JP2016538829A - 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異などの少なくとも1つの変異を含んでなる、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することで、LDLR分解の問題に対処する。本発明は、例えば、構造的および機能的統合性を保ちながら、核酸ベースの治療薬を最適化し、発現閾値を克服し、発現速度、半減期および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在を最適化し、免疫応答および/または分解経路などの有害生物応答を回避するのに有用な特性などの、当該技術分野の問題の1つまたは複数を回避する構造的および/または化学的特性を有する、核酸ベースの化合物またはポリヌクレオチド(コードおよび非コードの両方、ならびにそれらの組み合わせ)を提供することで、この必要性に対処する。これらの障壁は、本発明を使用することで低下または排除されてもよい。
ングフレームを含んでなってよく、例えば配列番号56〜718などであるが、これに限定されるものではない。
列挙される修飾などであるがこれに限定されるものではない少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなってもよく、例えば、ウリジン修飾、シチジン修飾、グアノシン修飾、アデノシン修飾および/またはチミジン修飾などであるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、例えば、IVTポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、2つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなる。2つの化学修飾ヌクレオシドは、ウリジン修飾、シチジン修飾、グアノシン修飾、アデノシン修飾および/またはチミジン修飾などであるが、これに限定されるものではない、表5に列挙される修飾であってもよい。さらに別の実施形態では、例えば、IVTポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、3つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなってもよい。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、例えば、LDLRをコードするキメラポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドであり、例えば、キメラポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、式I、
5’[An]x−L1−[Bo]y−L2−[Cp]z−L3 3’
I
を含んでなる配列を有し、
式中、
AおよびBは、それぞれ独立して連結ヌクレオシド領域を含んでなり;
Cは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり;
領域A、B、またはCの少なくとも1つは、位置的に修飾され;
n、o、およびpは、独立して15〜1000の整数であり;
xおよびyは、独立して1〜20であり;
zは0〜5であり;
L1およびL2は、独立して任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかであり;および
L3は、任意選択のコンジュゲートまたは任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかである。
2つの変異とを含んでなる、目的のポリペプチドをコードしてもよい。EGF−Aドメイン上の変異は、N316AおよびL339Dであってもよいが、これに限定されるものではなく、細胞内ドメイン上の変異は、K816R、K830R、およびC839Aであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、目的のポリペプチドは、EGF−Aドメイン上のN316A変異と、細胞内ドメイン上のK830RおよびC839A変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、EGF−Aドメイン上のN316A変異と、細胞内ドメイン上のK816R、K830R、およびC839A変異とを含んでなってもよい。非限定的例として、目的のポリペプチドは、EGF−Aドメイン上のL339D変異と、細胞内ドメイン上のK830RおよびC839A変異とを含んでなってもよい。別の非限定的例として、目的のポリペプチドは、EGF−Aドメイン上のL339D変異と、細胞内ドメイン上のK816R、K830R、およびC839A変異とを含んでなってもよい。
一実施形態では、Bの連結ヌクレオシド領域の少なくとも1つは、配列番号56〜718などであるが、これに限定されるものではない、核酸配列の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含んでなる。
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの領域Bまたは領域Cは、位置的に修飾され、ポリペプチドは、完全に領域A内でコードされる。
一実施形態では、領域A、BまたはCの少なくとも1つは、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されてもよい。
本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドはまた、環状であってもよい。
と、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる組成物である。薬学的に許容可能な賦形剤は、溶剤、水性溶剤、非水性溶剤、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物であってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、薬学的に許容可能な賦形剤は脂質であり、脂質は、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、reLNP、PLGA、PEG、PEG−DMA、およびPEG化脂質、ならびにそれらの混合物から選択されてもよい。
細胞、組織または臓器、および究極的には生物にとって有益な生理学的な成果をもたらすために、試験管内(インビトロ)、生体内(インビボ)、原位置(in situ)ま
たは生体外(ex vivo)を問わず、例えば、リボ核酸(RNA:ribonucl
eic acid)などの核酸を設計し、合成して細胞内部に送達できることは、治療薬、診断薬、試薬分野で、および生物学的アッセイにとって、大きな関心事である。1つの有益な成果は、核酸の細胞内翻訳、および少なくとも1つのコードされる目的のペプチドまたはポリペプチドの生成を引き起こすことである。同様に、非コードRNAは、多くの研究の焦点となっており;非コードポリヌクレオチドの使用は、単独で、およびコードポリヌクレオチドとの併用で、治療シナリオに有益な成果を提供し得る。
本発明によって、ポリヌクレオチドは、好ましくは、当該技術分野におけるその他の分子の欠損を回避する方法で修飾される。
、米国仮特許出願第61/681,654号明細書、米国仮特許出願第61/737,152号明細書、米国仮特許出願第61/618,885号明細書、米国仮特許出願第61/681,658号明細書、米国仮特許出願第61/737,155号明細書、米国仮特許出願第61/618,896号明細書、米国仮特許出願第61/668,157号明細書、米国仮特許出願第61/681,661号明細書、米国仮特許出願第61/737,160号明細書、米国仮特許出願第61/618,911号明細書、米国仮特許出願第61/681,667号明細書、米国仮特許出願第61/737,168号明細書、米国仮特許出願第61/618,922号明細書、米国仮特許出願第61/681,675号明細書、米国仮特許出願第61/737,174号明細書、米国仮特許出願第61/618,935号明細書、米国仮特許出願第61/681,687号明細書、米国仮特許出願第61/737,184号明細書、米国仮特許出願第61/618,945号明細書、米国仮特許出願第61/681,696号明細書、米国仮特許出願第61/737,191号明細書、米国仮特許出願第61/618,953号明細書、米国仮特許出願第61/681,704号明細書、米国仮特許出願第61/737,203号明細書の表6、米国仮特許出願第61/681,720号明細書、米国仮特許出願第61/737,213号明細書、米国仮特許出願第61/681,742号明細書の表6および7;国際公開第2013151666号パンフレット、国際公開第2013151668号パンフレット、国際公開第2013151663号パンフレット、国際公開第2013151669号パンフレット、国際公開第2013151670号パンフレット、国際公開第2013151664号パンフレット、国際公開第2013151665号パンフレット、国際公開第2013151736号パンフレットの表6;国際公開第2013151672号パンフレットの表6および7;国際公開第2013151671号パンフレットの表6、178、および179;米国仮特許出願第61/618,870号明細書の表6、28、および29;米国仮特許出願第61/681,649号明細書の表6、56、および57;米国仮特許出願第61/737,139号明細書の表6、186、および187;国際公開第2013151667号パンフレットの表6、185、および186に列挙されるもので開示される。前述のいずれもIVTポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとして合成されることができ、このような実施形態は本発明によって検討される。
ポリヌクレオチド
本発明は、いくつかの実施形態では1つまたは複数の目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子、特に、ポリヌクレオチドを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含んでなる、任意の化合物および/または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称されることが多い。
パンフレット、国際公開第2013151665号パンフレット、国際公開第2013151671号パンフレット、および国際公開第2013151736号パンフレットに記載される。
ク質の生物学的特性を変化させる、少なくとも1つの変異を含んでなる。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、LDLRの発現、特に細胞表面発現を変化させる、少なくとも1つの変異を含んでなる。このような変異は、本明細書で、「細胞表面発現促進」変異」と称される。代表的な「細胞表面発現促進変異」は、例えば、LDLR分解を阻害または低下するなどして変化させ、したがって例えば、LDLRまたはLDLRタンパク質の細胞表面発現などの発現増大、または細胞表面のLDLRレベル増大をもたらす。例示的な実施形態では、細胞表面発現促進変異は、LDLR分解と関係があるLDLRドメインで起こる。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、IDOL相互作用ドメインの変異を含んでなる、LDLRタンパク質の変異型をコードしてもよい。IDOL(inducible degrader of LDLR:LDLRの誘導性分解因子)はE3ユビキチンリガーゼであり、肝臓X受容体の活性化に続いて誘導され、引き続いて、受容体のユビキチン化と分解を仲介するLDLR(IDOL相互作用ドメイン)内の細胞質内ドメインと、相互作用することが知られている。非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるIDOL相互作用ドメインの改変は、IDOL媒介LDLR分解の阻害をもたらし、LDLRタンパク質発現の増大を引き起こす。さらなる非限定的例として、例えば、その中に変異を導入することによるIDOL相互作用ドメインの変化は、IDOL媒介LDLR分解をもたらし、低密度リポタンパク質(LDL:low density
lipoprotein)取り込みを促進する。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも1つの目的のペプチドポリペプチドをコードする領域の長さは、約30ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも
約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000を超え、または100,000個以下のヌクレオチド)。本明細書の用法では、このような領域は、「コード領域」または「コードする領域」と称されてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含んでもよい。自己切断ペプチドは、2Aペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号1)のタンパク質配列、その断片または変異型を有してもよい。一実施形態では、2Aペプチドは、最後のグリシンおよび最後のプロリン間を切断する。別の非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号1)のタンパク質配列、その断片または変異型を有する2Aペ
プチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
従来、mRNA分子の基本的成分は、少なくとも1つのコード領域、5’UTR、3’UTR、5’キャップ、およびポリAテールを含む。本発明のIVTポリヌクレオチドは、mRNAとして機能することができるが、核酸ベースの治療薬を使用した効果的なポリペプチド生成における既存の問題を克服するのに役立つそれらの機能的および/または構造的設計特性において、野生型mRNAとは区別される。
105である。従来、この作動可能領域は、開始コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
び29;米国仮特許出願第61/681,649号明細書の表6、56、および57;米国仮特許出願第61/737,139号明細書の表6、186、および187;国際公開第2013151667号パンフレットの表6、185、および186に記載される、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。野生型ヒト低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の代表的参照アミノ酸および核酸配列は、それぞれ、>gi|4504975|ref|NP_000518.1|低密度リポタンパク質受容体イソ型1前駆体[ホモ・サピエンス(Homo sapiens)](配列番号744)および>gi|307775410|ref|NM_000527.4|ホモ・サピエンス(Homo sapiens)低密度リポタンパク質受容体(LDLR)転写変異型1 mRNA(配列番号745)に記載される。野生型マウス低密度リポタンパク質受容体(LDLR)の代表的参照アミノ酸および核酸配列は、それぞれ、>gi|113195700|ref|NP_034830.2|低密度リポタンパク質受容体イソ型1前駆体[ハツカネズミ(Mus musculus)](配列番号746)および>gi|358030302|ref|NM_010700.3|ハツカネズミ(Mus musculus)低密度リポタンパク質受容体(Ldlr)転写変異体1 mRNA(配列番号747)に記載される。受入番号は、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI:National Center for Biotechnology Information)のウェブサイトにある。
あるいは、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。
00、および4,500〜5,500)ヌクレオチドを含む。
含んでもよい。IVTポリヌクレオチド中の2Aペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法および/または当該技術分野で公知の方法によって、修飾されまたはコドン最適化されてもよい。
一実施形態では、本発明のIVTポリヌクレオチドは、構造修飾または化学修飾されてもよい。化学修飾および/または構造修飾される場合、IVTポリヌクレオチドは、「修飾IVTポリヌクレオチド」と称されてもよい。
号パンフレット、国際公開第2013151670号パンフレット、国際公開第2013151664号パンフレット、国際公開第2013151665号パンフレット、国際公開第2013151671号パンフレット、国際公開第2013151672号パンフレット、および国際公開第2013151736号パンフレットに記載される。
本発明のキメラポリヌクレオチドまたはRNAコンストラクトは、IVTポリヌクレオチドと同様のモジュール構造を保つが、キメラポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに有用な特性を与える1つまたは複数の構造的および/または化学的な修飾または改変を含んでなる。したがって、本発明の修飾mRNA分子であるキメラポリヌクレオチドは、「キメラ修飾mRNA」または「キメラmRNA」と称される。
5’[An]x−L1−[Bo]y−L2−[Cp]z−L3 3’
式I
を含んでなる構造を有し、
式中、
AおよびBのそれぞれは、独立して連結ヌクレオシド領域を含んでなり;
Cは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり;
領域A、BまたはCの少なくとも1つは位置的に修飾されて、位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、またはウリジンの同一ヌクレオシドタイプの1つまたは複数の少なくとも2つの化学修飾ヌクレオシドを含んでなり、同一タイプのヌクレオシドの少なくとも2つの化学修飾は、異なる化学修飾であり;
n、o、およびpは、独立して15〜1000の整数であり;
xおよびyは、独立して1〜20であり;
zは0〜5であり;
L1およびL2は、独立して任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかであり;および
L3は、任意選択のコンジュゲートまたは任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベースまたは非核酸ベースのいずれかである。
本明細書の用法では、「ヘミマー」は、1つの化学修飾のパターン、パーセント、位置、または集団の半分と、第2の化学修飾のパターン、パーセント、位置、または集団の半分とを含んでなる、領域または部分を含んでなる、キメラポリヌクレオチドである。本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、ヘミマー小領域を含んでなってもよい。一実施形態
では、部分または領域は、1つの50%および別の50%である。
同一ヌクレオシドタイプ(A、C、G、T、またはU)の2つ以上のヌクレオシドメンバーの2つ以上の異なる化学修飾がある少なくとも1つの領域を有する本発明のキメラポリヌクレオチド(それらの部分または領域を含む)は、「位置的修飾」キメラと称される。位置的修飾キメラは、本明細書では、「選択的配置」キメラまたは「選択的配置ポリヌクレオチド」とも称される。名称が暗示するように、選択的配置は、任意のA、C、G、TまたはUの修飾が合成法のために同一である当該技術分野のポリヌクレオチドとは異な
るポリヌクレオチドの設計を指し、それらのポリヌクレオチドまたは領域内で、個々のA、C、G、TまたはUに異なる修飾を有し得る。例えば、位置修飾キメラポリヌクレオチド中では、A、C、G、T、またはUのヌクレオシドタイプのいずれかに、2つ以上の異なる化学修飾があってもよい。また2つ以上の同一ヌクレオシドタイプに、任意の2つ以上の組み合わせがあってもよい。例えば、位置修飾キメラポリヌクレオチドまたは選択的位置キメラポリヌクレオチドは、分子中のアデニン集団に3つの異なる修飾を含んでなって、かつまたコンストラクト中のシトシン集団にも3つの異なる修飾を有してもよく、それらは全て独自の非無作為位置を有してもよい。
キメラポリヌクレオチドが、化学修飾および/または構造修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称されてもよい。
4、15、17、20、25または30アミノ酸のペプチド、または例えば35、30、25、20、17、15、14、13、12、11または10アミノ酸以下などの40アミノ酸以下のペプチドをコードするのに十分であってもよい。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例としては、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明は、環状または環式のポリヌクレオチドを検討する。名称が暗示するように、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、ライゲーション、共有結合、同一タンパク質またはその他の分子または複合体との共通の会合によるか、それともハイブリダイゼーションによるかを問わず、末端が何らかの方法で連結することを意味する。環状ポリヌクレオチドのいずれかは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2014年9月3日に出願された国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/053904号明細書(代理人整理番号M51)で教示される。
明細書の用法では、「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」または「circSP」は、少なくとも1つのセンサー配列を含んでなり、目的のポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。本明細書の用法では、「センサー配列」は、内在性核酸結合分子の受容体または疑似受容体を意味する。センサー配列の非限定的例としては、マイクロRNA結合部位、マイクロRNAシード配列、シード配列なしのマイクロRNA結合部位、転写因子結合部位、および疑似受容体として機能するように操作された人工結合部位、およびそれらの部分と断片が挙げられる。
207である。従来、この作動可能領域は、終止コドンを含んでなる。作動可能領域は、あるいは、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含んでなってもよい。本発明によれば、複数の連続した終止コドンもまた使用されてもよい。一実施形態では、本発明の操作領域は、2つの終止コドンを含んでなってもよい。第1の終止コドンは、「TGA」または「UGA」であってもよく、第2の終止コドンは、「TAA」、「TGA」、「TAG」、「UAA」、「UGA」、または「UAG」からなる群から選択されてもよい。
環状ポリヌクレオチドを製造、使用、および投与する方法は、その内容全体が参照により援用される、同時係属国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/53904号明細書(代理人整理番号M51.20)にもまた記載される。
本発明によれば、複数の異なるキメラポリヌクレオチドおよび/またはIVTポリヌクレオチドは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを使用して、3’末端を介して共に連結されてもよい。化学的コンジュゲーションが使用されて、細胞内送達の化学量論比が調節されてもよい。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼが細胞内に1:1の比率で提供されて、細胞脂肪酸代謝が改変されてもよい。この比率は、1つのポリヌクレオチド種上の3’−アジド末端ヌクレオチドと、対向するポリヌクレオチド生物種上のC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドとを使用して、キメラポリヌクレオチドおよび/またはIVTポリヌクレオチドを化学的に連結することで調節されてもよい。修飾ヌクレオチドは、マサチューセッツ州イプスウィッチ(Ipswich,MA)のニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)の末端トランスフェラーゼを使用して、製造業者のプロトコルに従って、転写後に付加される。3’−修飾ヌクレオチドの付加後、文献に記載されるようにして、2つのポリヌクレオチド種が銅の存在または不在下において、水溶液中で組み合わされて、クリックケミストリー機序を通じて、新規共有結合が形成されてもよい。
タンパク質生成をさらに向上させるために、本発明のポリヌクレオチドは、その他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラーレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進薬(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、例えば糖タンパク質などのタンパク質、または例えば共リガンドのための特異的親和性を有する分子などのペプチド、または例えばがん細胞または内皮細胞または骨細胞などの指定された細胞型と結合する抗体などの抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、脂質やレクチンや炭水化物やビ
タミンや補助因子などの非ペプチド化学種、または薬剤にコンジュゲートされるように設計され得る。
は、CD47膜であってもよく、またはコンジュゲートは、既述の「自己」ペプチドなどのCD47膜タンパク質から誘導されてもよい。別の態様では、ナノ粒子は、PEG、およびCD47のコンジュゲートまたはその誘導体を含んでなってもよい。さらに別の態様では、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドおよび膜タンパク質CD47の両方を含んでなってもよい。
本発明の一実施形態では、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性IVTポリヌクレオチド、二機能性キメラポリヌクレオチドまたは二機能環状ポリヌクレオチド)がある。名称が暗示するように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、またはその能力があるものである。これらの分子はまた、慣例によって、多機能と称されてもよい。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば非コード領域を有するなど、部分的にまたは実質的に翻訳可能でない配列を含んでなってもよい。非限定的一例として、非コード領域は、IVTポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドの第1の領域であってもよい。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であってもよい。別の非限定的例として、非コード領域は、キメラポリヌクレオチドのA、Bおよび/またはC領域であってもよい。
れによって細胞内のタンパク質発現を効果的に低下させるか、または細胞内の1つまたは複数の経路またはカスケードを調節して、それは次にタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の長い非コードRNA(lncRNA:long noncoding RNA、またはlincRNA)またはその一部、小型核小体RNA(sno−RNA:small nucleolar RNA)、マイクロRNA(miRNA:micro RNA)、低分子干渉RNA(siRNA)またはPiwi相互作用RNA(piRNA:small interfering RNA)を含有するか、またはそれをコードしてもよい。そのいずれでもポリヌクレオチド中でコードされてもよいlncRNAを標的化するように設計されたこのようなlncRNA分子およびRNAiコンストラクトの例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012/018881 A2号パンフレットで教示される。
本発明のポリヌクレオチドは、目的の1つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異などの少なくとも1つの変異を含んでなってもよい。非限定的例として、目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異などの、少なくとも2つの変異を含んでなるLDLRタンパク質であってもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、1つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドのレベル、シグナル伝達または機能に影響を及ぼしてもよい。目的のポリペプチドとしては、LDLR、野性型LDLRおよびLDLR変異体および本明細書の表3、10および11で教示されるもの、または、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第61/618,862号明細書、米国仮特許出願第61/681,645号明細書、米国仮特許出願第61/737,130号明細書、米国仮特許出願第61/618,866号明細書、米国仮特許出願第61/681,647号明細書、米国仮特許出願第61/737,134号明細書、米国仮特許出願第61/618,868号明細書、米国仮特許出願第61/681,648号明細書、米国仮特許出願第61/737,135号明細書、米国仮特許出願第61/618,873号明細書、米国仮特許出願第61/681,650号明細書、米国仮特許出願第61/737,147号明細書、米国仮特許出願第61/618,878号明細書、米国仮特許出願第61/681,654号明細書、米国仮特許出願第61/737,152号明細書、米国仮特許出願第61/618,885号明細書、米国仮特許出願第61/681,658号明細書、米国仮特許出願第61/737,155号明細書、米国仮特許出願第61/618,896号明細書、米国仮特許出願第61/668,157号明細書、米国仮特許出願第61/681,661号明細書、米国仮特許出願第61/737,160号明細書、米国仮特許出願第61/618,911号明細書、米国仮特許出願第61/681,667号明細書、米国仮特許出願第61/737,168号明細書、米国仮特許出願第61/618,922号明細書、米国仮特許出願第61/681,675号明細書、米国仮特許出願第61/737,174号明細書、米国仮特許出願第61/618,935号明細書、米国仮特許出願第61/681,687号明細書、米国仮特許出願第61/737,184号明細書、米国仮特許出願第61/618,945号明細書、米国仮特許出願第61/681,696号明細書、米国仮特許出願第61/737,191号明細書、米国仮特許出願第61/618,953号明細書、米国仮特許出願第61/681,704号明細書、米国仮特許出願第61/737,203号明細書の表6、米国仮特許出願第61/681,720号明細書、米国仮特許出願第61/737,213号明細書、米国仮特許出願第61/681,742号明細書の表6および7;国際公開第2013151666号パンフレット、国際公開第2013151668号パンフレット、国際公開第2013151663号パンフレット、国際公開第2013151669号パンフレッ
ト、国際公開第2013151670号パンフレット、国際公開第2013151664号パンフレット、国際公開第2013151665号パンフレット、国際公開第2013151736号パンフレットの表6;国際公開第2013151672号パンフレットの表6および7;国際公開第2013151671号パンフレットの表6、178、および179;米国仮特許出願第61/618,870号明細書の表6、28、および29;米国仮特許出願第61/681,649号明細書の表6、56、および57;米国仮特許出願第61/737,139号明細書の表6、186、および187;国際公開第2013151667号パンフレットの表6、185、および186に列挙されるもののいずれかが挙げられる。
「アナログ」は、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失などの、1つまたは複数のアミノ酸改変によって異なるが、依然として、親または出発ポリペプチドの特性の1つまたは複数を保つ、ポリペプチド変異型を含むことが意図される。
するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って生成されたポリペプチドに存在してもよい。
本明細書の用法では、ポリペプチドに言及する場合、「局所性立体構造的形状」という用語は、タンパク質の限定できる空間内に位置する、タンパク質のポリペプチドベースの構造的発現を意味する。
。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有しまたはそれを含んでなると同定された場合、奇数ループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分を含んでなる(ループ/2+/−0.5アミノ酸のアミノ酸数)。例えば、7アミノ酸ループとして同定されたループは、3アミノ酸または4アミノ酸の半ループを生じ得る(7/2=3.5+/−0.5は3または4である)。
本発明のポリヌクレオチドは、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはそれに対していかなる治療指標も同定されていないが、それでもなお研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これに限定されるものではない、いくつかの標的カテゴリーのいずれかから選択される、目的のポリペプチドをコードするように設計されてもよい。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013151666号パンフレットに記載されるような、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質内もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質をコードするように設計されてもよい。
81,647号明細書、米国仮特許出願第61/737,134号明細書、米国仮特許出願第61/618,868号明細書、米国仮特許出願第61/681,648号明細書、米国仮特許出願第61/737,135号明細書、米国仮特許出願第61/618,873号明細書、米国仮特許出願第61/681,650号明細書、米国仮特許出願第61/737,147号明細書、米国仮特許出願第61/618,878号明細書、米国仮特許出願第61/681,654号明細書、米国仮特許出願第61/737,152号明細書、米国仮特許出願第61/618,885号明細書、米国仮特許出願第61/681,658号明細書、米国仮特許出願第61/737,155号明細書、米国仮特許出願第61/618,896号明細書、米国仮特許出願第61/668,157号明細書、米国仮特許出願第61/681,661号明細書、米国仮特許出願第61/737,160号明細書、米国仮特許出願第61/618,911号明細書、米国仮特許出願第61/681,667号明細書、米国仮特許出願第61/737,168号明細書、米国仮特許出願第61/618,922号明細書、米国仮特許出願第61/681,675号明細書、米国仮特許出願第61/737,174号明細書、米国仮特許出願第61/618,935号明細書、米国仮特許出願第61/681,687号明細書、米国仮特許出願第61/737,184号明細書、米国仮特許出願第61/618,945号明細書、米国仮特許出願第61/681,696号明細書、米国仮特許出願第61/737,191号明細書、米国仮特許出願第61/618,953号明細書、米国仮特許出願第61/681,704号明細書、米国仮特許出願第61/737,203号明細書の表6;米国仮特許出願第61/681,720号明細書、米国仮特許出願第61/737,213号明細書、米国仮特許出願第61/681,742号明細書の表6および7;国際公開第2013151666号パンフレット、国際公開第2013151668号パンフレット、国際公開第2013151663号パンフレット、国際公開第2013151669号パンフレット、国際公開第2013151670号パンフレット、国際公開第2013151664号パンフレット、国際公開第2013151665号パンフレット、国際公開第2013151736号パンフレットの表6;国際公開第2013151672号パンフレットの表6および7;国際公開第2013151671号パンフレットの表6、178、および179;米国仮特許出願第61/618,870号明細書の表6、28、および29;米国仮特許出願第61/681,649号明細書の表6、56、および57;米国仮特許出願第61/737,139号明細書の表6、186、および187;国際公開第2013151667号パンフレットの表6、185、および186で開示されるポリペプチドのいずれか1つなどのLDLRタンパク質であってもよい。非限定的例として、参照ポリペプチド配列は、任意のコードする低密度リポタンパク質受容体(LDLR)またはその変異型であってもよい。
)、ニューヨーク、1993年;グリフィン,A.M.(Griffin,A.M.)およびグリフィン,H.G.(Griffin,H.G.)編集、「配列データのコンピュータ解析(Computer Analysis of Sequence Data)」、第1部、ヒュマナ・プレス(Humana Press)、ニュージャージー、1994年;フォン・ヘインジュ,G.(von Heinje,G.)著、「分子生物学における配列解析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」、アカデミック・プレス(Academic Press)、1987年;グリブスコブ,M.(Gribskov,M.)およびデブルー,J.(Devereux,J.)編集、「配列解析入門書(Sequence Analysis Primer)」、M.ストックトン・プレス(M.Stockton Press)、ニューヨーク、1991年;およびカリロ(Carillo)ら著、SIAMジャーナル・オン・アプライド・マシマティクス(SIAM J.Applied Math.)、1988年、第48巻、p1073に記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
Res.)、1997年、第25巻、p3389〜3402のものが挙げられる。その他のツールは、具体的に「同一性」の定義中で、本明細書に記載される。
本発明のいくつかの実施形態では、標的部分を発現するようにポリヌクレオチドが提供される。これらとしては、インビボまたはインビトロのいずれでも、細胞を特定の組織空間に標的化するように、または特定の部分と相互作用するように機能する細胞表面のタンパク質結合パートナーまたは受容体が挙げられる。適切なタンパク質結合パートナーとしては、抗体とそれらの機能的断片、スキャフォールドタンパク質、またはペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、ポリヌクレオチドを用いて、脂質、炭水化物、またはその他の生物の部分または生体分子の合成および細胞外局在化を誘導し得る。
一実施形態では、ポリヌクレオチドが使用されて、ポリペプチドライブラリーが作成されてもよい。これらのライブラリーは、それぞれ様々な構造修飾もしくは化学修飾の設計を含有するポリヌクレオチド集団の作成から生じてもよい。この実施形態では、ポリヌクレオチド集団は、本明細書で教示されまたは当該技術分野で公知の抗体または抗体断片、タンパク質結合パートナー、スキャフォールドタンパク質、およびその他のポリペプチドを含むが、これに限定されるものではない、複数のコードされるポリペプチドを含んでなってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的細胞または培養物への直接導入に適してもよく、それは次に、コードされるポリペプチドを合成してもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、1つまたは複数の抗菌性ペプチド(AMP:antimicrobial peptide)または抗ウイルスペプチド(AVP:antiviral peptide)をコードするように設計されてもよい。AMPおよびAVPは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、および哺乳類などであるが、これに限定されるものではない、幅広い動物から単離され記載されている(ワング(Wang)ら著、ニュークレイック・アシッドリ・サーチ(Nucleic Acids Res.)2009年、第37巻(データベース版):D933〜7)。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、その他の核酸ベースの分子の既知の領域または部分と同様に機能する、領域、小領域または部分を含んでなるように設計されてもよい。このような領域としては、本明細書で考察されるmRNA領域と、非コード領域とが挙げられる。非コード領域は、領域が1つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドであるかまたはそれを組み込む場合のように単一ヌクレオシドのレベルであってもよい。
一実施形態では、1つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドが、二機能性修飾RNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシド抗がん剤としては、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、5−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、フトラフール(FTORAFUR)(登録商標)(テガフールとウラシルの組み合わせ)、テガフール((RS)−5−フル
オロ−1−(テトラヒドロフラン−2−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン)、および6−メルカプトプリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ジン、2−クロロ−プリン、およびイノシン、またはそれらの組み合わせも挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のポリヌクレオチドは、非翻訳領域として作用しまたは機能する、1つまたは複数の領域または部分を含んでなってもよい。ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの目的のポリペプチドをコードするように設計される場合、ポリヌクレオチドは、これらの非翻訳領域の1つまたは複数を含んでなってもよい。
天然5’UTRは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。これらは、それによってリボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始する過程に関与することが一般に知られているコザック配列のようなシグネチャを保有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、Rは、別の「G」がそれに続く、開始コドン(AUG)上流のプリン(アデニンまたはグアニン)三塩基である。5’UTRはまた、延長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
てもよい。例えば、イントロンが、またはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチド領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みは、タンパク質生成ならびにポリヌクレオチドレベルを増大させてもよい。
とも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する、2つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。
一実施形態では、5’非翻訳領域は、3’非翻訳領域とは異なる生物種に由来してもよい。
天然または野性型3’UTRは、それらの中に包埋された一続きのアデノシンおよびウリジンを有することが知られている。これらのAU富化シグネチャは、代謝回転率の高い遺伝子に特に多く見られる。それらの配列特性および機能的性質に基づいて、AU富化要素(ARE:AU rich element)は、3つのクラスに分離され得る(チェン(Chen)ら、1995年):クラスIAREはU富化領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIAREを含有する。クラスIIAREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子としては、GM−CSFおよびTNF−aが挙げられる。クラスIIIARESは、あまり明確に定義されていない。これらのU富化領域は、AUUUAモチーフを含有しない。c−Junおよびミオゲニンは、このクラスの十分に研究された2つの例である。AREに結合する大部分のタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られている一方で、ELAVファミリーのメンバーは、中でも注目すべきことにHuRは、mRNAの安定性を増大させることが実証されている。HuRは、全ての3つのクラスのAREと結合する。3’UTR中への核酸分子のHuR特異的結合部位を設計することで、HuR結合を引き起こし、ひいてはインビボでのメッセージの安定化を引き起こす。
マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合して、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって、遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNAシードを含んでなってもよい。このような配列は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2005/0261218号明細書および米国特許出願公開第2005/0059005号明細書で教示されるものなどの任意の既知のマ
イクロRNAに相当してもよい。
KK)、ジョンストン WK(Johnston WK)、ガレット−エンゲル P(Garrett−Engele P)、リム LP(Lim LP)、バーテル DP(Bartel DP)著、モレキュラー・セル(Mol Cell.)、2007年7月6日、第27巻、第1号、p91〜105を参照されたい。マイクロRNAシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。対象のマイクロRNAが利用できるという条件で、マイクロRNA標的配列を操作して、本発明のポリヌクレオチド(例えば、3’UTR様領域またはその他の領域)に入れることで、分子を分解のためまたは翻訳低下のために標的化し得る。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険性を低下させる。マイクロRNAの同定、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発現パターン、および生物学における役割が、報告されている(それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ボナウアー(Bonauer)ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ(Curr Drug Targets)、2010年、第11巻、p943〜949;アナンド(Anand)およびチェレシュ(Cheresh)著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー(Curr Opin Hematol)、2011年、第18巻、p171〜176;コントレラス(Contreras)およびラオ(Rao)著、ロイケミア(Leukemia)、2012年、第26巻、p404〜413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356);バーテル(Bartel)著、セル(Cell)、2009年、第136巻、p215〜233;ランドグラフ(Landgraf)ら著、セル(Cell)、2007年、第129巻、p1401〜1414)。
作され得る(すなわちそれから除去され得る)。例えば、miR−122結合部位が除去されて、肝臓内のタンパク質発現が改善されてもよい。複数組織内の発現調節は、導入または除去あるいは1つまたは数種のマイクロRNA結合部位を通じて達成され得る。
天然mRNAの5’キャップ構造は、核外搬出に関与し、mRNA安定性を増大させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP:Cap Binding Protein)に結合する。CBPは、成熟環式mRNA化学種を形成するCBPとポリ(A)結合タンパク質との結合を通じて、細胞内mRNA安定性および翻訳能力の原因となる。キャップは、mRNAスプライシング中における、5’隣接イントロン除去の除去をさらに促進する。
は前方末端転写ヌクレオチドはまた、任意選択的に2’−O−メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた5’キャップ除去は、分解のために、mRNA分子などの核酸分子を標的としてもよい。
England Biolabs)からのワクシニアキャッピング酵素が、製造会社の使用説明書に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドと共に使用されて、5’−ppp−5’キャップ中にホスホロチオエート結合が生成してもよい。α−メチル−ホスホネートおよびセレン含有ホスフェートヌクレオチドなどの追加的な修飾グアノシンヌクレオチドが、使用されてもよい。
7−(4−クロロフェノキシエチル)置換ジククレオチド(dicucleotide)形態の非限定的例としては、N7−(4−クロロフェノキシエチル)−G(5’)ppp(5’)GおよびN7−(4−クロロフェノキシエチル)−M3’−OG(5’)ppp(5’)Gキャップアナログが挙げられる(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、コレ(Kore)ら著、バイオオルガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー(Bioorganic&Medicinal Chemistry)、2013年、第21巻、p4570〜4574に記載される様々なキャップアナログおよびキャップアナログ合成法を参照されたい)。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、4−クロロ/ブロモフェノキシエチルアナログである。
オオムギ黄萎ウイルス(BYDV−PAV)、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(JSRV)および/または地方病性経鼻腫瘍ウイルスの翻訳エンハンサー配列(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012129648号パンフレットを参照されたい)などであるが、これに限定されるものではない、追加的なウイルス配列が操作されて、本発明のポリヌクレオチドに挿入され得、インビトロおよびインビボでコンストラクトの翻訳を刺激し得る。形質移入の12時間、24時間、48時間、72時間、および7日後に、形質移入実験が妥当な細胞系内で実施され得、タンパク質生成がELISAによってアッセイされ得る。
さらに、提供されるのは、配列内リボソーム進入部位(IRES:internal ribosome entry site)を含有してもよいポリヌクレオチドである。最初に特徴ピコルナウイルスRNAとして同定されたIRESは、5’キャップ構造不在下における、タンパク質合成の開始に重要な役割を果たす。IRESは、唯一のリボソーム結合部位の機能を果たしてもよく、またはmRNAの複数リボソーム結合部位の1つの役割を果たしてもよい。2つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳される、いくつかのペプチドまたはポリペプチド(「マルチシストロン性核酸分子」)をコードしてもよい。ポリヌクレオチドがIRESと共に提供される場合、第2の翻訳可能な領域が、任意選択的にさらに提供される。本発明に従って利用され得るIRES配列の例としては、限定されることなく、ピコルナウイルス(例えばFMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ブタコレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)由来のものが挙げられる。
RNAプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖(ポリAテール)がmRNA分子などのポリヌクレオチドに付加されて、安定性が増大されてもよい。転写直後に、転写物の3’末端が切断されて、3’ヒドロキシルが遊離されてもよい。次にポリAポリメラーゼが、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と称されるこの過程は、例えば、およそ80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250残基長を含む、およそ80からおよそ250残基長であり得る、ポリAテールを付加する。
本発明によれば、安定化のために、ポリAテール上の末端基が組み込まれてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、デス−3’ヒドロキシルテールを含んでもよい。それらは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、ジュンジ・リー(Junjie Li)ら著、(カレント・バイオロジー(Current Biology)、2005年8月23日、第15巻、p1501〜1507)によって教示されるような、構造部分または2’−Oメチル修飾もまた含んでもよい。
欠如によって識別され、その機能は、それに代えて、安定なステムループ構造とその同族のステムループ結合タンパク質(SLBP:stem−loop binding protein)とが担う;後者は、ポリアデニル化mRNA上のPABPと同様の機能を果たす」(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ノーベリー(Norbury)著、「細胞質内RNA:本末転倒の例(Cytoplasmic RNA:a case of the tail wagging the dog)」、ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー(Nature Reviews Molecular Cell Biology;AOP)、2013年8月29日オンライン公開;doi:10.1038/nrm3645)。
通常、ポリAテール長は、存在する場合、30ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリAテールは、35ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000またはそれを超えるヌクレオチド)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約30〜約3,000(例えば30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜750、30〜1,000、30〜1,500、30〜2,000、30〜2,500、50〜100、50〜250、50〜500、50〜750、50〜1,000、50〜1,500、50〜2,000、50〜2,500、50〜3,000、100〜500、100〜750、100〜1,000、100〜1,500、100〜2,000、100〜2,500、100〜3,000、500〜750、500〜1,000、500〜1,500、500〜2,000、500〜2,500、500〜3,000、1,000〜1,500、1,000〜2,000、1,000〜2,500、1,000〜3,000、1,500〜2,000、1,500〜2,500、1,500〜3,000、2,000〜3,000、2,000〜2,500、および2,500〜3,000)ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似性でありまたはそのように機能する領域を有してもよい。
一実施形態では、第1の開始コドンまたは代替開始コドンを遮蔽して遮蔽された開始コドンまたは代替開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替開始コドン上で翻訳が開始する可能性を高めるために、遮蔽剤が使用されもよい。
補体内に位置してもよい。miR結合部位の完全な補体は、遮蔽剤と同様に、翻訳、ポリヌクレオチドの長さおよび/または構造の調節を促進し得る。非限定的例として、開始コドンまたは代替開始コドンは、miR−122結合部位に対する完全な補体の中央に位置してもよい。開始コドンまたは代替開始コドンは、1番目のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、3番目のヌクレオチド、4番目のヌクレオチド、5番目のヌクレオチド、6番目のヌクレオチド、7番目のヌクレオチド、8番目のヌクレオチド、9番目のヌクレオチド、10番目のヌクレオチド、11番目のヌクレオチド、12番目のヌクレオチド、13番目のヌクレオチド、14番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチド、16番目のヌクレオチド、17番目のヌクレオチド、18番目のヌクレオチド、19番目のヌクレオチド、20番目のヌクレオチドまたは21番目のヌクレオチドの後に位置してもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)前に、少なくとも2つの終止コドンを含んでもよい。終止コドンは、TGA、TAA、およびTAGから選択されてもよい。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、終止コドンTGAおよび1つの追加的な終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加終止コドンは、TAAであってもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの終止コドンを含む。
ポリヌクレオチドはまた、治療的に妥当な部位へのポリペプチドの輸送を容易にする追加的な特徴をコードしてもよい。タンパク質輸送を促進するこのような1つの特徴は、シグナル配列である。本明細書の用法では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、約9〜200ヌクレオチド(3〜60アミノ酸)長で、それぞれ、コード領域またはコードされるポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれる。これらの配列の付加は、1つまたは複数の分泌系経路を通じた、コードされるポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。数種のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第1の領域を含んでなってもよい。本発明の目的のポ
リペプチドまたは「標的」は、下の表3に列挙される。目的のポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明に加えて、表3に示されるのは、ENSEMBL転写物ID(ENST)、ENSEMBLタンパク質ID(ENSP)、および利用できる場合は、最適化配列ID(OPT配列番号)である。任意の特定の遺伝子では、1つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。存在する場合、それらもまた表に示される。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。これらは、ORFまたはコード領域の5’(上流)または3’(下流)のいずれかで、各ENST転写物中でコードされる。コード領域は、ENSP配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。1つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利用することで、5’および3’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ENST転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのタンパク質切断部位を含有する、少なくとも1つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。タンパク質切断部位は、N末端;C末端;NとC末端の中間点、N末端と中間点の間、中間点とC末端の間などであるが、これに限定されるものではない、NおよびC末端間の任意の場所;およびそれらの組み合わせに位置してもよい。
1/3(PC1/3)、PC2、フューリン、PC4、PC5/6、対形成塩基性アミノ酸開裂酵素4(PACE4)およびPC7として知られている、酵母ケキシンに関連する7つの塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンイソ酵素1(SKI−1)およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン9(PCSK9)と称される、非塩基性残基で切断する2つのその他のサブチラーゼとを含んでなる、9つのプロティナーゼのファミリーである。
一実施形態では、ポリヌクレオチドの5’UTRは、同一塩基の少なくとも1つの領域および/または一連のヌクレオシドの挿入によって置換されてもよい。ヌクレオチド領域および/または一連のヌクレオチドは、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8ヌクレオチドを含んでもよいが、これに限定されるものではなく、ヌクレオチドは、天然および/または非天然であってもよい。非限定的例として、ヌクレオチド群は、5〜8個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書で開示される一連の別のヌクレオチドのいずれかおよび/またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
領域(+1〜+6などであるが、これに限定されるものではない)で、少なくとも1つの核酸が置換されることで、転写開始部位の下流で起こってもよい。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域の変化は、開始速度に影響を及ぼし、見かけのヌクレオチド三リン酸(NTP)反応定数値を増大させ、初期転写をキュアリングする転写複合体からの短い転写物の分離を増大させてもよい(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ブリーバ(Brieba)ら著、バイオケミストリー(Biochemistry)、2002年、第41巻、p5144〜5149)。少なくとも1つのヌクレオシドの修飾、置換および/または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こしてもよく、またはアミノ酸配列中に変異を引き起こしてもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの転写後制御調節因子
を含んでもよい。これらの転写後制御調節因子は、小型分子、化合物、および制御配列であってもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、転写後制御は、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド(South Plainfield,NJ)のPCTセラピューティクス株式会社(PTC Therapeutics Inc.)によって、同社のジェムス(GEMS)(商標)(小型分子による遺伝子発現調節(Gene Expression Modulation by Small−Moleclues))スクリーニング技術を使用して同定される、小型分子を使用して達成されてもよい。
設計−コドン最適化
ポリヌクレオチド、それらの領域または部分または小領域は、コドン最適化されてもよい。コドン最適化法は、当該技術分野で公知であり、いくつかの目的の1つまたは複数を
達成する試みにおいて、有用であってもよい。これらの目的としては、適切な折りたたみを確実にするための標的および宿主生物におけるコドン頻度の一致;mRNA安定性を増大させ、または二次構造を低下させるためのGC含有量の偏り、遺伝子の構築または発現を損なうこともあるタンデム反復コドンまたは塩基ランの最小化;転写および翻訳制御領域の個別調整;タンパク質輸送配列の挿入または除去;コード化タンパク質中の翻訳後修飾部位(例えばグリコシル化部位)の除去/付加;タンパク質ドメインの付加、除去またはシャッフル;制限酵素認識部位の挿入または欠失;翻訳比率を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にするためのリボソーム結合部位およびmRNA分解部位の修飾;またはポリヌクレオチド中の二次構造問題の低減または排除が挙げられる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的例としては、ライフテクノロジーズのジーンアートGeneArt(Life Technologies)、カリフォルニア州メンロパーク(Menlo Park CA)のDNA2.0が提供するサービスおよび/または独自仕様の方法が挙げられる。一実施形態では、ORF配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。各アミノ酸のためのコドン選択肢は、表4に記載される。
の両方を含有する必要はない。このような特徴の例としては、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、オリゴ(dT)配列、および検出可能タグが挙げられるが、これに限定されるものではなく、XbaI認識を有してもよい複数クローニング部位を含んでもよい。
が参照により本明細書に援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/53907号明細書の段落[000315]〜[000322]などに記載される。
鎖の合成中にまたは合成後に、非天然修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドまたは核酸に導入されて、所望の機能または特性が得られてもよい。修飾は、ヌクレオチド間系統、プリンまたはピリミジン塩基、または糖の上にあってもよい。修飾は、化学合成によって、またはポリメラーゼ酵素によって、鎖の末端に、または鎖中の他のいずれかの箇所に導入されてもよい。例えば、ヘキシトール核酸(HNA)はヌクレアーゼ耐性であり、RNAに強力なハイブリダイゼーションを提供する。2つのコドン中にヘキシトール残基がある短いメッセンジャーRNA(mRNA)が、構築されている(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ラブリク(Lavrik)ら著、バイオケミストリー(Biochemistry)、2001年、第40巻、p11777〜11784)。5’および3’HNA配列で挟まれるホスホロチオエート中心配列を含んでなる、キメラHNAギャップマーオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果もまた試験されている(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、カング(Kang)ら著、ニュークレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)、2004年、第32巻、第4号、p4411〜4419を参照されたい)。六員環を含んでなる修飾ヌクレオチドの調製と、RNA干渉、アンチセンス療法またはその他の用途におけるその使用は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ヘルデウィジン(Herdewijn)らに付与された、米国特許出願公開第2008/0261905号明細書および米国特許出願公開第2010/0009865号明細書および国際公開第97/30064号パンフレットで開示される。修飾核酸およびそれらの合成は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、同時係属国際公開第2013052523号パンフレット(代理人整理番号M09)で開示される。修飾ポリヌクレオチドの合成およびストラテジーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、フェルマ(Verma)およびエクスタイン(Eckstein)著、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annual Review of Biochemistry)、1998年、第76巻、p99〜134によって概説される。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エキソソーム中で、または1つまたは複数の体液から誘導された際に、定量化されてもよい。本明細書の用法では「体液」としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF:cerebrospinal
fluid)、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー氏腺液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、吐瀉物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、および臍帯血が挙げられる。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、
胃、腸管、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される臓器から取得されてもよい。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの精製は、ポリヌクレオチド浄化、品質保証、および品質管理を含んでもよいが、これに限定されるものではない。浄化は、マサチューセッツ州ダンバーズ(Danvers,MA)のベックマン・コールター・ゲノミクス(Beckman Coulter Genomics)からのジェンコート(GENCOURT)(登録商標)ビーズ;ポリTビーズ;デンマーク国ベズベック(Vedbaek,Denmark)のエキシコン社(EXIQON(登録商標)Inc)からのエルエヌエー(LNA)(商標)オリゴT捕捉プローブ;または強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC:reverse phase HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC:hydrophobic interaction HPLC)などであるが、これに限定されるものではないHPLCベースの精製法などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知
の方法によって実施されてもよい。「精製」という用語は、「精製ポリヌクレオチド」などのように、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも1つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書の用法では、「汚染物質」は、別の物質を不適当にし、不純にして、または劣化させる、任意の物質である。したがって、精製ポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、それが自然界で見られるのと異なる形態または設定で、またはそれが処理または精製法の対象とされる前に存在したのと異なる、形態または設定で存在する。
III.修飾
本明細書の用法では、ポリヌクレオチド(キメラポリヌクレオチド、IVTポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドなど)における、「化学修飾」または必要に応じて「化学修飾された」という用語は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、チミジン(T)またはシチジン(C)リボ−またはデオキシリブヌクレオシド(deoxyribnucleosides)に関する、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団の1つまたは複数における修飾を指す。通常、本明細書では、これらの用語は、天然の5’末端mRNAキャップ部分のリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
修飾は、様々な別個の修飾であってもよい。いくつかの実施形態では、領域は、1つ、2つ、またはそれを超える(任意選択的に異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有してもよい。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、細胞内で、未修飾ポリヌクレオチドと比較して分解の低下を示してもよい。
本発明は、例えば、ポリヌクレオチド分子の修飾リボヌクレオシド、および修飾リボヌクレオチドの基本単位もまた含む。例えば、これらの基本単位は、本発明のポリヌクレオチドを調製する上で有用たり得る。このような基本単位は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013052523号パンフレット(代理人整理番号M9)および国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2013/75177号明細書(代理人整理番号M36)で教示される。
ポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載されるようなRNAまたはmRNA)に組み込まれてもよい修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、基本単位分子)は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。2’位における代表的置換としては、H;ハロ;任意選択的に置換されたC1〜6アルキル;任意選択的に置換されたC1〜6アルコキシ;任意選択的に置換されたC6〜10アリールオキシ;任意選択的に置換されたC3〜8シクロアルキル;任意選択的に置換されたC3〜8シクロアルコキシ;任意選択的に置換されたC6〜10アリールオキシ;任意選択的に置換されたC6〜10アリール−C1〜6アルコキシ;任意選択的に置換されたC1〜12(ヘテロシクリル)オキシ;糖(例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載される任意のもの);ポリエチレングリコール(PEG)、−O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(式中、Rは、Hまたは任意選択的に置換されたアルキルであり、nは、0〜20の整数(例えば、0〜4、0〜8、0〜10、0〜16、1〜4、1〜8、1〜10、1〜16、1〜20、2〜4、2〜8、2〜10、2〜16、2〜20、4〜8、4〜10、4〜16、および4〜20)である);その中で2’ヒドロキシルが、C1〜6アルキレンまたはC1〜6ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖の4’炭素に結合されて、代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる、「ロックされた」核酸(LNA);本明細書で定義されるようなアミノアルキル;本明細書で定義されるようなアミノアルコキシ;本明細書で定義されるようなアミノ;および本明細書で定義されるようなアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する);リボース環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員環を形成する);リボースの環拡大(例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホロアミダート主鎖もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成する);多環形態(例えば、トリシクロ;およびグリコール核酸(例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって交換されたR−GNAまたはS−GNA)、(GNA)などの「アンロックされた」形態、トレオース核酸(リボースがα−L−トレオフラノシル−(3’→2’)で置換されたTNA);およびペプチド核酸(2−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびリン酸ジエステル主鎖を置換するPNA)が挙げられる。糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、1つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。このような糖修飾は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013052523号パンフレット(代理人整理番号M9)および国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2013/75177号明細書(代理人整理番号M36)で教示される。
本開示は、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されるように「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンまたはピリミジン)またはその誘導体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)との組み合わせで、糖分子(例えば、ペントースまたはリボース)またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載されるように、「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、任意の有用な方法によって、(例えば、1つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、化学的に、酵素的に、または組換え的に)合成されてもよい。ポリヌクレオチドは、連結ヌクレオシドの1つおよび複数の領域を含んでなってもよい。このような領域は、変動する主鎖結合を有してもよい。結合は、標準リン酸エステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド領域を含んでなる。
本発明のポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載される任意の1つまたは複数の修飾を含み得る。
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、1つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされた、ポリヌクレオチド組成物および複合体を提供する。医薬組成物は、任意選択的に、例えば、治療的および/または予防的活性物質などの、1つまたは複数の追加的な活性物質を含んでなってもよい。本発明の医薬組成物は、絶対無菌および/または発熱性物質非含有であってもよい。医薬品の製剤化および/または製造の概論は、例えば、レミントン:調剤の科学と実践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Lippincott Williams&Wilkins)、2005年(その内容全体が参照により本明細書に援用される)にある。
本発明のポリヌクレオチドは、(1)安定性を増大させ;(2)細胞形質移入を増大させ;(3)持続性または遅延性放出を可能にし(例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤からの);(4)生体内分布を変化させ(例えば、特定の組織または細胞型にポリヌクレオチドを標的化する);(5)インビボで、コード化タンパク質の翻訳を増大させ;および/または(6)インビボで、コード化タンパク質の放出プロファイルを変化させるための1つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散体または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料などの従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定されることなく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、(例えば、対象に移植するための)ポリヌクレオチドで形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびそれらの組み合わせを含み得る。したがって、本発明の製剤は1つまたは複数の賦形剤を含み得、賦形剤は、それぞれ、一緒になってポリヌクレオチドの安定性を増大させ、ポリヌクレオチドによる細胞形質移入を増大させ、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を増大させ、および/またはポリヌクレオチドがコードするタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して、製剤化されてもよい。
Tポリヌクレオチドを含んでなってもよい。さらに別の実施形態では、製剤は、IVTポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、および環状ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。
リピドイドの合成は、広範囲にわたって説明され、これらの化合物を含有する製剤は、特にポリヌクレオチドの送達に適している(全てその内容全体が本明細書に援用される、マホン(Mahon)ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjug
Chem.)、2010年、第21巻、p1448〜1454;シュローダー(Schroeder)ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン(J Intern
Med.)、2010年、第267巻、p9〜21;アキンク(Akinc)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2008年、第2
6巻、p561〜569;ラブ(Love)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2010年、第107巻、p1864〜1869;ジークバルト(Siegwart)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2011年、第108巻、p12996〜3001を参照されたい)。
Natl Acad Sci USA.)、2008年、第105巻、p11915〜11920;アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2009年、第17巻、p872〜879;ラブ(Love)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2010年、第107巻、p1864〜1869;ロイシュナー(Leuschner)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2011年、第29巻、p1005〜1010を参照されたい)本開示は、それらの製剤化と、ポリヌクレオチド送達におけるその使用を記載する。
クレオチドに加えて、3つまたは4つまたはそれを超える成分のいずれかを含んでなる粒子を含み得る。
本発明のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、製剤化され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成されてもよく、栄養素および医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用されてもよい、人工的に調製される小胞である。リポソームは異なるサイズであり得、直径が数百ナノメートルであってもよく、狭い水性区画によって隔てられる一連の同心円状二重層を含有してもよい、多重膜小胞(MLV:multilamellar vesicle);直径が50nmより小さくてもよい小型単細胞小胞(SUV:small unicellular vesicle);および直径が50〜500nmであってもよい大型単層小胞(LUV:large unicellular vesicle)などであるが、これに限定されるものではない。リポソーム設計としては、不健康組織へのリポソーム付着を改善するための、またはエンドサイトーシスなどであるが、これに限定されるものではない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドが挙げられるが、これに限定されるものではない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低または高pHを含有してもよい。
らのドキシル(DOXIL)(登録商標)などであるが、これに限定されるものではない、小分子薬剤を送達してもよいリポソームが挙げられる。
ポリペプチドをコードしてもよい、ポリヌクレオチドを送達するために形成されてもよい、リポソームを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、リポソームによってカプセル化されてもよく、および/またはそれは、次にリポソームによってカプセル化されてもよい水性コアに含まれてもよい(それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される。国際公開第2012031046号パンフレット、国際公開第2012031043号パンフレット、国際公開第2012030901号パンフレット、および国際公開第2012006378号パンフレット、および米国特許出願公開第20130189351号明細書、米国特許出願公開第20130195969号明細書、および米国特許出願公開第20130202684号明細書を参照されたい)。
06年、第5巻、第12号、p1708〜1713)、およびイスラエル国(Israel)のクワイエット・セラピューティクス(Quiet Therapeutics)からのヒアルロナン被覆リポソームなどであるが、これに限定されるものではないリポソームに製剤化されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、カチオン性脂質を含んでなるリポソームに製剤化されてもよい。リポソームは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013006825号パンフレットに記載されるように1:1〜20:1である、RNA中のリン酸塩に対するカチオン性脂質中の窒素原子のモル比(N:P比)を有してもよい。別の実施形態では、リポソームは、20:1を超えまたは1:1未満のN:P比を有してもよい。
ソーム中の脂質とmRNAの比率は、約約5:1〜約20:1、約10:1〜約25:1、約15:1〜約30:1および/または少なくとも30:1であってもよい。
120号パンフレット、国際公開第2011149733号パンフレット、国際公開第2011090965号パンフレット、国際公開第2011043913号パンフレット、国際公開第2011022460号パンフレット、国際公開第2012061259号パンフレット、国際公開第2012054365号パンフレット、国際公開第2012044638号パンフレット、国際公開第2010080724号パンフレット、国際公開第201021865号パンフレット、国際公開第2008103276号パンフレット、国際公開第2013086373号パンフレット、および国際公開第2013086354号パンフレット、米国特許第7,893,302号明細書、米国特許第7,404,969号明細書、米国特許第8,283,333明細書、および米国特許第8,466,122号明細書、および米国特許出願公開第20100036115号明細書、米国特許出願公開第20120202871号明細書、米国特許出願公開第20130064894号明細書、米国特許出願公開第20130129785号明細書、米国特許出願公開第20130150625号明細書、米国特許出願公開第20130178541号明細書、および米国特許出願公開第20130225836号明細書に記載されるカチオン性脂質から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012040184号パンフレット、国際公開第2011153120号パンフレット、国際公開第2011149733号パンフレット、国際公開第2011090965号パンフレット、国際公開第2011043913号パンフレット、国際公開第2011022460号パンフレット、国際公開第2012061259号パンフレット、国際公開第2012054365号パンフレット、国際公開第2012044638号パンフレット、および国際公開第2013116126号パンフレット、または米国特許出願公開第20130178541号明細書および米国特許出願公開第20130225836号明細書に記載される、式Aから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2008103276号パンフレットの式CLI〜CLXXIX、米国特許第7,893,302号明細書の式CLI〜CLXXIX、米国特許第7,404,969号明細書の式CLI〜CLXXXXII、および米国特許出願公開第20100036115号明細書の式I〜VI、米国特許出願公開第20130123338号明細書の式Iから選択されてもよいが、これに限定されるものではない。非限定的例として、カチオン性脂質は、(20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメミルヘキサコサ(dimemylhexacosa)−17,20−ジエン−9−アミン、(1Z,19Z)−N5N−ジメチルペンタコサ−16、19−ジエン−8−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチルドコサ−13,16−ジエン−5−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチルヘニコサ−12,15−ジエン−4−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−6−アミン、(15Z,18Z)−N,N−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−7−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−10−アミン、(15Ζ,18Ζ)−Ν,Ν−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−5−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−4−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメイヒルオクタコサ(dimeihyloctacosa)−19,22−ジエン−9−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−8−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17,20−ジエン−7−アミン、(16Z,19Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−6−アミン、(22Z,25Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22,25−ジエン−10−アミン、(21Z,24Z)−N,N−ジメチルトリアコンタ−21,24−ジエン−9−アミン、(18Z)−N,N−ジメチルヘプタコス(dimetylheptacos)−18−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルヘキサコス17−エン−9−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメチルオクタコサ−19,22−ジエン−7
−アミン、N,N−ジメチルヘプタコサン−10−アミン、(20Z,23Z)−N−エチル−N−メチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、1−[(11Z,14Z)−1−ノニリコサ−11,14−ジエン−1−イル]ピロリジン、(20Z)−N,N−ジメチルヘプタコス−20−エン−10−アミン、(15Z)−N,N−ジメチルエプタコス(eptacos)−15−エン−10−アミン、(14Z)−N,N−ジメチルノナコス−14−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルノナコス−17−エン−10−アミン、(24Z)−N,N−ジメチルトリトリアコント−24−エン−10−アミン、(20Z)−N,N−ジメチルノナコス−20−エン−10−アミン、(22Z)−N,N−ジメチルヘントリアコント−22−エン−10−アミン、(16Z)−N,N−ジメチルペンタコス−16−エン−8−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチル−2−ノニルヘニコサ−12,15−ジエン−1−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチル−3−ノニルドコサ−13,16−ジエン−1−アミン、N,N−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]エプタデカン(eptadecan)−8−アミン、1−[(1S,2R)−2−ヘキシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、N,N−ジメチル−21−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘニコサン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン−8−アミン、Ν,Ν−ジメチル−[(1R,2S)−2−ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン−5−アミン、N,N−ジメチル−3−{7−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン−1−アミン、1−[(1R,2S)−2−ヘプチルシクロプロピル]−Ν,Ν−ジメチルオクタデカン−9−アミン、1−[(1S,2R)−2−デシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルペンタデカン−6−アミン、N,N−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ペンタデカン−8−アミン、R−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、S−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−[(5Z)−oct−5−en−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘプチルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−(ノニルオキシ)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(9Z)−オクタデク−9−エン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン;(2S)−N,N−ジメチル−1−[(6Z,9Z,12Z)−オクタデカ−6,9,12−トリエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(ペンチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−3−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−Ν,Ν−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ
)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z)−ドコス−13−エン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(13Z)−ドコス−13−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(9Z)−ヘキサデク−9−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2R)−N,N−ジメチル−H(1−メトイルオクチル(metoylo ctyl))オキシ]−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2R)−1−[(3,7−ジメチルオクチル)オキシ]−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−(オクチルオキシ)−3−({8−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−{[8−(2−オクリルシクロプロピル(oclylcyclopropyl))オクチル]オキシ}−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミンおよび(11E,20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−11,20,2−トリエン−10−アミン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩または立体異性体から選択されてもよい。
、本明細書に記載される修飾RNAは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2011127255号パンフレットおよび/または国際公開第2008103276号パンフレットに記載されるようにしてLNP製剤中でカプセル化されてもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、迅速排除脂質ナノ粒子(reLNP:rapidly eliminated lipid nanoparticle)として知られている生分解性カチオン性脂質によって、カチオン性脂質を置換することで、改良されてもよい。DLinDMA、DLin−KC2−DMA、およびDLin−MC3−DMAなどであるが、これに限定されるものではない、イオン化可能カチオン性脂質は、血漿および組織内に経時的に蓄積内にして、毒性の潜在的な供給源になってもよいことが示されている。迅速排除脂質の迅速な代謝は、ラットにおいて、脂質ナノ粒子の耐容性および治療指数を1mg/kg用量から10mg/kg用量に一桁分改善し得る。酵素分解されるエステル結合の包含は、カチオン性成分の分解および代謝プロファイルを改善し得る一方で、なおもreLNP製剤の活性を保つ。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置し得、またはそれは、脂質鎖の端末側終端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置換してもよい。
一実施形態では、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含んでもよい脂質ナノ粒子を送達することで引き起こされてもよい(それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120189700号明細書および国際公開第2012099805号パンフレット)。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル化し、またはナノ化学種を部分的にカプセル化してもよい。免疫原は、本明細書に記載される、組換えタンパク質、修飾RNAおよび/またはポリヌクレオチドであってもよい。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、病原体に対するワクチンなどであるが、これに限定されるものではない、ワクチンで使用するために製剤化されてもよい。
、ジーン・セラピー(Gene Ther)、2006年、第13巻、p1360〜1370;グートビア(Gutbier)ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス(Pulm Pharmacol.Ther.)、2010年、第23巻、p334〜344;カウフマン(Kaufmann)ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ(Microvasc Res)、2010年、第80巻、p286〜293;ヴァイデ(Weide)ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー(J Immunother.)、2009年、第32巻、p498〜507;ヴァイデ(Weide)ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー(J Immunother.)、2008年、第31巻、p180〜188;パスコロ(Pascolo)著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opin.Biol.Ther.)、第4巻、p1285〜1294;フォティン−・ムレチェク(Fotin−Mleczek)ら著、2011年、ジャーナル・オブ・イムノセラピー(J.Immunother.)、第34巻、p1〜15;ソン(Song)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnol.)、2005年、第23巻、p709〜717ピア(Peer)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2007年、第6号、第104巻、p4095〜4100;ド・フジュロル(deFougerolles)著、ヒューマン・ジーン・セラピー(Hum Gene Ther.)、2008年、第19巻、p125〜132)などのリポプレックスとして製剤化される。
Biotechnol.)、2005年、第23巻、p709〜717ジャッジ(Judge)ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J Clin
Invest.)、2009年、第119巻、p661〜673;カウフマン(Kaufmann)ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ(Microvasc Res)、2010年、第80巻、p286〜293;サンテル(Santel)ら著、ジーン・セラピー(Gene Ther)、2006年、第13巻、p1222〜1234;サンテル(Santel)ら著、ジーン・セラピー(Gene Ther)、2006年、第13巻、p1360〜1370;グートビア(Gutbier)ら著、パルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス(Pulm Pharmacol.Ther.)、2010年、第23巻、p334〜344;バシャ(Basha)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2011年、第19巻、p2186〜2200;フェンスケ(Fenske)およびキュリス(Cullis)、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Opin Drug Deliv.)、2008年、第5号、p25〜44;ピア(Peer)ら著、サイエンス(Science.)、2008年、第319巻、p627〜630;ピア(Peer)およびリーバーマン(Lieberman)、ジーン・セラピー(Gene Ther.)2011年、第18巻、p1127〜1133)。製剤の肝細胞への受動的標的化の一例としては、アポリポタンパク質Eと結合して、インビボでこれらの製剤の肝実質細胞への結合および取り込みを促進することが示されている、DLin−DMA、DLin−KC2−DMAおよびDLin−MC3−DMAベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられる(その内容全体が参照により本明細書に援用される、アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p1357〜1364)。製剤はまた、それらの表面上の異なるリガンドの発現を通じて選択的に標的化され得、それは葉酸、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体標
的化アプローチによって例示されるが、それによって限定されない(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コルハトカル(Kolhatkar)ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー(Curr Drug Discov Technol.)、2011年、第8巻、p197〜206;ムサッキオ(Musacchio)およびトーチリン(Torchilin)、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス(Front Biosci.)、2011年、第16巻、p1388〜1412;ユー(Yu)ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー(Mol Membr Biol.)、2010年、第27巻、p286〜298;パティル(Patil)ら著、クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリアー・システムズ(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.)、2008年、第25巻、p1〜61;ブノワ(Benoit)ら著、バイオモレキュールズ(Biomacromolecules.)、2011年、第12巻、p2708〜2714;チャオ(Zhao)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert Opin Drug Deliv.)、2008年、第5巻、p309〜319;アキンク(Akinc)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p1357〜1364;スリニバサン(Srinivasan)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2012年、第820巻、p105〜116;ベン・アリ(Ben−Arie)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2012年、第757巻、p497〜507;ピア(Peer)著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(J Control Release.)、2010年、第20巻、p63〜68;ピア(Peer)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2007年、第104巻、p4095〜4100;キム(Kim)ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol.)、2011年、第721巻、p339〜353;スブラマニャ(Subramanya)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2010年、第18巻、p2028〜2037;ソン(Song)ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol.)、2005年、第23巻、p709〜717ピア(Peer)ら著、サイエンス(Science.)、2008年、第319巻、p627〜630;ピア(Peer)およびリーバーマン(Lieberman)、ジーン・セラピー(Gene Ther.)2011年、第18巻、p1127〜1133)。
を伴って、ポリプレックスプラスミドDNAの効果的な全身送達を可能にする。(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ヘイズ(Heyes)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol Ther.)、2007年、第15巻、p713〜720)。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用されてもよい。
術分野で公知の任意のポリマー内にカプセル化されてもよい。別の非限定的例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であってもよい、ポリマーマトリックス内にカプセル化されてもよい。
されるジブロック共重合体を含んでなってもよい。さらに別の実施形態では、ジブロック共重合体は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013120052号パンフレットに記載されるものなどの高度Xジブロック共重合体であってもよい。
enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.)」ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(J Controlled Release.)、2007年、第118巻、p245〜253を参照されたい)。本発明のポリヌクレオチドは、PEG−PLGA−PEGブロック共重合体を含んでなる、脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
3号明細書に記載される方法によって、製剤化されてもよい。
sign and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing)」、(ラングミュア(Langmuir.)、2012年、第28巻、p3633〜40;ベリボー,N.M.(Belliveau,N.M.)ら著、「siRNAのインビボ送達のための非常に強力な限界寸法脂質ナノ粒子のマイクロ流体合成(Microfluidic synthesis of highly potent limit−size lipid nanoparticles for
in vivo delivery of siRNA)」、モレキュラー・セラピー・ニュークレイック・アシッズ(Molecular Therapy−Nucleic
Acids.)、2012年、1:e37;チェン,D.(Chen,D.)ら著,「制御されるマイクロ流体製剤によって可能になる強力なsiRNA含有脂質ナノ粒子の迅速な発見(Rapid discovery of potent siRNA−containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation)」米国化学会誌(J Am Chem Soc.)、2012年、第134巻、第16号、p6948〜51)が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、SHMを含んでなるLNPを生成する方法は、少なくとも2つの投入ストリームを混合するステップをさらに含んでなり、混合は、微細構造誘導性カオス的移流(MICA:microstructure−induced chaotic advection)によって起こる。この方法によって、流体ストリームはヘリンボーンパターンで存在するチャネルを通過して、回転流が引き起こされて流体は互いの周辺に折りたたまれる。この方法はまた、表面が、流体循環中の方向を変化させることを特徴とする、流体混合のための表面を含んでなってもよい。SHMを使用してLNPを生成する方法としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される、米国特許出願公開第2004/0262223号明細書および米国特許出願公開第2012/0276209号明細書で開示されるものが挙げられる。
Interdigital Micro Mixer)またはキャタピラ(CPMM)または衝突ジェット(IJMM:Impinging−jet))などであるが、これに限定されるものではない、マイクロミキサーを使用して生成される、脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。
haotic Mixer for Microchannels.)」、サイエンス(Science)、2002年、第295号、p647〜651を参照されたい)。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、100nmを超え、150nmを超え、200nmを超え、250nmを超え、300nmを超え、350nmを超え、400nmを超え、450nmを超え、500nmを超え、550nmを超え、600nmを超え、650nmを超え、700nmを超え、750nmを超え、800nmを超え、850nmを超え、900nmを超え、950nmを超え、または1000nmを超える直径を有してもよい。
cylphophatidylcholine)、および1−パルミトイル−2−オレオイルホスファチジルコリン(POPC)などであるが、これに限定されるものではない、リン脂質を含んでなってもよい。別の態様では、限界寸法脂質ナノ粒子は、DLPE−PEG、DMPE−PEG、DPPC−PEG、およびDSPE−PEGなどであるが、これに限定されるものではない、ポリエチレングリコール脂質を含んでなってもよい。
(III)2−{4,7−ビス−カルボキシメチル−10−[(N,N−ジステアリルアミドメチル−N’−アミド−メチル]−1,4,7,10−テトラ−アザシクロドデク−1−イル}−酢酸と、中性完全飽和リン脂質成分を含んでなってもよい(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130129636号明細書を参照されたい)。
されてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、天然および/または合成ポリマーを使用して製剤化され得る。送達のために使用されてもよいポリマーの非限定的例としては、限定されることなく、カリフォルニア州パサデナ(Pasadena,CA)のアローヘッド・リサーチ・コーポレーション(Arrowhead Research Corp.)からのダイナミック・ポリコンジュゲート(DYNAMIC POLYCONJUGATE)(登録商標);ウィスコンシン州マジソン(Madison,WI)のミルス(MIRUS)(登録商標)ビオ(Bio)およびウィスコンシン州マジソン(Madison,WI)のロシュ・マジソン(Roche Madison)からの製剤;ワシントン州シアトル(Seattle,WA)のフェーズアールエクス(PHASERX)(登録商標)からのスマート・ポリマー・テクノロジー(SMARTT POLYMER TECHNOLOGY)(商標)などのフェーズアールエクス(PHASERX)(商標)ポリマー製剤;DMRI/DOP;ポロキサマー;カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego,CA)のビカル(Vical)からのバックスフェクチン(VAXFECTIN)(登録商標)アジュバント;キトサン;カリフォルニア州パサデナ(Pasadena,CA)のカランド・フファーマスーティカルズ(Calando Pharmaceuticals)からのシクロデキストリン;デンドリマー;およびポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸
)(PLGA)ポリマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。カリフォルニア州パサデナ(Pasadena,CA)のアローヘッド・リサーチ・コーポレーション(Arrowhead Research Corp.)からのロンデル(RONDEL)(商標)アールエヌエーアイ/オリゴヌクレオチド・ナノパーティクル・デリバリー(RNAi/Oligonucleotide Nanoparticle Delivery)ポリマー;およびワシントン州シアトル(Seattle,WA)のフェーズアールエクス(PHASERX)(登録商標)などであるが、これに限定されるものではない、pH応答性共ブロックポリマーである。
クトサミン基の置換を通じて、標的をアシアロ糖タンパク質受容体発現肝実質細胞から、類洞内皮およびクッパー細胞に変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞における、EWS−FLI1遺伝子産物の標的化サイレンシングを実証し、(その内容全体が参照により本明細書に援用される、フー・リスコバン(Hu−Lieskovan)ら著、キャンサー・リサーチ(Cancer Res.)、2005年、第65巻、p8984〜8982)これらのナノ粒子に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類において良好に耐えられた(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ハイデル(Heidel)ら著、米国科学アカデミー紀(Proc Natl Acad Sci USA)、2007年、第104巻、p5715〜21)。これらの両方の送達ストラテジーは、標的化送達およびエンドソーム漏出機構の両方を使用する、合理的なアプローチを取り入れる。
nc.)からのフィブリノーゲンポリマーなどの外科用シーラント;イリノイ州ディアフィールド(Deerfield,IL)のバクスター・インターナショナル株式会社(Baxter International,Inc)からのティセル(TISSELL)(登録商標);PEGベースのシーラント、およびイリノイ州ディアフィールド(Deerfield,IL)のバクスター・インターナショナル株式会社(Baxter International,Inc)からのコシール(COSEAL)(登録商標)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
リ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−コ−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはまたはそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、少なくとも1つのポリマーが挙げられる。
は、本発明のポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2011115862号パンフレットに記載される、式Zのポリマーと共に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012082574号パンフレットまたは国際公開第2012068187号パンフレットおよび米国特許出願公開第2012028342号明細書に記載される、式Z、Z’またはZ’’のポリマーと共に製剤化されてもよい。本発明の修飾RNAと共に製剤化されたポリマーは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012082574号パンフレットまたは国際公開第2012068187号パンフレットに記載される方法によって合成されてもよい。
共重合体は、当該技術分野で公知の方法および/またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,057,821号明細書、米国特許第8,444,992号明細書、または米国特許出願公開第2012009145号明細書に記載されるような方法によって製造されてもよい。例えば、多重ブロック共重合体は、分枝ポリエチレンイミンと比較して、別個のパターンを有する、直鎖ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを使用して合成されてもよい。さらに、組成物または医薬組成物は、本明細書に記載される、またはそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20100004315号明細書、または米国特許第6,267,987号明細書および米国特許第6,217,912号明細書に記載されるような、当該技術分野で公知の方法によって製造されてもよい。
、PLGA−DSPE−PEGが形成されてもよい。別の非限定的例として、本発明によって使用されるPEGコンジュゲートは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2008103276号パンフレットに記載される。ポリマーは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,273,363号明細書に記載されるコンジュゲートなどであるが、これに限定されるものではない、リガンドコンジュゲートを使用して、コンジュゲートされてもよい。
2−(オレオイルオキシ)エチル]−2−オレイル−3−(2−ヒドロキシエチル)イミダゾリニウム塩化物(DOTIM)、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、3B−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウム臭化物(DDAB)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウム塩化物DODAC)、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130065942号明細書に記載されるものなどのカチオン性リポポリマーと共に製剤化されてもよい。
Mater.)2006年、第5巻、p791〜796;フラー(Fuller)ら著、バイオマテリアルズ(Biomaterials.)、2008年、第29巻、p1526〜1532;デコッカー(DeKoker)ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Adv Drug Deliv Rev.)、2011年、第63巻、p748〜761;エンドレス(Endres)ら著、バイオマテリアルズ(Biomaterials.)、2011年、第32巻、p7721〜7731;スー(Su)ら著、モレキュラー・ファーマコロジー(Mol Pharm.)、2011年6月6日、第8巻、第3号、p774〜87)。非限定的例として、ナノ粒子は、親水性−疎水性ポリマー(例えばPEG−PLGA)、疎水性ポリマー(例えばPEG)および/または親水性ポリマーなどであるが、これに限定されるものではない、複数のポリマーを含んでなってもよい(その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第20120225129号パンフレット)。
Gポリアニオンブロック共重合体上で改善されてもよい。
明細書に援用される、国際公開第2013049328号パンフレットに記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、ジアルファテック(di−alphatic)置換PEG化脂質であってもよい。
ーゼ発現を有意に抑制することが確認された。(その内容全体が参照により本明細書に援用される、シャイ(Shi)ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション(Angew Chem Int Ed.)、2011年、第50巻、p7027〜7031)。
本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入を増大させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質と共に製剤化され得る。一実施形態では、細胞透過性のペプチドなどであるが、これに限定されるものではないペプチド、および細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドが使用されて、医薬製剤が送達されてもよい。本発明の薬剤製剤と共に使用されてもよい細胞透過性ペプチドの非限定的例としては、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドなどの細胞内空間への送達を容易にするポリカチオンに付着する、細胞透過性ペプチド配列が挙げられる(例えば、全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、カロン(Caron)ら著、モレキュラー・セラピー(Mol.Ther.)、2001年、第3巻、第3号、p310〜8;ランゲル(Langel)著、「細胞透過性ペプチド:プロセスおよび応用(Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications)」、シーアールシー・プレス(CRC)、フロリダ州ボカラトン(Boca Raton FL)、2002年;エル−アンダロウシ(El−Andaloussi)ら著、カレント・ファーマスーティカル・デザイン(Curr.Pharm.Des.)、2003年、第11巻、第28号、p3597〜611;およびデシャイエ(Deshayes)ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ(Cell.Mol.Life Sci.)、2005年、第62巻、第16号、p1839〜49を参照されたい)。組成物はまた、例えば、細胞内空間への組成物送達を促進するリポソームなどの細胞透過性因子を含むように、製剤化され得る。本発明のポリヌクレオチドは、細胞内送達を可能にするために、マサチューセッツ州ケンブリッジ(Cambridge,MA)のエルロン・セラピューティクス(Aileron Therapeutics)およびマサチューセッツ州ケンブリッジ(Cambridge,MA)のパーメロン・バイオロジクス(Permeon Biologics)からのペプチドおよび/またはタンパク質などであるが、これに限定されるものではない、ペプチドおよび/またはタンパク質に複合体化されてもよい(全てそれらの内容全体が参照により本明細書に援用される、クロニカン(Cronican)ら著、エーシーエス・ケミカル・バイオロジー(ACS Chem.Biol.)、2010年、第5巻、p747〜752;マクノートン(McNaughton)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、2009年、第106巻、p6111〜6116;Sawyer著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン(Chem Biol Drug Des.)、2009年、第73巻、p3〜6;ベルジン(Verdine)およびヒリンスキー(Hilinski)著、メソッズ・イン・エンザイモロジ−(Methods Enzymol.)、2012年、第503巻、p3〜33)。
本発明のポリヌクレオチドは、生体外で(ex vivo)細胞内に形質移入され得、それは引き続いて対象に移植される。非限定的例として、医薬組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄性細胞に送達するための赤血球、ウイルス様粒子(VLP:virus−like particle)内の修飾RNAを送達するためのビロソーム、およびメリーランド州ゲーサーズバーグ(Gaithersburg,MD)のマックスサイト(MAXCYTE)(登録商標)からの、およびフランス国リヨン(Lyon,France)のエリテック(ERYTECH)(登録商標)からのものなどであるが、これに限定されるものではない、修飾RNAを送達するための電気穿孔細胞を含んでもよい。ポリヌクレオチド以外のペイロードを送達するための、赤血球、ウイルス性粒子、および電気穿孔細胞の使用の例は、実証されている(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、ゴッドフリン(Godfrin)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opin Biol Ther.)、2012年、第12巻、p127〜133;ファング(Fang)ら著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opin Biol Ther.)、2012年、第12巻、p385〜389;フー(Hu)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc Natl Acad Sci USA.)、2011年、第108巻、p10980〜10985;ルンド(Lund)ら著、ファーマスーティカル・リサーチ(Pharm Res.)、2010年、第27巻、p400〜420;ハックリーデ(Huckriede)ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ(J Liposome Res.)、2007年、第17巻、p39〜47;クシ(Cusi)著、ヒューマン・ワクチン(Hum Vaccin.)、2006年、第2巻、p1〜7;ド・ジョンジュ(de Jonge)ら著、ジーン・セラピー(Gene Ther.)、2006年、第13巻、400〜411頁)。
ウイルス媒介性技術および非ウイルス媒介性技術を含む多様な方法が、当該技術分野で公知であり、細胞に核酸を導入するのに適する。典型的な非ウイルス媒介性技術の例とし
ては、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、微粒子銃媒介性移入(ナノ粒子)、カチオン性ポリマー媒介性移入(DEAE−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール(PEG)など)または細胞融合が挙げられるが、これに限定されるものではない。
Gene Ther.)、2010年、第10巻、p128〜138)。電気穿孔装置は、マサチューセッツ州ホリストン(Holliston,MA)のビーティーエックス(BTX)(登録商標)インスツルメンツ(Instruments)(例えば、アジャイルパルス・イン・ビボ・システム(AgilePulse In Vivo System))およびペンシルベニア州ブルーベル(Blue Bell,PA)のイノビオ(Inovio)(例えば、イノビオ(Inovio)SP−5P筋肉内送達デバイスまたはセレクトラ(CELLECTRA)(登録商標)3000皮内送達デバイス)を含むが、これに限定されるものではない世界中の多数の企業によって販売される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、電気穿孔によって送達されてもよい。
ポリヌクレオチドは、微小器官に含有されてもよく、次にそれは持続性治療製剤中で、コードされる目的のポリペプチドを発現し得る。微小器官およびそれらの製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000701]〜[000705]中などに記載される。
本発明のポリヌクレオチドの筋肉内または皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含み得る。ヒアルロニダーゼは、間質関門の構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することで、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって組織透過性を高める(その内容全体が参照により本明細書に援用される、フロスト(Frost)著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー(Expert
Opin.Drug Deliv)、2007年、第4巻、p427〜440)。それは、形質移入細胞によって生成されるコードされるタンパク質の分散と、全身分布を促進するのに有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼが使用されて、筋肉内または皮下投与される本発明のポリヌクレオチドに曝露される、細胞数が増大され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ナノ粒子模倣体内にカプセル化されおよび/またはそれに吸収されてもよい。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、プリオン、および細胞などであるが、これに限定されるものではない、送達機能生物または粒子を模倣し得る。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る、非ヴィロン粒子内にカプセル化されてもよい。(それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012006376号パンフレットおよび米国特許出願公開第20130171241号明細書および米国特許出願公開第20130195968号明細書を参照されたい)。
本発明のポリヌクレオチドは、ロゼットナノチューブ、リンカーがある対塩基を有するロゼットナノチューブ、炭素ナノチューブ、および/または単一壁炭素ナノチューブなどであるが、これに限定されるものではない、少なくとも1つのナノチューブに付着し得、または別の方法でそれに結合し得る。ポリヌクレオチドは、立体化学力、イオン力、共有結合力および/またはその他の力などであるが、これに限定されるものではない力を介して、ナノチューブに結合してもよい。ポリヌクレオチドを含んでなるナノチューブおよびナノチューブ製剤は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000708]〜[000714]中などに記載される。
本発明のポリヌクレオチドは、担体または標的化群に共有結合する、または一緒になって融合タンパク質(例えば、標的化群と治療用タンパク質またはペプチドとを有する)を生じる2つのコード領域を含む、ポリヌクレオチドなどのコンジュゲートを含む。
、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣剤、またはアプタマーであり得る。
Santarisからのものなど、ロックド核酸(LNA)の調製を教示する典型的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第6,268,490号明細書;米国特許第6,670,461号明細書;米国特許第6
,794,499号明細書;米国特許第6,998,484号明細書;米国特許第7,053,207号明細書;米国特許第7,084,125号明細書;および米国特許第7,399,845号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)および2’−フルオロ(2’−F)が挙げられる。同様の修飾はまた、その他の位置、特に、3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位に、または2’−5’連結dsRNA中に、および5’末端ヌクレオチドの5’位に作成されてもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する典型的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第4,981,957号明細書;米国特許第5,118,800号明細書;米国特許第5,319,080号明細書;米国特許第5,359,044号明細書;米国特許第5,393,878号明細書;米国特許第5,446,137号明細書;米国特許第5,466,786号明細書;米国特許第5,514,785号明細書;米国特許第5,519,134号明細書;米国特許第5,567,811号明細書;米国特許第5,576,427号明細書;米国特許第5,591,722号明細書;米国特許第5,597,909号明細書;米国特許第5,610,300号明細書;米国特許第5,627,053号明細書;米国特許第5,639,873号明細書;米国特許第5,646,265号明細書;米国特許第5,658,873号明細書;米国特許第5,670,633号明細書;および米国特許第5,700,920号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
自己組織化ナノ粒子
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、自己組織化ナノ粒子に製剤化されてもよい。核酸自己組織化ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特
許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000740]〜[000743]中などに記載される。ポリマーベースの自己組織化ナノ粒子は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000744]〜[000749]中などに記載される。
ポリヌクレオチドは、送達のために、両親媒性巨大分子(AM:amphiphilic macromolecule)に製剤化されてもよい。AMは、ポリ(エチレングリコール)に共有結合的に連結するアルキル化糖主鎖を有する、生体適合性両親媒性ポリマーを含んでなる。水溶液中において、AMは、自己組織化してミセルを形成する。AMを形成する方法、およびAMの非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130217753号明細書に記載される。
本発明のポリヌクレオチデス(polynucleotidess)は、無機ナノ粒子に製剤化されてもよい。(その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,257,745号明細書)。無機ナノ粒子としては、水膨潤性の粘土物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。非限定的例として、無機ナノ粒子としては、単純なケイ酸塩から製造される合成)スメクタイト粘土が挙げられる(例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第5,585,108号明細書および米国特許第8,257,745号明細書を参照されたい)。
本発明のポリヌクレオチデス(polynucleotidess)は、半導電または金属素材を含んでなる水分散性ナノ粒子に製剤化されてもよく(その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120228565号明細書)、または磁性ナノ粒子に形成されてもよい(それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20120265001号明細書および米国特許出願公開第20120283503号明細書)。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子または親水性ナノ粒子であってもよい。
一実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意のハイドロゲル中にカプセル化されてもよく、それは対象に注射されるとゲルを形成してもよい。ゲルおよびハイドロゲルなどの外科用シーラントは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000762]〜[000809]中などに記載される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、水不混和性油デポー、界面活性剤および/または共界面活性剤および/または共溶媒を含んでなる、懸濁製剤が提供される。油および界面活性剤の組み合わせは、ポリヌクレオチドとの懸濁製剤を可能にしてもよい。水不混和性デポー中のポリヌクレオチド送達が使用されて、デポーから周囲の生理学的環境内へのmRNAの持続性放出を通じて生物学的利用能が改善され、ヌクレアーゼによるポリヌクレオチド分解が防止されてもよい。
、これに限定されるものではない、ナノエマルションに製剤化されてもよい。ナノエマルションは、本明細書に記載されるナノ粒子を含んでなってもよい。非限定的例として、ナノ粒子は、脂質または界面活性剤層で取り囲まれてもよく、またはそれで被覆されてもよい、液体疎水性コアを含んでなってもよい。脂質または界面活性剤層は、少なくとも1つの膜組み込みペプチドを含んでなってもよく、また標的化リガンドを含んでなってもよい(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,496,945号明細書を参照されたい)。
本明細書で開示されるポリヌクレオチド製剤は、カチオンまたはア二オンを含んでもよい。一実施形態では、製剤は、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+、およびそれらの組み合わせなどであるが、これに限定されるものではない、金属カチオンを含む。非限定的例として、製剤は、金属カチオンと複合体化されたポリマーおよびポリヌクレオチドを含んでもよい。(例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第6,265,389号明細書および米国特許第6,555,525号明細書を参照されたい)。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ナノ粒子および/または微粒子に製剤化されてもよい。これらのナノ粒子および/または微粒子は、任意のサイズ、形状、および化学的性質に成形されてもよい。一例として、ナノ粒子および/または微粒子は、ノースカロライナ州モリスビル(Morrisville,NC)のリキダ・テクノロジーズ(LIQUIDA TECHNOLOGIES)(登録商標)によるプリント(PRINT)(登録商標)技術を使用して製造されてもよい(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2007024323号パンフレットを参照されたい)。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ペンシルベニア州ステートカレッジ(State College,PA)のキーストーン・ナノ(Keystone Nano)によって、ナノジャケットおよびナノリポソームに製剤化されてもよい。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含む体内で天然に見られる化合物からできており、小量のケイ酸塩もまた含んでもよい。ナノジャケットは、サイズが5〜50nmの範囲であってもよく、ポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、親水性および疎水性化合物を送達するのに使用されてもよい。
一実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、偽ウイルス粒子(例えば、偽ウイルス粒子)に製剤化されてもよい。非限定的例として、偽ウイルス粒子は、マサチューセッツ州ケンブリッジ(Cambridge,MA)のアウラ・バイオサイエンシズ(Aura Biosciences)によって開発されたもの、および/またはそれによって記載されるものであってもよい。一態様では、偽ウイルス粒子は、ケラチノサイトおよび基底膜に薬剤を送達するために開発されてもよい(例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130012450号明細書、米国特許出願公開第20130012566号明細書、米国特許出願公開第21030012426号明細書、および米国特許出願公開第20120207840号明細書、および国際公開第2013009717号パンフレットを参照されたい)。
るパピローマウイルス感染に至る初期段階(The initial steps leading to papillomavirus infection occur on the basement membrane prior to cell surface binding)」、米国科学アカデミー紀要(PNAS)、2009年、第106巻、第48号、p20458〜20463;ロバーツ(Roberts)ら著、「マウスモデルにおけるHPVの生殖器伝染はノノキシノール−9によって増強されカラギーナンによって阻害される(Genital transmission of HPV in a mouse model is potentiated by nonoxynol−9 and inhibited by carrageenan)」、ネイチャー・メディシン(Nature Medicine)2007年、第13巻、第7号、P857〜861;ゴードン(Gordon)ら著、「SIV DNAを送達するヒトパピローマウイルスプセデュドビリオン(Psedudovirion)ワクチンによる膣粘膜の標的化(Targeting the Vaginal Mucosa with Human Papillomavirus Psedudovirion Vaccines delivering SIV DNA)」、ジャーナル・オブ・イムノロジー(J Immunol.)、2012年、第188巻、第2号、p714〜723;クブル(Cuburu)ら著、「HPVベクターによる膣内免疫は組織常駐CD8+T細胞応答を誘導する(Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue−resident CD8+ T cell responses)」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)、2012年、第122巻、第12号、p4606〜4620;ハング(Hung)ら著、「HSV−tk遺伝子を保有するHPV−16プセデュドビリオン(Psedudovirion)を使用した卵巣がん遺伝子治療(Ovarian Cancer Gene Therapy Using HPV−16 Psedudovirion Carrying the HSV−tk Gene)」、プロス・ワン(PLoS ONE)、2012年、第7巻、第7号、e40983;ジョンソン(Johnson)ら著、「ヒトパピローマウイルスによる雌マウス生殖管への付着と感染におけるヘパラン硫酸の役割(Role of Heparan Sulfate in Attachment to and Infection of the Murine Femal Genital Tract by Human Papillomavirus)」、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー(J Virology)、2009年、第83巻、第5号、p2067〜2074を参照されたい)。
ぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130177587号明細書または米国特許第8,506,967号明細書に記載されるようなインフルエンザウイルスに由来してもよい。さらに別の態様では、VLPは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013116656号パンフレットに記載されるような、脂質膜に、または粒子外部にアンカーされる、B7−1および/またはB7−2分子を含んでなってもよい。一態様では、VLPは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2012049366号パンフレットに記載されるVLPなどの、ノロウイルス、ロタウイルス組換えVP6タンパク質または二層VP2/VP6に由来してもよい。
HPV vectors induces tissue−resident CD8+ T cell responses)」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)、2012年、第122巻、第12号、p4606〜4620;ハング(Hung)ら著、「HSV−tk遺伝子を保有するHPV−16プセデュドビリオン(Psedudovirion)を使用した卵巣がん遺伝子治療(Ovarian Cancer Gene Therapy Using HPV−16 Psedudovirion Carrying the HSV−tk Gene)」、プロス・ワン(PLoS
ONE)、2012年、第7巻、第7号、e40983;ジョンソン(Johnson)ら著、「ヒトパピローマウイルスによる雌マウス生殖管への付着と感染におけるヘパラン硫酸の役割(Role of Heparan Sulfate in Attachment to and Infection of the Murine Femal Genital Tract by Human Papillomavirus)」、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー(J Virology)、2009年、第83巻、第5号、p2067〜2074に記載されるものなどであるが、これに限定されるもの
ではない、ヒト乳頭腫ウイルス様粒子であってもよい。
一態様では、ポリヌクレオチドは、細菌ミニセルに製剤化されてもよい。非限定的例として、細菌ミニセルは、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013088250号パンフレットまたは米国特許出願公開第20130177499号明細書に記載されるものであってもよい。本明細書に記載されるポリヌクレオチドなどの治療薬を含んでなる細菌ミニセルは、脳腫瘍に治療薬を送達するのに使用されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、疎水性マトリックスと共に製剤化されて、半固体組成物が形成れてもよい。非限定的例として、半固体組成物またはペースト様組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第201307604号パンフレットに記載される方法によって製造されてもよい。半固体組成物は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第201307604号パンフレットに記載されるような徐放性製剤であってもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、エキソソームに製剤化されてもよい。エキソソームには、少なくとも1つのポリヌクレオチドが装入されて、細胞、組織および/または生物に送達されてもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013084000号パンフレットに記載さ
れるエキソソームに装入されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、持続性放出シルクベース送達システムに製剤化されてもよい。シルクベース送達システムは、シルクフィブロイン溶液と、本明細書に記載される、および/または当該技術分野で公知のポリヌクレオチドなどであるが、これに限定されるものではない、治療薬とを接触させることで、形成されてもよい。非限定的例として、本発明で使用されてもよい持続性放出シルクベース送達システム、およびこのようなシステムを製造する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130177611号明細書に記載される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドを含んでなる製剤は、微粒子を含んでなってもよい。微粒子は、本明細書に記載されるポリマー、および/またはポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステルおよびポリ酸無水物などであるが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知のポリマーを含んでなってもよい。微粒子は、吸着材表面を有して、ポリヌクレオチドなどの生物活性分子を吸着してもよい。非限定的例として本発明と共に使用される微粒子、および微粒子を製造する方法は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2013195923号明細書および米国特許出願公開第20130195898号明細書、および米国特許第8,309,139号明細書および米国特許第8,206,749号明細書に記載される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、アミノ酸脂質に製剤化されてもよい。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基および1つまたは複数の親油性テールを含んでなる、親油性化合物である。アミノ酸脂質およびアミノ酸脂質を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,501,824号明細書に記載される。
別の実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合して、それを放出する、アミノ酸脂質を含んでなる、放出可能形態でポリヌクレオチドを送達してもよい。非限定的例として、ポリヌクレオチドの放出は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第7,098,032号明細書、米国特許第6,897,196号明細書、米国特許第6,426,086号明細書、米国特許第7,138,382号明細書、米国特許第5,563,250号明細書、および米国特許第5,505,931号明細書に記載されるものなどであるが、これに限定されるものではない、酸不安定性リ
ンカーによって提供されてもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、微小胞に製剤化されてもよい。微小胞の非限定的例としては、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第20130209544号明細書に記載されるものが挙げられる。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、高分子電解質間複合体に製剤化されてもよい。高分子電解質間複合体は、電荷動的高分子が、1つまたは複数のアニオン性分子と複合体化すると形成される。電荷動的高分子および高分子電解質間複合体および高分子電解質間複合体を製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,524,368号明細書に記載される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、結晶性高分子システムに製剤化されてもよい。結晶性高分子システムは、結晶性部分、および/または結晶性部分を含んでなる末端単位がある、ポリマーである。「CYCポリマー」結晶性ポリマーシステムと称される、結晶性部分、および/または結晶性部分を含んでなる末端単位があるポリマー、およびこのようなポリマーおよびシステムを製造する方法の非限定的例は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第8,524,259号明細書に記載される。
医薬製剤は、本明細書の用法では、所望される特定の投与形態に適する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散体または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、固体バインダー、潤滑剤、着香剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、pH調節剤などを含むが、これに限定されるものではない、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなってもよい。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製する技術は、当該技術分野で公知である(その内容全体が参照により本明細書に援用される、A.R.ジェナーロ(A.R.Gennaro)著、レミントン:調剤の科学と実践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Williams&Wilkins)、メリーランド州ボルチモア(Baltimore,MD)、2006年を参照されたい)。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果の発生、またはさもなければ医薬組成物の任意のその他の成分との有害な方法での相互作用などによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で検討されてもよく、その使用は、本発明の範囲内で検討される。
macopoeia)、欧州薬局方(EP:European Pharmacopoeia)、英国薬局方、および/または国際薬局方の標準規格を満たしてもよい。
ンステアリン酸、およびソルトール(SOLUTOL)(登録商標))、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、(例えばクレモフォア(CREMOPHOR)(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル[ブリジ(BRIJ)(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、ジエチレングリコールモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、エチルラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、プルオリンク(PLUORINC)(登録商標)F68、ポロキサマー(POLOXAMER)(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、および/またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
酸、ソルビン酸、および/またはフィチン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他保存料としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエネド(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス(GLYDANTPLUS)(登録商標)、フェノニップ(PHENONIP)((登録商標)、メチルパラベン、ジャーマール(GERMALL)(登録商標)115、ジャーマベン(GERMABEN)(登録商標)II、ネオロン(NEOLONE)(商標)、カトン(KATHON)(商標)、および/またはユーキシル(EUXYL)(登録商標)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチベル、クルミ、およびコムギ胚芽油が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的油としては、ステアリン酸ブチル、カプリルトリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン360、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および/またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
代表的添加剤としては、生理学的生体適合性緩衝液(例えば、トリメチルアミン塩酸塩)、錯化剤の付加(例えば、DTPAまたはDTPA−ビスアミドなどの)またはカルシウムキレート錯体(例えばカルシウムDTPA、CaNaDTPA−ビスアミドとして)、または任意選択的にカルシウム塩またはナトリウム塩の付加(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム)が挙げられる。さらに、抗酸化剤および懸濁剤も使用され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、シロプロテクタント(cyroprotectant)を含んでなってもよい。本明細書の用法では、用語「抗凍結剤」は、所与の物質と組み合わされると、凍結時に起こる物質に対する障害を低下させまたは排除するのを促進する1つまたは複数の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、抗凍結剤は、凍結中にポリヌクレオチドを安定化させるために、それらと組み合わされる。−20℃〜−80℃におけるmRNAの冷凍貯蔵は、ポリヌクレオチドの長期間(例えば36ヶ月間)安定性にとって有利であってもよい。いくつかの実施形態では、抗凍結剤がポリヌクレオチド製剤に包含されて、凍結/解凍サイクルを通じた、および冷凍貯蔵条件下でのポリヌクレオチドが安定化される。本発明の抗凍結剤としては、スクロース、トレハロース、乳糖、グリセロール、デキストロース、ラフィノースおよび/またはマンニトールが挙げられるが、これに限定されるものではない。トレハロースは、米国食品医薬品局によって、一般的に安全とみなされている(GRAS)として記載され、一般に商業的医薬製剤で使用される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、増量剤を含んでなってもよい。本明細書の用法では、「増量剤」という用語は、製剤に包含されて、製剤に、所望の粘稠度および/または製剤成分安定化を与える、1つまたは複数の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、増量剤が凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤に包含されて、「薬理的にエレガントな」ケークをもたらし、長期間(例えば36ヶ月間)にわたる保存し中に、凍結乾燥ポリヌクレオチドを安定化する。本発明の増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、乳糖および/またはラフィノースが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗凍結剤と増量剤組み合わせ(例えば、スクロース/グリシンまたはトレハロース/マンニトール)が包含されて、ポリヌクレオチドを凍結中に安定化し、凍結乾燥のための増量剤もまた提供してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド製剤は、不活性成分である少なくとも1つの賦形剤を含んでなってもよい。本明細書の用法では、用語「不活性成分」は、製剤に包
含される1つまたは複数の不活性剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤で使用されてもよい不活性成分の全て、皆無または一部は、米国食品医薬品局(FDA:Food and Drug Administration)により認可されてもよい。不活性成分および不活性成分が製剤化されてもよい投与経路の非総記的一覧は、同時係属国際出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書(代理人整理番号M030)の表4に記載される。
本開示は、薬物送達の科学における有望な進歩を勘案した、任意の適切な手段による、治療、製薬、診断またはイメージングのいずれかのためのポリヌクレオチドの送達を包含する。送達は、ネイキッドまたは製剤化送達であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、細胞にネイキッドで送達されてもよい。本明細書の用法では、「ネイキッド」は、形質移入を促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有しなくてもよい。ネイキッドポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される、投与経路を使用して、細胞に送達されてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法を使用して、製剤化されてもよい。製剤は、修飾であってもおよび/または未修飾であってもよい、ポリヌクレオチドを含有してもよい。製剤としては、細胞透過剤、薬学的に許容できる担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶剤、および持効性送達デポーが挙げられる、これに限定されるものではない。製剤化ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される、投与経路を使用して、細胞に送達されてもよい。
)、回腸内(小腸遠位部分内部)、病巣内(局在性の病変の内部またはそれへの直接導入)、管腔内(管腔内部)、リンパ管内(リンパ内部)、髄内(骨髄腔内部)、髄膜内(髄膜内部)、眼内(眼内部)、卵巣内(卵巣内部)、心膜内(心膜内部)、胸膜内(胸膜内部)、前立腺内(前立腺腺内部)、肺内(肺またはその気管支内部)、副鼻腔内(鼻洞または眼窩周囲洞内部)、脊髄内(脊柱内部)、滑液嚢内(関節の滑液腔内部)、腱内(腱内部)、精巣内(精巣内部)、クモ膜下腔内(脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部)、胸郭内(胸郭内部)、小管内(臓器細管内部)、腫瘍内(腫瘍内部)、鼓室内(中耳内部)、血管内(1つまたは複数の血管内部)、脳(心)室内(脳(心)室内部)、イオン注入(その中で可溶性塩イオンが身体組織に移動する電流の手段による)、灌注(開放創傷または身体窩洞を浸すまたは洗い流す)、喉頭(喉頭に直接)、鼻腔胃(鼻を通じて胃内に)、密封包帯技術(次に領域を閉鎖する包帯剤によって被覆される局所投与手段)、眼部(外眼部に)、中咽頭(口および咽頭に直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器(局所性または全身性効果のための経口または経鼻吸入による気道内部)、眼球後(脳橋背後または眼球背後)、心筋内の(心筋に入る)、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性(胎盤を通じてまたはそれを越える)、経気管(気管壁を通じて)、経鼓膜(鼓室を越えてまたはそれを通じて)、尿管(尿管へ)、尿道(尿道へ)、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスまたは脊髄が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、組成物は、それらが、血液脳関門、血管関門、またはその他の上皮性関門を越えられるようにする方法で投与されてもよい。一実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含んでもよい。投与経路および特定の投与経路のための製剤に包含されてもよい不活性成分の非限定的例は、表9に示される。表9では、「AN」は麻酔薬を意味し、「CNBLK」は頸神経ブロックを意味し、「NBLK」は神経ブロックを意味し、「IV」は静脈内を意味し、「IM」は筋肉内を意味し、「SC」は皮下を意味する。
非経口および注射投与
非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシル剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水またはその他の溶媒;エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤などの、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでなってもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香料、および/または芳香剤などの補助剤を含み得る。非経口投与のため
の特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール(CREMOPHOR)(登録商標)、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000910]〜[000913]中などに記載される方法または組成物によって、直腸内および膣内投与のために製剤化されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000914]〜[000924]中などに記載される方法または組成物によって、経口投与のために製剤化されてもよい。経口投与は、液体剤形または固体剤形であってもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000925]〜[000941]中などに記載される方法または組成物によって、局所または経皮投与のために製剤化されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000942]〜[000948]中などに記載される方法または組成物によって、デポー投与のために製剤化されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000949]〜[000954]中などに記載される方法または組成物によって、肺投与のために製剤化されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000955]〜[000958]中などに記載される方法または組成物によって、鼻腔内、経鼻またはバッカル投与のために製剤化されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000959]〜[000965]中などに記載される方法または組成物によって、眼部または耳介(otic)投与のために製剤化されてもよい。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その中で、生物学的標的への物質の送達(「ペイロード」)が所望される、例えば、標的検出のための検出可能物質の送達、または治療薬送達などの、いくつかの異なる筋書きで使用され得る。検出法としては、例えば、免疫組織化学的検査、生物発光イメージング(BLI:bioluminescence
imaging)、磁気共鳴画像法(MRI:Magnetic Resonance
Imaging)、陽電子放出断層撮影(PET:positron emission tomography)、電子顕微鏡検査、X線コンピュータ断層撮影、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、赤外線画像、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡検査、蛍光分子断層撮影、核磁気共鳴イメージング、X線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室アッセイ、または標識付け/染色/イメージングが必要な任意の状況などの、インビトロおよびインビボの両方でのイメージング法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
テロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、例えばマイタンシノールなどのマイタンシノイド(その内容全体を本明細書に援用する、米国特許第5,208,020号明細書を参照されたい)、ラケルマイシン(CC−1065、それらの全てが参照により本明細書に援用される、米国特許第5,475,092号明細書、米国特許第5,585,499号明細書、および米国特許第5,846,545号明細書を参照されたい)、およびそれらのアナログまたはホモログが挙げられるが、これに限定されるものではない。放射性イオンとしては、ヨウ素(例えば、ヨウ素125またはヨウ素131)、ストロンチウム89、亜リン酸、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム90、サマリウム153、およびプラセオジムが挙げられるが、これに限定されるものではない。その他治療薬としては、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロランブシル、ラケルマイシン(CC−1065)、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前のダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ソチオシアン酸塩);エチジウム;フルオレセインおよび誘導体(例えば、5−カルボキシフルオセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、X−ローダミン−5−(および−6)−イソチオシアン酸塩(QFITCまたはXRITC)、およびフルオレスカミン);2−[2−[3−[[1,3−ジヒドロ−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル)−2H−ベンズ[e]インドール−2−イルイデン]エチリデン]−2−[4−(エトキシカルボニル)−1−ピペラジニル]−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−1,1−ジメチル−3−(3−スルホルプロピル(sulforpropyl))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミンとの化合物(1:1)(IR144);5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イルイデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアン酸塩;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(シバクロン(CIBACRON)(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンB塩化スルホニルロダルニン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアン酸塩、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101の塩化スルホニル誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアン酸塩(TRITC));リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5);シアニン−7(Cy7);IRD700;IRD800;アレクサ647;ラジョルタ(Jolta)ブルー;フタロシアニン;およびナフタロシアニンが挙げられる。
immunoassay)、放射免疫測定法(RIA:radioimmunoassay)、およびウエスタンブロット分析が挙げられるが、これに限定されるものではない。
1つまたは複数のその他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と組み合わせて、ポリヌクレオチドが使用されてもよい。「と組み合わせて」によって、薬剤が、同時に投与されなくてはならない、および/または一緒に送達するために製剤化されなくてはならないと、暗示することは意図されないが、これらの送達方法は本開示の範囲内である。組成物は、1つまたは複数のその他の所望の治療薬または医学的手技と、同時に、その前に、またはそれに引き続いて、投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された、用量でおよび/または時間スケジュールで、投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、薬剤と組み合わされた医薬、予防的、診断、またはイメージング組成物の送達
を包含し、薬剤は、医薬、予防的、診断、またはイメージング組成物の生物学的利用能を改善してもよく、それらの代謝を低減および/または修正してもよく、それらの排出を阻害してもよく、および/またはそれらの体内分布を修正してもよい。一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、その内容全体が参照により援用される、国際特許出願PCT/米国特許出願公開第2014/027077号明細書の段落[000978]〜[001023]中などに記載されるような、1つまたは複数のその他の薬剤との組み合わせで使用されてもよい。
本発明は、本発明に従って、それを必要とする対象に、修飾mRNAおよびそれらがコードするタンパク質または複合体を投与するステップを含んでなる方法を提供する。核酸、タンパク質または複合体、またはそれらの医薬、イメージング、診断、または予防的組成物は、疾患、障害、および/または病状(例えば、作業記憶欠陥に関する疾患、障害、および/または病状)を予防し、治療し、診断し、またはイメージングするのに効果的な、任意の量および任意の投与経路を使用して、対象に投与されてもよい。要する正確な量は、対象の生物種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて、対象毎に様々であろう。本発明に従った組成物は、典型的に、投与の容易さと投与量の均一性のために、投与単位形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の1日の総使用量は、主治医によって、健全な医学的判断の範囲内で決定されてもよいことが、理解されるであろう。任意の特定患者のための、特定の治療的に有効であり、予防的に有効であり、または適切なイメージング用量であるレベルは、治療される障害および障害の重症度;用いられる特定化合物の活性;用いられる特定組成物;患者の年齢、体重、総体的な健康、性別、および食生活;用いられる特定化合物の投与時間、投与経路、および排出速度;治療持続期間;用いられる特定化合物との組み合わせでまたはそれと同時に使用される薬剤;および医療技術分野で周知の同様の要素を含む、多様な要素に左右されるであろう。
本明細書に記載される医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注射用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)などの本明細書に記載される投与形態に製剤化され得る。
非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシル剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水またはその他の溶媒;エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含むが、これに限定されるものではない、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでなってもよい。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、クレモフォール(CREMOPHOR)(登録商標)、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合されてもよい。
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、適当な分散剤、湿潤剤、および/または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化されてもよい。無菌注射用製剤は、例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液などの、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤および/または溶媒中の無菌注射液、懸濁液、および/またはエマルションであってもよい。用いられてもよい許容できるビヒクルおよび溶媒としては、水、米国薬局方リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられるが、これに限定されるものではない。無菌の不揮発性油が、溶剤または懸濁媒として慣習的に用いられている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む、あらゆる無刺激不揮発性油を用い得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製で使用され得る。
いは、非経口的に投与されたポリヌクレオチドの吸収遅延は、油ビヒクルにポリヌクレオチドを溶解させまたは懸濁させることで、達成されてもよい。注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー内に、ポリヌクレオチドの微小カプセル化マトリックスを形成することで製造される。ポリヌクレオチドとポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド放出速度は調節され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ(オルトエステル)およびポリ(酸無水物)が挙げられるが、これに限定されるものではない。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション内に、ポリヌクレオチドを封入することで製剤化されてもよい。
肺送達のために有用である、本明細書に記載される製剤はまた、医薬組成物の鼻腔内送達のためにも使用されてもよい。鼻腔内投与に適する別の製剤は、活性成分を含んでなり、約0.2μm〜500μmの平均的粒子を有する粗粉末であってもよい。このような製剤は、その中で嗅剤が服用される方法で、すなわち鼻の近くに保持される粉末容器からの鼻腔を通じた迅速な吸入によって、投与されてもよい。
錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸内コーティングおよび製剤処方技術分野で周知のその他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは不透明剤を任意選択的に含んでなってもよく、または任意選択的に遅延方法で、腸管の特定部分で活性成分のみを放出し、または活性成分を優先的に放出する、組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質、およびワックスが挙げられる。類似タイプの固体組成物は、乳糖または乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物および/または組成物は、2つ以上の用量で投与されてもよい(本明細書で「複数用量投与」と称される)。このような用量は、同一
成分を含んでなってもよく、または先の用量に包含されない成分を含んでなってもよい。このような用量は、先の用量と比較して、同一質量および/または容量の成分を含んでなってもよく、または変化した質量および/または容量の成分を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、複数用量投与は、反復用量投与を含んでなってもよい。本明細書の用法では、「反復用量投与」という用語は、連続して、または実質的に同一質量および/または容量で供される、実質的に同一成分を含んでなる反復投与計画中で、投与される2つ以上の用量を指す。いくつかの実施形態では、対象は、反復用量応答を示してもよい。本明細書の用法では、「反復用量応答」という用語は、反復用量投与計画中で投与される別の投与量と異なる反復用量に対する、対象中の反応を指す。いくつかの実施形態では、このような反応は、mRNAを含んでなる反復用量に応答した、タンパク質発現であってもよい。このような実施形態では、タンパク質発現は、反復用量投与計画中の別の投与量と比較して、上昇してもよく、またはタンパク質発現は、反復用量投与計画中の別の投与量と比較して低下してもよい。タンパク質発現の変化は、約1%〜約20%、約5%〜約50%約10%〜約60%、約25%〜約75%、約40%〜約100%および/または少なくとも100%であってもよい。投与されるRNAから翻訳されるタンパク質のレベルが、反復投与計画中の別の用量と比較して、40%を超えて低下する、反復投与計画の一部として投与されるmRNAの発現低下は、本明細書で「反復用量耐性」と称される。
本明細書に記載される医薬組成物は、以下の性質の1つまたは複数によって特徴付けられ得る。
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に組成物に製剤化された際に、本明細書に記載されるような送達剤を欠く組成物と比較して、生物学的利用能の増大を示し得る。本明細書の用法では、「生物学的利用能」という用語は、哺乳類に投与された所与の量のポリヌクレオチドの全身性の利用可能性を指す。生物学的利用能は、哺乳類への化合物の投与に続いて、化合物の無変化形態の曲線下面積(AUC:area under the curve)、または最大血清または血漿濃度(Cmax)を測定することで、評価され得る。AUCは、横軸(X−軸)に沿う時間に対する、縦軸(Y−軸)に沿う化合物の血清または血漿濃度をプロットする曲線下面積の測定である。概して、特定化合物のAUCは、当業者に知られており、その内容全体が参照により本明細書に援用される、G.S.バンカー(G.S.Banker)著、「現代薬学、薬剤および薬科学(Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences)」、第72巻、マーセル・デッカー・ニューヨーク株式会社(Marcel Dekker,New York,Inc.)、1996年に記載されるような方法を使用して、計算され得る。
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に組成物に製剤化されると、本明細書に記載されるような送達剤を欠く投与されたポリヌクレオチド組成物治療濃度域と比較して、投与されたポリヌクレオチド組成物の治療濃度域の増大を示し得る。本明細書の用法では、「治療濃度域」は、高確率で治療効果を引き起こす、作用部位における治療効果のある物質の血漿濃度範囲またはレベル範囲を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの治療濃度域は、本明細書に記載されるような送達剤と同時投与されると、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%増大し得る。
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような送達剤と共に、組成物に製剤化されると、本明細書に記載されるような送達剤を欠く組成物と比較して、例えば、低下または標的化などの、改善された分布容量(Vdist)を示し得る。分布容量(Vdist)は、血液中または血漿中の薬剤濃度に対する、体内の薬剤の量に関する。本明細書の用法では、「分布容量」という用語は、血液中または血漿中と同一濃度で、体内に薬剤総量を含有するのに必要な液量を指す:Vdistは、体内薬剤量/血液中または血漿中薬剤濃度に等しい。例えば、10mgの用量および10mg/Lの血漿濃度では、分布容量は1リットルになる。分布容量は、薬剤が血管外組織内に存在する程度を反映する。大きな分布容量は、化合物が、血漿タンパク質結合と比較して、組織構成要素に結合する傾向を反映する。臨床状況において、Vdistは、定常状態濃度を達成するための負荷量を決定するのに利用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような送達剤と同時投与された場合、ポリヌクレオチドの分布容量は、少なくとも約2%、少なくとも約
5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%低下し得る。
一実施形態では、動物に送達される修飾mRNAの生物学的効果は、動物中のタンパク質発現を分析することで、分類されてもよい。タンパク質発現は、本発明の修飾mRNAを投与された哺乳類から収集された生物学的サンプルを分析することで、判定されてもよい。一実施形態では、哺乳類に投与された修飾mRNAによってコードされる発現タンパク質が、少なくとも50pg/mlであることが好ましくあってもよい。例えば、哺乳類に送達される修飾mRNAによってコードされるタンパク質について50〜200pg/mlのタンパク質の発現は、哺乳類におけるタンパク質の治療有効量と見なされてもよい。
質量分析法(MS:Mass spectrometry)は、イオンへの変換後の分子に関する構造的および分子量/濃度情報を提供し得る分析技術である。分子は最初にイオン化されて、正または負の荷電を獲得し、次にそれらは、質量分析器を通過して移動し、それらの質量/電荷(m/z)比に従って、検出器の異なる領域に到達する。
chemical ionization)、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃(FAB:fast atom bombardment)/液体二次イオン化(LSIMS:liquid secondary ionization)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI:matrix−assisted laser
desorption/ionization)、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー/プラズマスプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施されてもよい。当業者は、イオン化法の選択が、測定される検体、サンプルタイプ、検出器タイプ、正対負イオンモードの選択などに基づいて決定され得ることを理解するであろう。
ion monitoring mode)を使用する)、またはあるいは、イオンは、例えば、多重反応モニタリング(MRM:multiple reaction monitoring)または選択反応モニタリング(SRM:selected reaction monitoring)などのスキャニングモードを使用して、検出されてもよい。
明細書に援用される、ケシシアン(Keshishian)ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス(Mol Cell Proteomics)、2009年、第8巻、p2339〜2349;クーン(Kuhn)ら著、クリニカル・ケミストリー(Clin Chem)、2009年、第55巻、p1108〜1117;ロペス(Lopez)ら著、クリニカル・ケミストリー(Clin Chem)、2010年、第56巻、p281〜290)。生物マーカー発見研究で頻繁に使用される非標的質量分析法とは異なり、標的化MS法は、複雑な混合物中の数十から数百の選択されたペプチドに装置の全分析能力を集中させる、MSのペプチド配列ベースモードである。対象タンパク質に由来するペプチドのみに、検出および断片化を限定することで、発見モードMS法と比較して、感度および再現性が劇的に改善される。この質量分析法に基づくタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)定量化法は、臨床サンプルの迅速な標的化された多重タンパク質発現プロファイリングを通じて、生物マーカーの発見および定量化に劇的な影響を及ぼし得る。
多重反応モニタリングを使用して、分析されてもよい。
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫応答などの有害生物応答および/または分解経路の回避またはそれからの逃避を提供して、発現閾値を克服し、および/またはタンパク質生成能力を改善し、発現比率または翻訳効率を改善して、薬剤またはタンパク質半減期および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在を最適化して、組織内の安定性および/またはクリアランス、受容体取り込みおよび/または動態、組成物による細胞アクセス、翻訳機構との関わり、分泌効率(当てはまる場合)、循環へのアクセスしやすさ、および/または細胞の状態、機能および/または活性の調節の1つまたは複数を改善するように、設計される。
LDLR関連疾患、障害および/または病状
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、LDLR関連疾患、障害または病状を治療および/または予防するのに、使用されてもよい。LDLR関連疾患、障害または病状の非限定的例としては、LDL低下、コレステロール低下、高コレステロール血症、高脂血症、およびアテローム性動脈硬化が挙げられる。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、アテローム性動脈硬化を発症するリスクを低下させるのに使用されてもよい。理論による拘束は望まないが、アテローム性動脈硬化は、大多数の心血管疾患の原因である。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象においてコレステロールを低下させるのに使用されてもよい。非限定的例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、対象の血漿中のコレステロールレベルを低下させることができてもよい。
代謝疾患、障害および/または病状
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、代謝疾患、障害および/または病状を治療および/または予防するのに使用されてもよい。非限定的例として、代謝障害、障害または病状は、酸性リパーゼ疾患、バース症候群(BTHS:Barth Syndrome)、橋中央ミエリン溶解、ファーバー病、ガングリオシド症、ハンター症候群、ハーラー症候群、トリメチルアミン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、脂質蓄積症、代謝性ミオパシー、ミトコンドリア性ミオパシー、ムコリピドーシス、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、ポンペ病、グリコーゲン蓄積症、尿素サイクル疾患、高シュウ酸尿症およびシュウ酸症であってもよい。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、心血管疾患、障害および/または病状を治療および/または予防するのに使用されてもよい。非限定的例として、心血管疾患、障害または病状は、心不全、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、不整脈、狭窄症、逆流症、僧帽弁プロラパーゼ(prolapase)であってもよい。
修飾核酸および修飾RNAなどの本発明のポリヌクレオチド、およびそれらから翻訳される本明細書に記載されるタンパク質は、治療的または予防的薬剤として使用され得る。それらは、医療で使用するために提供される。例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが対象に投与され得、ポリヌクレオチドがインビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドが生成する。提供されるのは、ヒトおよびその他の哺乳類において、疾患または病状を診断、治療または予防するための成物、方法、キット、および試薬である。本発明の活性治療薬としては、ポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドを含有する細胞とが挙げられる。
に増大させ;このような増大は、内在性タンパク質のレベルを正常以下のレベルから正常レベルにしてもよく、または正常レベルを過正常のレベルにしてもよい。
m noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.)」、ネイチャー(Nature)、2010年、第466巻、p714〜721)。
study)、およびその他の当該技術分野で公知の方法を含む基準に基づいて、対象を同定、診断、および分類する方法である。
免疫応答の回避
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドの有用な特徴は、細胞の先天性免疫応答を低下させ、それから逃避しまたはそれを回避する能力である。一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞に送達されると、例えば、本発明のポリヌクレオチドに対応する未修飾ポリヌクレオチドまたは本発明の異なるポリヌクレオチドなどの基準化合物によって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答の低下をもたらす、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本明細書の用法では、「基準化合物」は、哺乳類に投与されると、既知の程度、レベルまたは免疫刺激量を有する先天性免疫応答をもたらす、任意の分子または物質である。基準化合物は核酸分子でなくてもよく、それは本発明のポリヌクレオチドのいずれでなくてもよい。したがって、ポリヌクレオチドの回避、それからの逃避または免疫応答始動の失敗の尺度は、このような応答を始動することが知られている任意の化合物または物質に対する相対的な用語で表され得る。
当該技術分野の「全てまたは皆無」モデルは、ポリヌクレオチドの治療的有用性に関連した生物学的現象を説明するのには、非常に不十分であると評価されている。本発明者らは、タンパク質生成を改善するためには、修飾の性質、または修飾の組み合わせ、パーセント修飾を検討して、2つ以上のサイトカインまたは尺度を調査し、特定のポリヌクレオチドの有効性およびリスクプロファイルを判定してもよいと断定した。
測定を通じて、インビボでもまた評価され得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、生物学的活性増大、患者予後改善、または保護機能などを含む、改善された疾患修飾活性を有する、天然に存在するタンパク質の変異型を発現するのに、利用され得る。多くこのような変更遺伝子が、哺乳類で記載される(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、ナドー(Nadeau)著、カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・デベロップメント(Current
Opinion in Genetics&Development)、2003年、第13号、p290〜295;ハミルトン(Hamilton)およびユー(Yu)著、プロス・ジェネティクス(PLoS Genet.)、2012年、第8巻、e1002644;コーダ(Corder)ら著、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)、1994年、第7巻、p180〜184)。ヒトにおける例としては、アポE2タンパク質、アポA−I変異型タンパク質(アポA−Iミラノ、アポA−Iパリ)、機能亢進性第IX因子タンパク質(第IX因子パドアArg338Lys)、トランスサイレチン変異体(TTR Thr119Met)が挙げられる。ApoE2(cys112、cys158)の発現は、アルツハイマー病、および場合により心血管疾患などのその他の病状に対する感受性を低下させることで、その他のApoEイソ型(ApoE3(cys112、arg158)、およびApoE4(arg112、arg158))と比較して、保護を与えることが示されている(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コーダ(Corder)ら著、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)、1994年、第7巻、p180〜184セリパ(Seripa)ら著、リジュベネーション・リサーチ(Rejuvenation Res.)、2011年、第14巻、p491〜500;リュー(Liu)ら著、ネイチャー・レビュ
ーズ・ニューロロジー(Nat Rev Neurol.)、2013年、第9巻、p106〜118)。アポA−I変異型の発現は、コレステロールの低下と関連付けられている(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、デゴマ(deGoma)およびラダー(Rader)著、2011年、ネイチャー・レビューズ・カージオロジー(Nature Rev Cardiol)、第8巻、p266〜271;ニッセン(Nissen)ら著、2003年、米国医師会雑誌(JAMA)、第290巻、p2292〜2300)。特定集団におけるアポA−Iのアミノ酸配列は、アポA−Iミラノ(Arg173がCysに変化)中で、およびアポA−Iパリ(Arg151がCysに変化)中で、システインに変化している。R338L位(FIXパドア)における第IX因子変異は、約10倍の活性増大を有する第IX因子タンパク質をもたらす(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、シミオニ(Simioni)ら著、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(N Engl J Med.)、2009年、第361巻、p1671〜1675;フィン(Finn)ら著、ブラッド(Blood)、2012年、第120巻、p4521〜4523;カントレ(Cantore)ら著、ブラッド(Blood)、2012年、第120巻、p4517〜20)。104または119位(Arg104His、Thr119Met)におけるトランスサイレチンの変異は、疾患を引き起こすVal30Met変異もまた保有する患者に、保護を提供することが示されている(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、サライバ(Saraiva)、ヒューマン・ミューテーション(Hum Mutat.)、2001年、第17巻、p493〜503;トランスサイレチン変異データベースhttp://www.ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html)。Met119およびHis104変異をそれぞれ保有する、ポルトガル人および日本人のMet30患者における臨床症状と症状重症度の違いが、より高い安定性を分子に与える、非病原性変異体によって発揮された明らかな保護効果と共に観察された(全てその内容全体が参照により本明細書に援用される、コエリョ(Coelho)ら著、1996年、ニューロマスキュラー・ディスオーダーズ(Neuromuscular Disorders)(補遺)第6巻、S20;テラザキ(Terazaki)ら著、1999年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem Biophys Res Commun)、第264巻、p365〜370)。これらの保護的TTR対立遺伝子をコードする修飾mRNAは、TTRアミロイドーシス患者で発現され得、それによって病原性の変異TTRタンパク質の効果が低下される。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも1つの低密度リポタンパク質受容体(LDLR)タンパク質またはその変異型をコードする。ワトソン(Watson)らの図14は、LDLRの構造を示し(その内容全体が参照により本明細書に援用される、ワトソン(Watson)ら著、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー(Nature Reviews Drug Discovery)、2008年1月、第7巻、p84〜99の図4aを参照されたい)、星印は、カルシウム結合によって安定化された領域を表す。LDLRは、リガンド結合領域、表皮成長因子(EGF:epidermal growth factor)様領域、β−プロペラ構造、グリコシル化領域、膜貫通ドメイン、および細胞質領域を含んでなる。受容体は、システインに富むリガンド結合領域の7反復、EGF前駆体様の3反復、Tyr−Trp−Thr−Aspから構成される6枚羽根β−プロペラ構造、高度にグリコシル化された領域、膜貫通ドメイン、および情報伝達のためのNPXYモチーフを含有する小型細胞質ドメインからなる。
血流からどの程度迅速に除去されるかを決定する。LDLRタンパク質変異体などの変異型は、遺伝型高コレステロールとしてもまた知られている、常染色体優性疾患家族性高コレステロール血症(FH)を引き起こし得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、LDLRタンパク質のEGF−Aドメイン中に、少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現向上変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)を含んでなる、少なくとも1つのLDLRタンパク質をコードする。非限定的例として、LDLRタンパク質の細胞内ドメインは、配列GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE(配列番号719)と、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%相同的な配列を含んでなってもよい。非限定的例として、LDLRタンパク質の細胞内ドメインは、配列GTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE(配列番号719)を含んでなってもよい。一態様では、変異は、荷電側鎖、酸がある別の酸性アミノ酸による、荷電側鎖がある酸性アミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)の
置換であってもよい。非限定的例として、アスパラギン酸(Asp、D)が、グルタミン酸(Glu、E)で置換されてもよい。別の態様では、変異は、荷電側鎖酸性アミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)による、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン)の置換であってもよい。非限定的例として、ロイシン(Leu、L)が、アスパラギン酸(Asp、D)で置換されてもよい。さらに別の態様では、変異は、疎水性側鎖、脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン)による、極性中性側鎖アミノ酸(例えば、アスパラギン、システイン、グルタミン、メチオニン、セリンまたはスレオニン)の置換であってもよい。非限定的例として、アスパラギン(Asn、N)が、アラニン(Ala、A)で置換されてもよい。別の態様では、変異は、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン)による、荷電側鎖酸性アミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)の置換であってもよい。非限定的例として、グルタミン酸(Glu、E)が、アラニン(Ala、A)で置換されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、LDLRタンパク質の細胞内ドメイン中に、少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)を含んでなる、少なくとも1つのLDLRタンパク質をコードする。非限定的例として、LDLRタンパク質の細胞内ドメインは、配列KNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDEVHICHNQDGYSYPSRQMVSLEDDVA(配列番号720)と、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なく
とも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%相同的な配列を含んでなってもよい含んでなってもよい。非限定的例として、LDLRタンパク質の細胞内ドメインは、配列KNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDEVHICHNQDGYSYPSRQMVSLEDDVA(配列番号720)を含んでなってもよい含んでなってもよい。一態様では、変異は、別の荷電側鎖塩基性アミノ酸による、荷電側鎖塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン)の置換であってもよい。非限定的例として、リジン(Lys、K)が、アルギニン(Arg、R)で置換されてもよい。別の態様では、変異は、疎水性側鎖脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン)による、極性中性側鎖アミノ酸(例えば、アスパラギン、システイン、グルタミン、メチオニン、セリンまたはスレオニン)の置換であってもよい。非限定的例として、システイン(Cys、C)が、アラニン(Ala、A)で置換されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、LDLRタンパク質のEGF−Aドメイン中の少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)と、細胞内ドメイン中の少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)とを含んでなる、少なくとも1つのLDLRタンパク質をコードする。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、LDLRタンパク質に、プロタンパク質コンバターゼサブチリシン/ケキシンタイプ9(PCSK9)結合の欠損を引き起こす、少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)をEGF−Aドメイン中に含んでなる、少なくとも1つのLDLRタンパク質をコードする。PCSK−9の結合部位は、以前、LDLRのEGF−A(またはEGF様反復)ドメインに位置確認されている(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、クウォン(Kwon)ら著、「PCSK9によるLDL受容体認識のための分子的基盤(Molecular Basis for LDL receptor recognition by PCSK9)」、米国科学アカデミー紀要(PNAS)、2008年、第105巻、第6号、p1820〜1825を参照されたい)。したがって、PCSK9結合欠損LDLRは、コレステロールを肝実質細胞に運び込む。
も1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)を含んでなってもよいLDLRタンパク質は、本明細書に記載されるようなPCSK9結合欠損である。
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、IDOL(モシン(mosin)制御軽鎖結合タンパク質(MYLIP:mosin regulatory high chain interacting protein)としてもまた知られている、LDLRの誘導性分解因子)がLDLRを分解するのを妨げる、少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)を細胞内ドメイン中に含んでなる、少なくとも1つのLDLRタンパク質をコードする(例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、ゼルサー(Zelcer)ら著、サイエンス(Science)、2009年、第325巻、第5936号、p100〜104;ソレンティノ(Sorrentino)およびゼルサー(Zelcer)著、2012年、第23巻、第3号、p213〜219;およびザング(Zhang)ら著、ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ(J Lipid Research)、2013年、第54巻、p1410〜1420によって記載される細胞内ドメイン変異を参照されたい)。理論による拘束は望まないが、IDOLは、膜貫通タンパク質の細胞質内ドメインとの相互作用を媒介する、バンド4.1およびエズリン/ラジジン(Radizin)/モエイシン(Moeisin)相同性(FERM)ドメインを含有する。IDOLはまた、C末端RINGドメインも含有して、E3−ユビキチンリガーゼの機能を果たすことが提案されている。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、結合が欠損して、ホモログ2、マイトジェン応答性リンタンパク質(DAB2)を無力化してもよい。理論による拘束は望まないが、DAB2結合欠損LDLRは、DAB2経路を通じたLDLRの内部移行を制限し、ひいてはLDLR取り込みを低下させてもよい。
一実施形態では、LDLRの被覆ピットを通じた迅速なエンドサイトーシスのためのシグナルを変更するために、LDLRのNPXYモチーフが修飾されてもよい。NPXYモチーフは、少なくとも1つの変異、少なくとも2つの変異、少なくとも3つの変異、少なくとも4つの変異、または5つ以上の変異を含んでなってもよい。非限定的例として、NPXYモチーフは、LDLR配列のアミノ酸822からアミノ酸829を含んでなってもよい。別の非限定的例として、NPXYモチーフは、配列NFDNPVYQ(配列番号721)を含んでなってもよい。
別の実施形態では、LDLRのNPXYモチーフが修飾されて、LDLRのNPXYモチーフへのSorting Nexin17(SNX17)の結合を低下させてもよい。受容体のエンドソームの再循環を調節するために、LDLRのNPXYモチーフへのSNX17の結合低下が使用されてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるLDLR配列は、少なくとも1つのリン酸化されているアミノ酸を含んでなってもよい。非限定的例として、配列NQDGYSYPSR(配列番号722)中の少なくとも1つのアミノ酸が、リン酸化されてもよい。非限定的例として、配列番号722のLDLRの2つのチロシン(Y)が、リン酸化されてもよい。別の非限定的例として、本明細書に記載されるLDLR配列中の少なくとも1つのチロシン(Y)が、リン酸化されてもよい。さらに別の非限定的例として、本明細書に記載されるLDLRの845位のチロシンおよび847位のチロシンがリン酸化される。
一実施形態では、本明細書に記載されるLDLR配列は、C末端配列LEDDVA(配列番号7)に、少なくとも1つのアミノ酸変異を含んでなってもよい。非限定的例として、配列番号723は、LDLR配列のアミノ酸855〜アミノ酸860であってもよい。
一実施形態では、LDLR配列はLDLR配列のN結合グリコシル化部位に、少なくとも1つの変異を含んでなってもよい。非限定的例として、少なくとも1つの変異は、アミノ酸97、156、272、515および/または657に位置してもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質1(LDLRAP1:low density lipoprotein receptor adaptor protein 1)への結合が欠損していてもよい。理論による拘束は望まないが、LDLRAP1結合欠損LDLRは、LDLRの結合および内部移行を制限し、ひいてはLDLR取り込みを低下させてもよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるLDLR配列およびコンストラクトのエクトドメインは、細胞質内ドメインと融合してもよい。非限定的例として、LDLRエクトドメインは、葉酸受容体TM−細胞質内ドメインと融合してもよい。別の非限定的例として、LDLRエクトドメインは、GPI結合受容体TM−細胞質内ドメインと融合してもよい。
一実施形態では、LDLRタンパク質は、少なくとも1つの変異(例えば、LDLR細胞表面発現促進変異、細胞表面におけるLDLR滞留時間を増大させる変異、または細胞表面におけるLDLRレベル増大をもたらす変異)を含んでなって、LDLRの表面発現を促進する。非限定的例として、少なくとも1つの変異は、EGF−Aドメイン、細胞内ドメイン、本明細書に記載されるLDLRのドメインまたは領域、またはそれらの組み合わせに位置する。非限定的例として、少なくとも1つの変異は、LDLRの表面発現を促進するために、EGF−Aドメインおよび細胞内ドメインに位置する。
本明細書で提供されるのは、細胞分裂阻害または細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、細菌、酵母、原虫、蠕虫などの病原性の微生物、またはがん細胞などの病的細胞を標的化する方法である。好ましくは導入されるmRNAは、標的病原性生物中で排他的にまたは優先的に翻訳されて、治療薬の可能なオフターゲット効果を低下させる、修飾ヌクレオシドまたはその他の核酸配列修飾を含有する。このような方法は、血液、精液、卵を含む任意の生物学的材料に、かつ胚組織および臓器を含む移植材料に見られる、病原性生物を除去し、または病的細胞を死滅させるのに有用である。
ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドの生成方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質生成物の収率を高めるために有用であってもよい。バイオプロセシング方法およびその使用は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013151666号パンフレットの段落[000934]〜[000945]中などに記載される。
一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類、および真菌細
胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスターまたはウシ細胞などであるが、これに限定されるものではない、哺乳類細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、HeLa、NS0、SP2/0、KEK293T、Vero、Caco、Caco−2、MDCK、COS−1、COS−7、K562、Jurkat、CHO−K1、DG44、CHOK1SV、CHO−S、Huvec、CV−1、Huh−7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR−90、MCF−7、U−20S、Per.C6、SF9、SF21またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO:Chinese Hamser Ovary)細胞を含むが、これに限定されるものではない、確立された細胞系に由来してもよい。
当業者は、培養細胞から目的のタンパク質を精製または単離するために使用される方法を決定できるべきである。一般に、これは、親和性結合または非親和性精製を使用する捕捉方法を通じて実施される。目的のタンパク質が、培養細胞によって分泌されなければ、精製または単離の前に培養細胞の溶解が実施されるべきである。本発明では、細胞培養液成分、ならびに消泡剤化合物、およびその他の栄養素および補給剤、細胞、細胞残骸、宿主細胞タンパク質、DNA、ウイルスなどの細胞培養添加剤と共に、目的のタンパク質を含有する非清澄化細胞培養液が使用されてもよい。工程は、バイオリアクター自体の中で実施されてもよい。流体は、pHまたは温度またはその他の刺激特性などの所望の刺激に予備調整されてもよく、または流体は、ポリマーの添加時に調整され得、またはポリマーは、そのポリマーを流体中で可溶化させるのに必要な刺激条件の必須パラメータに適切に調整されたキャリヤ液に、添加され得る。ポリマーは、流体と共に完全に循環されてもよく、次に刺激(pH、温度、塩濃度、などの変化)が適用されてもよく、所望のタンパク質およびポリマーが溶液から析出され得る。ポリマーおよび所望のタンパク質は、流体の残りから分離され、任意選択的に1回または複数回洗浄され得、任意の捕捉されたまたは緩く結合する汚染物質が除去される。次に、所望のタンパク質が、例えば溶出などによって、ポリマーから回収されてもよい。好ましくは、溶出は、所望のタンパク質の選択された溶出中に、ポリマーがその沈殿形態に留まって任意の不純物をそれに保持するような、一連の条件下で実施されてもよい。ポリマーおよびタンパク質ならびに任意の不純物は、
水または緩衝溶液などの新規流体中で可溶化されてもよく、タンパク質は、ポリマーまたは不純物よりもタンパク質に対する優先度および選択性を有する、アフィニティ、イオン交換、疎水性、またはいくつかのその他のタイプのクロマトグラフィーなどの手段によって、回収されてもよい。溶出したタンパク質は、次に回収されてもよく、適切ならば、バッチ様工程または連続流動工程のいずれかで、追加的な処理工程を受けてもよい。
目的のタンパク質は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養液から回収されてもよく、または分泌シグナルなしで発現される場合は、それは宿主細胞溶解産物から回収され得る。目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られるような方法で、その他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質から、目的のタンパク質を精製することが必要なこともある。細胞および/または微粒子細胞破片は、培養液または溶解産物から除去されてもよい。次に目的の生成物は、例えば、イムノアフィニティーまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相HPLC(RP−HPLC)、セファデックス(登録商標)クロマトグラフィー、シリカ上のまたはDEAEなどのカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィーによって、汚染物質可溶性タンパク質、ポリペプチド、および核酸から精製されてもよい。宿主細胞によって異種発現されるタンパク質を精製する方法は、当該技術分野で周知である。
S)、セジウィック JD(Sedgwich JD)著、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー(Cur.Opin.Immunol.)、2006年、第18巻、第6号、p670〜5)。別の実施形態では、核酸は、ケモカイン受容体の拮抗物質をコードする。ケモカイン受容体CXCR−4およびCCR−5は、宿主細胞へのHIV侵入に必要である(アレンザナ−セイスデドス F(Arenzana−Seisdedos F)ら著、ネイチャー(Nature)、1996年10月3日、第383号、第6599巻、p400)。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、細胞集団内の1つまたは複数の標的遺伝子の発現をサイレンシング(すなわち、妨げまたは実質的に低下させる)のに有用である。ポリペプチドが翻訳されて、ヒストンH3メチル化および引き続くヘテロクロマチン形成
を通じて、標的遺伝子の遺伝子転写を低下させるような条件下で、配列特異的ヒストンH3メチル化を誘導できる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、集団中の細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、サイレンシング機序は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で実施される。非限定的例として、有用な標的遺伝子は、変異型ヤヌスキナーゼ−2ファミリーメンバーであり、変異標的遺伝子を発現する哺乳類対象は、異常なキナーゼ活性に起因する骨髄増殖性疾患に罹患している。
生物学的経路の調節
細胞内に装入された迅速翻訳ポリヌクレオチドは、標的生物学的経路を調節する望ましい機序を提供する。このような調節としては、所与の経路の拮抗作用または受容体活性化作用が挙げられる。一実施形態では、ポリヌクレオチドが細胞内に局在して、細胞内でポリヌクレオチドからポリペプチドが翻訳され得、ポリペプチドが生物学的経路内のポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物の有効量を細胞に接触させることで、細胞内において生物学的経路に拮抗するための方法が提供される。代表的生物学的経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎大腸炎、またはクローン病などの自己免疫または炎症性疾患中で欠陥があるものであり;特に、IL−12およびIL−23シグナル伝達経路の拮抗作用には、特定の効用がある。(キクリー K(Kikly K)、リュー L(Liu L)、ナー S(Na S)、セジウィック JD(Sedgwich
JD)著、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー(Curr.Opin.Immunol.)、2006年、第18巻、第6号、p670〜5を参照されたい)。
本明細書に記載されるいくつかの態様および態様の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが使用されて、細胞表面にリガンドまたはリガンド受容体(例えば、自動誘導部分)が発現され得る。細胞表面に付着したリガンドまたはリガンド受容体部分は、細胞が、インビボで、組織または薬剤との所望の生物学的相互作用を有することができるようにし得る。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、例えば細胞表面受容体などの受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬物、グリコサミノグリカン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、リガンドは、がん細胞特異的抗原を認識する抗体であり得、細胞が腫瘍細胞と優先的に相互作用できるようにして、改変細胞が腫瘍特異的に局在化できるようにする。好ましいリガンドは、治療される組織の外面で標的分子と相互作用できてもよいため、リガンドは、治療される組織内に蓄積する能力を細胞組成物に与え得る。その他の組織との限定的交差反応性を有するリガンドが、一般的に好ましい。
標的哺乳類細胞中の細胞運命の改変を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆細胞であってもよく、改変は、系統への分化を駆動し、またはこのような分化を阻止することを伴ってもよい。あるいは、標的哺乳類細胞は、分化した細胞であってもよく、細胞運命の改変としては、がん細胞のがん幹細胞への脱分化など、多能性前駆細胞への脱分化を駆動し、またはこのような脱分化を阻止することが挙げられる。細胞運命の変化が所望される状況では、細胞運命の改変が誘導されるような条件下で、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードするmRNAの有効量が、標的細胞内に装入される。いくつかの実施形態では、修飾mRNAは、細胞亜集団を第1の表現型から第2の表現型に再プログラムするのに有用である。このような再プログラム化は、一時的または恒久的であってもよい。任意選択的に、再プログラム化は、標的細胞が中間表現型を取るように誘導する。
細胞型を含有する標的細胞集団が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を有する組成物に接触される。非限定的実施形態では、標的細胞集団は、哺乳類対象中の受傷組織、または外科手術の影響を受けた組織を含有する。例えば、前駆細胞は、間質前駆細胞、神経前駆細胞、または間葉前駆細胞である。
一実施形態では、ポリヌクレオチド組成物が使用されて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド、またはそれらの組み合わせの発現が増大されることで、細胞(例えば、がん細胞)内でアポトーシスが誘導され得る。組成物およびそれらの使用方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2013151666号パンフレットの段落[000966]〜[000969]中などに記載される。
キット
本発明は、好都合におよび/または効果的に本発明の方法を実施するための、多様なキットを提供する。典型的に、キットは、使用者が、対象の複数回治療を実施できるよう、および/または複数回実験を実施できるようにするのに、十分な量および/または数の構成要素を含んでなる。
なる、タンパク質生成のためのキットを提供する。
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組み込まれてもよい装置を提供する。これらの装置は、安定な製剤中に、ヒト患者などのそれを必要とする対象に即座に送達するのに利用できる製剤中に、ポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
カテーテルおよび管腔を使用する方法および装置が用いられて、本発明のポリヌクレオチドが、単一、複数または分割投与計画で投与されてもよい。このような方法および装置は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2013年3月9日に出願された、国際出願PCT/米国特許出願公開第2013/30062号明細書(代理人整理番号M300)に記載される。
電流を利用する方法および装置が用いられて、本明細書で教示される単一、複数または分割投与計画に従って、本発明のポリヌクレオチドが送達されてもよい。このような方法および装置は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2013年3月9日に
出願された、国際出願PCT/米国特許出願公開第2013/30062号明細書(代理人整理番号M300)に記載される。
本明細書の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基が、群または範囲で開示される。本開示は、このような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の下位組み合わせを含むことが、特に意図される。
組み合わせ投与:本明細書の用法では、「組み合わせ投与」または「混合型投与」という用語は、2つ以上の薬剤が、対象に、同時に、または患者に対する各薬剤効果の重なりがあってもよいような間隔内に、投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは、互いに約60、30、15、10、5、または1分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、コンビナトリアル(例えば、相乗的)効果が達成されるように、間隔が十分に接近している。
動物:本明細書の用法では、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達期にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達期にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類(例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、またはブタ)である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子組換え動物、遺伝子改変動物、またはクローンである。
、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満の範囲内にある、一連の値を指す(このような数値が、可能な値の100%を超える場合を除く)。
生物活性:本明細書の用法では、「生物活性」という語句は、生体系および/または生物中で活性を有する、任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与されると、生物に対する生物学的効果を有する物質は、生物活性と見なされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部だけでも生物活性であれば、または生物学的に関連したと見なされる活性を模倣すれば、生物活性と見なされてもよい。
キメラ:本明細書の用法では、「キメラ」は、2つ以上の不調和なまたは異種起源の部分または領域を有する実体である。
本明細書に記載される化合物は、非対称性であり得る(例えば、1つまたは複数の立体中心を有する)。特に断りのない限り、鏡像異性体およびジアステレオマーなどの全ての立体異性体が意図される。非対称的置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性またはラセミ形態で単離され得る。ラセミ混合物分解、または立体選択的合成などによっ
て、光学活性出発原料から光学活性形態を調製する方法は、当該技術分野で公知である。オレフィン、C=N二重結合などの多くの幾何学的異性体もまた、本明細書に記載される化合物中に存在し得、全てのこのような安定異性体が本開示で検討される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、異性体混合物としてまたは分離された異性体として、単離されてもよい。
コミットした:本明細書の用法では、「コミットした」という用語は、細胞に言及する場合、細胞が分化経路に十分深く入り込んでおり、正常な状況下では、それが異なる細胞型に分化しまたは分化度の低い細胞型に復帰することなく特定の細胞型または細胞型小集団への分化を継続することを意味する。
環式または環化:本明細書の用法では、「環式」という用語は、連続ループの存在を指す。環式分子は、連結してサブユニットの切れ目のない鎖を形成するのみで、環状でなくてもよい。本発明の操作されたRNAまたはmRNAなどの環式分子は、単一単位または多量体であってもよく、または1つまたは複数の複合体構成要素またはより高次の構造を含んでなってもよい。
送達剤:本明細書の用法では、「送達剤」は、ポリヌクレオチドの標的細胞へのインビボ送達を少なくともある程度容易にする、任意の物質を指す。
消化する:本明細書の用法では、「消化する」という用語は、より小型の小片または成分への切断を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化はペプチドの生成をもたらす。
分化:本明細書の用法では、「分化因子」という用語は、所望の細胞型への細胞の分化を引き起こし得る、タンパク質、RNAまたは小分子などの発達可能性改変因子を指す。
遠位:本明細書の用法では、「遠位」という用語は、中心から離れて、または目的の地
点または領域から離れて、位置していることを意味する。
用量分割係数(DSF:Dose splitting factor)−総一日用量または単一単位用量のPUDで除した、用量分割療法のPUDの比率。値は、投与計画群の比較から誘導される。
コード化タンパク質切断シグナル:本明細書の用法では、「コード化タンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
発現:本明細書の用法では、核酸配列の「発現」は、以下の事象の1つまたは複数を指す:(1)(例えば、転写による)DNA配列からのRNAテンプレートの生成;(2)(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、および/または3’末端プロセッシングによる)RNA転写物のプロセッシング;(3)RNAのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳;および(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
製剤:本明細書の用法では、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドおよび送達剤を含む。
相同性:本明細書の用法では、「相同性」という用語は、例えば、核酸分子間(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)および/またはポリペプチド分子間などの、ポ
リマー分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、重合性分子は、それらの配列が、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一であり、または類似していれば、互いに「相同的」と見なされる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)間の比較を指す。本発明によれば、2つのポリヌクレオチド配列は、少なくとも1つの一続きの少なくとも約20個のアミノ酸にわたり、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%にさえ至れば、相同的と見なされる。いくつかの実施形態では、相同的なポリヌクレオチド配列は、一続きの少なくとも4〜5個の一意に特定化されたアミノ酸をコードする能力によって、特徴付けられる。60ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、一続きの少なくとも4〜5個の一意に特定化されたアミノ酸をコードする能力によって判定される。本発明によれば、タンパク質が、少なくとも1つの一続きの少なくとも約20個のアミノ酸について、少なくとも約50%、60%、70%、80%、または90%同一であれば、2つのタンパク質配列は相同的と見なされる。
4を使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている、メイヤーズ(Meyers)およびミラー(Miller)のアルゴリズム(コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ(CABIOS)、1989年、第4巻、p11〜17)を使用して、判定され得る。あるいは、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用して、GCGソフトウェアパッケージ中のギャッププログラムを使用して判定され得る。配列間のパーセント同一性を判定するために、一般に用いられる方法としては、参照により本明細書に援用される、カリロ,H.(Carillo,H.)およびリップマン,D.(Lipman,D.)、SIAMジャーナル・オン・アプライド・マシマティクス(SIAM J.Applied Math.)、1988年、第48巻、p1073で開示されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。同一性を判定する技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで体系化される。2つの配列間の相同性を判定するための代表的コンピュータソフトウェアとしては、GCGプログラムパッケージ、デブルー,J.(Devereux,J.)ら著、ニュークレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)、1984年、第12巻、第1号、p387、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、アルチュール,S.F.(Altschul,S.F.)ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Molec.Biol.)、1990年、第215巻、p403)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
遺伝子の発現を阻害する:本明細書の用法では、「遺伝子の発現を阻害する」という語句は、遺伝子の発現産物量の低下を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたRNA(例えば、mRNA)であり得、または遺伝子から転写されたmRNAから転写されたポリペプチドであり得る。典型的に、mRNAレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドレベルの低下をもたらす。発現レベルは、mRNAまたはタンパク質を測定する標準技術を使用して、判定されてもよい。
たはキラル溶剤中の化合物の結晶化などの周知の方法によって、それらの構成要素鏡像異性体または立体異性体に分離され得る。鏡像異性体および立体異性体はまた、周知の非対称性合成法によって、ステレオマー的にまたは鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から入手され得る。
単離された:本明細書の用法では、「単離された」という用語は、それが結合される構成要素の少なくとも一部から分離された、物質または実体を指す(自然界または実験的状況を問わない)。単離された物質は、それらが結合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有してもよい。単離された物質および/または実体は、それらが最初に結合されていた、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、またはそれを超える別の成分から分離されてもよい。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%を超えて、または約99%を超えて純粋である。本明細書の用法では、物質がその他の構成要素を実質的に含まなければ、それは「純粋」である。実質的に単離された:「実質的に単離された」は、その中でそれが形成されまたは検出される環境から、化合物が実質的に分離されていることを意味する。部分的分離としては、例えば、本開示の合物に富む組成物が挙げられる。実質的分離としては、重量基準で、本開示の化合物またはそれらの塩を少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%含有する組成物が挙げられる。化合物およびそれらの塩を単離する方法は、当該技術分野のルーチンである。
、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これに限定されるものではない。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールなどのエチレンまたはプロピレングリコール単量体単位)、およびデキストランポリマーおよびその誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の例としては、例えば、還元剤または光分解を使用して切断され得る、ジスルフィド結合(−S−S−)またはアゾ結合(−N=N−)などのリンカー中の切断可能部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。選択的に切断可能な結合の非限定的例としては、例えば、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、またはその他の還元剤、および/または光分解の使用によって切断され得るアミド結合、ならびに例えば酸性または塩基性加水分解によって切断され得るエステル結合が挙げられる。
天然起源:本明細書の用法では、「天然起源」は、人為的な補助なしに自然に存在することを意味する。
オープンリーディングフレーム:本明細書の用法では、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、所定の読み枠内に終止コドンを含有しない配列を指す。
任意選択的に置換される:本明細書では、「任意選択的に置換されるX」(例えば、任意選択的に置換されるアルキル)という形態の語句は、「X、式中、Xは任意選択的に置
換される」(例えば、「アルキル、式中、前記アルキルは任意選択的に置換される」)と均等であることが意図される。特徴「X」(例えば、アルキル)自体が任意選択的であると、意味することは意図されない。
ペプチド:本明細書の用法では、「ペプチド」は、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長など、50アミノ酸長以下である。
患者:本明細書の用法では、「患者」は、治療を求めまたはそれを必要としていてもよく、治療を要求していてもよく、治療を受けており、治療を受けるであろう対象、または特別な疾患または病状について訓練を受けた専門家の介護下にある対象を指す。
トン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、櫛状、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。典型的なアルカリ性またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これに限定されるものではない、無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、無毒の無機または有機酸から形成される、従来の親化合物の無毒の塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、水中または有機溶剤中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態と、化学量論的に適量の塩基または酸とを反応させることで調製され得て;一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、「レミントン薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、第17版、マック・パブリッシング・カンパニー(Mack Publishing
Company)、ペンシルベニア州イーストン(Easton,Pa.)、1985年、p.1418;「薬用塩類:性質、選択、および用途(Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)」、P.H.シュタール(P.H.Stahl)およびC.G.ワームース(C.G.Wermuth)編集、ワイリー−VCH(Wiley−VCH)、2008年;およびベルジュ(Berge)ら著、ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンス(Journal of Pharmaceutical Science)、1977年、第66巻、p1〜19に見られる。
排泄(Excretion)(または排出)は、身体からの物質の排除を指す。稀には、いくつかの薬剤は、体組織内に不可逆的に蓄積される。
単位薬当たりポリペプチド(PUD:Polypeptide per unit drug):本明細書の用法では、PUDまたは単位薬当たり製品は、体液または組織中で測定される、通常は1mg、pg、kgなどの(ポリペプチドなどの)製品である、総一日用量の細分化部分と定義され、通常は、体流中測定値で除したpmol/mL、mmol/mLなどの濃度で定義される。
予防的:本明細書の用法では、「予防的」は、疾患の広がりを予防するために使用される、治療薬または行動方針を指す。
目的のタンパク質:本明細書の用法では、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書で提供されるもの、およびそれらの断片、変異体、変異型、および改変を含む。
プソイドウリジン:本明細書の用法では、プソイドウリジンは、ヌクレオシドウリジンのC−グリコシド異性体を指す。「プソイドウリジンアナログ」は、プソイドウリジンの任意の修飾、変異型、イソ型または誘導体である。例えば、プソイドウリジンアナログとしては、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−プソイドウリジン、1−メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、1−メチル−4−チオ−プソイドウリジン(m1s4Ψ)、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、3−メチル−プソイドウリジン(m3Ψ)、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、2−メトキシ−4−チオ−プソイドウリジン、N1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3Ψ)、および2’−O−メチル−プソイドウリジン(Ψm)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
分集合、またはその画分または一部から調製される、ホモジネート、溶解産物または抽出物をさらに含んでもよい。サンプルは、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含有してもよい、栄養ブロスまたはゲルなどの培地をさらに指す。
単一単位用量:本明細書の用法では、「単一単位用量」は、1用量/1回/単一経路/単一接触点で、すなわち、単回投与事象で、投与される任意の治療薬の用量である。
安定:本明細書の用法では、「安定」は、反応混合物から有用な純度への単離を乗り切るのに十分に堅固で、好ましくは有効な治療薬に処方できる化合物を指す。
立体異性体:本明細書の用法では、「立体異性体」という用語は、化合物(例えば本明細書に記載される任意の式の化合物)が有してもよい、全ての想定される異なる異性体ならびに立体構造形態、特に基本的分子構造の全ての想定される立体化学的および立体構造的異性体、全てのジアステレオマー、鏡像異性体および/または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性形態で存在してもよく、後者は全て本発明の範囲内に含まれる。
実質的に同時:本明細書の用法では、複数の用量に関して、用語は、2秒間以内を意味する。
罹患し易い:疾患、障害、および/または病状に「罹患し易い」個体は、疾患、障害、および/または病状の症状によって診断されず、および/またはそれを示さなくてもよい
が、疾患またはその症状を生じる性向を保有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および/または病状(例えば、がん)に罹患し易い個体は、以下の1つまたは複数によって特徴付けられてもよい:(1)疾患、障害、および/または病状の発生に関連する、遺伝子変異;(2)疾患、障害、および/または病状の発生に関連する、遺伝子多形性;(3)疾患、障害、および/または病状に関連する、タンパク質および/または核酸の発現および/または活性の増大および/または低下;(4)疾患、障害、および/または病状の発生に関連する、嗜癖および/または生活習慣;(5)疾患、障害、および/または病状の家族歴;および(6)疾患、障害、および/または病状の発生に関連する微生物への曝露および/またはそれによる感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および/または病状に罹患し易い個体は、疾患、障害、および/または病状を発生する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および/または病状に罹患し易い個体は、疾患、障害、および/または病状を発生しない。
合成:「合成」という用語は、人の手によって生産され、調製され、および/または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
全能性:本明細書の用法では、「全能性」は、成体身体に見られる全ての細胞、ならびに胎盤を含む胚体外組織を生成する発生能がある細胞を指す。
たはその他の分子との複合体中で、標的遺伝子の転写を制御してもよい。
ワクチン:本明細書の用法では、「ワクチン」という語句は、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的製剤を指す。
均等物および範囲
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または見極めることができるであろう。本発明の範囲は、上の説明に限定されることは意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
という用語もまた包含されて、開示される。
(実施例)
実施例1.ポリヌクレオチドの製造
本発明によれば、ポリヌクレオチドおよびまたはそれらの部分または領域の製造は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2013年3月15日に出願された、「RNA転写物の生成のための製造法(Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts)」という名称の米国特許出願第61/800,049号明細書(代理人整理番号M500)で教示される方法を使用することで、達成されてもよい。
本明細書に援用される、2013年3月15日に出願された、「mRNA不均一性および安定性の解析(Analysis of mRNA Heterogeneity and Stability)」という名称の米国特許出願第61/799,905号明細書(代理人整理番号M506);および2013年3月15日に出願された、「mRNAのイオン交換精製(Ion Exchange Purification of mRNA)」という名称の米国特許出願第61/800,110号明細書(代理人整理番号M507)で教示される。
序論
本発明によれば、三リン酸化学反応を使用して、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分が、連結またはライゲートされてもよい。
キメラポリヌクレオチド第2の領域または部分は、化学合成法またはIVT法のいずれかを使用して、合成されてもよい。IVT法は、修飾キャップがあるプライマーを使用し得る、RNAポリメラーゼを含んでもよい。あるいは、80ヌクレオチドまでのキャップが化学的に合成されて、IVT領域または部分と連結されてもよい。
キメラポリヌクレオチド全体が、リン酸−糖主鎖と共に、製造されなくてもよい。領域または部分の1つがポリペプチドをコードする場合、このような領域または部分は、リン酸エステル−糖主鎖を含んでなることが好ましい。
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発断片を使用して作られる。このような断片としては、
(a)正常3’OHを含んでなる、キャッピングされ保護された5’断片(SEG.1)、
(b)ポリペプチドのコード領域を含んでもよく、正常3’OHを含んでなる、5’三リン酸断片(SEG.2)、
(c)コルジセピンを含んでなりまたは3’OHを含まない、キメラポリヌクレオチドの3’末端(例えばテール)のための5’一リン酸断片(SEG.3)
が挙げられる。
スファターゼで処置されて、5’一リン酸が生成される。
次にRNAリガーゼを使用して、断片2(SEG.2)がSEG.3にライゲートされる。次にライゲートポリヌクレオチドが精製されて、ピロホスファターゼで処置され、二リン酸が切断される。次に処置されたSEG.2−SEG.3コンストラクトが精製されて、SEG.1が5’末端にライゲートされる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップが実施されてもよい。
実施例3.cDNA生成のためのPCR
cDNA調製のためのPCR手順は、マサチューセッツ州ウォーバーン(Woburn,MA)のカパ・バイオシステムズ(Kapa Biosystems)の2×KAPA
HIFI(商標)ホットスタート・レディミックス(HotStart ReadyMix)を使用して実施される。このシステムは、2×KAPAレディミックス(ReadyMix)12.5μl;順方向プライマー(10μm)0.75μl;逆方向プライマー(10μm)0.75μl;テンプレートcDNA−100ngを含み、dH20で25.0μlに希釈される。反応条件は、95℃で5分間、98℃で20秒間を25サイクル、次に58℃で15秒間、次に72℃で45秒間、次に72℃で5分間、次に4℃で終結する。
インビトロ転写反応は、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレトディズ(polynucletodies)を生じる。このような均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含んでなってもよい。供試ヌクレオチド三リン酸(NTP)混合物は、天然および非天然NTPを使用してイン・ハウス作成される。
1 1.0μgのテンプレートcDNA、
2 2.0μlの10×転写緩衝液(400mMのTris−HCl pH8.0、190mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのスペルミジン)、
3 7.2μlのカスタムNTP(各25mM)、
4 20UのRNase阻害剤、
5 3000UのT7 RNAポリメラーゼ、
6 最大20.0μlのdH20
を含み、および
7 37℃で3〜5時間インキュベーションされる。
ポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のようにして実施され、混合物は、60μg〜180μgのIVT RNAおよび72μに満たす量のdH20を含む。混合物は65℃で5分間インキュベートされ、RNAが変性されて、次に即座に氷に移動される。
cDNA中のポリ−Tなしでは、最終生成物の浄化前に、ポリ−Aテーリング反応が実施されなくてはならない。これは、キャップドIVTRNA(100μl);RNase阻害剤(20U);10×テーリング緩衝液(0.5MのTris−HCl(pH8.0)、2.5MのNaCl、100mMのMgCl2)(12.0μl);20mMのATP(6.0μl);ポリAポリメラーゼ(20U);123.5μlに満たす量のdH20を混合して、37℃で30分間インキュベーションすることで実施される。ポリAテールが、転写物中に既にあれば、次にテーリング反応がスキップされて、テキサス州オースティン(Austin,TX)のアンビオン(Ambion)のメガクリア(MEGACLEAR)(商標)キットによる精製に、直接進められてもよい(最大500μg)。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
、150〜165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164または165などのおよそ40〜200ヌクレオチドのポリAテールは、本発明の範囲内である。
ポリヌクレオチドの5’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、以下の化学的RNAキャップアナログを使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、5’−グアノシンキャップ構造が生成されてもよい:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[theARCAcap];G(5’)ppp(5’)A;G(5’)ppp(5’)G;m7G(5’)ppp(5’)A;m7G(5’)ppp(5’)G(マサチューセッツ州イプスウィッチ(Ipswich,MA)のニュー・イングランド・バイオラブズ(New England BioLabs))。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)Gが生成されてもよい(マサチューセッツ州イプスウィッチ(Ipswich,MA)のニュー・イングランド・バイオラブズ(New England BioLabs))。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2’−Oメチル−トランスフェラーゼの両方を使用して生成されてもよく、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルが生成される。キャップ2構造は、キャップ1構造から生成されてもよく、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを使用した、5’末端から3番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化がそれに続く。キャップ3構造は、キャップ2構造から生成されてもよく、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを使用した、5’末端から4番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化がそれに続く。酵素は、好ましくは、組換え源に由来する。
A.タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞に形質移入され得る。形質移入の6、12、24および36時間後に、培養液中に分泌されるタンパク質量は、ELISAによってアッセイされ得る。培地中により高レベルのタンパク質を分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力があるキャップ構造がある合成ポリヌクレオチドに相当する。
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を使用して、純度について比較され得る。電気泳動による単一統合バンドがあるポリヌクレオチドは、複数バンドまたは縞バンドがあるポリヌクレオチドと比較して、より高純度の生成物に相当する。単一HPLCピークがある合成ポリヌクレオチドもまた、より高純度の生成物に相当する。より高効率でのキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供する。
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数濃度で細胞に質移入され得る。形質移入の6、12、24および36時間後、培養液中に分泌されるTNF−αおよびIFN−βなどの炎症促進性サイトカインの量が、ELISAによってアッセイされ得る。培地中へのより高レベルの炎症促進性
サイトカイン分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに相当する。
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後に、LC−MSによってキャッピング反応効率について分析され得る。キャップドポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチドと、LC−MSによって検出可能であるキャップド5’−5三リン酸キャップ構造との混合物をもたらす。LC−MSスペクトル上のキャップド生成物の量は、反応からの全ポリヌクレオチドのパーセントとして表され得、キャッピング反応効率に対応する。より高いキャッピング反応効率があるキャップ構造は、LC−MSによってより多量のキャップド生成物を有する。
個々のポリヌクレオチド(20μl容量中の200〜400ng)または逆転写PCR産物(200〜400ng)は、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad,CA)のインビトロジェン(Invitrogen)の非変性1.2%アガロースE−ゲル上のウェルに装入されて、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間泳動される。
ナノドロップ(Nanodrop)UV吸光度読み取りのために、TE緩衝液(1μl)中の修飾ポリヌクレオチドが使用されて、化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率が定量化される。
細胞への添加前に、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとリピドイドとを設定比率で混合することで、インビトロ実験のために製剤化される。インビボ製剤は、身体全体にわたる循環を促進するための追加の成分の添加を要してもよい。これらのリピドイドが、インビボ研究に適した粒子を形成する能力を試験するために、siRNA−リピドイド製剤のための標準製剤過程が、出発点として使用されてもよい。粒子形成後、ポリヌクレオチドが添加されて、複合体と一体化される。カプセル化効率は、標準色素排除アッセイを使用して評価される。
A.エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルが調製されて、1、2、3または4台の質量分析器を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)のための製造業者のプロトコルに従って分析される。生物学的サンプルはまた、タンデムESI質量分析システムを使用して分析されてもよい。
B.マトリックス支援レーザー脱離/イオン化
対象に投与される1つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルが調製されて、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)のための製造業者のプロトコルに従って分析される。
C.液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析
1つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含有してもよい生物学的サンプルは、トリプシン酵素で処理されて、中に含有されるタンパク質が消化されてもよい。結果として生じるペプチドは、液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析(LC/MS/MS:liquid chromatography−mass spectrometry−mass spectrometry)によって分析される。ペプチドは質量分光計内で断片化されて、コンピュータアルゴリズムによってタンパク質配列データベースとマッチされ得る診断パターンが得られる。消化されたサンプルが希釈されて、所与のタンパク質について、1ng以下の出発原料が得られてもよい。単純な緩衝液バックグラウンド(例えば、水または揮発性塩)を含有する生物学的サンプルは、直接溶液内消化に適しており;より複雑なバックグラウンド(例えば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール)は、サンプル分析を容易にするための追加的な浄化工程を要する。
実施例13.環化および/または鎖状化
本発明によれば、ポリヌクレオチドは環化または鎖状化されて、翻訳能力がある分子が生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との相互作用を促進してもよい。環化または鎖状化機序は、1)化学的、2)酵素的、および3)リボザイム触媒性の少なくとも3つの異なる経路を通じて起こってもよい。新たに形成される5’−/3’−結合は、分子内または分子間にあってもよい。
ドイツ国ヴェセル(Wesel,Germany)のLGCスタンダーズ有限責任会社(LGC standards GmbH)からのヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細
胞は、米国サンノゼ(San Jose,USA)のBDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)からの6ウェルプレート上に接種される。HEK293は、ウェルあたり3mLの細胞培養液中の約500,000細胞の密度で接種される。野性型LDLR mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aドメイン配列変異体mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aおよび細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはLDLR細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはG−CSFの対照(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり800ngの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるLDLR mRNA配列変異型としては、N316A、E317A、D331A、およびY336A(#399)の4アミノ酸置換変異型、またはY336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、K816R、K830R、またはC839Aを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の1つまたは複数もまた含有してもよい。mRNA形質移入細胞は、抗LDLR抗体で処理されて、1セットのLDLR形質移入細胞は、対照として正常ヤギIgGで処理される。結合一次抗体は、フィコエリトリン(PE:Phycoerythrin)標識二次抗体による処理に続いて、FACS分析によって検出される。ゲート生細胞パーセントは、LDLRを発現することが検出される。対照非免疫IgGで染色されたLDLR mRNA処理細胞では染色が観察されず、G−CSFmRNAで形質移入された細胞ではLDLR陽性細胞が検出されないことが期待される。
A.発現
ドイツ国ヴェセル(Wesel,Germany)のLGCスタンダーズ有限責任会社(LGC standards GmbH)からのヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細胞は、米国サンノゼ(San Jose,USA)のBDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)からの6ウェルプレート上に接種される。HEK293は、ウェルあたり3mLの細胞培養液中の約500,000細胞の密度で接種される。野性型LDLR mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aドメイン配列変異体mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aおよび細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはLDLR細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも
140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはG−CSFの対照(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり800ngの量で添加されて、60μg/mLの外来性ヒトPCSK9の存在および不在下でインキュベートされる。調製され試験されるLDLR mRNA配列変異型としては、N316A、E317A、D331A、およびY336A(#399)の4アミノ酸置換変異型(本明細書では4変異LDLR変異体とも称される)、またはY336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、K816R、K830R、またはC839Aを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の1つまたは複数もまた含有してもよい。mRNA形質移入細胞は、抗LDLR抗体で処理されて、1セットのLDLR形質移入細胞は、対照として正常ヤギIgGで処理される。37℃で15時間後、形質移入媒体が除去されて、細胞は洗浄され、上述されるようにフィコエリトリン(PE)にコンジュゲートされた抗LDLR抗体で処理される。LDLR形質移入細胞の1セットは、PEにコンジュゲートされた正常ヤギIgGで処理され、別の非形質移入細胞のセットは、対照として使用される。G−CSF修飾mRNAで形質移入された細胞が、追加的な陰性対照として使用される。結合一次抗体は、上述されるようにフローサイトメトリーによって検出される。
発現されたLDLRが機能的かどうかを評価するために、ボディパイ標識LDLが使用される。HEK293細胞は、LDLRまたはG−CSF mRNAのいずれかで一晩形質移入され、細胞は洗浄されて、増大される量のボディパイLDLと共にインキュベートされる。37℃で1時間のインキュベーションに続いて、細胞が洗浄されて、細胞結合型ボディパイLDLが、フローサイトメトリーによって評価される。ボディパイLDL結合の等高線図が得られる。野生型、LDLR PCSK9および/または細胞質内ドメイン結合変異型では、LDLR mRNA形質移入細胞へのボディパイLDLの結合は、ボディパイLDL濃度と共に増大する、ゲート細胞数における右方移行として明らかである。LDLR mRNAコンストラクトのそれぞれで形質移入された細胞において、ゲート細胞数に同様の右方移行が見られることが予測される。野性型、PCSK9結合欠損、および/または細胞質内ドメイン変異型LDLR mRNAのいずれかで形質移入された細胞に結合するボディパイLDLについて、最大半量細胞結合が同一であることもまた予測される。各コンストラクトについて、ボディパイLDL結合は、高親和性(0.6〜0.7ng/mLの最大半量結合)かつ飽和性であることが予測される。G−CSF mRNAで形質移入された細胞では、ボディパイLDL結合が観察されない可能性が高い。
外来性PCSK9が、LDLR mRNAで形質移入された細胞の細胞表面LDL受容体の見かけの半減期を調節し得るかどうかを評価するために、HEK293細胞が播種され、インキュベートされ、上述されるようにLDLR mRNAで形質移入される。細胞単層が洗浄されて、PCSK9(60μg/mL)ありまたはなしで新鮮培地が添加される。37℃で様々なインキュベーション時間後、細胞表面LDLR発現が、上述されるように抗LDLR抗体を使用するフローサイトメトリーによって、モニターされる。野生型LDLR mRNAで形質移入された細胞の細胞表面LDLRは、時間依存的方法で低下することが期待される。同様に、野生型LDLR mRNAで形質移入された細胞の培地へのPCSK9の添加は、細胞表面LDLRの見かけの半減期を低下させることが予測される。対照的に、PCSK9結合欠損LDLR mRNAで、またはPCSK9結合欠損および細胞質内ドメイン変異体LDLR mRNAで形質移入された細胞の培地へのPCSK9の添加は、細胞表面LDLRの見かけの半減期にわずかまたは皆無の変化を生じる。これらのデータは、細胞質内ドメイン変異の存在または不在下で、PCSK9結合部位に変異があるLDLRをコードするLDLR mRNAで形質移入された細胞が、外来性PCSK9に応答できないことを示すと予想され、これらの結合変異型が、インビボで野生型LDLRよりもさらに長い半減期を有して、高コレステロール血症がある患者を治療するために有用であってもよいことが示唆される。
共に、または単独で、または組み合わせで、LDLRの細胞質内ドメインをコードするLDLR mRNAの変異(K816R、K830R、またはC839A)は、LDLRのユビキチン化を妨げ、ひいてはLDLRの細胞半減期を延長することが期待される。これを評価するために、HEK293細胞またはHep−G2細胞が、野性型LDLR mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aドメイン配列変異体mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aおよび細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはLDLR細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはG−CSFの対照(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤で形質移入されて、細胞播種の直後にウェルあたり800ngの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるLDLR
mRNA配列変異型としては、N316A、E317A、D331A、およびY336A(#399)の4アミノ酸置換変異型、またはY336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、K816R、K830R、またはC839Aを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の1つまたは複数もまた含有してもよい。細胞は、LXRαのためのオキシステロールリガンドと共に37℃で最高24時間インキュベートされて、IDOLの発現が誘導される。IDOLが、LDLRをユビキチン化する能力は、ユビキチンおよびLDLR特異的抗体による細胞抽出物のウエスタン分析によって評価される。細胞質内ドメイン変異を含有するLDLR変異型は、ユビキチン化低下を示すことが期待される。
インビボでLDLR mRNAの機能を評価するために、LDL受容体欠損マウスが使用される。動物は、野性型LDLR mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾、または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aドメイン配列変異体mRNA(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、LDLR EGF−Aおよび細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはLDLR細胞質内ドメイン配列変異体(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)、またはG−CSFの対照(5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる完全修飾または1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する、例えば、C12−200を使用するものなどの様々な用量のナノ粒子製剤を投与されて、細胞播種の直後にウェルあたり800ngの量で添加されてインキュベートされる。調製され試験されるLDLR mRNA配列変異型としては、N316A、E317A、D331A、およびY336A(#399)の4アミノ酸置換変異型、またはY336A(#400)、E317A(#401)、N316A(#402)、L339D(#403)、D331E(#404)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。これらの配列変異型は、K816R、K830R、またはC839Aを含む、いくつかの細胞質内ドメイン変異型の1つまたは複数もまた含有してもよい。様々な時間後に、マウスは殺処分されて、血清サンプルが得られ、ウエスタンブロット法によって肝臓のLDLR発現レベルが評価される。PCSK9結合変異型によってコードされるLDLRの見かけの半減期は、増大することが期待される。細胞質内ドメインの変異もまた保有する、PCSK9結合変異体によってコードされるLDLRの半減期も、増大することがさらに期待される。LDLR変異体の延長半減期は、血清VLDL+IDL+LDLコレステロールのレベル低下に関連すると予測される。これらのデータは、LDLR mRNAがある家族性高コレステロール血症を治療するためのアプローチをさらに確認する。
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、マウスLDLRをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第1の領域を含んでなってもよい。本発明のマウスLDLRタンパク質配列は、下の表10に列挙される。表10に示されるのは、遺伝子およびタンパク質配列識別子の名称および説明である。任意の特定の遺伝子では、1つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。コード領域は、タンパク質配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。1つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利用することで、5’および3’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ENST転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、ヒトLDLRをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第1の領域を含んでなってもよい。本発明のヒトLDLRタンパク質配列は、下の表11に列挙される。表11に示されるのは、遺伝子およびタンパク質配列識別子の名称および説明である。任意の特定の遺伝子では、1つまたは複数の変異型またはイソ型が存在してもよい。表で開示されるのは、可能な隣接領域であることが、当業者によって理解されるであろう。コード領域は、タンパク質配列を教示することで、確定的かつ具体的に開示される。その結果、タンパク質をコードするものに隣接する教示される配列は、隣接領域と見なされる。1つまたは複数の利用可能データベースまたはアルゴリズムを利
用することで、5’および3’隣接領域をさらに特性決定することもまた可能である。データベースは、ENST転写物の隣接領域に含まれる特徴をアノテートし、これらは当該技術分野で利用できる。
A.LDLR−IDOL変異体のインビトロ発現
HEK293細胞は、ヒトまたはマウスLDLR変異体をコードするmRNAで形質移入されて、対照ヒトまたはマウスLDLR(野性型)と比較される。HEK293細胞は、リポフェクタミン2000を使用して、mRNA(約4〜4000ngのmRNA)用量を増大させて、ヒトまたはマウスLDLRをコードするmRNAによって12〜14時間形質移入される。細胞は収集されて、ヤギ抗hLDLR−PEまたはヤギIgG−PE抗体のいずれかで染色されて、フローサイトメーターで分析される。LDLR発現は、各用量および評価されるコンストラクトに対するLDLR陽性細胞の百分率として、評価される。
されず、5’キャップはCapであり、mRNAは5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾される)、変異K830R、C839A、およびL339D(アミノ酸配列は配列番号52に示される;mRNA配列は配列番号736に示され、およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中に図示されず、5’キャップはCapであり、mRNAは5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾される)、または変異K830RおよびC839A(アミノ酸配列は配列番号54に示される;mRNA配列は配列番号737に示され、およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中に図示されず、5’キャップはCapであり、mRNAは5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾される)が挙げられる。
LDLR−IDOL変異体の発現の確立に続いて、これらのmRNAのインビトロ生物活性が評価されて、野生型受容体のインビトロ生物活性と比較される。LDLR−IDOL変異体をコードするmRNAは、ボディパイ標識LDL結合アッセイを使用して、リガンド結合について評価される。HEK293細胞は、LDLR−IDOL変異体をコードするmRNAで、約4ng〜約4000ngの範囲の用量で、12〜14時間形質移入される。
れ、およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中に図示されず、5’キャップはCapであり、mRNAは5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾される)、または変異K832RおよびC841A(アミノ酸配列は配列番号728に示される;mRNA配列は配列番号734に示され、およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中に図示されず、5’キャップはCapであり、mRNAは5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾される)が挙げられる。
LDLR−IDOL変異体をコードするmRNAは、PCSK9抑制的調節に対する抵抗性について評価される。
ヒトまたはマウスLDLR−IDOL変異体をコードするmRNAの能力が、インビボでヒトまたはマウスLDLR(野生型)と比較される。
ドイツ国ヴェセル(Wesel,Germany)のLGCスタンダーズ有限責任会社(LGC standards GmbH)からのヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細胞は、米国サンノゼ(San Jose,USA)のBDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)からの48ウェルプレート上に接種される。HEK293は、ウェルあたり0.2mLの細胞培養液中の約60,000細胞の密度で接種される。1μLのリポフェクタミンおよび150ngの野性型(WT:wild type)LDLR mRNA(mRNA配列は配列番号738に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)または150ngの変異体LDLR配列mRNAまたはG−CSFmRNAの対照(mRNAは配列番号739に示される;5−メ
チルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり60,000の量で添加されてインキュベートされる。
systems)カタログ番号AC−108−C)で処理された。結合一次抗体は、ミネソタ州ミネアポリス(Minneapolis,MN)のアール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)からのフィコエリトリン(PE)標識抗体による処理に続き、FACS分析によって検出された。PEへのコンジュゲーションは、イノーバ・バイオサイエンシズ(Innova biosciences)ライトニング・リンク(lightning−link)コンジュゲーション・キット(ライトニング・リンク(Lightning−Link)R−PE抗体標識キット、ノーバス・バイオロジカルズ(Novus Biologicals)、カタログ番号:703−0010)によって完了した。
ドイツ国ヴェセル(Wesel,Germany)のLGCスタンダーズ有限責任会社
(LGC standards GmbH)からのヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細胞は、米国サンノゼ(San Jose,USA)のBDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)からの48ウェルプレート上に接種される。HEK293は、ウェルあたり0.2mLの細胞培養液中の約60,000細胞の密度で接種される。1μLのリポフェクタミン2000および150ngの野性型(WT)LDLR mRNA(mRNA配列は配列番号738に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)または150ngのLDLR配列変異体mRNAまたは150ngのG−CSFmRNAの対照(mRNAは配列番号739に示される;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤は、細胞播種の直後にウェルあたり800ngの量で添加されて、60μg/mLの外来性ヒトPCSK9の存在および不在下でインキュベートされる。
発現されたLDLRが機能性であるかどうかを評価するために、ボディパイ標識LDLが使用された。ウェルあたり60,000個のHEK293細胞は、1μLのリポフェクタミン2000および150ngのコードする野性型(WT)LDLR mRNA(mRNA配列は配列番号738に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)または150ngのLDLR変異体mRNAまたは150のG−CSFmRNAの対照(mRNAは配列番号739に示される;5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンによる完全修飾;5’キャップ、cap1;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない)を含有する製剤で一晩形質移入された。
配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、D331E(mRNA配列は配列番号64に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
外来性PCSK9が、LDLR mRNAで形質移入された細胞において、細胞表面LDL受容体の見かけの半減期を調節し得るかどうかを評価するために、ウェルあたり130,000個の細胞で、HEK293細胞が24ウェルプレート上に播種されて、LDLR mRNAで形質移入され、上述されるように14時間インキュベートされた。細胞単層は洗浄され、PCSK9(60μg/mL)添加またはPCSK9非添加の新鮮培地が添加された。37℃で様々なインキュベーション時間後、細胞表面LDLR発現が、上述されるように抗LDLR抗体を使用するフローサイトメトリーによって、モニターされた。図19Aに示されるように、300ngの野生型LDLR mRNA(mRNA配列は配列番号738に示される;およそ160ヌクレオチドノポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)で形質移入された細胞における細胞表面LDLRは、時間依存的方法で低下して、見かけの半減期はおよそ13時間であった。野生型LDLR mRNAで形質移入された細胞の培地へのPCSK9添加は、細胞表面LDLRの見かけの半減期を約4時間に低下させた。図19A中で、「*」は、統計的検定による有意差を表す。
ap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、L339D(mRNA配列は配列番号65に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、D331E(mRNA配列は配列番号64に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。
10%ウシ胎仔血清添加完全細胞培地MEM(グルタマックス(GlutaMAX)、ライフサイエンス(Life Science)、カタログ番号41090−036)に添加されたPCSK9量を増大させることによる、細胞表面LDLR発現の抑制的調節を評価することを目的とした。HEK293細胞は、ウェルあたり300,000個の細胞で播種されて、6時間培養され、300ngの野生型LDLR mRNA(mRNA配列は配列番号738に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、またはPCSK9結合変異体をコードするLDLR mRNAのいずれかで、15時間にわたり形質移入された。調製され試験されるPCSK9結合変異体mRNA配列としては、N316A(mRNA配列は配列番号66に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、およびD331E(mRNA配列は配列番号64に示される;およそ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)の単一アミノ酸置換変異型が挙げられる。mRNA UGT1A1をコードする対照(mRNA配列は配列番号740に示される;ほぼ160ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシオスチン(methylcyostine)および1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)もまた使用された。
脂質ナノ粒子(LNP)は、当該技術分野で公知の方法、本明細書に記載される方法および/またはその内容全体が参照により本明細書に援用される、「修飾ヌクレオシド、ヌ
クレオチド、および核酸組成物(Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Composition)」という名称の国際公開第2013090648号パンフレットに記載される方法を使用して、製剤化される。本明細書で使用されるLNPは、イオン化可能脂質DLin−KC2−DMAまたはカチオン性脂質C12−200を含んでなり得る。
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号741に示される;少なくとも140ヌクレオチドのポリAテール配列中には示されない;5’キャップ、Cap1)は、5−メチルシトシンおよびプソイドウリジンのいずれかによって完全修飾され、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによって完全修飾され、プソイドウリジンによって完全修飾され、1−メチルプソイドウリジンによって完全修飾され、または25%のウリジン残基が2−チオウリジンで修飾され、25%のシトシン残基が5−メチルシトシンで修飾される。次にルシフェラーゼmRNAは、カチオン性脂質DLin−KC2−DMA(KC2)またはC12−200を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化される。PBS中の製剤化LNP、またはPBS単独の対照が、表13に概説されるように、LDLR−/−または正常マウスに静脈内に投与される。マウスは、注射の2時間、8時間、24時間、および48時間後にイメージングされる。イメージングの10分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液が、150mg/kgで腹腔内注射される。次に動物は麻酔されて、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)のイビス・ルミナ・ツー(IVIS Lumina II)イメージングシステムによって、イメージングが得られる。
マウスモデル(LDLR−/−マウス)は、LDLR受容体遺伝子のエクソン4中に挿
入されたネオカセットを使用して、C57BL/6バックグラウンド系統から開発された。マウスモデルは、200〜400mg/dlの上昇した血清コレステロールレベルを有して(80〜100mg/dlが正常レベルと見なされる)、高脂肪食を与えられると200mg/dlを超えて上昇する。
1.1mg/kgのヒトLDLR mRNA(配列番号63;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)またはルシフェラーゼ(配列番号741;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)は、C12−200(モル比40%)、コレステロール(モル比25%)、PEG脂質(モル比5%)、およびDSPC(モル比30%)を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化された。脂質ナノ粒子の平均サイズは105nmであり、PDIは0.15、pH7.4におけるζは0.7mV、カプセル化効率(リボグリーン(RiboGreen))は55%であり、総脂質と修飾mRNAの質量比は20:1であった。製剤化mRNAは、100μLで静脈内投与された。1.4ng/mlの組換えヒトLDLRが、対照として使用された。投与の6時間および24時間後に肝臓が採取され、ミクロソーム調製物が作成されて、LicorウエスタンブロットおよびCEアッセイを使用して分析された。CEアッセイでは、濃度が、カルネキシン負荷対照に対して正規化された。LDLR発現は、投与の6時間および24時間後に見られた。
A.マウスLDLR
マウスLDLR二重変異体(PCSK9およびIDOL変異型)をコードするmRNA、マウスLDLRPCSK9変異体をコードするmRNA、マウスLDLRIDOL変異体をコードするmRNA、およびマウス野性型LDLRをコードするmRNAは製剤化されて、LDLR−/−マウスに投与される。投与の2、4、5、6、8および/または24時間後にサンプルが収集され、当該技術分野で公知の方法(例えば、CEアッセイまたはウエスタンブロット)を使用して、発現が評価される。
ヒトLDLR二重変異体(PCSK9およびIDOL変異型)をコードするmRNA、ヒトLDLRPCSK9変異体をコードするmRNA、ヒトLDLRIDOL変異体をコードするmRNA、およびマウス野性型LDLRをコードするmRNAは製剤化されて、LDLR−/−マウスに投与される。投与の2、4、5、6、8および/または24時間後にサンプルが収集され、当該技術分野で公知の方法(例えば、CEアッセイまたはウエスタンブロット)を使用して、発現が評価される。
LDLR−/−マウスには、0.5mg/kg、0.1mg/kg、または0.05mg/kgで、C12−200(モル比40%)、コレステロール(モル比25%)、PEG2000−DOMG脂質(モル比5%)、およびDSPC(モル比30%)を含んでなる脂質ナノ粒子に製剤化された、100μlのマウスLDLR mRNA(配列番号742;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、マウスLDLR変異体1(野性型配列(配列番号742)mRNAと比較して変異N317A、K832R、およびC841Aを含んでなる(配列番号724;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、マウスLDLR変異体2(野性型配列(配列番号742)mRNAと比較して変異L340D、K832R、およびC841Aを含んでなる(配列番号733;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)、またはマウスIDOL変異体(野性型配列(配列番号742)mRNAと比較して変異K832RおよびC841Aを含んでなる(配列番号734;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)が静脈内投与された。脂質ナノ粒子の平均サイズは105nmであり、PDIは0.15、pH7.4におけるζは0.7mV、カプセル化効率(リボグリーン(RiboGreen))は55%であり、総脂質と修飾mRNAの質量比は20:1であった。コレステロール、DSPC、およびPEG2000−DOMG(40:25:30:5モル比)、を含んでなるC12−200脂質ナノ粒子に製剤化された、0.5mg/kgのルシフェラーゼ(配列番号741;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)の対照、野性型マウスおよび組換えマウスLDLR標準が、対照として使用された。投与の6時間後に、投与24時間後の肝臓を採取して、Licorウエスタンブロットを使用して、ミクロソーム調製物が作成された。図21および表14に示されるように、マウスLDLR変異型は、評価された全ての濃度で野生型LDLRよりも良好に発現された。
100ngのLDLRをコードする野性型マウスmRNA(配列番号:742;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)およびマウスLDLR変異体1(野性型配列(配列番号742)mRNAと比較して変異N317A、K832R、およびC841Aを含んでなる(配列番号724;およそ140ヌクレオチド
のポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap0;1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)が、HeLaおよびHepa1−6に形質移入された。細胞はまた、100μL中の100ngのルシフェラーゼmRNA(配列番号741;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)または100μL中の1.1mg/kgIDOL mRNA(配列番号743;およそ140ヌクレオチドのポリAテールは配列中には示されない;5’キャップ、Cap1;1−メチルプソイドウリジンによる完全修飾)でも形質移入された。LDLR発現は、フローサイトメトリーによって14時間後に分析された。
使用された言葉は限定でなく説明の言葉であり、そのより広い態様で本発明の真の範囲および趣旨を逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更形態をなし得ることが理解される。
Claims (21)
- 低密度リポタンパク質受容体(LDLR)をコードするポリヌクレオチドであって、前記LDLRが、EGF−Aドメイン、細胞内ドメイン、およびEGF−ドメインと細胞内ドメインとの両方からなる群から選択されるドメイン中に、少なくとも1つの変異を含み、
前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号37〜55および724〜729からなる群から選択される目的のポリペプチドをコードする、連結ヌクレオシドの第1の領域;
(b)少なくとも1つの5’末端キャップを含む、前記第1の領域に対して5’に位置する第1の隣接領域;
(c)連結ヌクレオシドの3’テーリング配列を含む、前記第1の領域に対して3’に位置する第2の隣接領域
を含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチド。 - 前記連結ヌクレオシドの第1の領域が、少なくとも核酸配列のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列が、配列番号56〜718および732〜737からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記目的のポリペプチドが、少なくとも2つの変異を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも2つの変異が、前記細胞内ドメインに位置する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記2つの変異が、K816R、K830R、およびC839Aからなる群から選択される、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記2つの変異が、K830RおよびC839Aである、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記目的のポリペプチドが、前記細胞内ドメインに3つの変異を含み、かつ前記3つの変異が、K816R、K830R、およびC839Aである、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記目的のポリペプチドが、前記EGF−Aドメインに1つの変異、および前記細胞内ドメインに少なくとも2つの変異を含む、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EGF−Aドメイン中の前記1つの変異が、N316AおよびL339Dからなる群から選択され、かつ前記細胞内ドメイン中の前記少なくとも2つの変異が、K816R、K830R、およびC839Aからなる群から選択される、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EGF−Aドメイン中の前記1つの変異がN316Aであり、かつ前記細胞内ドメインが前記K830RおよびC839A変異を含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EGF−Aドメイン中の前記1つの変異がN316Aであり、かつ前記細胞内ドメインが前記K816R、K830R、およびC839A変異を含む、請求項9に記載のポ
リヌクレオチド。 - 前記EGF−Aドメイン中の前記1つの変異がL339Dであり、かつ前記細胞内ドメインが前記K830RおよびC839A変異を含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EGF−Aドメイン中の前記1つの変異がL339Dであり、かつ前記細胞内ドメインが前記K816R、K830R、およびC839A変異を含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ドメインが前記細胞内ドメインであり、および前記少なくとも1つの変異が、IDOLがLDLRを分解するのを妨げる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドが、表5の修飾から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記表5の修飾がウリジン修飾である、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 前記表5の修飾がシチジン修飾である、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、2つの化学修飾ヌクレオシドを含む、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 第1の前記化学修飾ヌクレオシドがウリジンであり、第2の前記化学修飾ヌクレオシドがシトシンである、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
- 対象の血漿中のコレステロールレベルを調節する方法であって、前記対象を請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物に接触させるステップを含む、方法。
- 細胞表面のLDLRのレベルまたは量を増大させる方法であって、前記対象を請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物に接触させるステップを含む、方法。
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