CN115671390B - 一种复合型胶原蛋白组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种复合型胶原蛋白组合物及其制备方法，属于整形材料领域，所述的复合型胶原蛋白组合物中包括胶原复合纤维，所述的胶原复合纤维中包括I型、III型和V型胶原，其中I型胶原的占比为20%‑59.8%，III型胶原的占比为40%‑79.8%，V型胶原的占比为0.2%‑2%。本发明提供的复合型胶原蛋白组合物具有更好的支撑性和内聚性，收缩程度小，且能促进皮肤中的细胞分泌新生胶原，实现皮肤的再生修复和年轻化。

Description

一种复合型胶原蛋白组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于整形材料领域，具体涉及一种复合型胶原蛋白组合物及其制备方法。

背景技术

在医美微整形领域，胶原作为一种天然的皮肤主要成分，是一种较为理想的软组织填充材料。不同于透明质酸钠类材料，胶原具有融合度好、不易透光、效果自然等特点，且具备促进组织再生修复的功能，因此在医美微整形领域始终占据着一席之地。

目前的胶原类填充材料的胶原类型为I型胶原，或者以I型胶原为主，含有少量的III型胶原（不大于15%）。I型胶原填充材料是由I型胶原分子在一定条件下发生自组装形成I型胶原纤维，分散于生理盐水或磷酸盐缓冲液中，呈可注射的凝胶状。由于I型胶原自组装形成纤维的特点，目前的胶原填充材料支撑性差、弥散度大，仅适合应用于程度较轻的皱纹的改善和相对较浅层的注射，对于程度较大的皱纹的改善或是相对较深层次的注射效果欠佳，限制了其应用部位和层次。同时材料在植入后体积收缩严重，通常需要补充注射才能满足预期的填充效果。另外，现有材料在改善肤质、促进组织再生的效果仍具有进一步提高的空间。

申请号为CN201810580957.6的中国专利中公开了：一种软组织填充材料及其制备方法与应用。针对注射填充胶原的不足，提供一种用D-核糖为交联剂对动物胶原蛋白进行交联反应制备而成的注射用胶原蛋白。通过特殊的胶原纯化再生技术，降低了病毒感染以及免疫排斥的风险；选用人体细胞本身含有的物质为交联剂，提升了植入后的安全性，且延长了植入后的降解时间；特殊的交联技术，增加胶原溶解度，缩短交联时间，提升交联效率，降低生产成本。但其对于材料的支撑力提升不大。

申请号为CN201710623512.7的中国专利中公开了：一种注射用胶原蛋白及其制备方法，注射用胶原蛋白含有经过交联的胶原蛋白颗粒，胶原蛋白颗粒均匀分散在磷酸盐缓冲液中。可用于人体皮肤组织填充修复，包括去除皱纹和修复凹陷性疤痕。可以注射到皱纹、凹陷性疤痕、创伤性皮肤真皮中以及嘴唇等部位，以达到填充、修复的目的。但其功效水平仍停留在普通产品水平。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种复合型胶原蛋白组合物，该复合型胶原蛋白组合物由胶原复合纤维悬浮分散于平衡盐溶液中，呈凝胶状；胶原复合纤维中包含I型、III型和V型胶原。为医美微整形领域提供了效果更好的新材料。

一方面，本发明提供了一种复合型胶原蛋白组合物。

所述的复合型胶原蛋白组合物中包括胶原复合纤维。

优选地，所述的复合胶原蛋白组合物为复合胶原蛋白凝胶。

所述的胶原复合纤维中包括I型、III型和V型胶原，其中I型胶原的占比为20%-59.8%，III型胶原的占比为40%-79.8%，V型胶原的占比为0.2%-2%。

优选地，所述的I型胶原的占比为20%-55%、30%-55%或33%-55%。

优选地，所述的III型胶原的占比为43%-79.8%、43%-68.5%或43%-66%。

优选地，所述的V型胶原的占比为1%-2%、1.5%-2%或1.8%-2%。

进一步优选地，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为30%-55%，III型胶原的占比为43%-68.5%，V型胶原的占比为1.5%-2%。

在一些实施例中，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为55%，III型胶原的占比为43%，V型胶原的占比为2%。

在一些实施例中，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为33%，III型胶原的占比为66%，V型胶原的占比为1%。

在一些实施例中，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为30%，III型胶原的占比为68.5%，V型胶原的占比为1.5%。

所述I型胶原为两条α1（I）链和一条α2（I）链结合在一起形成完整三螺旋结构的胶原。

所述III型胶原为三条α1（III）链结合在一起形成完整三螺旋结构的胶原。

所述V型胶原为一条α1（V）链、一条α2（V）和一条α3（V）链结合在一起形成完整三螺旋结构的胶原。

所述I型、III型、V型胶原均由哺乳动物的组织提取并经过纯化得到。

优选地，所述哺乳动物为猪或牛。

具体地，所述的复合型胶原蛋白组合物由所述的胶原复合纤维悬浮分散于平衡盐溶液中制备。

具体地，所述的复合型胶原蛋白组合物中胶原复合纤维的含量为20-75mg/mL。

具体地，所述的复合型胶原蛋白组合物中胶原复合纤维的含量可以是25-50mg/mL、30-40mg/mL、30-75mg/mL、35-75mg/mL、40-75mg/mL或50-75mg/mL。

优选地，所述的复合型胶原蛋白组合物中胶原复合纤维的含量为20-50mg/mL。

进一步优选地，所述的复合型胶原蛋白组合物中胶原复合纤维的含量为30-40mg/mL。

具体地，所述的平衡盐溶液为pH在6.5-8.0、渗透压在250-350mOsm/L的电解质溶液。

优选地，所述的平衡盐溶液为pH在6.8-7.5、渗透压在270-320mOsm/L的磷酸盐缓冲液或生理盐水。

再一方面，本发明提供了前述的复合型胶原蛋白组合物在医学整形和制备用于医学整形的产品中的应用。

所述的医学整形可以是软组织注射填充。

具体地，所述的产品中包括前述的复合型胶原蛋白组合物。

具体地，所述的产品类型可以是：复合型胶原填充剂或胶原植入剂。

又一方面，本发明提供了一种用于医学整形的产品。

具体地，所述的产品中包括前述的复合型胶原蛋白组合物。

具体地，所述的产品类型可以是：复合型胶原填充剂或胶原植入剂。

又一方面，本发明提供了一种复合型胶原蛋白组合物的制备方法。

所述的制备方法用于制备前述的复合型胶原蛋白组合物。

具体地，所述的制备方法中包括以下步骤：

（1）按比例分别称取I、III、V型胶原低温溶解于盐酸溶液中，得到复合胶原溶液；

（2）低温下调节溶液至中性；之后溶液程序升温诱导各型别胶原复合自组装形成胶原复合纤维；

（3）将胶原复合纤维浓缩；

（4）将浓缩后的胶原复合纤维分散于平衡盐溶液中，得到复合型胶原蛋白组合物。

优选地，所述的步骤（2）中低温下调节溶液至中性为：低温下向步骤（1）溶液中加入磷酸二氢钠溶液和氢氧化钠溶液，调节溶液至中性。

优选地，所述的制备步骤如下：

（1）按比例分别称取一定量I、III、V型胶原，溶解于0.001-0.01mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为2-8℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为1-6mg/mL，优选地，为2-5mg/mL；复合胶原中I型胶原的占比为20%-59.8%，III型胶原的占比为40%-79.8%，V型胶原的占比为0.2%-2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为2-8℃，向溶液中加入1/5-1/10复合胶原溶液体积的0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液，并用1-5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.6-8.2；之后将溶液以0.1℃/min的速率升温至25-37℃，优选地，为30-36℃；在最终温度保持2-24h，使各型别胶原复合自组装形成胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得自组装后的胶原复合纤维使用离心机以5000-12000g的离心力离心0.5-3h，弃上清，使用平衡盐溶液洗涤沉淀，收集沉淀，达到浓缩的目的；

（4）向步骤（3）所得沉淀使用均质器均质，得到复合型胶原蛋白组合物。

在本发明的部分实施例中，为保证最终样品的无菌和低内毒素，所述各个步骤配制溶液所用的水均为注射用水，所述步骤（1）中最终获得的复合胶原溶液经0.22μm的滤芯进行过滤除菌，所述步骤（2）、（3）、（4）的操作均在无菌条件下进行，所述步骤（2）的磷酸氢二钠溶液经0.22μm的滤芯进行过滤除菌，所述步骤（3）的平衡盐溶液经0.22μm的滤芯进行过滤除菌。

本发明公开的复合型胶原蛋白组合物基于具有完整三螺旋结构的I、III、V型胶原在适当的温度、pH、离子强度的条件下复合自组装而成。I、III、V型胶原均为纤维型胶原，在一定条件下均可以由三螺旋结构的分子状态（三级结构）通过自组装形成胶原纤维（四级结构）。在I、III、V型胶原分子共同存在的情况下，三种型别的胶原分子会复合自组装形成胶原复合纤维，即一个微纤维结构是由三种型别的胶原按规则平行排列成束、首尾错位相接而成。它完全不同于几种型别的胶原各自自组装形成纤维后简单的物理混合。与单独的I型胶原或只含有少量III型胶原的I型胶原不同的是：本发明中合适比例的III型胶原使得自组装过程中微纤维横向和纵向延伸的速率发生了改变，同时III型胶原相对I型胶原亲水性更佳，提高III型胶原的比例可以有效降低材料的脱水收缩；V型胶原的N端不参与平行排列，它的存在可以使微纤维的直径得到有效控制，同时V型胶原通常作为胶原复合自组装的成核点，胶原纤维以它为核心向多个方向延伸。这些原理使得得到的胶原复合纤维在微观结构上与传统的I型胶原纤维不同，也使得形成的复合型胶原蛋白组合物在宏观性状方面与传统的I型胶原自组装形成的凝胶有明显的不同。另一方面，本发明所述的复合型胶原蛋白组合物包含的不同型别的胶原在皮肤的不同层次或结构中发挥重要功能，相比I型胶原，复合型胶原丰富了其与细胞及其他功能蛋白如整合素等的相互作用，对于细胞外基质再生修复具有重要意义。

本发明的有益效果：

（1）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物所包含的I、III、V型胶原均为具有完整三螺旋结构的天然胶原，具备良好的生物活性。

（2）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物不含任何化学交联剂，避免了化学交联剂的不良影响。制备方法相对简单，操作条件温和，易于产业化。

（3）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物与常规的I型胶原填充剂相比具有更好的支撑性和内聚性，预期作为软组织填充剂注射后抗压能力强，不易弥散，具有良好的塑形效果，适合于更多部位和层次的应用。

（4）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物与常规的I型胶原填充剂相比具有收缩程度小的优点，预期作为软组织填充剂注射后体积变化小，无需额外补充。

（5）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物在微观的纤维网络结构上与常规的I型胶原填充剂相比，胶原纤维的直径较小且均一，纤维之间的连接点更多，网络结构的孔隙相对更大。而作为细胞支架更有利于营养物质和代谢废物的交换，能为生长于其中的细胞提供更好的环境。

（6）本发明提供的复合型胶原蛋白组合物作为填充剂注射于皮肤等软组织后，相对于常规的I型胶原填充剂更能促进皮肤中的细胞分泌新生胶原，实现皮肤的再生修复和年轻化。

附图说明

图1为本发明实施例7与对比例1的宏观形态。

图2为本发明实施例7与对比例1的扫描电镜图片。

图3为本发明实施例7与对比例1培养L929细胞的生长曲线。

图4为本发明实施例7与对比例1植入3d后超声检测图片。

图5为本发明实施例7与对比例1植入后周围组织的Masson染色图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：

猪Ⅰ型、Ⅲ型胶原购自成都市科乐生物技术；猪V型胶原、牛V型胶原购自AdvancedBiomatrix；牛Ⅰ型、Ⅲ型胶原购自河北考力森生物科技。

实施例1一种复合型胶原凝胶及其制备方法

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原200mg、猪III型胶原798mg、猪V型胶原2mg，溶解于1000mL浓度为0.001mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为2℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为1mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为20%，III型胶原的比例为79.8％，V型胶原的占比为0.2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为2℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液100mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.6；之后将溶液以0.1℃/min的速率升温至37℃，并在37℃保持24h，使各型别胶原复合自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以5000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为6.5、渗透压为280mOsm/L的生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.5，渗透压为250mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为20mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为20%，III型胶原的比例为79.8％，V型胶原的占比为0.2%。

实施例2

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原598mg、猪III型胶原400mg、猪V型胶原2mg，溶解于167mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为6mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为59.8%，III型胶原的比例为40％，V型胶原的占比为0.2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为4℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液16.7mL，并用2mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.7；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至30℃，并在30℃保持2h，使胶原复合自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以5000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为7.5、渗透压为320mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为7.5，渗透压为300mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为20mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为59.8%，III型胶原的比例为40％，V型胶原的占比为0.2%。

实施例3

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取牛I型胶原275mg、牛III型胶原215mg和牛V型胶原10mg，溶解于100mL浓度为0.01mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为8℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为5mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为55%，III型胶原的比例为43％，V型胶原的占比为2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液20mL，并用5mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.2；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至25℃，并在25℃保持12h，使胶原复合自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以12000g的离心力离心3h，弃上清，加入pH为7.4、渗透压为360mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为8.0，渗透压为350mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为75mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为55 %，III型胶原的比例为43％，V型胶原的占比为2%。

实施例4

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原330mg、猪III型胶原660mg、猪V型胶原10mg，溶解于250mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为4mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为33%，III型胶原的比例为66％，V型胶原的占比为1%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液30mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.9；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在36℃保持6h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以7000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为6.8、渗透压为350mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.8，渗透压为320mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为25mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为33%，III型胶原的比例为66％，V型胶原的占比为1%。

实施例5

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原499mg、猪III型胶原499mg、猪V型胶原2mg，溶解于250mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为4mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为49%，III型胶原的比例为49％，V型胶原的占比为2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液30mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.9；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在36℃保持6h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以9000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为7.2、渗透压为330mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.8，渗透压为315mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为30mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为49.9%，III型胶原的比例为49.9％，V型胶原的占比为0.2%。

实施例6

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原450mg、猪III型胶原1027.5mg、猪V型胶原22.5mg，溶解于500mL浓度为0.008mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为3mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为30%，III型胶原的比例为68.5％，V型胶原的占比为1.5%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液80mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.9；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在36℃保持12h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以11000g的离心力离心1h，弃上清，加入pH为7.2、渗透压为320mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为7.2，渗透压为308mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为40mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为30%，III型胶原的比例为68.5％，V型胶原的占比为1.5%。

实施例7

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原600mg、猪III型胶原885mg、猪V型胶原15mg，溶解于500mL浓度为0.007mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为3mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为40%，III型胶原的比例为59％，V型胶原的占比为1%；将复合胶原溶液用0.22μm孔径的囊式过滤器进行过滤除菌，得到无菌的复合胶原溶液450mL。

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，在局部百级层流下，向上述溶液中加入经过0.22μm孔径针头滤器过滤除菌的0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液50mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在33℃保持16h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以9000g的离心力离心1h，在局部百级层流下，弃上清，加入pH为7.2、渗透压为320mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用拍打式无菌均质器均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为7.1，渗透压为305mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为35mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为40%，III型胶原的比例为59％，V型胶原的占比为1%。

实施例8

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原330mg、猪III型胶原660mg、猪V型胶原10mg，溶解于250mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为4mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为33%，III型胶原的比例为66％，V型胶原的占比为1%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液30mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.9；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在36℃保持6h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以10000g的离心力离心2h，弃上清，加入pH为6.8、渗透压为350mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.8，渗透压为320mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为50mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为33%，III型胶原的比例为66％，V型胶原的占比为1%。

对比例1

以商业化的I型胶原植入剂为对比例1。该植入剂中胶原来源于猪。测得其pH为7.5，渗透压为313mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，测得其胶原的总浓度为35mg/mL，其中I型胶原的比例为95%，III型胶原的比例为5％，未检出其他型别胶原。

对比例2

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原100mg、猪III型胶原898mg、猪V型胶原2mg，溶解于1000mL浓度为0.001mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为2℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为1mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为10%，III型胶原的比例为89.8％，V型胶原的占比为0.2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为2℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液100mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.6；之后将溶液以0.1℃/min的速率升温至37℃，并在37℃保持24h，使各型别胶原复合自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以5000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为6.5、渗透压为280mOsm/L的生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.5，渗透压为250mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为20mg/mL，复合胶原中复合胶原中I型胶原的比例为10%，III型胶原的比例为89.8％，V型胶原的占比为0.2%。

对比例3

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原698mg、猪III型胶原300mg、猪V型胶原2mg，溶解于167mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为6mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为69.8%，III型胶原的比例为30％，V型胶原的占比为0.2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为4℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液16.7mL，并用2mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.7；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至30℃，并在30℃保持2h，使胶原复合自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以5000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为7.5、渗透压为320mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为7.5，渗透压为300mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为20mg/mL，复合胶原中复合胶原中I型胶原的比例为69.8%，III型胶原的比例为30％，V型胶原的占比为0.2%。

对比例4

按以下步骤制备复合型胶原凝胶：

（1）分别称取猪I型胶原500mg、猪III型胶原500mg，溶解于250mL浓度为0.005mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为4℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为4mg/mL，复合胶原中I型胶原的比例为49%，III型胶原的比例为49％，V型胶原的占比为2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为8℃，向溶液中加入0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液30mL，并用1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.9；之后将溶液以1℃/5min的速率升温至33℃，并在36℃保持6h，使复合胶原自组装，得胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得胶原复合纤维使用离心机以9000g的离心力离心0.5h，弃上清，加入pH为7.2、渗透压为330mOsm/L的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤沉淀，然后收集沉淀；

（4）将步骤（3）所得沉淀使用旋转式均质器进行均质，得到复合型胶原凝胶。

最终制备的复合型胶原凝胶检测得其pH为6.8，渗透压为320mOsm/L。采用液相色谱质谱联用技术，通过相应型别胶原特征肽进行表征，得复合型胶原凝胶中复合胶原的总浓度为30mg/mL，复合胶原中复合胶原中I型胶原的比例为50%，III型胶原的比例为50%。

实施例9

使用流变仪对各实施例及对比例进行法向力测试，用于比较它们的支撑力大小。测试条件为37℃，压向力为1.0N，记录稳定段的平均值作为法向力的大小。结果如表1所示，可以看出，所有实施例样品测得的法向力均大于对比例1，说明具有更好的支撑力。值得一提的是，参考实施例4和实施例8的数据，胶原总浓度对法向力影响显著，而实施例1和2在胶原总浓度明显低于对比例1的情况下，其测得的法向力仍高于对比例1，进一步说明了本发明的效果。对比例2与实施例1相比具有更多比例的III型胶原，其法向力与对比例相差不明显，说明III型胶原比例过高的情况下对支撑能力的提升不明显。对比例3与实施例2相比具有更多比例的I型胶原，其法向力与对比例相差不明显，说明Ｉ型胶原比例过高的情况下也不能提高支撑能力。对比例4相对实施例5，区别在于不含有V型胶原，其法向力明显降低，说明V型胶原的存在对支撑能力的提升具有重要作用。综上所述，只有在I型胶原和III胶原的比例在合适范围内，同时存在V型胶原的情况下，才能显著提高样品的支撑能力。

表1 各实施例及对比例法向力检测结果

检测样品	法向力（N）
		实施例1	0.276±0.043
实施例2	0.266±0.036
		实施例3	0.575±0.028
实施例4	0.357±0.045
		实施例5	0.352±0.047
实施例6	0.405±0.037
		实施例7	0.398±0.043
实施例8	0.521＋0.032
		对比例1	0.234±0.065
对比例2	0.238±0.039
		对比例3	0.227±0.046
对比例4	0.253±0.052

将实施例7所得样品装入注射器用注射针推注0.2g于载玻片上，以同样方式推注对比例1的样品0.2g于载玻片上，观察样品形态的变化，30min后样品形态如图1所示，可以看出实施例7所得样品相比对比例1能保持更高的堆积形态，较直观地说明本发明在提高胶原凝胶支撑能力方面具有优势。

实施例10

分别取实施例及对比例样品各1g左右，精密称量后置于西林瓶中后密封，置于37℃恒温保持1h后，用滤纸吸走脱出的水分，称量剩余样品的重量。样品初始重量与剩余样品重量的差值与样品初始重量的百分比记为样品的收缩率。结果如表2所示，可以看出，所有实施例样品的收缩率均小于对比例1。对比例2的收缩率小于实施例1，对比例3的收缩率大于实施例2，对比例4的收缩率与实施例5非常接近。总的来说，III型胶原比例的增加使样品的收缩率下降，V型胶原的存在对样品收缩率影响不明显。需要说明的是，参考实施例4和实施例8，胶原总浓度对收缩率也有影响。

表2 各实施例及对比例收缩率检测结果。

检测样品	收缩率（%）
		实施例1	15.63±2.02
实施例2	18.25±2.23
		实施例3	6.98±1.54
实施例4	12.77±1.93
		实施例5	13.16±1.32
实施例6	10.94±1.87
		实施例7	11.87±1.96
实施例8	9.03±1.16
		对比例1	32.18±2.35
对比例2	14.75±2.13
		对比例3	24.82±1.89
对比例4	12.97±1.71

实施例11

将实施例7及对比例1的样品冷冻干燥后用扫描电子显微镜观察其微观结构。如图2所示，可以看出，对比例1样品的胶原纤维相对较粗且不均，纤维之间的连接点相对较少，整体偏向于较为紧密而杂乱的线团状结构。而实施例7所得样品的胶原纤维较细且均一，纤维之间的连接点相对较多，整体偏向于较为疏松而规整的网络状结构。这两种样品微观结构的差异一定程度上决定了性质和功能的差异，纤维之间连接点可以起到稳定三维网络结构的作用，宏观表现为支撑性的提高。

实施例12

分别将实施例7和对比例1用于细胞培养。具体地，分别将实施例7和对比例1的样品加入48孔板中，用培养基洗涤后接种入L929细胞，在培养1、4、7、14天后，使用CCK-8试剂盒检测活细胞的数量，以只添加培养基的孔作为空白对照组。结果如图3所示，相比空白对照组，实施例7和对比例1的样品均能促进L929细胞的生长增殖，而实施例7的样品对细胞的支持效果更为明显。

实施例13

以体重为200-300g的SD大鼠作为实验动物进行试验。试验大鼠背部术野剃毛并用脱毛膏处理，保证皮肤满足超声诊断的条件，再用碘酒、酒精常规消毒，称重后按照 0.3mL/100 g 的剂量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后进行皮下注射。为保证每只大鼠注射位点相同，均由背部肩胛骨中心部位皮下注射试验样品0.5mL。大鼠共分为3组，对照组注射氯化钠注射液，实验组1注射实施例7所得样品，实验组2注射对比例1的样品。

在植入后3天随机取样进行超声检测，观察植入物的状态，如图4所示，可以看出实施例7所得样品相比对比例1的样品，隆起高度更高，延展宽度更小，说明具备更好的支撑力和内聚力。

在植入后10天、4周、12周切取植入部位周围组织，多聚甲醛固定后HE染色，进行病理学观察，发现各组均无明显炎症反应，说明两组样品均具有非常好的生物相容性。

在植入后10天、4周、12周切取植入部位周围组织，多聚甲醛固定后Masson染色，观察胶原新生情况。如图4所示为植入4周后各组植入部位周围组织胶原纤维分布情况，可以看出，实验组2（对比例1）相对对照组胶原纤维量有一定程度增加，而实验组1（实施例7所得样品）相比实验组2（对比例1）胶原纤维的增加量更加明显，说明了本发明作为软组织植入剂对于促进胶原再生方面的优势。

Claims (13)

1.一种复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的复合型胶原蛋白组合物由I型、III型和V型胶原形成胶原复合纤维悬浮分散于平衡盐溶液中制备；

所述的胶原复合纤维中包括I型、III型和V型胶原，其中I型胶原的占比为20%-59.8%，III型胶原的占比为40%-79.8%，V型胶原的占比为0.2%-2%；

所述的胶原复合纤维的含量为20-75mg/mL；

所述的平衡盐溶液为pH在6.5-8.0、渗透压在250-350mOsm/L的电解质溶液；

所述的复合型胶原蛋白组合物的制备方法包括以下步骤：

（1）按比例分别称取I、III、V型胶原低温溶解于盐酸溶液中，得到复合胶原溶液；

（2）低温下调节溶液至中性；之后溶液程序升温诱导各型别胶原复合自组装形成胶原复合纤维；

（3）将胶原复合纤维浓缩；

（4）将浓缩后的胶原复合纤维分散于平衡盐溶液中，得到复合型胶原蛋白组合物。

2.根据权利要求1所述的复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为33%-55%，III型胶原的占比为43%-68.5%，V型胶原的占比为1.5%-2%。

3.根据权利要求2所述的复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的胶原复合纤维中I型胶原的占比为55%，III型胶原的占比为43%，V型胶原的占比为2%。

4.根据权利要求1所述的复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的胶原复合纤维的含量为20-50mg/mL。

5.根据权利要求4所述的复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的胶原复合纤维的含量为30-40mg/mL。

6.根据权利要求1所述的复合型胶原蛋白组合物，其特征在于，所述的平衡盐溶液为pH在6.8-7.5、渗透压在270-320mOsm/L的磷酸盐缓冲液或生理盐水。

7.权利要求1-6任一项所述的复合型胶原蛋白组合物在制备用于医学整形的产品中的应用。

8.一种用于医学整形的产品，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的复合型胶原蛋白组合物。

9.根据权利要求8所述的用于医学整形的产品，其特征在于，为复合型胶原填充剂或胶原植入剂。

10. 一种复合型胶原蛋白组合物的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求1-6 任一项所述的复合型胶原蛋白组合物，包括以下步骤：

（1）按比例分别称取I、III、V型胶原低温溶解于盐酸溶液中，得到复合胶原溶液；

（2）低温下调节溶液至中性；之后溶液程序升温诱导各型别胶原复合自组装形成胶原复合纤维；

（3）将胶原复合纤维浓缩；

（4）将浓缩后的胶原复合纤维分散于平衡盐溶液中，得到复合型胶原蛋白组合物。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中低温下调节溶液至中性为：低温下向步骤（1）溶液中加入磷酸二氢钠溶液和氢氧化钠溶液，调节溶液至中性。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）按比例分别称取一定量I、III、V型胶原，溶解于0.001-0.01mol/L的盐酸溶液中，溶解温度为2-8℃；使最终溶液中复合胶原的总浓度为1-6mg/mL；复合胶原中I型胶原的占比为20%-59.8%，III型胶原的占比为40%-79.8%，V型胶原的占比为0.2%-2%；

（2）控制上述复合胶原溶液温度为2-8℃，向溶液中加入1/5-1/10复合胶原溶液体积的0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液，并用1-5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.6-8.2；之后将溶液以0.1℃/min的速率升温至25-37℃；在最终温度保持2-24h，使各型别胶原复合自组装形成胶原复合纤维；

（3）将步骤（2）所得自组装后的胶原复合纤维使用离心机以5000-12000g的离心力离心0.5-3h，弃上清，使用平衡盐溶液洗涤沉淀，收集沉淀，达到浓缩的目的；

（4）向步骤（3）所得沉淀使用均质器均质，得到复合型胶原蛋白组合物。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中最终溶液中复合胶原的总浓度为2-5mg/mL。

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