CN114014926B

CN114014926B - 一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g1和g2的方法

Info

Publication number: CN114014926B
Application number: CN202111381011.5A
Authority: CN
Inventors: 程光宇; 王荣昌; 李玲; 甘露; 王玉莹; 陈道稳; 陈雨豪; 徐鑫鑫
Original assignee: Jiangsu Tianmeijian Natural Bioengineering Co ltd
Current assignee: Jiangsu Tianmeijian Natural Bioengineering Co ltd
Priority date: 2021-11-20
Filing date: 2021-11-20
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2041-11-20
Also published as: CN114014926A

Abstract

本发明提供了一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，该方法是将牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白去除后，进行DEAE离子交换层析后，获得高纯度的免疫球蛋白G1和G2。本发明本发明在对牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白去除后，只需进行一次DEAE离子交换层析后，即可获得克级的高纯度免疫球蛋白G1和G2，制备方法简单且快速；通过本方法获得的高纯度免疫球蛋白G1和G2，纯度能够高达95%，支持批量制备；填补了国内高纯度免疫球蛋白制备的空白，有助于保障生产企业及检测单位工作的有序进行。

Description

一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法。

背景技术

免疫球蛋白（Ig）是牛初乳中最重要的免疫因子，在牛初乳中免疫球蛋白含量高达5O～150 mg/mL，是普通牛乳的5O～100倍。在牛初乳中含有的免疫球蛋白有免疫球蛋白G(IgG)、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)五种，其中含量最高的是IgG ，也是最重要免疫球蛋白，它占总Ig的80%以上，IgG还包括IgG1和IgG2，其中又以IgG1为主要成分。IgG能部分取代人类母乳SLgA 的功能，是保健食品和医药产品中的最重要的功效成分之一。

IgG 最主要功能是能够特异性识别和结合入侵机体的微生物病原体，如流感病毒、腺病毒、幽门螺杆菌、病原性大肠杆菌、轮状病毒和沙门氏菌等呼吸道和肠道致病菌，并能介导补体活化以及免疫调节等反应，在增强机体免疫力、中和毒素、杀死肿瘤细胞等机体防御维护机体健康等方面起到着重要的作用，并具有调理作用和细胞解毒作用, 能促进吞噬细胞对细菌等颗粒性抗原的吞噬, 并增强NK细胞和促发吞噬细胞对组织靶细胞的杀伤破坏作用。同时IgG 也是唯一能够从母体通过胎盘转移到胎儿体内的Ig, 是胎儿和新生婴儿抗感染和免疫作用的主要来源。最新研究表明, IgG 还具有提示早期诊断肺癌的可能性。

人类很早就认识到了牛初乳在防治疾病和维持健康水平方面的作用，并认识到牛初乳的这种作用主要是它含有高水平的免疫球蛋白。从20世纪初人们就已经开始利用这种免疫球蛋白来增强机体的免疫力,对一些疾病进行被动免疫治疗，如作为婴幼儿食品添加剂，能提高机体免疫力和抗病、防病能力；作为功效因子用于功能性食品，能对多种疾病起到预防和治疗作用；作为生物医药产品，对病原微生物的感染，特别是婴幼儿呼吸道、消化道疾病的感染，进行有效的预防和治疗；作为生物活性物质添加剂，能用于免疫力低下的人群的辅助治疗。到目前为止，已有较多的来源于牛初乳的免疫球蛋白在临床上用于治疗的报道，如口服牛初乳浓缩物可以预防婴幼儿轮状病毒感染，口服免疫球蛋白可以预防治疗肠道病原菌、大肠杆菌等引起的肠道感染和腹泻，可以预防低体重婴幼儿感染分发病率。

牛初乳含有高水平的IgG，其水平远高于血清，是迄今为止提取IgG的理想材料，但因牛初乳的成分远比血清复杂，其提取和分离难度也更大，获取一定数量高纯度的IgG就更加困难。目前，IgG的分离纯化的方法研究已很多报道，有离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、免疫亲和色谱法、疏水作用色谱法、金属螯合色谱法、超滤法等。但用单一的方法很难制备出高纯度的Ig，通常都是采用一下几种方法相结合对Ig进行分离纯化。

1、通过用酸沉法分离乳清蛋白，通过超滤粗提免疫球蛋白，再通过离子层析方法纯化目标物，最终得到纯度为78.28%的免疫球蛋白产品；

2、通过用硫酸铵沉淀法提取乳清中的粗IgG，然后通过新型混合模式吸附剂树脂层析分离提取牛初乳乳清中免疫球蛋白，制得纯度为93.9%的免疫球蛋白；

3、用新型混合模式层析介质从牛初乳蛋白粉中分离免疫球蛋白纯度达95% 以上，纯化的免疫球蛋白为4.8mg；

4、采用离子交换色谱和凝胶过滤色谱联合分离纯化牛初乳中的IgG1和IgG2，得到的IgG含量在85%-90%之间,其中IgG1含量为90%；

5、采用中空纤维超滤膜（100kD）超滤浓缩分离免疫初乳中的抗体，再经硫酸铵盐析，可得到80%以上纯度的IgG浓缩物。

6、利用金属螯合色谱分离提取的IgG纯度达到了89%。

目前，免疫球蛋白G的分离和纯化的技术虽然已步入工艺较为成熟的阶段, 目前工业化生产普遍采用离子交换层析和凝胶过滤层析, 其分离效果较好，操作简便，但制备一定数量的高纯度的IgG仍是一个有待解决的技术难题。特别是前些年由于受国外疯牛病等的影响，用于牛初乳产品检测的免疫球蛋白G的标准品一度禁止入境，使生产企业和检测单位受到很大影响，因此，制备有知识产权的高纯度免疫球蛋白G就显得尤为重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，该方法是将牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白去除后，进行DEAE柱层析分离后，获得高纯度的免疫球蛋白G1和G2。

进一步地，牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白依次通过脱脂、去酪蛋白、盐析、超滤脱盐并浓缩进行去除。

进一步地，具体方法如下：

（1）脱脂取用牛初乳，去除上层脂肪和底部沉淀物，过滤后获得脱脂乳，备用；（2）去酪蛋白取用步骤（1）获得的脱脂乳进行稀释，并将PH调节至4.4～4.6，搅拌后静置；离心去除沉淀的酪蛋白，保留上清液，并将上清液的PH调节至6.5～7.0；（3）盐析向步骤（2）获得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到40%饱和度，静置后离心，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，离心后去除沉淀；剩下的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，离心后取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到35%饱和度，静置后离心，弃上清液，保留沉淀备用；（4）超滤脱盐并浓缩将步骤（3）获得的沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，进行脱盐，直到检测滤液中无氨离子后，浓缩去除牛初乳中100kD以下分子量的蛋白质；（5）DEAE柱层析分离（5.1）DEAE的预处理：取DEAE干粉于蒸馏水中充分溶涨，倒去上层未沉降的细微颗粒和水层，加入氢氧化钠进行浸泡，用蒸馏水洗至中性；再加入氯化氢进行浸泡，用蒸馏水洗至中性；最后再加入氢氧化钠进行浸泡，用蒸馏水洗至中性，用磷酸盐缓冲液将DEAE层析柱充分平衡待用；（5.2）加样与洗脱：将浓缩液于透析袋中对BP液透析过夜，离心后将上清液加到DEAE层析柱上，用BP液洗至A280值接近BP值；（5.3）免疫球蛋白G1的分离纯化：使用含50mmol/L的BP液进行洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下先后有一个主峰和一个小峰被洗脱下来，先洗脱的主峰为免疫球蛋白G；将该主峰合并，通过截留分子量为100Kda的超滤膜包使用去离子水进行脱盐并浓缩，将浓缩液在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G1；（5.4）免疫球蛋白G2的分离纯化：使用含50mmol/L的BP液继续洗脱至A280值接近BP值，然后用含100mmol/L的BP液继续洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下只有一个蛋白峰被洗脱下来，将该蛋白峰合并，用截留分子量为100Kda的超滤膜包进行脱盐并浓缩，并在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G2。

进一步地，步骤（1）的具体方法为：取用牛初乳，在4℃的温度下，以4000r/min的速度离心30min，去除上层脂肪和底部沉淀物，中间层经8层纱布过滤后获得脱脂乳，备用或于-20℃的温度下冷冻保存。

进一步地，步骤（2）的具体方法为：取用步骤（1）获得的100ml脱脂乳，加等体积的去离子水进行稀释，使用1N的氯化氢将PH调节至4.4～4.6，搅拌后静置15～30min；以4500r/min的速度离心15min去除沉淀的酪蛋白，保留上清液，并将上清液的PH调节至6.5～7.0。

进一步地，步骤（3）的具体方法为：向步骤（2）获得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到40%饱和度，在4℃的温度下静置3h以上，再以4000r/min的速度离心15min，将沉淀溶解于200ml、PH为7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液中，离心后去除沉淀，剩下的上清液重复以上步骤后，离心后再取上清液；向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到35%饱和度，在4℃下静置过夜，并以4000r/min的转速离心15min，弃上清液，保留沉淀备用。

进一步地，步骤（4）的具体方法为：将步骤（3）获得的沉淀溶解于200ml的磷酸盐缓冲液中，在0.15MPa的压力条件下用截留分子量为100Kda的超滤膜包，以5～10倍体积的磷酸盐缓冲液进行脱盐，直到检测滤液中无氨离子后，将体积浓缩到50～80ml，去除牛初乳中100kD以下分子量的蛋白质。

进一步地，步骤（5.1）的具体方法为：取100gDEAE干粉于蒸馏水中充分溶涨0.5h，倒去上层未沉降的细微颗粒和水层，加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性；再加入0.5N的氯化氢浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性；最后再加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性，用磷酸盐缓冲液将DEAE层析柱充分平衡待用。

进一步地，步骤（5.2）的具体方法为：将浓缩液于透析袋中在4℃条件下，对BP液透析过夜，离心后将上清液加到DEAE层析柱上，用BP液洗至A280值接近BP值。

本发明的有益效果为：

1、本发明在对牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白去除后，只需进行一次DEAE离子交换层析后，即可获得克级的高纯度免疫球蛋白G1和G2，制备方法简单且快速；

2、通过本方法获得的高纯度免疫球蛋白G1和G2，纯度能够高达95%，支持批量制备；

3、填补了国内高纯度免疫球蛋白制备的空白，有助于保障生产企业及检测单位工作的有序进行。

附图说明

图1、免疫球蛋白G1的HPLC分离图谱；

图2、免疫球蛋白G2的HPLC分离图谱；

图3、不连续系统SDS-PAGE 法测定图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例为一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，该方法是将牛初乳中100kD以下分子量杂蛋白依次通过脱脂、去酪蛋白、盐析、超滤脱盐并浓缩进行去除，进行DEAE柱层析分离后，获得高纯度的免疫球蛋白G1和G2。

具体方法如下：

（1）脱脂

取用牛初乳，在4℃的温度下，以4000r/min的速度离心30min，去除上层脂肪和底部沉淀物，中间层经8层纱布过滤后获得脱脂乳，备用或于-20℃的温度下冷冻保存；

（2）去酪蛋白

取用步骤（1）获得的100ml脱脂乳，加等体积的去离子水进行稀释，使用1N的氯化氢将PH调节至4.4～4.6，搅拌后静置15～30min；以4500r/min的速度离心15min去除沉淀的酪蛋白，保留上清液，并将上清液的PH调节至6.5～7.0；

（3）盐析

向步骤（2）获得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到40%饱和度，在4℃的温度下静置3h以上，再以4000r/min的速度离心15min，将沉淀溶解于200ml、PH为7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液中，离心后去除沉淀，剩下的上清液重复以上步骤后，离心后再取上清液；向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到35%饱和度，在4℃下静置过夜，并以4000r/min的转速离心15min，弃上清液，保留沉淀备用；

（4）超滤脱盐并浓缩

将步骤（3）获得的沉淀溶解于200ml的磷酸盐缓冲液中，在0.15MPa的压力条件下用截留分子量为100Kda的超滤膜包，以5～10倍体积的磷酸盐缓冲液进行脱盐，直到检测滤液中无氨离子后，将体积浓缩到50～80ml，去除牛初乳中100kD以下分子量的蛋白质；

（5）DEAE柱层析分离

（5.1）DEAE的预处理：

取100gDEAE干粉于蒸馏水中充分溶涨0.5h，倒去上层未沉降的细微颗粒和水层，加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至中性；再加入0.5N的氯化氢浸泡0.5h，用蒸馏水洗至中性；最后再加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至中性，用磷酸盐缓冲液将DEAE层析柱充分平衡待用；

（5.2）加样与洗脱：

将浓缩液于透析袋中在4℃条件下，对BP液透析过夜，离心后将上清液加到DEAE层析柱上，用BP液洗至A280值与BP值相同；

（5.3）免疫球蛋白G1的分离纯化：

使用含50mmol/L的BP液进行洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下先后有一个主峰和一个小峰被洗脱下来，先洗脱的主峰为免疫球蛋白G；将该主峰合并，通过截留分子量为100Kda的超滤膜包使用去离子水进行脱盐并浓缩，将浓缩液在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G1；

（5.4）免疫球蛋白G2的分离纯化：

使用含50mmol/L的BP液继续洗脱至A280值接近BP值，然后用含100mmol/L的BP液继续洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下只有一个蛋白峰被洗脱下来，将该蛋白峰合并，用截留分子量为100Kda的超滤膜包进行脱盐并浓缩，并在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G2。

本实施例获得的免疫球蛋白G1和G2的纯度和分子量分别采用HPLC法以及SDS-PAGE法进行检测，其中免疫球蛋白G1和G2的HPLC分离图谱分别如图1、图2所示，以面积归一发法求出样品峰的百分含量以表示免疫球蛋白G1纯度，G1纯度为99.9%，G2纯度为99.4%

同时以马脾铁蛋白（分子量440kD）、IgG(分子量150kD)、BSA（分子量67kD）、OVA(分子量43kD) 绘制标准曲线得 y=-0.7247*x+14.264，r=0.9966，得G1分子量为159.97kD，G2分子量为179.99 kD。

采用不连续系统的SDS-PAGE 法检测亚基分子量，如图3所示，G1的亚基分子量分别为53.85kD和27.13kD；G2的亚基分子量分别为54.44kD和27.23kD；标准IgG的亚基分子量分别54.09kD和27.35kD。

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：该方法是将牛初乳中100kDa以下分子量杂蛋白依次通过脱脂、去酪蛋白、盐析、超滤脱盐并浓缩进行去除后，进行DEAE 柱层析分离后，获得高纯度的免疫球蛋白G1和G2；

具体方法如下：（1）脱脂取用牛初乳，去除上层脂肪和底部沉淀物，过滤后获得脱脂乳，备用；（2）去酪蛋白取用步骤（1）获得的脱脂乳进行稀释，并将PH调节至4.4～4.6，搅拌后静置；离心去除沉淀的酪蛋白，保留上清液，并将上清液的PH调节至6.5～7.0；（3）盐析向步骤（2）获得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到40%饱和度，静置后离心，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，离心后去除沉淀；剩下的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，离心后取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到35%饱和度，静置后离心，弃上清液，保留沉淀备用；（4）超滤脱盐并浓缩将步骤（3）获得的沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，进行脱盐，直到检测滤液中无氨离子后，浓缩去除牛初乳中100kDa以下分子量的蛋白质；（5）DEAE柱层析分离（5.1）DEAE的预处理：取DEAE干粉于蒸馏水中充分溶涨，倒去上层未沉降的细微颗粒和水层，加入氢氧化钠进行浸泡，用蒸馏水洗至中性；再加入氯化氢进行浸泡，用蒸馏水洗至中性；最后再加入氢氧化钠进行浸泡，用蒸馏水洗至中性，用磷酸盐缓冲液将DEAE层析柱充分平衡待用；（5.2）加样与洗脱：将浓缩液于透析袋中对磷酸盐缓冲液透析过夜，离心后将上清液加到DEAE层析柱上，用磷酸盐缓冲液洗至A280值与预设值相同；（5.3）免疫球蛋白G1的分离纯化：使用含50mmol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下先后有一个主峰和一个小峰被洗脱下来，先洗脱的主峰为免疫球蛋白G；将该主峰合并，通过截留分子量为100kDa的超滤膜包使用去离子水进行脱盐并浓缩，将浓缩液在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G1；（5.4）免疫球蛋白G2的分离纯化：使用含50mmol/L的磷酸盐缓冲液继续洗脱至A280值接近预设值，然后用含100mmol/L的磷酸盐缓冲液继续洗脱，用部分收集器进行分部收集，用核酸蛋白检测仪进行监控，在此条件下只有一个蛋白峰被洗脱下来，将该蛋白峰合并，用截留分子量为100kDa的超滤膜包进行脱盐并浓缩，并在冷冻干燥机上冻干，得到纯化的免疫球蛋白G2。

2.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体方法为：取用牛初乳，在4℃的温度下，以4000r/min的速度离心30min，去除上层脂肪和底部沉淀物，中间层经8层纱布过滤后获得脱脂乳，备用或于-20℃的温度下冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体方法为：取用步骤（1）获得的100ml脱脂乳，加等体积的去离子水进行稀释，使用1N的氯化氢将PH调节至4.4～4.6，搅拌后静置15～30min；以4500r/min的速度离心15min去除沉淀的酪蛋白，保留上清液，并将上清液的PH调节至6.5～7.0。

4.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体方法为：向步骤（2）获得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到40%饱和度，在4℃的温度下静置3h以上，再以4000r/min的速度离心15min，将沉淀溶解于200ml、PH为7.4的100mmol/L磷酸盐缓冲液中，离心后去除沉淀，剩下的上清液重复以上步骤后，离心后再取上清液；向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液达到35%饱和度，在4℃下静置过夜，并以4000r/min的转速离心15min，弃上清液，保留沉淀备用。

5.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（4）的具体方法为：将步骤（3）获得的沉淀溶解于200ml的磷酸盐缓冲液中，在0.15MPa的压力条件下用截留分子量为100kDa的超滤膜包，以5～10倍体积的磷酸盐缓冲液进行脱盐，直到检测滤液中无氨离子后，将体积浓缩到50～80ml，去除牛初乳中100kDa以下分子量的蛋白质。

6.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（5.1）的具体方法为：取100gDEAE干粉于蒸馏水中充分溶涨0.5h，倒去上层未沉降的细微颗粒和水层，加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性；再加入0.5N的氯化氢浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性；最后再加入0.5N的氢氧化钠浸泡0.5h，用蒸馏水洗至接近中性，用磷酸盐缓冲液将DEAE层析柱充分平衡待用。

7.根据权利要求1所述的一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白G1和G2的方法，其特征在于：所述步骤（5.2）的具体方法为：将浓缩液于透析袋中在4℃条件下，对磷酸盐缓冲液透析过夜，离心后将上清液加到DEAE层析柱上，用磷酸盐缓冲液洗至A280值与预设值相同。