ES2627856T3 - Material compuesto de péptido-hidrogel - Google Patents

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Suzanne MITHIEUX
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Abstract

Polímero para la formación de un hidrogel, incluyendo el polímero: un primer monómero con capacidad de unión a agua en el que el primer monómero es un poliéter seleccionado de polietilenglicol (PEG), oligo(etilenglicol) (OEG), poli(óxido de etileno) (PEO), poli(óxido de etileno-co-óxido de propileno) (PPO), copolímeros de bloque o al azar de copoli(óxido de etileno) y poli(alcohol vinílico) (PVA); un segundo monómero para conferir propiedades mecánicas a un hidrogel en el que el segundo monómero es un metacrilato o un poliéster seleccionado de metacrilato de hidroxietilo (HEMA), poli(ácido láctico), poli(caprolactona), poli(glicolida), poli(glicolida-co-lactida), poli(glicolida-co-caprolactona) y copolímeros al azar de los mismos; y un tercer monómero para la unión a una proteína de la matriz extracelular, en el que el tercer monómero tiene grupos funcionales electrófilos para la unión a una proteína de la matriz extracelular seleccionados de Nhidroxisuccinimidas (NHS), N-hidroxisulfosuccinimida (SNHS), succinimida N-hidroxietoxilada (ENHS) y Nacriloxisuccinimida (NAS).

Description

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DESCRIPCION
Material compuesto de peptido-hidrogel Campo de la invencion
La invencion se refiere a pollmeros para la formacion de hidrogeles, y a composiciones e hidrogeles que incluyen tales pollmeros. Tambien se describe en el presente documento el uso de hidrogeles para la reparacion o restauracion de tejido, en particular, para la reparacion o restauracion de cartllago, especialmente cartllago articular.
Antecedentes de la invencion
El cartllago articular es un tejido altamente especializado que reduce la friccion articular en los extremos de los huesos largos. Es predominantemente avascular, aneural y alinfatico y consiste esencialmente en condrocitos, algunas celulas progenitoras y una matriz extracelular (MEC). La MEC se compone de una red de colagenos, en particular colageno de tipo II, que proporciona al tejido su conformacion y resistencia mecanica, y proteoglicanos, que proporcionan resistencia a tensiones mecanicas. Tambien se encuentran fibras de elastina, predominantemente en la zona superficial.
La reparacion de dano al cartllago articular es uno de los asuntos mas desafiantes de la medicina musculoesqueletica debido a la escasa capacidad intrlnseca del cartllago para la reparacion.1 La reparacion de cartllago natural es limitada porque el metabolismo y la densidad de condrocitos son bajos y el cartllago no tiene riego sangulneo.2
Los tratamientos habituales para la reparacion de cartllago incluyen trasplante autologo de condrocitos (TAC), microfractura, mosaicoplastia y trasplante de aloinjerto osteocartilaginoso. Se ha usado TAC durante casi tres decadas para tratar defectos cartilaginosos de espesor completo a nivel mundial. Sin embargo, limitaciones inherentes de TAC incluyen la baja eficacia de las celulas debido principalmente a los numeros escasos obtenidos a traves de biopsia y disimilitud estructural entre el tejido reparado y el cartllago nativo. Otros inconvenientes de estos tratamientos incluyen morbilidad de sitio de donante, intervenciones quirurgicas complicadas, riesgos de infeccion y rechazo de injerto.3
Debido a su capacidad limitada de autorreparacion, el cartllago es un candidato ideal para la ingenierla de tejidos. Puesto que el propio colageno es un andamiaje tridimensional natural para celulas in vivo, se ha usado colageno aislado de animales para varios andamiajes para ingenierla de tejidos in vitro, en formas tanto de gel o solidas. Por ejemplo, el gel de colageno tipo I, cuando se usa como andamiaje tridimensional para encapsulacion celular, potencia la estabilidad y diferenciacion de celulas encapsuladas.
Un problema con el colageno es que solo no puede proporcionar la resiliencia a la compresion requerida en el cartllago articular que se proporciona normalmente por el proteoglicano, especialmente agrecano y otras moleculas de tejido conjuntivo con capacidad de union a agua. Ademas, cuando se reticula, el colageno puede ser diflcil de inyectar a temperatura ambiente.
Desafortunadamente, debido a varias caracterlsticas del colageno que son confusas, se ha avanzado poco en la produccion de andamiajes hlbridos que incorporan tanto colageno como moleculas sinteticas con capacidad de union a agua. En particular, debido a su estructura reticular difusa, el colageno es ineficaz en la retencion de moleculas adsorbidas de manera pasiva, que residen principalmente en los espacios altamente hidratados entre las fibras de colageno, que carecen de fuerzas de atraccion. Otros problemas, tales como una escasa resistencia mecanica y la falta de adhesion especlfica de tejido y moleculas de senalizacion, tambien limitan el uso de colageno purificado como andamiaje para ingenierla de tejidos. Ademas la composition qulmica heterogenea del colageno y su arquitectura molecular compleja presentan retos importantes cuando se realizan reacciones qulmicas con colageno para modular sus propiedades bioqulmicas.
Por otra parte, los andamiajes sinteticos, tales como hidrogeles, ofrecen un mejor control de la composicion qulmica y la arquitectura de la matriz. Sin embargo, se aplican varias limitaciones al uso de hidrogeles que consisten en moleculas sinteticas. En primer lugar, sin colageno u otros componentes de la MEC, las caracterlsticas necesarias de conformacion y resistencia mecanica del cartllago articular que surgen del colageno no pueden derivarse de un hidrogel sintetico. En segundo lugar, se forman hidrogeles a partir de pollmeros que deben reticularse inicialmente antes de que pueda formarse el hidrogel. La reticulation es una etapa de fabrication adicional que aumenta la posibilidad de contamination del hidrogel, particularmente con componentes toxicos, o disminuye de otro modo la posibilidad de biocompatibilidad con el tejido. En tercer lugar, los hidrogeles sinteticos tienen bajas actividades biologicas y, por tanto, son limitados en la medida en que pueden proporcionar a un sustrato interaction con elementos biologicos.
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Hasta la fecha, ha sido dificil proporcionar un andamiaje en el que se asocien colageno y pollmero sintetico entre si, de modo que se proporcione un hidrogel que tenga la resistencia mecanica, conformation y resiliencia a la compresion del cartllago articular. Aplicar simplemente una composition de colageno y pollmero sintetico no funciona porque el colageno y el pollmero tienden a disociarse in vivo de modo que no se forma un hidrogel util para la reparation del cartllago articular.
Lee et al.A describen un material compuesto en el que un pollmero reticulado con UV se une qulmicamente a protelna modificada de colageno (PMC). El material compuesto forma un sustrato sobre el que pueden crecer celulas y depositarse colageno. El colageno se une entonces a la PMC a traves de interacciones no covalentes, formando de ese modo un material compuesto de hidrogel biosintetico in vivo. El problema con este enfoque es que se basa en celulas existentes en tejido cartilaginoso para proporcionar colageno. Eso requiere o bien que se infiltren celulas endogenas a traves del cartllago articular, lo que es poco probable dado que el cartllago es esencialmente acelular, o bien el trasplante de condrocitos o celulas relacionadas. Ademas, el enfoque requiere una reticulation previa de pollmeros para formar el hidrogel.
El documento WO 01/70288 A2 se refiere a una formulation de pollmero sensible a la temperatura para la administration de protelnas osteoinductoras. El documento WO 2008/045904 A2 se refiere a copollmeros biocompatibles y a composiciones que comprenden los copollmeros. El documento WO 2010/127254 A2 se refiere a copollmeros biocompatibles y a composiciones que comprenden los copollmeros. Schmaljohann et al. (2003) Biomacromolecules, vol. 4, n.° 6, pags. 1733-1739, se refiere a pellculas de PNiPAAm-g-PEG termosensibles para el desprendimiento celular controlado.
Existe la necesidad de hidrogeles mejorados que modelen eficazmente las caracterlsticas de conformacion, resistencia mecanica y resiliencia del cartllago articular.
Existe la necesidad de materiales compuestos que contienen MEC que modelen eficazmente las caracterlsticas de capacidad de union a agua y resiliencia del cartllago articular proporcionadas en otros casos por el componente de proteoglicano del cartllago articular.
Existe la necesidad de hidrogeles sinteticos que modelen eficazmente las caracterlsticas de conformacion y resistencia mecanica del cartllago articular proporcionadas en otros casos por el colageno y componente de MEC del cartllago articular.
Existe la necesidad de hidrogeles sinteticos que puedan formarse sin el uso de reticulacion qulmica, o reticulacion mediante irradiacion UV o similar.
Existe la necesidad de hidrogeles que se unan a factores de crecimiento, farmacos y similares, y que sean un sustrato util para el crecimiento de celulas sobre el mismo.
Existe la necesidad de composiciones para la reparacion del cartllago articular que sean inyectables a temperatura ambiente y que formen un hidrogel a la temperatura corporal.
Sumario de la invencion
La invention trata de abordar, o al menos proporcionar una mejora de, una o mas de las limitaciones, necesidades o problemas mencionados anteriormente y en una realization proporciona un pollmero para la formation de un hidrogel. El pollmero incluye:
- un primer monomero con capacidad de union a agua en el que el primer monomero es un polieter seleccionado de polietilenglicol (PEG), oligo(etilenglicol) (OEG), poli(oxido de etileno) (PEO), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno) (PPO), copollmeros de bloque o al azar de co-poli(oxido de etileno) y poli(alcohol vinllico) (PVA);
- un segundo monomero para conferir propiedades mecanicas a un hidrogel en el que el segundo monomero es un metacrilato o un poliester seleccionado de metacrilato de hidroxietilo (HEMA), poli(acido lactico), poli(caprolactona), poli(glicolida), poli(glicolida-co-lactida), poli(glicolida-co-caprolactona) y copollmeros al azar de los mismos; y
- un tercer monomero para la union a una protelna de la matriz extracelular en el que el tercer monomero tiene grupos funcionales electrofilos para la union a una protelna de la matriz extracelular seleccionados de N- hidroxisuccinimidas (NHS), N-hidroxisulfosuccinimida (SNHS), succinimida N-hidroxietoxilada (ENHS) y N- acriloxisuccinimida (NAS).
En determinadas realizaciones, el pollmero incluye ademas:
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- un cuarto monomero para conferir caracterlsticas de transition de fase a un hidrogel que permitan la inyeccion a temperatura ambiente, y la formation de gel a la temperatura corporal.
En otras realizaciones se proporciona una composition para la formacion de un hidrogel. La composition incluye:
- una protelna de la matriz extracelular; y
- un pollmero segun la invention.
La union de la protelna de la matriz extracelular al tercer monomero reticula el pollmero en la composicion, permitiendo de ese modo la formacion de un hidrogel cuando la composicion se pone en contacto con agua.
Este segundo monomero permite que el pollmero en la composicion contribuya a propiedades mecanicas adicionales (tal como resistencia mecanica y resiliencia) para el hidrogel.
En realizaciones adicionales, el pollmero en la composicion incluye ademas:
- un cuarto monomero para conferir caracterlsticas de transicion de fase a un hidrogel que permitan la inyeccion a temperatura ambiente, y la formacion de gel a la temperatura corporal.
Aun en realizaciones adicionales, se proporciona un hidrogel que incluye:
- agua;
- una protelna de la matriz extracelular; y
- un pollmero segun la invencion.
La union de la protelna de la matriz extracelular al tercer monomero reticula el pollmero en el hidrogel, formando de ese modo el hidrogel.
Tal como se menciono anteriormente, el segundo monomero permite que el pollmero contribuya a propiedades mecanicas adicionales (tal como resistencia mecanica y resiliencia) para el hidrogel.
En realizaciones adicionales, el pollmero en el hidrogel incluye ademas:
- un cuarto monomero para conferir caracterlsticas de transicion de fase a un hidrogel que permitan la inyeccion a temperatura ambiente, y la formacion de gel a la temperatura corporal.
Tambien se describen en el presente documento metodos y usos proporcionados del pollmero y la composicion descritos anteriormente para la formacion de un hidrogel, y usos del hidrogel para la reparation o restauracion del cartllago articular.
Breve description de los dibujos
Figura 1. Diferentes metodos para la conjugation de protelna y PNPHO para la formacion de hidrogeles de protelna- PNPHO.
Figura 2. Espectro de 1H-RMN de PNPHO.
Figura 3. Solubilidad de copollmeros sintetizados a diferente fraction molar de HEMA-PLA en disolucion acuosa a 4°C para un Indice de lactato de 3 (a) y 6 (b). (*, ** y *** representan p<0,05, < 0,01, y <0,001, respectivamente).
Figura 4. Bioconjugacion de elastina y copollmero de PNPHO en PBS (a), formacion de hidrogel de biopollmero a 37°C (b), espectros de FTIR de hidrogel de biopollmero y copollmero de PNPHO (c) y prueba de estabilidad de hidrogeles de elastina-PNPHO y PNPHO en un entorno fisiologico (d).
Figura 5. Espectros de ATR-FTIR de pollmero (color rojo) e hidrogel (color negro).
Figura 6. Imagen macroscopica del hidrogel (pollmero y colageno) formado a 37°C.
Figura 7. Efecto de la temperatura sobre el modulo de elasticidad de diferente composicion de copollmero (a)
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modulo de elasticidad de diferente composition de copollmero a lo largo del tiempo a 37°C (e). Temperatura de gelificacion ((b) y (c)) y tiempo de gelificacion ((e) y (f)) de diferentes composiciones de copollmero sintetizadas con Indices de lactato de 3 ((b) y (e)) y 6 en HEMA-PLA ((c) y (f)).
Figura 8. Eficiencia de conjugation de elastina a diferentes copollmeros. Se midio la concentration de elastina despues de una incubation durante 24 h en PBS a 37°C. HEMA-PLA con Indice de lactato de 3 (a) y 6 (b).
Figura 9. Temperatura de gelificacion de precursores de biopollmero formados con copollmero antes y despues de degradation (a) y perdida de peso de diferentes hidrogeles de biopollmero a lo largo del tiempo en PBS a 37°C (b).
Figura 10. Retention de la estructura de hidrogeles de protelna-PNPHO con diferentes grados de conjugacion (a) y el efecto del nivel de conjugacion sobre varianzas volumetricas de los hidrogeles (b).
Figura 11. Imagen de microscopla optica de fibroblastos que crecen sobre matraz de ingenierla de tejidos despues de 24 horas (a) y 48 horas (b) en las proximidades de hidrogeles de elastina-PNPHO8(6)5.
Figura 12. Tincion de nucleolos de Hoechst 33258 de fibroblastos, encapsulados dentro de un hidrogel de elastina- PNPHO despues de 24 horas (a) y 72 horas ((b)-(d)).
Figura 13. Crioseccion que muestra condrocitos ovinos primarios (algunos en division) en lagunas en un hidrogel de elastina (a) y section tenida con hematoxilina adyacente que confirma condrocitos viables (b). La barra de escala es de 100 pm.
Description detallada de las realizaciones
Al reconocer las limitaciones anteriores en el campo de los hidrogeles sinteticos biocompatibles, los inventores han disenado un nuevo pollmero que permite la formation de un hidrogel util para la reparation del cartllago articular. Consideraciones clave en el diseno del pollmero han sido garantizar que (i) todos los componentes del hidrogel pueden suministrarse desde fuentes externas y sin basarse en maquinaria celular o tisular; (ii) los componentes, en particular el pollmero sintetico y la protelna de la matriz extracelular (PMEC) se unen de modo que no pueden disociarse in vivo; (iii) no se requiere reticulation qulmica y UV; (iv) el hidrogel puede inyectarse a temperatura ambiente; (v) el hidrogel es un sustrato compatible para celulas y tejido.
Al disenar el pollmero, los inventores han reconocido que un potencial aun sin aprovechar de pollmeros basados en protelna tales como colageno como agente de reticulacion de pollmeros sinteticos podrla realizarse incorporando un monomero que tiene un grupo funcional para la union a colageno u otras PMEC a un pollmero sintetico, permitiendo de ese modo que la PMEC reticule el pollmero para la formacion de andamiajes de hidrogel que pueden usarse para la ingenierla de tejidos, y en particular en la reparacion y regeneration de cartllago. Los hidrogeles de la presente invention se forman combinando simplemente una PMEc (por ejemplo, colageno) con un pollmero hidrofilo que puede unirse a la PMEC. Por tanto, los hidrogeles de la presente invencion pueden formarse sin el uso de ningun agente adicional (por ejemplo, iniciadores de la reticulacion) o condiciones especiales (por ejemplo, irradiation de los pollmeros con radiation Uv y/o IR) para efectuar la reticulacion de los pollmeros, mientras que se proporciona todavla un andamiaje que puede usarse para encapsular celulas y otros componentes de la MEC para ayudar en la reparacion y regeneracion de cartllago, tras la administration del hidrogel al sitio deseado. El hidrogel de la presente invencion tambien tiene la ventaja anadida de poder administrarse facilmente (por ejemplo, mediante inyeccion) directamente al sitio deseado, debido sus propiedades de transition de fase.
Las propiedades ventajosas de los hidrogeles de la presente invencion pueden atribuirse a la combination de las PMEC y los componentes particulares de los pollmeros de la presente invencion. En particular, los pollmeros de la presente invencion presentan la capacidad de union a agua y capacidad de reticulacion (que tambien puede denominarse capacidad de conjugacion) requeridas, de tal manera que pueden unirse a las PMEC y formar hidrogeles que contienen las PMEC, ademas de tener, en algunas realizaciones, componentes particulares que contribuyen a las propiedades de resistencia mecanica, conformation, resiliencia y transferencia de fase del hidrogel, una vez formado. Las PMEC, ademas de proporcionar un entorno que imita, en cierta medida, el entorno natural del tejido que va a sustituirse y/o repararse, tambien proporcionan la resistencia mecanica y conformacion requeridas a los hidrogeles de la presente invencion. Esto es particularmente importante en aplicaciones tales como la reparacion y sustitucion de cartllago, en las que es necesario que los hidrogeles resistan las tensiones impuestas normalmente sobre regiones de soporte de cartllago, tales como las articulaciones.
Los presentes inventores han desarrollado pollmeros que tienen las caracterlsticas deseadas para su uso en hidrogeles destinados para la reparacion de tejido, y en particular aquellos hidrogeles destinados para la reparacion y/o sustitucion de cartllago, combinando componentes que o bien presentan de manera inherente algunas de estas caracterlsticas, o bien que pueden proporcionar tales caracterlsticas al hidrogel una vez que se forma. Por consiguiente, los pollmeros de la presente invencion incluyen, dentro de su estructura, unidades particulares (por
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ejemplo, monomeros, macromonomeros, y similares) que se han elegido basandose en su capacidad para conferir las propiedades deseadas de capacidad de union a agua, reticulacion, resistencia mecanica, resiliencia y transferencia de fase a los pollmeros de la presente invencion, y posteriormente a los hidrogeles formados a partir de tales pollmeros. Ademas, pueden ajustarse las propiedades de estos pollmeros (y, por tanto, los hidrogeles formados a partir de estos pollmeros), en el sentido de que diferentes monomeros, as! como diferentes proporciones de estos monomeros, pueden incorporarse selectivamente en los pollmeros
Estas propiedades ventajosas de los hidrogeles de la presente invencion se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, y en particular, se presentan en los ejemplos, que muestran que los hidrogeles de la presente invencion pueden prepararse de manera simple usando una simple combinacion de los pollmeros de la presente invencion con las PMEC, y que los hidrogeles as! formados presentan las propiedades requeridas de resistencia mecanica, resiliencia y conformacion, lo que permite que se usen en aplicaciones de ingenierla de tejidos.
A. Pollmeros
El termino “pollmero”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula grande (macromolecula) que se compone de unidades estructurales de repeticion (monomeros). Estas subunidades se conectan normalmente mediante enlaces qulmicos covalentes. Los pollmeros pueden ser pollmeros lineales o ramificados. Los pollmeros de la presente invencion son copollmeros que comprenden tres o mas monomeros diferentes.
El pollmero de la presente invencion incluye un primer monomero con capacidad de union a agua, un segundo monomero que puede conferir propiedades mecanicas a un hidrogel, y un tercer monomero que tiene un grupo funcional para la union a una PMEC.
El termino “monomero”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad estructural que puede combinarse para formar un pollmero, pero que puede ser a su vez un pollmero, o un derivado de un monomero o pollmero. Los monomeros de este tipo tambien se denominan en el presente documento “macromonomeros”.
A1. Monomeros con capacidad de union a agua
Tal como se comento anteriormente, las propiedades ventajosas de los hidrogeles de la presente invencion pueden atribuirse a la combinacion de las PMEC y los componentes particulares de los pollmeros de la presente invencion. Una propiedad ventajosa particular de los pollmeros de la presente invencion es su capacidad de union a agua. La presencia de agua en los hidrogeles de la presente invencion proporciona tanto un entorno que se asemeja al entorno natural del tejido danado (lo que ayuda en la regeneracion del tejido), como la resistencia a la compresion requerida al hidrogel.
Por consiguiente, los pollmeros de la presente invencion deben incluir monomeros o unidades que puedan unirse a agua hasta una capacidad tal que pueda formarse un hidrogel cuando el pollmero se pone en contacto con una PMEC y agua. Ademas, el hidrogel as! formado debe tener la resistencia a la compresion y resiliencia requeridas. Esto es importante para aplicaciones tales como la reparacion y restauracion de cartllago, porque, tal como se comento anteriormente, el cartllago esta sometido habitualmente a tensiones mecanicas significativas.
Un experto en la tecnica entendera que es necesario que esten presentes monomeros con capacidad de union a agua en los pollmeros de la presente invencion en proporciones que sean suficientes para producir un pollmero que cumpla estos requisitos. Generalmente, la proporcion de monomeros con capacidad de union a agua en el pollmero es una razon molar de aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5 de monomeros con capacidad de union a agua:resistencia mecanica. De hecho, es necesario que los monomeros con capacidad de union a agua hagan no solo que el pollmero sea hidrofilo, sino que confieran capacidades de union a agua mucho mas significativas al pollmero. Por consiguiente, los pollmeros segun la presente invencion tendran capacidades de union a agua de entre aproximadamente el 70% y aproximadamente el 500%, entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 400%, entre aproximadamente el 90% y el 300% o entre aproximadamente el 100% y el 200%. Por ejemplo, la capacidad de union a agua de los pollmeros de la
presente invencion es de aproximadamente el 100%,
aproximadamente el 70%, aproximadamente el 110%, aproximadamente el 140%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 180%, aproximadamente el 190%, aproximadamente el 220%, aproximadamente el 230%, aproximadamente el 260%, aproximadamente el 270%,
aproximadamente el 80% aproximadamente el
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el 90%, 130%, 170%,
aproximadamente el 200%, aproximadamente el 210%, aproximadamente el 240%, aproximadamente el 250%, aproximadamente el 280%, aproximadamente el 290%,
aproximadamente aproximadamente el aproximadamente el
aproximadamente el 300%, aproximadamente el 310%, aproximadamente el 320%, aproximadamente el 340%, aproximadamente el 350%, aproximadamente el 360%,
aproximadamente el 330%, aproximadamente el 370%,
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aproximadamente el 460%, aproximadamente el 470%, aproximadamente el 480%, aproximadamente el 490% o el aproximadamente el 500%. Los ejemplos de monomeros con capacidad de union a agua incluyen aquellos que pueden sintetizarse para dar pollmeros tales como polieteres (por ejemplo, poli(oxidos de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG), oligo(etilenglicol) (OEG), poli(oxido de etileno) (PEO), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno) (PPO), copollmeros de bloque o al azar de co-poli(oxido de etileno), poli(alcohol vinllico) (PVA)), poli(vinil- pirrolidinona) (PVP), poli(aminoacidos) y dextrano. Los polieteres, y mas particularmente oligo(oxialquilenos) (por ejemplo, OEG), se prefieren especialmente, porque tienen la capacidad de union a agua requerida, son sencillos de sintetizar y/o adquirir, y son inertes, en el sentido de que producen una respuesta inmunitaria minima o ausente a partir de los tejidos en los que se situan. Ademas, cualquiera de una variedad de funcionalidades hidrofilas pueden usarse para hacer que un monomero (y, por tanto, un pollmero formado a partir de un monomero de este tipo) sea soluble en agua. Por ejemplo, pueden incorporarse grupos funcionales como fosfato, sulfato, amina cuaternaria, hidroxilo, amina, sulfonato y carboxilato, que son solubles en agua, en un monomero para hacer que sea soluble en agua.
Un pollmero segun la invencion incluye un monomero con capacidad de union a agua en el que el monomero es un polieter seleccionado de polietilenglicol (PEG), oligo(etilenglicol) (OEG), poli(oxido de etileno) (PEO), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno) (PPO), copollmeros de bloque o al azar de co-poli(oxido de etileno) y poli(alcohol vinllico) (PVA).
A2. Conferir propiedades mecanicas
Tal como se comento anteriormente, las propiedades ventajosas de los hidrogeles de la presente invencion pueden atribuirse, en parte, a los componentes particulares que componen los polimeros de la presente invencion. Los polimeros de la presente invencion pueden contribuir a propiedades mecanicas adicionales a los hidrogeles de la presente invencion, lo que produce hidrogeles que, debido a su resistencia mecanica y resiliencia, pueden usarse en la reparacion y restauracion de tejidos (por ejemplo, cartilago) que residen en entornos de altas tensiones, tales como articulaciones.
Por consiguiente, los polimeros de la presente invencion pueden incluir monomeros o unidades que pueden proporcionar la resistencia mecanica y resiliencia requeridas en el cartilago articular. Esto es importante para aplicaciones tales como la reparacion y restauracion de cartilago, porque, tal como se comento anteriormente, el cartilago esta sometido habitualmente a tensiones mecanicas significativas.
Un experto en la tecnica entendera que es necesario que esten presentes monomeros que puedan conferir propiedades mecanicas a un hidrogel en los polimeros de la presente invencion en proporciones que sean suficientes para producir un hidrogel que tiene las propiedades mecanicas deseadas. Generalmente, la proporcion de monomeros “mecanicos” en el pollmero es una razon molar de aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5 de monomeros con capacidad de union a agua:resistencia mecanica.
Los ejemplos adecuados de monomeros que pueden conferir propiedades mecanicas (por ejemplo, resistencia a la compresion) a un hidrogel incluyen acrilatos tales como metacrilato de hidroxietilo (HEMA), poliesteres tales como poli(acido lactico), poli(caprolactona), poli(glicolida) y sus copollmeros al azar (por ejemplo, poli(glicolida-co-lactida) y poli(glicolida-co-caprolactona)).
A3. Union a PMEC
Tal como se comento anteriormente, los hidrogeles de la presente invencion se forman combinando un pollmero de la presente invencion con una PMEC, en presencia de agua. Con el fin de combinar eficazmente los polimeros de la presente invencion con una PMEC, los inventores han incluido, en los polimeros de la presente invencion, monomeros o unidades que tienen capacidad de reticulacion.
Esta capacidad de reticulacion significa que los polimeros pueden unirse a las PMEC (tal como se comenta adicionalmente a continuacion) y, al hacerlo, reticulan las PMEc para formar hidrogeles que contienen las PMEC. Alternativamente, mediante un mecanismo similar, las PMEC actuan como agente de reticulacion, reticulando de ese modo el pollmero para formar un hidrogel.
Concibiendo un diseno de pollmero unico mediante el cual se proporciona un monomero que tiene un grupo funcional para la union con colageno, elastina o similar en el pollmero, los inventores han reconocido que no es necesario que se reticulen adicionalmente los polimeros con, por ejemplo, reticulacion qulmica o UV, para formar un hidrogel.
Ademas, mediante la union covalente de la PMEC al pollmero, la PMEC se retiene de manera mas eficaz en la red
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del hidrogel, lo que significa que, una vez que se administra el hidrogel al sitio de reparacion, la PMEC no puede migrar facilmente lejos del sitio. Esto significa que se mantiene la integridad estructural del gel en el sitio de reparacion (debido a las propiedades mecanicas de las PMEC, tal como se menciono anteriormente) y ayuda a proporcionar un entorno en el sitio de reparacion que imita estrechamente el entorno natural del tejido.
Con el fin de producir un pollmero que pueda unirse a una PMEC, un experto en la tecnica entendera que es necesario que esten presentes monomeros que puedan unirse a una PMEC en los pollmeros de la presente invention en proporciones que sean suficientes para reticularse con una PMEC, de tal manera que pueda formarse un hidrogel en presencia de agua. Generalmente, la proportion de monomeros de “reticulation” en el pollmero es una razon molar de al menos aproximadamente 1:1 de monomero de reticulacion: monomero con capacidad de union a agua. Esta razon puede aumentarse hasta, por ejemplo, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1 y aproximadamente 10:1.
Los monomeros que pueden unirse a las PMEC tienen generalmente grupos funcionales o bien electrofilos o bien nucleofilos, de tal manera que un grupo funcional nucleofilo en, por ejemplo, una PMEC puede reaccionar con un grupo funcional electrofilo en el monomero, para formar un enlace covalente. Preferiblemente, el pollmero comprende mas de dos monomeros con capacidad de union a PMEC, de modo que, como resultado de reacciones de tipo electrofilo-nucleofilo, el pollmero se combina con la PMEC para formar productos polimericos reticulados. Tales reacciones se denominan “reacciones de reticulacion”.
Por tanto, por ejemplo, si una PMEC tiene grupos funcionales nucleofilos tales como aminas, el pollmero puede tener grupos funcionales electrofilos tales como N-hidroxisuccinimidas (NHS). Otros grupos funcionales electrofilos que son adecuados para su uso en la presente invencion son N-hidroxisulfosuccinimida (SNHS) y succinimida N- hidroxietoxilada (ENHs). Un ejemplo de un monomero de este tipo es N-acriloxisuccinimida (NAS). Por otra parte, si una PMEC tiene grupos funcionales electrofilos, entonces el pollmero puede tener grupos funcionales nucleofilos tales como aminas o tioles.
Un pollmero segun la invencion incluye un monomero para la union a una protelna de la matriz extracelular, en el que el monomero tiene grupos funcionales electrofilos para la union a una protelna de la matriz extracelular seleccionados de N-hidroxisuccinimidas (NHS), N-hidroxisulfosuccinimida (SNHS), succinimida N-hidroxietoxilada (ENHS) y N-acriloxisuccinimida (NAS).
A4. Monomeros con transition de fase
En otra realization de la presente invencion, el pollmero puede incluir ademas un cuarto monomero que puede conferir caracterlsticas de transicion de fase al hidrogel, permitiendo de ese modo que el material compuesto este en forma inyectable a temperatura ambiente, y en una forma de hidrogel a la temperatura corporal. Ademas, estas caracterlsticas de transicion de fase permiten que los pollmeros de la presente invencion formen hidrogeles, pudiendo variarse diversas propiedades (tal como viscosidad) de los cuales alterando factores tales como pH y temperatura. Se disenan hidrogeles inyectables termosensibles de tal manera que la temperatura crltica de disolucion inferior (LCST) esta por debajo de la temperatura corporal. Por tanto, puede lograrse la gelificacion simplemente aumentando la temperatura del hidrogel, por ejemplo, dejando que se caliente hasta la temperatura corporal (lo que se produce cuando se administra el hidrogel al organismo). Diversos pollmeros termosensibles e inyectables incluyendo copollmeros de poli(oxido de etileno)/poli(oxido de propileno) y poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) son adecuados para su uso en la presente invencion. PNIPAAm es particularmente adecuado, ya que tiene una LCST de 32°C, permitiendo que este en forma de gel a la temperatura corporal.
Con el fin de producir un pollmero que sea termosensible, un experto en la tecnica entendera que es necesario que esten presentes monomeros con transicion de fase en los pollmeros de la presente invencion en proporciones que sean suficientes como para permitir que se varle la viscosidad de un hidrogel que incluye el pollmero mediante la exposition del hidrogel a diferentes condiciones de temperatura y pH. Generalmente, la proporcion de monomeros con “transicion de fase” en el pollmero es una razon molar de al menos aproximadamente 9:1 de monomero con transicion de fase:monomero con capacidad de union a agua. Esta razon puede aumentar hasta, por ejemplo, aproximadamente 10:1, aproximadamente 11:1, aproximadamente 12:1, aproximadamente 13:1, aproximadamente 14:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 16:1, aproximadamente 17:1, aproximadamente 18:1,
aproximadamente 19:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 21:1, aproximadamente 22:1, aproximadamente 23:1, aproximadamente 24:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 26:1, aproximadamente 27:1,
aproximadamente 28:1, aproximadamente 29:1 y una razon molar de aproximadamente 30:1 de monomero con transicion de fase:monomero con capacidad de union a agua.
Los presentes inventores han encontrado que la viscosidad de los hidrogeles de la presente invencion, a menores temperaturas (por ejemplo, 4°C), es tal que el hidrogel puede inyectarse. El hidrogel se vuelve entonces mas viscoso a medida que aumenta la temperatura, formandose un gel que tiene la viscosidad deseada a una temperatura de aproximadamente 37°C. Esto significa que el hidrogel de la presente invencion, a temperaturas mas frlas, puede
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administrarse facilmente al sitio de reparacion, por ejemplo, mediante inyeccion. El hidrogel se transforma entonces, calentandose en el organismo hasta la temperatura corporal natural, en un gel mas viscoso, que tiene las propiedades deseadas de resistencia mecanica y elasticidad.
A5. Otras propiedades de pollmeros y slntesis de pollmeros
Un experto en la tecnica entendera que, combinando diferentes tipos de monomeros, pueden producirse pollmeros que tienen una gama de diferentes propiedades. Ademas, incorporando monomeros o grupos funcionales particulares en un pollmero preexistente, pueden modificarse las propiedades del pollmero. Por ejemplo, puede usarse la copolimerizacion de monomeros de HEMA con otros monomeros (tales como metacrilato de metilo) para modificar propiedades tales como el hinchamiento y propiedades mecanicas. Los monomeros tambien pueden hacerse reaccionar con otros compuestos para formar “macromonomeros” (mencionados anteriormente) que se incluyen entonces en los pollmeros de la presente invencion. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar HEMA con lactida para formar un pollmero de HEMA-poli-(acido lactico) (HEMA-PLA), que puede usarse a su vez como monomero en los pollmeros de la presente invencion. Ademas, los propios monomeros pueden ser combinaciones de unidades monomericas, que se incorporan entonces en el pollmero. Un ejemplo de este tipo de monomero es metacrilato de monometil eter de oligo(etilenglicol) (OEGMA), que es un monomero hidrofilo que se compone de dos monomeros hidrofilos: etilenglicol y metacrilato.
Los pollmeros de la presente invencion pueden modificarse adicionalmente con uno o mas restos y/o grupos funcionales. Cualquier resto o grupo funcional puede usarse segun la presente invencion. En algunas realizaciones, pueden modificarse pollmeros con polietilenglicol (PEG), con un hidrato de carbono, y/o con poliacetales aclclicos derivados de polisacaridos. Ademas, tal como se comento anteriormente, pueden incorporarse grupos hidrofilos en monomeros (y, por tanto, pollmeros) para aumentar la capacidad de union a agua de un pollmero.
En cuanto a la secuencia, los copollmeros pueden ser copollmeros de bloque, copollmeros de injerto, copollmeros al azar, combinaciones, mezclas y/o aductos de cualquiera de los anteriores pollmeros y otros. Normalmente, los pollmeros segun la presente invencion son pollmeros organicos. Preferiblemente, los pollmeros de la presente invencion son biocompatibles. En algunas realizaciones, los pollmeros son biodegradables. En otras realizaciones, los pollmeros son tanto biocompatibles como biodegradables.
Los pollmeros de la presente invencion tambien pueden incluir otros monomeros en su estructura. Por ejemplo, los monomeros pueden ser pollmeros tales como poli(alcohol vinllico) (PVA), poliesteres, pollmeros acrllicos y pollmeros ionicos, o monomeros de estos.
Si se desea que el pollmero sea biodegradable o absorbible, pueden usarse uno o mas monomeros que tienen uniones biodegradables. Como alternativa, o ademas, los monomeros pueden elegirse de tal manera que el producto de la reaccion entre ellos de como resultado una union biodegradable. Para cada enfoque, pueden elegirse monomeros y/o iones de tal manera que el pollmero biodegradable resultante se degrade o absorba en un periodo de tiempo deseado. Preferiblemente, los monomeros y/o uniones se seleccionan de tal manera que, cuando el pollmero se degrada en condiciones fisiologicas, los productos resultantes no son toxicos.
La union biodegradable puede ser hidrolizable o absorbible qulmica o enzimaticamente. Las uniones biodegradables hidrolizables qulmicamente ilustrativas incluyen pollmeros, copollmeros y oligomeros de glicolida, lactida, caprolactona, dioxanona y carbonato de trimetileno. Las uniones biodegradables hidrolizables enzimaticamente ilustrativas incluyen uniones peptldicas escindibles por metaloproteinasas y colagenasas. Uniones biodegradables ilustrativas adicionales incluyen pollmeros y copollmeros de poli(hidroxiacidos), poli(ortocarbonatos), poli(anhldridos), poli(lactonas), poli(aminoacidos), poli(carbonatos) y poli(fosfonatos).
En una realizacion, el pollmero de la presente invencion es un pollmero de formula (I):
imagen1
en la que A es un monomero con capacidad de union a agua, B es un monomero que puede conferir propiedades mecanicas a un hidrogel, C es un monomero que tiene un grupo funcional para la union a una PMEC, m es un numero entero desde 1 hasta 10, n es un numero entero desde 1 hasta 10, y p es un numero entero desde 1 hasta 10.
Por consiguiente, el pollmero de la presente invencion puede ser un pollmero de formula (la):
imagen2
en la que A es el monomero con capacidad de union a agua OEGMA, B es el monomero que confiere resistencia mecanica HEMA-PLA, C es el agente de reticulacion NAS, m, n y p son tal como se definieron anteriormente, x es 5 un numero entero desde 1 hasta 1000, e y es un numero entero desde 1 hasta 1000.
Cuando el pollmero de la presente invencion incluye un cuarto monomero que puede conferir caracterlsticas de transicion de fase al hidrogel, el pollmero puede ser un pollmero de formula (II):
imagen3
en la que A, B, C, m, n, y p son tal como se definieron anteriormente, D es un monomero que puede conferir 10 caracterlsticas de transicion de fase al hidrogel, y q es un numero entero desde 1 hasta 10. Un ejemplo de un pollmero de este tipo es un pollmero de formula (lla):
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en la que A es el monomero con capacidad de union a agua OEGMA, B es el monomero que confiere resistencia mecanica HEMA-PLA, C es el agente de reticulacion NAS, D es el monomero con transition de fase NIPAAm, y m, n, p, q, x e y son tal como se definieron anteriormente.
Los presentes inventores tambien han encontrado que algunos monomeros, tales como HEMA-PLA, poliesteres tales como poli(acido lactico), poli(caprolactona), poli(glicolida) y sus copollmeros al azar (por ejemplo, poli(glicolida- co-lactida) y poli(glicolida- co-caprolactona) y otros pollmeros biodegradables y biocompatibles, pueden elevar la LCST del pollmero durante la degradation de segmentos biodegradables (por ejemplo, pLa) in vivo, lo que conduce a la biorresorcion del pollmero. Esto proporciona la ventaja adicional de que los pollmeros de la presente invention pueden disenarse de modo que sean biodegradables in vivo.
Un experto en la tecnica conocera que los monomeros A, B, C y D pueden estar presentes en el pollmero en cualquier orden, siempre que se logren las capacidades requeridas de union a agua, conferir resistencia mecanica y/o reticulacion.
El tamano global del pollmero de la presente invencion puede diferir, dependiendo de factores tales como los tipos de monomeros que se incorporan en el pollmero, el tipo de PMEC que se pretende usar para formar el hidrogel, y las condiciones en las que va a acoplarse la protelna al pollmero. Sin embargo, en general, el pollmero de la presente invencion puede ser una molecula de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 kDa, o de aproximadamente 30 kDa.
Tal como se usa en el presente documento, una redaction que define los llmites de un intervalo o una longitud tal como, por ejemplo, “desde 1 hasta 5” significa cualquier numero entero desde 1 hasta 5, es decir 1, 2, 3, 4 y 5. Dicho de otro modo, cualquier intervalo definido por dos numeros enteros mencionados expllcitamente pretende comprender y dar a conocer cualquier numero entero que definan dichos llmites y cualquier numero entero comprendido en dicho intervalo.
Un experto en la tecnica conocera metodos adecuados de slntesis de los pollmeros de la presente invencion. Estos incluyen metodos tales como polimerizacion por apertura de anillo, polimerizacion por adicion (incluyendo polimerizacion por radicales libres) y polimerizacion por condensacion.
B. Composiciones para la formacion de hidrogeles
La presente invencion tambien se refiere a una composition para la formation de un hidrogel, incluyendo la composition una protelna de la matriz extracelular y un pollmero segun la invencion.
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La union de la protelna de la matriz extracelular al tercer monomero reticula el pollmero, permitiendo de ese modo la formacion de un hidrogel cuando la composicion se pone en contacto con agua.
El termino “composicion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composicion solida o llquida que contiene los componentes mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, tambien pueden incluirse en las composiciones de la presente invencion otros componentes tales como excipientes farmaceuticamente aceptables y agentes biologicamente activos (por ejemplo, farmacos, vitaminas y minerales), para ayudar a la reparacion y/o regeneracion del tejido diana, y/o para proporcionar un metodo para lograr la administracion dirigida de compuestos biologicamente activos.
En general, la cantidad de pollmero en la composicion de la presente invencion es una cantidad que permite la formacion de hidrogeles segun la presente invencion. En algunas realizaciones, la cantidad de pollmero en la composicion de la presente invencion oscila entre aproximadamente el 1% p/p y aproximadamente el 90% p/p, entre aproximadamente el 2% p/p y aproximadamente el 80% p/p, entre aproximadamente el 4% p/p y aproximadamente el 70% p/p, entre aproximadamente el 5% p/p y aproximadamente el 60% p/p, entre aproximadamente el 5% p/p y aproximadamente el 50% p/p, entre aproximadamente el 6% p/p y aproximadamente el 40% p/p, entre aproximadamente el 7% p/p y aproximadamente el 30% p/p o entre aproximadamente el 8% p/p y aproximadamente el 20% p/p. En algunas realizaciones, la cantidad de pollmero es de aproximadamente el 1% p/p, aproximadamente el 2% p/p, aproximadamente el 3% p/p, aproximadamente el 4% p/p, aproximadamente el 5% p/p, aproximadamente el 6% p/p, aproximadamente el 7% p/p, aproximadamente el 8% p/p, aproximadamente el 9% p/p, aproximadamente el 10% p/p, aproximadamente el 15% p/p, aproximadamente el 20% p/p, aproximadamente el 25% p/p, aproximadamente el 30% p/p, aproximadamente el 35% p/p, aproximadamente el 40% p/p, aproximadamente el 45% p/p, aproximadamente el 50% p/p, aproximadamente el 55% p/p, aproximadamente el 60% p/p, aproximadamente el 65% p/p, aproximadamente el 70% p/p, aproximadamente el 75% p/p, aproximadamente el 80% p/p o mas. En algunas realizaciones, la cantidad de pollmero es de aproximadamente el 85% p/p. Como regla general, la solidez del hidrogel aumenta con mayores concentraciones de pollmero en la composicion.
B1. Excipientes y agentes biologicamente activos
Pueden incluirse excipientes farmaceuticamente aceptables en las composiciones y/o los hidrogeles de la presente invencion, e incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, diluyentes inertes, u otros vehlculos llquidos, adyuvantes de dispersion o suspension, agentes de granulacion, agentes tensioactivos, agentes disgregantes, agentes isotonicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, agentes aglutinantes, lubricantes, agentes tamponantes, aceites, y similares, segun sea adecuado para la forma de dosificacion particular deseada. Remington5 da a conocer diversos excipientes usados en la formulacion de composiciones farmaceuticas y tecnicas conocidas para la preparacion de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tales como produciendo cualquier efecto biologico no deseado o interaccionando de otro modo de manera perjudicial con cualquier otro componente de la composicion farmaceutica, se contempla que su uso este dentro del alcance de esta invencion.
Excipientes tales como agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes pueden estar presentes en la composicion, segun el criterio del formulador.
Los agentes biologicamente activos o compuestos farmacologicos que pueden anadirse a la composicion y/o el hidrogel de la presente invencion incluyen protelnas, glicosaminoglicanos, hidratos de carbono, acidos nucleicos y compuestos biologicamente activos inorganicos y organicos, tales como enzimas, antibioticos, agentes antineoplasicos, anestesicos locales, hormonas, agentes angiogenicos, agentes antiangiogenicos, factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-I), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y factor de crecimiento transformante-b (TGFb)), anticuerpos, neurotransmisores, farmacos psicoactivos, farmacos contra el cancer, farmacos quimioterapicos, farmacos que afectan a los organos reproductores, genes y oligonucleotidos.
Una composicion que contiene componentes tales como excipientes y/o agentes biologicamente activos puede producirse combinando un pollmero de la presente invencion con una PMEC, secando la composicion resultante, y luego combinando esta con uno o mas de otros componentes. La composicion resultante puede estar en forma de un polvo y otra forma particulada, a la que se anade entonces agua para formar un hidrogel, segun la presente invencion. Por tanto, puede producirse un hidrogel que contiene estos componentes simplemente anadiendo el disolvente acuoso deseado a la composicion.
La cantidad de pollmero, PMEC y agente biologicamente activo presentes en la composicion dependera necesariamente del farmaco particular y el estado que va a tratarse. Un experto en la tecnica conocera cantidades y agentes apropiados para su uso para tratar el estado.
B2. PMEC
Tal como se usa en el presente documento, el termino “protelna de la matriz extracelular” (o PMEC) se refiere a protelnas que estan presentes de manera natural en la parte extracelular de tejido animal que proporciona soporte estructural a las celulas animales (ademas de realizar otras diversas funciones importantes). La matriz extracelular (o MEC) es la caracterlstica definitoria del tejido conjuntivo en animales. Las protelnas que se encuentran 5 habitualmente en la MEC incluyen colageno, elastina, fibrina, fibronectina y laminina (e isoformas de los mismos).
En el contexto de la presente invencion, PMEC es importante porque, tal como se comento anteriormente, reticula pollmeros, lo que permite que los pollmeros formen un hidrogel. Los hidrogeles de la presente invencion pueden formarse, por ejemplo, exponiendo colageno o elastina a un pollmero de formula (I). PMEC es tambien importante porque proporciona propiedades mecanicas adicionales (tal como resistencia mecanica y resiliencia) al hidrogel, as! 10 como proporciona, en el sitio de reparacion, un entorno que imita al entorno natural, ayudando de ese modo en la reparacion y regeneracion de tejido.
En una realizacion, la PMEC puede estar en forma de un monomero. Un ejemplo es tropoelastina. En otra realizacion, la PMEC puede estar en forma de monomeros reticulados. Un ejemplo es elastina. Aun en realizaciones adicionales, la PMEC puede ser una combinacion de una gama de diferentes isoformas, por ejemplo, colageno tipo 15 1, 2, 3, 4, o una gama de diferentes protelnas, por ejemplo, colageno y elastina, etc.
Es importante que la PMEC contenga cadenas laterales u otros grupos funcionales que quedan expuestos para permitir la reaccion con el grupo funcional del/de los monomero(s) con capacidad de union a PMEC, uniendose de ese modo la PMEC al pollmero a traves del/de los monomero(s) de con capacidad de union a PMEC. Los ejemplos de cadenas laterales adecuadas incluyen cadenas laterales de acido glutamico o lisilo.
20 La presente invencion tambien incluye variantes de las PMEC, por ejemplo variantes de especie o variantes polimorficas. La presente invencion pretende cubrir todas las variantes funcionalmente activas de las PMEC que presenten la misma actividad. Esto tambien incluye apo- y holo-formas de las PMEC, formas modificadas de manera postraduccional, as! como derivados glicosilados o desglicosilados. Tales fragmentos y variantes funcionalmente activos incluyen, por ejemplo, los que tienen sustituciones de aminoacidos conservativas.
25 En general, la cantidad de PMEC en la composition de la presente invencion es una cantidad que permite la formation de hidrogeles segun la presente invencion. En algunas realizaciones, la cantidad de PMEC en la composicion de la presente invencion oscila entre aproximadamente el 1% p/p y aproximadamente el 60% p/p, entre aproximadamente el 1% p/p y aproximadamente el 50% p/p, entre aproximadamente el 1% p/p y aproximadamente el 40% p/p, entre aproximadamente el 5% p/p y aproximadamente el 30% p/p, entre aproximadamente el 5% p/p y 30 aproximadamente el 20% p/p, o entre aproximadamente el 5% p/p y aproximadamente el 10% p/p. En algunas realizaciones, el porcentaje de PMEC es de aproximadamente el 1% p/p, aproximadamente el 2% p/p, aproximadamente el 3% p/p, aproximadamente el 4% p/p, aproximadamente el 5% p/p, aproximadamente el 6% p/p, aproximadamente el 7% p/p, aproximadamente el 8% p/p, aproximadamente el 9% p/p, aproximadamente el 10% p/p, aproximadamente el 20% p/p, aproximadamente el 30% p/p, aproximadamente el 40% p/p, aproximadamente el 35 50% p/p, o mas.
Preferiblemente, las PMEC para su uso en la presente invencion se obtendran de fuentes recombinantes, aunque tambien pueden extraerse de fuentes naturales o sintetizarse.
C. Hidrogeles
La presente invencion tambien se refiere a un hidrogel que incluye agua, una protelna de la matriz extracelular y un 40 pollmero segun la invencion.
La union de la protelna de la matriz extracelular al tercer monomero reticula el pollmero, formando de ese modo un hidrogel, con agua contenida en el mismo.
En una realizacion, el hidrogel incluye un pollmero que tiene un monomero descrito anteriormente para permitir la transition de fase del hidrogel desde el estado llquido a menor temperatura al estado de gel a la temperatura 45 corporal. Un ejemplo de un monomero util para este fin es NIPAAM. Es un hallazgo particularmente sorprendente que pueda hacerse que una molecula por lo demas insoluble, tal como elastina o colageno, presente una transicion del estado llquido al de gel segun el perfil de temperatura mediante el uso de este monomero. Por tanto, la ventaja es que el hidrogel de la presente invencion, a temperaturas mas frlas, puede administrarse facilmente, por ejemplo, mediante inyeccion. El hidrogel se transforma entonces en un gel mas viscoso, que tiene las propiedades deseadas 50 de resistencia mecanica y elasticidad, tras su calentamiento en el organismo hasta la temperatura corporal natural.
Habiendo proporcionado una composicion de pollmero descrita anteriormente, puede formarse el hidrogel anadiendo agua a la composicion de cualquier modo conocido por un experto en la tecnica. En efecto, una ventaja de la presente invencion es que no es necesario que se reticule el pollmero en modo alguno antes del contacto con la
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PMEC, con el fin de que se forme un hidrogel.
C1. Celulas
El hidrogel de la presente invencion tambien puede incluir celulas para ayudar a la reparacion y/o regeneration del tejido diana.
En general, las celulas que van a usarse segun la presente invencion son cualquier tipo de celulas. Las celulas deben ser viables cuando se encapsulan dentro de los hidrogeles de la presente invencion. En algunas realizaciones, las celulas que pueden encapsularse dentro de hidrogeles segun la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas de mamlferos (por ejemplo, celulas humanas, celulas de primate, celulas de mamlferos, celulas de roedores, etc.), celulas de aves, celulas de peces, celulas de insectos, celulas vegetales, celulas fungicas, celulas bacterianas y celulas hlbridas. En algunas realizaciones, las celulas a modo de ejemplo que pueden encapsularse dentro de hidrogeles incluyen celulas madre, celulas totipotentes, celulas pluripotentes y/o celulas madre embrionarias. En algunas realizaciones, las celulas a modo de ejemplo que pueden encapsularse dentro de hidrogeles segun la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas y/o llneas celulares primarias de cualquier tejido. Por ejemplo, pueden encapsularse dentro de hidrogeles segun la presente invencion cardiomiocitos, miocitos, hepatocitos, queratinocitos, melanocitos, neuronas, astrocitos, celulas madre embrionarias, celulas madre adultas, celulas madre hematopoyeticas, celulas hematopoyeticas (por ejemplo, monocitos, neutrofilos, macrofagos, etc.), ameloblastos, fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, neuronas, espermatozoides, ovulos, celulas hepaticas, celulas epiteliales de pulmon, celulas epiteliales de intestino, hlgado, celulas epiteliales de la piel, etc., y/o hlbridos de las mismas.
Las celulas de mamlferos a modo de ejemplo que pueden encapsularse dentro de hidrogeles segun la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de rinon canino de Madin-Darby (MDCK), celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK), celulas NS0, celulas MCF-7, celulas MDA-MB-438, celulas U87, celulas A172, celulas HL60, celulas A549, celulas SP10, celulas DOX, celulas DG44, celulas HEK 293, SHSY5Y, celulas de Jurkat, celulas BCP-1, celulas COS, celulas Vero, celulas GH3, celulas 9L, celulas 3T3, celulas MC3T3, celulas C3H-10T1/2, celulas NIH-3T3 y celulas C6/36.
En algunas realizaciones, se desea que las celulas se distribuyan uniformemente por la totalidad de un hidrogel. La distribucion uniforme puede ayudar a proporcionar hidrogeles similares a tejidos mas uniformes que proporcionan un entorno mas uniforme para las celulas encapsuladas. En algunas realizaciones, las celulas estan ubicadas en la superficie de un hidrogel. En algunas realizaciones, las celulas estan ubicadas en el interior de un hidrogel. En algunas realizaciones, se estratifican las celulas dentro de un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel contiene diferentes tipos de celulas.
En algunas realizaciones, se alteran las condiciones en las que se encapsulan celulas dentro de hidrogeles con el fin de maximizar la viabilidad celular. En algunas realizaciones, por ejemplo, la viabilidad celular aumenta con menores concentraciones de pollmero. En algunas realizaciones, las celulas ubicadas en la periferia de un hidrogel tienden a tener una viabilidad disminuida con relation a celulas que estan totalmente encapsuladas dentro del hidrogel. En algunas realizaciones, puede ser necesario tener que regular y/o alterar las condiciones (por ejemplo, pH, fuerza ionica, disponibilidad de nutrientes, temperatura, disponibilidad de oxlgeno, osmolaridad, etc.) del entorno circundante para maximizar la viabilidad celular.
En algunas realizaciones, puede medirse la viabilidad celular monitorizando uno de muchos indicadores de viabilidad celular. En algunas realizaciones, los indicadores de viabilidad celular incluyen, pero no se limitan a, actividad esterasa intracelular, integridad de la membrana plasmatica, actividad metabolica, expresion genica y expresion de protelnas. Por mencionar solo un ejemplo, cuando se exponen celulas a un sustrato de esterasa fluorogenico (por ejemplo, calcelna AM), las celulas vivas producen fluorescencia de color verde como resultado de actividad esterasa intracelular que hidroliza el sustrato de esterasa para dar un producto fluorescente de color verde. Por mencionar otro ejemplo, cuando se exponen celulas a una tincion de acido nucleico fluorescente acido (por ejemplo, homodlmero-1 de etidio), las celulas muertas producen fluorescencia de color rojo porque sus membranas plasmaticas estan comprometidas y, por tanto, son permeables a la tincion de acido nucleico de alta afinidad.
En general, la cantidad de celulas en una composition es una cantidad que permita la formation de hidrogeles segun la presente invencion. En algunas realizaciones, la cantidad de celulas que es adecuada para la formacion de hidrogeles segun la presente invencion oscila entre aproximadamente el 0,1% p/p y aproximadamente el 80% p/p, entre aproximadamente el 1,0% p/p y aproximadamente el 50% p/p, entre aproximadamente el 1,0% p/p y aproximadamente el 40% p/p, entre aproximadamente el 1,0% p/p y aproximadamente el 30% p/p, entre aproximadamente el 1,0% p/p y aproximadamente el 20% p/p, entre aproximadamente el 1,0% p/p y aproximadamente el 10% p/p, entre aproximadamente el 5,0% p/p y aproximadamente el 20% p/p, o entre aproximadamente el 5,0% p/p y aproximadamente el 10% p/p. En algunas realizaciones, la cantidad de celulas en una composicion que es adecuada para la formacion de hidrogeles segun la presente invencion es de aproximadamente el 5% p/p. En algunas realizaciones, la concentration de celulas en una disolucion precursora que
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es adecuada para la formacion de hidrogeles segun la invention oscila entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1 x 108 celulas/ml, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1 x 107 celulas/ml, entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 106 celulas/ml, o entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 105 celulas/ml. En algunas realizaciones, un unico hidrogel comprende una poblacion de celulas y/o tipos de celula identicos. En algunas realizaciones, un unico hidrogel comprende una poblacion de celulas y/o tipos de celula que no son identicos. En algunas realizaciones, un unico hidrogel puede comprender al menos dos tipos de celulas diferentes. En algunas realizaciones, un unico hidrogel puede comprender 3, 4, 5, 10 o mas tipos de celulas. Por mencionar solo un ejemplo, en algunas realizaciones, un unico hidrogel puede comprender solo celulas madre embrionarias. En algunas realizaciones, un unico hidrogel puede comprender tanto celulas madre embrionarias como celulas madre hematopoyeticas.
C2. Medios
Puede usarse cualquiera de una variedad de medios de cultivo celular, incluyendo medios complejos y/o medios de cultivo libres de suero, que pueden soportar el crecimiento del uno o mas tipos de celula o llneas celulares para hacer crecer y/o mantener las celulas. Normalmente, un medio de cultivo celular contiene un tampon, sales, fuente de energla, aminoacidos (por ejemplo, aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, etc.), vitaminas, y/u oligoelementos. Los medios de cultivo celular pueden contener opcionalmente una variedad de otros componentes, incluyendo pero sin limitarse a, fuentes de carbono (por ejemplo, azucares naturales, azucares no naturales, etc.), cofactores, llpidos, azucares, nucleosidos, componentes de origen animal, hidrolizados, hormonas, factores de crecimiento, surfactantes, indicadores, minerales, activadores de enzimas especlficas, activadores inhibidores de enzimas especlficas, enzimas, productos organicos, y/o metabolitos de molecula pequena. Los medios de cultivo celular adecuados para su uso segun la presente invencion estan disponibles comercialmente de una variedad de fuentes, por ejemplo, ATCC (Manassas, Va.). En determinadas realizaciones, se usan uno o mas de los siguientes medios para hacer crecer celulas: medio RPMI-1640, medio de Eagle modificado por Dulbecco, medio esencial mlnimo Eagle, medio F-12K, medio de Eagle modificado por Iscove.
Los expertos en la tecnica reconoceran que las celulas enumeradas en el presente documento representan una lista a modo de ejemplo, no exhaustiva, de celulas que pueden encapsularse dentro de una disolucion precursora (y, por tanto, eventualmente en un hidrogel) segun la presente invencion.
D. Tratamiento del cartllago articular
Puede administrarse una cantidad terapeuticamente eficaz de un hidrogel de la presente invencion a un paciente y/u organismo antes de, simultaneamente a y/o despues del diagnostico de una enfermedad, un trastorno y/o estado. En algunos casos, administrarse una cantidad terapeuticamente eficaz de un hidrogel de la presente invencion a un paciente y/u organismo antes de, simultaneamente a y/o despues de la aparicion de los slntomas de una enfermedad, un trastorno y/o estado.
Por consiguiente, se describe en el presente documento un metodo de reparation de tejido biologico, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un hidrogel de la presente invencion.
Tambien se describe en el presente documento el uso de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition de la presente invencion o un hidrogel de la presente invencion para reparar tejido biologico.
Tambien se describe en el presente documento una composicion de la presente invencion o un hidrogel de la presente invencion para su uso en la reparacion de tejido biologico, en cualquiera de los casos descritos en la memoria descriptiva.
Tambien se describe en el presente documento el uso de una cantidad terapeuticamente eficaz de un hidrogel de la presente invencion o una composicion de la presente invencion para la fabrication de un medicamento para reparar tejido biologico.
Tambien se describe en el presente documento una composicion de la presente invencion o un hidrogel de la presente invencion cuando usado en un metodo de reparacion de tejido biologico.
Tambien se describe en el presente documento una composicion que tiene un principio activo para su uso en la reparacion de tejido biologico, en el que el principio activo es un hidrogel de la presente invencion.
Tambien se describe en el presente documento el uso de una composicion de la presente invencion o un hidrogel de la presente invencion en la reparacion de tejido biologico, tal como se describio anteriormente.
En un caso, el tejido biologico es cartllago. El cartllago puede ser cartllago articular.
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El termino “cantidad terapeuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad del hidrogel de la presente invencion que es suficiente para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retardar la aparicion de, inhibir la progresion de, reducir la gravedad de, y/o reducir la incidencia de uno o mas slntomas o caracterlsticas de la enfermedad, el trastorno y/o estado. En particular, una “cantidad terapeuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para reparar tejido biologico, tal como cartllago (y, en particular, cartllago articular). El termino “reparacion” se refiere a la sustitucion o restauracion de tejido biologico danado, por ejemplo de tal manera que se restaure la funcionalidad original del tejido danado. Un experto en la tecnica entendera que la restauracion puede ser completa, de tal manera que se ha restaurado el 100% de la funcionalidad original, o puede ser parcial, de tal manera que solo ha restaurado una parte de la funcionalidad original.
Los hidrogeles de la presente invencion pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier via de administracion eficaces para el tratamiento. La cantidad exacta requerida variara de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la infeccion, el hidrogel particular, su modo de administracion, su modo de actividad, y similares.
Normalmente se formulan las composiciones y los hidrogeles de la presente invencion en forma unitaria de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. Sin embargo, se entendera que el uso diario total de los hidrogeles y/o conjuntos de hidrogel de la presente invencion lo decidira el medico encargado dentro del alcance del criterio medico solido.
El nivel de dosis terapeuticamente eficaz especlfico para cualquier sujeto u organismo particular dependera de una variedad de factores incluyendo el trastorno que este tratandose y la gravedad del trastorno; la actividad del principio activo especlfico empleado; el pollmero y/o las celulas especlficos empleados; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del principio activo especlfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o de manera coincidente con el principio activo especlfico empleado; y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas.
Los hidrogeles de la presente invencion pueden administrarse por cualquier via. En algunos casos, los hidrogeles de la presente invencion pueden administrarse por una variedad de vlas, incluyendo administracion directa a un sitio afectado. Por ejemplo, los hidrogeles pueden administrarse localmente cerca de un sitio que necesita regeneration del tejido. La administracion local puede lograrse mediante inyeccion del hidrogel enfriado directamente en un sitio que necesita nuevo crecimiento y/o reparacion de tejido.
En determinados casos, los hidrogeles de la presente invencion pueden administrarse de tal manera que se liberen celulas y/o agentes terapeuticos encapsulados que van a administrarse a concentraciones que oscilan entre aproximadamente 0,001 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg, entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg, entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal del sujeto al dla, una o mas veces al dla, para obtener el efecto terapeutico deseado. La dosificacion deseada puede administrarse, por ejemplo, tres veces al dla, dos veces al dla, una vez al dla, cada dos dlas, cada tres dlas, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En determinadas realizaciones, la dosificacion deseada puede administrarse usando administraciones multiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce administraciones o mas).
En algunos casos, la presente divulgacion engloba “cocteles terapeuticos” que comprenden los hidrogeles de la presente invencion. En algunos casos, los hidrogeles comprenden un unico tipo de celula y, opcionalmente, un agente terapeutico. En algunos casos, los hidrogeles comprenden multiples tipos de celula diferentes y, opcionalmente, un agente terapeutico.
Se apreciara que los hidrogeles cargados con celulas segun la presente invencion pueden emplearse en terapias de combinacion. La combinacion particular de terapias (tratamientos o procedimientos) a emplear en un regimen de combinacion tendra en cuenta la compatibilidad de los tratamientos y/o procedimientos deseados y el efecto terapeutico deseado que debe lograrse. Se apreciara que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo fin (por ejemplo, un hidrogel que comprende un determinado tipo de celula que va a usarse para fomentar el crecimiento de tejido puede administrarse de manera concurrente con otro agente terapeutico usado para estimular el crecimiento del mismo tejido), o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso, tal como inflamacion, infeccion, etc.).
E. Kits
Tambien se describen en el presente documento una variedad de kits que comprenden uno o mas de los hidrogeles
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y/o las composiciones de la presente invencion. Por ejemplo, se describe un kit que comprende un hidrogel y/o una composicion e instrucciones de uso. Un kit puede comprender multiples hidrogeles y/o composiciones diferentes. Un kit puede comprender opcionalmente pollmeros, celulas, PMEC, compuestos biologicamente activos, y similares. Un kit puede comprender cualquiera de varios componentes o reactivos adicionales en cualquier combinacion. Todas las diversas combinaciones no se exponen expllcitamente pero cada combinacion esta incluida en el alcance de la divulgacion. Se describen unos cuantos kits a modo de ejemplo en los siguientes parrafos.
En determinados casos, un kit puede incluir, por ejemplo, (i) una disolucion que comprende un pollmero, una disolucion que comprende PMEC; y (ii) instrucciones para la formacion de un hidrogel a partir de la disolucion.
En otro caso, un kit puede incluir, por ejemplo, (i) una composicion que comprende un pollmero y PMEC; y (ii) instrucciones para la formacion de un hidrogel a partir de la composicion.
Los kits pueden incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Los kits incluyen normalmente instrucciones de uso de los hidrogeles de la presente invencion. Las instrucciones pueden comprender, por ejemplo, protocolos y/o describir condiciones para la produccion de hidrogeles, administracion de hidrogeles a un sujeto que lo necesita, produccion de conjuntos de hidrogel, etc. Los kits incluiran generalmente uno o mas recipientes o envases de modo que algunos o todos los reactivos y componentes individuales pueden alojarse por separado. Los kits tambien pueden incluir medios para encerrar envases individuales en confinamiento relativamente proximo para la venta comercial, por ejemplo, una caja de plastico, en la que pueden adjuntarse instrucciones, materiales de acondicionamiento tales como espuma de poliestireno, etc.
El kit o “articulo de fabrication” puede comprender un envase y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, envases de tipo blister, etc. Los envases pueden estar formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El envase contiene el hidrogel o la composicion que es eficaz para tratar el estado y puede tener un orificio de acceso esteril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de disolucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable mediante una aguja de inyeccion hipodermica). La etiqueta o el prospecto indican que el hidrogel o la composicion se usan para tratar el estado elegido. En una realization, la etiqueta o el prospecto incluyen instrucciones de uso e indican que la composicion terapeutica puede usarse para reparar o regenerar tejido.
La presente invencion se describira ahora en mayor detalle con referencia a los ejemplos y dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que la siguiente description es meramente ilustrativa y no debe tomarse en modo alguno como restriction de la generalidad de la invencion descrita anteriormente.
Ejemplos
Materiales
Se adquirieron los productos qulmicos de Sigma-Aldrich a menos que se indique de otro modo. Se usaron 2- etilhexanoato estannoso (Sn(OCt)2), N-isopropilacrilamida (NIPAAm), metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), 4,4'- azobis(acido 4-cianovalerico) (ACVA) y N-acriloxisuccinimida (NAS) tal como se recibieron. Se purifico el metacrilato de monometil eter de oligo(etilenglicol) (OEGMA, Mn = 475) haciendo pasar su disolucion en diclorometano (con una razon volumetrica 1:1) a traves de una columna de alumina neutra para retirar el inhibidor antes de su uso. Se seco el monomero de D,L-lactida (LA) a vaclo a 40°C durante 24 h antes de su uso. El azobisisobutironitrilo (AIBN) lo obsequio amablemente la Escuela de Qulmica de la Universidad de Sidney.
Sintesis de macromonomero de HEMA-poli(lactida) (HEMA-PLA)
Se sintetizo el macromonomero de HEMA-PLA mediante polimerizacion por apertura de anillo de LA con el grupo hidroxilo de HEMA como iniciador y Sn(OCt)2 como catalizador (Esquema 1).6
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Se mezclaron LA y HEMA en un matraz de tres bocas a 110°C bajo una atmosfera de nitrogeno durante 15 min. Posteriormente, se anadio una mezcla del 1% molar de Sn(OCt)2 (con respecto a la alimentacion de HEMA) en 1 ml de tolueno anhidro, a la disolucion de LA/HEMA. Se agito la mezcla resultante a 300 rpm y 110°C durante 1 h bajo una atmosfera de nitrogeno. Despues de la reaccion, se disolvio la mezcla en tetrahidrofurano y se precipito en agua destilada frla a 1°C. Se separo el precipitado formado, mediante centrifugacion a 3000 rpm durante 5 min. Se repitio el ciclo de centrifugacion tres veces para retirar toda la cantidad de monomeros sin reaccionar y subproductos (principalmente sales). Entonces se disolvio el precipitado en acetato de etilo. Se retiraron las partlculas solidas en suspension de la disolucion con centrifugacion a 6000 rpm durante 5 min y se seco el sobrenadante con MgSO4 durante 12 h. Se filtro el sobrenadante secado para retirar las partlculas de MgSO4. Entonces se seco la disolucion polimerica a 60°C a presion reducida y se elimino ademas el residuo de disolvente a vaclo, a 40°C durante 24 h. Se guardo el aceite viscoso resultante en un congelador para su uso posterior.
Se vario la razon de alimentacion de HEMA:LA entre 1:1,5 y 1:2,5 para obtener macromero de PLA/HEMA con diferentes longitudes de lactato. Se sintetizaron dos macromonomeros de PLA/HEMA con longitudes de lactato de 3 y 6 usando una razon molar de 1:1,5 y 1:2,5 de monomeros de HEMA con respecto a LA, respectivamente.
Se confirmo la slntesis de macromero de PLA/HEMA, usando espectros de 1H-RMN con evidencias de picos de proton tanto de HEMA como de LA. Se calculo la razon molar de LA con respecto a macromero de PLA/HEMA en HEMA a partir de los espectros de 1H-RMN usando los picos a 5,2 ppm para metino en lactato, y las integraciones totales de los picos a 5,7 ppm y 6,0 ppm para HEMA.
Slntesis de poli(NIPAAm-co-NAS-co-(HEMA-PLA)-co-OEGMA) (PNPHO)
Se sintetizo PNPHO usando el metodo o bien (1) o bien (2) tal como se describe a continuacion (Esquema 2).
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CltlCHjlj
CH(CH3h
CH-CH,
H,C
C=0
CH
HjC
70 °C
DMr
NAS
NIPAAm
OEOMA
HEWA-PLA
P(NiPAAm-co-NAS-c«HHEMA-PLA)-c<s-OESMA(
Esquema 2. Slntesis de PNPHO
Metodo 1
Se sintetizo PNPHO mediante polimerizacion por radicales libres usando AIBN como iniciador. Se cargo un matraz Schlenk con una barrita de agitacion magnetica y un septo de caucho con NIPAAm (12 mmol), NAS (1,0 mmol), HEMA-PLA (0,57 mmol), OEGMA (0,56 mmol), AIBN (0,07 mmol) y W,W-dimetilformamida (DMF) anhidra. Se desoxigeno el matraz mediante tres ciclos de congelacion-bombeo-descongelacion, y luego se sello seguido por inmersion del matraz en un bano de aceite precalentado a 70°C para iniciar la polimerizacion. Despues de reaccion durante 24 h, se enfrio la mezcla de reaccion hasta temperatura ambiente, se precipito en dietil eter, se filtro y luego
se seco a vaclo. Se purifico el pollmero dos veces mediante redisolucion/nueva precipitacion con THF/etil eter y finalmente se seco a vaclo durante 2 dlas.
Metodo 2
Se sintetizo PNPHO mediante polimerizacion por radicales libres, usando ACVA como iniciador. Se cambio la 5 composicion de copollmeros variando la longitud de lactato (3 y 6 en HEMA-PLA), las razones molares de HEMA- PLA (el 6, el 8 y el 11% molar) y OEGMA (el 3, el 5 y el 8% molar). Se disolvieron cantidades conocidas de NIPAAm, NAS, HEMA-PLA, OEGMA, ACvA (7,0 x 10-5 mol) en 13 ml de W,W-dimetilformamida anhidra en un matraz de fondo redondo, de una sola boca. Entonces se desoxigeno el sistema mediante al menos tres ciclos de congelacion- bombeo-descongelacion, usando nitrogeno llquido como refrigerante. Los resultados tambien mostraron que es 10 factible desoxigenar la disolucion de monomero purgando con gas nitrogeno durante 10 min en la disolucion a vaclo. Esta tecnica proporciona un metodo mas eficaz para eliminar el oxlgeno de la disolucion a gran escala. Entonces se sella el reactor y se sumerge en un bano de aceite a 70°C durante 24 h. Luego se enfrio la disolucion polimerica resultante a temperatura ambiente durante 1 h y se precipito en 250 ml de dietil eter. Entonces se recogio el precipitado mediante filtracion de la suspension y se seco a vaclo durante 6 h. Se disolvio el polvo secado en 15 tetrahidrofurano y se precipito en dietil eter para retirar adicionalmente residuos de macromeros. Se seco el polvo final a vaclo durante al menos 48 h.
Composiciones de PNPHO
Se confirmo la slntesis de copollmeros de PNPHO con espectros de 1H-RMN con evidencias de picos de proton para cada monomero, tal como se muestra en la figura 2. Se detectaron picos de proton caracterlsticos para NIPAAm (a y 20 b), NAS (e), HEMAPLA (f, h, k) y OEGMA (m y n). Se calculo la composicion final de copollmero basandose en la
integracion de estos picos de cada monomero como para NIPAAm (a), NAS(e/2-f), HEmA-PLA (h) y OEGMA (n/2). Se midieron los pesos moleculares de los copollmeros usando cromatografla de permeacion en gel. Para cada composicion, se llevaron a cabo al menos tres slntesis y se analizo estadlsticamente la varianza entre razones de alimentacion y la composicion final de copollmeros, usando analisis de la varianza de una via (ANOVA). Se encontro 25 que las composiciones de copollmeros concordaban (p>0,05) con las razones de alimentacion, tal como se notifica en la tabla 1. En este estudio, se indica el copollmero como PNPHO y se anade el sublndice que corresponde a las razones molares de HEMA-PLA (longitud de lactato) con respecto a OEGMA. Por ejemplo PNPHO8(6)3 representa el copollmero sintetizado con el 8% molar de HEMA-PLA con una longitud de lactato de 6, y el 3% molar de OEGMA.
Tabla 1. Razon de alimentacion, composicion final y peso molecular de PNPHO sintetizado con diferentes 30 composiciones.
Razon molar de monomeros
Composicion final de copollmero Mw
6(3)/3/7/84
8,7(3)/3,4/7,9/80 21.212
8(3)/3/7/82
10,9(3)/3,9/8,2/77 21.451
11 (3)/3/7/79
11(3)/3/8/78 22.444
6(3)/5/7/82
7,8(6)/5/8,2/79 22.551
8(3)/5/7/80
9,1(6)/6,5/8,4/76 23.544
11 (3)/5/7/77
9,1(6)/7/7,9/76 23.001
6(3)/8/7/79
8,2(6)/7/7/77,8 25.541
8(3)/8/7/77
8,8(6)/8,1/8,1/75 25.550
11 (3)/8/7/74
11,8(6)/8/8,2/72 27.002
6(6)/3/7/84
6,8(6)/3/8,5/81,5 23.211
8(6)/3/7/82
9,1(6)/3/8/79,9 22.551
11 (6)/3/7/79
12,2(6)/3,2/8,6/76 24.555
6(6)/5/7/82
6(6)/5,6/8,4/80 27.521
8(6)/5/7/80
6(6)/8,1/5,5/8,4/77 25.521
11(6)/5/7/77
11,1(6)/5,6/8/75,3 26.555
6(6)/8/7/79
9(6)/8,5/8/74,5 28.452
8(6)/8/7/77
10(6)/9/8,3/72,6 28.881
11(6)/8/7/74
11(6)/8/7/74
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1. PLA-HEMA (longitud de lactato):OEGMA:NAS:NIPAAm
En la slntesis y purification de HEMA-PLA, OEGAMA y PNPHO, se usaron diferentes disolventes organicos, incluyendo acetato de etilo, dimetilformamida, tetrahidrofurano y dietil eter. Se uso cromatografla de gases para medir los residuos de estos disolventes en PNPHO. Los resultados mostraron que la concentration de todos estos disolventes organicos en los productos finales estaba por debajo del nivel de ppm, mostrando que el procedimiento 35 de purificacion en multiples etapas era eficaz y las aplicaciones in vivo e in vitro de este precursor de pollmero son seguras.
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Solubilidad de PNPHO en PBS
Se modificaron las razones monomericas de PNPHO para adquirir una gama de composiciones que se disolvieron en medios acuosos, tales como PBS para el desarrollo de formulaciones inyectables. Los copollmeros basados en NIPAAm son solubles en disoluciones acuosas por debajo de su LCST debido a la formacion de enlaces de hidrogeno entre los grupos polares del copollmero y las moleculas de agua. En este estudio, se estudiaron los efectos de la longitud de lactato, el contenido de HEMA-PLA y OEGMA sobre la solubilidad de PNPHO midiendo la concentracion de saturacion de diferentes composiciones de PNPHO en PBS.
Los resultados en la figura 3 demuestran que la longitud de lactato creciente dentro del intervalo de 3 a 6 en la estructura principal de HEMA-PLA no tuvo un efecto significativo sobre la solubilidad de PNPHO en PBS (p>0,05). Por tanto, las propiedades hidrofobas de una cadena lateral en la estructura principal de PNPHO tuvo un impacto mlnimo sobre la solubilidad global de PNPHO en medios acuosos, dentro del intervalo examinado. Por tanto, cambiando la longitud de lactato, pueden ajustarse otras caracterlsticas de PNPHO, tales como el comportamiento de gelificacion y las propiedades mecanicas, sin afectar a la solubilidad de PNPHO en medios acuosos.
Puede ajustarse la solubilidad de PNPHO en PBS cambiando el contenido tanto hidrofobo como hidrofilo. El segmento de PLA es la mayor estructura principal hidrofoba, mientras que ambos monomeros de NAS y HEMA presentan propiedades hidrofilas relativamente limitadas. Por tanto, se incluyo OEGMA en la slntesis de PNPHO para fomentar las propiedades hidrofilas del copollmero. El aumento de HEMA-PLA (es decir, el contenido hidrofobo) en copollmeros desde el 6 hasta el 8 y el 11% molar disminuyo la solubilidad de PNPHO en PBS en el 30% y el 50%, respectivamente. Por ejemplo, la concentration de saturation de PNPHO6(6)3 disminuyo significativamente (p<0,001) desde 250 ± 17 mg/ml hasta 190 ± 10 mg/ml y 164 ± 6 mg/ml en PNPHO8(6)3 y PNPHOn(6)3,
respectivamente. Esta reduction de la solubilidad tambien se debio a la disminucion de la concentracion del segmento relativamente hidrofilo NIPAAm en el copollmero (p<0,05). Por tanto, la disminucion del contenido de NIPAAm en PNPHO afecto sustancialmente a la hidratacion del copollmero.
La solubilidad de PNPHO en agua aumento drasticamente, cuando se uso mas del 3% molar (por ejemplo, el 1,5% molar) de OEGMA como segmento hidrofilo. Los resultados mostraron que los copollmeros con un contenido de OEGMA menor del 3% molar no eran solubles en medios acuosos. Los resultados en la figura 3 muestran que la solubilidad de copollmeros de PNPHO con el 6% molar de PLA/HEMA aumento significativamente 2 y 3 veces cuando se elevo la concentracion de OEGMA desde el 3% molar hasta el 5 y el 8% molar, respectivamente. Sin embargo, en copollmeros que contenlan una menor razon molar del segmento hidrofobo HEMA-PLA (es decir, el 8% molar y el 11% molar), la concentracion de OEGMA tuvo un pequeno efecto sobre la solubilidad de PNPHO. Este comportamiento se atribuyo a la formacion de copollmeros con cadenas mas largas y mayor MW, lo que impidio la hidratacion y solubilidad del copollmero en disolucion acuosa. Como ilustracion, el peso molecular de PNPHOh(3)8 fue significativamente (p<0,01) mayor que el de PNPHOn(3)5 (27 K en comparacion con 26 K), lo que comprometio el efecto de su mayor contenido hidrofilo y, por tanto, la concentracion de saturacion para ambos compuestos fue de aproximadamente 300 mg/ml.
Se evaluo el efecto de concentracion de copollmeros de PNPHO solubles en agua sobre la facilidad de inyeccion de sus disoluciones a traves de una aguja 18G. Se encontro que una disolucion de PNPHO 150 mg/ml en PBS podia inyectarse a traves de una aguja 18G y se uso esta concentracion de copollmero para analisis adicional. Pueden usarse mayores concentraciones de polimeros para otras aplicaciones biomedicas tales como fabrication de andamiajes para crecimiento de tejido in vitro.
Conjugation de PNPHO con proteinas derivadas de manera natural y formacion de hidrogeles
La presencia del grupo ester de succinimida en la estructura molecular de PNPHO proporciono sitios activos faciales para la conjugacion con proteinas derivadas de manera natural tales como elastina, colageno y tropoelastina recombinante. Se usaron diferentes tecnicas de conjugacion (tal como se muestra en la figura 1) para preparar hidrogeles de proteina-copolimero.
Elastina
En el metodo (a), se disolvio copollmero de PNPHO en PBS durante 24 h. Se anadio disolucion de proteina a disolucion de PNPHO y se incubo a 4°C durante 24 h mas. En el metodo (b), se llevaron a cabo la disolucion de PNPHO y conjugacion de proteina al mismo tiempo. En el metodo (c), se disolvio PNPHO y se conjugo con proteina derivada de manera natural en un agitador. En el metodo (d), se formo polvo de conjugado de PNPHO-proteina mediante secado por congelation de disolucion de PNPHO-proteina. Se disolvio el polvo de conjugado en PBS en un agitador para formar la disolucion polimerica final. Se convirtieron las disoluciones de proteina-PNPHO formadas con diferentes tecnicas en hidrogeles mediante el aumento de la temperatura hasta 37°C.
Se examino la factibilidad de conjugacion o reticulation de esta clase de copollmeros con proteina derivada de
manera natural. Para los fines de este estudio, se usaron PNPHO6(6)8 y elastina (como protelna modelo). Se muestra el esquema del procedimiento, usado para la conjugation de PNPHO con elastina, en la figura 4(a). En cada ejecucion, se usaron una elastina 100 mg/ml y 150 mg/ml de PNPHO para formar conjugado de elastina-copollmero. En este estudio, se usaron diferentes tecnicas (tal como se muestra esquematicamente en la figura 1) para disminuir 5 el tiempo de preparation de la disolucion de protelna-copollmero para facilitar la aplicacion cllnica de este sistema. Se confirmo la conjugacion qulmica de elastina y PNPHO con diferentes tecnicas midiendo la tasa de retention de elastina dentro de la estructura del hidrogel conjugado. Estudios previos mostraron que despues de 24 h de incubation, se retenla menos del 40% en peso de protelnas en la estructura de los hidrogeles.7 En este estudio, se correlaciono la razon de conjugacion de elastina y PNPHO con la razon de retencion de elastina en la estructura de 10 biopollmero despues de 24 h de lavado meticuloso del hidrogel conjugado en PBS en condiciones fisiologicas. Se uso el ensayo de protelnas de Bradford para determinar la concentration de protelna solubilizada en los medios de lavado.8
Se resumen en la tabla 2 el tiempo de preparacion y la razon de retencion de elastina en hidrogeles conjugados, preparados con diferentes tecnicas.
15 Tabla 2. El efecto del metodo de preparacion sobre la retencion de elastina
Tecnica de preparacion1
Tiempo de preparacion Retencion de elastina (% en peso)
Metodo a
48 horas 51 ± 4
Metodo b
24 horas 78 ± 3
Metodo c
10 horas 77 ± 3
Metodo d
6 horas
1. Remltase a la figura 1 para una vision general esquematica de las tecnicas de preparacion.
Tal como se menciono anteriormente, en el metodo (a) se disolvio PNPHO en PBS en el plazo de 24 h. Posteriormente, se anadio la disolucion de elastina a la disolucion de PNPHO y se incubo a 4°C durante 24 h mas. Los resultados del ensayo de protelnas de Bradford mostraron que el 51 ± 4% en peso de elastina participo en la reaction de conjugacion qulmica. Mediante la disolucion y conjugacion simultaneas de copollmero de PNPHO y 20 elastina (metodo (b)) se disminuyo el tiempo de preparacion de 48 h a 24 h y aumento significativamente (p<0,05) la razon de retencion de elastina hasta el 78 ± 3% en peso. Se disminuyo adicionalmente el tiempo de preparacion hasta 10 h en el metodo (c) llevando a cabo la fase de disolucion y conjugacion a 4°C con agitador sin afectar a la razon de retencion de elastina (p>0,05). En el metodo (d), se conjugaron protelna (tal como elastina) y copollmero. Entonces se seco por congelation la disolucion de conjugado, formandose polvo de elastina-PNPHO. Se disolvio 25 este polvo en PBS en 6 h y puede administrarse como producto final. Se disminuyo el tiempo de preparacion desde 48 h hasta 6 h, lo que se ha considerado que es un tiempo de preparacion cllnicamente aceptable. Se uso el metodo (d) para la preparacion de diferentes hidrogeles de protelna-PNPHO.
La estructura del copollmero de PNPHO termicamente sensible consiste en enlaces de amida hidrofilos y grupos isopropilo hidrofobos. El aumento de la temperatura de las disoluciones (en ambas disoluciones de PNPHO y 30 elastina-PNPHO) desde 4°C hasta 37°C (por encima de la LCST) instigo la deshidratacion de los grupos isopropilo hidrofobos durante la transition de espiral a globo (dirigida por el contenido de PNIPAAm), seguido por la precipitation de los compuestos. Existe un fuerte enlace de hidrogeno entre agua y ambas protelnas y copollmero, que dio como resultado la formation de un hidrogel conjugado por encima de la LSCT, tal como se muestra en la figura 4(b).
35 Se uso ATR-FTIR para confirmar la formacion de enlaces covalentes entre elastina y PNPHO. Los resultados en la figura 4(c) muestran que los picos clave para PNPHO incluyen tensiones N-H y C=O de NIPAAm a 1540 cm-1 y 1645 cm-1 y tres picos caracterlsticos de grupo ester de succinimida a 1740 cm-1, 1763 cm-1 y 1795 cm-1. La ausencia de estos picos para NAS en espectros de ATR-FTIR de conjugado de elastina-copollmero subrayo que la elastina se unla covalentemente al grupo ester de succinimida en PNPHO.
40 La presencia de elastina dentro de la estructura del conjugado hidrogel tambien se confirmo mediante los picos de elastina de ATR-FTIR caracterlsticos. En general para todas las protelnas tales como elastina, los enlaces amida se presentan dentro de 1600 cm-1 a 1700 cm-1. Esta region procede de la vibration de tension C=O y confirma la estructura secundaria de la estructura principal de protelna. Los picos entre 1600 cm-1 y 1640 cm-1 corresponden a las bandas de lamina beta e interaction intermolecular. El hidrogel de elastina-PNPHO mostro un pico a 1640 cm-1, 45 confirmando la presencia de interaccion intermolecular y formacion de estructura de protelna estable. Ademas, los picos entre 1640 cm-1 y 1660 cm-1 demuestran la contribution de espirales al azar y helices alfa en la elastina. El conjugado de copollmero-elastina tambien mostro un pico a 1640 cm-1 debido a la presencia de a-helices en la elastina. Los picos restantes en la region de amida I desde 1660 cm-1 hasta 1690 cm-1 predominaron mediante vibraciones de estructuras de giro beta, con algunos pequenos picos de otras estructuras, indicados como puntos de 50 giro. En la region de amida II (de 1500 a 1600 cm-1), los espectros de ATR-FTIR de elastina-PNPHO mostraron un desplazamiento significativo que correspondla a la tension N-H de NIPAAm y elastina desde 1535 cm-1 hasta
1545 cm-1 de numero de ondas. Este desplazamiento en los espectros de FTIR confirma la interaccion molecular entre PNPHO y elastina en el producto de conjugado de elastina-copollmero.
Ademas, tal como se muestra en la figura 5, el pollmero mostro un pico caracterlstico a 1812 cm-1 asociado con el grupo succinimida. Despues de la conjugation de elastina, este pico desaparecio por completo, indicando la 5 participation de elastina en la reaction de condensation con el grupo succinimida. Tras la comparacion de
espectros antes y despues de la incorporation de elastina, se observo una atenuacion significativa de la absorcion del grupo ester (1735 cm-1) y un aumento espectacular de la absorcion del grupo amida (1630 y 1545 cm-1), que resulto de la conversion del enlace ester en una union amida en el transcurso de la reticulation. Esto dio como resultado la variation de intensidad relativa correspondiente observada de estos picos caracterlsticos.
10 En ausencia de protelna, se precipito PNPHO en disolucion de PNPHO a 37°C y el enmaranamiento al azar de las cadenas de pollmero formo un hidrogel fragil con escasa integridad flsica. Se disolvio totalmente el hidrogel de PNPHO en PBS despues de 4 dlas en PBS (que se uso para imitar el entorno fisiologico) tal como se muestra en la figura 4(c). La conjugacion de PNPHO con protelna (por ejemplo, elastina) condujo a la formation de enlaces covalentes que mantuvieron la integridad del hidrogel durante un periodo de tiempo mas largo. Esta conjugacion 15 qulmica proporciona por tanto suficiente estabilidad a los hidrogeles para diferentes aplicaciones biomedicas.
Los resultados de observation visual, la interaccion intermolecular adquirida del analisis por ATR-FTIR y la tasa de retention de protelna en hidrogeles conjugados demostraron que el copollmero sintetizado tiene la capacidad para unirse covalentemente a una protelna tal como elastina. Se estudiaron las caracterlsticas fisicoqulmicas de conjugados de elastina-PNPHO formados con diferentes composiciones de copollmero para seleccionar la 20 composition adecuada para inyeccion y aplicacion biomedica. Estos analisis incluyeron propiedades de gelificacion,
eficiencia de conjugacion y comportamiento de degradation.
Colageno
Puesto que el agente de union de succinimida muestra alta reactividad y accesibilidad optimizada hacia compuestos que contienen grupos amino, es razonable postular que el pollmero puede aplicarse a otros tipos de pollmeros 25 naturales con grupos amino para la fabrication de hidrogeles inyectables. Para confirmar esta suposicion, se examino la factibilidad de una reaccion entre el pollmero y colageno.
Se neutralizo una disolucion de colageno (OVICOLL®CLEAR, al 1%, pH 2,5~3,5) con pequenas allcuotas de disolucion de NaOH 1 M. Se mezclaron meticulosamente 250 ml de la disolucion de colageno neutralizada resultante con 500 ml de disolucion de pollmero/PBS 250 mg/1 ml. Entonces se transfirio la mezcla a una nevera. Despues de 30 conservation a 4°C durante 24 h, se permitio entonces que gelificase la mezcla a 37°C seguido por lavado con agua destilada para retirar cualquier impureza.
Los resultados (figura 6) muestran la formacion satisfactoria del hidrogel.
Comportamiento de gelificacion
En este estudio, se estudiaron los efectos de la razon molar de LA, el contenido de OEGMA y HEMA-PLA sobre el 35 comportamiento de gelificacion de conjugados de copollmero de elastina. Se midieron la temperatura de gelificacion y el tiempo de gelificacion para la conjugacion de elastina con diferentes tipos de PNPHO sintetizados en el presente documento.
Temperatura de gelificacion
Se evaluo el comportamiento reologico de conjugado de elastina con diferentes tipos de copollmero de PNPHO 40 dentro del intervalo de temperatura de 10°C a 37°C a la velocidad de 0,3°C/min. Se usaron estos datos para determinar la temperatura de gelificacion de las disoluciones de elastina-PNPHO, formadas con diferentes composiciones de copollmero. Se muestra el comportamiento reologico de tres composiciones de copollmeros como ejemplo en la figura 7(a). Por debajo de la LCST, estas tres disoluciones de elastina-PNPHO se mantuvieron en fase llquida. El aumento de la temperatura por encima de la LCST desencadeno la fase de deshidratacion, seguido por la 45 formacion del hidrogel. Basandose en el comportamiento reologico de los conjugados, se registro la temperatura de gelificacion en el punto de cruce del modulo de almacenamiento dinamico (G') y modulo de perdida (G”), tal como se muestra en la figura 7(a). Despues de este punto, la respuesta elastica de los hidrogeles predomino frente a la respuesta viscosa y la estructura del hidrogel continuo evolucionando, a medida que aumento G'. En este periodo, G” permanecio constante a aproximadamente 1 Pa. Los resultados en la figura 7(b) mostraron que la mayor parte de 50 las disoluciones de elastina-copollmero examinadas permitieron la formacion de un hidrogel por debajo de 37°C (temperatura corporal). Sin embargo, la LCST para la disolucion de conjugado de elastina-PNPHO6(3)8 fue de aproximadamente 40°C es decir por encima de la temperatura corporal. Por tanto, esta composicion de copollmero puede no ser un candidato favorable para aplicaciones biomedicas. La alta LCST en PNPHO6(3)8 se debio a un alta
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razon de contenido hidrofilo con respecto a contenido hidrofobo en este copollmero. Ademas, en PNPHOii(3)3 y PNPHOii(6)3 la falta de sitios hidrofilos inhibio la rehidratacion del biopollmero despues de la fase de condensacion. Este efecto condujo a la precipitacion de conjugado en forma de polvo con debil integridad estructural. Se presenta el efecto de la razon molar de lactato, OEGMA y HEMA-PLA sobre la temperatura de gelificacion de diferentes conjugados en las figuras 7(b) y (c).
Estos datos muestran que la razon molar de lactato en macromero de HEMA-PLA no tuvo un efecto significativo sobre la temperatura de gelificacion (p>0,05). Tambien se observo una tendencia similar para el efecto de este parametro sobre la solubilidad presentado en la figura 3. Este resultado sugiere que las propiedades hidrofobas de las cadenas laterales en la estructura principal de HEMA-PLA del copollmero no tuvo un efecto significativo sobre las propiedades hidrofilas del copollmero dentro del intervalo examinado.
La presencia de OEGMA desempeno un papel importante en el comportamiento de gelificacion de disoluciones de conjugado. Se elevo la temperatura de gelificacion del conjugado de elastina-PNPHO desde 17 ± 2°C hasta 24 ± 1°C y 27 ± 2°C cuando se aumento el contenido de OEGMA desde el 3% molar (PNPHOs(6)3) hasta el 5 (PNPHOaps) y el 8% molar (PNPHO8(6)8), respectivamente (p<0,01).
Tambien se estudio el efecto de la concentracion de HEMA-PLA como segmento hidrofobo sobre la temperatura de gelificacion del copollmero de PNPHO. El aumento del contenido de HEMA-PLA desde el 6% molar hasta el 8% molar y el 11% molar disminuyo significativamente (p<0,001) la temperatura de gelificacion de copollmero conjugado en aproximadamente el 20% y el 30%, respectivamente. Estos datos demuestran que la temperatura de gelificacion de conjugado de protelna-PNPHO puede ajustarse dentro del intervalo de 11°C a 40°C manipulando los contenidos hidrofobo e hidrofilo.
Tiempo de gelificacion
Se examino el comportamiento reologico de disoluciones de conjugado a 37°C a lo largo del tiempo para determinar el tiempo de gelificacion de disoluciones de elastina-PNPHO con diferentes composiciones de copollmero. El comportamiento reologico de tres composiciones de copollmeros se muestra como ejemplo en la figura 7(d). El tiempo de gelificacion es importante para aplicaciones in vivo de formulaciones inyectables. Una gelificacion rapida puede conducir a gelificacion prematura y bloqueo de la aguja o aumentar la viscosidad de disoluciones inyectables. Estos dos problemas dan como resultado una administracion inconveniente de la formulacion. Se considera optimo un tiempo de gelificacion de aproximadamente 9 minutos para la operation cllnica. Se altero el tiempo de gelificacion de la disolucion de protelna-PNPHO cambiando la longitud de lactato, el contenido de HEMA-PLa y OEGMA, tal como se muestra en las figuras 7(e) y (f).
El aumento de la longitud de lactato desde 3 hasta 6 disminuyo significativamente (p<0,05) el tiempo de gelificacion del sistema conjugado en aproximadamente el 10%. Elevando el contenido de HEMA-PLA desde el 6% molar hasta el 8% molar y el 11% molar, se redujo el tiempo de gelificacion en el 20% y el 40%, respectivamente. Estas reducciones del tiempo de gelificacion se atribuyeron a la elevation de la fraction hidrofoba y el peso molecular del copollmero de PNPHO. Lo primero acelero la velocidad de condensacion de la disolucion de elastina-PNPHO, mientras que lo ultimo afecto al enmaranamiento de la cadena polimerica durante la fase de gelificacion, y por tanto el tiempo de gelificacion.
El aumento del contenido de OEGMA desde el 3% molar hasta el 5% molar y el 8% molar dio como resultado una elevacion significativa (p<0,001) del tiempo de gelificacion de 2-3 veces, respectivamente. El aumento del contenido de OEGMA fue un obstaculo para las interacciones hidrofobas durante la condensacion y, por tanto, la formation del hidrogel. Por ejemplo, el comportamiento reologico de PNPHO8(6)3, PNPHO8(6)5 y PNPHO8(6)8, mostrado en la figura 7(d), revelo que el copollmero con mayor contenido hidrofilo mostro un tiempo de gelificacion mas corto. En PNPHO8(6)3 el tiempo de gelificacion fue de 7,2 ± 0,5 min, que era menor que para PNPHO8(6)5 (10,1 ± 0,6 min) y PNPHO8(6)8 (12,2 ± 0,2 min). Los datos adquiridos en este caso demuestran que es viable cambiar la temperatura y el tiempo de gelificacion de disoluciones de conjugado variando la composition del copollmero. Esto permite que se ajuste el comportamiento de gelificacion del sistema conjugado basandose en la aplicacion biomedica final del hidrogel inyectable.
Eficiencia de conjugation de PNPHO
Se diseno el copollmero de PNPHO para la conjugacion con biopollmeros basados en protelna con posible aplicacion en la administracion de biofactores encapsulados en el sitio requerido y regeneration del tejido in vivo. Puede ser viable usar este concepto para conjugar una protelna terapeutica con copollmero de PNPHO para administraciones inyectables y liberation controlada. Para ingenierla de tejidos in vivo, la incorporation de protelna derivada de manera natural dentro de la estructura de copollmero potencia la actividad biologica del copollmero sintetico. Se evaluo la capacidad de conjugacion de diferentes composiciones de copollmeros evaluando la razon de retention de elastina dentro de la estructura del copollmero. Para este analisis, se uso la tecnica de Bradford. Se
evaluaron los efectos de longitud de lactato, contenido de HEMA-PLA y OEGMA sobre la capacidad de conjugacion de los copollmeros.
Se encontro que se fomentaba la conjugacion de elastina con copollmeros cuando se usaron razones casi equimolares de segmentos hidrofilos con respecto a hidrofobos. Para copollmeros con Indice de lactato de 6, la 5 conjugacion de elastina se aproximo al 91 ± 1% en peso para copollmero que tenia (8% molar) OEGMA/(8% molar) HEMA-PLA (es decir, razon equimolar). En copollmeros sintetizados con indice de lactato de 3 (propiedades hidrofobas relativamente menores de la estructura principal de HEMA-PLA), se logro la mayor conjugacion de elastina del 81 ± 2% en peso para un contenido de HEMA-PLA y OEGMA del 11% molar y el 8% molar, respectivamente.
10 Los resultados del ensayo de proteinas de Bradford demuestran que la conjugacion de elastina fue de mas del 65% en peso y hasta del 90%. La capacidad de conjugacion del copolimero de PNPHO es superior a la de copollmeros sintetizados previamente para la conjugacion con proteinas. La alta estabilidad de elastina conjugada en la estructura de PNPHO puede atribuirse a la formacion de enlaces covalentes entre elastina y el copolimero, segun se confirma mediante los resultados de FTIR (comentado anteriormente). En aplicaciones biomedicas de hidrogeles 15 inyectables, es importante poder incorporar una alta razon de protelna dentro de un copolimero a nivel molecular. Las composiciones de copolimero seleccionadas para la caracterizacion adicional son PNPHOn(3)5, PNPHOn(3)8, PHPHO8(6)5 y PNPHO8(6)8, que presentan todos una eficiencia de conjugacion por encima del 80% en peso.
Comportamiento de biorresorcion de hidrogeles de proteina-PNPHO
En ingenieria de tejidos, es favorable usar una estructura polimerica que es biodegradable o biorresorbible en 20 condiciones biologicas. Se diseno PNPHO con dominio hidrofobo degradable (HEMA-PLA): su escision gradual junto con la retencion de la estructura principal hidrofila (OEGMA) de la estructura molecular del copolimero puede conducir a la disolucion de hidrogel en el entorno fisiologico. Ademas, la tasa de biorresorcion es un factor importante en la utilidad de los hidrogeles para aplicaciones biomedicas. Se evaluaron las propiedades de biorresorcion de hidrogeles conjugados mediante hidrolisis del segmento de PLA y la tasa de biorresorcion de 25 diferentes hidrogeles de elastina-PNPHO en entornos fisiologicos.
Capacidad de biorresorcion de los hidrogeles
Tal como se comento anteriormente, la degradacion de dominios hidrofobos (HEMA-PLA) en PNPHO y la retencion de segmentos hidrofilos (OEGMA) puede dar como resultado el aumento de la LCST y la disolucion de polimero conjugado en el organismo. Se llevo a cabo la hidrolisis acelerada sumergiendo la muestra en una disolucion de 30 hidroxido de sodio (1 M) durante un periodo de tres semanas a 4°C. Despues de este periodo, se neutralizo la suspension con disolucion de clorhidrato 10 M. Se examino el efecto de la hidrolisis de PLA sobre la estabilidad del conjugado de proteina-PNPHO en condiciones fisiologicas. Se seleccionaron cuatro copollmeros diferentes con las mayores eficiencias de conjugacion PNPHOn(3)5, PNPHOn(3)8, PNPHO8(6)5 y PNPHO8(6)8 para este estudio (tal como se menciono anteriormente). Despues de la hidrolisis, desaparecio el pico caracteristico de PLA a 5,1 ppm en los 35 espectros de 1H-RMN de estos copollmeros, confirmando la escision de PLA. Entonces se conjugaron con elastina los hidrolizados.
Se compararon las propiedades reologicas de copolimero conjugado a diferentes temperaturas antes y despues de la hidrolisis. Los resultados presentados en la figura 8(a) destacan el desplazamiento significativo de la temperatura de gelificacion hasta por encima de 37°C para hidrogeles formados con copollmeros hidrolizados. Por ejemplo, la 40 temperatura de gelificacion de PNPHOn(3)8 despues de degradacion acelerada aumento significativamente (p<0,001) desde 20,1 ± 1,0°C hasta 42,2 ± 3,1°C. Este resultado sugirio que los copollmeros convertidos se volvieron solubles a 37°C tras la esicision de residuos de polilactida en la estructura principal de HEMA-PLA del copolimero. Para muchas aplicaciones biomedicas, tales como crecimiento de tejido in vivo, la tasa de degradacion normal en un entorno fisiologico es un factor importante.
45 La tasa de biorresorcion de hidrogeles de proteina-PNHPO en el entorno fisiologico
Se usaron cuatro composiciones de copollmeros con las mayores eficiencias de bioconjugacion (PNPHO11(3)5, PNPHOii(3)8, PNPHOs(6)5 y PNPHOs(6)8) junto con PNPHOs(6)3 como control para estudiar la degradacion y biorresorcion de hidrogeles conjugados en un entorno confinado a 37°C en PBS. Se empaparon estos hidrogeles en PBS a 37°C durante 30 dlas y se uso una tecnica gravimetrica para determinar la razon de perdida de peso de los 50 hidrogeles en diferentes intervalos de tiempo. Los resultados mostraron que los copollmeros con alta eficiencia de conjugacion mostraron una tasa de degradacion significativamente (p<0,001) menor en comparacion con PNPHO8(6)3 con una eficiencia de conjugacion del 60%, tal como se muestra en la figura 9(b). La formacion de enlaces covalentes entre elastina y copolimero impidio la formacion de enlaces no especlficos de la molecula de copolimero con ella misma y con elastina. La formacion de enlaces no especlficos en estructuras moleculares 55 complejas pueden conducir a una alta tasa de degradacion y perdida de peso en los hidrogeles. Los copollmeros de
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PNPHO con alta eficiencia de conjugacion pueden formar enlaces covalentes con elastina, lo que inhibirla la formacion de interacciones no especlficas de la cadena de copollmero con ella misma y elastina.
Los resultados mostraron que los cuatro biopollmeros con alta eficiencia de conjugacion mostraron una perdida de peso relativamente baja (< 15%) en el plazo de 30 dlas de incubacion en PBS tal como se muestra en la figura 9(c). Durante los primeros 7 dlas, no hubo una diferencia significativa entre la tasa de degradation de todos los copollmeros con diferente contenido hidrofilo e hidrofobo (p>0,05). Despues de 14 dlas de incubacion, los copollmeros con mayor contenido de OEGMA (pNPHOn(3)8 y pNPHOaps) y mayor eficiencia de conjugacion mostraron una perdida de peso relativamente menor (p<0,05) en comparacion con los otros dos copollmeros con un contenido de OEGMA del 5% molar. Este resultado concordo con datos previos de que los copollmeros con una mayor razon de bioconjugacion podlan retener su estructura durante un periodo de tiempo mas largo.
Los hidrogeles de elastina-copollmero formados con las composiciones de copollmero optimas pudieron retener el 85% de su peso inicial despues de 30 dlas de incubacion en PBS. En cambio, Guan et al. notificaron una perdida de peso de aproximadamente el 90% para hidrogeles formados mediante conjugacion de colageno y poli(NIPAAm-co- AAc-co-NAs-co-HEMA-PLA) despues de 21 dlas.9 La mayor estabilidad de los hidrogeles de la presente invention se debio a la alta capacidad de conjugacion del copollmero de PNPHO. La alta estabilidad de PNPHO en el entorno fisiologico era comparable con otros copollmeros inyectables de base sintetica tales como poli(NIPAAm-co-HEMA- co-metacrilato-polilactida (MAPLA)). Este copollmero mostro una retention de peso de aproximadamente el 80% despues de 30 dlas de incubacion en PBS a 37°C. Sin embargo, este copollmero sin embargo no tenia ningun grupo funcional que pudiera unirse a proteinas. La presencia de sitios activos faciales en PNPHO confiere capacidad de conjugacion con proteinas a este sistema inyectable. Esta propiedad del copollmero de PNPHO puede transmitir propiedades biologicas superiores al sistema inyectable y hacer que sea mas favorable para diferentes aplicaciones biomedicas tales como administration de biofactores y crecimiento de tejido in vivo.
El efecto de la razon de conjugacion sobre la retencion de la estructura de hidrogeles
Cualquier biomaterial usado para aplicaciones de ingenieria de tejidos debe unirse fuertemente al tejido del huesped para fomentar la formacion de tejido acelerando la migration celular dentro de la estructura. Ademas, el biomaterial debe presentar una buena retencion de la estructura a lo largo del tiempo para fomentar la integration de tejido regenerado con el entorno circundante. Adhesivos tisulares disponibles comercialmente, basados en fibrinas, son el tratamiento de referencia actual para aplicaciones quirurgicas debido a sus propiedades no citotoxicas. Su aplicacion, sin embargo, es limitada debido a la tasa de degradacion muy alta. En particular, la presencia de celulas de condrogenesis aumenta drasticamente la tasa de degradacion de estos tipos de adhesivos tisulares. Mas recientemente, se sintetizaron adhesivos basados en sulfato de condroitina para unir covalentemente cartilago con hidrogeles. Este enfoque fomento la estabilidad estructural de los hidrogeles. Sin embargo, requiere tecnicas de implantation invasivas que implican digestion de cartilago y reticulation UV. Para abordar estos problemas, se disenaron geles de sulfato de condroitina-PEG para unir covalentemente con aminas primarias colageno mediante la formacion de enlaces amida en un entorno fisiologico. Estos hidrogeles, sin embargo, no permitian el crecimiento de condrocitos y la remodelacion de cartilago.
La capacidad de los hidrogeles para retener su integridad estructural en los sitios implantados es importante en el desarrollo de un biomaterial adecuado para la reparation de tejido. Se estudio la integridad estructural de hidrogeles de proteina-PNPHO en un entorno fisiologico. Los resultados mostraron que la conjugacion quimica entre proteina y copollmero desempena un papel importante al lograr la integridad estructural de los hidrogeles.
Se potencio el grado de conjugacion quimica entre proteina y copollmero teniendo una conjugacion de elastina- PNPHO en dos etapas, aumentando los sitios activos faciales en el copollmero, o usando tropoelastina recombinante (rTE) para conjugarla con PNPHO. En esta parte del estudio, se uso PNPHO8(6)5. En un procedimiento de conjugacion en dos etapas, se disolvio polvo de elastina-PNPHO8(6)5 en disolucion de elastina en vez de PBS para aumentar la razon de conjugacion entre elastina y copollmero (elastina(2x)-PNPHO8(6)5). En el segundo enfoque, para elevar el grado de conjugacion, se aumento el sitio activo de proteina en el copollmero de PNPHO desde el 7 hasta el 14% molar aumentando la razon de alimentation de NAS en la sintesis del copollmero, formandose PNPHO8(6)5-14. Alternativamente, se sustituyo elastina por rTE con mayor grupos de amina primaria (35 residuos de lisina por molecula en comparacion con a-elastina con menos del 1%) para formar un sistema de proteina-PNPHO8(6)5 conjugado con un mayor grado de conjugacion. Se empaparon los hidrogeles en PBS a 37°C y se registraron sus variaciones volumetricas en diferentes intervalos de tiempo tal como se muestra en la figura 10.
Los resultados mostraron que el grado de conjugacion quimica entre proteina y copollmero desempena un papel importante en la retencion de la estructura de los hidrogeles. Esto se confirmo mediante menores varianzas volumetricas de hidrogeles con mayores grados de conjugacion en comparacion con elastina-PNPHO8(6)5. La conjugacion quimica de elastina y copollmero aumento significativamente en hidrogeles de elastina(2x)-PNPHO8(6)5 en aproximadamente dos veces. Este efecto produce una varianza volumetrica menor del 50% en elastina(2x)- PNPHO8(6)5 despues de 14 dias en comparacion con elastina-PNPHO8(6)5. La integridad estructural del hidrogel de proteina-copolimero aumento adicionalmente elevando la reactividad con proteina del copollmero. Elastina-
PNPHO8(6)5-14 presento una integridad estructural significativamente mayor en condiciones fisiologicas en comparacion con elastina-PNPHO8(6)5. Usando rTE (que presenta un mayor numero de grupos de amina primaria) la conjugacion de protelna y copollmero tambien aumento y el hidrogel de rTE-PNPHO865 presento la mayor integridad estructural en un entorno fisiologico despues de 14 dlas. Este hidrogel mostro menos del 20% de varianza 5 volumetrica dentro de este periodo. Estos resultados muestran que el grado de conjugacion qulmica entre protelna y copollmero desempena un papel importante en la estabilidad y propiedades flsicas de un sistema conjugado.
Estudios biologicos
Celulas de fibroblastos de piel humana
Se cultivaron celulas de fibroblastos de piel humana (GM3348) en las proximidades de un hidrogel conjugado para 10 evaluar la citocompatibilidad de hidrogeles de elastina-PNPHO. Se formo una disolucion de elastina y PNPHO usando PBS esterilizado. Tras la gelificacion, se lavaron los hidrogeles con PBS precalentado, tres veces para eliminar todas las protelnas y copollmero sin reaccionar. Entonces se equilibraron los hidrogeles (sin esterilizacion adicional) en medios (DMED, FBS al 10% y pen.-estrep.) durante la noche a 37°C. Luego se cultivaron las celulas a 2x105 celulas/pocillo en una placa de 6 pocillos en las proximidades de hidrogeles conjugados. Se estudio la 15 proliferacion celular en la superficie de pocillo con analisis por microscopla optica para evaluar la citocompatibilidad in vitro de los hidrogeles. Los resultados en la figura 11 muestran que despues de 72 horas, los fibroblastos estaban vivos y proliferaron cerca del hidrogel. Este resultado confirma que los hidrogeles conjugados son citocompatibles y los productos de degradacion no son citotoxicos.
Tambien se evaluo la capacidad de encapsulacion celular de hidrogeles conjugados, usando fibroblastos. Se mezclo 20 una suspension celular altamente concentrada con una disolucion de elastina-PNPHO a temperatura ambiente. Entonces se incubo esta suspension a 37°C, seguido por la adicion gradual de medios (DMEM, FBS al 10% y pen.- estrep.) a los hidrogeles. Se uso la tincion de nucleolos de Hoechst 33258 para visualizar las celulas de fibroblastos, encapsuladas dentro de la estructura de los hidrogeles. Los resultados en la figura 12 muestran que la poblacion celular aumento significativamente desde el dla 1 hasta el dla 3 dentro de los hidrogeles de elastina-PNPHO. Este 25 resultado confirma la citocompatabilidad de este hidrogel conjugado.
Condrocitos
Estos resultados demuestran la factibilidad de combinar PNPHO, elastina y condrocitos primarios a las mismas densidades de celulas viables tal como se observa en cartllago de oveja (figura 13). Los condrocitos incrustados persisten de forma anaerobia en lagunas como lo hacen en el cartllago nativo. Este resultado subraya la 30 biocompatibilidad del pollmero sintetizado y el potencial de uso de este constructo para la reparacion de cartllago.
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Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Pollmero para la formacion de un hidrogel, incluyendo el pollmero:
    un primer monomero con capacidad de union a agua en el que el primer monomero es un polieter seleccionado de polietilenglicol (PEG), oligo(etilenglicol) (OEG), poli(oxido de etileno) (PEO), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno) (PPO), copollmeros de bloque o al azar de copoli(oxido de etileno) y poli(alcohol vinllico) (PVA);
    un segundo monomero para conferir propiedades mecanicas a un hidrogel en el que el segundo monomero es un metacrilato o un poliester seleccionado de metacrilato de hidroxietilo (HEMA), poli(acido lactico), poli(caprolactona), poli(glicolida), poli(glicolida-co-lactida), poli(glicolida-co-caprolactona) y copollmeros al azar de los mismos; y
    un tercer monomero para la union a una protelna de la matriz extracelular, en el que el tercer monomero tiene grupos funcionales electrofilos para la union a una protelna de la matriz extracelular seleccionados de N- hidroxisuccinimidas (NHS), N-hidroxisulfosuccinimida (SNHS), succinimida N-hidroxietoxilada (ENHS) y N- acriloxisuccinimida (NAS).
  2. 2. Pollmero segun la reivindicacion 1, en el que el primer monomero es oligo(etilenglicol) (OEG).
  3. 3. Pollmero segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el segundo monomero es el copollmero al azar HEMA-poli(acido
    lactico).
  4. 4. Pollmero segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tercer monomero tiene el grupo funcional electrofilo N-acriloxisuccinimida (NAS).
  5. 5. Pollmero segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pollmero incluye ademas un cuarto monomero para conferir caracterlsticas de transicion de fase a un hidrogel.
  6. 6. Pollmero segun la reivindicacion 5, en el que el cuarto monomero es poli(N-isopropilacrilamida).
  7. 7. Pollmero segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pollmero es un pollmero de formula
    (Ila):
    imagen1
    en la que m es un numero entero desde 1 hasta 10, n es un numero entero desde 1 hasta 10, p es un numero entero desde 1 hasta 10, q es un numero entero desde 1 hasta 10, x es un numero entero desde 1 hasta 1000 e y es un numero entero desde 1 hasta 1000.
  8. 8. Composicion para la formacion de un hidrogel, incluyendo la composicion una protelna de la matriz extracelular y un pollmero segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  9. 9. Composicion segun la reivindicacion 8, en la que la protelna de la matriz extracelular es colageno.
  10. 10. Hidrogel que incluye agua, una protelna de la matriz extracelular y un pollmero segun una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 7.
  11. 11. Hidrogel segun la reivindicacion 10, en el que el hidrogel se forma anadiendo agua a la composicion segun la reivindicacion 8.
  12. 12. Hidrogel segun la reivindicacion 10 u 11, en el que el hidrogel incluye ademas una o mas celulas para ayudar en la reparacion de tejido biologico.
    10 13. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la protelna de la matriz extracelular es
    colageno.
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