CN1660905A - 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 - Google Patents
一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1660905A CN1660905A CN 200410013585 CN200410013585A CN1660905A CN 1660905 A CN1660905 A CN 1660905A CN 200410013585 CN200410013585 CN 200410013585 CN 200410013585 A CN200410013585 A CN 200410013585A CN 1660905 A CN1660905 A CN 1660905A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igg
- pbs
- purifying
- sample
- ion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种提取纯化牛初乳中的IgG的方法,步骤如下:将收集到的牛初乳过滤,离心脱脂,将脱脂后的牛初乳巴氏消毒;加盐析物质去除酪蛋白及无抗体活性蛋白;乳清脱盐、除糖:盐析、透析;用离子交换柱层析法分离纯化;凝胶过滤层析纯化,即可得IgG。本发明利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG.,简化了生产工艺,使提取、纯化出的牛初乳中的IgG.含量可达90%以上。
Description
技术领域:本发明涉及一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法,具体是利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG。
背景技术:免疫球蛋白(Immunoglobulin,简称Ig)是牛初乳和常乳中最引人注目的免疫因子,初乳中富含的多种免疫球蛋白(IgG、IgM等)能够形成抗体,与病源微生物及毒素等抗原结合,在哺乳动物新生幼仔自身免疫系统发育成熟、正常运作之前,可以保护其免受病源体的侵袭。牛初乳中免疫球蛋白(Immunoglobulin,简称Ig)有IgG、IgA、IgM、IGD和IgE等种类,而且对于每一类还可以有更细致的分类。因此如果要从Ig中分离出IgG而且要达到很高的浓度(效价),单纯依靠一般效率的分离手段是很难完成的,目前已有一些提取牛初乳中的IgG的方法,但这些方法存在着提取、纯化出的IgG含量低、工艺复杂等不足。
发明内容:本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种工艺简单、提取纯化出的IgG含量高的一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法。本发明的技术方案是:本发明的提取、纯化方法步骤如下:1、将收集到的牛初乳过滤,利用离心机在30℃-50℃离心脱脂,将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒;2、加盐析物质沉淀去除酪蛋白及无抗体活性蛋白;3、乳清脱盐、除糖,盐析、透析:将去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的上清液经强酸型树脂(Catex,Na+型)处理,去除过量的盐析物质;在乳清中加入分析纯硫酸铵,使其饱和度达到35%,4℃静置12-13h,在4℃下离心25-35min,保留沉淀,用原乳清液体积5%的PBS(磷酸盐缓冲液,pH6.8,0.01mol/L)溶解沉淀,将沉淀置入透析袋中,在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在(或用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在),然后冻干,得到IgG初步分离浓缩产物;4、离子交换柱层析分离纯化;5、凝胶过滤层析纯化,纯化后即可得含量达90%以上的IgG。
本发明由于选择合适的离子交换填料和凝胶过滤填料(选择以SepharoseFF为基架的离子交换介质:DEAE Sepharose F.F选择凝胶过滤填料Sephacry/s-200HR),利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG.,并选择二甲基十二烷基苄基溴化铵作为盐析物质,沉淀去除不具备抗体活性的初乳蛋白,简化了生产工艺,使提取、纯化出的牛初乳中的IgG.含量可达90%以上。
具体实施方式:
1、将收集到的牛初乳在4-10℃过滤,利用4000r/min离心机,30℃-50℃离心脱脂,将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒25-35min之后冷冻保藏;
2、将冷冻的脱脂牛初乳室温解冻并升温至20℃-30℃,搅拌下缓慢加入等体积的2% DMLDAB(二甲基十二烷基苄基溴化胺)水溶液,调节pH7.9-pH8.1,沉淀酪蛋白及各种无抗体活性的的初乳蛋白组分,将浑浊混合物加热至43℃-45℃,冷却至室温,沉淀15-20小时,离心18-25min除去沉淀,保留上清液;
3、上清液经强酸型树脂(Catex,Na+型)处理,去除过量的DMLDAB;在乳清中加入分析纯硫酸铵,使其饱和度达到35%,4℃静置12-13小时,在4℃下离心25-35min,保留沉淀;用原乳清液体积5%的PBS(磷酸盐缓冲液,pH6.8,0.01mol/L)溶解沉淀,将沉淀置入透析袋中,在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在(或者用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在)。然后冻干,得到IgG初步分离浓缩产物;
4、离子交换柱层析分离纯化:(1)离子交换柱填充及连接:填料采用DEAE Sepharose F.F(安法玛西亚,amersham pharmacia biotech),将柱填料分别用蒸馏水、0.5mol/L NaOH溶液处理,然后用pH7.4,0.01mol/L的PBS平衡,在0.3MPa下填充到规格为45mmi.d.×200mm的离子交换柱管中,制成DEAE Sepharose F.F离子交换柱。将离子交换柱管部分安装到用生化培养箱改制的冷阱柱箱中(温控范围:2℃-50℃),将梯度转换接头与P2000高效液相色谱泵连接(将泵的最小压力设置为“0”MPa)。用UV200紫外检测器检测,402色谱工作站记录绘图;
(2)、样品准备及上样洗脱:取2.0g IgG初步分离的样品,用pH7.4,0.01mol/L的PBS30mL溶解,置于透析袋中,然后在4℃下对2500mL的pH7.4,0.01mol/L的PBS透析24h后上样,上样后分别采用3种洗脱液进行分段洗脱(用TSP高效液相色谱系统的P2000二元梯度泵代替普通的梯度混合器),第一阶段采用pH7.4,0.01mol/L的PBS洗脱;第1个峰流出后,再采用pH5.4,0.02mol/L的PBS进行第二阶段洗脱;第2个峰流出后,改用pH5.4,0.08mol/L的PBS洗脱至第3个峰流出,洗脱体积流速为300mL/h,分离过程中控制柱温为4℃;
5、凝胶过滤层析纯化:采用Sephacryl S-200 HR凝胶过滤填料(安法玛西亚,amersham pharmacia biotech)进行凝胶过滤层析,将填料在0.2MPa下填充到16mmi.d.×800mm凝胶过滤柱管中。填充后,用pH7.6,0.005mol/LPBS在4℃下平衡12h,体积流速为36mL/h。将DEAESepharose F.F分离得到的3个峰分别用pH7.6,0.005mol/L的PBS溶解并上样,洗脱液为pH7.6,0.005mol/L的PBS,洗脱体积流速为36mL/h。分离过程中控制柱温为4℃,根据组分的保留时间,用BS-100A型自动馏分收集器将3个峰收集并冻干。即获IgG纯品,IgG含量为90%以上。
Claims (4)
1、一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法,其特征在于其步骤为:(1)、将收集到的牛初乳过滤,利用离心机在30℃-50℃离心脱脂,将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒;(2)、加盐析物质沉淀去除酪蛋白及无抗体活性蛋白;(3)、乳清脱盐、除糖、盐析、透析:将去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的上清液经Catex,Na+型强酸型树脂处理,去除过量的盐析物质;在乳清中加入分析纯硫酸铵,使其饱和度达到35%,4℃静置12-13h,在4℃下离心25-35min,保留沉淀,用原乳清液体积5%的pH6.8,0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶解沉淀,将沉淀置入透析袋中,在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在,或用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在,冻干后得到IgG初步分离浓缩产物;(4)、用离子交换柱层析分离纯化;(5)、凝胶过滤层析纯化,即可得IgG纯品。
2、如权利要求1所述的一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法,其特征在于所述的去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的方法中所用的盐析物质是二甲基十二烷基苄基溴化胺水溶液,其方法的步骤是:将脱脂消毒后的牛初乳在20℃-30℃下,搅拌缓慢加入等体积的2%的二甲基十二烷基苄基溴化胺水溶液,调节pH7.9-pH8.1,沉淀各种无抗体活性的的初乳蛋白组分,将浑浊混合物加热至43℃-45℃,冷却至室温,沉淀15-20小时,离心18-25min除去沉淀,保留上清液。
3、如权利要求1所述的一种提取纯化、牛初乳中的IgG的方法,其特征在于所述的离子交换柱层析分离纯化的方法的步骤是:(1)离子交换柱填充及连接:填料采用DEAE Sepharose F.F(安法玛西亚,amersham pharmacia biotech),将柱填料分别用蒸馏水、0.5mol/LNaOH溶液处理,然后用pH7.4,0.01mol/L的PBS平衡,在0.3MPa下填充到规格为45mm i.d.×200mm的离子交换柱管中,制成DEAESepharose F.F离子交换柱。将离子交换柱管部分安装到用生化培养箱改制的冷阱柱箱中,温控范围:2℃-50℃,将梯度转换接头与P2000高效液相色谱泵连接,将泵的最小压力设置为“0”MPa,用UV200紫外检测器检测,402色谱工作站记录绘图;(2)、样品准备及上样洗脱:取2.0g IgG初步分离的样品,用pH7.4,0.01mol/L的PBS30mL溶解,置于透析袋中,然后在4℃下对2500mL的pH7.4,0.01mol/L的PBS透析24h后上样,上样后分别采用3种洗脱液进行分段洗脱,第一阶段采用pH7.4,0.01mol/L的PB洗脱;第1个峰流出后,再采用pH5.4,0.02mol/L的PBS进行第二阶段洗脱;第2个峰流出后,改用pH5.4,0.08mol/L的PBS洗脱至第3个峰流出,洗脱体积流速为300mL/h,分离过程中控制柱温为4℃。
4、如权利要求1所述的一种提取纯化牛初乳中的IgG的方法,其特征在于所述的凝胶过滤层析纯化的方法的步骤是:用SephacrylS-200 HR凝胶过滤填料(安法玛西亚,amersham pharmacia biotech)进行凝胶过滤层析,将填料在0.2MPa下填充到16mm i.d.×800mm凝胶过滤柱管中,填充后,用pH7.6,0.005mol/L PBS在4℃下平衡12h,体积流速为36mL/h,将DEAE Sepharose F.F分离得到的3个峰分别用pH7.6,0.005mol/L的PBS溶解并上样,洗脱液为pH7.6,0.005mol/L的PBS,洗脱体积流速为36mL/h,分离过程中控制柱温为4℃,根据组分的保留时间,用BS-100A型自动馏分收集器将3个峰收集并冻干即可得IgG纯品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410013585 CN1660905A (zh) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410013585 CN1660905A (zh) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1660905A true CN1660905A (zh) | 2005-08-31 |
Family
ID=35010485
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200410013585 Pending CN1660905A (zh) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1660905A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101248819B (zh) * | 2008-03-04 | 2010-12-22 | 江苏星驰生物科技有限公司 | 富含IgG的牛初乳粉的制备方法 |
CN102321150A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-01-18 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法 |
CN103159824A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-06-19 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统及其在无菌无热原蛋白质药物制备上的应用 |
CN103732253A (zh) * | 2011-08-19 | 2014-04-16 | Emd密理博公司 | 小分子在纯化生物分子的方法中的用途 |
CN106390116A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-02-15 | 湖北华冠中科生物药业有限公司 | 一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白g制剂及其制备方法 |
CN114014926A (zh) * | 2021-11-20 | 2022-02-08 | 江苏天美健大自然生物工程有限公司 | 一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g1和g2的方法 |
-
2004
- 2004-02-27 CN CN 200410013585 patent/CN1660905A/zh active Pending
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101248819B (zh) * | 2008-03-04 | 2010-12-22 | 江苏星驰生物科技有限公司 | 富含IgG的牛初乳粉的制备方法 |
CN102321150A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-01-18 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法 |
CN103732253A (zh) * | 2011-08-19 | 2014-04-16 | Emd密理博公司 | 小分子在纯化生物分子的方法中的用途 |
CN102321150B (zh) * | 2011-08-19 | 2014-09-24 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法 |
CN103159824A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-06-19 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统及其在无菌无热原蛋白质药物制备上的应用 |
CN103159824B (zh) * | 2013-02-06 | 2015-11-25 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统及其在无菌无热原蛋白质药物制备上的应用 |
CN106390116A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-02-15 | 湖北华冠中科生物药业有限公司 | 一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白g制剂及其制备方法 |
CN114014926A (zh) * | 2021-11-20 | 2022-02-08 | 江苏天美健大自然生物工程有限公司 | 一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g1和g2的方法 |
CN114014926B (zh) * | 2021-11-20 | 2023-08-18 | 江苏天美健大自然生物工程有限公司 | 一种简单快速从牛初乳中制备高纯度免疫球蛋白g1和g2的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2009247031B2 (en) | Process for producing milk fractions rich in secretory immunoglobulins | |
Cheang et al. | Separation of α‐lactalbumin and β‐lactoglobulin using membrane ultrafiltration | |
EP0390821B1 (en) | Process for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactoferrin from milk serum | |
US5714583A (en) | Factor IX purification methods | |
CN102178951B (zh) | 一种生产静注人免疫球蛋白的方法 | |
US5194591A (en) | Isolation of an immunoglobulin rich fracton from whey | |
CN102898516A (zh) | 一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法 | |
CN1660905A (zh) | 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 | |
JPH0533239B2 (zh) | ||
US6001974A (en) | Method of separating albumin from serum by ion-exchange chromatography with membrane adsorbers | |
US6555659B1 (en) | Process for isolating glycomacropeptide from dairy products with a phenylalanine impurity of 0.5% w/w | |
Zhang et al. | Selective separation of proteins by microfiltration with formed-in-place membranes | |
CN105924514A (zh) | 一种重组人白细胞介素-12的纯化方法 | |
CN101045750B (zh) | 骆驼初乳免疫球蛋白IgA、IgG的提取工艺 | |
CN110678481B (zh) | 用于纯化白蛋白的方法 | |
Fweja et al. | Isolation of lactoperoxidase using different cation exchange resins by batch and column procedures | |
NZ243727A (en) | Isolation of charged particles from fluids by ion exchange where the ion exchange medium is disposed on a porous membrane | |
CN104513305B (zh) | 一种乳清蛋白的纯化方法 | |
CN109734796B (zh) | 一种从溶血血清中分离白蛋白的工艺 | |
CN106146608A (zh) | 一种蜜蜂抗菌肽的提取制备方法 | |
CN116606370B (zh) | 一种天然IgM纯化的方法 | |
CN105037451B (zh) | 一种超滤处理黄霉素发酵液的方法 | |
EP3451845B1 (en) | Apparatus and method for separating whey proteins from whey using the same | |
CN111116706A (zh) | 一种提取母乳中乳清蛋白的纯化制备方法 | |
Marella et al. | Whey Protein Fractionation Using a Multistage Ultrafiltration System |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |