ES2573507T3 - Armazones formados de conjugados de polímero-proteína, métodos de generación de los mismos y usos de los mismos - Google Patents

Armazones formados de conjugados de polímero-proteína, métodos de generación de los mismos y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un conjugado que comprende un polipéptido que tiene, unido al mismo, al menos dos restos poliméricos, comprendiendo cada uno de dichos restos poliméricos un poloxámero, en el que dicho polipéptido comprende una proteína de la matriz extracelular.

Description

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DESCRIPCION
Armazones formados de conjugados de poKmero-protema, metodos de generacion de los mismos y usos de los mismos
Campo y antecedentes de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a conjugados de poUmero-protema y, mas particularmente, pero no exclusivamente, a conjugados de polfmero-proterna que forman un armazon, a procesos de generacion de los mismos y a usos de los mismos, por ejemplo, en ingeniena de tejidos.
A medida que evoluciona el campo de la ingeniena de tejidos existe la necesidad de nuevos armazones de biomaterial que puedan proporcionar mas de solo un soporte arquitectonico y mecanico. Estando siendo desarrollados nuevos materiales “tnbridos” como armazones sofisticados en los que polfmeros biologicos tales como alginato, colageno o fibrinogeno se combinan con polfmeros sinteticos para proporcionar versatilidad y bioactividad anadidas en la interfase material/celula. A partir de la perspectiva de las interacciones celulares, los dominios biologicos del material tnbrido pueden participar activamente en estimular las celulas hacia la formacion de tejidos funcionales. Las senales bioactivas estan controladas mediante macromoleculas biologicas tales como segmentos de protema [Cutler y Garcia, Biomaterials 2003, 24:1759-1770], factores de crecimiento [Seliktar et al., J Biomed Mater Res A 2004, 68:704-716; Zisch et al., FASEB J 2003;17:2260-2262; DeLong et al., Biomaterials 2005, 26:3227-3234] o peptidos bioactivos cortos [Mann et al., Biomaterials 2001, 22:3045-3051; Lutolf et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100:5413-5418; Stile y Healy, Biomacromolecules 2001, 2:185-194]. Estos elementos son capaces de influir en la migracion de celulas, proliferacion y diferenciacion guiada [Dikovsky et al., Biomaterials 2006, 27:1496-1506]. Desde la perspectiva de las propiedades de los biomateriales, tambien pueden usarse polfmeros “inteligentes” para proporcionar mejor control con respecto a las caractensticas voluminosas del armazon en respuesta a cambios en la temperatura, pH o luz [Furth et al., Biomaterials 2007, 28:5068-5073; Galaev y Mattiasson, Trends Biotechnol 1999, 17:335-340]. Los materiales tnbridos preparados con polfmeros inteligentes tienen grados adicionales de libertad, que incluyen control con respecto a la densidad aparente, degradabilidad, porosidad y cumplimiento, todos los cuales pueden regularse por el componente de polfmero sintetico [Peppas et al., Annu Rev Biomed Eng 2000, 2:9-29; Tsang y Bhatia, Adv Drug Deliv Rev 2004, 56:1635-1647; 3] Baier Leach et al., Biotechnol Bioeng 2003, 82:578-589].
Se han preparado materiales tnbridos basandose en la conjugacion de protemas endogenas con polfmeros sinteticos versatiles [Almany y Seliktar, Biomaterials 2005, 26:2467-2477; Gonen-Wadmany et al., Biomaterials 2007, 28:3876-3886; Peled et al., Biomed Mater Res A 2007, 80:874-884; Seliktar, Ann N Y Acad Sci 2005, 1047:386-394]. Se ha investigado el efecto de alternar propiedades estructurales de hidrogeles hechos de poli(etilenglicol) (PEG) conjugado con fibrinogeno sobre la morfologfa y la remodelacion de celulas de musculo liso encapsuladas [Dikovsky et al., Biomaterials 2006, 27:1496-1506; Dikovsky et al., Biophys J 2008, 94:2914-2925]. Estos materiales presentaron una capacidad para controlar el comportamiento celular cambiando factores tales como la densidad, rigidez y degradabilidad proteolttica mediante el componente sintetico versatil. El fibrinogeno es un sustrato natural para la remodelacion de tejido que contiene varios dominios de senalizacion de celulas, que incluyen un sustrato de degradacion de proteasa y motivos de adhesion a celula [Herrick et al., Int J Biochem Cell Biol 1999, 31:741-746; Werb, Cell 1997, 91:439-442].
La solicitud de patente internacional PCT/IL2004/001136 (publicada como WO2005/061018) y la solicitud de patente de EE.UU. N.° 11/472.437 describen un armazon biodegradable compuesto de un esqueleto de protema (por ejemplo, fibrinogeno) reticulado por un polfmero sintetico tal como poli(etilenglicol), y metodos de generacion de tales armazones a partir de conjugados de polfmero-protema.
La solicitud de patente internacional PCT/IL2008/000521 (publicada como WO 2008/126092) describe armazones compuestos de albumina o colageno tiolado reticulado por un polfmero sintetico tal como poli(etilenglicol).
Los polfmeros termosensibles inversos son capaces de producir soluciones acuosas de baja viscosidad a temperatura ambiente, y formar un gel a una mayor temperatura. Esta propiedad puede usarse para generar implantes in situ [Cohn et al., Biomacromolecules 2005, 6:1168-1175].
Stile y Healy [Biomacromolecules 2001, 2:185-194] modificaron un polfmero inteligente, N-isopropilacrilamida, con peptidos que contienen RGD (Arg-Gly-Asp) para formar un hidrogel termo-sensible reversible con segmentos bioactivos para estudios de cultivo celular. Informaron de que la conjugacion de peptidos RGD con el polfmero inteligente termo-sensible no comprende la transicion sol-gel inducida por la temperatura de los hidrogeles. Adicionalmente informaron de que el peptido RGD conjugado potencio las interacciones biologicas de la red de polfmero de N-isopropilacrilamida de otro modo inerte.
Tambien se ha informado de polfmeros termo-sensibles inversos que tienen una estructura de tribloque de poli(oxido de etileno) (PEO)-poli(oxido de propileno) (PPO)-PEO, denominados “poloxameros”. La transicion sol-gel
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endotermica tiene lugar debido a un aumento en la entropfa producida por la liberacion de moleculas de agua unidas a los segmentos de PPO a medida que aumenta la temperatura [Alexandridis, Colloid Surface A 1995, 96:1-46].
El poloxamero Pluronic® F127 es un copoUmero de tribloque sintetico muy conocido (PEO99-PPO67-PEO99) [Nagarajan y Ganesh, J Colloid Interface Sci 1996, 184:489-499; Sharma y Bhatia, Int J Pharm 2004, 278:361-377; Cohn et al., Biomaterials 2003, 24:3707-3714], que presenta una propiedad de gelacion termica inversa (GTI) por encima de una temperatura cntica en soluciones acuosas. Cohn et al. [Polym Adv Tech 2007;18:731-736] informaron que F127 polimerizado muestra gelacion termica inversa a menores concentraciones y con propiedades mecanicas potenciadas, en comparacion con F127.
Tecnica anterior adicional incluye Halstenberg et al. [Biomacromolecules 2002, 3:710-723], Cohn et al. [Polym Adv Tech 2007;18:731-736] y la patente de EE.UU. N.° 7.842.667.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define en su sentido mas amplio por las reivindicaciones adjuntas.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un conjugado que comprende una protema de la matriz extracelular que tiene unida a ella al menos dos restos polimericos, comprendiendo cada uno de dichos restos un poloxamero.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una composicion de materia que comprende una forma reticulada de un conjugado descrito en el presente documento, comprendiendo la forma reticulada una pluralidad de moleculas del conjugado reticuladas entre sf.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un proceso de produccion de una composicion de materia descrita en el presente documento, comprendiendo el proceso calentar una solucion de una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento de una primera temperatura a una segunda temperatura, siendo la segunda temperatura de forma que se efectue una gelacion termica inversa del conjugado en la solucion, produciendo asf la composicion de materia.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un proceso de produccion de una composicion de materia descrita en el presente documento, comprendiendo el proceso someter una solucion que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento, comprendiendo el conjugado al menos un resto de reticulacion, a condiciones que efectuan la reticulacion covalente de los restos de reticulacion, produciendo asf la composicion de materia.
Adicionalmente se describe un proceso de produccion de una composicion de materia descrita en el presente documento in vivo, comprendiendo el proceso:
(a) someter una solucion que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento, comprendiendo el conjugado al menos un resto de reticulacion, a condiciones que efectuan la reticulacion covalente ex vivo, para asf producir un armazon covalentemente reticulado; y
(b) someter el armazon covalentemente reticulado a una temperatura fisiologica in vivo, de forma que se efectue una gelacion termica inversa del armazon in vivo, produciendo asf la composicion de materia.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo de control de una propiedad ffsica de una composicion de materia descrita en el presente documento, comprendiendo el metodo control de un parametro seleccionado del grupo que consiste en una concentracion de un conjugado descrito en el presente documento en solucion, una temperatura ambiente, una presencia o ausencia de un iniciador, una dosis de irradiacion durante la reticulacion covalente, y una temperatura de reticulacion.
En el presente documento tambien se desvela un proceso de produccion del conjugado descrito en el presente documento, comprendiendo el proceso unir covalentemente un polfmero a un polipeptido, siendo el polfmero y el polipeptido de forma que al menos dos moleculas de polfmero se unan covalentemente a una molecula del polipeptido, en el que al menos una de las dos moleculas de polfmero presenta una gelacion termica inversa, produciendo asf el conjugado.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un uso de un conjugado descrito en el presente documento o de una composicion de materia descrita en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para reparar dano tisular.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un uso de un conjugado descrito en el presente documento o de una composicion de materia descrita en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para tratar un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por dano o perdida tisular.
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Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una composicion de materia descrita en el presente documento para su uso en reparar dano tisular in vivo induciendo la formacion de un tejido in vivo y/o induciendo una formacion de tejido ex vivo e implantar el tejido obtenido y/o la composicion de materia que comprende el tejido formado en un sujeto.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion hay un conjugado para su uso en reparar el dano tisular in vivo induciendo una formacion de tejido in vivo y/o induciendo una formacion de un tejido ex vivo e implantar el tejido obtenido que comprende el tejido formado en un sujeto.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo de induccion de la formacion de un tejido ex vivo, comprendiendo el metodo someter una composicion de materia que comprende ademas celulas en su interior a condiciones propicias para el crecimiento de las celulas, para asf inducir la formacion de tejido.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una composicion farmaceutica, cosmetica o cosmeceutica que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento, siendo la composicion identificada para su uso en inducir la formacion de un tejido in vivo tras ponerse en contacto con un tejido y adicionalmente tras someter la composicion a una temperatura fisiologica.
Segun un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un kit para inducir la formacion de un tejido, comprendiendo el kit:
(a) un conjugado descrito en el presente documento;
(b) un disolvente acuoso; y
(c) instrucciones para la reticulacion de una solucion acuosa del conjugado con el fin de formar un armazon para inducir la formacion del tejido.
Segun la invencion, cada uno de los restos polimericos presenta una gelacion termica inversa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, al menos uno de los restos polimericos comprende ademas al menos un resto de reticulacion para la reticulacion covalente de una pluralidad de moleculas del conjugado entre su
Adicionalmente se desvelan conjugados de la formula general:
X(-Y-Zm)n
en la que:
X es un polipeptido descrito en el presente documento;
Y es un resto polimerico descrito en el presente documento;
Z es un resto de reticulacion descrito en el presente documento; n es un numero entero superior a 1; y m es 0, 1 o un numero entero superior a 1.
Segun algunos aspectos, el polipeptido comprende una protema o un fragmento de la misma.
Segun la invencion, la protema es una protema de la matriz extracelular. Protemas adicionalmente desveladas se seleccionan del grupo que consiste en una protema de senalizacion de celulas, una protema de adhesion a celula, un factor de crecimiento, protema A, a proteasa y un sustrato de proteasa.
Segun la invencion, la protema de la matriz extracelular esta seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, colageno, fibronectina y elastina.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el polipeptido comprende un fibrinogeno o un fragmento del mismo. Segun algunas realizaciones, la protema se desnaturaliza.
Segun algunas realizaciones, el polipeptido es un fibrinogeno desnaturalizado.
Segun la invencion, al menos dos de los restos polimericos comprenden un poloxamero (copolfmero de poli(oxido de etileno-oxido de propileno)).
Segun la invencion, cada uno de los restos polimericos comprende un poloxamero.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el poloxamero es el poloxamero F127.
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Segun algunas realizaciones de la invencion, al menos uno de los restos polimericos comprende el poUmero T1307. Segun algunas realizaciones de la invencion, los restos polimericos estan seleccionados del grupo que consiste en un polfmero Pluronic® y un polfmero Tetronic®.
Segun algunas realizaciones de la invencion, cada uno de los restos polimericos comprende de 1 a 10 de los restos de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el resto de reticulacion comprende un grupo polimerizable.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el grupo polimerizable es polimerizable por polimerizacion por radicales libres.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el grupo polimerizable esta seleccionado del grupo que consiste en un acrilato, un metacrilato, una acrilamida, una metacrilamida y una vinilsulfona.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el polipeptido es fibrinogeno desnaturalizado y los restos polimericos comprenden el poloxamero F127.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende restos diacrilato del poloxamero F127, en el que un grupo acrilato de cada uno de los restos diacrilato del poloxamero F127 esta unido a un residuo de cistema del fibrinogeno.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el polipeptido es fibrinogeno desnaturalizado y los restos polimericos comprenden el polfmero T1307.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende restos tetra-acrilato de T1307, en el que un grupo acrilato de cada uno de los restos tetra-acrilato de T1307 esta unido a un residuo de cistema del fibrinogeno.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado se caracteriza por una capacidad de someterse a gelacion termica inversa en una solucion acuosa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa se efectua a una concentracion inferior al 10 por ciento en peso del conjugado en la solucion acuosa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa del conjugado aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la solucion acuosa al menos diez veces.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la solucion acuosa a al menos 20 Pa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la solucion acuosa de menos de 2 Pa a al menos 20 Pa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa se produce tras un aumento de la temperatura de 10 °C a 55 °C.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa es reversible.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa forma un gel biodegradable.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado se identifica para su uso en generar un armazon.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado se identifica para su uso en generar reversiblemente un armazon.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el armazon es un hidrogel.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el hidrogel se caracteriza por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos 15 Pa a una temperatura de 37 °C.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el hidrogel es capaz de experimentar una gelacion termica inversa. Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia es un hidrogel.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se genera por una gelacion termica inversa de la pluralidad de moleculas del conjugado en una solucion acuosa.
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Segun algunas realizaciones de la invencion, la pluralidad de moleculas del conjugado se reticulan no covalentemente entre sr
Segun algunas realizaciones de la invencion, la forma reticulada del conjugado es reversible.
Segun algunas realizaciones de la invencion, al menos uno de los restos polimericos comprende un resto de reticulacion, y la pluralidad de moleculas del conjugado se reticulan covalentemente entre sr
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se genera sometiendo una pluralidad de moleculas del conjugado a condiciones para efectuar la reticulacion de los restos de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se caracteriza por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos 20 Pa a una temperatura de 37 °C.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia es capaz de experimentar una gelacion termica inversa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia al menos el 200 %.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia a al menos 15 Pa.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia de un primer valor en un intervalo de 0,5 Pa a 200 Pa a un segundo valor que es al menos el 20 % superior al primer valor.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia de un primer valor a un segundo valor en un intervalo de 20 Pa a 5000 Pa, siendo el segundo valor al menos el 20 % superior al primer valor.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia se produce tras un aumento de la temperatura de 10 °C a 55 °C.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la gelacion termica inversa de la composicion de materia es reversible.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se caracteriza por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de una porcion de la composicion de materia que es diferente de un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos otra porcion de la composicion de materia.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia es biodegradable.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia comprende ademas celulas en su interior.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se identifica para su uso en inducir una formacion de un tejido.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se identifica para su uso en reparar dano tisular.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la composicion de materia se produce in vivo.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la segunda temperatura anteriormente mencionada es una temperatura fisiologica.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende al menos un resto polimerico que comprende ademas al menos un resto de reticulacion, y el proceso comprende ademas someter la solucion a condiciones que efectuan la reticulacion de los restos de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, someter la solucion a las condiciones que efectuan la reticulacion se efectua antes del calentamiento.
Segun algunas realizaciones de la invencion, someter la solucion a las condiciones que efectuan la reticulacion se efectua posterior al calentamiento.
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Segun algunas realizaciones de la invencion, la reticulacion covalente se efectua in vivo.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la reticulacion covalente se efectua ex vivo, para asf producir un armazon covalentemente reticulado, y el proceso comprende ademas someter el armazon covalentemente reticulado a una temperatura fisiologica in vivo, de forma que una gelacion termica inversa del armazon se efectua in vivo, produciendo asf una composicion de materia descrita en el presente documento.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las condiciones comprenden irradiacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, las condiciones comprenden una presencia de un iniciador de radicales libres.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la solucion comprende ademas celulas, y el proceso es para producir una composicion de materia que comprende celulas incorporadas en su interior.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion, y el metodo comprende ademas reticular covalentemente la pluralidad de moleculas del conjugado.
Segun algunas realizaciones de la invencion, la reticulacion se efectua sometiendo la pluralidad de moleculas del conjugado a condiciones que efectuan la reticulacion covalente del resto de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion, y la composicion descrita en el presente documento se identifica para su uso en inducir la formacion de un tejido tras someter adicionalmente la pluralidad de moleculas del conjugado a condiciones que efectuan la reticulacion covalente del resto de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, una composicion farmaceutica, cosmetica o cosmeceutica descrita en el presente documento comprende ademas un iniciador para inducir la reticulacion covalente del resto de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, una composicion farmaceutica, cosmetica o cosmeceutica descrita en el presente documento se envasa en un material de envasado y se identifica impreso, en o sobre el material de envasado, para su uso en inducir la formacion del tejido.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion, y el kit comprende ademas un iniciador para inducir la reticulacion covalente del resto de reticulacion.
Segun algunas realizaciones de la invencion, el kit comprende ademas celulas para incorporar en el armazon descrito en el presente documento.
Breve descripcion de los dibujos
Algunas realizaciones de la invencion se describen en el presente documento, a modo de ejemplo solo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia espedfica ahora a los dibujos en detalle, se acentua que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y para fines de discusion ilustrativa de realizaciones de la invencion. A este respecto, la descripcion tomada con los dibujos hace evidente para aquellos expertos en la materia como pueden ponerse en practica las realizaciones de la invencion.
En los dibujos:
Las FIGs. 1A y 1B son esquemas que muestran la smtesis de diacrilato del poloxamero F127 (FIG. 1A) a partir del poloxamero F127 y cloruro de acriloMo en una mezcla 1:2 de diclorometano (DCM) y tolueno con trietilamina ((Et)3N) a temperatura ambiente (T.A.), y la smtesis de un conjugado de poloxamero F127-fibrinogeno (FF127) usando el diacrilato del poloxamero (FIG. 1B) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con urea 8 M, segun algunas realizaciones de la invencion;
la FIG. 2 presenta representaciones comparativas que muestran el modulo de almacenamiento (G') de soluciones de FF127 a concentraciones de fibrinogeno de 4, 6 y 8 mg/ml, en funcion de la temperatura; el grafico anadido muestra el modulo de almacenamiento (G') y el modulo de perdida (G'') de una solucion FF127 con 8 mg/ml de fibrinogeno; las FIGs. 3A y 3B presentan graficos que muestran los modulos de almacenamiento de soluciones de FF127 con (FIG. 3B) y sin (FIG. 3A) reticulacion qrnmica (covalente) de FF127 en funcion del tiempo con cambios de temperatura dclicos entre 15 °C y 37 °C, en presencia de 0, 1 o 0,01 mg/ml de colagenasa, y en ausencia de colagenasa;
la FIG. 4 es una ilustracion esquematica de polipeptidos de fibrinogeno (rojo, verde y azul) conjugados con un polfmero (negro) y ensamblaje de hidrogel segun algunas realizaciones de la invencion por reticulacion reversible (no covalente) del polfmero en una manera dependiente de la temperatura o reticulacion (covalente) inducida por UV irreversible;
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la FIG. 5 es una grafica que muestra un aumento reversible en el modulo de almacenamiento (G') de una solucion de FF127 aumentando la temperatura ambiente (Tamb) y un posterior aumento inducido por UV irreversible posterior del modulo de almacenamiento;
la FIG. 6 presenta representaciones comparativas que muestran el modulo de almacenamiento (G') de un FF127 qmmicamente (covalentemente) reticulado a concentraciones de fibrinogeno de 4, 6 y 8 mg/ml, en funcion de la temperatura; el grafico anadido muestra el modulo de almacenamiento (G') y el modulo de perdida (G'') de un FF127 qmmicamente (covalentemente) reticulado con 8 mg/ml de fibrinogeno;
las FIGs. 7A y 7B presentan graficos que muestran el efecto de la tension oscilante y los cambios de temperatura sobre el modulo de almacenamiento (G'; FIG. 7A) y el modulo de perdida (G''; FIG. 7B) de hidrogeles de 8 mg/ml de FF127 con (lmea negra) y sin (lmea de puntos) reticulacion qmmica (covalente) (las temperaturas fueron en ciclos entre 37 °C (lmeas rojas) y 15 °C (lmeas azules) a una tasa de 1 °C/segundo; la frecuencia de oscilacion fue 1 Hz; la deformacion fue del 2 %);
la FIG. 8 presenta una grafica que muestra el modulo de almacenamiento (G') de hidrogeles de FF127 (8 mg/ml de fibrinogeno) reticulados (covalentemente) por aplicacion de luz UV a diferentes temperaturas de reticulacion (Tret), tras la exposicion a temperaturas ambiente (Tamb) (antes Tamb = 37 °C, Tamb = Tret);
la FIG. 9 es un grafico de barras que muestra la relacion de hinchamiento de hidrogeles de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) formados con temperaturas de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C y un hidrogel formado a partir de conjugados de PEG de 12 kDa-fibrinogeno reticulados (PF12kDa), a temperaturas ambiente (Tamb) de 4 °C y 37 °C; las FIGs. 10A y 10B son imagenes que muestran los diametros (marcados por drculos negros) de hidrogeles de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) qmmicamente (covalentemente) reticulados a una temperatura de 21 °C (FIG. 10A) o 37 °C (FIG. 10B), y luego sometidos a temperaturas ambiente de 37 °C; las imagenes a la izquierda muestran los hidrogeles a la temperatura de reticulacion inmediatamente despues de la reticulacion qmmica, y las imagenes a la derecha muestran los hidrogeles qmmicamente (covalentemente) reticulados despues de incubacion a 37 °C; la FIG. 11 presenta representaciones comparativas que muestran la degradacion en solucion de tripsina de hidrogeles formados por reticulacion de FF127 o conjugado de PEG de 12 kDa-fibrinogeno (PF12) a una temperatura de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C (se indican los modulos de almacenamiento (G') y semividas de degradacion (t50) de los hidrogeles);
la FIG. 12 es un grafico de barras que muestra el modulo de almacenamiento (G') de hidrogeles formados por reticulacion de FF127 (a una temperatura de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C), conjugado de PEG de 12 kDa- fibrinogeno (PF12kDa) o diacrilato de F127 (F127-DA), a una temperatura ambiente (Tamb) de 37 °C; las FIGs. 13A y 13B son esquemas que ilustran la smtesis (FIG. 13A) de un conjugado de T1307-fibrinopeptido (FT- 1307) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con urea 8 M a temperatura ambiente (T.A.), y la estructura del conjugado (FIG. 13B), segun algunas realizaciones de la invencion;
las FIGs. 14A y 14B presentan representaciones comparativas (FIG. 14A) y un grafico de barras (FIG. 14B) que muestra el modulo de almacenamiento (G') de hidrogeles FT-1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) reticulados a una temperatura (Tret) de 4 °C, 21 °C o 37 °C, en funcion de la temperatura ambiente (FIG. 14A), y como media ± EEM de 4 muestras a una temperatura ambiente de 37 °C (FIG. 14B);
la FIG. 15 es un grafico de barras que muestra la relacion de hinchamiento (Qm) de hidrogeles de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) reticulados a una temperatura (Tret) de 4 °C, 21 °C o 37 °C, a una temperatura ambiente (Tamb) de 4 °C y 37 °C;
la FIG. 16 es un grafico de barras que muestra la semivida de biodegradacion (T1/2) en solucion de tripsina de hidrogeles de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) reticulados a una temperatura (Tret) de 4 °C, 21 °C o 37 °C; la FIG. 17 presenta imagenes que muestran fibroblastos de prepucio humano sembrados en hidrogeles formados por reticulacion de FF127 (a una temperatura de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C), conjugado de PEG de 12 kDa- fibrinogeno (PEG-Fib 12kDa), o diacrilato de F127 (F127-DA), 3 y 6 dfas despues de la siembra (barra de escala = 100 pm);
la FIG. 18 es una imagen que muestra fibroblastos de prepucio humano sembrados en hidrogeles de FF127 con reticulacion (ffsica + qmmica) y sin qmmica (ffsica) de FF127 (a una temperatura de reticulacion de 37 °C), 3 y 6 dfas despues de la siembra (barra de escala = 100 pm);
la FIG. 19 es una grafica que muestra la viabilidad de fibroblastos de prepucio humano sembrados durante 0 o 3 dfas en hidrogeles formados por reticulacion de FF127 a una temperatura de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C (se indican los modulos de almacenamiento (G') y las semividas de degradacion (t50) de los hidrogeles); las FIGs. 20A y 20B son una imagen (FIG. 20A) y una grafica (FIG. 20B) que muestran la invasion celular de tejido de musculo liso en hidrogeles formados por reticulacion de FF127 (a una temperatura de reticulacion (Tret) de 21 °C o 37 °C) o conjugado de PEG de 12 kDa-fibrinogeno (PF12kDa), en los dfas 1, 3 y 5 despues de la encapsulacion del tejido en el hidrogel; la FIG. 20B muestra la distancia de invasion en funcion del tiempo (barra de escala = 100 pm);
la FIG. 21 es una imagen que muestra fibroblastos de prepucio humano 3 horas, 3 dfas o 6 dfas despues de sembrarse en hidrogeles FT1307 con modulos de almacenamiento de 52, 244 o 373 Pa (las celulas viables se tinen con calcema (verde) y las celulas no viables se tinen con etidio (naranja); barra de escala = 100 pm); la FIG. 22 es una imagen que muestra celulas HeLa 3 horas, 3 dfas o 6 dfas despues de sembrarse en hidrogeles FT1307 con modulos de almacenamiento de 52, 244 o 373 Pa (las celulas viables se tinen con calcema (verde) y las celulas no viables se tinen con etidio (naranja); barra de escala = 100 pm);
las FIGs. 23A y 23B representan la preparacion de una capsula de FF127 sembrada en celulas incorporada en un hidrogel de FT1307, segun algunas realizaciones de la invencion;
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las FIGs. 24A y 24B son fotograffas que muestran una capsula de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) sembrada con fibroblastos de prepucio humano (verde) incorporada durante 6 d^as en un hidrogel de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) que tiene un modulo de almacenamiento de 373 Pa (FIG. 24A) o 52 Pa (FIG. 24B) (barra de escala = 200 pm);
las FlGs. 25A y 25B son fotograffas que muestran una capsula de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) sembrada con celulas HeLa (verde) incorporada durante 6 dfas en un hidrogel de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) que tiene un modulo de almacenamiento de 373 Pa (FIG. 25A) o 52 Pa (FIG. 25B) (barra de escala = 200 pm); las FIGs. 26A y 26B son fotograffas que muestran capsulas de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) sembradas con un co-cultivo de fibroblastos de prepucio humano (tenido de verde) y celulas HeLa (tenido de rojo) en el dfa 0 (FIG. 26A) y en el dfa 5 (FIG. 26B) de ser incorporadas en un hidrogel de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) (los cffculos discontinuos en la FIG. 26B muestran el diametro del cultivo celular en el dfa 0, barra de escala = 200 pm); y las FIGs. 27A y 27B son fotograffas que muestran capsulas de FF127 (6 mg/ml de fibrinogeno) sembradas con un co-cultivo de fibroblastos de prepucio humano (tenido de verde) y celulas HeLa (tenido de rojo) en el dfa 0 (FIG. 26A) y en el dfa 5 (FIG. 26B) de ser incorporadas en un hidrogel de FT1307 (6 mg/ml de fibrinogeno) (barra de escala = 200 pm).
Descripcion de realizaciones espedficas de la invencion
La conjugacion de un poffmero sintetico con una protema natural tal como fibrinogeno proporciona un medio de creacion de hidrogeles biocompatibles mientras que controla sus propiedades ffsicas. La reaccion de conjugacion pretende dotar a la protema constituyente de versatilidad estructural adicional, sin comprometer su biocompatibilidad.
Los presentes inventores han desvelado previamente una metodologfa de generacion de hidrogeles preparados a partir de un poffmero sintetico tal como poli(etilenglicol) (PEG) conjugado con fibrinogeno, que permite controlar el comportamiento celular de los hidrogeles formados manipulando factores tales como la densidad, rigidez y degradabilidad proteofftica mediante el componente sintetico versatil.
En una busqueda de metodologfas para generar hidrogeles con control mejorado de las caractensticas del hidrogel, los presentes inventores han disenado y puesto satisfactoriamente en practica una metodologfa de generacion de hidrogeles “inteligentes”, conjugando con protemas un poffmero sintetico que presenta una propiedad de gelacion termica inversa (GTI) por encima de una temperatura cntica en soluciones acuosas.
Se encontro que esta metodologfa produda hidrogeles con un control excepcional de las caractensticas ffsicas de los hidrogeles, ya que permiffa manipular estas caractensticas seleccionando, por ejemplo, el grado y la naturaleza de las reacciones de reticulacion que conducen a la formacion de gel. Como no se habfa descubierto que los conjugados de protema-poffmero presentaran una propiedad de gelacion termica inversa, el grado y la aparicion de reticulacion no covalente (ffsica) puede controlarse, por lo que pueden seleccionarse condiciones qmmicas para efectuar la reticulacion covalente, si se desea.
Asf, usando una combinacion de reticulacion por foto-polimerizacion y temperatura, se demostro un control excepcional sobre las propiedades ffsicas de los hidrogeles generados. Tambien se ha demostrado la capacidad de los hidrogeles generados para actuar de una matriz para el crecimiento y la supervivencia de celulas y tejido (por ejemplo, como armazon).
Los presentes inventores han demostrado la novedosa metodologfa, a la vez que utilizan el poloxamero F127 Pluronic® y el copoffmero Tetronic® T1307 (un derivado de poloxamero) que estan funcionalizados en los extremos con grupos acrilo y se hacen reaccionar con fibrinogeno desnaturalizado mediante una reaccion de adicion de tipo Michael para formar un conjugado de protema-copoffmero. Estos conjugados polimericos a modo de ejemplo podnan reticularse para formar una estructura que comprende multiples unidades (“ummeros”) del conjugado. Se realizaron mediciones reologicas sobre los ummeros funcionalizados y los hidrogeles generados a partir de los mismos con el fin de caracterizar la respuesta ffsica de estos conjugados a esffmulos medioambientales (por ejemplo, sensibilidad a la temperatura).
Los presentes inventores han descubierto asf adicionalmente que los hidrogeles generados retienen la biocompatibilidad de su constituyente de fibrinogeno con la ventaja anadida de precision potenciada en el control de las propiedades ffsicas de la red polimerica usando el constituyente F127 sintetico.
Se mostro que la reaccion de conjugacion no elimina las propiedades de auto-ensamblaje de F127, sino que las potencia, dotando asf a los conjugados de protema-poffmero obtenidos de las propiedades de gelacion termica inversa (GTI). Asf, se descubrio que el conjugado de poloxamero-fibrinogeno experimenta sorprendentemente gelacion a bajas concentraciones (por ejemplo, inferiores a 20 mg/ml de conjugado), que son considerablemente inferiores a las concentraciones necesarias para la gelacion termica inversa del poloxamero solo. Esto indica que la protema actua de sustancia de relleno de las cadenas permitiendo que el conjugado de poloxamero-protema experimente gelacion a estas concentraciones excepcionalmente menores.
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La capacidad para obtener hidrogeles a bajas concentraciones de conjugado es ventajosa para aplicaciones tales como regeneracion de tejido, debido a que tales hidrogeles son mejor aptos para permitir el crecimiento celular y la migracion dentro de un hidrogel.
Usando una combinacion de reticulacion por foto-polimerizacion y temperatura se demostro un excepcional control sobre las propiedades ffsicas de los hidrogeles generados. Tambien se ha demostrado la capacidad de los hidrogeles generados para actuar de una matriz para el crecimiento y la supervivencia de celulas y tejido.
Con referencia ahora a los dibujos, las Figuras 1A y 1B ilustran la smtesis de un conjugado de poloxamero F127- fibrinogeno a modo de ejemplo.
La Figura 2 muestra la gelacion del conjugado por un aumento de la temperatura (es decir, gelacion termica inversa) a diversas concentraciones, que incluye a concentraciones de conjugado inferiores a 20 mg/ml. Tales concentraciones son inferiores a las concentraciones que permiten la gelacion termica inversa del poloxamero F127 solo, que indica que la conjugacion con el fibrinogeno potencio las propiedades de GTI del poloxamero actuando como sustancia de relleno de cadenas.
Las Figuras 3A y 3B muestran que la gelacion termica inversa del conjugado es reversible, de forma que la gelacion puede inducirse e invertirse repetidamente, incluso despues de haberse reticulado covalentemente el conjugado (Figura 3B). La Figura 6 muestra la gelacion termica inversa del conjugado covalentemente reticulado a diversas concentraciones.
La Figura 4 ilustra dos tipos de reticulacion que las moleculas del conjugado pueden experimentar para formar un hidrogel; una reticulacion dependiente de la temperatura reversible de moleculas conjugadas (por gelacion termica inversa), y una reticulacion irreversible inducida por luz UV. La Figura 5 muestra aumentos en el modulo de almacenamiento al cizallamiento resultante de tanto reticulacion reversible como irreversible de moleculas de conjugado.
Las Figuras 7A y 7B muestran los diferentes comportamientos de hidrogeles covalentemente reticulados y no covalentemente reticulados a modo de ejemplo en respuesta a la tension. Las Figuras 7A y 7B tambien muestran que, despues de colapsar en respuesta a la tension, ambos tipos de hidrogel se recuperan completamente despues de reducir y aumentar la temperatura, de manera que anulan y recuperan la gelacion termica inversa.
Las Figuras 8 y 12 muestran que el modulo de almacenamiento al cizallamiento de hidrogeles covalentemente reticulados a modo de ejemplo depende fuertemente de la temperatura a la que el conjugado se reticula covalentemente. La Figura 11 muestra que el efecto de la temperatura de reticulacion sobre la biodegradabilidad es considerablemente mas debil, y que la biodegradabilidad esta afectada mas por el tipo de poffmero conjugado con la protema.
Las Figuras 9-10B muestran que las propiedades de hinchamiento de hidrogeles de poloxamero-fibrinogeno covalentemente reticulados son dependientes de la temperatura (a diferencia de los hidrogeles de PEG-fibrinogeno reticulados), y que el grado de dependencia de la temperatura esta afectado por la temperatura de reticulacion.
Las Figuras 13A y 13B ilustran la smtesis de un conjugado de T1307-fibrinogeno a modo de ejemplo, en la que cada resto T1307 en el conjugado comprende tres restos de reticulacion de acrilato.
Las Figuras 14A y 14B muestran que el modulo de almacenamiento al cizallamiento de hidrogeles de T1307- fibrinogeno covalentemente reticulados depende fuertemente de la temperatura a la que el conjugado se reticula covalentemente. La Figura 15 muestra que las propiedades de hinchamiento de hidrogeles de T1307-fibrinogeno covalentemente reticulados son dependientes de la temperatura, y que el grado de dependencia de la temperatura esta afectado por la temperatura de reticulacion. La Figura 16 muestra que la biodegradabilidad no se correlacionada claramente con la temperatura de reticulacion.
Los resultados presentados en las Figuras 14A-16 indican que las propiedades de hidrogeles que contienen T1307 son similares a aquellas de hidrogeles que contienen el poloxamero F127.
Las Figuras 17-22 y 24A-27B muestran que hidrogeles a modo de ejemplo pueden servir de matrices para el crecimiento celular e invasion, y que la tasa y tipo de crecimiento e invasion celular depende de la temperatura de reticulacion covalente de los hidrogeles. Las Figuras 26A-27B muestran los efectos de diferentes propiedades de hidrogeles sobre el crecimiento celular en un co-cultivo de diferentes tipos de celulas.
Las Figuras 23A y 23B ilustran un proceso a modo de ejemplo para preparar una capsula de hidrogel con un conjunto de propiedades ffsicas, incorporada dentro de un hidrogel con un conjunto diferente de propiedades ffsicas.
Asf, se ha demostrado que los conjugados de poffmero-fibrinogeno segun realizaciones a modo de ejemplo de la invencion pueden reticularse facilmente para formar armazones de hidrogel. Ademas, puede combinarse facilmente la reticulacion no covalente y covalente. Los hidrogeles presentan alta flexibilidad, biodegradabilidad, buena
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biofuncionalidad y soporte para la diseminacion e invasion de celulas, y un modulo de almacenamiento al cizallamiento que puede controlarse facilmente por diversos parametros. La temperatura a la que se realiza la reticulacion covalente fue particularmente util para controlar el modulo de almacenamiento al cizallamiento, ya que tiene relativamente poco efecto sobre otras propiedades, tales como la biodegradabilidad.
Segun un aspecto de la presente invencion, se proporciona un conjugado que comprende un polipeptido que tiene unida a el al menos dos restos polimericos, comprendiendo al menos de los restos polimericos un poloxamero en el que dicho polipeptido comprende una protema de la matriz extracelular. Los restos polimericos presentan una gelacion termica inversa.
Como se usa en el presente documento, la expresion “gelacion termica inversa” describe una propiedad por la cual una sustancia (por ejemplo, una solucion acuosa de un compuesto) aumenta en viscosidad tras un aumento en la temperatura. El aumento en la viscosidad puede ser, por ejemplo, conversion de un estado lfquido a un estado semisolido (por ejemplo, gel), conversion de un estado lfquido a un estado lfquido mas viscoso, o conversion de un estado semisolido a un estado semisolido mas ngido. En el presente documento, todas aquellas conversiones estan englobadas por el termino “gelacion”. El aumento en la temperatura que efectua la gelacion puede estar entre dos temperaturas cualesquiera. Opcionalmente, la gelacion se efectua a una temperatura dentro del intervalo de 0 °C a 55 °C.
En el presente documento, se considera que un resto polimerico presenta una gelacion termica inversa cuando una solucion acuosa de un polfmero que se corresponde con el resto polimerico (por ejemplo, un polfmero no unido al polipeptido anteriormente mencionado) presenta una gelacion termica inversa, como se describe en el presente documento.
Una variedad de polfmeros presentan una gelacion termica inversa. Cada polfmero puede caracterizarse por una temperatura de gelacion cntica, en la que la gelacion se efectua a la temperatura de gelacion cntica o a temperaturas por encima de la temperatura de gelacion cntica.
En el presente documento, “temperatura de gelacion cntica” se refiere a la temperatura mas baja a la que se observa algo de gelacion de un material (por ejemplo, por aumento en el modulo de almacenamiento al cizallamiento).
El resto polimerico puede seleccionarse para conferir al conjugado que contiene el mismo una gelacion termica inversa que se caracteriza por una temperatura de gelacion cntica dentro de un intervalo de temperatura (por ejemplo, en un intervalo de 0 °C a 55 °C) que permite la conveniente manipulacion de las propiedades del conjugado por exposicion a una temperatura ambiente por encima y/o por debajo de la temperatura de gelacion cntica.
La temperatura de gelacion cntica del polfmero puede seleccionarse, por ejemplo, basandose en el uso previsto o propiedades deseadas de un conjugado. Por ejemplo, la temperatura de gelacion cntica puede seleccionarse de forma que el conjugado este en un estado gelificado a una temperatura fisiologica, pero no a temperatura ambiente, de forma que la gelacion pueda efectuarse in vivo. En otro ejemplo, la temperatura de gelacion cntica puede seleccionarse de forma que el conjugado este en un estado de gelificacion a temperatura ambiente, pero no a una temperatura moderadamente mas baja, de forma que la gelacion pueda efectuarse, por ejemplo, por eliminacion de la refrigeracion.
El resto polimerico comprende opcionalmente un polfmero sintetico. Los poloxameros (por ejemplo, poloxamero F127) son polfmeros a modo de ejemplo que presentan una gelacion termica inversa a temperaturas.
Como se usa en el presente documento y en la materia, un “poloxamero” se refiere a copolfmero de bloque de poli(oxido de etileno) (PEO) - poli(oxido de propileno) (PPO) que tiene una estructura PEO-PPO-PEO. Poloxameros adecuados estan comercialmente disponibles, por ejemplo, como los polfmeros Pluronic®.
Normalmente, la gelacion termica inversa esta mediada por la formacion de reticulacion no covalente (por ejemplo, mediante interacciones hidrofobas, interacciones ionicas y/o enlace de hidrogeno) entre moleculas, en la que el grado de reticulacion no covalente aumenta en respuesta a un aumento de temperatura.
En el presente documento, reticulacion “no covalente” (formada como resultado de una gelacion termica inversa) tambien se denomina reticulacion “ffsica” o “reticulacion no qmmica”. La reticulacion no covalente puede, por tanto, entenderse como una reticulacion dependiente de la temperatura.
El resto polimerico puede comprender uno o mas restos que efectuan reticulacion no covalente (por ejemplo, restos hidrofobos). El grado de gelacion y las condiciones (por ejemplo, temperatura) bajo las que se efectua la gelacion pueden controlarse opcionalmente por la naturaleza y el numero de restos que participan en la reticulacion no covalente.
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El resto polimerico puede comprender de 1 y hasta 100 e incluso 1000 restos que participan en la reticulacion no covalente. En muchas realizaciones, cuanto mayor sea el numero de tales restos, y mayores sean los restos (por ejemplo, mayores son los pesos moleculares), a menor temperature se efectua la gelacion.
El resto polimerico puede comprender uno o mas tipos de restos que efectuan la reticulacion. Estos restos pueden efectuar la reticulacion no covalente mediante las mismas interacciones intermoleculares (por ejemplo, interacciones hidrofobas) o mediante diferentes interacciones intermoleculares (por ejemplo, interacciones hidrofobas e ionicas). Los polfmeros que presentan gelacion termica inversa (tambien denominados en la materia polfmeros GTI) incluyen, pero no se limitan a, poli(N-isopropilacrilamida), que experimenta gelacion termica inversa a temperaturas por encima de aproximadamente 32-33 °C, ademas de copolfmeros de los mismos (por ejemplo, poli(N- isopropilacrilamida-co-dimetil-Y-butirolactona), copoKmeros de bloque de poli(etilenglicol)-poli(aminouretano) (PEG- PAU), copolfmeros de bloque de poli(£-caprolactona)-poli(etilenglicol) (PCL-PEG) (por ejemplo, PCL-PEG-PCL), y poli(metil 2-propionamidoacrilato). Ademas, se han descrito poliorganofosfacenos con PEG y grupos laterales de oligopeptido hidrofobo (que proporcionan interacciones hidrofobas intermoleculares), que gelifican a temperaturas de 35-43 °C [Seong et al., Polymer 2005, 46:5075-5081].
Por ejemplo, un resto de poloxamero comprende un resto PPO hidrofobo que media en la gelacion. Un resto polimerico puede comprender opcionalmente un resto PPO tal, o alternativamente, una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, etc., hasta 100 e incluso 1000 de tales restos) de tales restos.
Similarmente, los copolfmeros de PCL-PEG comprenden PEG hidrofilo y un resto de poli(£-caprolactona) (PCL) relativamente hidrofobo, y los copolfmeros de PEG-PAU comprenden PEG hidrofilo y un resto de poli(aminouretano) (PAU) hidrofobo (por ejemplo, un resto de polfmero de condensacion de bis-1,4-(hidroxietil)piperazina - 1,6- diisocianatohexametileno).
Asf, en general, pueden prepararse muchos polfmeros de bloque que presentan gelacion termica inversa a partir de una combinacion de unidades estructurales hidrofilas e hidrofobas.
En algunas realizaciones, cada resto polimerico comprende un poloxamero (por ejemplo, poloxamero F127). Opcionalmente, un resto polimerico comprende un poloxamero.
Alternativamente o adicionalmente, al menos un resto polimerico comprende una pluralidad de restos de poloxamero. Los polfmeros que comprenden una pluralidad de restos de poloxamero estan comercialmente disponibles, por ejemplo, como polfmeros Tetronic®. T1307 (por ejemplo, Tetronic® T1307) es un polfmero a modo de ejemplo que comprende cuatro restos de poloxamero.
Segun realizaciones opcionales, al menos uno de los restos polimericos comprende ademas al menos un resto de reticulacion para la reticulacion covalente de una pluralidad de moleculas del conjugado entre sf. Opcionalmente, el resto polimerico comprende de 1 a 10, opcionalmente de 1 a 5, y opcionalmente de 1 a 3 restos de reticulacion.
Debe observarse que la expresion “resto de reticulacion” se usa en el presente documento para describir restos que estan unidos al resto polimerico (por ejemplo, como grupo terminal o como grupos laterales), o que forman una parte integral del resto polimerico, incluso se diferencia de aquellos restos en el resto polimerico que efectuan la reticulacion no covalente, como se describe anteriormente en este documento.
Un “resto de reticulacion”, como se usa en el presente documento, describe asf restos sobre el resto polimerico que efectuan la reticulacion covalente, como se define en el presente documento, entre moleculas del conjugado.
En el presente documento, “reticulacion covalente” (tambien denominada en el presente documento “reticulacion qmmica”) se refiere a una formacion de un enlace covalente (“reticulacion”) entre dos o mas moleculas (por ejemplo, dos moleculas de conjugado descritas en el presente documento). Una molecula puede unirse a una pluralidad de otras moleculas, estando cada otra molecula unida por un enlace covalente diferente. Asf, pueden ligarse juntas una pluralidad de moleculas (por ejemplo, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100).
Un conjugado como se describe pueden opcionalmente representarse por la formula general:
X(-Y-Zm)n
en la que X es un polipeptido como se describe en el presente documento, Y es un resto polimerico como se describe en el presente documento, Z es un resto de reticulacion como se describe en el presente documento, n es un numero entero superior a 1 (por ejemplo, 2, 3, 4 y hasta 20), y m representa el numero de restos de reticulacion por resto polimerico. Asf, m es 0 en realizaciones que carecen del resto de reticulacion opcional, y m es 1 o un numero entero superior a 1, en aspectos que comprenden el resto de reticulacion opcional.
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Debe entenderse que como la formula anterior incluye mas de un resto -Y-Zm, diferentes restos -Y-Zm en un conjugado puede tener opcionalmente un valor diferente para m.
Como se usa en el presente documento, la expresion “resto de reticulacion” se refiere a un resto (por ejemplo, un grupo funcional) caracterizado por una capacidad para efectuar la reticulacion covalente con un grupo funcional de otra molecula (por ejemplo, otro conjugado).
Segun realizaciones opcionales, el resto de reticulacion es capaz de efectuar la reticulacion con un conjugado similar a y/o identico al conjugado descrito en el presente documento (por ejemplo, un conjugado que comprende un resto de reticulacion qmmicamente relacionado con y/o identico al resto de reticulacion del conjugado descrito en el presente documento).
Asf, el resto de reticulacion descrito en el presente documento proporciona un conjugado con una capacidad para experimentar reticulacion covalente, mientras que un resto polimerico que presenta gelacion termica inversa, como se describe en el presente documento, proporciona un conjugado con una capacidad para experimentar reticulacion no covalente (auto-ensamblaje). Por tanto, en realizaciones sin un resto de reticulacion (por ejemplo, en las que m en la formula general es 0), la reticulacion del conjugado puede efectuarse unicamente por reticulacion no covalente por el resto polimerico, mientras que en realizaciones con un resto de reticulacion (por ejemplo, en la que m en la formula general es 1 o mas), la reticulacion del conjugado puede efectuarse por reticulacion no covalente y/o por reticulacion covalente, como se trata en mas detalle en el presente documento.
Restos de reticulacion a modo de ejemplo que son adecuados para su uso en el contexto de realizaciones de la invencion incluyen, pero no se limitan a, grupos polimerizables, como se detalla adicionalmente en el presente documento mas adelante.
Asf, en algunas realizaciones, el resto de reticulacion comprende un grupo polimerizable, de forma que la reticulacion pueda efectuarse por polimerizacion del grupo polimerizable. En el contexto de realizaciones de la presente invencion, los grupos polimerizables pueden actuar de monomeros, por lo que la polimerizacion de los grupos polimerizables reticula los conjugados que comprenden los grupos polimerizables.
Se conocen en la tecnica muchos grupos polimerizables, que incluyen grupos (por ejemplo, grupos insaturados) que experimentan facilmente polimerizacion por radicales libres, y grupos dclicos (por ejemplo, lactonas) que experimentan facilmente polimerizacion mediante abertura de anillo. La polimerizacion puede efectuarse, por ejemplo, mediante fotoiniciacion (en presencia de una luz apropiada, por ejemplo, 365 nm), mediante reticulacion qmmica (en presencia de un donante de radicales libes) y/o calentamiento (a las temperaturas apropiadas).
En algunas realizaciones, un grupo polimerizable se selecciona de forma que la polimerizacion del mismo pueda efectuarse bajo condiciones relativamente suaves que no son perjudiciales para las celulas vivas. Por ejemplo, las condiciones de polimerizacion son opcionalmente suficientemente no toxicas y no perjudiciales, de manera que son adecuadas para efectuar la polimerizacion in vivo, como se describe en el presente documento.
Debe observarse que la reticulacion covalente puede efectuarse tambien en presencia de un agente de reticulacion. Un agente tal normalmente es un resto qmmico bifuncional que es capaz de reaccionar con el grupo de reticulacion. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, PEG terminados en ambos extremos con un grupo reactivo que puede reaccionar facilmente con el grupo de reticulacion.
En algunas realizaciones, el grupo polimerizable es polimerizable por polimerizacion por radicales libres. Ejemplos de tales grupos incluyen, sin limitacion, un acrilato, un metacrilato, una acrilamida, una metacrilamida y una vinilsulfona.
Segun realizaciones opcionales, el conjugado comprende un resto polimerico que comprende una pluralidad de restos de reticulacion que pueden unirse a un polipeptido. Por ejemplo, acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida y vinilsulfona, ademas de ser grupos polimerizables, son adecuados para la union a un grupo tiol (por ejemplo, en un residuo de cistema) mediante adicion de tipo Michael.
Asf, como se ejemplifica en la seccion de ejemplos en el presente documento, un resto polimerico puede comprender una pluralidad de tales restos (por ejemplo, acrilato), uno de los cuales une el resto polimerico al polipeptido, siendo los restos restantes restos de reticulacion como se describe en el presente documento.
Asf, en realizaciones a modo de ejemplo, el conjugado comprende restos diacrilato del poloxamero (por ejemplo, diacrilato del poloxamero F127), en el que un grupo acrilato en cada resto esta unido a un residuo de cistema de un polipeptido (por ejemplo, fibrinogeno desnaturalizado), y un grupo acrilato sirve de resto de reticulacion.
En realizaciones adicionales a modo de ejemplo, el conjugado comprende restos tetraacrilato polimericos (por ejemplo, tetraacrilato de T1307), en el que un grupo acrilato en cada resto esta unido a un residuo de cistema de un polipeptido (por ejemplo, fibrinogeno desnaturalizado), y tres grupos acrilato sirven de restos de reticulacion.
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El polipeptido del conjugado tiene al menos 10 aminoacidos de longitud, opcionalmente al menos 20 aminoacidos de longitud, y opcionalmente al menos 50 aminoacidos de longitud.
El termino “polipeptido”, como se usa en el presente documento, engloba polipeptidos nativos (tanto productos de degradacion, polipeptidos sinteticamente sintetizados como polipeptidos recombinantes) y peptidomimeticos (normalmente, polipeptidos sinteticamente sintetizados), ademas de peptoides y semipeptoides que son analogos de polipeptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que convierten los polipeptidos en mas estables mientras estan en un cuerpo o mas capaces de penetrar en las celulas. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificacion del extremo N, modificacion del extremo C, modificacion del enlace peptfdico, que incluye, pero no se limita a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones del esqueleto y modificacion de residuos. Los metodos de preparacion de compuestos peptidomimeticos son muy conocidos en la tecnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)), que se incorpora por referencia como si se expusiera completamente en el presente documento. Mas detalles a este respecto se proporcionan en el presente documento mas adelante.
Los enlaces peptfdicos (-CO-NH-) dentro del peptido pueden estar sustituidos, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CHa)-CO-), enlaces ester (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces -aza (-NH-N(R)- CO-), en la que R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (- CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefmicos (-CH=CH-), enlaces retro-amida (-NH-CO-), derivados de peptido (-N(R)-CH2-CO-), en la que R es la cadena lateral “normal”, naturalmente presentada sobre el atomo de carbono. Estas modificaciones pueden producirse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena de polipeptidos e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo.
Como se usa en todo el presente documento, el termino “aminoacido” o “aminoacidos” se entiende que incluye los 20 aminoacidos que existen de forma natural; aquellos aminoacidos frecuentemente modificados post- traduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoacidos poco usuales que incluyen, pero no se limitan a, acido 2-aminoadfpico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor- leucina y ornitina. Ademas, el termino “aminoacido” incluye tanto aminoacidos D como L.
El polipeptido comprende una protema o un fragmento de la misma.
La protema puede ser una protema que existe de forma natural (por ejemplo, una protema que existe en organismos eucariotas y/o procariotas, celulas, material celular, material no celular, y similares) o un homologo de polipeptido (por ejemplo, al menos el 90 % homologo, opcionalmente al menos el 95 % homologo, y opcionalmente al menos el 99 % homologo) a una protema que existe de forma natural.
En algunos aspectos, la protema (o fragmento de protema) esta desnaturalizada.
Debe entenderse que la protema descrita en el presente documento puede comprender opcionalmente mas de una cadena de polipeptidos.
Comprendiendo una protema caracterizada por mas de una cadena de polipeptidos, el conjugado descrito en el presente documento comprende opcionalmente un polipeptido de la protema.
Alternativamente, el conjugado descrito en el presente documento comprende una pluralidad de polipeptidos de la protema (por ejemplo, todos los polipeptidos de la protema). Opcionalmente, la pluralidad de polipeptidos estan enlazados juntos (por ejemplo, por enlaces no covalentes y/o covalentes) para formar un multfmero (por ejemplo, un dfmero, un tnmero, un tetramero, un hexamero, etc.), teniendo el multimero unido al mismo, al menos dos restos polimericos, como se describe en el presente documento. Opcionalmente, los polipeptidos de la protema estan separados (por ejemplo, separados por desnaturalizacion de la protema), de forma que el conjugado descrito en el presente documento es una mezcla de diferentes especies conjugadas, en la que cada una de las especies conjugadas comprende un polipeptido diferente.
Opcionalmente, el polipeptido (por ejemplo, protema o fragmento de protema) esta seleccionado de manera que presente una actividad biologica. Opcionalmente, la actividad biologica comprende soporte para el crecimiento y/o invasion celular.
Ejemplos de protemas que presentan una actividad biologica que es ventajosa en el contexto de las realizaciones de la presente invencion incluyen, sin limitacion, una protema de senalizacion de celulas, una protema de la matriz extracelular, una protema de adhesion a celula, un factor de crecimiento, protema A, una proteasa y un sustrato de proteasa. Segun la presente invencion, la protema es una protema de la matriz extracelular.
Segun realizaciones opcionales, el polipeptido comprende un polipeptido de fibrinogeno (cadenas a, p y/o y de fibrinogeno) o un fragmento del mismo. Opcionalmente, el conjugado descrito en el presente documento comprende las cadenas a, p y y de fibrinogeno. En realizaciones a modo de ejemplo, el polipeptido es un fibrinogeno desnaturalizado (por ejemplo, una mezcla de cadenas a, p y y desnaturalizadas de fibrinogeno).
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Ejemplos de protemas de la matriz extracelular segun la invencion incluyen fibrinogeno (por ejemplo, cadena a - N° de acceso de GenBank NP_068657; cadena p - N° de acceso de GenBank P02675; cadena y - N° de acceso de GenBank P02679), colageno (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000079), fibronectina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002017) y elastina. Protemas de la matriz extracelular adicionales desveladas en el presente documento son vimentina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_003371), fibrilina, fibulina, laminina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000218) y gelatina.
Ejemplos de protemas de senalizacion de celulas incluyen, pero no se limitan a, protema cinasa activada por mitogeno p38 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002736), factor nuclear kappa B (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_003989), protema inhibidora de la cinasa Raf (RKIP) (por ejemplo, N° de acceso de GenBank XP_497846), Raf-1 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank Np_002871), MeK (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002746), protema cinasa C (PKC) (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002728), fosfoinositida-3-cinasa gamma (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002640), tirosina cinasas de receptor tales como receptor de insulina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000199), protemas G heterotrimericas (por ejemplo, Galfa(i) - N° de acceso de GenBank NP_002060; Galfa(s) - N° de acceso de GenBank NP_000507; Galfa(q) - N° de acceso de GenBank NP_002063), caveolina-3 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_001225), protema 1B asociada a microtubulos y protemas 14-3-3 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_003397).
Ejemplos de protema de adhesion a celula incluyen, pero no se limitan a, integrina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002202), molecula de adhesion intercelular (ICAM) 1 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000192), N-CAM (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000606), cadherina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_00435l), tenascina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_061978), gicerina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_00649l) y protema 2 inducida por lesion nerviosa (ninjurina 2) (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_067606).
Ejemplos de factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento epidermico (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_001954), factor de crecimiento transformante p (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000651), factor de crecimiento de fibroblastos acido (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000791), factor de crecimiento de fibroblastos basico (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_001997), eritropoyetina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000790), trombopoyetina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000451), factor de crecimiento de axones, factor de crecimiento de hepatocitos (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000592), factor de crecimiento similar a la insulina-I (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000609), factor de crecimiento similar a la insulina-II (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000603), interferon-y (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_000610) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_079484).
Ejemplos de proteasas incluyen, pero no se limitan a, pepsina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_055039), quimotripsina de baja especificidad, quimotripsina de alta especificidad, tripsina (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002760), carboxipeptidasas (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_001859), aminopeptidasas (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_001141), prolina-endopeptidasa (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_002717), proteasa V8 de Staphylococcus aureus (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_374168), proteinasa K (PK) (por ejemplo, N° de acceso de GenBank P06873), proteasa aspartica (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_0o4842), serina proteasas (por ejemplo, N° de acceso de GenBank Np_624302), metaloproteasas (por ejemplo, N° de acceso de GenBank nP_787047), ADAMTS17 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_620688), triptasa-y (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_036599), matriptasa-2 (por ejemplo, N° de acceso de GenBank NP_694564).
Ejemplos de sustratos de proteasa incluyen el peptido o secuencias de peptidos que son la diana de la protema proteasa. Por ejemplo, la lisina y la arginina son la diana para tripsina; tirosina, fenilalanina y triptofano son la diana para quimotripsina.
Tales protemas que existen de forma natural pueden obtenerse de cualquier proveedor conocido de reactivos de biologfa molecular.
Como se ejemplifica en la seccion de ejemplos mas adelante, se ha descubierto sorprendentemente que un conjugado que comprende un polipeptido como se describe en el presente documento y al menos un resto polimerico que presenta gelacion termica pueden proporcionar al conjugado una capacidad para experimentar gelacion termica inversa.
Por tanto, segun un aspecto opcional, el conjugado se caracteriza por una capacidad para experimentar gelacion termica inversa en una solucion acuosa, como se describe en el presente documento.
Opcionalmente, la gelacion termica inversa del conjugado se produce a una temperatura inferior a 55 °C, opcionalmente inferior a 50 °C, opcionalmente inferior a 40 °C, y opcionalmente inferior a 30 °C. Opcionalmente, la
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gelacion termica inversa se produce a una temperatura inferior a aproximadamente 37 °C, de forma que a una temperature fisiologica de aproximadamente 37 °C, el conjugado esta en un estado gelificado.
Opcionalmente, la gelacion termica inversa del conjugado se produce a una temperatura superior a 0 °C, opcionalmente superior a 10 °C, opcionalmente superior a 20 °C y opcionalmente superior a 30 °C.
En algunas realizaciones, la gelacion termica inversa del conjugado se produce tras un aumento de la temperatura de 0 °C a 55 °C, opcionalmente de 10 °C a 55 °C, opcionalmente de 10 °C a 40 °C, opcionalmente de 15 °C a 37 °C, y opcionalmente de 20 °C a 37 °C. La gelacion termica inversa que se produce tras un aumento de la temperatura de una temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25 °C) a una temperatura fisiologica (por ejemplo, aproximadamente 37 °C) es particularmente util para algunas aplicaciones (por ejemplo, aplicaciones medicas), ya que la gelacion puede inducirse transfiriendo el conjugado de un entorno de temperatura ambiente a una temperatura fisiologica, por ejemplo, poniendo el conjugado en un cuerpo.
Como se ejemplifica en el presente documento, la temperatura a la que se produce la gelacion de una solucion de conjugado puede controlarse variando la concentracion del conjugado.
Ademas, la temperatura de gelacion puede controlarse seleccionando un polfmero con una temperatura de gelacion apropiada para inclusion en el resto polimerico, y/o variando la concentracion de restos polimericos que presentan gelacion termica inversa (por ejemplo, variando el numero de restos polimericos unidos a un polipeptido y/o variando el tamano de los restos polimericos).
Como se ha ejemplificado adicionalmente en la seccion de ejemplos, las soluciones acuosas que comprenden los conjugados descritos en el presente documento pueden experimentar gelacion termica inversa a concentraciones relativamente bajas, por ejemplo, inferiores al 20 por ciento en peso, opcionalmente inferiores al 10 por ciento en peso, opcionalmente inferiores al 5 por ciento en peso, y opcionalmente inferiores al 2 por ciento en peso.
Sin desear quedar ligado a teona particular alguna, se cree que la conjugacion de un polipeptido con un polfmero que presenta gelacion termica inversa actua de extension de cadena del polfmero, que reduce la concentracion minima necesaria para la gelacion.
Debe observarse que nunca se ha informado hasta la fecha de un fenomeno de una sustancia de relleno de cadenas de una naturaleza u origen biologico (por ejemplo, un polipeptido).
La gelacion termica inversa del conjugado como se describe en el presente documento puede determinarse midiendo un modulo de almacenamiento al cizallamiento de una solucion acuosa que lo contiene. Un aumento dependiente de la temperatura en el modulo de almacenamiento es indicativo de una formacion de gel mediante una gelacion termica inversa.
Como se usa en el presente documento y en la materia, un “modulo de cizallamiento” se define como la relacion de la tension al cizallamiento con respecto a la deformacion al cizallamiento. El modulo de cizallamiento puede ser una variable compleja, en cuyo caso el “modulo de almacenamiento” es el componente real y el “modulo de perdida” es el componente imaginario. El modulo de almacenamiento y el modulo de perdida en solidos viscoelasticos miden la energfa almacenada, que representa la porcion elastica, y la energfa disipada como calor, que representa la porcion viscosa.
En algunas realizaciones, la gelacion termica inversa descrita en el presente documento aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento (tambien denominado en el presente documento “modulo de almacenamiento”, o “G'”) de la solucion acuosa del conjugado al menos diez veces, opcionalmente al menos 30 veces, opcionalmente al menos 100 veces, y opcionalmente al menos 300 veces.
En algunas realizaciones, la gelacion termica inversa descrita en el presente documento aumenta un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la solucion acuosa al menos 5 Pa, opcionalmente al menos 15 Pa, opcionalmente al menos 20 Pa, opcionalmente al menos 50 Pa, opcionalmente al menos 100 Pa, y opcionalmente al menos 200 Pa.
En algunas realizaciones, el modulo de almacenamiento al cizallamiento de la solucion acuosa que contiene el conjugado antes de la gelacion termica inversa (por ejemplo, a una temperatura inferior a una temperatura a la que se produce gelacion) es inferior a 2 Pa, opcionalmente inferior a 1 Pa, opcionalmente inferior a 0,5 Pa, y opcionalmente inferior a 0,2 Pa.
Segun realizaciones opcionales, la gelacion termica inversa es reversible, es decir, un estado gelificado obtenido aumentando una temperatura puede invertirse al estado no gelificado reduciendo la temperatura, teniendo el estado no gelificado sustancialmente las mismas propiedades que existieron antes de la gelacion termica inversa. La gelacion reversible es ventajosa porque un estado gelificado puede modificarse y/o reconstruirse produciendo al menos una porcion del estado gelificado para invertir a un estado no gelificado (disminuyendo una temperatura),
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seguido de formacion de un estado gelificado (aumentando una temperature) en una forma deseada. Ademas, la gelacion reversible no crea desperdicio de un producto por gelacion antes de usar un producto (por ejemplo, un producto en almacenamiento), ya que puede eliminarse cualquier gelacion tal antes del uso del producto (por enfriamiento).
Opcionalmente, la gelacion es reversible durante muchos ciclos (por ejemplo, al menos 10 ciclos, al menos 50 ciclos) de aumentar y disminuir una temperatura.
Opcionalmente, un gel formado por gelacion termica inversa de una solucion acuosa del conjugado es un gel biodegradable, es decir, el gel se degrada en contacto con un tejido y/o una celula (por ejemplo, por proteolisis y/o hidrolisis). Materiales biodegradables son utiles en diversas aplicaciones medicas, por ejemplo, como implantes temporales. Ademas, los materiales biodegradables son altamente adecuados como matrices para soportar el crecimiento y/o la migracion celular, ya que el crecimiento y/o la migracion celular estan asociados a la degradacion de una matriz de alrededor.
Como se ejemplifica en la seccion de ejemplos mas adelante, un gel formado por gelacion termica inversa de una solucion de un conjugado descrito en el presente documento puede servir de matriz adecuada para el crecimiento celular, diseminacion, expansion y/o invasion.
Por tanto, el conjugado descrito en el presente documento se identifica opcionalmente para su uso en generar un armazon, como se define en el presente documento. El armazon puede generarse por gelacion termica inversa del conjugado (por ejemplo, por reticulacion no covalente del conjugado) y/o por reticulacion covalente del conjugado.
El conjugado descrito en el presente documento puede, por tanto, denominarse tambien una molecula precursora para generar un armazon. Asf, el armazon se forma reticulando entre sf (de manera covalente y/o no covalente) una pluralidad de moleculas precursoras.
Como se usa en el presente documento, el termino “armazon” describe un esqueleto de soporte bidimensional o tridimensional. El armazon segun realizaciones de la presente invencion esta compuesto por unidades precursoras (que comprenden los conjugados como se describen en el presente documento) que estan reticuladas entre sf. En algunas realizaciones, puede usarse un armazon como soporte para el crecimiento celular, union y/o diseminacion y asf facilitar la generacion tisular y/o reparacion tisular. En algunas realizaciones, un armazon mantiene una forma deseada de un tejido y/o colonia de celulas soportada por el.
En realizaciones a modo de ejemplo, el armazon es un hidrogel, es decir, el gel formado a partir del conjugado comprende agua absorbida en su interior, por ejemplo, agua de una solucion acuosa del conjugado que se sometio a gelacion.
Como se usa en el presente documento y es muy conocido en la tecnica, el termino “hidrogel” se refiere a un material que comprende redes solidas formadas de cadenas de polfmero natural o sintetico soluble en agua, normalmente que contiene mas del 99 % de agua.
Opcionalmente, el hidrogel se caracteriza por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos 15 Pa (opcionalmente al menos 50 Pa, opcionalmente al menos 100 Pa, y opcionalmente al menos 200 Pa) a 37 °C.
Opcionalmente, la generacion del armazon es reversible. La generacion de armazon reversible se obtiene opcionalmente en realizaciones en las que la generacion de armazon es por gelacion termica inversa, como se ha tratado anteriormente en este documento.
Opcionalmente, el armazon se genera por medios distintos de gelacion termica inversa, por ejemplo, por reticulacion covalente. El armazon obtenido (por ejemplo, un hidrogel) es opcionalmente capaz de experimentar adicionalmente una gelacion termica inversa. Adicionalmente opcionalmente, el armazon se genera por una gelacion termica inversa y es a partir de aqrn que se somete adicionalmente a reticulacion covalente, como se describe en el presente documento.
Como se ha tratado en el presente documento, los conjugados descritos en el presente documento pueden reticularse por reticulacion no covalente (ffsica) y/o por reticulacion covalente (qmmica).
Por tanto, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una composicion de materia (por ejemplo, un armazon o un hidrogel) que comprende una forma reticulada de un conjugado descrito en el presente documento. La composicion de materia comprende asf una pluralidad de moleculas del conjugado reticuladas entre sf.
Debe entenderse que aunque la composicion de materia se describe en el presente documento por simplicidad como que comprende un conjugado, las composiciones de materia que comprenden una pluralidad de especies de
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conjugado (por ejemplo, una mezcla de diferentes conjugados) estan englobadas por el termino “composicion de materia ”.
En algunas realizaciones, las moleculas de conjugado estan reticuladas no covalentemente.
Opcionalmente, las moleculas estan reticuladas solo no covalentemente (es decir, no esta presente reticulacion covalente sustancial).
Las composiciones de materia descritas en el presente documento pueden generarse opcionalmente por reticulacion no covalente y/o covalente de moleculas de conjugado en una solucion, preferentemente una solucion acuosa. Opcionalmente, la solucion permanece absorbida al conjugado reticulado, por ejemplo, en forma de un gel (por ejemplo, un hidrogel).
La solucion puede seleccionarse adecuadamente para efectuar la reticulacion covalente y/o no covalente anteriormente mencionada.
En algunas realizaciones, la solucion es una solucion acuosa.
Las composiciones de materia que comprenden solo reticulacion no covalente pueden opcionalmente generarse por gelacion termica inversa de las moleculas de conjugado en una solucion acuosa (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Opcionalmente, la forma no covalentemente reticulada es reversible, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, las moleculas de conjugado estan reticuladas covalentemente. En tales realizaciones, el conjugado comprende un resto de reticulacion (como se describe en el presente documento). La composicion de materia se genera opcionalmente sometiendo una pluralidad de moleculas de conjugado a condiciones para efectuar la reticulacion covalente de los restos de reticulacion de las moleculas de conjugado.
Opcionalmente, la composicion de materia covalentemente reticulada se caracteriza por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos 20 Pa a 37 °C, y opcionalmente al menos 50 Pa, opcionalmente al menos 100 Pa, opcionalmente al menos 200 Pa, y opcionalmente al menos 300 Pa.
En algunas realizaciones, una composicion de materia comprende reticulacion no covalente, ademas de la reticulacion covalente.
Por ejemplo, una composicion de materia que comprende reticulacion covalente puede ser capaz de experimentar gelacion termica inversa (por ejemplo, una gelacion termica inversa reversible).
Una gelacion termica inversa tal de una composicion de materia covalentemente reticulada puede aumentar opcionalmente un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia al menos el 20 %, opcionalmente al menos el 50 %, opcionalmente al menos el 200 %, opcionalmente al menos el 400 %, y opcionalmente al menos el 900 %.
El modulo de almacenamiento al cizallamiento antes de la gelacion termica inversa esta opcionalmente en un intervalo de 0,5 Pa a 200 Pa, opcionalmente en un intervalo de 0,5 Pa a 100 Pa, y opcionalmente en un intervalo de 10 Pa a 100 Pa.
El modulo de almacenamiento al cizallamiento tras la gelacion termica inversa es opcionalmente al menos 15 Pa, y opcionalmente en un intervalo de 20 Pa a 5000 Pa, opcionalmente de 20 Pa a 1000 Pa, opcionalmente de 20 Pa a 500 Pa, y opcionalmente de 50 Pa a 500 Pa.
Opcionalmente, la gelacion termica inversa de una composicion de materia covalentemente reticulada es una temperatura descrita en el presente documento para la gelacion de un conjugado.
Como se ejemplifica en la seccion de ejemplos mas adelante, una composicion de materia puede caracterizarse por un modulo de almacenamiento al cizallamiento de una porcion de la composicion de materia que es diferente de un modulo de almacenamiento al cizallamiento de al menos otra porcion de la composicion de materia. Cada porcion pueden caracterizarse independientemente por reticulacion no covalente, reticulacion covalente o una combinacion de reticulacion no covalente y covalente (por ejemplo, como se describe anteriormente en este documento).
Una composicion de materia tal puede prepararse, por ejemplo, usando dos soluciones de un conjugado (por ejemplo, soluciones de diferentes conjugados y/o soluciones con diferentes concentraciones de conjugado). Opcionalmente, una solucion se reticula para obtener una primera composicion de materia (por ejemplo, como se describe en el presente documento), tras lo cual la primera composicion de materia se anade a la segunda solucion. Tras la reticulacion de la segunda solucion (por ejemplo, en condiciones que no afectan significativamente la primera
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composicion de materia), puede obtenerse una composicion de materia que tiene porciones con diferentes propiedades.
Independientemente del tipo (no covalente y/o covalente) de reticulacion, las composiciones de materia descritas en el presente documento son opcionalmente biodegradables. En algunas realizaciones, la incorporacion de un polipeptido en una red de conjugados reticulados dentro de la composicion de materia hace que la composicion de materia se biodegrade tras la biodegradacion del polipeptido.
Segun realizaciones opcionales, la composicion de materia comprende ademas celulas (preferentemente celulas vivas) en su interior. Las celulas pueden comprender un tipo de celula o dos o mas tipos de celulas.
Las composiciones de materia descritas en el presente documento pueden ser utiles para inducir la formacion de un tejido, por ejemplo, sirviendo de matriz para soportar el crecimiento y/o invasion celular, y/o proporcionando celulas (por ejemplo, incorporadas en la composicion de materia) que inducen la formacion de tejido. Tales propiedades pueden ser utiles para reparar dano tisular.
Por tanto, en algunas realizaciones, la composicion de materia se identifica para su uso en inducir la formacion de un tejido, como se trata en mas detalle en el presente documento mas adelante.
En algunas realizaciones, la composicion de materia se identifica para su uso en reparar dano tisular, como se trata en mas detalle en el presente documento mas adelante.
Las composiciones de materia descritas en el presente documento pueden prepararse por diversos procesos, dependiendo del tipo de composicion de materia, y particularmente, del tipo de reticulacion (es decir, no covalente y/o covalente) en la composicion de materia.
Asf, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un proceso de produccion de una composicion de materia que comprende reticulacion no covalente (por ejemplo, como se describe en el presente documento). El proceso comprende calentar una solucion (por ejemplo, una solucion acuosa) que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado como se describe en el presente documento, de una primera temperatura a una segunda temperatura. La segunda temperatura es tal que se efectue una gelacion termica inversa del conjugado en solucion, produciendo asf una composicion de materia con reticulacion no covalente.
La segunda temperatura es una temperatura en o por encima de la temperatura cntica del conjugado precursor, como se detalla anteriormente en este documento.
Opcionalmente, la composicion de materia se produce in vivo, por ejemplo, calentando a una temperatura fisiologica (por ejemplo, aproximadamente 37 °C). Tal calentamiento puede efectuarse simplemente poniendo en contacto una solucion del conjugado con un cuerpo.
En algunas realizaciones, el conjugado es un conjugado que comprende al menos un resto de reticulacion descrito en el presente documento, y el proceso comprende ademas someter la solucion de conjugado a condiciones que efectuan la reticulacion de los restos de reticulacion (por ejemplo, antes del calentamiento anteriormente mencionado, posterior al calentamiento o concomitante con el calentamiento). La reticulacion de los restos de reticulacion puede realizarse opcionalmente para obtener una composicion de materia que comprende tanto reticulacion no covalente como covalente.
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un proceso de produccion de una composicion de materia que comprende reticulacion covalente (por ejemplo, como se describe en el presente documento). El proceso comprende someter una solucion que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento, en el que el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion (como se describe en el presente documento), a condiciones que efectuan la reticulacion covalente de los restos de reticulacion, produciendo asf una composicion de materia con reticulacion covalente.
Opcionalmente, la reticulacion covalente se efectua in vivo.
Alternativamente, la reticulacion covalente se efectua ex vivo.
Opcionalmente, el proceso comprende ademas formar reticulaciones no covalentes, por ejemplo, por exposicion a una temperatura a la que se produce gelacion termica inversa.
En algunas realizaciones, la reticulacion covalente se efectua ex vivo, para asf producir un armazon covalentemente reticulado, y el proceso comprende ademas someter el armazon covalentemente reticulado a una temperatura fisiologica in vivo (por ejemplo, poniendo en contacto el armazon con un cuerpo), tal que se efectue la gelacion termica inversa del armazon in vivo, produciendo asf una composicion de materia in vivo que comprende reticulacion no covalente y covalente.
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En algunas realizaciones, la solucion del conjugado comprende ademas celulas. Por consiguiente, el proceso produce una composicion de materia que comprende celulas incorporadas en su interior (como se describe en el presente documento).
Las condiciones que efectuan la reticulacion de restos de reticulacion dependeran de las propiedades qmmicas de los restos de reticulacion.
Se conocen en la tecnica diversas condiciones para efectuar la reticulacion. Por ejemplo, la reticulacion puede efectuarse por irradiacion (por ejemplo, por luz UV, por luz visible, por radiacion ionizante), por un iniciador (por ejemplo, donantes de radicales libres) y/o calor.
Preferentemente, las condiciones para efectuar la reticulacion covalente son biocompatibles, concretamente, usan agentes o condiciones que no se consideran perjudiciales en aplicaciones in vivo.
Segun una realizacion opcional de la presente invencion, la reticulacion es por iluminacion con UV (por ejemplo, a una longitud de onda de aproximadamente 365 nm).
Como se usa en el presente documento, el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.
Cuando se reticula in vivo, es preferible evitar dosis de irradiacion que sean perjudiciales. La maxima dosis que es no perjudicial dependera, por ejemplo, del tipo (por ejemplo, longitud de onda) de irradiacion, y de la parte del cuerpo expuesta a la irradiacion. Un experto en la materia sera capaz de determinar facilmente si una dosis es perjudicial o no perjudicial.
En alguna realizacion, las condiciones comprenden la presencia de un iniciador que se anade para facilitar reticulacion.
Opcionalmente, el iniciador es capaz de efectuar la reticulacion sin irradiacion.
Alternativamente, el iniciador es un fotoiniciador que efectua la reticulacion en presencia de irradiacion (por ejemplo, luz UV, luz visible). La adicion de un fotoiniciador normalmente permitira usar menores dosis de luz UV para la reticulacion.
Como se usa en el presente documento, el termino “fotoiniciador” describe un compuesto que inicia una reaccion qmmica (por ejemplo, reaccion de reticulacion, polimerizacion de cadena) cuando se expone a UV o iluminacion visible. Muchos fotoiniciadores adecuados seran conocidos para un experto en la materia. Fotoiniciadores a modo de ejemplo incluyen, sin limitacion, oxido de bis(2,4,6-trimetilbenzoil)fenilfosfina (BAPO), 2,2-dimetoxi-2- fenilacetofenona (DMPA), canforquinona (CQ), 1-fenil-1,2-propanodiona (PPD), el complejo organometalico Cp'Pt(CH(3))(3) (Cp' = eta(5)-C(5)H(4)CH(3)), 2-hidroxi-1-[4-(hidroxietoxi)fenil]-2-metil-1-propanona (por ejemplo, Irgacure™ 2959), metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA), 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona, benzofenona (BP) y flavinas.
Como se ejemplifica en la seccion de ejemplos mas adelante, las propiedades ffsicas (por ejemplo, modulo de almacenamiento al cizallamiento) de las composiciones de materia dependen de ciertos parametros que pueden controlarse facilmente. Asf, una composicion de materia que tiene una propiedad ffsica deseada puede prepararse seleccionando un valor adecuado de uno o mas de tales parametros.
Por tanto, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un metodo de control de una propiedad ffsica (por ejemplo, un modulo de almacenamiento al cizallamiento) de una composicion de materia tal como se describe en el presente documento. El metodo comprende el control de un parametro que caracteriza la composicion de materia. Un parametro tal puede ser, por ejemplo, una concentracion de un conjugado descrito en el presente documento en la solucion (solucion acuosa), una temperatura ambiente, una temperatura de reticulacion. Ademas, el parametro puede ser la presencia o ausencia de reticulacion covalente, una concentracion de iniciador (por ejemplo, presencia o ausencia de iniciador) durante la reticulacion covalente, y/o una dosis de irradiacion usada para la reticulacion covalente.
La concentracion de un conjugado en una composicion de materia puede controlarse facilmente preparando una solucion del conjugado a una concentracion seleccionada, y reticulando el conjugado por reticulacion covalente y/o no covalente, como se describe en el presente documento, de forma que la solucion del conjugado se convierta en una composicion de materia descrita en el presente documento, que tiene la concentracion seleccionada de conjugado.
En algunas realizaciones, la concentracion de conjugado se correlaciona positivamente con el modulo de almacenamiento al cizallamiento, como se ejemplifica en los ejemplos en el presente documento.
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En algunas realizaciones, la concentracion de conjugado se correlaciona negativamente con una temperatura a la que se efectua la gelacion termica inversa (por ejemplo, una temperatura de gelacion cntica), como se ejemplifica en los ejemplos en el presente documento.
En algunas realizaciones, la temperatura ambiente controla una propiedad ffsica de una composicion de materia que afecta la gelacion termica inversa de una composicion de materia, como se describe en el presente documento.
La temperatura ambiente puede seleccionarse, por ejemplo, de forma que la gelacion no se efectue (por ejemplo, a una temperatura relativamente baja) y el modulo de almacenamiento al cizallamiento sea relativamente bajo, de forma que se efectue la gelacion (por ejemplo, a una temperatura relativamente alta) y el modulo de almacenamiento al cizallamiento sea relativamente alto. Ademas, puede seleccionarse una temperatura ambiente (por ejemplo, a una temperatura intermedia) de forma que la gelacion se efectue parcialmente a cualquier grado deseado, de forma que el almacenamiento al cizallamiento pueda ser a cualquier nivel intermedio que se desee.
Normalmente, la composicion de materia se caracterizara por un intervalo de temperatura relativamente estrecho (por ejemplo, un intervalo de 5 °C, un intervalo de 10 °C, un intervalo de 15 °C) en el que una propiedad ffsica (por ejemplo, un modulo de almacenamiento al cizallamiento) presenta una dependencia de temperatura particularmente fuerte. Opcionalmente, una temperatura ambiente esta seleccionada de dentro de este intervalo de temperatura, de forma que la propiedad ffsica pueda controlarse convenientemente por cambios relativamente pequenos en la temperatura ambiente.
La temperatura de reticulacion (es decir, una temperatura a la que los conjugados en la composicion de materia se reticulan covalentemente) puede usarse para controlar una propiedad ffsica de una composicion de materia que comprende reticulacion covalente (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
En algunas realizaciones, la temperatura de reticulacion se correlaciona negativamente con un modulo de almacenamiento al cizallamiento de la composicion de materia, como se ejemplifica en los ejemplos en el presente documento.
En algunas realizaciones, una correlacion entre una propiedad ffsica (por ejemplo, modulo de almacenamiento al cizallamiento) y la temperatura de reticulacion es particularmente fuerte cuando la temperatura de reticulacion este en un intervalo de temperatura en el que una propiedad ffsica presenta una dependencia de temperatura particularmente fuerte, como se describe anteriormente en este documento. Opcionalmente, una temperatura de reticulacion se selecciona de dentro de este intervalo de temperatura, de forma que la propiedad ffsica pueda controlarse convenientemente por cambios relativamente pequeno en la temperatura de reticulacion.
En algunas realizaciones, la presencia de reticulacion covalente esta asociada a un mayor modulo de almacenamiento al cizallamiento, como se ejemplifica en el presente documento.
En algunas realizaciones, un grado de reticulacion covalente modulando las condiciones para efectuar la reticulacion covalente.
Asf, por ejemplo, puede obtenerse bajo grado de reticulacion covalente efectuando la reticulacion covalente sin un iniciador o con una cantidad mas pequena de iniciador, y/o sin irradiacion o con una pequena dosis de irradiacion (por ejemplo, usando un tiempo de irradiacion corto y/o una baja intensidad de irradiacion).
En algunas realizaciones, el parametro (por ejemplo, temperatura ambiente, temperatura de reticulacion) es relativamente independiente de algunas propiedades ffsicas (por ejemplo, tasa de biodegradacion). Esto permite ventajosamente el control de dos o mas propiedades ffsicas de interes (por ejemplo, tasa de degradacion y modulo de almacenamiento al cizallamiento) sin creacion de una necesidad de experimentacion para determinar como de interdependientes son tales propiedades ffsicas. Por ejemplo, un modulo de almacenamiento al cizallamiento puede controlarse opcionalmente seleccionando una temperatura de reticulacion adecuada, mientras que una tasa de degradacion puede controlarse seleccionando un poffmero apropiado para los restos polimericos descritos en el presente documento.
Asf, en algunas realizaciones, el cambiar un parametro descrito en el presente documento (por ejemplo, temperatura ambiente, temperatura de reticulacion) cambiara una tasa de biodegradacion por un factor inferior a 4, opcionalmente por un factor inferior a 3, opcionalmente por un factor inferior a 2, y opcionalmente por un factor inferior a 1,5.
La tasa de biodegradacion se cuantifica opcionalmente midiendo una semivida de la composicion de materia en una solucion de tripsina (por ejemplo, usando procedimientos descritos en el presente documento).
Los conjugados segun realizaciones de la invencion pueden producirse de una manera relativamente simple y barata.
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As^ segun otro aspecto desvelado en el presente documento, se proporciona un proceso de produccion de un conjugado como se describe en el presente documento, comprendiendo el proceso unir covalentemente un poKmero a un polipeptido, siendo el poUmero y polipeptido de forma que al menos dos moleculas de polfmero se unan a una molecula del polipeptido, en el que al menos una de las dos moleculas de polfmero presenta una gelacion termica inversa.
El polfmero puede comprender opcionalmente al menos un resto de reticulacion (por ejemplo, como se describe en el presente documento), para producir un conjugado que comprende al menos un resto de reticulacion, como se describe en el presente documento.
Opcionalmente, el polfmero comprende al menos un primer resto (opcionalmente una unico primer resto) que es capaz de reaccionar de manera que se una el polfmero al polipeptido, y opcionalmente al menos un segundo resto que es un resto de reticulacion descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, el primer resto y el segundo resto son diferentes, de forma que el primer resto pueda hacerse reaccionar de manera que se una el polfmero al polipeptido, sin provocar que el segundo resto (resto de reticulacion) reaccione prematuramente (por ejemplo, antes de que desee la reticulacion de moleculas de conjugado).
En algunas realizaciones, el primer resto y el segundo resto son los mismos, siendo el resto adecuado para unir el polfmero al polipeptido y para la reticulacion del conjugado.
Opcionalmente, un resto de reticulacion tal se selecciona como que es capaz de experimentar dos reacciones diferentes, cada una bajo condiciones diferentes, de forma que el resto pueda hacerse reaccionar bajo un conjunto de condiciones de manera que se una el polfmero al polipeptido, y entonces reaccione bajo condiciones diferentes de manera que se reticulen moleculas de conjugado. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, algunos restos insaturados (por ejemplo, acrilatos) pueden experimentar adicion de tipo Michael por un tiol (por ejemplo, en condiciones basicas) de manera que se una el polfmero a un polipeptido, y tambien experimenten polimerizacion (por ejemplo, en condiciones para iniciar la polimerizacion por radicales libres) de manera que se reticulen conjugados.
En algunas realizaciones en las que el primer y segundo restos descritos en el presente documento son los mismos (o de otro modo capaces de experimentar reacciones similares bajo las mismas condiciones), el polipeptido se hace reaccionar con un exceso molar (por ejemplo, al menos 20:1, al menos 50:1, al menos 100:1, al menos 200:1) del polfmero, para prevenir que cada molecula de polfmero se una a mas de un sitio sobre el polipeptido.
Aparte de ser baratas de producir, las composiciones de materia de las realizaciones de la presente invencion son altamente reproducibles, flexibles (pueden tensionarse o estirarse facilmente), presentan propiedades estructurales controlables, y estan dispuestas a biodegradacion controlable; caractensticas que las hacen altamente adecuadas para regeneracion in vivo o ex vivo de tejidos tales como hueso, cartflago, corazon musculo, tejido de piel, vasos sangumeos y otros tejidos (bandos y duros) en el cuerpo. Por ejemplo, un armazon de hidrogel tal puede colocarse facilmente en huecos dentro de un tejido o un organo, tras lo cual pueden llenar el vado e iniciar el proceso de regeneracion a medida que el armazon se degrada.
Por tanto, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un uso de un conjugado descrito en el presente documento o de una composicion de materia descrita en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para reparar dano tisular.
El medicamento es opcionalmente para inducir la formacion de un tejido (in vivo y/o ex vivo).
Opcionalmente, el medicamento es para tratar un trastorno caracterizado por dano o perdida tisular (por ejemplo, como se describe en el presente documento). En el presente documento, la expresion “tejido” se refiere a parte de un organismo que consiste en un agregado de celulas que tienen una estructura y funcion similar. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tejido cerebral, retina, tejido de piel, tejido hepatico, tejido pancreatico, hueso, cartflago, tejido conjuntivo, tejido sangumeo, tejido de musculo, tejido cardfaco, tejido cerebral, tejido vascular, tejido renal, tejido pulmonar, tejido gonadal, tejido hematopoyetico y tejido adiposo. Preferentemente, la expresion “tejido”, como se usa en el presente documento, tambien engloba la expresion “organo” que se refiere a una unidad estructural y funcional completamente diferenciada en un animal que esta especializado para alguna funcion particular. Ejemplos no limitantes de organos incluyen cabeza, cerebro, ojo, pierna, mano, corazon, tugado rinon, pulmon, pancreas, ovario, testfculo y estomago.
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un uso de un conjugado descrito en el presente documento o de una composicion de materia descrita en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para tratar un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por dano o perdida tisular.
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Como se usa en el presente documento, la expresion “trastorno caracterizado por dano o perdida tisular” se refiere a cualquier trastorno, enfermedad o afeccion que presente un dano tisular (por ejemplo, tejido no funcionante, tejido canceroso o pre-canceroso, tejido roto, tejido fracturado, tejido fibrotico o tejido isquemico) o una perdida de tejido (por ejemplo, tras un traumatismo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad genetica, y similares) que requiere regeneracion de tejido. Ejemplos de trastornos o afecciones que requieren regeneracion de tejido incluyen, pero no se limitan a, cirrosis hepatica tal como en pacientes con hepatitis C (tejido del fugado), diabetes tipo 1 (tejido pancreatico), fibrosis qmstica (tejido de pulmon, fugado, pancreatico), cancer de huesos (tejido de hueso), quemadura y cicatrizacion (tejido de piel), degeneracion macular relacionada con la edad (tejido retiniano), infarto de miocardio, reparacion miocardica, lesiones del SNC (mielina), defectos del cartflago articular (condrocitos), degeneracion de la vejiga, degeneracion intestinal, y similares. Ademas, el dano cosmetico o perdida tisular estan englobados por el termino “trastorno”.
Como se usa en el presente documento, el termino “cosmetico” se refiere a tejido evidente (por ejemplo, visible), que incluye, pero no se limita a, tejido de piel. El dano cosmetico o perdida tisular normalmente es perjudicial esteticamente, y puede ser perjudicial por motivos adicionales (por ejemplo, factores psicologicos).
En el presente documento, la expresion “tratar” se refiere a inhibir o detener el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afeccion y/o causar la reduccion, remision o regresion de una enfermedad, trastorno o afeccion en un individuo que padece, o esta diagnosticado con, la enfermedad, trastorno o afeccion. Aquellos expertos en la materia conoceran diversas metodologfas y ensayos que pueden usarse para evaluar el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afeccion, y similarmente, diversas metodologfas y ensayos que pueden usarse para evaluar la reduccion, remision o regresion de una enfermedad, trastorno o afeccion.
En algunas realizaciones, un medicamento que comprende un conjugado como se describe en el presente documento se identifica por reticularse con el conjugado (in vivo y/o ex vivo), como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un medicamento que comprende una composicion de materia descrita en el presente documento se identifica para ser implantado en un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” se refiere a un vertebrado, preferentemente un mairnfero, mas preferentemente un ser humano (masculino o femenino) en cualquier edad.
La implantacion se efectua opcionalmente usando una herramienta quirurgica tal como un escalpelo, cuchara, espatula, u otro dispositivo quirurgico. Opcionalmente, la implantacion se efectua mediante inyeccion (por ejemplo mediante jeringa, cateter, y similares)
En el presente documento, los terminos “implante” e “implantacion” engloban poner una sustancia (por ejemplo, un conjugado o composicion de materia descrita en el presente documento) en un cuerpo o sobre una superficie del cuerpo (por ejemplo, sobre una superficie de la piel). Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una composicion de materia descrita en el presente documento para su uso en un metodo de induccion de la formacion de un tejido in vivo, comprendiendo el metodo implantar la composicion de materia descrita en el presente documento en un sujeto (por ejemplo, como se describe en el presente documento), para asf inducir la formacion del tejido.
En algunas realizaciones, la composicion de materia es una composicion de materia que comprende conjugado covalentemente reticulado como se describe en el presente documento, y se reticula no covalentemente in vivo tras la implantacion (por ejemplo, para proporcionar la composicion de materia con una rigidez deseada). Opcionalmente, la reticulacion no covalente se efectua por exposicion a una temperatura fisiologica (por ejemplo, como se describe en el presente documento), siendo la exposicion a la temperatura fisiologica un resultado directo de la implantacion.
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un conjugado descrito en el presente documento para su uso en un metodo de induccion de la formacion de un tejido in vivo, comprendiendo el metodo implantar una pluralidad de moleculas del conjugado descrito en el presente documento en un sujeto, para asf inducir la formacion del tejido.
En algunas realizaciones, el conjugado se reticula no covalentemente in vivo tras la implantacion (por ejemplo, para formar un armazon). Opcionalmente, la reticulacion no covalente se efectua por exposicion a una temperatura fisiologica (por ejemplo, como se describe en el presente documento), siendo la exposicion a la temperatura fisiologica un resultado directo de la implantacion.
En algunas realizaciones, el conjugado se reticula covalentemente in vivo tras la implantacion (por ejemplo, para formar un armazon). La reticulacion puede realizarse como se describe en el presente documento, usando agentes y/o condiciones no toxicas, no perjudiciales (por ejemplo, aplicacion de irradiacion UV).
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un metodo de induccion de la formacion de un tejido ex vivo, comprendiendo el metodo someter una composicion de materia que tiene celulas en su interior
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(como se describe en el presente documento) a condiciones propicias para el crecimiento de las celulas, para as^ inducir la formacion de tejido.
Como se usa en el presente documento, la expresion “ex vivo” se refiere a celulas vivas que se derivan de un organismo y estan creciendo (o se cultivan) fuera del organismo vivo, por ejemplo, fuera del cuerpo de un vertebrado, un mairnfero, o ser humano. Por ejemplo, las celulas que se derivan de un ser humano tales como celulas de musculo humano o celulas endoteliales aorticas humanas y se cultivan fuera del cuerpo se denominan celulas que se cultivan ex vivo.
Las celulas en una composicion de materia descrita en el presente documento se seleccionan opcionalmente de manera que sean capaces de formar un tejido. Tales celulas pueden ser, por ejemplo, citoblastos tales como citoblastos embrionarios, citoblastos de medula osea, celulas de sangre del cordon, citoblastos mesenquimatosos, citoblastos de tejido adulto, o celulas diferenciadas tales como celulas neurales, celulas retinianas, celulas epidermicas, hepatocitos, celulas pancreaticas, celulas oseas, celulas cartilaginosas, celulas elasticas, celulas fibrosas, miocitos, celulas miocardicas, celulas endoteliales, celulas de musculo liso y celulas hematopoyeticas.
La composicion de materia que comprende las celulas puede comprender celulas incorporadas dentro de y/o sobre la superficie de la composicion de materia. Las celulas pueden incorporarse opcionalmente dentro de la composicion de materia por reticulacion de un conjugado descrito en el presente documento en presencia de celulas (por ejemplo, como se describe en el presente documento). La incorporacion de celulas sobre una superficie de la composicion de materia puede efectuarse opcionalmente poniendo en contacto una composicion de materia preparada con las celulas.
La concentracion de celulas en y/o sobre la composicion de materia depende del tipo de celula y las propiedades del armazon. Aquellos expertos en la materia son capaces de determinar la concentracion de celulas usada en cada caso.
La composicion de materia se pone opcionalmente en contacto con medio de cultivo de tejido y factores de crecimiento.
Alternativamente o adicionalmente, la composicion de materia comprende medio de cultivo de tejido y factores de crecimiento, por ejemplo, en una fase acuosa de un hidrogel.
Opcionalmente, las celulas se examinan rutinariamente (por ejemplo, usando un microscopio invertido) para la evaluacion de crecimiento celular, diseminacion y la formacion de tejido, con el fin de facilitar el control sobre la formacion de tejido, y/o para determinar cuando se ha completado un proceso de la formacion de tejido.
Tras la formacion ex vivo de tejido, el tejido obtenido y/o la composicion de materia que comprende el tejido formado se implanta opcionalmente en el sujeto (por ejemplo, para inducir adicionalmente la formacion de tejido, para reparar dano tisular, y/o para tratar un trastorno como se describe en el presente documento). Aquellos expertos en la tecnica son capaces de determinar cuando y como implantar el tejido y/o la composicion de materia para asf inducir la formacion y/o reparacion de tejido, y/o para tratar una enfermedad descrita en el presente documento.
Se apreciara que las celulas que van a implantarse en un sujeto (por ejemplo, para inducir la formacion in vivo de tejido y/o tras la formacion ex vivo de un tejido), como se describe en el presente documento, pueden derivarse opcionalmente del sujeto tratado (fuente autologa), y opcionalmente de fuentes alogenas tales como citoblastos embrionarios que no se espera que induzcan una reaccion inmunogenica.
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una composicion de materia descrita en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por dano o perdida tisular (por ejemplo, como se describe en el presente documento), comprendiendo el metodo implantar la composicion de materia descrita en el presente documento en un sujeto, como se describe en el presente documento, para asf inducir la formacion del tejido, tratando asf el trastorno caracterizado por dano o perdida tisular.
Segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por dano o perdida tisular (por ejemplo, como se describe en el presente documento), comprendiendo el metodo implantar la pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento en un sujeto, como se describe en el presente documento, para asf inducir la formacion del tejido, tratando asf el trastorno caracterizado por dano o perdida tisular.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento que se efectuan implantando un conjugado, el conjugado comprende opcionalmente al menos un resto de reticulacion (por ejemplo, como se describe en el presente documento). En tales realizaciones, el metodo comprende opcionalmente ademas reticular covalentemente la pluralidad de moleculas del conjugado, por ejemplo, sometiendo la pluralidad de moleculas a condiciones (por
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ejemplo, como se describe en el presente documento) que efectuan la reticulacion covalente de los restos de reticulacion de las moleculas.
Un conjugado descrito en el presente documento puede proporcionarse como una composicion, por ejemplo, una composicion para efectuar un metodo o uso descrito en el presente documento. La composicion puede ser para efectuar un tratamiento farmaceutico (por ejemplo, medicinal) y/o un tratamiento cosmetico (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
Por tanto, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica, cosmetica o cosmeceutica que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado descrito en el presente documento, siendo la composicion identificada para su uso en inducir la formacion de un tejido in vivo tras ponerse en contacto con un tejido y adicionalmente tras someter la composicion a una temperatura fisiologica.
En el presente documento, la expresion “composicion cosmeceutica” se refiere a una composicion caracterizada por tanto usos farmaceuticos como cosmeticos.
Opcionalmente, el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion (como se describe en el presente documento), y la composicion se identifica para su uso en inducir la formacion de un tejido tras someter adicionalmente la pluralidad de moleculas del conjugado a condiciones (por ejemplo, como se describe en el presente documento) que efectuan la reticulacion covalente de los restos de reticulacion de las moleculas.
Opcionalmente, la composicion comprende ademas un iniciador (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para inducir la reticulacion covalente de los restos de reticulacion.
Opcionalmente, la composicion descrita en el presente documento se envasa en un material de envasado y se identifica impresa, en o sobre el material de envasado, para su uso en inducir la formacion de tejido y/o para tratar un trastorno, como se describe en el presente documento.
La composicion puede comprender ademas un vehuculo farmaceuticamente aceptable, y formularse para facilitar su administracion (por ejemplo, implantacion).
En el presente documento, el termino “vehuculo farmaceuticamente aceptable” se refiere a un vehuculo o un diluyente que no produce irritacion significativa a un organismo y no anula la actividad biologica y propiedades del compuesto administrado. Ejemplos, sin limitaciones, de vehuculos son: propilenglicol, solucion salina, emulsiones y mezclas de disolventes organicos con agua, ademas de vehfculos solidos (por ejemplo, en polvo) y gaseosos.
Opcionalmente, el vehuculo es un vehuculo acuoso, por ejemplo, una solucion acuosa (por ejemplo, solucion salina).
El conjugado tambien puede proporcionarse como parte de un kit.
Asf, segun otro aspecto de las realizaciones de la invencion, se proporciona un kit para inducir la formacion de un tejido, comprendiendo el kit un conjugado descrito en el presente documento, un disolvente acuoso e instrucciones para la reticulacion de una solucion acuosa del conjugado con el fin de formar un armazon para inducir la formacion de tejido.
Opcionalmente, el conjugado y el disolvente se almacenan por separado dentro del kit (por ejemplo, en unidades de envase separadas), de forma que el conjugado se almacena en un estado seco hasta que se ponga en contacto con el disolvente para la formacion de una solucion del conjugado (por ejemplo, una solucion descrita en el presente documento). Tal almacenamiento del conjugado antes de uso puede aumentar una duracion eficaz del conjugado (y kit).
Opcionalmente, el conjugado comprende al menos un resto de reticulacion (por ejemplo, como se describe en el presente documento), y el kit comprende ademas un iniciador (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para inducir la reticulacion covalente del resto de reticulacion.
Opcionalmente, el kit comprende ademas celulas para incorporar en el armazon (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
Las celulas pueden formar una parte del disolvente o pueden envasarse por separado.
En algunas realizaciones, el kit comprende instrucciones como un prospecto.
Las instrucciones para la reticulacion del conjugado en el disolvente pueden ser, por ejemplo, mezclar el conjugado y el disolvente y someter la solucion obtenida a una cierta temperatura (por ejemplo, para efectuar la gelacion termica inversa).
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Por ejemplo, si la gelacion del conjugado se efectua a temperatura ambiente, las instrucciones pueden ser guardar el kit bajo refrigeracion (por ejemplo, inferior a 10 °C o a 4 °C), mezclar los componentes a temperatura ambiente y esperar hasta que se observe la formacion del gel.
Si la gelacion se efectua a mayores temperaturas, las instrucciones pueden ser mezclar los componentes y luego calentar la solucion durante un periodo de tiempo indicado.
Si la reticulacion covalente va a efectuarse por irradiacion, las instrucciones pueden ser mezclar los componentes (que opcionalmente incluyen un fotoiniciador como se describe en el presente documento), irradiar la solucion, y opcionalmente calentar la solucion para efectuar la gelacion termica como se describe anteriormente en este documento. La irradiacion puede ser antes de, concomitante con o despues de la irradiacion.
Si la reticulacion covalente va a efectuarse por polimerizacion por radicales libres, las instrucciones pueden ser mezclar los componentes (incluyendo un iniciador de la polimerizacion como se describe en el presente documento), y opcionalmente calentar la solucion para efectuar la gelacion termica como se describe anteriormente en este documento y/o para efectuar la polimerizacion (si se desea calentar). El calentamiento para efectuar la gelacion termica y para efectuar la polimerizacion puede ser a la misma temperatura o a temperaturas diferentes.
En algunas realizaciones, el conjugado y la solucion se envasan dentro del kit a una relacion adecuada para obtener una composicion de materia con las propiedades deseadas. Una relacion tal puede estar predeterminada como se detalla anteriormente en este documento.
Opcionalmente, las instrucciones incluyen adicionalmente orientacion para seleccionar una relacion adecuada para obtener una propiedad adecuada de la composicion de materia, segun la descripcion proporcionada anteriormente en este documento.
Las instrucciones pueden incluir ademas orientacion con respecto a seleccionar las condiciones de reticulacion (por ejemplo, con o sin irradiacion; con o sin calentamiento; con o sin adicion de un iniciador de la polimerizacion) para obtener una composicion de materia con propiedades deseadas.
Los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero no se limita a”.
El termino “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.
El termino “que consiste esencialmente en” significa que la composicion, metodo o estructura puede incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los componentes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las caractensticas basicas y novedosas de la composicion, metodo o estructura reivindicado.
La expresion “a modo de ejemplo” se usa en el presente documento para significar “que sirve de ejemplo, caso o ilustracion”. Cualquier realizacion descrita como “a modo de ejemplo” no debe interpretarse como preferida o ventajosa con respecto a otras realizaciones y/o para excluir la incorporacion de caractensticas de otras realizaciones.
La palabra “opcionalmente” se usa en el presente documento para significar “se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones”.
Como se usa en el presente documento, la forma en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluye referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, el termino “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, que incluye mezclas de los mismos.
La descripcion de un intervalo debe considerarse que ha desvelado espedficamente todos los posibles subintervalos, ademas de valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 debe considerarse que ha desvelado espedficamente la descripcion tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., ademas de numeros individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la anchura del intervalo.
Siempre que un intervalo numerico se indique en el presente documento, pretende incluir cualquier numero citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. La expresion “que oscila/oscila entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que oscila/oscila de” un primer numero indicado “a” un segundo numero indicado se usan en el presente documento indistintamente y se indican para incluir el primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionarios y enteros entremedias.
Como se usa en el presente documento, el termino “metodo” se refiere a modos, medios, tecnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada que incluye, pero no se limita a, aquellos maneras, medios, tecnicas y
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procedimientos tanto conocidos para, como facilmente desarrollados, de modos, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las ciencias qmmicas, farmacologicas, biologicas, bioqmmicas y medicas.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion como se describen anteriormente en este documento y como se reivindican en la seccion de reivindicaciones mas adelante encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invencion.
Materiales y metodos
Materiales:
Se obtuvo acetona de Bio-Lab (Israel);
se obtuvo cloruro de acriloMo de Merck;
se obtuvo calcema AM de Sigma-Aldrich;
se obtuvo colageno tipo I de BD Biosciences;
se obtuvo colagenasa 1A de Sigma-Aldrich;
se obtuvo diclorometano de Aldrich;
se obtuvo eter dietflico de Frutarom (Israel);
se obtuvo medio Eagle modificado por Dulbecco de Gibco;
se obtuvo homodfmero 1 de etidio de Sigma-Aldrich;
se obtuvo suero bovino fetal de Biological Industries (Israel);
se obtuvo formalina de Sigma-Aldrich;
se obtuvo Hoechst 33342 de Sigma Aldrich;
se obtuvo el iniciador Irgacure® 2959 de Ciba;
se obtuvo mercaptoetanol de Gibco;
se obtuvo W-hidroxisuccinimida-fluorescema de Thermo Scientific;
se obtuvieron aminoacidos no esenciales de Biological Industries (Israel);
se obtuvo penicilina-estreptomicina de Biological Industries (Israel);
se obtuvo eter de petroleo 40-60 de Bio-Lab (Israel);
se obtuvo Pluronic® F127 (12,6 kDa) de Sigma;
se obtuvo poli(etilenglicol) (12 kDa) de Fluka;
se obtuvo azida de sodio de Riedel-de Haen;
se obtuvo tetraol T1307 Tetronic® de BASF;
se obtuvo tolueno de Bio-Lab (Israel);
se obtuvo trietilamina de Fluka;
se obtuvo clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de Sigma; se obtuvo tripsina de MP Biomedicals.
S^ntesis de poloxamero F127-diacrilato, T1307 Tetronic®-tetraacrilato y PEG-diacrilato:
Se prepararon poloxamero F127-diacrilato (F127-DA), T1307Tetronic®-tetraacrilato (T1307-TA) y poli(etilenglicol)- diacrilato (PEG-DA) a partir de Pluronic® F127 (12,6 kDa), tetraol T1307 Tetronic® (18 kDa) y poli(etilenglicol) (PEG) diol (12 kDa), respectivamente, segun los procedimientos descritos en Halstenberg et al. [Biomacromolecules 2002, 3:710-723]. Como se representa en la Figura 1A, la acrilatacion de los polfmeros se llevo a cabo bajo argon haciendo reaccionar los polfmeros terminados en hidroxilo en una solucion de diclorometano y tolueno con cloruro de acriloflo (Merck, Darmstadt, Alemania) y trietilamina a una relacion molar de 1,5:1 con respecto a los grupos hidroxilo. El producto final se precipito en eter dietflico frio en hielo (para PEG-DA) o eter de petroleo 40-60 (para F127-DA y T1307-TA). El polfmero solido se seco a vacfo durante 48 horas.
Usando RMN protonica, se determino que el numero promedio de grupos acrilo por molecula de F127-DA era 2,15, se determino que el numero promedio de grupos acrilo por molecula de T1307-TA era 4,38, y se determino que el numero promedio de grupos acrilo por PEG-DA era 1,74.
Caracterizacion reologica:
Se llevaron a cabo mediciones reologicas usando un reometro AR-G2 (TA Instruments) equipado con una base de temperatura controlada por placa de Peltier. Se uso una geometna de la placa de cuarzo de 40 mm en todos los experimentos. Cada medicion se llevo a cabo con 0,4 ml de la solucion de polfmero que contema 0, 1 % (peso/volumen) de iniciador Irgacure® 2959. Se aplico luz UV (365 nm) por una matriz multi-diodo circular (Moritex, Japon). Las condiciones de prueba para todas las mediciones fueron del 2 % de deformacion a una frecuencia de oscilacion de 1 Hz.
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Mediciones de la captacion de agua:
Se prepararon construcciones de hidrogel a partir de un volumen de 100 |jl de solucion de conjugado de poKmero- fibrinogeno con 0, 1 % (peso/volumen) de iniciador Irgacure® 2959 en un tubo de silicio de 5 mm de diametro. Las construcciones se reticularon bajo luz UV (365 nm, 4-5 mW/cm2) para formar un cilindro de 5 mm de altura. FF127 se reticulo a una temperatura de 4 °C, 21 °C o 37 °C. La captacion de agua se evaluo calculando la relacion de hinchamiento (Qm), es decir, la relacion del peso humedo (masa despues del hinchamiento) dividida entre el peso seco (peso despues de la liofilizacion).
Mediciones de biodegradacion:
La biodegradacion de los hidrogeles se caracterizo marcando fluorometricamente el componente biologico en el hidrogel biosintetico con N-hidroxisuccinimida-fluorescema (NHS-fluorescema) reactiva con amina. La tasa de degradacion se cuantifico midiendo la liberacion de la protema durante la disolucion enzimatica del hidrogel. Se tineron tapones de 100 jl de hidrogel durante la noche en una solucion de PBS que contema 0,05 mg/ml de NHS- fluorescema, y se lavaron ampliamente para eliminar la fluorescema no unida. Entonces, los tapones se transfirieron a 3 ml de PBS con 0,01 mg/ml de tripsina y 0,1 % de azida de sodio (Riedel-de Haen, India), y se incubaron a 37 °C con agitacion continua. Las mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo en un espectrofotometro Thermo Varioskan (longitud de onda de excitacion 494 nm, longitud de onda de emision 518 nm) con el software Skanlt2.2®. Despues del ultimo momento de tiempo, cada hidrogel se disocio hidroltticamente anadiendo NaOH 0,1 M. Despues de 30 minutos, los valores de emision se registraron al 100 % de degradacion. Se usaron tapones de hidrogel marcados sin enzima y tapones no tenidos con solucion de enzima como controles negativos.
Preparacion de construcciones sembradas con celulas:
Se prepararon construcciones de hidrogel sembradas con celulas por reticulacion inducida por UV de conjugados de FF127 o de FT1307 en solucion en presencia de fibroblastos de prepucio humano dispersos o celulas HeLa. Las celulas sometidas a pases se tripsinaron y se suspendieron en 100 jl de una solucion del conjugado a una concentracion de 106 celulas/ml, junto con un fotoiniciador (0,1% en peso/volumen). Las construcciones en forma de disco se expusieron a luz UV durante 5 minutos a 4 °C, 21 °C o 37 °C. Se prepararon construcciones sembradas con celulas de control a partir de PEG (12 kDa)-fibrinogeno, diacrilato del poloxamero F127 o tetraacrilato T1307 (3 % en peso/peso en PBS). Las construcciones sembradas con celulas se cultivaron durante hasta 6 dfas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contema 10 % de suero bovino fetal (FBS), 1 % de penicilina-estreptomicina, 1 % de aminoacidos no esenciales y 0,2 % de 2-mercaptoetanol.
Microscop^a optica y microscop^a fluorescente:
Se realizaron microscopfa optica y microscopfa fluorescente usando un microscopio Eclipse TE2000-S (Nikon) o un microscopio Eclipse TS100 (Nikon), y una camara digital.
Analisis estad^stico:
Se realizo analisis estadfstico usando el software de analisis estadfstico Microsoft Excel. Se cuantificaron los datos de experimentos independientes y se analizaron para cada variable. Se hicieron comparaciones entre dos tratamientos usando la prueba de la t de Student (bilateral, varianza igual) y se hicieron comparaciones entre multiples tratamientos con analisis de la varianza (ANOVA). Un valor de p de <0,05 se considero estadfsticamente significativo.
Ejemplo 1
Conjugado de poloxamero F127-fibrinogeno
Se conjugo fibrinogeno con diacrilato del poloxamero F127 (preparado como se describe anteriormente en este documento, y como se representa en la Figura 1A) por una reaccion de adicion de tipo Michael, como se representa en la Figura 1B. Con el fin de comparar las propiedades de los conjugados de poloxamero-protema con aquellas de los conjugados de poli(etilenglicol) (PEG)-protema, se conjugo fibrinogeno con PEG de 12 kDa-diacrilato (preparado como se describe anteriormente en este documento), usando la misma reaccion.
Se complemento una solucion de 3,5 mg/ml de fibrinogeno en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) 150 mM con urea 8 M con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a una relacion molar de 1,5:1 de TCEP con respecto a residuos de cistema de fibrinogeno. Entonces se anadio PBS con urea 8 M y 280 mg/ml del polfmero funcionalizado (F127-DA o PEG-DA) a una relacion molar de 4:1 de moleculas de polfmero con respecto a residuos de cistema de fibrinogeno. La mezcla se dejo reaccionar durante 3 horas a temperatura ambiente. Entonces, la protema conjugada se precipito anadiendo 4 volumenes de acetona. El precipitado se redisolvio en PBS que contema urea 8 M a una concentracion de protema de 10 mg/ml y luego se dializo contra PBS durante 2 dfas a 4 °C, sustituyendose el PBS dos veces por dfa. El tubo de dialisis tuvo un corte de 12-14 kDa (Spectrum).
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Con el fin de establecer la concentracion total de los conjugados de F127-fibrinogeno y PEG-fibrinogeno, se liofilizaron 0,5 ml de la solucion de conjugado durante 24 horas y se peso. La concentracion de fibrinogeno neta se determino usando un ensayo de protemas BCA™ convencional (Pierce Biotechnology) y se compararon las concentraciones de los conjugados (peso seco) y fibrinogeno con el fin de determinar la concentracion de polfmero sintetico en los conjugados. La eficiencia de la reaccion de conjugacion (£conjugacion) se calculo basandose en las concentraciones y pesos moleculares del polfmero sintetico y fibrinogeno, suponiendo un maximo teorico de 29 moleculas de poKmero sintetico por molecula de fibrinogeno (ya que el fibrinogeno comprende 29 grupos tiol), usando la siguiente formula:
_ [PoHmero sin t.] [Fibrinogeno]
x teoricos
MW
fibrinogen o
29 x MW,
Polimero sin t.
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coniugacio n
La concentracion media de fibrinogeno y la eficiencia de conjugacion obtenidas durante 4 lotes de cada uno de los conjugados de F127-fibrinogeno y PEG-fibrinogeno se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1: Concentracion media de fibrinogeno y eficiencia de conjugacion de conjugados de polfmero sintetico-
___________________fibrinogeno (media ± error estandar de la media)___________________
Polfmero MW Concentracion Concentracion Concentracion de Eficiencia de
sintetico de fibrinogeno de conjugado polfmero sintetico conjugacion
(medida) (medida) (calculada) (Econjugacion)
___________(kDa)_____(mg/ml)_________(mg/ml)__________(mg/ml)__________(%)_____
F127-DA
12,6 7,7 ± 0,5 21 ± 2,3 13 ± 1,9 79 ± 8,4
PEG-DA
12 8,9 ± 2 24,7 ± 6,7 15,8 ± 4,8 83,8 ± 10,5
Como se muestra en la Tabla 1, tanto el poloxamero F127 como PEG se conjugaron con fibrinogeno con una eficiencia de conjugacion relativamente alta. No hubo diferencia estadfsticamente significativa entre la eficiencia de conjugacion o la concentracion de fibrinogeno obtenida con el poloxamero F127 y PEG.
Ejemplo 2
Propiedades reologicas del conjugado de poloxamero F127-fibrinogeno (FF127) e hidrogeles formados por reticulacion de FF127
Se estudiaron las propiedades reologicas del conjugado de poloxamero F127-fibrinogeno (FF127) descrito en el Ejemplo 1, como se describe en la seccion de Materiales y metodos anteriormente en este documento.
Como se muestra en la Figura 2, el modulo de almacenamiento al cizallamiento (G') de FF127 aumento considerablemente a temperaturas por encima de aproximadamente 20 °C. La transicion dependio de la concentracion de FF127, y que el modulo de almacenamiento de 8 mg/ml de FF127 aumento a una temperatura ligeramente menor que el modulo de almacenamiento de 4 mg/ml de FF127.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 2, el aumento en el modulo de almacenamiento al cizallamiento estuvo acompanado por un pico en el modulo de perdida al cizallamiento (G'') de FF127.
Como se muestra en la Figura 3A, el modulo de almacenamiento al cizallamiento aumento repetidamente (hasta aproximadamente 185 Pa) y disminuyo aumentando la temperatura a 37 °C y reduciendo la temperatura a 15 °C, que indica una transicion reversible.
Estos resultados indican que FF127 se somete a transicion de fase de gelacion termica inversa (GTI) a tales temperaturas, como resultado de la formacion de una matriz polimerica continua debido a reticulacion ffsica (es decir, no covalente) de moleculas de FF127, como se representa en la Figura 4.
Es notable que la gelacion termica inversa se produjo a concentraciones inferiores a 20 mg/ml de conjugado (correspondientes a una concentracion de fibrinogeno de aproximadamente 8 mg/ml), ya que F127 no presenta gelacion termica inversa a concentraciones inferiores al 14,6 % (peso/peso) [Cohn et al., Biomacromolecules 2005, 6:1168-1175].
La reticulacion qrnmica (es decir, covalente) de las moleculas de FF127 se realizo anadiendo 0,1 % (peso/volumen) de iniciador Irgacure® 2959 a soluciones de FF127, e irradiando la solucion con luz UV (365 nm, 4-5 mW/cm2).
Como se muestra en la Figura 5, la reticulacion qrnmica de FF127 produjo un aumento irreversible en el modulo de almacenamiento.
Este resultado indica que se forma un hidrogel debido a la polimerizacion por radicales libres iniciada por UV de los grupos funcionales acrilo sobre las moleculas de FF127.
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Como se muestra en la Figura 6, el hidrogel qmmicamente reticulado presento un aumento dependiente de la temperatura en el modulo de almacenamiento y el modulo de perdida.
Como se muestra en la Figura 3B, el modulo de almacenamiento del hidrogel qmmicamente reticulado aumento repetidamente (hasta aproximadamente 300 Pa) y disminuyo aumentando la temperatura a 37 °C y reduciendo la temperatura a 15 °C, que indica una transicion reversible.
Este resultado indica que el hidrogel qmmicamente reticulado presenta adicionalmente transiciones de fase de GTI debidas a la reticulacion ffsica de ummeros de FF127, como se observa en FF127 sin reticulacion qmmica.
Como se muestra adicionalmente en las Figuras 3A y 3B, la gelacion de FF127 y FF127 qmmicamente reticulado a 37 °C se elimino gradualmente en presencia de colagenasa (que degrada el fibrinogeno), de un modo dependiente de la dosis.
Estos resultados indican que la gelacion termica inversa de tanto FF127 como FF127 qmmicamente reticulado esta asociada al peso molecular del fibrinogeno que forma el esqueleto de FF127. Como el fibrinogeno se degrado proteoffticamente por la colagenasa, los ummeros de FF127 se vuelven mas pequenos y asf se afecto la capacidad para formar una matriz polimerica ffsica.
Con el fin de explorar la estabilidad de las propiedades de la red de hidrogel bajo condiciones de carga aplicada, se prepararon hidrogeles a partir de FF127 (8 mg/ml) con o sin reticulacion qmmica y se expusieron a mediciones reologicas de barrido de tiempo a medida que se aumentaron gradualmente los niveles de tension de cizallamiento.
Como se muestra en la Figura 7, el hidrogel qmmicamente reticulado fue mas sensible a los cambios de temperatura en comparacion con el hidrogel ffsico, que presenta un mayor modulo de almacenamiento a 37 °C, pero colapso bajo menos tension oscilante (70 Pa) que el hidrogel ffsico (200 Pa).
Como se muestra adicionalmente en el presente documento, cuando se elimino la tension aplicada a 37 °C, el hidrogel qmmicamente reticulado se restauro casi completamente, mientras que el hidrogel ffsicamente reticulado se recupero solo ligeramente de la tension aplicada. Sin embargo, el reducir la temperatura a 15 °C y elevarla de nuevo a 37 °C restauro completamente las propiedades mecanicas de ambos hidrogeles.
Estos resultados indican que las propiedades de los geles pueden “resetearse” reduciendo y aumentando la temperatura.
Ejemplo 3
Efecto de la temperatura de reticulacion sobre las propiedades ftsicas de hidrogeles de conjugado de poloxamero F127-fibrin6geno (FF127)
Como las interacciones entre moleculas del conjugado de FF127 son dependientes de la temperatura, se planteo la hipotesis de que la temperatura durante la reaccion de reticulacion qmmica (Tret) influyera en la reaccion de reticulacion qmmica. La reticulacion qmmica de una red de hidrogel en presencia de radicales libres puede depender de la movilidad de los precursores moleculares y de su probabilidad de formar reticulaciones qmmicas cuando experimentan una transicion ffsica dependiente de la temperatura.
Se formaron hidrogeles por reticulacion activada por UV, como se describe en el Ejemplo 2, a diferentes temperaturas.
Como se muestra en la Figura 8, el valor de G' de los hidrogeles a 37 °C fue inversamente proporcional a la temperatura a la que se realizo la reticulacion inducida por UV. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, los valores de G' de hidrogeles qmmicamente reticulados a diferentes temperaturas fueron casi identicos a 15 °C.
Estos resultados indican que la reticulacion ffsica tiene un efecto altamente significativo sobre las propiedades ffsicas que caracterizan las redes qmmicamente reticuladas, ya que las propiedades de los diversos hidrogeles variaron considerablemente a 37 °C, cuando la reticulacion ffsica esta presente, pero no a 15 °C, cuando la reticulacion ffsica esta ausente.
Ejemplo 4
Captation de agua por los hidrogeles de conjugado de poloxamero F127-fibrin6geno (FF127)
Se determino la captacion de agua de las construcciones de hidrogel de FF127 reticulado como se describe en la seccion de Materiales y metodos anterior en este documento. Se reticulo FF127 a una temperatura de 21 °C o a una
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temperatura de 37 °C. Como control, se determino la captacion de agua de hidrogeles de PEG (12 kDa)-fibrinogeno reticulados como se describe anteriormente en este documento.
La captacion de agua en cada hidrogel representa una medida caractenstica de su estado de equilibrio entre agua y matriz polimerica, y da una indicacion de las fuerzas estructurales implicadas en formar y sostener la red de hidrogel. La relacion de hinchamiento (Qm) se midio para los tres hidrogeles a dos temperaturas ambiente separadas, 4 °C y 37 °C.
Como se muestra en la Figura 9, no hubo diferencia significativa en la relacion de hinchamiento entre los diferentes hidrogeles a 4 °C, mientras que a 37 °C, FF127 y PEG-fibrinogeno presentan propiedades significativamente diferentes. Los hidrogeles de fF127 expulsaron agua cuando se calentaron a 37 °C, pero no los hidrogeles de PEG- fibrinogeno.
Como se muestra en las Figuras 9, 10A y 10B, el FF127 reticulado a 21 °C expulso mas agua que el FF127 reticulado a 37 °C.
Estos resultados indican que a una temperatura a la que los efectos de la gelacion termica inversa son despreciables (por ejemplo, 4 °C), los diferentes polfmeros reticulados presentan propiedades similares, mientras que a una temperatura a la que los efectos de la gelacion termica inversa son significativos (por ejemplo, 37 °C), el grado de gelacion termica inversa afecta las propiedades de hinchamiento de las redes de polfmero.
Ejemplo 5
Comparacion de la biodegradacion y propiedades reologicas de los hidrogenes de conjugado de poloxamero F127- fibrinogeno (FF127)
Se determino la cinetica de biodegradacion de FF127 qmmicamente reticulado e hidrogeles de PEG (12 kDa)- fibrinogeno en una solucion de 0,01 mg/ml de tripsina a 37 °C, como se describe anteriormente en este documento. Los hidrogeles de FF127 se reticularon a temperaturas de 21 °C y 37 °C y se compararon. Los hidrogeles se reticularon por exposicion a UV, como se describe anteriormente en este documento.
Los modulos de almacenamiento de los hidrogeles se determinaron como se describe anteriormente en este documento. Para comparacion, se preparo un hidrogel por reticulacion de diacrilato de F127 a 37 °C y se determino el modulo de almacenamiento.
Como se muestra en la Figura 11, hubo una diferencia estadfsticamente significativa entre los tres materiales en terminos de su tasa de biodegradacion (p<0,05). Los hidrogeles preparados a partir de PEG-fibrinogeno se degradaron los mas rapidos, con una semivida de 105 ± 5,4 minutos, y se degradaron completamente despues de 24 horas en 0,01 mg/ml de tripsina. Los hidrogeles preparados de FF127 alcanzaron solo ~60 % de degradacion despues de 24 horas. La semivida de los hidrogeles de FF127 fue 420 ± 66 minutos cuando se reticularon a 37 °C, y 580 ± 90 minutos cuando se reticularon a 21 °C.
Como se muestra en la Figura 12, el modulo de almacenamiento de FF127 reticulado a 37 °C fue similar al del PEG- fibrinogeno, y considerablemente menos que el de FF127 reticulado a 21 °C. Como se muestra adicionalmente en el presente documento, el modulo de almacenamiento de FF127 reticulado a 21 °C fue similar al de diacrilato de F127 reticulado a 37 °C.
Asf, aunque la tasa de biodegradacion de FF127 reticulado fue mas lenta que la de PEG-fibrinogeno reticulado, y estuvo solo moderadamente afectada por la temperatura de reticulacion, el modulo de almacenamiento de FF127 reticulado se afecto fuertemente por la temperatura de reticulacion.
Estos resultados indican que los factores que determinan la tasa de biodegradacion (por ejemplo, tipo de polfmero) pueden seleccionarse relativamente independientemente de los factores que determinan las propiedades reologicas (por ejemplo, temperatura de reticulacion).
Ejemplo 6
Conjugado de T1307 Tetronic®-fibrinogeno
Se conjugo fibrinogeno con tetraacrilato de T1307 Tetronic® (preparado como se describe anteriormente en este documento) por una reaccion de adicion de tipo Michael, usando esencialmente los mismos procedimientos que se describen en el Ejemplo 1. Como se representa en las Figuras 13A y 13B, la conjugacion de un polfmero de tetraacrilato con fibrinogeno produce 3 grupos acrilato libres por polfmero conjugado (1 grupo acrilato une el fibrinogeno al polfmero), proporcionando elevada capacidad de reticulacion.
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La concentracion media de fibrinogeno y la eficiencia de conjugacion se determinaron para 4 lotes de T1307- fibrinogeno, como se describe en el Ejemplo 1.
La solucion obtenida de conjugado de T1307-fibrinogeno comprendio 20,4 ± 1,4 mg/ml de conjugado, 6,7 ± 1 mg/ml de fibrinogeno y 13,7 ± 0,5 mg/ml de poffmero sintetico. La eficiencia de conjugacion fue 66,3 ± 8,5 %.
Ejemplo 7
Propiedades fisicas de hidrogeles de T1307-fibrin6geno (FT1307)
El conjugado de T1307-fibrinogeno (FT1307) descrito en el Ejemplo 6 se reticulo qmmicamente por luz UV a una concentracion de 6 mg/ml, a temperaturas de 4 °C, 21 °C o 37 °C. Se determinaron las propiedades reologicas, captacion de agua y biodegradacion de los hidrogeles obtenidos, como se describe anteriormente en este documento.
Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, la temperatura de reticulacion de FT1307 se correlaciono inversamente con el modulo de almacenamiento a 37 °C.
Como se muestra en la Figura 15, la temperatura de reticulacion de FT1307 se correlaciono inversamente con la cantidad de agua expulsada del hidrogel cuando el hidrogel se calento hasta 37 °C. A diferencia, la temperatura de reticulacion tuvo poco efecto sobre la captacion de agua de los poffmeros a 4 °C.
A diferencia, como se muestra en la Figura 16, la temperatura de reticulacion de FT1307 no presento ninguna correlacion clara con las tasas de degradacion de FT1307.
Estos resultados son similares a aquellos presentados en los Ejemplos 3 y 4, e indican que la temperatura de reticulacion puede usarse para determinar las propiedades de hidrogeles de poffmero-protema formados usando una variedad de poffmeros de gelacion termica inversa, y que las propiedades reologicas de los hidrogeles pueden determinarse independientemente de las tasas de degradacion.
Ejemplo 8
Hidrogeles de F127-fibrin6geno (FF127) sembrados en celulas
Se prepararon construcciones de hidrogel sembradas en celulas por reticulacion inducida por UV de una solucion de conjugado de FF127 en presencia de fibroblastos de prepucio humano dispersos (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.), como se describe en la seccion de Metodos y materiales. Se prepararon construcciones sembradas con celulas de control a partir de PEG (12 kDa)-fibrinogeno y diacrilato del poloxamero F127. Muestras para histologfa se fijaron en 4 % de formalina en el dfa 3 y en el dfa 6 de cada experimento. Se tineron secciones transversales con hematoxilina y eosina (H & E) para la obtencion de imagenes.
Como se muestra en la Figura 17, la formacion de lamelipodios y una morfologfa de celulas fusiformes avanzo mas rapidamente en FF127 reticulado a 37 °C que en FF127 reticulado a 21 °C. En el dfa 3, las celulas en FF127 reticulado a 21 °C se redondearon relativamente y acababan de empezar a formar lamelipodios, mientras que en el FF127 reticulado a 37 °C, las celulas eran altamente fusiformes con muchos lamelipodios celulares. Por consiguiente, en el dfa 6, las celulas en FF127 reticulado a 21 °C habfan empezado a invadir la matriz mediante lamelipodios celulares, pero solo algunos eran completamente fusiformes, mientras que la mayona de las celulas en FF127 reticulado a 37 °C eran completamente fusiformes y presentaron muchos lamelipodios.
Como se muestra adicionalmente en el presente documento, en el PEG-fibrinogeno reticulado, que se caracteriza tanto por una biodegradabilidad relativamente alta como por modulo de almacenamiento bajo (como se muestra anteriormente en este documento), las celulas fueron altamente fusiformes en el dfa 3.
Como se muestra adicionalmente en el presente documento, en diacrilato de F127 reticulado, que carece de fibrinogeno, las celulas siguieron completamente redondas y no formaron extensiones celulares.
Las construcciones de hidrogel de FF127 sembradas en celulas tambien se prepararon por reticulacion ffsica a 37 °C sin reticulacion qmmica por luz UV. Las celulas en tales hidrogeles se compararon con aquellas en construcciones de hidrogel de FF127 qmmicamente reticulado a 37 °C.
Como se muestra en la Figura 18, las celulas en hidrogeles de FF127 con solo reticulacion ffsica y las celulas en hidrogeles de FF127 con tanto reticulacion ffsica como qmmica presentaron ambas una morfologfa similar. En el dfa 3 en ambos materiales, las celulas presentaron morfologfa fusiforme con protuberancias que invadieron la matriz, y en el dfa 6 en ambos materiales, las celulas se diseminaron completamente y tomaron forma altamente fusiforme.
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La viabilidad de las celulas encapsuladas se determino en el dfa 0 y en el dfa 3 de cada experimento. Las celulas se eliminaron de la construccion disolviendo el fibrinogeno en solucion de 0,4 mg/ml de colagenasa 1A durante 4 horas, seguido de 5 minutos de centrifugacion (1000 rotaciones por minuto). El sedimento se redisolvio en 100 pl de solucion de tincion que contema homod^ero 1 de etidio 0,004 mM y 2 mg/ml de Hoechst 33342 en PBS. Las celulas se tineron durante 30 minutos sobre un agitador orbital en la oscuridad y a continuacion se centrifugaron durante 5 minutos (1000 rotaciones por minuto). El sedimento de celulas se disolvio en 25 pl de PBS, y se obtuvieron imagenes en un portaobjetos de microscopio de vidrio recubierto con un cubreobjetos. Se obtuvieron imagenes de las celulas tenidas por microscopfa fluorescente. Se contaron las celulas vivas y muertas y se normalizaron por una suspension de control que no se expuso a luz UV.
Como se muestra en la Figura 19, la viabilidad de celulas en FF127 qmmicamente reticulado fue al menos el 88 % en el dfa 0 y al menos el 85 % en el dfa 3. La viabilidad celular en ambos dfas fue mayor en FF127 reticulado a 37 °C que en FF127 reticulado a 21 °C, aunque las diferencias no fueron estadfsticamente significativas.
Los resultados anteriores indican que los hidrogeles formados a partir de conjugados de poloxamero-fibrinogeno, que incluyen hidrogeles con y sin reticulacion qmmica de los conjugados, pueden servir de matrices para el crecimiento e invasion celulares. Los resultados indican adicionalmente que la tasa de invasion celular puede modularse seleccionando las propiedades ffsicas del gel, por ejemplo, seleccionando una temperatura de reticulacion adecuada.
Ejemplo 9
Crecimiento hacia afuera celular en hidrogeles de F127-fibnnogeno (FF127)
Se realizaron experimentos de crecimiento hacia afuera usando una construccion de tejido densa hecha de celulas de musculo liso aorticas bovinas compactadas (Genlantis) sembradas en geles de colageno. Cada gel de colageno sembrado en celulas compactadas se encapsulo dentro de un hidrogel de FF127. Como control, un gel de colageno sembrado en celulas compactadas se encapsulo dentro de un hidrogel de PEG-fibrinogeno.
El tejido basado en colageno se preparo una solucion de 5 x DMEM, 10 % de suero bovino fetal, solucion de colageno tipo I reconstituida en acido acetico 0,02 N (2 mg/ml) y NaOH 1 M con celulas de musculo liso dispersas a una concentracion de 3x106 celulas/ml. Los geles de colageno sembrados en celulas se cultivaron durante 2 dfas en medio de cultivo antes de poner el tejido compactado en 300 pl de solucion de conjugado de FF127 (o PEG- fibrinogeno) y fotoiniciador en una placa de 48 pocillos. Despues de la exposicion a 5 minutos de luz UV a 37 °C o 21 °C, el tejido encapsulado se cultivo dentro del hidrogel con 500 pl de medio de cultivo. El crecimiento hacia afuera celular del gel de colageno en la matriz que encapsula FF127 (o PEG-fibrinogeno) se monitorizo diariamente durante hasta 5 dfas. Los resultados del crecimiento hacia afuera se cuantificaron midiendo la distancia recorrida promedio de las celulas de los margenes del tejido de colageno denso en el hidrogel de FF127 (o PEG-fibrinogeno) usando micrograffas de contraste de fase de las muestras tomadas a intervalos de tiempo fijados.
Como se muestra en las Figuras 20A y 20B, en cada uno de los tres materiales probados (FF127 reticulado a 21 °C y a 37 °C, y PEG-fibrinogeno reticulado), las celulas empezaron a invadir la matriz que rodea la masa de tejido despues de 1 dfa y continuaron invadiendo la matriz durante la duracion del experimento.
Como se muestra en la Figura 20B, la tasa de invasion en el FF127 reticulado a 37 °C siguio siendo constante durante la duracion del experimento, mientras que la tasa de invasion disminuyo en FF127 reticulado a 21 °C y en el PEG-fibrinogeno, a partir del tercer dfa del experimento. Empezando en el dfa 3, hubo una diferencia estadfsticamente significativa entre la distancia de migracion de celulas en FF127 reticulado a 21 °C y en FF127 reticulado a 37 °C. En el dfa 4, la distancia que recorrieron las celulas fue el 21 % inferior en FF127 reticulado a 21 °C que en FF127 reticulado a 37 °C, y en el dfa 5 la distancia fue del 11 % inferior en FF127 reticulado a 21 °C. Las celulas invasoras no presentaron una diferencia morfologica entre los tres materiales probados.
Estos resultados indican adicionalmente que la tasa de invasion celular puede modularse seleccionando las propiedades ffsicas del gel.
Ejemplo 10
Hidrogeles de T1307-fibrinogeno (FT1307) sembrados en celulas
Se prepararon construcciones de hidrogel sembradas en celulas por reticulacion inducida por UV de una solucion de conjugado de FT1307 en presencia de fibroblastos de prepucio humano y celulas HeLa de adenocarcinoma humano, como se describe en la seccion de Metodos y materiales. Se prepararon construcciones sembradas en celulas de control a partir de tetraacrilato de T1307.
Con el fin de visualizar las celulas sembradas y determinar su viabilidad, las construcciones sembradas en celulas se colocaron en un pocillo que contema 2 ml de calcema AM 4 mM y homodfmero 1 de etidio 2 mM en DMSO, y se
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incubaron durante 45 minutes. Las celulas viables se tinen por calcema y las celulas no viables se tinen por etidio. Cada construccion se lavo entonces dos veces durante l5 minutos en PBS con el fin de eliminar el exceso de moleculas de colorante. Entonces se obtuvieron imagenes de las celulas por microscopfa fluorescente.
Como se muestra en la Figura 21, la diseminacion de celulas de fibroblastos avanzo relativamente rapidamente en FT1307 reticulado a 37 °C, y mas lentamente en FT1307 reticulado a 21 °C, y se detuvo casi completamente en FT1307 reticulado a 4 °C. La tasa de diseminacion de celulas se correlaciono inversamente con el modulo de almacenamiento, que fue 52 Pa, 244 Pa y 373 Pa siguiendo las temperaturas de reticulacion de 37 °C, 21 °C y 4 °C, respectivamente.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 21, la viabilidad celular fue alta en los tres tipos de matrices de FT1307, como se evidencia por la escasez de tincion con etidio (color naranja).
Como se muestra en la Figura 22, las colonias de celulas HeLa fueron relativamente densas y se confinaron en FT1307 reticulado a 4 °C, algo menos densas y se confinaron en FT1307 reticulado a 21 °C, y relativamente dispersas en FT1307 reticulado a 37 °C.
Los resultados anteriores indican que la tasa de diseminacion celular y la estructura de las colonias de celulas estan afectadas por las propiedades ffsicas de la matriz, que puede determinarse por la temperatura de reticulacion.
Ejemplo 11
Crecimiento hacia afuera celular en hidrogeles de F127-fibrin6geno (FF127) encapsulados dentro de hidrogeles de T1307-fibrin6geno (FT1307)
Se realizaron experimentos de crecimiento hacia afuera usando capsulas de FF127 ffsicamente reticulado que conteman cultivos o co-cultivos de fibroblastos dermicos humanos y celulas HeLa, que estuvieron atrapados en hidrogeles qmmicamente reticulados de FT1307. Se suspendieron celulas tripsinadas en 500 pl de solucion de conjugado de FF127 a una concentracion de 107 celulas/ml, y se cargaron en una jeringa de 30G Micro-Fine™ (BD, New Jersey, EE.UU.).
Como se muestra en la Figura 23A, mientras que se mantema la temperatura inferior a 20 °C, gotas 20 de la suspension de celulas en FF127 se anadieron de la jeringa 10 a un medio 30 de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) suavemente agitada mantenido a una temperatura de 37 °C. Las gotas 20 gelificaron tras la exposicion a una temperatura de 37 °C en medio 30 de PBS, formando capsulas 40 sembradas en celulas. Las capsulas 40 sembradas en celulas se aislaron y se incubaron en medio de cultivo celular DMEM durante 2 dfas a 37 °C, y luego se sembraron en 300 pl de solucion de conjugado de FT1307 con un fotoiniciador (0,1 % peso/volumen), y se expusieron a luz UV durante 5 minutos a temperaturas de 37 °C, 21 °C o 4 °C.
Como se muestra en la Figura 23B, este procedimiento produjo una construccion co-polimerica - de manera que atrapa las capsulas 50 de FF127 ffsicamente reticulado relativamente blandas dentro de un medio 60 de FT1307 qmmicamente reticulado mas duro.
Como se describe anteriormente en este documento, las temperaturas de reticulacion de 37 °C, 21 °C o 4 °C produjeron modulos de almacenamiento de FT1307 de 52 Pa, 244 Pa y 373 Pa, respectivamente.
Como se muestra en las Figuras 24A y 24B, los fibroblastos presentaron crecimientos hacia afuera en un hidrogel con un bajo modulo de almacenamiento (52 Pa), pero no en un hidrogel con un alto modulo de almacenamiento (373 Pa).
En comparacion, como se muestra en las Figuras 25A y 25B, las celulas HeLa presentaron diferentes estrategias de migracion/invasion en hidrogeles con diferentes modulos; las celulas presentaron migracion ameboide individual en un hidrogel con un bajo modulo de almacenamiento (52 Pa) y migracion multicelular colectiva en un hidrogel con un alto modulo de almacenamiento (373 Pa).
Los co-cultivos de celulas HeLa y fibroblastos se sembraron en capsulas de FF127 dentro de hidrogeles de FT1307 con el fin de evaluar como el modulo del hidrogel afecta el desarrollo de cultivos heterogenicos. Con el fin de diferenciar entre fibroblastos y celulas HeLa, se co-cultivaron fibroblastos marcados con GFP (protema verde fluorescente) y celulas HeLa tenidas con Dil (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3'3'-tetrametilindocarbocianina).
Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, en un hidrogel de FT1307 con un alto modulo de almacenamiento (373 Pa), las celulas HeLa se empujaron en el hidrogel de FT1307, aumentando el diametro de la capsula, mientras que se detuvo el crecimiento hacia afuera de fibroblastos.
5 Como se muestra en las Figuras 27A y 27B, en un hidrogel de FT1307 con un bajo modulo de almacenamiento (52 Pa), el frente de la capsula estuvo dominado por fibroblastos, que realizaron eficazmente la migracion mesenquimatosa en el hidrogel de FT1307.
Los resultados anteriores indican que el crecimiento hacia afuera de celulas de cultivos homogeneos y heterogeneos 10 puede modularse segun las propiedades ffsicas de un hidrogel de alrededor.
Los resultados anteriores indican adicionalmente que pueden prepararse hidrogeles heterogeneos a partir de mas de un tipo de conjugado de polfmero-protema.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado que comprende un polipeptido que tiene, unido al mismo, al menos dos restos polimericos, comprendiendo cada uno de dichos restos polimericos un poloxamero, en el que dicho polipeptido comprende una protefna de la matriz extracelular.
  2. 2. El conjugado de la reivindicacion 1, en el que al menos uno de dichos restos polimericos comprende ademas al menos un resto de reticulacion para la reticulacion covalente de una pluralidad de moleculas del conjugado entre si.
  3. 3. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha protefna de la matriz extracelular esta seleccionada del grupo que consiste en fibrinogeno, colageno, elastina y fibronectina.
  4. 4. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho polipeptido comprende un fibrinogeno.
  5. 5. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la generacion de un armazon.
  6. 6. Una composicion de materia que comprende una forma reticulada del conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicha forma reticulada una pluralidad de moleculas del conjugado reticuladas entre si.
  7. 7. La composicion de materia de la reivindicacion 6, en la que al menos uno de dichos restos polimericos comprende ademas un resto de reticulacion, y dicha pluralidad de moleculas del conjugado se reticulan covalentemente entre si.
  8. 8. La composicion de materia de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en inducir una formacion de un tejido in vivo.
  9. 9. La composicion de materia de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en reparar dano tisular in vivo induciendo una formacion de un tejido in vivo y/o induciendo una formacion de un tejido ex vivo e implantar el tejido obtenido y/o composicion de materia que comprende el tejido formado en un sujeto.
  10. 10. Un proceso de produccion de la composicion de materia de la reivindicacion 6, comprendiendo el proceso calentar una solucion de una pluralidad de moleculas de un conjugado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 de una primera temperatura a una segunda temperatura, siendo dicha segunda temperatura tal que se efectue una gelacion termica inversa del conjugado en dicha solucion, produciendo asf la composicion de materia.
  11. 11. Un proceso de produccion de la composicion de materia de la reivindicacion 7, comprendiendo el proceso someter una solucion que comprende una pluralidad de moleculas de un conjugado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, comprendiendo dicho conjugado al menos un resto de reticulacion, a condiciones que efectuan la reticulacion covalente de dichos restos de reticulacion, produciendo asf la composicion de materia.
  12. 12. Un metodo de control de una propiedad ffsica de una composicion de materia de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, comprendiendo el metodo el control de un parametro seleccionado del grupo que consiste en una concentracion de un conjugado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en dicha solucion, una temperatura ambiente, una presencia o ausencia de un iniciador, una dosis de irradiacion durante la reticulacion covalente, y una temperatura de reticulacion.
  13. 13. Un metodo de induccion de la formacion de un tejido ex vivo, comprendiendo el metodo someter la composicion de materia de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que la composicion de materia comprende ademas celulas en su interior, a condiciones propicias para el crecimiento de dichas celulas, para asf inducir la formacion de tejido.
  14. 14. Una composicion farmaceutica, cosmetica o cosmeceutica que comprende una pluralidad de moleculas del conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, siendo la composicion para su uso en inducir la formacion de un tejido in vivo tras ponerse en contacto con un tejido y adicionalmente tras someter dicha composicion a una temperatura fisiologica.
  15. 15. Un kit para inducir la formacion de un tejido, comprendiendo el kit:
    (a) el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5;
    (b) un disolvente acuoso; y
    (c) instrucciones para la reticulacion de una solucion acuosa de dicho conjugado con el fin de formar un armazon para inducir la formacion de dicho tejido.
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