CN115536742B - 一种医美真皮填充用胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种医美真皮填充用胶原蛋白及其制备方法。本发明的的制备方法包括：对胶原蛋白消化液依次进行硅藻土吸附、一次超滤浓缩换液、阳离子交换层析、二次超滤浓缩换液、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤、自组装和分级沉淀，制得医美真皮填充用胶原蛋白；其中，自组装包括控制体系的胶原蛋白浓度为2.0‑2.5mg/mL，离子强度为0.15‑0.25mol/L，pH值为7.0‑8.0，按0.2‑0.3℃//的升温速度将体系温度升高10‑20℃并保温40‑60/；分级沉淀包括依次采用1.0‑1.5M的NaCl溶液和2.0‑2.5M的NaCl溶液进行沉淀。本发明方法制备的医美真皮填充用胶原蛋白含有I型胶原蛋白和III型胶原蛋白，III型胶原蛋白的质量含量≥15％，与成人皮肤中I型和III型胶原蛋白的比例相近，尤其适合用于医美真皮填充剂。

Description

一种医美真皮填充用胶原蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及胶原蛋白技术领域，尤其是涉及一种医美真皮填充用胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
目前，已经深入研究了胶原蛋白的结构、功能和合成方法。胶原蛋白中应用最为广泛的I型胶原蛋白分子由三个肽亚基组成，每个肽亚基由大约1050个氨基酸残基组成，其中包括约33％的甘氨酸、25％的脯氨酸和25％的羟脯氨酸。胶原蛋白的每个肽亚基形成螺旋结构，三个肽亚基以三螺旋前胶原分子的形式排列，然后释放到细胞外空间。
皮肤中的胶原蛋白类型主要为I型胶原蛋白(约85％)和III型胶原蛋白(约15％)。I型胶原蛋白分子长度300nm、宽1.5nm，是皮肤的主体，呈粗壮、排列紧密的束状结构，抗张强度可超过钢丝，被称作纳米钢索，能够维持皮肤张力和承受拉力，为皮肤提供较强的支撑结构和支撑力，让皮肤饱满充盈，I型胶原流失将会出现面部皱纹及凹陷。III型胶原蛋白呈疏松的丝网状，比较细小，主要散布于表皮真皮连接处的I型胶原周围，张力较低，为皮肤提供弹性和抗应力性，III型胶原具有很好的营养复弹和促修复愈合作用。
目前，成年牛真皮组织中III型胶原蛋蛋白的含量约为15-18％，常规提取工艺主要提取的是I型胶原蛋白，然而提取得到的III胶原蛋白的含量通常仅为5％以下，III胶原蛋白的提取率较低。现有解决上述问题的方式是通过采用高III型胶原蛋白含量的胎牛皮等材料作为原料进行提取，然而该原料存在材料来源有限、成本高昂等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种医美真皮填充用胶原蛋白及其制备方法，该方法制备的医美真皮填充用胶原蛋白含有I型胶原蛋白和III型胶原蛋白，III型胶原蛋白的质量含量≥15％，与成人皮肤中I型和III型胶原蛋白的比例相近，尤其适合用于医美真皮填充剂。
本发明提供一种医美真皮填充用胶原蛋白的制备方法，包括：对胶原蛋白消化液依次进行硅藻土吸附、一次超滤浓缩换液、阳离子交换层析、二次超滤浓缩换液、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤、自组装和分级沉淀，制得医美真皮填充用胶原蛋白；其中，自组装包括控制体系的胶原蛋白浓度为2.0-2.5mg/mL，离子强度为0.15-0.25mol/L，pH值为7.0-8.0，按0.2-0.3℃//的升温速度将体系温度升高10-20℃并保温40-60/；分级沉淀包括依次采用1.0-1.5M的NaCl溶液和2.0-2.5M的NaCl溶液进行沉淀。
研究发现：现有的提取工艺条件通常较为适合I型胶原蛋白的提取分离，从而导致主要提取得到的是I型胶原蛋白，然而III型胶原蛋白的提取率较低；本发明通过进行上述自组装，大幅度提高了III型胶原蛋白的自组装和沉淀效果，进而明显地提高了III型胶原蛋白的提取率。此外，上述分级沉淀能够良好地对I型胶原蛋白和III型胶原蛋白进行分离，既保证了I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的提取率，同时使得产品中的胶原蛋白组成与成人皮肤中I型和III型胶原蛋白的比例相近，有利于提高产品在医美真皮填充剂中的应用效果。
在本发明中，胶原蛋白消化液的制备方法包括：对成年牛真皮组织进行预处理、匀浆、酶解、灭酶，制得胶原蛋白消化液；其中，酶解包括采用脂肪酶和糖胺聚糖降解酶进行的第一酶解和采用胃蛋白酶进行的第二酶解，第二酶解时检测酶解液在波长520-540nm下的吸光度，在吸光度达到0.400-0.450时进行灭酶。
研究发现：不同的酶解条件对原料中的I型和III型胶原蛋白的提取效果具有一定的影响作用；常规提取采用胃蛋白酶进行，此时有利于I型胶原蛋白的提取，但并不能够最大限度地提取III型胶原蛋白。本发明先采用脂肪酶和糖胺聚糖降解酶进行第一酶解，从而使原料中的脂肪和糖胺聚糖等组分降解，有利于原料中III型胶原蛋白的释放，进而提高III型胶原蛋白的提取率。
在本发明中，预处理可以依次采用7-9wt％的冰醋酸溶液和1.5-2.5wt％的氢氧化钠溶液进行；具体地，预处理可以包括：采用7-9wt％的冰醋酸溶液对牛真皮组织进行第一次浸泡，第一次浸泡后对牛真皮组织进行搅碎，制得牛皮组织颗粒；采用1.5-2.5wt％的氢氧化钠溶液对牛皮组织颗粒进行第二次浸泡，第二次浸泡后离心，随后采用注射用水进行洗涤，洗涤后离心，得到牛皮组织颗粒；其中，第一次浸泡温度为15-25℃，第一次浸泡时间为7-9d；第二次浸泡温度为20-25℃，第二次浸泡时间为2-4h。
匀浆可以依次在17000-19000rpm的转速和20000-21000rpm的转速下进行；具体地，向牛皮组织颗粒中加入7-9倍的注射用水，随后进行匀浆；匀浆可以包括：先在17000-19000rpm下匀浆20-40/，再在20000-21000rpm下匀浆20-40/；匀浆后加注射用水控制牛真皮组织的含量在20-30g/L。
第一酶解时脂肪酶的用量为6-8IU/mL匀浆液，糖胺聚糖降解酶的用量为16-18IU/mL匀浆液，控制第一酶解的温度为35-40℃，时间为2-3h，脂肪酶可以采用常规脂肪酶，糖胺聚糖降解酶可以采用湖北信康医药化工有限公司的透明质酸酶；第二酶解时胃蛋白酶的用量为75-85IU/mL匀浆液，控制第二酶解的温度为18-22℃。
酶解终点采用浸入式光谱吸光度测量法确定，检测波长例如为527nm，以酶解前的空白酶解液标记吸光度0点，酶解时在线吸光度检测数值在0.400-0.450的范围时，结束酶解进入灭酶工序。上述方式能够保证端肽彻底去除，同时最大限度地提高胶原蛋白的收率，各批次产品的端肽去除率以及I型、III型胶原蛋白的收率相对稳定，产品稳定性好。
灭酶可以包括：采用9-11M的NaOH溶液将酶解后的酶解液的pH值调节至9-9.5，随后在20-22℃的条件下处理10-15h。
上述提取方法能够最大限度地提取成年牛真皮组织中的I型和III型胶原蛋白、特别是III型胶原蛋白，进而使得制备的医美真皮填充用胶原蛋白中III型胶原蛋白含量大大提高，特别是通过上述酶解能够控制产品中I型和III型胶原蛋白的比例与成人皮肤中I型和III型胶原蛋白的比例相近；此外，上述提取方法能够彻底去除端肽，并且大幅度降低内毒素含量，产品质量稳定，尤其适合用于医美真皮填充剂。
在本发明中，硅藻土吸附包括：先向胶原蛋白消化液中添加5-10g/L的700-900目红色硅藻土进行常温吸附，吸附吸附100-150min后静置取上清液；再采用5-10g/L的150-250目红色硅藻土对上清液进行过滤吸附，吸附后过滤，得到胶原蛋白吸附过滤液。
在本发明中，一次超滤浓缩换液包括：采用截流分子量为200kD的超滤系统进行超滤浓缩，在浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的15-25mM的醋酸钠缓冲液继续进行超滤浓缩，重复2-4次后，再次浓缩至初始体积的一半，得到胶原蛋白一次超滤浓缩液。
在本发明中，阳离子交换层析包括：先采用15-25mM的醋酸钠溶液对装有GPCM-30弱阳离子交换树脂的层析柱进行平衡，平衡后进行上样，上样后采用15-25mM的醋酸钠溶液进行冲洗，再采用含有280-320mM NaCl的15-25mM的醋酸钠溶液进行洗脱，收集胶原蛋白洗脱液。
在本发明中，二次透析换液包括：采用截流分子量为100kD的超滤系统进行超滤浓缩，在浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的8-12mM的稀盐酸溶液继续进行超滤浓缩，重复1-3次后，再次浓缩至初始体积的一半，得到胶原蛋白二次超滤浓缩液。
在本发明中，超滤浓缩包括：采用截流分子量为100kD的超滤系统进行浓缩，待浓缩至胶原蛋白的浓度为2mg/mL以上时，得到胶原蛋白原液。
在本发明中，自组装体系的初始温度可以控制在20-25℃，保温温度可以控制在35-37℃，并且可以在1min之内将体系温度从初始温度以0.2-0.3℃//的升温速度升高至35-37℃，在保温40-60/后，以0.2-0.3℃//的降温速度降温至初始温度。
在本发明中，分级沉淀包括：
将超滤浓缩后的胶原蛋白原液的pH值调节至7.0-7.5，加入NaCl溶液至终浓度为1.0-1.5M，在3000-4000rpm下离心15-30min，分别收集沉淀和上清液；
向上清液中继续加入NaCl溶液至终浓度为2.0-2.5M，在10000-12000rpm下离心25-35min，收集沉淀；
采用生理盐水洗涤各沉淀，得到医美真皮填充用胶原蛋白。
本发明还提供一种医美真皮填充用胶原蛋白，按照上述制备方法制得。
在本发明中，医美真皮填充用胶原蛋白包括I型胶原蛋白和III型胶原蛋白，III型胶原蛋白的质量含量≥15％；更具体地，医美真皮填充用胶原蛋白中I型胶原蛋白的质量含量为83-85％，III型胶原蛋白的质量含量为15-17％。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的制备方法利用特定的自组装大幅度提高了III型胶原蛋白的自组装和沉淀效果，明显地提高了III型胶原蛋白的提取率；同时，采用分级沉淀依次沉淀III型和I型胶原蛋白，制得的医美真皮填充用胶原蛋白中III型胶原蛋白的质量含量≥15％，与成人皮肤中I型和III型胶原蛋白的比例相近，尤其适合用于医美真皮填充剂；
2、本发明的制备方法在胃蛋白酶酶解前先脂肪酶和糖胺聚糖降解酶进行酶解，同时通过检测酶解液在波长520-540nm下的吸光度进行酶解终点控制，从而能够最大限度地提取成年牛真皮组织中的I型和III型胶原蛋白、特别是III型胶原蛋白，进而使得制备的医美真皮填充用胶原蛋白中III型胶原蛋白含量大大提高，同时能够彻底去除端肽，并且大幅度降低内毒素含量，产品的质量和稳定性大大提高。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的医美真皮填充用胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
1、制备胶原蛋白消化液
采用8wt％的冰醋酸溶液，在20℃下浸泡成年牛真皮组织(III型胶原蛋白约17％)8d，浸泡后对搅碎，制得牛皮组织颗粒；随后，采用2wt％的氢氧化钠溶液，在20℃下浸泡牛皮组织颗粒3h，浸泡后离心，用注射用水洗涤，加入成年牛真皮组织8倍质量的注射用水搅匀，制得预处理牛真皮组织。
将上述预处理牛真皮组织在18000rpm下匀浆30/，再在20000rpm下匀浆30/，匀浆后补注射用水至匀浆液中牛真皮组织含量为25g/L。
向匀浆液(pH 7.0)中加入脂肪酶溶液和糖胺聚糖降解酶溶液进行第一酶解，脂肪酶的用量为6IU/mL匀浆液，糖胺聚糖降解酶的用量为18IU/mL匀浆液，控制第一酶解的温度为38℃，时间为2.5h，制得第一酶解液。
向第一酶解液中加冰醋酸调节pH值至2.5，加入胃蛋白酶溶液进行第二酶解，胃蛋白酶添加量为80IU/mL匀浆液，在20℃下进行低温酶解，酶解终点采用浸入式光谱吸光度测量法确定，检测波长527nm，以酶解前的空白酶解液标记吸光度0点，酶解时每隔4h搅拌一次，搅拌1h后，在线吸光度检测数值在0.400-0.450的范围时，结束酶解。
结束酶解后，用10M的NaOH溶液调节酶解液的pH值至9.25，将酶解液在20℃静置12h，灭活胃蛋白酶，加注射用水进行等体积稀释，再用浓盐酸调节pH值至4.0±0.1，搅拌90min，制得胶原蛋白消化液。
2、硅藻土吸附
向上述胶原蛋白消化液中添加8g/L的800目红色硅藻土进行常温吸附，吸附120min后静置取上清液，制得胶原蛋白粗提液。
胶原蛋白粗提液再次使用预填充200目红色硅藻土的板框过滤器进行过滤，过滤前板框过滤器使用0.1M的NaOH溶液冲洗以去除设备可能带入的热源，然后用注射用水清洗至中性，然后将采用200目红色硅藻土溶液铺膜，红色硅藻土用量为8g/L上清液，铺膜后使用pH4.0的稀盐酸溶液洗涤红色硅藻土至体系pH值为4.0，将胶原蛋白粗提液导入到过滤器中进行吸附过滤，滤液完全吸入后，再次使用pH4.0的稀盐酸将残留的胶原蛋白粗提液完全洗出，得到胶原蛋白吸附过滤液。
3、一次超滤浓缩换液
使用截流分子量为200kD的超滤系统对胶原蛋白吸附过滤液进行一次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的20mM的醋酸钠溶液继续进行超滤浓缩，重复上述步骤换液3次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白一次超滤浓缩液。
4、阳离子交换层析
向层析柱中填装GPCM-30弱阳离子交换树脂，层析柱进行除热源准备，然后使用20mM的醋酸钠溶液进行平衡，根据层析柱蛋白载量上样，上样后使用20mM的醋酸钠溶液冲洗杂蛋白，再使用含有300mM NaCl的20mM醋酸钠溶液进行蛋白洗脱，收集胶原蛋白洗脱液。
5、二次超滤浓缩换液
采用截流分子量为100kD的超滤系统对胶原蛋白洗脱液进行二次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积一半时，补加等体积的10mM的稀盐酸溶液，重复上述步骤换液2次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白二次超滤浓缩液。
6、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤
使用预过滤器对胶原蛋白二次超滤浓缩液进行无菌过滤后，采用截流分子量为100kD的超滤系统进行浓缩，待浓缩至胶原蛋白的浓度为2mg/mL以上时，停止浓缩，得到胶原蛋白原液。
使用经过湿热灭菌的0.22um无菌滤膜对胶原蛋白原液进行过滤除菌，得到胶原蛋白无菌滤液。
7、自组装
将胶原蛋白无菌滤液的胶原蛋白浓度调节至2.0mg/mL左右，随后加入0.2M的Na3PO4缓冲液调节体系离子强度为0.2mol/L。
将上述体系(pH 7.0)从初始温度25℃按0.2℃//的升温速度升温至35℃，在35℃下保温50/，随后按0.2℃//的降温速度降温至25℃，完成自组装。
8、分级沉淀
在搅拌下，缓慢地将4.4M的NaCl冷溶液添加到自组装后的胶原蛋白溶液(pH 7.0)中，使NaCl的终浓度达到1.2M，随后在3500rpm/min下离心25min，分别收集沉淀(即第一沉淀)和上清液。
向上述上清液中继续加入4.4M的NaCl冷溶液至NaCl终浓度达到2.2M，随后在10000rpm/min下离心30min，收集沉淀(即第二沉淀)，用灭菌生理食盐水洗涤第一沉淀和第二沉淀，在10000rpm/min下离心30min，制得医美真皮填充用胶原蛋白。
对医美真皮填充用胶原蛋白中的I型、III型胶原蛋白含量、端肽去除率和胶原蛋白总收率进行检测，结果见表1。
实施例2
本实施例的医美真皮填充用胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
1、制备胶原蛋白消化液
采用7wt％的冰醋酸溶液，在15℃下浸泡成年牛真皮组织(III型胶原蛋白约17％)9d，浸泡后对搅碎，制得牛皮组织颗粒；随后，采用1.5wt％的氢氧化钠溶液，在20℃下浸泡牛皮组织颗粒4h，浸泡后离心，用注射用水洗涤，加入成年牛真皮组织7倍质量的注射用水搅匀，制得预处理牛真皮组织。
将上述预处理牛真皮组织在17000rpm下匀浆40/，再在21000rpm下匀浆20/，匀浆后补注射用水至匀浆液中牛真皮组织含量为25g/L。
向匀浆液(pH 7.0)中加入脂肪酶溶液和糖胺聚糖降解酶溶液进行第一酶解，脂肪酶的用量为8IU/mL匀浆液，糖胺聚糖降解酶的用量为16IU/mL匀浆液，控制第一酶解的温度为35℃，时间为3h，制得第一酶解液。
向第一酶解液中加冰醋酸调节pH值至2.0，加入胃蛋白酶溶液进行第二酶解，胃蛋白酶添加量为75IU/mL匀浆液，在22℃下进行低温酶解，酶解终点采用浸入式光谱吸光度测量法确定，检测波长527nm，以酶解前的空白酶解液标记吸光度0点，酶解时每隔4h搅拌一次，搅拌1h后，在线吸光度检测数值在0.400-0.450的范围时，结束酶解。
结束酶解后，用9M的NaOH溶液调节酶解液的pH值至9.0，将酶解液在22℃静置10h，灭活胃蛋白酶，加注射用水进行等体积稀释，再用浓盐酸调节pH值至4.0±0.1，搅拌90min，制得胶原蛋白消化液。
2、硅藻土吸附
向上述胶原蛋白消化液中添加5g/L的800目红色硅藻土进行常温吸附，吸附150min后静置取上清液，制得胶原蛋白粗提液。
胶原蛋白粗提液再次使用预填充200目红色硅藻土的板框过滤器进行过滤，过滤前板框过滤器使用0.1M的NaOH溶液冲洗以去除设备可能带入的热源，然后用注射用水清洗至中性，然后将采用200目红色硅藻土溶液铺膜，红色硅藻土用量为10g/L上清液，铺膜后使用pH4.0的稀盐酸溶液洗涤红色硅藻土至体系pH值为4.0，将胶原蛋白粗提液导入到过滤器中进行吸附过滤，滤液完全吸入后，再次使用pH4.0的稀盐酸将残留的胶原蛋白粗提液完全洗出，得到胶原蛋白吸附过滤液。
3、一次超滤浓缩换液
使用截流分子量为200kD的超滤系统对胶原蛋白吸附过滤液进行一次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的15mM的醋酸钠溶液继续进行超滤浓缩，重复上述步骤换液2次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白一次超滤浓缩液。
4、阳离子交换层析
向层析柱中填装GPCM-30弱阳离子交换树脂，层析柱进行除热源准备，然后使用15mM的醋酸钠溶液进行平衡，根据层析柱蛋白载量上样，上样后使用15mM的醋酸钠溶液冲洗杂蛋白，再使用含有280mM NaCl的15mM醋酸钠溶液进行蛋白洗脱，收集胶原蛋白洗脱液。
5、二次超滤浓缩换液
采用截流分子量为100kD的超滤系统对胶原蛋白洗脱液进行二次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积一半时，补加等体积的8mM的稀盐酸溶液，重复上述步骤换液1次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白二次超滤浓缩液。
6、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤
使用预过滤器对胶原蛋白二次超滤浓缩液进行无菌过滤后，采用截流分子量为100kD的超滤系统进行浓缩，待浓缩至胶原蛋白的浓度为2mg/mL以上时，停止浓缩，得到胶原蛋白原液。
使用经过湿热灭菌的0.22um无菌滤膜对胶原蛋白原液进行过滤除菌，得到胶原蛋白无菌滤液。
7、自组装
将胶原蛋白无菌滤液的胶原蛋白浓度调节至2.0mg/mL左右，随后加入0.25M的Na3PO4缓冲液调节体系离子强度为0.25mol/L。
将上述体系(pH 7.0)从初始温度27℃按0.3℃//的升温速度升温至37℃，在37℃下保温40/，随后按0.3℃//的降温速度降温至27℃，完成自组装。
8、分级沉淀
在搅拌下，缓慢地将4.4M的NaCl冷溶液添加到自组装后的胶原蛋白溶液(pH 7.0)中，使NaCl的终浓度达到1.5M，随后在3000rpm/min下离心30min，分别收集沉淀(即第一沉淀)和上清液。
向上述上清液中继续加入4.4M的NaCl冷溶液至NaCl终浓度达到2.5M，随后在12000rpm/min下离心25min，收集沉淀(即第二沉淀)，用灭菌生理食盐水洗涤第一沉淀和第二沉淀，在10000rpm/min下离心30min，制得医美真皮填充用胶原蛋白。
对医美真皮填充用胶原蛋白中的I型、III型胶原蛋白含量、端肽去除率和胶原蛋白收率进行检测，结果见表1。
实施例3
本实施例的医美真皮填充用胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
1、制备胶原蛋白消化液
采用9wt％的冰醋酸溶液，在25℃下浸泡成年牛真皮组织(III型胶原蛋白约17％)7d，浸泡后对搅碎，制得牛皮组织颗粒；随后，采用2.5wt％的氢氧化钠溶液，在25℃下浸泡牛皮组织颗粒2h，浸泡后离心，用注射用水洗涤，加入成年牛真皮组织9倍质量的注射用水搅匀，制得预处理牛真皮组织。
将上述预处理牛真皮组织在19000rpm下匀浆20/，再在20000rpm下匀浆40/，匀浆后补注射用水至匀浆液中牛真皮组织含量为25g/L。
向匀浆液(pH 7.0)中加入脂肪酶溶液和糖胺聚糖降解酶溶液进行第一酶解，脂肪酶的用量为7IU/mL匀浆液，糖胺聚糖降解酶的用量为17IU/mL匀浆液，控制第一酶解的温度为36℃，时间为2h，制得第一酶解液。
向第一酶解液中加冰醋酸调节pH值至3.0，加入胃蛋白酶溶液进行第二酶解，胃蛋白酶添加量为85IU/mL匀浆液，在20℃下进行低温酶解，酶解终点采用浸入式光谱吸光度测量法确定，检测波长527nm，以酶解前的空白酶解液标记吸光度0点，酶解时每隔4h搅拌一次，搅拌1h后，在线吸光度检测数值在0.400-0.450的范围时，结束酶解。
结束酶解后，用11M的NaOH溶液调节酶解液的pH值至9.5，将酶解液在20℃静置15h，灭活胃蛋白酶，加注射用水进行等体积稀释，再用浓盐酸调节pH值至4.0±0.1，搅拌90min，制得胶原蛋白消化液。
2、硅藻土吸附
向上述胶原蛋白消化液中添加10g/L的800目红色硅藻土进行常温吸附，吸附100min后静置取上清液，制得胶原蛋白粗提液。
胶原蛋白粗提液再次使用预填充200目红色硅藻土的板框过滤器进行过滤，过滤前板框过滤器使用0.1M的NaOH溶液冲洗以去除设备可能带入的热源，然后用注射用水清洗至中性，然后将采用200目红色硅藻土溶液铺膜，红色硅藻土用量为5g/L上清液，铺膜后使用pH4.0的稀盐酸溶液洗涤红色硅藻土至体系pH值为4.0，将胶原蛋白粗提液导入到过滤器中进行吸附过滤，滤液完全吸入后，再次使用pH4.0的稀盐酸将残留的胶原蛋白粗提液完全洗出，得到胶原蛋白吸附过滤液。
3、一次超滤浓缩换液
使用截流分子量为200kD的超滤系统对胶原蛋白吸附过滤液进行一次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的25mM的醋酸钠溶液继续进行超滤浓缩，重复上述步骤换液2次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白一次超滤浓缩液。
4、阳离子交换层析
向层析柱中填装GPCM-30弱阳离子交换树脂，层析柱进行除热源准备，然后使用25mM的醋酸钠溶液进行平衡，根据层析柱蛋白载量上样，上样后使用25mM的醋酸钠溶液冲洗杂蛋白，再使用含有320mM NaCl的25mM醋酸钠溶液进行蛋白洗脱，收集胶原蛋白洗脱液。
5、二次超滤浓缩换液
采用截流分子量为100kD的超滤系统对胶原蛋白洗脱液进行二次超滤浓缩，当吸附过滤液浓缩至初始体积一半时，补加等体积的12mM的稀盐酸溶液，重复上述步骤换液3次，再次浓缩至初始体积的一半时，得到胶原蛋白二次超滤浓缩液。
6、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤
使用预过滤器对胶原蛋白二次超滤浓缩液进行无菌过滤后，采用截流分子量为100kD的超滤系统进行浓缩，待浓缩至胶原蛋白的浓度为2mg/mL以上时，停止浓缩，得到胶原蛋白原液。
使用经过湿热灭菌的0.22um无菌滤膜对胶原蛋白原液进行过滤除菌，得到胶原蛋白无菌滤液。
7、自组装
将胶原蛋白无菌滤液的胶原蛋白浓度调节至2.0mg/mL左右，随后加入0.15M的Na3PO4缓冲液调节体系离子强度为0.15mol/L。
将上述体系(pH 7.0)从初始温度20℃按0.3℃//的升温速度升温至36℃，在36℃下保温60/，随后按0.3℃//的降温速度降温至20℃，完成自组装。
8、分级沉淀
在搅拌下，缓慢地将4.4M的NaCl冷溶液添加到自组装后的胶原蛋白溶液(pH 7.0)中，使NaCl的终浓度达到1M，随后在4000rpm/min下离心15min，分别收集沉淀(即第一沉淀)和上清液。
向上述上清液中继续加入4.4M的NaCl冷溶液至NaCl终浓度达到2M，随后在10000rpm/min下离心35min，收集沉淀(即第二沉淀)，用灭菌生理食盐水洗涤第一沉淀和第二沉淀，在10000rpm/min下离心30min，制得医美真皮填充用胶原蛋白。
对医美真皮填充用胶原蛋白中的I型、III型胶原蛋白含量、端肽去除率和胶原蛋白收率进行检测，结果见表1。
对照例1
除不进行自组装步骤之外，其余与实施例1基本相同。
对照例2
除不采用脂肪酶和糖胺聚糖降解酶进行第一酶解之外，其余与实施例1基本相同。
对照例3
除不采用浸入式光谱吸光度测量法确定酶解终点，而将胃蛋白酶第二酶解时间控制为7天，即胃蛋白酶酶解7天后结束酶解，其余与实施例1基本相同。
表1医美真皮填充用胶原蛋白的检测结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1. 一种医美真皮填充用胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：对胶原蛋白消化液依次进行硅藻土吸附、一次超滤浓缩换液、阳离子交换层析、二次超滤浓缩换液、预过滤、超滤浓缩、除菌过滤、自组装和分级沉淀，制得医美真皮填充用胶原蛋白；其中，胶原蛋白消化液的制备方法包括：对成年牛真皮组织进行预处理、匀浆、酶解、灭酶，制得胶原蛋白消化液；酶解包括采用脂肪酶和糖胺聚糖降解酶进行的第一酶解和采用胃蛋白酶进行的第二酶解，糖胺聚糖降解酶为透明质酸酶，第一酶解时脂肪酶的用量为6-8 IU/ mL匀浆液，糖胺聚糖降解酶的用量为16-18 IU/ mL匀浆液，控制第一酶解的温度为35-40℃，时间为2-3h，第二酶解时检测酶解液在波长520-540 nm下的吸光度，在吸光度达到0.400-0.450时进行灭酶；一次超滤浓缩换液包括：采用截流分子量为200kD的超滤系统进行超滤浓缩，在浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的15-25 mM的醋酸钠缓冲液继续进行超滤浓缩，重复2-4次后，再次浓缩至初始体积的一半，得到胶原蛋白一次超滤浓缩液；二次超滤浓缩换液包括：采用截流分子量为100kD的超滤系统进行超滤浓缩，在浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的8-12 mM的稀盐酸溶液继续进行超滤浓缩，重复1-3次后，再次浓缩至初始体积的一半，得到胶原蛋白二次超滤浓缩液；超滤浓缩包括：采用截流分子量为100kD的超滤系统进行浓缩，待浓缩至胶原蛋白的浓度为2mg/mL以上时，得到胶原蛋白原液；自组装包括控制体系的胶原蛋白浓度为2.0-2.5mg/mL，离子强度为0.15-0.25mol/L，pH值为7.0-8.0，按0.2-0.3℃/s的升温速度将体系温度升高10-20℃并保温40-60s；分级沉淀包括依次采用1.0-1.5M的NaCl溶液和2.0-2.5M的NaCl溶液进行沉淀，分级沉淀包括：将自组装后的胶原蛋白溶液的pH值调节至7.0-7.5，加入NaCl溶液至终浓度为1.0-1.5M，在3000-4000 rpm下离心15-30min，分别收集沉淀和上清液；向上清液中继续加入NaCl溶液至终浓度为2.0-2.5M，在10000-12000 rpm下离心25-35min，收集沉淀；采用生理盐水洗涤各沉淀，得到医美真皮填充用胶原蛋白。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第二酶解时胃蛋白酶的用量为75-85IU/mL匀浆液，控制第二酶解的温度为18-22 ℃。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，硅藻土吸附包括：先向胶原蛋白消化液中添加5-10 g/L的700-900目红色硅藻土进行常温吸附，吸附100-150min后静置取上清液；再采用5-10 g/L的150-250目红色硅藻土对上清液进行过滤吸附，吸附后过滤，得到胶原蛋白吸附过滤液。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阳离子交换层析包括：先采用15-25mM的醋酸钠溶液对装有GPCM-30弱阳离子交换树脂的层析柱进行平衡，平衡后进行上样，上样后采用15-25 mM的醋酸钠溶液进行冲洗，再采用含有280-320mM NaCl的15-25 mM的醋酸钠溶液进行洗脱，收集胶原蛋白洗脱液。
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