄球菌感染的受试者的方法，包括对具有或疑似具有葡萄球菌感染的患者施用有效量的经纯化的特异性结合葡萄球菌蛋白A的抗体或结合多肽。
在另一方面，方法涉及处理处于葡萄球菌感染风险中的受试者的方法，包括在被葡萄球菌感染之前对处于葡萄球菌感染风险中的患者施用有效量的结合葡萄球菌蛋白A多肽的抗体或结合多肽。
预期在这些实施方案中使用的抗体或结合多肽包括能够降低细菌负荷、增加存活、减少细菌脓肿、给予保护性免疫、减少抗生素使用天数、降低脓毒症或败血症的风险、降低休克的风险或提供一些其他保护效果的那些。
某些实施方案针对抗体或结合多肽组合物，其包含分离的和/或重组的特异性结合如上所述的肽节段的抗体或多肽。在一些方面，抗体或多肽具有其中、其中至少或其中至多80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其中可推出的任何范围)与本文中所提供的任何单克隆抗体的全部或部分相同的序列。在仍另外的方面，分离的和/或重组的抗体或多肽具有、具有至少或具有至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个来自本文中所提供的任意序列或这些序列的组合的连续氨基酸。
在另外的实施方案中，有包含本文中所讨论的一种或更多种多肽或抗体或抗体片段的药物组合物。这种组合物可以含有或不含有额外的活性成分。
在一些实施方案中，有基本上由包含一种或更多种本文中所讨论的抗体片段的多肽组成的药物组合物。预期组合物可以含有非活性成分。
一些方面涉及核酸分子，其对特异性结合SpA或不产生毒性的SpA变异体的抗体的重链可变区和/或轻链可变区编码。
其他方面涉及药物组合物，其包含有效抗菌量的特异性结合上述肽的抗体和药物可接受的载体。
术语“提供”根据其普通含义使用以表示“供给或供应以便使用”。在一些实施方案中，蛋白质直接通过施用包含本文中所述的抗体或其片段的组合物来提供。
受试者一般会具有(例如诊断为具有持续性葡萄球菌感染)、会疑似具有葡萄球菌感染，或处于患上葡萄球菌感染的风险中。组合物包含有效量的SpA结合多肽以达到预期目的-葡萄球菌感染的处理或防护。术语“结合多肽”是指与目标分子特异性结合的多肽，例如抗体与抗原的结合。结合多肽可以但是不必来源于免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段。更具体地，有效量表示提供对感染的抵抗、减轻或缓解必需的活性成分的量。在更具体的方面，有效量预防、缓和或减轻疾病或感染的症状，或者延长被处理的受试者的存活。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其根据本文所提供的详细公开。对于本文中所述方法中使用的任何制剂，有效的量或剂量可以首先由体外试验、细胞培养试验和/或动物模型试验来估计。例如，剂量可以以动物模型来配制以获得期望的反应。这种信息可以用于更准确地确定对人类有用的剂量。
组合物可以包含结合SpA的抗体或细胞。抗体可以是抗体片段、人源化的抗体、单克隆抗体、单链抗体等。在一些方面，通过提供导致产生在受试者中结合SpA的抗体的SpA肽或抗原或表位来引发SpA抗体。SpA抗体一般配制到药物可接受的组合物中。SpA抗体组合物还可以包含更多葡萄球菌抗原或其致免疫的片段的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种抗体。葡萄球菌抗原包括但不限于Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、SdrC、SdrD、SdrE、ClfA、ClfB、Coa、Hla(例如H35突变体)、IsdC、SasF、vWbp、SpA及其变异体(参见2009年4月3日提交的美国临时申请61/166,432号；2009年4月20日提交的61/170,779；和2009年10月6日提交的61/103,196；其每一个都通过引用完整地并入本文中)、52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO01/60852)、Aaa(GenBank CAC80837)、Aap(GenBank登录号AJ249487)、Ant(GenBank登录号NP_372518)、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、血纤蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性的ABC转运体、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运体、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活化蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和Ni ABC转运体、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白(参见PCT公开WO2007/113222、WO2007/113223、WO2006/032472、WO2006/032475、WO2006/032500，其每一个都通过引用完整地并入本文中)。葡萄球菌抗原或致免疫的片段或节段可以与SpA抗体同时施用。葡萄球菌抗原或致免疫的片段以及SpA抗体可以在相同或不同的组合物中并且同时或不同时地施用。
SpA抗体组合物还可以包含更多葡萄球菌抗原或其致免疫的片段的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种抗体、抗体片段或抗体亚片段。这类抗体、抗体片段或亚片段所针对的葡萄球菌抗原包括但不限于Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、SdrC、SdrD、SdrE、ClfA、ClfB、Coa、Hla(例如H35突变体)、IsdC、SasF、vWbp、SpA及其变异体(参见2009年4月3日提交的美国临时申请61/166,432号；2009年4月20日提交的61/170,779；和2009年10月6日提交的61/103,196；其每一个都通过引用完整地并入本文中)、52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO01/60852)、Aaa(GenBank CAC80837)、Aap(GenBank登录号AJ249487)、Ant(GenBank登录号NP_372518)、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、血纤蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性的ABC转运体、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运体、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活化蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和Ni ABC转运体、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白(参见PCT公开WO2007/113222、WO2007/113223、WO2006/032472、WO2006/032475、WO2006/032500，其每一个都通过引用完整地并入本文中)。其他葡萄球菌抗原或其致免疫的片段的抗体、抗体片段或抗体亚片段可以与SpA抗体同时施用。其他葡萄球菌抗原或其致免疫的片段的抗体、抗体片段或抗体亚片段可以在相同或不同的组合物中并且同时或不同时地施用到SpA抗体。
如本文中所使用的，术语“调节”包含词语“抑制”的意思。活性的“调节”是活性的降低。如本文中所使用的，术语“调节剂”是指影响葡萄球菌细菌的功能的化合物，包括蛋白质、核酸、基因、或生物体等的增强、抑制、向下调整或阻抑。
实施方案包括含有或不含有细菌的组合物。组合物可以包含或可以不包含毒性减弱的或有活力的或完整的葡萄球菌细菌。在一些方面，组合物包含非葡萄球菌细菌或不含有葡萄球菌细菌的细菌。在一些方面，细菌组合物包含分离的或重组表达的SpA抗体或对其编码的核酸。在仍另外的方面，SpA抗体多聚化，例如二聚、三聚、四聚等。
在一些方面，肽或抗原或表位可以呈现为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个肽节段或肽模拟物的多聚体。
术语“分离的”可以指基本没有其起源的细胞材料、细菌材料、病毒材料或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或者化学前驱体或其他化学品(当化学合成时)的核酸或多肽。此外，分离的化合物是指可以以分离的化合物施用到受试者的化合物；换句话说，当化合物粘附到柱上或嵌入在琼脂糖凝胶中时，其不可以简单地被认为是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是非天然地以片段形式出现的和/或一般未处于功能状态的核酸或蛋白片段。
组合物，例如抗体、肽、抗原或免疫原可以共价或非共价地缀合或连接到其他部分，例如佐剂、蛋白质、肽、载体、荧光部分或标记物。术语“缀合”或“免疫缀合”广泛地用于限定一个部分与另一试剂的有效缔合，并不打算仅指任何类型的有效缔合，并且不特别地限于化学“缀合”。特别地预期了重组的融合蛋白。
术语“SpA抗体”是指结合来自葡萄球菌细菌的SpA蛋白的多肽。
在另外的方面，组合物可以施用给受试者超过一次，并可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多次。组合物的施用包括但不限于经口的、肠胃外的、皮下的和静脉内的施用，或其各种组合，包括吸入或抽吸。
组合物一般对人类受试者施用，但是预期对能够提供对抗葡萄球菌细菌的治疗益处的其他动物的施用，特别是牛、马、山羊、绵羊和其他家畜，即哺乳类动物。在另外的方面，葡萄球菌细菌是金黄色葡萄球菌。在仍另外的方面，方法和组合物可以用于预防、减轻、减少或处理组织或腺体的感染，例如乳腺感染、特别是乳腺炎和其他感染。其他方法包括但不限于预防地降低未显示感染迹象的受试者中的细菌负荷，特别是那些疑似目标细菌定殖到的受试者或者处于目标细菌定殖风险的受试者，例如在住院、治疗和/或康复期间处于或会处于感染风险或者易于或会易于受感染的患者。
仍另外的实施方案包括用于为受试者提供对抗葡萄球菌细菌的保护性或治疗性组合物的方法，包括对受试者施用有效量的包括(i)SpA抗体；或(ii)对其编码的核酸分子的组合物；或(iii)施用具有本文中所述的细菌蛋白的任何组合或排列的SpA抗体。
实施例部分的实施方案应理解为适用于本发明的所有方面的实施方案，包括组合物和方法。
术语“或”在权利要求中的使用用于表示“和/或”，除非明确地说明是仅指替代性的，或替代是相互排斥的，尽管公开支持仅指替代和“和/或”的定义。还预期使用术语“或”所列出的任何事物也可以特别地排除在外
在本申请全文，术语“约”用于表明数值包括确定数值使用的装置或方法的误差的标准差。
根据长期存在的专利法，当在权利要求书或说明书中和词语与“包括”一起使用时如果没有数量词限定则表示一个或更多个，除非明确地说明。
如本说明书和权利要求书所用，单词“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。
本发明的其他目的、特征和优点通过下面的详细描述会变得显而易见。
然而，应该理解详细的说明和具体的实施例尽管表明本发明的具体实施方案，但是仅通过举例说明给出，这是因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改通过该详细说明对本领域技术人员会变得明显。
附图说明
更具体的描述和以上简要概括的本发明的某些实施方案在附图中进行说明，使得其中本发明的上述特征、优点和目的以及其他会变得清楚并可以详细地理解。这些附图形成说明书的一部分。然而应注意，附图说明本发明的一些实施方案，并因此不被认为是限定其范围。
图1：SpAKKAA-特异的单克隆抗体(mAb)保护小鼠免受MRSA感染。通过利用同型对照(IgG2a)或20mg·kg-1的SpAKKAA-mAb(3F6)的腹腔内注射使动物群组(n=10)免疫。在免疫后24小时，用5×106CFU的金黄色葡萄球菌MW2来攻击动物。(A)在攻击后15天，使动物安乐死以计算肾脏中葡萄球菌负荷的数目。(B)分析受感染15天小鼠的血清样品中葡萄球菌抗原基质(ClfA，聚集因子A；ClfB，聚集因子B；FnBPA，纤连蛋白结合蛋白A；FnBPB，纤连蛋白结合蛋白B；IsdA，铁表面决定子A；IsdB，铁表面决定子B；SdrD，丝氨酸-天冬氨酸重复蛋白D；SpAKKAA，不产生毒性的葡萄球菌蛋白A；Coa，凝固酶；EsxA，Ess[ESAT-6(早期分泌抗原目标6kDa)]分泌系统]细胞外基质A；EsxB，Ess[ESAT-6(早期分泌抗原目标6kDa)]分泌系统]细胞外基质B；Hla，α-溶血素；LukD，杀白细胞素D；vWbp，von Willebrand结合蛋白)的抗体。数值代表来自经mAb3F6处理的动物的样品相对于同型对照动物血清样品的增加倍数(对于IgG2a来说n=7，对于3F6来说n=8)。数据是平均值，误差条代表±SEM。A-B中的结果代表两次独立的分析。
图2：蛋白A特异的单克隆抗体的亲和力。单克隆抗体利用渐增浓度(0-4M)的硫氰酸铵来培养以扰乱(A)IgG1同型单克隆抗体、(B)IgG2a同型单克隆抗体和(C)IgG2b同型单克隆抗体中的抗原-抗体特异相互作用。数据是平均值，误差条代表±SEM。A-C中的结果代表三次独立的分析。
图3：SpAKKAA-特异的mAb结合野生型蛋白A。(A)检查固定化的野生型蛋白A(SpA)与同型对照抗体(IgG1、IgG2a或IgG2b)或SpAKKAA-特异的mAb(5A10、3F6和3D11)的结合的ELISA。（B)辣根过氧化物酶(HRP)缀合SpAKKAA特异的mAb(5A10-HRP、3F6-HRP和3D11-HRP)与固定化的SpAKKAA的缔合在读板仪实验中进行检查，其中SpAKKAA先利用同型对照抗体(IgG1、IgG2a或IgG2b)或三种不同的SpAKKAA-特异的mAb(5A10、3F6和3D11)来培养以评价结合相同或密切相关的位点的抗体的竞争性抑制的可能性(n=3)。测量OD405nm处的值并将其按SpAKKAA与HRP缀合SpA特异的mAb的相互作用进行归一化。数据是平均值，误差条代表±SEM。图A和B中的数据代表三次独立的分析。星号表示统计显著性(P<0.05)。
图4：SpAKKAA-mAb阻止葡萄球菌蛋白A与免疫球蛋白的缔合。(A)同型对照抗体或SpAKKAA-mAb用于扰乱人类IgG向固定在ELISA板上的蛋白质(野生型SpA，或缺乏结合Fcγ(SpAKK)或Fab(SpAAA)的能力的变异体)的结合。数值按没有抗体的蛋白A与人类IgG的相互作用进行归一化(n=4)。(B)葡萄球菌生长到中对数期，并利用同型对照抗体或mAb3F6培养，然后添加2μg野生型Sbi1-4。在培养后，使用经亲和纯化的α-SpAKKAA兔抗体通过免疫印迹来测量Sbi1-4消耗。数值按没有抗体的Sbi1-4沉降(无Ab)进行归一化。(C)将经亲和纯化的SpA(200μg)注射到用85μg(5mg·kg -1)的同型对照抗体或mAb 3F6预处理的小鼠的腹膜腔中。在指示的时间点使动物安乐死以用经亲和纯化的α-SpAKKAA兔抗体通过免疫印迹来测量循环血液中SpA的量(每时间点n=3)。数值按0分钟处注射的SpA的总量进行归一化。数据是平均值，误差条代表±SEM。A-C中的结果代表两次独立的分析。星号表示统计显著性(P<0.05)。
图5：SpAKKAA-mAb促进小鼠和人类血液中金黄色葡萄球菌的调理吞噬杀灭。(A)来匹卢定(Lepirudin)抗凝血的小鼠血液在同型小鼠抗体对照或SpAKKAA-mAb(2μg·ml-1)的存在下利用5×105CFU金黄色葡萄球菌Newman来培养30分钟，并进行存活测量(n=3)。(B)来匹卢定抗凝血的人类全血在同型小鼠抗体对照或SpAKKAA-mAb(10μg·ml-1)的存在下利用5×106CFU金黄色葡萄球菌MW2来培养120分钟，并进行存活测量(n=3)。(C-H)在培养抗凝血的人类血液中的葡萄球菌60分钟时，在用小鼠同型抗体对照(灰色箭头)培养的样品中检测到胞外葡萄球菌簇，而在用SpAKKAA-mAb培养的样品中的中性粒细胞（黑色箭头）内发现葡萄球菌。数据是平均值，误差条代表±SEM。A-H中的结果代表三次独立的分析。星号表示统计显著性(P<0.05)。
图6：通过mAb3F6产生蛋白A特异的免疫应答。通过ELISA来测量已经接收20μg的蛋白A变异体(SpA、SpAKK、SpAAA、SpAKKAA和PBS)和85μg的mAb3F6(一种IgG2a抗体)或其同型对照的混合物的动物(每组n=5)中的蛋白A特异的抗体滴度。免疫滴度按其同型对照标准进行归一化。数据是平均值，误差条代表±SEM。结果代表两次独立的分析。
图7：人类免疫球蛋白片段与蛋白A变异体的相互作用。通过ELISA来分析固定化的蛋白A变异体(野生型SpA、SpAKK、SpAAA或SpAKKAA)与人类免疫球蛋白(hIgG)以及其Fc或F(ab)2片段的缔合，并将其按SpA与人类IgG的相互作用进行归一化。SpA变异体的统计显著性与SpA与每一配体(人类IgG、Fc或F(ab)2片段，n=4)的结合进行比较。数据是平均值，误差条代表±SEM。结果代表三次独立的分析。星号表示统计显著性(P<0.05)。
图8A-B：SpAKKAA mAb CDR比对。使用ClustalW2比对来自从杂交瘤细胞系免疫球蛋白基因获得的CDR(互补决定区)的氨基酸序列。*(星号)表示具有单个、完全保守的残基的位置。:(冒号)表示具有强地相似性质-在Gonnet PAM250矩阵中评分>0.5的基团之间的保守。.(句号)表示具有弱地相似性质-在Gonnet PAM250矩阵中评分=<0.5的基团之间的保守。基于鼠科肾脓肿模型中CFU减少的mAb等级在mAb标识前显示为上标。表明小鼠IgG同型。AVFPMILW-小的(小的+疏水的(包括芳香的-Y))，DE-酸性的，RK-碱性的–H，STYHCNGQ-羟基+巯基+胺+G。
图9：SpA单克隆抗体(Spa27)不能引发小鼠中的保护性免疫。(A)检查SpA-mAb(Spa27)和SpAKKAA-mAb(3F6)与固定化的野生型蛋白A(SpA)和缺乏经由Fcγ(SpAKK)、Fab(SpAAA)或Fcγ和Fab(SpAKKAA)的免疫球蛋白结合的变异体的缔合的ELISA(n=3)。(B)通过利用5或50mg·kg -1的3F6、5mg·kg -1的Spa27、或者模拟物(PBS)的腹腔内注射使动物群组(n=9-15)免疫。在免疫后二十四小时，用5×106CFU的金黄色葡萄球菌USA300来攻击动物。(A)在攻击后四天，使动物安乐死以计算肾脏中葡萄球菌负荷的数目。
图10A-E：mAb358A76.1特异性识别葡萄球菌蛋白A的E域。ELISA检查(A)mAbs358A76.1和(B)3F6与固定化的不产生毒性的蛋白A变异体(SpAKKAA)、各免疫球蛋白结合域(EKKAA、DKKAA、AKKAA、BKKAA和CKKAA)以及来源于EKKAA免疫球蛋白结合域(IgBD)的三种螺旋线(H1、H2、H3、H1+2、H2+3)的合成线性肽的缔合。(C)蛋白A的五种IgBD的氨基酸序列的比对揭示在与其余四种IgBD的保守氨基酸残基不同的E域中的氨基酸残基(虚线框)。在不产生毒性的蛋白A内替换的氨基酸残基通过灰色框来标识。(D)氨基酸序列同源性水平使用ClustalW来比较，数字代表免疫球蛋白结合域之间的氨基酸同源性的百分比。(E)辣根过氧化物酶(HRP)缀合的mAb(358A76.1-HRP和3F6-HRP)与固定在ELISA板中的SpAKKAA的结合在读板仪实验中进行评价，其中SpAKKAA先利用同型对照抗体(IgG2a)或mAb(358A76.1和3F6)来培养以确定结合相同或密切相关的位点的抗体的竞争性抑制。记录OD405nm处的数值并将其按SpAKKAA与HRP缀合SpA特异的mAb的相互作用进行归一化。
图11A-B：SpA单克隆抗体358A76.1不能引发小鼠中的保护性免疫。(A)通过利用5mg·kg -1的模拟物(IgG2a同型对照mAb)、mAb358A76.1或mAb3F6的腹腔内注射使动物群组(n=10)免疫。在免疫后二十四小时，用5×106CFU的金黄色葡萄球菌USA300经由静脉内接种来攻击动物。在攻击后四天，使动物安乐死以计算肾脏中葡萄球菌负荷的数目。(B)抗凝血的小鼠血液在IgG2a同型对照mAb、mAb358A76.1或mAb3F6(10μg·ml-1)的存在下利用5×105CFU金黄色葡萄球菌USA300(LAC)来培养30分钟；测量葡萄球菌存活。(C)同型对照抗体、mAb358A76.1或mAb3F6用于扰乱人类IgG与固定在ELISA板上的野生型蛋白A(SpA)的结合。数值按不存在抗体的蛋白A与人类IgG的相互作用进行归一化。
具体实施方式
金黄色葡萄球菌是人类皮肤和鼻孔的共生体，并且是血流、皮肤和软组织感染的主要原因(Klevens等，2007)。葡萄球菌疾病死亡率最近急剧的增长是因为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的传播，所述菌株通常不易受抗生素的影响(Kennedy等，2008)。在一个大的回顾研究中，MRSA感染的发病率为美国所有入院中的4.6%(Klevens等，2007)。在美国用于94300个受感染的个体的年度医疗保健费用超过24亿美元(Klevens等，2007)。目前的MRSR传染病已经引发了必须通过开发预防性疫苗来解决的公共卫生危机(Boucher和Corey，2008)。迄今为止，无法获得FDA批准的预防金黄色葡萄球菌的疫苗。
本发明人在此描述了葡萄球菌蛋白A结合抗体及其抗原结合决定子。特别地，已经使用缺乏毒性(Fcγ相互作用)和针对B细胞的超级抗原活性(Fab相互作用)两者的SpA突变体蛋白制造了一批单克隆抗体。发现许多抗体以高亲和性和特异性与SpA相互作用。重要地，抗体能够抵消葡萄球菌蛋白A的分子机制。另外，当对动物施用时，抗体减少在用毒性的金黄色葡萄球菌攻击后的细菌负荷和脓肿形成。因为这些分子能够阻碍SpA的免疫抑制作用，所以这些抗体还可以增强在葡萄球菌感染后的宿主免疫应答。因此，实施方案的SpA结合分子提供一种新型且有效的途径来处理或预防葡萄球菌疾病。
I.SPA多肽
实施方案的一些方面涉及SpA多肽，例如本文以SEQ ID NO:1所提供的野生型SpA。然而，在一些方面，实施方案涉及突变或变异的SpA多肽，例如缺乏B细胞超级抗原活性和/或非特异性免疫球蛋白结合活性(即结合不依赖于Ig的CDR序列的Ig)的多肽。特别地，一些实施方案涉及与缺乏B细胞超级抗原活性和/或非特异性免疫球蛋白结合活性的SpA多肽特异性结合的多肽(例如包含抗体CDR域的多肽)。
蛋白A的N端部分由四个或五个56-61个氨基酸残基免疫球蛋白结合域(IgBD A-E)构成；根据实施方案使用的SpA变异体可以是例如包含变异的A、B、C、D和/或E域的全长的SpA变异体。在一些方面，SpA变异体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列80%、90%、95%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，或由其构成。在其他的实施方案中，SpA变异体包含SpA的节段。SpA节段可以包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个IgG结合域。IgG域可以是至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的A、B、C、D或E域。在一些方面，SpA变异体包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的A域。在另一方面，SpA变异体包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的B域。在仍另外的方面，SpA变异体包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的C域。在又一另外的方面，SpA变异体包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的D域。在一些方面，SpA变异体包含至少或至多1、2、3、4、5或更多个变异的E域。在另一方面，SpA变异体包含各种组合和排列的A、B、C、D和E域的组合。组合可以包括SpA信号肽节段、SpA区域X节段和/或SpA类别信号节段的全部或部分。在其他方面，SpA变异体不包括SpA信号肽节段、SpA区域X节段和/或SpA类别信号节段。在一些方面，变异的A域包含在SEQ ID NO:4的7、8、34和/或35位的替换。在另一方面，变异的B域包含在SEQ ID NO:6的7、8、34和/或35位的替换。在仍另外的方面，变异的C域包含在SEQ ID NO:5的7、8、34和/或35位的替换。在一些方面，变异的D域包含在SEQ ID NO:2的9、10、36和/或37位的替换。在另一方面，变异的E域包含在SEQ ID NO:3的6、7、33和/或34位的替换。
在一些方面，SpA域D变异体或其等价物可以包含在SEQ ID NO:2的9和36位；9和37位；9和10位；36和37位；10和36位；10和37位；9、36和37位；10、36和37位，9、10和36位；或9、10和37位的突变。在另一方面，类似的突变可以包含在域A、B、C或E中的一个或更多个中。
在另外的方面，SEQ ID NO:2的9位的氨基酸谷氨酰胺(Q)(或在其他SpA域中其相似的氨基酸)可以用丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代。在一些方面，9位的谷氨酰胺可以用精氨酸(R)替换。在另一方面，SEQ ID NO:2的9位的谷氨酰胺或其等价物可以用赖氨酸或甘氨酸替换。任何的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换可以明确地排除在外。
在另一方面，SEQ ID NO:2的10位的氨基酸谷氨酰胺(Q)(或在其他SpA域中其相似的氨基酸)可以用丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代。在一些方面，10位的谷氨酰胺可以用精氨酸(R)替换。在另一方面，SEQ ID NO:2的10位的谷氨酰胺或其等价物可以用赖氨酸或甘氨酸替换。任何的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换可以明确地排除在外。
在一些方面，SEQ ID NO:2的36位的天冬氨酸(D)(或在其他SpA域中其相似的氨基酸)可以用丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代。在一些方面，36位的天冬氨酸可以用谷氨酸(E)替换。在一些方面，SEQ ID NO:2的36位的天冬氨酸或其等价物可以用丙氨酸或丝氨酸替换。任何的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换可以明确地排除在外。
在另一方面，SEQ ID NO:2的37位的天冬氨酸(D)(或在其他SpA域中其相似的氨基酸)可以用丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代。在一些方面，37位的天冬氨酸可以用谷氨酸(E)替换。在一些方面，SEQ ID NO:2的37位的天冬氨酸或其等价物可以用丙氨酸或丝氨酸替换。任何的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换可以明确地排除在外。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的9位的氨基(或在另外的SpA域中相似的氨基酸)被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代。在一些方面，SEQ ID NO:2的9位的氨基酸被甘氨酸取代。在另一方面，SEQ IDNO:2的9位的氨基酸被赖氨酸取代。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的10位的氨基(或在另外的SpA域中相似的氨基酸)被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代。在一些方面，SEQ ID NO:2的10位的氨基酸被甘氨酸取代。在另一方面，SEQID NO:2的10位的氨基酸被赖氨酸取代。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的36位的氨基(或在另外的SpA域中相似的氨基酸)被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代。在一些方面，SEQ ID NO:2的36位的氨基酸被丝氨酸取代。在另一方面，SEQID NO:2的36位的氨基酸被丙氨酸取代。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的37位的氨基(或在另外的SpA域中相似的氨基酸)被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代。在一些方面，SEQ ID NO:2的37位的氨基酸被丝氨酸取代。在另一方面，SEQID NO:2的37位的氨基酸被丙氨酸取代。
在一些方面，SpA变异体包括(a)在SpA域A、B、C、D和/或E的IgG Fc结合子域中破坏或降低与IgG Fc的结合的一个或更多个氨基酸替换、和(b)在SpA域A、B、C、D和/或E的VH3结合子域中破坏或降低与VH3的结合的一个或更多个氨基酸替换的替换。在仍另外的方面，SpA变异体的氨基酸序列包含至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%（包括其间的所有值和范围）与SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在另一方面，SpA变异体包括(a)在SpA域D的IgG Fc结合子域中或在其他IgG域中相应的氨基酸位置处破坏或降低与IgG Fc的结合的一个或更多个氨基酸替换，和(b)在SpA域D的VH3结合子域中或在其他IgG域中相应的氨基酸位置处破坏或降低与VH3的结合的一个或更多个氨基酸替换。在一些方面，对域D的IgG Fc结合子域的氨基酸残基F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35(SEQ ID NO:2，QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES)进行改性或替换。在一些方面，对域D的VH3结合子域的氨基酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47(SEQ ID NO:2)进行改性或替换，使得与Fc或VH3的结合减弱。在另外的方面，相应的改性或替换可以在域A、B、C和/或E的相应位置中进行。相应的位置通过比对域D氨基酸序列与来自SpA的其他IgG结合域的一种或更多种氨基酸序列来限定。在一些方面，氨基酸替换可以是其他20中氨基酸中的任何种。在另一方面，保守性的氨基酸替换可以特别地从可能的氨基酸替换中排除。在其他方面，仅包括非保守性的替换。在任何情况下，预期降低域的结合使得SpA毒性显著降低的任何替换或替换的组合。结合降低的显著性是指当引入到受试者中时产生最低毒性到不产生毒性的变异体，并且可以使用本文所述的体外方法进行评价。
在一些实施方案中，变异的SpA包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个变异的SpA域D肽。在一些方面，对变异SpA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19或更多个氨基酸残基进行替换或改性-包括但不限于域D的IgG Fc结合子域的氨基酸F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35(SEQ ID NO:2)和域D的VH3结合子域的氨基酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47(SEQ ID NO:2)。在一个方面，使SEQ ID NO:2的9位和/或10位的谷氨酸残基(或其他域中的相应位置)突变。在另一方面，使SEQ ID NO:2的天冬氨酸残基36和/或37(或其他域中的相应位置)突变。在另一方面，使谷氨酸9和10以及天冬氨酸残基36和37突变。经纯化的本文所述的不产生毒性的SpA或SpA-D突变体/变异体不再能够显著地结合(即证明衰减的或被破坏的结合亲和性)Fcγ或F(ab)2VH3，也不刺激B细胞凋亡。
预期SpA的变异体还可以在域A、B、C和/或E中包括与上述域D中相同的变异。在一些实施方案中，SpA结合多肽或抗体可以与在域A、B、C、D和E的每个中具有本文所述的KKAA变异的SpA变异体结合。在另外的实施方案中，相同的SpA结合多肽或抗体还可以与在每个域中具有GGSS变异而不是KKAA的变异体结合。另外，在一些实施方案中，SpA结合多肽或抗体可以与变异的Sbi抗原结合，所述变异的Sbi抗原如在SpA中一样在其域的一个或更多个上发生改变。这样的实例示于图4中。
此外，预期本文所述的SpA结合多肽或抗体可以能够在结合免疫球蛋白Fc或Fab区域方面与SpA竞争，或可以阻止免疫球蛋白功能的SpA破坏。还预期本文所述的SpA结合多肽或抗体可以或能够扰乱免疫球蛋白功能的SpA破坏或与免疫球蛋白Fc或Fab区域的SpA结合。在一些实施方案中，该性质使得治疗性化合物能够用于处理感染。此外，方法涉及一种能够抵消免疫球蛋白功能的SpA破坏或与免疫球蛋白Fc或Fab区域的SpA结合的SpA结合多肽或抗体。
不产生毒素的蛋白A变异体可以用作亚单位疫苗，引起体液免疫应答并给与对金黄色葡萄球菌攻击的保护性免疫。与野生型全长蛋白A或野生型SpA-域D相比，利用SpA-D变异体的免疫导致蛋白A特异的抗体增加。其他SpA变异体及其使用方法在PCT公开WO2011/005341号和PCT申请PCT/US11/42845号中提供，两者通过引用并入本文。
II.蛋白质的组合物
替换的变异体一般含有在蛋白质内一个或更多个位点处一个氨基酸与另一个的交换，并可以设计为调整多肽的一个或更多个性质，具有或没有其他功能或性质的损失。替换可以是保守性的，即一个氨基酸用一个相似形状和电荷的氨基酸替代。保守性替换在本领域是众所周知的，包括例如以下的变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸盐到谷氨酸盐；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酸到天冬酰胺；谷氨酸盐到天冬氨酸盐；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬氨酸或谷氨酸；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守性的，使得影响多肽的功能或活性。非保守性的变化一般涉及用化学上不同的残基来替换残基，例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性的或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
蛋白质可以是重组的，或体外合成的。或者，非重组的或重组的蛋白质可以从细菌中分离。还预期可以在组合物和方法中实施含有这种变异体的细菌。然后，蛋白质不需要进行分离。
术语“功能等价的密码子”在本文中用来指对相同氨基酸编码的密码子，例如用于精氨酸或丝氨酸的六个密码子，还指对生物等价的氨基酸编码的密码子(参见下表)。
密码子表
还应理解氨基酸和核酸序列可以包含额外的残基,例如分别包含额外的N端或C端氨基酸，或5'或3'序列，但仍基本上如前所述在本文所公开的序列之一中，只要序列符合上述标准，当涉及蛋白表达时包括生物蛋白活性的维持。末端序列的添加特别地应用于例如可以包含位于编码区的5'部分或3'部分的侧面的各种非编码序列的核酸序列。
以下是基于改变蛋白质的氨基酸以创造等价的或甚至改善的第二代分子的讨论。例如，一些氨基酸可以替换为蛋白质结构中的其他氨基酸，而没有可观察到的与结构、例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点相互作用的结合能力的损失。因为正是蛋白质的相互作用的能力和本性限定蛋白质的生物功能活性,所以可以在蛋白质序列中和在其底层的DNA编码序列中进行一些氨基酸替换，仍然产生具有相似性质的蛋白质。因此本发明人预期，可以在基因的DNA序列中进行各种变化，而没有可观察到的其生物功效或活性的损失。
在进行这类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。在本领域中普遍地理解氨基酸亲水指数在给予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性（Kyte和Doolittle，1982）。接受的观点是氨基酸的相对亲水特性对生成的蛋白质的二级结构起作用，所述二级结构反过来限定蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、和抗原等的相互作用。
在本领域中还理解相似氨基酸的替换可以基于亲水性有效地进行。通过引用并入本文的美国专利4,554,101说明蛋白质的最大局部平均亲水性，如由其邻近的氨基酸的亲水性决定的，与蛋白质的生物学性质相关。应理解氨基酸可以替换为具有相似亲水性值的另一氨基酸，并仍生成生物学上等价且免疫学上等价的蛋白质。
如以上所概述的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、和大小等。考虑到各种前述特性的示例性替换是众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
预期在组合物中，每ml有在约0.001mg和约10mg之间的总的多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中蛋白质的浓度可以是大约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更大(或者其中可推出的任何范围)。其中，大约、至少约或至多约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%可以是结合SpA的抗体，并可以与本文所述的其他葡萄球菌蛋白或蛋白结合抗体组合使用。
A.多肽和多肽生成
实施方案涉及用于本文所述的各个方面的多肽、肽和蛋白质及其致免疫的片段。例如，试验特定的抗体以为了或用于抵消或抑制葡萄球菌感染，或在抵消或抑制葡萄球菌感染中使用特定的抗体。在具体的实施方案中，本文所述的蛋白质的全部或部分还可以根据惯用技术在溶液中或在固体支撑体上合成。各种自动的合成器是可商购的，并可以根据已知的方案来施用。参见例如Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，每一个都通过引用并入本文。或者，可以采用重组DNA技术，其中对肽或多肽编码的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞，并在适合于表达的条件下培养。
一个实施方案包括基因转移到细胞（包括微生物）用于蛋白质的生产和/或提呈的用途。关心的蛋白质的基因可以转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。可以采用实际上对任何多肽编码的核酸。在本文中讨论重组表达载体的代数和其中包含的元素。或者，待生成的蛋白质可以是通常由用于蛋白质生成的细胞合成的内源性蛋白质。
在一个特定的方面，致免疫的SpA片段基本上包含蛋白质的所有胞外域，其与在片段序列的长度上所选的序列具有至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性或至少97%到99%的同一性，包括其间所有的值和范围。
由葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白的致免疫片段(例如SpA)构成的融合蛋白也包含在致免疫的组合物中。或者，实施方案还包括葡萄球菌蛋白的个体融合蛋白或其致免疫的片段，作为具有异源序列例如T细胞表位或纯化标记提供者的融合蛋白，例如：β-半乳糖苷酶，谷胱甘肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)，表位标记如FLAG，myc标记，聚组氨酸，或病毒表面蛋白如流感病毒血凝素，或细菌蛋白如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。
B.抗体和抗体状分子
在一些方面，可以获得或生产一种或更多种抗体或抗体状分子(例如包含抗体CDR域的多肽)，其对SpA具有特异性。这些抗体可以在本文所述的各种诊断和治疗应用中使用。
如本文所使用的，术语“抗体”旨在概括地指任何免疫学结合剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR域的多肽。因此，术语“抗体”用来指具有抗原结合区的任何抗体状分子，并包括抗体片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(DAB)、Fv，scFv(单链Fv)和具有抗体CDR的多肽，显示CDR的支架域(例如anticalins)或纳米抗体。例如，纳米抗体可以是来自骆驼IgG2或IgG3的抗原特异的VHH(例如重组的VHH)，或来自这种骆驼Ig的CDR显示框架。用于制备和使用各种基于抗体的构造和片段的技术在本领域中是众所周知的。用于制备和表征抗体的手段在本领域中也是众所周知的(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；通过引用并入本文)。
还预期实施方案使用“微型抗体”或“迷你抗体”。迷你抗体是sFv多肽链，其包含在其C端通过枢纽区与sFv分开的寡聚化域。Pack等(1992)。寡聚化域包含可以通过额外的二硫键进一步稳定化的自缔合的α-螺旋，例如亮氨酸拉链。寡聚化域设计为适合于跨膜矢量折叠，一种被认为有助于活体内多肽折叠为功能结合蛋白的过程。通常迷你抗体使用本领域中众所周知的重组方法来产生。见例如Pack等(1992)；Cumber等(1992)。
在实施方案中还预期抗体状结合模拟肽。Liu等(2003)描述“抗体状结合模拟肽”(ABiP)，其是作为削减的抗体的抗体，并具有更长的血清半衰期以及较不麻烦的合成方法的优点。
抗原结合肽的替代支架，例如CDR也可获得，并可以用于根据实施方案产生SpA结合分子。通常，本领域技术人员知道如何确定在其上移植至少一个由原始抗体产生的CDR的蛋白质支架的类型。更特别地，已知待选的这类支架必须符合如下最大数量标准(Skerra，2000)：良好的系统发育保守；已知的三维结构(例如通过结晶学、NMR谱或本领域技术人员已知的任何其他技术)；小尺寸；很少或没有转录后的改性；和/或易于生产、表达和纯化。
这类蛋白质支架的起源可以是但不限于选自以下的结构：纤连蛋白和优选地纤连蛋白III型域10，脂笼蛋白，anticalin(Skerra，2001)，由金黄色葡萄球菌的蛋白A的域B产生的蛋白Z，硫氧还原蛋白A或具有重复的基序如“锚蛋白重复”(Kohl等，2003)、“犰狳重复”、“富亮氨酸重复”和“三角形四肽重复”的蛋白质。例如，anticalin或脂笼蛋白衍生物是一类对各种目标分子具有亲和性和特异性的结合蛋白，并且可以用作SpA结合分子。这类蛋白在美国专利公开20100285564号、20060058510号、20060088908号、20050106660号和PCT公开WO2006/056464号中进行描述，通过引用并入本文。
来源于毒素，例如来自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素的支架和神经元NO合酶的蛋白质抑制剂(PIN)也可以用于一些方面。
单克隆抗体(MAb)被识别为具有一些优点，例如重现性和大规模生产。实施方案包括人类、小鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和鸡源的单克隆抗体。
还预期“人源化的”抗体，同样预期带有人类恒定区和/或可变区的域的来源于小鼠、大鼠或其他物种的嵌合抗体，双特异性抗体，重组和改造的抗体及其片段。如本文中所使用的，术语“人源化的”免疫球蛋白是指包含人类框架区和来自非人类(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或更多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。“人源化的抗体”是包含人源化的轻链和人源化的重链免疫球蛋白的抗体。为了描述一些实施方案的抗体，可以测量被称为亲和性的抗体分子结合表位的强度。抗体的亲和性可以通过测量缔合常数(Ka)或解离常数(Kd)来确定。被认为在一些实施方案中有用的抗体可以具有大约、至少约或至多约106、107、108、109或1010M或其中可推出的任何范围的缔合常数。相似地，在一些实施方案中，抗体可以具有大约、至少约或至多约10-6、10-7、10-8、10-9或10-10M或其中可推出的任何范围的解离常数。对本文所讨论的抗体报道这些值，相同的试验可以用于评价这类抗体的结合性质。
在一些实施方案中，与SpA特异性结合的多肽能够抵消蛋白A和/或促进葡萄球菌的调理吞噬杀灭。此外，在一些实施方案中，所使用的多肽可以提供对抗金黄色葡萄球菌疾病的保护性免疫。预期从这些实施方案中排除mAb358A76.1。
1.用于产生抗体的方法
用于产生抗体(例如单克隆抗体和/或单克隆抗体)的方法在本领域中是已知的。简单地说，多克隆抗体通过根据实施方案利用SpA多肽(例如不产生毒性的SpA)或其部分使动物免疫并收集来自免疫的动物的抗血清来制备。
大范围的动物种类可以用于生产抗血清。一般地，用于生产抗血清的动物为兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。动物的选择可以根据操作的简便、成本或期望的血清量来决定，这对本领域技术人员是已知的。会理解，抗体还可以通过关于关心的免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的哺乳动物或植物的产生和以可回收的形式从中生产抗体来转基因地生产。关于哺乳动物中的转基因生产，抗体可以在山羊、牛和其他哺乳动物的奶中生产和回收。参见例如美国专利5,827,690号、5,756,687号、5,750,172号和5,741,957号。
如在本领域中众所周知的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用被称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂来增强。合适的佐剂包括任何可接受的免疫刺激化合物，例如细胞因子、趋化因子、辅助因子、毒素、原质团、合成的组合物或对这类佐剂编码的载体。
根据实施方案可以使用的佐剂包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂A(MPL)。还预期含有从细菌提取的三种组分MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的在2%鲨烯/吐温80乳液中的RIBI。甚至可以使用MHC抗原。示例性佐剂可以包括完整的弗氏佐剂(Freund's adjuvant)(一种含有杀灭的结核杆菌的免疫应答非特异性刺激剂)、不完整的弗氏佐剂和/或氢氧化铝佐剂。
除了佐剂之外，还期望共同施用生物应答改性剂(BRM)，其已经显示为上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性。这类BRM包括但不限于西咪替丁(Cimetidine)(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低剂量的环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)，细胞因子，例如-干扰素、IL-2或IL-12，或者对涉及免疫辅助功能的蛋白质编码的基因，例如B-7。
在抗体的生产中所使用的免疫原组合物的量根据免疫原的本性以及用于免疫的动物而变化。可以使用各种途径来施用免疫原，包括但不限于皮下的、肌肉内的、真皮内的、表皮内的、静脉内的和腹膜内的途径。抗体的生产可以通过在免疫后的各个点对免疫动物的血液进行采样来监测。
还可以给予第二加强剂量(例如在注射中所提供的)。重复推进和滴定的过程直到达到合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性，可以从免疫的动物取血，血清分离和储存，和/或动物可以用于产生MAb。
对于兔多克隆抗体的生产，可以通过耳血管或通过心脏穿刺从动物取血。允许移走的血液凝结，然后将其离心以从全血和血凝块中分离血清组分。血清可以用于各种应用，或者期望的抗体部分可以通过众所周知的方法来纯化，例如使用另一抗体、与固体基质结合的肽的亲和色谱，或通过使用例如蛋白A或蛋白G色谱等。
MAb可以通过使用众所周知的技术容易地制备，例如在美国专利4,196,265中所举例的那些，其通过引用并入本文。一般地，该技术涉及利用选定的免疫原组合物，例如经纯化的或部分纯化的蛋白、多肽、肽或域使合适的动物免疫，所述免疫原组合物为野生型或突变的组合物。以有效地刺激抗体生产细胞的方式施用免疫组合物。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。在一些实施方案中，啮齿动物，例如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或青蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是众所周知的，并可以提供一些优点(Goding，1986，第60到61页)。小鼠(例如BALB/c小鼠)是常规使用的，并通常给出高百分比的稳定融合。
通常如以上所述，对动物注射抗原。抗原可以与佐剂，例如弗氏完整或不完整的佐剂混合。利用相同抗原或对抗原编码的DNA的加强施用可以以大约两周的时间间隔发生。如在实施例中所讨论的，相比于在自然界中所发现的抗原序列，抗原可以改变。在一些实施方案中，采用变异的或改变的蛋白A肽或多肽以产生抗体。在一些实施方案中，SpA变异体具有在SpA的A、B、C、D或E域中的1、2、3、4或所有5个域中的1、2、3、4、5、6、7或8个变化。
在免疫后，选择具有生产抗体的潜力的体细胞，具体地B淋巴细胞(B细胞)用于在MAb产生方案中使用。这些细胞可以从活组织切除的脾脏、扁桃体或淋巴结中获得，或从外周血样品中获得。通常脾脏细胞是成浆细胞分裂阶段中的抗体生产细胞的丰富来源。一般地，外周血细胞可以容易地获得，这是因为外周血容易得到。
在一些实施方案中，一组动物会被免疫，具有最高抗体滴度的动物的脾脏会被摘除，并通过注射器使脾脏均匀化来获得脾脏淋巴细胞。一般地，来自免疫的小鼠的脾脏含有大约5×107到2×108个淋巴细胞。
来自免疫动物的生产抗体的B淋巴细胞然后与无限增殖的骨髓瘤细胞融合，所述无限增殖的骨髓瘤细胞通常是与免疫的动物相同物种的细胞。适合于在杂交瘤生产融合过程中使用的骨髓瘤细胞系优选为非抗体生产的，具有高的融合效率，以及使其不能在特定的选择性培养基中生长的酶缺陷，所述选择性培养基仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)的生长。
可以使用大量骨髓瘤细胞中的任何一种，如本领域技术人员已知的(Goding，第65到66页，1986；Campbell，第75到83页，1984)。例如，当免疫的动物是小鼠时，可以使用P3X63/Ag8、X63Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210Ag14、FO、NSO/U、MPC11、MPC11X45GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3Ag1.2.3、IR983F和4B210；U266、GM1500GRG2、LICR LON HMy2和UC7296均对人类细胞融合有用。参见Yoo等(2002)，关于骨髓瘤表达系统的讨论。
一种鼠类骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也被称为P3-NS-1-Ag4-1)，其可以通过要求细胞系保藏号GM3573从NIGMS人类基因突变细胞保藏室(Human Genetic MutantCell Repository)容易地得到。可以使用的另一小鼠骨髓瘤细胞系是8氮鸟嘌呤抗性小鼠鼠类骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。
用于产生生产抗体的脾脏细胞或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括以2:1的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，尽管在促进细胞膜融合的试剂(化学或电的)的存在下所述比例可以分别从约20:1变到约1:1。Kohler和Milstein(1975；1976)已经描述了使用仙台(Sendai)病毒的融合方法，且Gefter等(1977)描述了使用乙二醇(PEG)，例如37%(v/v)PEG的那些方法。使用电诱导的融合方法也是合适的(Goding，第71-74页，1986)。
融合过程通常以低频率，约1×10-6到1×10-8产生可存活的杂交体。然而，这不造成问题，这是因为可存活的、经融合的杂交体通过在选择性培养基中培养从亲代、未融合的细胞(特别是一般会无限地继续分裂的未融合的细胞)中分化出来。选择性培养基通常是含有在组织培养基中阻断核苷酸的从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨蝶呤、甲氨蝶呤和氮丝氨酸。氨蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨蝶呤和甲氨蝶呤时，用次黄嘌呤和胸苷补充培养基作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用氮丝氨酸时，用次黄嘌呤补充培养基。
选择培养基是HAT。仅能够操作核苷酸补救路径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救路径的关键酶例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)中是有缺陷的，它们不能存活。B细胞可以操作该路径，但是它们在培养中具有有限的寿命，并通常在大约两周内死亡。因此，可以在选择性培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂交体。
该培养提供杂交瘤群体，从所述杂交瘤群体中选择特定的杂交瘤。一般地，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中的单克隆稀释来培养细胞，然后测试单个克隆的上清液(在约两或三周后)的期望反应性。分析应该是灵敏的、简单的和快速的，例如放射性免疫分析、酶免疫分析、细胞毒性分析、噬菌斑分析、斑点免疫结合分析等。
选择的杂交瘤然后会被系列稀释，并克隆为单独的抗体生产细胞系，所述克隆然后可以无限地繁殖以提供MAb。细胞系可以以两种基本的方式用于MAb生产。首先，杂交瘤的样品可以注射(通常注射到腹膜腔内)到用于为初始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的组织相容型动物类型中(例如同源的小鼠)。任选地，在注射之前用碳氢化合物，尤其是油，例如姥鲛烷(四甲基十五烷)使动物具有易感性。经注射的动物长出肿瘤，所述肿瘤分泌由经融合的细胞杂交体生产的特异性单克隆抗体。然后可以抽出动物的体液，例如血清或腹水液以提供高浓度的MAb。其次，个别的细胞系可以在体外培养，其中MAb自然地被分泌到培养基中，从所述培养基中可以容易地获得高浓度的MAb。
另外，来自生产细胞系的抗体(或其其他部分)的表达可以使用大量已知的技术来增强。例如，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在一定条件下增强表达的通用方法。高表达的细胞克隆可以使用惯用技术，例如有限稀释克隆和微滴(Microdrop)技术来确定。在欧洲专利0216846号、0256055号和0323997号以及欧洲专利申请89303964.4号的全部或部分中讨论了GS系统。
如果需要，通过两者中任一手段生产的MAb可以使用过滤、离心和各种色谱方法例如HPLC或亲和色谱进一步纯化。单克隆抗体的片段可以从如下生产的单克隆抗体中获得：通过包括用酶，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法，和/或通过由化学还原造成的二硫键裂解。或者，单克隆抗体片段可以使用自动化的肽合成器来合成。
还预期可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。在一个实施方案中，组合的免疫球蛋白噬菌粒库由从免疫动物的脾脏中分离的RNA制成，表达合适抗体的噬菌粒通过使用表达抗原的细胞和对照细胞的淘选来选择。该方法相对于传统杂交瘤技术的优点是单轮可以生产和筛选大约104倍的抗体，且由H链和L链组合产生新的特异性，这进一步增加发现合适抗体的机会。
另一实施方案涉及生产抗体，例如如在美国专利6,091,001号中所发现的，其描述了使用Cre介导的位点特异性重组由包含改性的免疫球蛋白基因座的细胞的基因组序列生产表达抗体的细胞的方法。方法涉及利用同源靶向载体使抗体生产细胞进行第一转染，所述同源靶向载体包含脂氧合酶位点和与基因组序列的免疫球蛋白基因座区域邻近的第一DNA序列同源的靶向序列，所述免疫球蛋白基因座区域会被转变为经改性的区域，所以第一脂氧合酶位点经由位点特异性同源重组插入到基因组序列中。然后，利用脂氧合酶靶向载体使细胞转染，所述脂氧合酶靶向载体包含适合于利用完整的脂氧合酶位点的Cre介导的重组的第二脂氧合酶位点和将免疫球蛋白基因座区域转变为经改性的区域的改性序列。该转变通过使脂氧合酶位点与Cre在活体内相互作用来进行，使得改性序列经由脂氧合酶位点的Cre介导的位点特异重组插入到基因组序列中。
或者，单克隆抗体片段可以使用自动的肽合成器或通过大肠杆菌(E.coli)中全长基因或基因片段的表达来合成。
还预期可以在与特异性、亲和力、半衰期、免疫原性、结合缔合、结合解离相关的性质或关于作为感染的处理的整体功能性质方面进一步筛选和优化单克隆抗体。因此，预期单克隆抗体可以在单克隆抗体5A10、8E2、3A6、3F6、1F10、6D11、3D11、5A11、1B10或4C1的1、2、3、4、5或6个CDR的氨基酸序列中具有1、2、3、4、5、6或更多个变化。预期在单克隆抗体5A10、8E2、3A6、3F6、1F10、6D11、3D11、5A11、1B10或4C1的轻可变区或重可变区的VJ区或VDJ区的CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位中的氨基酸可以具有插入、删除或利用保守的或非保守的氨基酸的替换。上文公开了可以被替换或构成替换的这类氨基酸。
在一些实施方案中，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CHl域构成的Fab片段；(ii)由VH和CHl域构成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH域构成的Fv域；(iv)由VH或VL域构成的dAb片段(Ward，1989；McCafferty等，1990；Holt等，2003)；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab')2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通过肽连接体连接，所述肽连接体允许两个域缔合以形成抗原结合位点(Bird等，1988；Huston等，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体(diabody)”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等，1993)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过并入连接VH域和VL域的二硫化物桥来稳定(Reiter等，1996)。也可以制成包含连接到CH3域的scFv的迷你抗体(Hu等，1996)。该段中的引证通过引用并入。
抗体还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两种不同的可变区在相同分子中组合(Holliger，P.&Winter，G.1999Cancer andmetastasis rev.18:411-419，1999)。通过其在肿瘤细胞的表面上靶向几个分子或补充新效应物功能的能力证实其在诊断领域和治疗领域两者中的用途。当要使用双特异性抗体时，这些可以是传统的双特异性抗体，其可以以各种方式来制造(Holliger等，PNAS USA90:6444-6448，1993)，例如化学地或由杂交的杂交瘤来制备，或者可以是任何上述的双特异性抗体片段。这些抗体可以通过化学方法(Glennie等，1987J.Immunol.139，2367-2375；Repp等，J.Hemat.377-382，1995)或体细胞方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.PNAS83，1986；等，Method Enzymol.121:210-228，1986)但是同样地通过使得能够推动异源二聚并且从而有利于所寻求抗体的纯化过程的基因工程技术(Merchand等，Nature Biotech，16:677-681，1998)来获得。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合域，并经由短的柔性肽直接将其连接。这在一个短的单肽链上组合两个抗体。双抗体和scFv可以在没有Fc区的情况下仅使用可变域构建，可能降低抗独特型反应的效果。该段中的引证通过引用全部并入。
双特异性抗体可以构建为完整的IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或双特异性scFv。另外，两个双特异性抗体可以使用本领域中已知的常规方法进行连接以形成四价的抗体。
如与双特异性整体抗体相反的双特异性双抗体也可以是特别有用的，这是因为它们可以容易地构建并在大肠杆菌中表达。使用来自库的噬菌体展示(WO94/13804)可以容易地选择具有合适结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂要保持恒定，例如具有针对SpA的特异性，那么可以制作其中其他臂改变的库，并选择合适特异性的抗体。双特异性整体抗体可以通过如在Ridgeway等，(Protein Eng.，9:616-621，1996)中所述的可替代的工程方法来制作，所述方法通过引用并入本文。
C.抗体和多肽缀合物
实施方案提供SpA蛋白的抗体和抗体状分子，与至少一种试剂相连以形成抗体缀合物或有效负荷的多肽和肽。为了提高作为诊断剂或治疗剂的抗体分子的功效，通常连接或共价结合或配合至少一种期望的分子或部分。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应物分子或报道分子。效应物分子包括具有期望活性，例如细胞毒性活性的分子。已经附接到抗体的效应物分子的非限制性实例包括毒素、治疗酶、抗体、放射性标记的核苷酸等。相比之下，报道分子定义为可以使用分析检测到的任何部分。已经缀合到抗体的报道分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、着色的颗粒或配体如生物素。
抗体缀合物的一些实例为其中抗体连接到可检测到的标记的那些缀合物。“可检测的标记”为由于其特殊的功能性质和/或化学特性可以被检测到的化合物和/或元素，其使用使得它们附接到的抗体能够被检测到和/或如果需要的话进一步定量。
抗体缀合物通常优选地作为诊断剂使用。抗体诊断通常分为两类，用于体外诊断例如各种免疫分析中使用的那些，和/或在活体内诊断方案中使用的通常被称为“抗体直接成像”的那些。许多合适的成像剂在本领域中是已知的，用于将它们附接到抗体的方法也是已知的(参见例如美国专利5,021,236号、4,938,948号和4,472,509号，每个都通过引用并入本文)。使用的成像部分可以是顺磁粒子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测到的物质、X射线成像。
在顺磁离子的情况下，可以举例说明地提及离子，例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆为特别优选的。在其他情况，例如X射线成像中有用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)以及尤其是铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以使用砹211、碳14、铬51、氯36、钴57、钴58、铜67、Eu152、镓67、氢3、碘123、碘125、碘131、铟111、铁59、磷32、铼186、铼188、硒75、硫35、锝99m和/或钇90。125I通常在一些实施方案中使用，锝99m和/或铟111也由于其低的能量和适合于远程检测而通常使用。放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域中众所周知的方法来生产。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂，例如次氯酸钠或酶氧化剂，例如乳过氧化物酶接触进行碘化。单克隆抗体可以通过配体交换过程来用锝99m标记，例如通过用亚锡盐溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上并将抗体施加到该柱。或者，可以使用直接标记技术，例如通过培养高锝酸盐、还原剂如SnCl2、缓冲溶液如钠钾磷酸盐溶液和抗体。通常用于将以金属离子存在的放射性同位素结合到抗体的中间官能团是二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在预期用作缀合物的荧光标记中包括Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green488、Oregon Green500、OregonGreen514、Pacific Blue、REG、若丹明绿、若丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明/或Texas Red等。
抗体缀合物包括打算主要在体外使用的那些，其中抗体连接到与生色底物接触时会产生有色产物的第二结合配体和/或酶(酶标记)。合适的酶的实例包括但不限于脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或亲和素以及链霉亲和素化合物。这类标记的使用对本领域技术人员来说是众所周知的，并且例如在美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中进行描述；每个都通过引用并入本文。
将分子位点特异地附接到抗体的另一已知的方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。基本上，基于半抗原的亲和标记与在抗原结合位点的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻碍特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，这是因为其通过抗体缀合物导致抗原结合的损失。
含有叠氮基的分子也可以用于通过由低强度紫外线产生的反应性氮宾中间体形成与蛋白质的共价键(Potter&Haley，1983)。特别地，嘌呤核苷酸的2-叠氮基和8-叠氮基类似物已经用作位点定向的光学探针以确定在粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley，1987；Atherton等，1985)。2-叠氮基和8-叠氮基核苷酸还已经用于确定经纯化的蛋白质的核苷酸结合域的位置(Khatoon等，1989；King等，1989；和Dholakia等，1989)，并可以用作抗体结合剂。
用于将抗体附接或缀合到其缀合物部分的几个方法在本领域中是已知的。一些附接方法涉及使用金属螯合复合物，例如所述金属螯合复合物采用有机螯合剂，如二乙三胺五乙酸酸酐(DTPA)、亚乙基三胺四乙酸、N-氯-对甲苯磺酰胺和/或附接到抗体的四氯-3,6-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509号和4,938,948号，每个都通过引用并入本文)。单克隆抗体还可以在偶联剂，例如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。具有荧光素标记物的缀合物在这些偶联剂的存在下或通过与异氰酸盐反应来制备。在美国专利4,938,948号中，乳腺肿瘤的成像使用单克隆抗体来实现，可检测得到的成像部分使用连接剂例如对羟基苯甲亚胺酸甲酯或3-(4-羟基苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯结合到抗体。
在一些实施方案中，预期使用不改变抗体结合位点的反应条件通过在免疫球蛋白的Fc区域中选择性地引入巯基使免疫球蛋白衍生化。公开根据该方法生产的抗体缀合物以展示改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066号，通过引用并入本文)。效应物分子或报道分子的位点特异的附件也已经在文献中公开，其中报道分子或效应物分子偶连到Fc区域中的碳水化合物残基(O'Shannessy等，1987)。已经报道该方法生产在诊断和治疗方面有前景的抗体，其目前处于临床评价中。
在一些实施方案中，抗SpA的抗体连接到半导体纳米晶，例如美国专利6,048,616号、5,990,479号、5,690,807号、5,505,928号、5,262,357号(其全部完整地并入本文)以及PCT公开99/26299号(1999年5月27日公开的)中所述的那些。特别地，在生物和化学分析中用作半导体纳米晶的示例性材料包括但不限于上述那些，包括II-VI族、III-V族和IV族半导体，例如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、Ge和Si及其三元或四元混合物。美国专利6,630,307号和6,274,323号中描述了用于将半导体纳米晶连接到抗体的方法。
III.核酸
在一些实施方案中，有对本文所述的蛋白质、多肽或肽编码的重组多核苷酸。预期的多核苷酸序列包括对SpA的抗体或其SpA结合部分编码的那些。
如在本申请中所使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或已经从总的基因组核酸中分离的核酸分子。包括在术语“多核苷酸”内的是寡核苷酸(在长度上具有100个或更少的残基的核酸)，重组的载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、病毒等。在一些方面，多核苷酸包括基本上从其天然存在的基因或蛋白编码序列中分离出来的调控序列。多核苷酸可以是单链的(编码或反义的)或双链的，并可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但是不必存在于多核苷酸内。
在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用来指对蛋白质、多肽或肽编码的核酸(包括适当的转录、转译后改性或定位所需要的任何序列)。如本领域技术人员会理解的，该术语包括基因组序列、表达盒、cDNA序列、和表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、域、肽、融合蛋白和突变体的更小的改造核酸节段。对多肽的全部或部分编码的核酸可以含有对这种多肽的全部或部分编码的连续核酸序列。还预期特定的多肽可以由核酸进行编码，所述核酸含有具有稍微不同的氨基酸序列的变化但是对相同或基本上相似的蛋白质编码(参见上文)。
在具体的实施方案中，有分离的核酸节段和包含核酸序列的重组载体，所述核酸序列对与SpA结合的多肽(例如抗体或其片段)编码。术语“重组的”可以与多肽或特异性多肽的名字一起使用，这通常是指由已经在体外操作的核酸分子或为这种分子的复制产物的核酸分子所生产的多肽。
不考虑编码序列本身的长度，核酸节段可以与其他核酸序列如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码节段等组合使用，使得其总长度可以明显地变化。因而预期可以采用几乎任何长度的核算片段，其中总长度优选地由制备以及在计划的重组核酸方案中使用的简便性来限制。在一些情况中，核酸序列可以利用额外的异源的编码序列对多肽序列编码，例如以提供多肽的纯化、转运、分泌、转译后修饰，或提供治疗益处，例如靶向或功效。如以上所讨论的，标记或其他异源的多肽可以添加到经改性的多肽编码序列，其中“异源的”是指与经改性的多肽不相同的多肽。
在一些实施方案中，有与本文所公开的序列具有基本同一性的多肽变异体；使用本文所述方法(例如使用标准参数的BLAST分析)与本文所提供的多核苷酸序列相比，包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高（包括其间的所有值和范围）的序列同一性的那些。在一些方面，分离的多核苷酸会包含对多肽编码的核苷酸序列，所述多肽在序列的整个长度上与本文所述的氨基酸序列具有至少90%、优选95%及更高的同一性；或包含与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
A.载体
多肽可以由核酸分子进行编码。核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”用来指运载体核酸分子，异源的核酸序列可以插入到所述运载体核酸分子中用于引入到细胞中，在细胞中其可以被复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，这表示其处于与其中引入载体的细胞不同的环境中，或与其中并入所述核酸序列的核酸不同的环境中，其包含与细胞中或核酸中而不是在通常未发现其的宿主细胞或核酸内的位置中的序列同源的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员会能够通过标准重组技术(例如Sambrook等，2001；Ausubel等，1996，两者都通过引用并入本文)来构件载体。载体可以在宿主细胞中使用以生产结合SpA的抗体。
术语“表达载体”是指含有对能够被转录的基因产物的至少部分编码的核酸序列的载体。在一些情况中，RNA分子然后转译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以含有各种“控制序列”，所述“控制序列”是指在特定宿主生物中有效连接的编码序列的转录和可能的转译所需要的核酸序列。除了管理转录和转移的控制序列之外，载体和表达载体还可以含有具有其他功能的核酸序列，并且在本文中进行描述。
“启动子”是控制序列。启动子一般是核酸序列的控制转录的启动和速度的区域。其可以含有遗传因子，在所述遗传因子处调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。短语“有效地放置”、“有效地连接”、“处于控制之下”和“处于转录控制之下”表示启动子处于正确的功能定位和/或关于核酸序列的取向中，以控制转录启动和序列的表达。启动子可以或不可以与“增强剂”一起使用，所述“增强剂”是指涉及核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
认为用于控制对肽或蛋白质编码的多核苷酸的表达的特定的启动子不是决定性的，只要其能够在靶向细胞，优选细菌细胞中表达多核苷酸。当靶向人类细胞时，优选将多核苷酸编码区与启动子相邻放置，并处于启动子的控制之下，所述启动子能够在人类细胞中被表达。一般而言，这种启动子可以包括细菌、人类或病毒的启动子。
编码序列的有效转译还可以需要特定的启动信号。这些信号包括ATG启动密码子或相邻的序列。可以需要提供外源转录控制信号，包括ATG启动密码子。本领域技术人员会容易地能够确定这点，并提供必需的信号。
载体可以包含多克隆位点(MCS)，其为含有多个限制酶位点的核酸区域，所述多个限制酶位点中的任何一个可以与标准重组技术一起使用来消化载体。(参见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998和Cocea，1997，通过引用并入本文。)
大多数转录的真核RNA分子会经历RNA剪接以从初级转录物中移除内含子。含有基因组真核序列的载体可以需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白表达的转录物的适当加工。(参见Chandler等，1997，通过引用并入本文。)
载体或构造通常会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由涉及由RNA聚合酶造成的RNA转录物的特定终止的DNA序列构成。因此，在一些实施方案中，预期终止生产RNA转录物的终止信号。终止子可以是在体外必需的以实现期望的信使水平。在真核系统中，终止子区域还可以包含特定的DNA序列，其允许新转录物的位点特异裂解以暴露多腺苷酸化位点。这给专门的外源聚合酶发信号以将一段约200个A残基(polyA)添加到转录物的3'端。用该polyA尾部改性的RNA分子看起来更稳定，并且可以更有效率地转译。因此，在其他涉及真核生物的实施方案中，优选地终止子包含用于RNA裂解的信号，更优选地终止子信号促进信使的多腺苷酸化。
在表达，特别是真核表达中，一般会包含多腺苷酸化信号以产生转录物的适当多腺苷酸化。
为了在宿主细胞中繁殖载体，其可以包含一个或更多个复制位点起点(常被称为“ori”)，所述复制位点起点为复制启动位置的特定核酸序列。或者，当宿主细胞是酵母时，采用自主复制序列(ARS)。
B.宿主细胞
如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可以互换地使用。所有这些术语还包括其后代，所述后代是任何及全部后代。应理解全部后代由于有意或无意的突变可以不相同。在表达异源核酸序列的情况下，“宿主细胞”是指原核细胞或真核细胞，且其包括能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。宿主细胞可以并且已经用作载体或病毒的受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指通过其将外源核酸，例如重组蛋白编码序列转移或引入到宿主细胞的过程。转化的细胞包括初级受试细胞及其后代。
一些载体可以采用允许其在原核细胞和真核细胞两者中被复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员会进一步理解培养所有上述宿主细胞以维持它们并允许载体复制的条件。还应理解和知道会允许载体的大规模生产以及由载体编码的核酸及其同源多肽、蛋白质或肽的生产的条件。
C.表达系统
存在大量的表达系统，其包含上述组合物的至少部分或全部。可以采用基于原核的和/或真核的系统用于实施方案以生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白质和肽。许多这类系统是可商购的或可容易获得的。
昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸节段的高水平的蛋白表达，例如在美国专利5,871,986、4,879,236中所述的，两者都通过引用并入本文，且所述系统可以例如从以名称2.0购得和从以名称BACPACKTM杆状病毒表达系统购得。
除了所公开的表达系统之外，表达系统的其他实例包括的COMPLETE CONTROLTM可诱导的哺乳动物表达系统，其涉及合成蜕皮素可诱导受体或其pET表达系统，一种大肠杆菌表达系统。可诱导的表达系统的另一实例可从获得，其携带T-REXTM(四环素调节表达)系统，一种使用全长CMV启动子的可诱导的哺乳动物表达系统。还提供叫做甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，其设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中重组蛋白的高水平生产。本领域技术人员会知道如何表达载体，例如表达构造，以生产核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
D.基因转移的方法
认为用于核酸递送以有效表达组合物的合适方法实际上包括通过其可以将核酸(例如DNA，包括病毒载体和非病毒载体)引入到细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文所述的或如本领域普通技术人员会知道的。这类方法包括但不限于DNA的直接递送，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每一个都通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253号，通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE葡聚糖然后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；通过微粒轰击(PCT公开WO94/09699号和95/06128号；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，每一个都通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利5,302,523和5,464,765,每一个都通过引用并入本文)；通过农杆菌（Agrobacterium）介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055,每一个都通过引用并入本文)；或通过PEG介导的原生质体的转化(Omirulleh等，1993；美国专利4,684,611和4,952,500,每一个都通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)。通过诸如这些的技术的应用，可以持久地或暂时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
IV.处理的方法
如以上所讨论的，使用这些组合物的组合物和方法可以处理具有、疑似具有感染或相关疾病，特别是与葡萄球菌相关的那些，或者处于患上感染或相关疾病，特别是与葡萄球菌相关的那些的风险的受试者(例如限制细菌负荷或者脓肿形成或持续)。组合物的一种用途是通过在住院治疗前为受试者接种以预防医院内感染。
如本文所使用的，短语“免疫应答”或其等价物“免疫学应答”是指在受体患者中针对本发明的蛋白质、肽或多肽的免疫学应答(抗体介导的)、细胞应答(抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)或免疫学和细胞应答两者。处理或治疗可以是由免疫原的施用诱导的主动免疫应答或由抗体、含有抗体的材料或引发T细胞的施用造成的被动治疗。
如本文所使用的，“被动免疫”是指通过包括细胞介体或蛋白介体的免疫效应物(例如结合SpA蛋白的多肽)的施加而给予受试者的任何免疫。抗体组合物可以在用于预防或处理由携带抗体所识别的抗原的生物体造成的感染的被动免疫中使用。抗体组合物可以包含抗体或包含结合各种抗原的抗体CDR域的多肽，其可以与各种生物体缔合。抗体组分可以是多克隆抗血清。在一些方面，从已经用抗原攻击过的动物或第二受试者中亲和性纯化抗体。或者，可以使用抗体混合物，其为在相同的、相关的或不同的微生物或生物体，例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，包括但不限于葡萄球菌细菌中存在的抗原的单克隆抗体和/或多克隆抗体的混合物。
可以通过对患者施用从具有已知免疫反应性的供体或其他非患者源中获得的免疫球蛋白(Ig)或其片段和/或其他免疫因子来给予患者或受试者被动免疫。在其他方面，可以对受试者施用抗原的组合物，所述受试者然后作为球蛋白的来源或供体，所述球蛋白是响应来自组合物的攻击而产生的(“超免疫球蛋白”)，其含有针对葡萄球菌或其他生物体的抗体。如此处理的受试者会捐献血浆，然后会经由传统的血浆分离方法从所述血浆中获得超免疫球蛋白，并对另一受试者施用，以给予对葡萄球菌感染的抗性或者处理葡萄球菌感染。超免疫球蛋白对于缺乏免疫的个体，对于经受侵入性过程的个体特别有用，或者对时间不允许个体响应疫苗接种生产其自身抗体的情况特别有用。关于与被动免疫相关的示例性方法和组合物，参见美国专利6,936,258、6,770,278、6,756,361、5,548,066、5,512,282、4,338,298和4,748,018，其每一个都通过引用完整地并入。
对于本说明书和所附权利要求，术语“表位”和“抗原决定因子”可互换地使用，用来指抗原上B细胞和/或T细胞响应或识别的位点。B细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位一般用变性溶剂处理时失去。表位一般在独特空间构型中包含至少3个，更通常地至少5个或或8到10个氨基酸。确定表位的空间构型的方法包括在Epitope Mapping Protocols(1996)中所述的那些方法。T细胞识别CD8细胞的约9个氨基酸或CD4细胞约13到15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可以通过体外分析来鉴定，所述体外分析测量抗原决定的增殖，如通过响应表位由激活的T细胞引发的3H-胸苷并入(Burke等，1994)，通过抗原决定的杀灭(细胞毒性的T淋巴细胞分析，Tigges等，1996)，或通过细胞因子分泌所确定的。
细胞介导的免疫学应答的存在可以通过增殖分析(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒性的T淋巴细胞)分析来确定。体液应答和细胞应答对免疫原的保护性或治疗性效果的相应贡献可以通过分别从免疫同源动物中分离IgG和T细胞并测量在第二受试者中的保护性或治疗性效果来区分。如本文和权利要求中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可以互换地使用。
任选地，抗体或优选地抗体的免疫学部分可以与具有其他蛋白质的融合蛋白化学缀合，或表达为具有其他蛋白质的融合蛋白。为了本说明书和所述的权利要求，所有这类融合的蛋白质都包含在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。
在一个实施方案中，方法包括对由葡萄球菌病原体导致的疾病或病症的处理。在一些方面，实施方案包括处理葡萄球菌感染，例如医院获得的医院内感染的方法。在一些实施方案中，处理在葡萄球菌抗原的存在下施用。此外，在一些实施例中，处理包括施用针对细菌感染常用的其他试剂，例如一种或更多种抗生素。
治疗组合物以与剂型相容的方式和会治疗有效的量来施用。所施用的量取决于待处理的受试者。需要施用的活性成分的精确的量取决于医师的判断。用于最初施用和增效的合适方案也是可变的，但是典型的是最初施用然后是后续施用。
应用的方式可以大范围地变化。用于施用多肽治疗剂的任何传统方法都是可适用的。认为这些包括在固体生理可接受载体上或在生理可接受分散体中的经口应用、肠胃外的、通过注射等。组合物的剂量会取决于施用的途径，并会根据受试者的大小和健康而改变。
在一些实例中，期望具有组合物的多重施用，例如2、3、4、5、6或更多施用。施用可以是以1、2、3、4、5、6、7、8到5、6、7、8、9、10、11、12十二周时间为间隔，包括其间所有范围。
A.抗体和被动免疫
一些方面涉及制备用于预防或处理葡萄球菌感染的抗体的方法，包括利用疫苗使受体免疫和从受体分离抗体或生产重组抗体的步骤。另一方面是通过这些方法制备并用于处理或预防葡萄球菌感染的抗体。另一方面是包含特异性结合SpA的抗体和药物可接受载体的药物组合物，其可以在用于处理或预防葡萄球菌疾病的药物的制造中使用。另一方面是用于处理或预防葡萄球菌感染的方法，其包括对患者施用有效量的药物制剂。
用于多克隆抗体生产的接种物一般通过将抗原组合物(例如肽或抗原或SpA的表位或其共有部分)分散在生理可容忍的稀释剂，例如生理盐水或适合于人类使用的其他佐剂中以形成水性组合物来制备。对哺乳动物施用免疫刺激量的接种物，然后接种过的哺乳动物维持足以使抗原组合物诱导保护性抗体的一段时间。抗体可以通过众所周知的技术，例如亲和色谱分离到期望的程度(Harlow和Lane，Antibodies:A LaboratoryManual1988)。抗体可以包含来自各种常用动物，例如山羊、灵长动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人的抗血清制剂。对动物抽血并进行血清恢复。
抗体可以包含整个抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何种类(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的整个免疫球蛋白、嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体或具有对两个或更多个抗原的双特异性的杂交抗体。它们还可以是片段(例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv等，包括杂交的片段)。抗体还包括天然的、合成的或基因改造的蛋白质，其通过以足够的亲和性与特异性抗原结合来表现得像抗体。
可以对受体施用疫苗，所述受体然后作为抗体的来源，所述抗体响应来自特异性疫苗的攻击而产生。如此处理的受试者会捐献血浆，会经由传统的血浆分离方法从所述血浆中获得抗体。会对相同或不同的受试者施用分离的抗体，以给予对葡萄球菌感染的抗性或处理葡萄球菌感染。抗体对于处理或预防婴儿、缺乏免疫的个体的葡萄球菌疾病特别有用，或对需要处理但是个体没时间产生对疫苗接种的响应的情况特别有用。
另外的方面是药物组合物，其包含与致免疫组合物的至少两种成分反应的两种或更多种抗体或单克隆抗体(或其片段；优选地人类或人源化的)，其可以用于处理或预防由革兰氏阳性菌，优选葡萄球菌，更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌造成的感染。
B.组合疗法
组合物和相关方法，特别是结合SpA或肽或其共有肽的抗体对患者/受试者的施用还可以与传统治疗的施用组合使用。这些包括但不限于抗生素，例如链霉素、环丙沙星、强力霉素、庆大霉素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲噁唑、氨苄西林、四环素或各种抗生素的组合的施用。
在一个方面，预期治疗与抗菌处理一起使用。或者，治疗可以以在数分钟到数周的时间范围内的时间间隔在其他试剂处理之前或之后。在实施方案中，当其他试剂和/或蛋白质或多核苷酸分别施用时，通常会确保在各次递送的时间之间不经过明显的时段，使得治疗组合物会一直能够发挥对受试者有利的组合效果。在这类情况下，预期可以在彼此的约12到24小时内,更优选地在彼此的约6到12小时内施用两种用药程式。在一些情形中，期望明显地延长用于施用的时段，然而，其中在各自的施用之间经过数天(2、3、4、5、6或7)或数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以采用治疗的各种组合，例如抗生素治疗为“A”，包括结合SpA或肽或其共有肽的抗体的抗体治疗为“B”：
对患者/受试者施用抗体组合物会遵循用于施用这类化合物的一般方案，如果有的话考虑组合物的毒性。预期如果需要会重复处理周期。还预期各种标准的治疗，例如水疗可以与所述治疗组合施用。
C.一般药物组合物
在一些实施方案中，对受试者施用药物组合物。不同的方面可以涉及对受试者施用有效量的组合物。在一些实施方案中，可以对患者施用结合SpA或肽或其共有肽的抗体以防止或处理由来自葡萄球菌属的一种或更多种细菌的感染。或者，可以将对一种或更多种这类抗体或多肽或肽编码的表达载体给予患者作为预防性处理。另外，这类组合物可以与抗生素组合施用。这类组合物通常会溶解于或分散于药物可接受的载体或含水介质。
短语“药物可接受的”或“药理可接受的”是指当对动物或人类施用时不产生副作用、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药物可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这种介质和试剂的使用在本领域中是已知的。除非传统介质或试剂与活性成分不相容，否则预期其在致免疫和治疗的组合物中的使用。补充活性成分，例如其他抗感染剂和疫苗，也可以并入到组合物中。
活性化合物可以配制用于肠胃外施用，例如配制用于经由静脉内、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径的注射。一般地，这类组合物可以制备为液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前添加液体来制备溶液或悬浮液的固体形式；并且还可以乳化制剂。
适合于可注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是一定程度上可以容易地注射的流体。其还应是在制造和储存的条件下稳定的，并且必须在防微生物，例如细菌和真菌的污染作用的条件下保存。
蛋白质组合物可以配制为中性或盐的形式。药物可接受的盐，包括酸加成盐(利用蛋白质的自由氨基形成)，其利用无机酸，例如盐酸或磷酸，或有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离的羧基形成的盐还可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组胺酸、普鲁卡因等。
药物组合物可以包含溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以通过以下方式来保持适当的流动性：例如通过使用包被，例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持需要的粒径，和通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来实现。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌的可注射溶液通过以下方法来制备：在适当溶剂中将活性化合物以所需量与以上列举的各种其他成分合并，如果需要的话然后进行过滤杀菌或等效的过程。通常，分散体通过将将各种无菌的活性成分并入到无菌载剂中来制备，所述无菌载剂含有基本的分散介质和选自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分和任何额外的期望成分的粉末，所述额外的期望成分来自其预先无菌过滤的溶液。
组合物的施用一般会经由各种常用途径。这包括但不限于经口、经鼻或口腔含化的施用。或者，施用可以通过正位的、真皮内的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的、鼻内的或静脉内的注射。在一些实施方案中，可以吸入疫苗组合物(例如美国专利6,651,655，其通过引用特别地并入)。这类组合物通常会以药物可接受的组合物施用，所述药物可接受的组合物包含生理可接受的载体、缓冲剂或其他赋形剂。
基于预期的目标来确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理分离的单位，各单位含有结合其施用，即适当途径和方案计算以产生上述期望的响应的预定量的组合物。待施用的量，根据处理的数量和单位剂量两者，取决于期望的保护。
组合物的精确量还取决于医师的判断，并且对每一个体都是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、施用的途径、处理的预期目标(症状的缓和相对于治愈)和效力、稳定性以及特定组合物的毒性。
在配制后，溶液会以与剂型相容的方式和以治疗或预防上有效的量来施用。以各种剂型，例如上述可注射溶液的类型容易地施用制剂。
V.实施例
以下实施例为说明各种实施方案的目的给出，并非意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易地理解本发明很好地适合于实现目的并获得所提及的结果和优点，以及其中固有的目的、结果和优点。本发明的实施例，连同本文所描述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，并非意在限制本发明的范围。本领域技术人员会想到如由权利要求的范围所限定的涵盖在本发明精神之内的其他用途和其中的变化。
实施例1
金黄色葡萄球菌蛋白A的单克隆抗体
SpAKKAA-mAb保护小鼠免于由葡萄球菌引起的疾病。BALB/c小鼠采用初免-加强免疫方案使用经纯化的SpAKKAA来免疫，并且抗原特异性IgG应答通过ELISA来量化。使动物安乐死，并将它们的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。筛选所得的杂交瘤以制备抗原-特异性mAb。最初，利用功能试验以及鼠感染模型筛选蛋白A-特异性mAb(表1)。在初步筛选之后，选择三种mAb(5A10、3F6和3D11)用于进一步表征，这是因为这些抗体在每个同种型组中都表现出最好的免疫防护(表1)。BALB/c小鼠用经亲和纯化的mAb进行免疫(5mg·kg -1体重)，并通过将1×107CFU金黄色葡萄球菌Newman，－种对甲氧西林敏感的临床分离物(MSSA)(Baba等人，2007)注射到右眼的眶周静脉窦内进行攻击。攻击后四天通过组织病理切片检查葡萄球菌在肾组织内生长脓肿的能力(表1)。在对照小鼠(用5mg·kg-1同种型对照mAb进行免疫)的经均质化的肾组织中，得到5.02log10CFU·g-1(IgG1)、4.64log10CFU·g-1(IgG2a)和5.24log10CFU·g-1(IgG2b)平均葡萄球菌负荷(表1)。与经同种型mAb处理的对照组相比，接受蛋白A特异性mAb的动物表现出葡萄球菌负荷的降低[2.80log10CFU·g-1(5A10)、2.28log10CFU·g-1(3F6)和2.72log10CFU·g-1(3D11)]以及脓肿形成的减少(表1)。值得注意的是，不是所有SpAKKAA-mAb都对由葡萄球菌引起的疾病产生防护(表1)，尽管这些抗体以相当大的亲和性与它们的抗原结合(参见例如表3中的3A6和6D11)。
表1用SpAKKAA的单克隆抗体对小鼠被动免疫
SpAKKAA-mAbb保护小鼠免受MRSA攻击。用mAb5A10、3F6、3D11(5mg·kg-1)或这三种mAb的组合(15mg·kg-1)对BALB/c小鼠群组进行免疫，并用菌株MW2，一种社区获得性剧毒MRSA分离物(Baba等人，2002)进行攻击。与经同种型mAb处理的对照组相比，接受这三种mAb(5A10、3F6、3D11)中任一种的动物在肾组织中携带减少的细菌负荷和较少的由葡萄球菌引起的脓肿(表2)。用这三种mAb的混合物(15mg·kg-1)免疫的动物表现出甚至更大的葡萄球菌负荷的减少(减少2.03log10CFU·g-1；P<0.0002)和脓肿形成的减少(疫苗相对于模拟物，P<0.0004)。保护增强很可能是由于施用的mAb的浓度增加(15mg·kg-1相对于5mg·kg-1)。我们得出该假设，是因为这三种抗体虽然识别相似的结构特征，但是看起来似乎没有占据SpA上的相同结合位点(见下文)。另外，增加这三种mAb中的仅一种(3F6)的浓度产生相同效果：对增强由葡萄球菌引起的疾病的防护增强(见下文)。
除了对葡萄球菌的攻击提供即时防护之外，SpAKKAA-特异性mAb还可以抵消SpA的B-细胞超抗原活性(Goodyea和Silverman，2003)，由此使被感染的宿主能够对许多不同的葡萄球菌抗原产生抗体应答(Kim等人，2010a)。为了检验这种可能性，用mAb3F6或其IgG2a同种型对照物(20mg·kg-1)对BALB/c小鼠进行被动免疫，然后用金黄色葡萄球菌MW2进行静脉内攻击。攻击后十五天，使动物安乐死并检查器官组织中的葡萄球菌负荷(图1A)。用mAb3F6免疫的小鼠携带减少的葡萄球菌负荷(减少4.77log10CFU·g-1，P=0.0013)和减少的脓肿数量[从10.14(±2.08)(IgG2a)到3.00(±1.00)(3F6)，P=0.0065；图1A]。检查攻击后15天抽取的血液样品对十四种葡萄球菌抗原的血清IgG反应性：Coa、ClfA、ClfB、EsxA、EsxB、FnBPA、FnBPB、Hla、IsdA、IsdB、LukD、SdrD、SpAKKAA和vWbp(DeDent等人，2012)，这十四种葡萄球菌抗原考虑作为用于疫苗开发的保护性抗原。如之前使用主动接种SpAKKAA的动物所观察到的，用mAb3F6免疫的小鼠对几种不同的葡萄球菌抗原发展出较高的血清IgG滴度(图1B)(Kim等人，2010a)。特别地，与对照群组相比，经mAb3F6免疫的动物的血清样品中对Coa、ClfA、EsxA、EsxB、FnBPB、Hla、IsdA、LukD、SdrD和vWbp的IgG水平提高。然而，对IsdB(葡萄球菌血红蛋白载体(Mazmanian等人，2003))的血清IgG没有提高(图1B)。在mAb3F6被动转移后，对SpAKKAA的IgG滴度维持十五天(图1B)。
在葡萄球菌引起感染期间，预期可溶的SpA被mAb3F6识别以形成免疫复合物(IC)，该免疫复合物然后被免疫细胞吞噬。被吞噬的SpA然后被吞噬溶酶体中的蛋白酶处理，肽片段提呈给T细胞和B细胞以产生多克隆抗体。作为验证试验，动物群组在mAb3F6或其同种型对照物的存在下在第0天和第11天接受经亲和纯化的重组蛋白A变异体[SpA、SpAKK、SpAAA、SpAKKAA和模拟物(PBS)]的混合物。在第21天，使动物安乐死，并通过ELISA测量它们的引出不同种类SpA-特异性抗体的能力。所有未经mAb处理的动物都不能产生SpA-特异性抗体应答(图6)。另外，接受B细胞超抗原(SpA和SpAKK；见下文)的动物即使在mAb3F6存在下也未能产生SpA-特异性IgG1和IgG2a抗体(图6)。然而，用缺乏B细胞超抗原活性的SpA变异体(SpAAA和SpAKKAA；见下文)处理过的小鼠能够产生显著量的IgG1(图6)。虽然感染期间可溶蛋白A的估计量(每107CFU，5～10ng)远低于在这些实验中注入到动物体内的经亲和纯化的蛋白A的剂量，但是图6中的数据表明SpA-特异性T/B细胞在抵消B细胞超抗原活性中的潜在作用。综合考虑，发明人推测主动接种SpAKKAA(Kim等人，2010a)，但是未利用抵消mAb使被金黄色葡萄球菌感染的小鼠被动免疫(见下文)可以提高蛋白A-特异性抗体的显著水平。
表2用SpAKKAA-mAb免疫保护小鼠免于MRSA攻击
mAb Spa27不能识别SpAKKAA，因此不能引出小鼠中的保护性免疫。Spa27是一种市售的蛋白A-特异性单克隆抗体(Sigma)，其在过去的二十年间一直用于检测葡萄球菌蛋白A(Perry等人，2002)。Spa27杂交瘤得自已经用纯化自金黄色葡萄球菌菌株Cowan I的野生型葡萄球菌蛋白A免疫的小鼠(Sjoquist等人，1972)。之前的工作显示野生型蛋白A引发B细胞群的克隆扩增和皱缩(Forsgren等人，1976；Goodyear等人，2003)，由此阻止小鼠中蛋白A-特异性免疫应答(Goodyear等人，2004)，还显示野生型蛋白A包含Fcγ和Fab VH3的结合位点(Graille等人，2000；Stahlenheim等人，1970)。因此，我们想知道Spa27是否将野生型蛋白A识别为抗原。为了解决这个问题，我们利用ELISA使用经纯化的重组蛋白A(SpA)、或者其缺乏特异性结合Fcγ(SpAKK)、VH3的Fab域(SpAAA)或二者(SpAKKAA)的能力的变异体(图7)。数据显示Spa27强力结合到野生型SpA和SpAKK，但不结合到SpAAA或SpAKKAA(图9B)。Spa27是一种小鼠IgG1同种型抗体，这解释了其不能经由Fcγ结合蛋白A(Kronvall等人，1970)。Spa27和SpAAA或SpAKKAA之间弱的缔合可能是由于看起来可能性极小的SpA27需要五个IgBD的每一个中的残基D36/D37来识别抗原，或者对于我们来说更可能的Spa27经由其Fab域结合SpA，假设该抗体属于VH3或相关种类的抗体。
为了成对比较，我们通过将mAb3F6或者Spa27(5mg·kg-1)注射到BALB/c小鼠的腹膜腔内来检查Spa27的生物学功能。然后用在美国流行的社区获得性剧毒MRSA菌株(Diep等人，2006)，金黄色葡萄球菌USA300(LAC)来攻击这些动物。在攻击后第4天，使动物安乐死，并确定被感染的动物肾中的细菌负荷(图9B)。与模拟物(PBS)处理相比，接受mAb3F6的动物携带减少的细菌负荷(减少1.38log10CFU·g-1，P=0.0011)。与由3F6所引出的保护性免疫对比，mAb Spa27不能减少被感染的动物肾中的细菌负荷(减少0.20log10CFU·g-1，P=0.2111)。这些数据表明mAb Spa27不能对由葡萄球菌引起的疾病提供防护。另外，Spa27的实验说明用野生型蛋白A使小鼠免疫可能不会引出可以通过结合作为抗原的该分子的蛋白A的免疫调节属性的单克隆抗体。
通过mAb识别SpAKKAA。用SpAKKAA涂覆微量滴定盘，并利用ELISA确定经纯化的mAb的亲和常数(Ka=[mAb·Ag]/[mAb]×[Ag])。mAb3F6表现出最高的亲和性(Ka22.97×109M-1)，其次是mAb5A10(Ka8.47×109M-1)和mAb3D11(Ka3.93×109M-1，表3)。单独检查五个IgBD的每一个(EKKAA、DKKAA、AKKAA、BKKAA和CKKAA)或者检查包含IgBD EKKAA域的螺旋1、2或3以及螺旋1+2和2+3的肽的抗体结合(表3)。mAb5A10和mAb3F6以与SpAKKAA相同的亲和性结合所有五个IgBD。mAb5A10不能结合到螺旋肽，而mAb3F6对螺旋1+2肽表现出弱的亲和性。mAb3D11结合到BKKAA和CKKAA，弱结合到AKKAA，不能结合到EKKAA和DKKAA。总之，对小鼠中由葡萄球菌引起的疾病起到最高水平防护作用的SpAKKAA-mAb结合五个IgBD中的一些或全部，但是不结合仅包含IgBD的三个螺旋中的一个或两个的肽。这些数据表明保护性mAb识别每个IgBD的三个螺旋束的构象表位。
为了检查mAb的亲合力在免疫防护中是否起到显著作用，在增加离液试剂硫氰酸铵的浓度的情况下实施ELISA(图2)。测得的mAb3F6的亲合力明显高于mAb5A10和mAb3D11的亲合力(图2)。值得注意的是，3D11表现出相对低的亲合力，这可能是由于其仅与五个IgBD中的两个具有特异性相互作用(图2和表3)。由此我们可以推断mAb的亲合力可能不是它们对小鼠免疫防护的主要决定性因素。
美国专利申请公开US2008/0118937和US2010/0047252描述了一种鼠杂交瘤细胞系，其得自用野生型蛋白A免疫后的小鼠。据报道相应的抗体mAb358A76.1.1与野生型蛋白A缔合；然而，还没有揭示该缔合的分子特性。为了进一步探究B细胞对野生型蛋白A应答的特性，分离mAb358A76.1.1并研究其功能属性。与SpAKKAA-mAb不同，358A76.1抗体仅结合到SpA的E域，而不能结合到其他四个IgBD(D、A、B和C)中的任一个。此外，mAb358A76.1既不抵消蛋白A也不促进葡萄球菌的调理吞噬杀灭，mAb358A76.1的被动转移不能保护小鼠免于由金黄色葡萄球菌引起的疾病。
单克隆抗体358A76.1仅弱结合到SpA的E域。为了确定mAb358A76.1结合到蛋白A的亲和常数(Ka=[mAb·Ag]/[mAb]×[Ag])，用SpAKKAA、各IgBD(EKKAA、DKKAA、AKKAA、BKKAA或CKKAA)以及包含EKKAA三个螺旋束的各螺旋(H1、H2、和H3)或两个螺旋(H1+2和H2+3)的合成肽来涂覆微量滴定板。mAb3F6是由SpAKKAA得到的小鼠单克隆抗体，对全长度SpAKKAA(Ka22.97×109M-1)和五个IgBD的每一个(Ka12.41-27.46×109M-1)都具有高亲和性。与mAb3F6相比，mAb358A76.1对SpAKKAA表现出弱得多的亲和性(Ka1.00×109M-1，图10A-B)。值得注意的是，mAb358A76.1仅结合到EKKAA(Ka0.21×109M-1)，而不能结合到其他四个IgBD的任一个(DKKAA、AKKAA、BKKAA或CKKAA，表6)。此外，mAb358A76.1不能识别包含EKKAA IgBD的一个或者两个螺旋(H1、H2、H3、H1+2、和H2+3)的合成肽的任一种。比较而言，mAb3F6对螺旋1+2肽表现出弱的亲和性(表6)。所有五个IgBD的氨基酸序列的比对全部显示E域是最不相似的域(Sjodahl，1977)。然而，E域，就像其他四个IgBD一样，与人和动物免疫球蛋白缔合，还没有注意到其不相似性的重要性(Moks等人，
1986)(图10C-D)。mAb358A76.1可以特异性地结合包含E域的螺旋1和3的非保守氨基酸的构象表位(图10C-D)。
为了检查mAb3F6和358A76.1是否共享SpAKKAA(EKKAA)上的表位结合位点，我们采用增加浓度的IgG2a同种型对照物、mAb358A76.1或者mAb3F6实施竞争ELISA。在30μg·ml-1浓度下，同种型对照抗体(IgG2a)不妨碍HRP-缀合的mAb358A76.1或者mAb3F6结合到SpAKKAA(图10E)。如所预期的，mAb358A76.1与HRP-缀合的mAb358A76.1竞争结合到SpAKKAA，然而它不妨碍HRP-缀合的mAb3F6的结合(图10E)。值得注意的是，mAb3F6能够完全阻止HRP-缀合的mAb358A76.1缔合到SpAKKAA(96.4%的抑制，图10E)，而mAb358A76.1仅产生88.0%的抑制(mAb3F6相对于mAb358A76.1，P=0.0007)。
单克隆抗体358A76.1不会引起小鼠的保护性免疫。将5mg·kg-1mAb358A76.1或者mAb3F6注射到BALB/c小鼠群组的腹膜腔内。用在美国流行的社区有关的剧毒MRSA菌株(Diep等人，2006；Kennedy等人，2008)金黄色葡萄球菌USA300(LAC)攻击经被动免疫的动物。与经IgG2a同种型mAb处理的对照组相比，接受mAb3F6的动物在肾组织中携带减少的细菌负荷(减少1.26log10CFU·g-1；P=0.0021，图11A)。有趣地，接受mAb358A76.1的动物仅表现出小的细菌负荷减少，其未能获得统计显著性(减少0.42log10CFU·g-1；P=0.0948，图11A)。与mAb358A76.1相比，mAb3F6的被动转移在经免疫的小鼠中对CA-MRSA菌株USA300产生增加的防护(减少0.84log10CFU·g-1；P=0.0011，图11A)。
调理吞噬杀灭侵入的微生物是被感染宿主的关键防御方案，并且也代表许多不同细菌疫苗的保护性免疫的关联(Robbins等人，1987；Robbins等人，1990)。采用新鲜小鼠血液中调理吞噬杀灭的检测，我们寻求mAb358A76.1是否可以促进MRSA菌株USA300的调理吞噬杀灭。简单地，在10μg·ml-1mAb358A76.1、mAb3F6或mAb IgG2a同种型对照物的存在下或没有它们的情况下，用金黄色葡萄球菌USA300培养从首次接受试验的6周大的BALB/c小鼠获得的抗凝血液。溶解血液样品，铺在琼脂培养基上并计算葡萄球菌负荷。与使血液中葡萄球菌负荷减少49%的mAb3F6相比，mAb358A76.1和IgG2a对照物未能激活葡萄球菌的调理吞噬杀灭(mAb3F6相对于PBS，P<0.0001；mAb3F6相对于358A76.1，P=0.0007；图11B)。
在感染过程中，蛋白A与免疫球蛋白一起俘获并装饰葡萄球菌的表面。通过与免疫球蛋白的Fcγ域缔合，SpA阻止补体激活、Fc受体参与和吞噬细胞对葡萄球菌的调理作用。此外，从细菌表面释放的SpA分子交联VH3-型B细胞受体而激活淋巴细胞，最终导致它们凋亡并阻碍对葡萄球菌的适应性免疫应答的发展。我们使用ELISA来确定mAb358A76.1是否可以抵消蛋白A的免疫球蛋白结合活性。作为对照，在6μg·ml-1和30μg·ml-1下，mAb3F6抵消蛋白A结合人IgG结合的能力，而IgG2a同种型对照物mAb不会抵消(图11C)。此外，在6μg·ml-1或者30μg·ml-1的浓度下，mAb358A76.1不会阻止人IgG缔合到蛋白A(图11C)。
表6mAb358A76和mAb3F6结合到SpAKKAA及其片段的缔合常数
a横跨涂覆有抗原(对于SpAKKAA，20nM，对于IgG结合域，100nM)的ELISA板连续稀释经亲和纯化的抗体(100μg·ml-1)，以利用(GraphPad Software，Inc.)来计算缔合常数。为了研究抗体对蛋白A抗原的结合，我们使用在蛋白A的五个免疫球蛋白结合域(IgBD)的每一个[E(残基1-56)、D(残基57-117)、A(残基118-175)、B(残基176-233)和C(残基234-291)]中有四个氨基酸被替代的SpAKKAA变异体(携带六个N-末端组氨酸残基的成熟的SpA的残基1-291)。在每个IgBD中，谷氨酰胺在位置9和10(IgBD-E的氨基酸残基)处被赖氨酸(Q9K，Q10K)替代，天冬氨酸36和37被丙氨酸替代(D36A，D37A)。将相同替代引入到横跨各个IgBD:EKKAA、DKKAA、AKKAA、BKKAA和CKKAA(全部用六个N-末端组氨酸标签表达并纯化)的蛋白质。SpAKKAA和各个IgBD从大肠杆菌提取物通过亲和色谱纯化。肽H1、H2、H3、H1+2、和H2+3在肽合成仪上合成并经HPLC纯化。所述肽包含EKKAA IgBD(SpAKKAA的残基1-56：NH2-AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-COOH)三个螺旋束的螺旋1(H1:NH2-AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNA-COOH)、2(H2:NH2-NMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQ-COOH)、3(H3:NH2-AAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-COOH)、1+2(H1+2:NH2-AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQ-COOH)、或2+3(H2+3:NH2-NMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-COOH).b符号<表示测量结果过低而不允许缔合常数的测定。
mAb3F6结合Sbi。金黄色葡萄球菌的分泌蛋白Sbi由五个不同的域组成(Zhang等人，1998)。两个N-末端域(1和2)与SpA的IgBD同源(Zhang等人，1999)。域3和4与补体成分C3和因子H缔合，已经提出C-末端域通过结合到脂磷壁酸将一些分泌的Sbi分子保留在葡萄球菌的包膜内(Burman等人，2008；Smith等人，2012)。域1和2结合到免疫球蛋白的Fcγ部分(Atkins等人，2008)；这种活性，与域3和4的C3和因子H结合属性一致，促进流体补体成分的无用消耗(Haupt等人，2008)。Sbi看起来不会产生B细胞超抗原活性，这是因为其两个IgBD(域1和2)缺乏两个典型的在位置36和37处的天冬氨酸残基(Graille等人，2000；Lim等人，2011)。包含IgBD和补体结合域的重组蛋白His-Sbi1-4在亲和色谱实验中保留人IgG。His-Sbi1-4/KKAA是域1和2中的保守谷氨酰胺残基(Q51,52和Q103,104)，即所预测的Sbi IgBD的Fcγ结合位点被赖氨酸(K)替代且补体结合域的精氨酸(R231)和天冬氨酸(D238)残基被丙氨酸(A)替代的变异体(Haupt等人，2008)。His-Sbi1-4/KKAA在实施亲和色谱期间不保留人IgG。当通过ELISA检查时，His-Sbi1-4结合到小鼠以及人IgG并且结合到人IgG的Fc和Fab域，而His-Sbi1-4/KKAA不会这样。mAb5A10和mAb3D11不会结合到His-Sbi1-4/KKAA，然而3F6结合到该蛋白。因此，mAb3F6可以抵消Sbi或者从循环除去分泌Sbi，由此防止葡萄球菌消耗补体因子C3。
使用SpAKKAA-mAb的结合位点竞争实验。ELISA研究显示三种mAb5A10、mAb3F6和mAb3D11以相似的亲和性结合到野生型SpA(图3A)。与5A10相比，IgG1对照抗体表现出对SpA小的亲和性。另外，与mAb3D11的亲和性相比，IgG2b对照抗体的亲和性降低。与3F6相比，IgG2a对照抗体以稍微降低的亲和性结合SpA。在使用辣根过氧化物酶缀合的mAb(5A10-HRP、3F6-HRP和3D11-HRP)的竞争ELISA检测中，同种型对照抗体不妨碍HRP-缀合的mAb结合到SpA(图3B)。添加等摩尔量的每种mAb降低对应HRP-缀合物的结合(图3B)。mAb3D11不能阻止HRP-5A10或者HRP-3F6与SpA的缔合，然而mAb5A10和mAb3F6妨碍HRP-3D11结合到SpA。mAb3F6导致HRP-5A10结合到SpA的些许降低(图3B)。最后，mAb5A10是3F6-HRP结合到SpA的弱的竞争者(图3B)。这些数据表明三种mAb在SpA三螺旋束的表面上的结合位点可能是彼此靠近或者甚至部分重叠的(表3)。
SpAKKAA-mAb阻止免疫球蛋白与蛋白A缔合。同种VH3相关的家族(例如7183、J606和S107)的小鼠抗体通过它们的Fab部分结合SpA，而其他VH家族(J558、Q52、Sm7、VH10、VH11和VH12)的那些小鼠抗体不会结合SpA(Cary等人，1999)。SpAKKAA-特异性mAb的互补决定区(CDR)的氨基酸序列通过使来源于杂交瘤转录物的cDNA测序来确定。数据显示mAb5A10属于同种VH37183家族；其Fab域很可能显示出SpA亲和性(表4)。mAb3F6和mAb3D11分别是VH10和J558家族的成员(表4)；这些抗体家族的Fab域的与SpA的缔合是未知的。
表4单克隆抗体的CDR区的氨基酸序列
野生型SpA及其变异体SpAKKAA、SpAKK和SpAAA经纯化并与人IgG一起用于ELISA结合研究。如所预期的，SpA结合到IgG或其Fcγ和F(ab)2片段，而SpAKKAA不会(图7)。SpAKK变异体(10个谷氨酰胺残基全部被赖氨酸替代)结合到Fcγ片段的能力消弱，但结合到F(ab)2片段的能力没有消弱，而SpAAA变异体(10个天冬氨酸残基全部被丙氨酸替代)结合到Fcγ，但不结合F(ab)2(图7)。这三种mAb(5A10、3F6和3D11)全部以超过同种型对照mAb的竞争的方式阻止人IgG结合到SpA(图4A)。这三种抗体全部妨碍人IgG结合到SpAKK(Fab结合)或者SpAAA(Fab结合)(图4A)。因此，SpAKKAA-特异性mAb阻止SpA与免疫球蛋白的非免疫缔合。基于这些数据，我们推测蛋白A-特异性mAb与包含IgBD的螺旋2、Fcγ中所涉及的结构要素和SpA的Fab相互作用的构象表位相互作用。
如果mAb3F6结合葡萄球菌表面上作为抗原的野生型SpA，则其Fcγ域应可用于识别免疫细胞表面上的补体或者Fc受体。为了验证该预测，用3F6、其同种型对照物和经亲和纯化的Sbi1-4培养金黄色葡萄球菌。抗体介导的共沉淀导致上清液中可溶的Sbi1-4减少，其分析作为细菌表面上Fcγ位点可利用性的量度。用仅可以以非免疫方式与SpA缔合的对照mAb培养葡萄球菌导致可溶Sbi1-4中度的减少(图4B)。比较而言，用mAb3F6培养葡萄球菌使可溶Sbi1-4减少，表明mAb3F6结合细菌表面上的SpA抗原，同时呈现其Fcγ域与Sbi1-4缔合(图4B)。
为了测试mAb3F6结合到SpA是否确实是在体内发生，用mAb3F6或者同种型对照抗体对BALB/c小鼠进行免疫。在将经纯化的SpA注射到腹膜腔内之后，通过在第30分钟采集血液样品来评估其在循环中的丰度。与用对照mAb处理的动物相比，对经mAb3F6处理的动物的注射导致SpA从血流的清除加速(图4C)。推测mAb3F6对SpA的免疫识别提供其Fcγ域，以介导抗原-抗体复合物从血流的Fc-受体介导的去除。
SpAKKAA-mAb促进人和小鼠血液中葡萄球菌的调理吞噬杀灭。促进病原体的调理吞噬杀灭的引起适应性免疫应答是疫苗开发和许可的普遍目标(Robbins等人，1996)。这对于金黄色葡萄球菌来说尚未实现，这是因为这种病原体通过其表面暴露和分泌的SpA和Sbi分子来抵御调理抗体(Kim等人，2011)。为了测试SpAKKAA-mAb是否可以促进调理吞噬，采用由RebeccaLancefield开发的新鲜血液中细菌杀灭的检测(Lancefield，1928)。在2μg·ml- 1mAb5A10、mAb3F6和mAb3D11或它们的同种型对照物的存在下或者不存在它们的情况下，用MSSA菌株Newman培养来自首次接受试验的6周大的BALB/c小鼠的来匹卢定抗凝血液。溶解血液样品，铺在琼脂培养基上并计算葡萄球菌负荷(图5A)。全部三种mAb都引起葡萄球菌的调理吞噬杀灭，其范围从接种物的37%(3D11，P=0.0025)到33%(3F6，P=0.0478)和16%(5A10，P=0.0280)。作为用于人血液中葡萄球菌的调理吞噬杀灭的试验，发明人招募健康的人志愿者类并检查它们的血清的SpAKKAA抗体特异性。如之前所报道的，没有任何一个志愿者携带针对蛋白A的血清抗体(数据未示出)(Kim等人，2010a)。在10μg·ml-1mAb5A10、mAb3F6和mAb3D11或它们的同种型对照物的存在下或者不存在它们的情况下，用MSSA菌株USA400(MW2)培养抗凝的人新鲜血液样品(图5B)。全部三种mAb都引起葡萄球菌的调理吞噬杀灭，其范围从接种物的52%(3D11，P=0.0002)到44%(3F6，P=0.0001)和34%(5A10，P=0.0035)。将血液样品铺展在载玻片上，用Giemsa染色并通过显微镜分析。在mAb5A10、mAb3F6和mAb3D11的存在下培养的血液样品携带与中性粒细胞缔合的葡萄球菌，即它们可以与这些白细胞缔合或者位于细胞内(图5C-E)。用同种型对照mAb培养的血液样品携带细胞外的葡萄球菌（红色箭头）以及与白细胞缔合的葡萄球菌（蓝色箭头）的簇(图5F-H)。
讨论
单克隆抗体对研究微生物表面产物的体液适应性免疫应答的生物学属性提供独特的机会，显示微生物免疫逃避和保护性免疫的分子属性(Fischetti，1989)。例如，群A链球菌M蛋白，一种关键的致病因子和α-螺旋形卷曲螺旋表面蛋白(Phillips等人，1981)，赋予耐调理吞噬清除性，其可以在感染期间通过体液适应性免疫应答克服(Lancefield，1962；Scott等人，1986)。结合到M蛋白的α-螺旋形卷曲螺旋的mAb不能诱导群A链球菌的调理吞噬杀灭，然而其通过针对N-末端无规卷曲域的mAb来实现(Jones和Fischetti，1988；Jones等人，1986)。M蛋白的N-末端域在临床分离株之间是高度可变的，这代表类型特异性免疫的分子基础(Hollingshead等人，1987；Lancefield，1962)。
与链球菌M蛋白类似，蛋白A也起到金黄色葡萄球菌的保护性抗原的作用(Stranger-Jones等人，2006)。事实上，金黄色葡萄球菌的所有临床分离株都表达蛋白A，然而其IgBD的氨基酸序列是非常保守的(McCarthy和Lindsay，2010)。在小鼠或者人中葡萄球菌引起的感染不会引起蛋白A-特异性体液免疫应答(Kim等人，2010a)，这通过该分子的B细胞超抗原活性来解释(Silverman和Goodyear，2006)。用蛋白A变异体、特别是SpAKKAA分子免疫引起小鼠和兔子中的体液免疫应答；这些抗体与野生型蛋白A发生交叉反应并对小鼠中的由葡萄球菌引起的疾病提供防护(Kim等人，2010a)。当在抗凝小鼠血液中培养时，经亲和纯化的多克隆兔子抗体可以阻断小鼠中野生型蛋白A的B细胞超抗原活性，并增强小鼠中性粒细胞的调理吞噬能力。另外，缺乏蛋白A(spa)结构基因的金黄色葡萄球菌突变体表现出显著的致病缺陷，并且也允许对许多不同的葡萄球菌抗原的体液免疫应答的发展以及保护性免疫的发展(Cheng等人，2009；Kim等人，2011)。因此，抵消SpA的免疫-调节属性的抗体不仅可以提供对急性葡萄球菌感染的防护，而且可以使得对其他葡萄球菌抗原的保护性免疫应答能够发展并且预防复发的金黄色葡萄球菌感染。发明人通过提高mAb对抗SpAKKAA来验证该预测。引起小鼠中保护性免疫的所有单克隆抗体均识别蛋白A的构象表位并与其IgBD的三螺旋折叠相互作用。重要地，SpAKKAA的多个或全部IgBD的具有强亲和性和交叉反应性的这些单克隆抗体也识别野生型蛋白A。当在体外测试时，mAb，特别地mAb5A10、mAb3F6和mAb3D11阻止蛋白A与免疫球蛋白的Fcγ和Fab域缔合，并在小鼠和人血液中触发通过吞噬细胞的金黄色葡萄球菌的调理吞噬杀灭。当注入到小鼠的腹膜腔内时，mAb对MSSA和MRSA金黄色葡萄球菌分离株均引起有效的免疫防护。另外，SpAKKAA-mAb在体内介导的SpA的抵消刺激体液免疫应答对抗几种不同的金黄色葡萄球菌抗原，支持SpAKKAA-抗体抑制葡萄球菌的B细胞超抗原活性的假设。
值得注意的是，在被动免疫的小鼠中抗体对葡萄球菌抗原的应答的量值比在用SpAKKAA主动免疫的小鼠中引起的免疫应答低得多。主动免疫方案与被动免疫方案之间的主要差别在于控制宿主免疫应答的抗原特异性T/B细胞种群的发展，其是主动免疫方案的结果。保证进一步研究以确定蛋白A特异性T/B细胞在提高适当的全身免疫应答例如TH1/17介导的功能吞噬细胞对金黄色葡萄球菌感染的补充中是否是关键的(Spellberg等人，2012)。
之前的工作证明了小鼠中蛋白A对VH3-型B细胞受体的超抗原活性(Goodyear等人，2003)。值得注意的是，只有5-10%的小鼠B细胞是VH3-克隆的并且对蛋白A超抗原敏感(Silverman等人，2006)。然而，在用于该疾病的小鼠模型中蛋白A突变体葡萄球菌在脓肿形成的致病原中表现出重大缺陷(Cheng等人，2009；Kim等人，2011)。与小鼠相比，人VH3克隆B细胞包含高达50%的全部B细胞种群(Berberian等人，1993，Huang等人，1992)，表明在葡萄球菌引起感染期间蛋白A超抗原活性的影响很可能大于人B细胞种群(Silverman等人，2006)。如果这样的话，蛋白A-介导的B细胞激活可以触发VH3B细胞克隆的偏性使用和非生理性B细胞种群的发展。最后，葡萄球菌蛋白A期望VH3阳性B细胞和VH3-型抗体的人宿主。类似的方案适于HIV包膜糖蛋白gp120，其也与VH3克隆B细胞相互作用，导致AIDS患者中VH3B细胞(抗体基因)的克隆缺失(Berberian等人，1993；Berberian等人，1991)。这些事件很可能是在HIV和金黄色葡萄球菌感染过程中抵消抗体应答的预防中的关键因素(Kim等人，2012b)。
其他人做的工作尝试分离对抗蛋白A的单克隆抗体。一种这样的抗体SPA27(Sigma，St.Louis，MO)被分类作为小鼠IgG1，一种Fcγ域不与蛋白A相互作用的抗体种类(Kronvall等人，1970)。然而，甚至IgG1亚型抗体也可以通过伪免疫缔合与蛋白A结合，假设这些抗体携带VH3-型Fab域(Cary等人，1999；Sasso等人，1989)。我们近来开发了可以区分这些可能性的试剂。例如，野生型蛋白A(SpA)通过Fcγ和VH3-型Fab域结合免疫球蛋白(Silverman等人，2006)。SpAKK仅与VH3-型抗体的Fab域缔合，而SpAAA仅结合到IgG的Fcγ域，但不结合到VH3-型免疫球蛋白的Fab域(Kim等人，2012a)。利用这些试剂，我们观察到SPA27结合到野生型SpA和SpAKK，但不结合到SpAAA或者SpAKKAA(Kim等人，2012a)。因此，从用来自金黄色葡萄球菌Cowan1的野生型蛋白A免疫小鼠后的杂交瘤分离出来的SPA27不会特异性地识别蛋白A(Kim等人，2012a)。而是，SPA27被蛋白A结合(Kim等人，2012a)。如从这些观察所能够预期的，SPA27不能抵消蛋白A的IgG或者IgM结合活性，并且不会在之后通过金黄色葡萄球菌感染攻击的小鼠中提供防护(Kim等人，2012a)。
我们想知道在金黄色葡萄球菌感染期间或者在用野生型蛋白A免疫之后宿主免疫系统不能产生抵消抗体是否是一种普遍现象(Kim等人，2012a，Kim等人，2012b)。为了测试该模型，我们纯化mAb358A76.1，一种在用来自金黄色葡萄球菌Cowan1的野生型蛋白A免疫小鼠后分离出来的抗体(Sjoquist等人，1972)(美国专利US2008/0118937A1和US2010/0047252A1)。与mAbSPA27不同，mAb358A76.1与SpA、SpAKK、SpAAA和SpAKKAA均表现出免疫反应性(Kim等人，2012a)。我们观察到mAb358A76.1的特异性结合位点限于EKKAA域，并且该抗体不能识别DKKAA域、AKKAA域、BKKAA域和CKKAA域。在EKKAA和其他四个IgBD之间氨基酸不相似性的基础上，我们推测mAb358A76.1识别E-IgBD域的表面上的构象表位。mAb358A76.1和蛋白A的E域之间的缔合不能抵消其他四个IgBD(D、A、B和C)。不出意料地，mAb358A76.1被动转移到首次接受试验的小鼠中不会对金黄色葡萄球菌的攻击给予保护，并且不会触发血液中葡萄球菌的调理吞噬杀灭。基于这些观察，我们提出只有用不产生毒素的蛋白A例如SpAKKAA免疫才能够引起抵消蛋白A的所有IgBD并对金黄色葡萄球菌疾病给予防护的抗体的发展。
本文所呈现的数据对于SpA的Fcγ和Fab结合活性的抵消代表对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的关联的一般假设提供佐证：预期这类抗体触发血液中病原体的调理吞噬杀灭并引起抵消葡萄球菌的分泌的致病因子的抗体(Mazmanian等人，1999)。
序列分析
野生型金黄色葡萄球菌蛋白A通过2个非抗原型结合位点与人IgG相互作用。第一个是与Fc恒定区，第二个是与人VH3种族的Fab重链(Fab结合也与IgA和IgM一起发生)。因此，属于对应于人VH3的小鼠种族的mAb很可能与野生型抗原具有三个可能的并且可能是竞争性的结合亲和，一个针对Fc，一个针对Fab，第三个是通过CDR介导的抗原特异性结合。对产生SpAKKAA-特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系进行CDR序列分析。每个单个抗体包括两个抗原识别位点(Fab片段)，其中每个Fab部分包含三个轻链中的CDR和三个重链中的CDR。被鉴别为对金黄色葡萄球菌感染给予防护的mAb包括5A10、3F6、3D11、5A11、1B10和4C1。
提供重要保护的3F6在一系列SpAkkaa mAb中呈现最与众不同的序列。虽然具有与1F10和6D11相同的轻链CDR序列，但是3F6具有与1F10和6D11不同的独特的重链CDR序列。最后，1F10和6D11分享共同的轻链CDR序列和重链CDR序列，表明它们是同族mAb。1F10抗体和6D11抗体在小鼠中都不能产生明显的免疫防护。产生最有前途的保护作用并且已经被进一步表征的这三种mAb(5A10、3F6和2F2)以粗体表示。
三个主要的轻链序列组被识别并通过类似序列联合。第一组包含3F6、1F10、6D11、4C1、6B2、2B8和4C5，除了在6B2中有一个氨基酸差别和在4C5中有两个氨基酸差别之外，其全部分享共同的轻链CDR序列。尽管仅分享轻链序列，但是这些mAb仍然产生多种保护作用，表明重链序列中的特异性差别可能显著地影响这些mAb的功能作用。第二组分享一组轻链CDR序列(重链CDR序列不同)并且包含5A10和2F2，包括主要保护性抗体之一5A10在内。
计算所有抗体的对应CDR的百分比一致性并以矩阵形式在7-15中示出。相对于3F6、5A10或3D11的各CDR具有大于40%各CDR序列一致性的抗体总结在表16中。对于与3F6的对应CDR具有大于40%一致性的每组CDR的共有序列在表17中示出。
实施例2
材料和方法
细菌菌株和生长条件。金黄色葡萄球菌菌株Newman和MW2在37℃在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长。大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)在37℃在含有100μg·ml-1氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)肉汤中生长。
单克隆抗体。通过常规方法制备小鼠单克隆抗体(和C.Milstein.1975)。简单地，通过腹腔内注射100μg用Complete Freund’s Adjuvant(CFA,DIFCO)1:1乳化的经纯化的SpAKKAA使BALB/c小鼠(8周大，雌性，JacksonLaboratory)免疫。在第21天和第42天，通过腹腔内注射100μg用Complete Freund’s Adjuvant(CFA，DIFCO)1:1乳化的相同抗原来强化小鼠。在第31天和第52天，采集小鼠的血液和血清样品，通过ELISA筛选特异性抗体。在最初免疫后七十九天，用25μg相同抗原来强化通过ELISA显示出强的抗原-免疫反应性的小鼠。三天后，收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/mIL-6(SP2/0骨髓瘤细胞系的白介素6分泌衍生物)融合。通过ELISA筛选来自所得杂交瘤的上清液，通过限制稀释进一步亚克隆抗原-特异性克隆以产生由单一细胞引起的单克隆抗体-分泌杂交瘤。由所用的细胞系培养物上清液纯化抗体。从Sigma购买Spa27单克隆抗体。从American Type培养物Collection购买杂交瘤细胞系358A76.1.1(ATCC登录号PTA-7938)，并在Fitch单克隆抗体工厂(University of Chicago)扩增。
重组蛋白的纯化。通过CPC Scientific Inc(Sunnyvale，USA)合成来源于SpA-EKKAA域的氨基酸序列的多肽。用蒸馏水或二甲基亚砜(DMSO)溶解冻干的肽样品，然后分成等份并在-80℃冷冻。之前已经描述了使用野生型SpA和SpAKKAA的质粒(Kim等人，2010a)。通过Integrated DNA Technologies，Inc(USA)合成用于合成SpAKK(在五个IgBD的每一个中Q9K，Q10K被替代)、SpAAA(在五个IgBD的每一个中D36A、D37A被替代)、SpAKKAA的各个IgBD(E、D、A、B和C)的寡核苷酸。SpAKKAA变异体的PCR产物克隆进入产生N-末端His6-标记的重组蛋白的pET15b载体内。Sbi1-4的编码序列是用来自具有经改造的N-末端Strep标签(WSHPQFEK(SEQID NO:10))的金黄色葡萄球菌Newman染色体DNA的两种引物5’-AAAAAAGCTAGCTGGTCTCATCCTCAATTTGAGAAGACGCAACAAACTTCAACTAAG-3’(SEQ ID NO:8)和5’-AAAAAACTCGAGTTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3’(SEQ ID NO:9)扩增的PCR。Sbi1-4的PCR产物克隆进入产生具有经改造的N-末端Strep标签(WSHPQFEK(SEQ ID NO:10))的C-末端His6-标记的重组蛋白的pET24b载体内。所有质粒转变为用于亲和纯化的BL21(DE3)。重组大肠杆菌菌株的过夜培养物以1:100稀释到新鲜的培养基中并在37℃生长至A6000.5，在该点处用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养物并再生长三小时。细菌细胞通过离心沉淀，悬浮在柱缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl)中并在14000psi下用弗氏压碎器破坏。通过在40000×g下超速离心从溶解产物清除膜和不溶组分。对清除的溶解产物中的蛋白质进行镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析。在相继含有较高浓度咪唑(100-500mM)的柱缓冲液中洗脱蛋白质。通过二金鸡纳酸(BCA)测定(Thermo Scientific)确定蛋白质浓度。
酶联免疫吸附测定。为了确定SpA特异性血清IgG，用经亲和纯化的SpAKKAA涂覆ELISA板(NUNC Maxisorp)，以1μg·ml-1，在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5，在4℃)中，过夜。第二天，阻断板，用超免疫血清稀释来培养并用OptEIA试剂(BD Biosciences)显影。为了确定SpA-特异性mAb的结合亲和性，用经亲和纯化的各免疫球蛋白结合域或者序列来源于SpA-EKKAA的序列的合成肽(H1、H2、H3、H1+3和H2+3)涂覆ELISA板。使用肽以在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5，在4℃)中100nM的浓度涂覆板过夜。第二天，在PBS-T中用1%BSA溶液阻断板，并用不同浓度的SpA-特异性mAb培养。为了确定特异性mAb的亲合力，用增加浓度(0-4M)的硫氰酸铵干扰抗体-抗原相互作用。对于SpA和Sbi结合测定，将经亲和纯化的SpA和Sbi以在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5，在4℃)中的1μg·ml-1涂覆在ELISA板上过夜。第二天，阻断板，并利用过氧化物酶-缀合的人IgG、Fc和F(ab)2(Jackson Laboratory)稀释或者同种型对照抗体和SpAKKAA-特异性mAb稀释来培养；利用OptEIA试剂使测定显影。为了测量人IgG和SpA之间的免疫缔合的抑制，在配体结合之前用20μg·ml-1同种型对照抗体或SpAKKAA-特异性mAb培养板。对于竞争测定，在4℃用在0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5)中10ng·ml-1SpAKKAA涂覆板过夜。第二天，阻断板，并用30μg·ml-1同种型对照抗体或SpAKKAA-特异性mAb培养，然后在100-200ng·ml-1最终浓度下用HRP-缀合的SpA-特异性mAb(Innova Biosciences)或者人IgG培养。
小鼠肾脓肿模型。将在PBS中的经亲和纯化的抗体以5、15、20或者50mg·kg-1实验动物体重的浓度注射到BALB/c小鼠(6周大，雌性，Charles River Laboratories)的腹膜腔内，4-24小时后用金黄色葡萄球菌攻击。将金黄色葡萄球菌菌株的过夜培养物以1:100稀释到新鲜的TSB中并在37℃生长2小时。使葡萄球菌沉淀、清洗并悬浮在PBS中至所希望的细菌浓度。通过将样品等分部分铺展在TSA上并计算培养后形成的集落来量化接种物。通过每千克体重腹腔内注射100mg·ml-1氯胺酮和20mg·ml-1甲苯噻嗪来麻醉BALB/c小鼠。通过将1×107CFU金黄色葡萄球菌Newman或者5×106CFU金黄色葡萄球菌USA300(LAC)或USA400(MW2)注射到右眼的眶周静脉窦内来感染小鼠。在攻击后第4天或第15天，通过CO2吸入杀死小鼠。移除双肾，并通过用PBS、0.1%Triton X-100均质化肾组织来分析一个器官中的葡萄球菌负荷。将匀浆的系列稀释物铺展在TSA上并培养至集落形成。剩下的器官通过组织病理切片进行检查。简单地，在室温下将肾放置在10%福尔马林中24小时。组织嵌入苏木精-伊红染色的薄石蜡片中，并通过光学显微镜检查以计算脓肿病损伤。针对14种以2μg固定在硝酸纤维素膜上的经亲和纯化的葡萄球菌抗原，通过免疫印迹法检查在感染后第15天收集的免疫血清样品。如之前描述的量化信号强度(Kim等人，2010b)。根据遵照在芝加哥大学的Institutional Biosafety Committee(IBC)和Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)审阅和批准的实验方案的指导方针进行所有小鼠实验。
血液中葡萄球菌存活。通过心脏刺穿并用10μg·ml-1来匹卢定抑制凝血从BALB/c小鼠收集全血。在2μg·ml-1mAb的存在下将50μl5×105CFU·ml-1金黄色葡萄球菌Newman与950μl小鼠血液混合。在37℃利用缓慢旋转30分钟培养样品，然后在冰上用1%皂素/PBS培养。对于人血液研究，在10μg·ml-1mAb的存在下将50μl5×106CFU·ml-1金黄色葡萄球菌MW2与950μl新抽取的人血液混合。在37℃利用缓慢旋转120分钟培养试管。在冰上用1%皂素/PBS培养等分部分以溶解血液细胞。在琼脂上进行葡萄球菌的稀释物的铺板用于集落形成。用芝加哥大学的Institutional Review Board(IRB)已经审阅、批准并监督的方案来实施来自人志愿者的血液的实验。
SpA-特异性血清IgG。在85μg mAb3F6或其同种型对照物的存在下，在第0天和第11天将20μg经亲和纯化的SpA变异体注射到BALB/c小鼠的腹膜内。在第21天，从BALB/c小鼠收集全血以获得超免疫血清。
测量循环中SpA丰度。将200μg经亲和纯化的野生型SpA注射到被动免疫的BALB/c小鼠的腹膜内。在所示的时间间隔，使用10μg·ml-1来匹卢定抗凝剂从BALB/c小鼠收集全血。将所有样品和1%皂素/PBS保持在冰上10分钟。然后以1:10PBS稀释溶解的样品并以1:1与SDS-PAGE样品缓冲液混合。将样品在90℃煮5分钟，然后实施SDS-PAGE凝胶电泳。将样品转移到PDVF并用经亲和纯化的兔子α-SpAKKAA抗体通过免疫印迹法进行分析。
Sbi消耗测定。将金黄色葡萄球菌Newman的过夜培养物1:100稀释到新鲜TSB中，生长2小时，并用预冷的TSB调节A600到0.4(1×108CFU·ml-1)。清洗细胞，并用100μl同种型对照物或者mAb3F6以100μg·ml-1的最终浓度在4℃培养1小时。培养后，用预冷的TSB清洗葡萄球菌并用2μg经亲和纯化的野生型Sbi在4℃培养1小时。通过在13000×g下离心1分钟使葡萄球菌沉淀，去除上清液并与样品缓冲液混合(1:1)。将样品在90℃煮5分钟，然后实施SDS-PAGE凝胶电泳。将样品电转移到PDVF膜，并用经亲和纯化的兔子α-SpAKKAA抗体通过免疫印迹法进行分析。
单克隆抗体的测序。采用标准化的方案分离来自杂交瘤细胞的总RNA样品。简单地，在DMEM-10培养基中与10%FBS一起培养的1.4×107个杂交瘤细胞用PBS清洗，通过离心来沉淀并溶解在TRIzol(Invitrogen)中。将样品与20%氯仿混合，在室温下培养三分钟，并在4℃以10,000×g离心十五分钟。移出水层中的RNA并用70%异丙醇清洗。RNA通过离心沉淀并用75%焦炭酸二乙酯(DEPC)-乙醇清洗。干燥丸粒并将RNA溶解在DEPC中。cDNA利用cDNA合成试剂盒(Novagen)进行合成，并使用PCR Reagent System(Stratagene)、独立的引物(每种5pmol)和小鼠可变重链和轻链特异性引物集(Novagen)进行PCR扩增。将PCR产物使用IMGT Vquest(可在imgt.cines.fr/IMGT_vquest处获得)进行测序并分析。
统计分析。用于金黄色葡萄球菌感染的实验动物模型中的细菌负荷和脓肿数量采用双尾Mann-Whitney试验进行分析，以测量统计显著性。进行未配对的双尾Student的t-试验来分析ELISA数据、免疫印迹信号和体内血液存活数据的统计显著性。所有数据均通过Prism(GraphPad Software,Inc.)进行分析并且P值小于0.05被视为是显著的。
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Claims (46)

1.有效量的能够特异性结合缺乏非特异性Ig结合活性的SpA变异体的至少两个SpAIgG结合域A、B、C、D和E的经纯化的SpA结合多肽在制备用于处理具有葡萄球菌感染或处于葡萄球菌感染风险中的患者中的葡萄球菌感染的药物中的用途，其中所述经纯化的多肽包含来自3F6单克隆抗体的VH域和VL域的六个CDR氨基酸区域，其中所述3F6单克隆抗体的VH域包括序列分别为SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的三个CDR氨基酸区域，所述3F6单克隆抗体的VL域包括序列分别为SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的三个CDR氨基酸区域。
2.权利要求1所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽与至少两个且最多五个SpAIgG结合域AKKAA、BKKAA、CKKAA、DKKAA和EKKAA结合。
3.权利要求2所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽对于至少两个且最多五个SpA IgG结合域AKKAA、BKKAA、CKKAA、DKKAA和EKKAA具有0.5×109M-1或更大的缔合常数。
4.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽能够降低患者中的葡萄球菌负荷。
5.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述SpA结合多肽能够介导金黄色葡萄球菌的调理吞噬杀灭。
6.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述SpA结合多肽能够扰乱人类IgG与野生型SpA的结合。
7.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽是人源化的抗体，其包含来自3F6单克隆抗体的CDR氨基序列。
8.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中处理葡萄球菌感染包括减少患者中的脓肿形成或降低患者中的细菌负荷。
9.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中缺乏非特异性Ig结合活性的SpA多肽是SpAKKAA。
10.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽与3F6单克隆抗体竞争结合SpAKKAA多肽。
11.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在0.5×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
12.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在1.0×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
13.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在2.0×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
14.权利要求1到3中任一项所述的用途，进一步包括施用有效量的两种或更多种经纯化的SpA结合多肽。
15.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽是重组多肽。
16.权利要求15所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽是人源化抗体。
17.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽是人类抗体。
18.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽包含来自3F6单克隆抗体的VH域和VL域。
19.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽包含来自3F6单克隆抗体的VH域。
20.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述经纯化的SpA结合多肽包含来自3F6单克隆抗体的VL域。
21.权利要求15所述的用途，其中所述重组多肽包含来自选自免疫球蛋白、纤连蛋白、脂笼蛋白或金黄色葡萄球菌蛋白Z的多肽的支架。
22.权利要求15所述的用途，其中重组的经纯化的SpA结合多肽有效地连接到第二经纯化的SpA结合多肽。
23.权利要求22所述的用途，其中所述第二经纯化的SpA结合多肽结合第二葡萄球菌蛋白。
24.权利要求1到3中任一项所述的用途，进一步包括施用结合第二葡萄球菌蛋白的第二经纯化的SpA结合多肽。
25.权利要求1到3中任一项所述的用途，进一步包括施用抗生素或葡萄球菌疫苗组合物。
26.权利要求1到3中任一项所述的用途，其中以0.1mg/kg到500mg/kg的剂量施用所述经纯化的SpA结合多肽。
27.一种经纯化的多肽，其包含来自3F6单克隆抗体的VH域和VL域的六个CDR氨基酸区域，其中所述多肽能够特异性结合缺乏非特异性Ig结合活性的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽变异体的至少两个SpA IgG结合域A、B、C、D和E，其中所述3F6单克隆抗体的VH域包括序列分别为SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的三个CDR氨基酸区域，所述3F6单克隆抗体的VL域包括序列分别为SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的三个CDR氨基酸区域。
28.权利要求27所述的多肽，其中缺乏非特异性Ig结合活性的SpA多肽是SpAKKAA。
29.权利要求28所述的多肽，其中所述经纯化的多肽与3F6单克隆抗体竞争结合SpAKKAA多肽。
30.权利要求28到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在0.5×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
31.权利要求28到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在1.0×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
32.权利要求28到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽对于SpAKKAA多肽具有如通过ELISA所测量的在2.0×109M-1和100×109M-1之间的缔合常数。
33.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽是人源化单克隆抗体。
34.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中经纯化的多肽是人类抗体。
35.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽是重组的。
36.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽包含3F6单克隆抗体的VH域和VL域。
37.权利要求27所述的多肽，其中所述经纯化的多肽包含3F6单克隆抗体的VH域。
38.权利要求27所述的多肽，其中所述经纯化的多肽包含3F6单克隆抗体的VL域。
39.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽包含来自选自免疫球蛋白、纤连蛋白、脂笼蛋白或金黄色葡萄球菌蛋白Z的多肽的支架。
40.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽有效地连接到与第二葡萄球菌蛋白特异性结合的重组多肽。
41.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽是3F6单克隆抗体。
42.权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述经纯化的多肽是包含(a)重链和(b)轻链的抗体，其中所述重链包含所述VH区和来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的人类枢纽区、CH1区、CH2区和CH3区；所述轻链包含所述VL区，和人类kappa CL或人类lambda CL。
43.一种包含权利要求27到42中任一项所述的经纯化的多肽的药物组合物。
44.权利要求43所述的药物组合物，其包含在密封容器中的单个单位剂量的所述经纯化的多肽。
45.权利要求43所述的药物组合物，其包含至少一种第二抗菌剂。
46.权利要求45所述的药物组合物，其中所述第二抗菌剂是抗生素、葡萄球菌疫苗组合物或与第二葡萄球菌蛋白特异性结合的多肽。
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