CN114887123B - 水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用。制备方法包括：(1)将宽体金线蛭冻干后粉碎，用PBS缓冲液提取过滤得到水蛭素粗提液；(2)将水解角蛋白和三(2‑羧乙基)膦盐酸盐一同加入到水蛭素粗提液，透析后，截留液加热后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；(3)将水蛭素接枝人发角蛋白溶于六氟异丙醇，静电纺丝后，得到纳米纤维血管支架材料。该纳米纤维支架将水蛭素固定化，能局部过滤血液中的凝血酶，具有抗凝血的效果。

Description

水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用。

背景技术

水蛭素是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子多肽。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。水蛭素具有极强的抑制凝血作用和抗血栓形成作用，在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着广阔的应用前景。

此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。

但是水蛭素大剂量使用可能会引起出血，治疗期间为安全起见定期测定凝血酶时间进行监控，使其应用受到了限制。水蛭的副作用对于贫血的病人来说尤为明显。贫血的人一旦服用水蛭，其凝血的时间就会相应地延长。如果贫血的病人出现出血的情况是很难止住的。特别是对于那些贫血的孕妇，水蛭导致的伤害更是明显，会出现死胎和吸收胎情况，甚至造成终止妊娠、堕胎的恶果。

发明内容

为了克服水蛭素使用的不良反应并进一步增强材料的抗凝血活性，本发明所要解决的技术问题是提供一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用，本发明制备的血管支架材料将水蛭素固定化，能局部过滤血液中的凝血酶，具有抗凝血的效果，可应用于血管支架的制备。

本发明采用的技术方案如下：

一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，包括如下步骤：

S1：将宽体金线蛭冻干后液氮粉碎，用PBS缓冲液提取过滤得到水蛭素粗提液；

S2：将水解角蛋白和三(2-羧乙基)膦盐酸盐一同加入到水蛭素粗提液，透析后，截留液水浴加热后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；

S3：将水蛭素接枝人发角蛋白溶于六氟异丙醇，搅拌得到纺丝液，静电纺丝后，得到纳米纤维血管支架材料。

优选的，步骤S1中，所述的宽体金线蛭、液氮、PBS缓冲液的比例为1g:(10-22)mL:(15-40)mL，最优为1g:16mL:34mL。

优选的，步骤S1中，所述的提取和过滤温度为0-8℃，最优为3℃。

优选的，步骤S2中，水解角蛋白、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和水蛭素粗提液的比例为(5-8)g:(0.8-2)g:50mL，最优为6g:1.3g:50mL。

优选的，步骤S2中，透析截留分子量为2000-5000，最优为4000。

优选的，步骤S2中，所述的水浴加热温度为50-80℃，最优为60℃；加热时间为3-9h，最优为7h。

优选的，步骤S3中，水蛭素接枝人发角蛋白在六氟异丙醇中的浓度为20-60g/L，最优为44g/L。

优选的，步骤S3中，静电纺丝采用21G不锈钢针头；静电纺丝条件为，电压12-25kV，最优为20kV；距离7-20cm，最优为10cm；纺丝液进样速率0.5-1.0mL/h，最优为0.7mL/h；温度25-35℃，最优为32℃；相对湿度为20-30％，最优为22％。

本发明还提供了一种上述的制备方法制备得到的水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料。

本发明还提供了一种上述水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料在血管支架制备中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)水蛭素的N末端有3对二硫键，使N末端肽链绕叠成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。水蛭素C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。本申请利用水蛭素结构特征，将二硫键断开，并与角蛋白上的半胱氨酸重新连接，接枝使水蛭素的蛋白结构更加稳固。同时不影响水蛭素C末端的10个氨基酸，其为实现水蛭素功能必需的最小结构，C末端的最佳大小至少是12个氨基酸(Hir54-65)，在这一序列中每个氨基酸都非常重要。此外，利用三(2-羧乙基)膦盐酸盐同时将水蛭素N端和角蛋白中的二硫键断开，实现重构，能够实现交错的网络结构，完成了水蛭素的固定化。

2)将水蛭素固定在纳米纤维中，可以实现局部抗凝血，防止因水蛭素过量导致的副作用的发生，使水蛭素能够用于贫血患者。

3)采用纳米纤维接枝固定化水蛭素，能够最大化反应的表面积，实现水蛭素抗凝血功能。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1、将2g宽体金线蛭冻干后，加入32mL液氮粉碎，用68mL PBS缓冲液在3℃下提取过滤得到水蛭素粗提液；

2、取50mL步骤1制备的水蛭素粗提液，加入6g水解角蛋白和1.3g三(2-羧乙基)膦盐酸盐，用截留分子量为4000的半透膜透析后，截留液水浴加热至60℃后保温7h，之后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；

3、将0.88g步骤2制备的水蛭素接枝人发角蛋白溶于20mL六氟异丙醇，搅拌得到纺丝液，静电纺丝，条件为21G不锈钢针头，电压20kV，距离10cm，纺丝液进样速率0.7mL/h，温度32℃，相对湿度22％，即得一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料。

实施例2：

1、将2g宽体金线蛭冻干后，加入20mL液氮粉碎，用30mL PBS缓冲液在0℃下提取过滤得到水蛭素粗提液；

2、取50mL步骤1制备的水蛭素粗提液，加入8g水解角蛋白和0.8g三(2-羧乙基)膦盐酸盐，用截留分子量为2000的半透膜透析后，截留液水浴加热至50℃后保温9h，之后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；

3、将0.4g步骤2制备的水蛭素接枝人发角蛋白溶于20mL六氟异丙醇，搅拌得到纺丝液，静电纺丝，条件为21G不锈钢针头，电压12kV，距离20cm，纺丝液进样速率1mL/h，温度25℃，相对湿度20％，即得一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料。

实施例3：

1、将2g宽体金线蛭冻干后，加入44mL液氮粉碎，用80mL PBS缓冲液在8℃下提取过滤得到水蛭素粗提液；

2、取50mL步骤1制备的水蛭素粗提液，加入5g水解角蛋白和2g三(2-羧乙基)膦盐酸盐，用截留分子量为5000的半透膜透析后，截留液水浴加热至80℃后保温3h，之后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；

3、将1.2g步骤2制备的水蛭素接枝人发角蛋白溶于20mL六氟异丙醇，搅拌得到纺丝液，静电纺丝，条件为21G不锈钢针头，电压25kV，距离7cm，纺丝液进样速率0.5mL/h，温度35℃，相对湿度30％，即得一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料。

抗凝血活性测试：

含牛纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液的配制：0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25mL与0.1mol/L盐酸溶液约40mL，加水至100mL，调节pH值至7.4，加入牛纤维蛋白原0.5g。

凝血酶溶液的配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1mL含凝血酶2个单位的溶液。

生理盐水的配制：0.9g氯化钠加入到100mL去离子水中，搅拌溶解。

取实施例1-3的材料0.05g，加入生理盐水5mL，充分搅拌，浸提30分钟，并振摇，离心，量取上清液100μL，置离心管中，加入含牛纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液200μL，摇匀，置水浴中37℃温浸5分钟，滴加凝血酶溶液，每1分钟滴加1次，每次2μL，边滴加边轻轻摇匀至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：

U＝(C1V1/C2V2)

式中U——每1g含凝血酶活性单位，U/g；

C1——凝血酶溶液的浓度，U/mL；

C2——供试品溶液的浓度，g/mL；

V1——消耗凝血酶溶液的体积，μL；

V2——供试品溶液的加入量，μL。

表1材料的抗凝血活性

	抗凝血活性U/g
		实施例1	60.8±3.0
实施例2	57.6±2.0
		实施例3	55.2±1.6

通过材料的抗凝血活性测试(表1)可知，实施例制备的材料具有优良的抗凝血活性。

抗凝血时间测试：

取0.2g实施例1-3样品放入试管中，将实验兔固定，从兔子心脏处采集血液3mL，沿管壁向待测样品试管缓慢注入血液2mL，轻轻倒立试管使血液与抗凝剂混和均匀，然后将试管浸没在37℃恒温水浴中。从血液进入注射器时开始记录时间，3min后，每隔30s缓慢将试管倾斜一次，直至血液不能流动为止，记录该时间，即为该样品全血凝固时间(CT)。每个样品测量五次。

溶纤实验：

采用纤维蛋白平板法，测定材料的溶纤活性。配制5mL 10mg/mL纤维蛋白原溶液和1mL 20U/mL凝血酶加入到2％琼脂糖溶液中摇匀，倒入培养皿中室温静置30min后用打孔器打孔。每个孔中分别加入0.1g实施例材料，37℃保温3h，测定乳白色平板上的透明圈直径。

体外溶血实验：

取5支洁净的离心管，分别加入0.05、0.10、0.15、0.20和0.40g样品，向各离心管加入4.5mL 37℃预热的兔心脏血液，轻轻晃动混匀，再放入37℃恒温水浴中60min后，慢慢取出1000r/min离心5min，取上层清液，在570nm波长下，测定其吸光值。以9g/L NaCl溶液作为阴性对照，以蒸馏水作为阳性对照，用溶血率对样品的溶血性能进行评价。

根据下式计算样品的溶血率：

溶血率＝(D-D0)/(D1-D0)×100％

式中，D：样品吸光值；D0：阴性对照吸光值；D1：阳性对照吸光值。

表2材料的全血凝固时间、溶纤圈直径及溶血率

	全血凝固时间(’)	溶纤圈直径(mm)	溶血率(％)
				实施例1	252±14	24.2±2.7	2.8
实施例2	219±10	22.1±3.6	2.0
				实施例3	213±5	19.4±2.2	1.8

全血凝固时间测试和溶纤实验结果(表2)表明，实施例材料处理的血液凝固时间达到了200’以上，抗凝血效果突出，实施例的溶纤效果也非常显著。血液相容性研究结果(表2)表明，本发明的血管支架材料溶血率<5％，符合生物材料和医疗器械对溶血性的要求，证实本发明产品具有良好的稳定性和生物相容性，可应用于血管支架制备。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将宽体金线蛭冻干后液氮粉碎，用PBS缓冲液提取过滤得到水蛭素粗提液；

S2：将水解角蛋白和三(2-羧乙基)膦盐酸盐一同加入到水蛭素粗提液，透析后，截留液水浴加热后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；

S3：将水蛭素接枝人发角蛋白溶于六氟异丙醇，搅拌得到纺丝液，静电纺丝，得到纳米纤维血管支架材料。

2.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述的宽体金线蛭、液氮、PBS缓冲液的比例为1g:(10-22)mL:(15-40)mL。

3.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述的提取和过滤温度为0-8℃。

4.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，水解角蛋白、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和水蛭素粗提液的比例为(5-8)g:(0.8-2)g:50mL。

5.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，透析截留分子量为2000-5000。

6.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述的水浴加热温度为50-80℃，加热时间为3-9h。

7.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，水蛭素接枝人发角蛋白在六氟异丙醇中的浓度为20-60g/L。

8.根据权利要求1所述的一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，静电纺丝采用21G不锈钢针头；静电纺丝条件为，电压12-25kV，距离7-20cm，纺丝液进样速率0.5-1.0mL/h，温度25-35℃，相对湿度为20-30％。

9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料。

10.权利要求9所述的水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料在血管支架制备中的应用。