CN1660905A - 一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取纯化牛初乳中的IgG的方法，步骤如下：将收集到的牛初乳过滤，离心脱脂，将脱脂后的牛初乳巴氏消毒；加盐析物质去除酪蛋白及无抗体活性蛋白；乳清脱盐、除糖：盐析、透析；用离子交换柱层析法分离纯化；凝胶过滤层析纯化，即可得IgG。本发明利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG.，简化了生产工艺，使提取、纯化出的牛初乳中的IgG.含量可达90％以上。
Description
技术领域：本发明涉及一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法，具体是利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG。
背景技术：免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)是牛初乳和常乳中最引人注目的免疫因子，初乳中富含的多种免疫球蛋白(IgG、IgM等)能够形成抗体，与病源微生物及毒素等抗原结合，在哺乳动物新生幼仔自身免疫系统发育成熟、正常运作之前，可以保护其免受病源体的侵袭。牛初乳中免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)有IgG、IgA、IgM、IGD和IgE等种类，而且对于每一类还可以有更细致的分类。因此如果要从Ig中分离出IgG而且要达到很高的浓度(效价)，单纯依靠一般效率的分离手段是很难完成的，目前已有一些提取牛初乳中的IgG的方法，但这些方法存在着提取、纯化出的IgG含量低、工艺复杂等不足。
发明内容：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、提取纯化出的IgG含量高的一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法。本发明的技术方案是：本发明的提取、纯化方法步骤如下：1、将收集到的牛初乳过滤，利用离心机在30℃-50℃离心脱脂，将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；2、加盐析物质沉淀去除酪蛋白及无抗体活性蛋白；3、乳清脱盐、除糖，盐析、透析：将去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的上清液经强酸型树脂(Catex，Na+型)处理，去除过量的盐析物质；在乳清中加入分析纯硫酸铵，使其饱和度达到35％，4℃静置12-13h，在4℃下离心25-35min，保留沉淀，用原乳清液体积5％的PBS(磷酸盐缓冲液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，将沉淀置入透析袋中，在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在(或用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在)，然后冻干，得到IgG初步分离浓缩产物；4、离子交换柱层析分离纯化；5、凝胶过滤层析纯化，纯化后即可得含量达90％以上的IgG。
本发明由于选择合适的离子交换填料和凝胶过滤填料(选择以SepharoseFF为基架的离子交换介质：DEAE Sepharose F.F选择凝胶过滤填料Sephacry/s-200HR)，利用制备色谱技术提取、纯化牛初乳中的IgG.，并选择二甲基十二烷基苄基溴化铵作为盐析物质，沉淀去除不具备抗体活性的初乳蛋白，简化了生产工艺，使提取、纯化出的牛初乳中的IgG.含量可达90％以上。
具体实施方式：
1、将收集到的牛初乳在4-10℃过滤，利用4000r/min离心机，30℃-50℃离心脱脂，将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒25-35min之后冷冻保藏；
2、将冷冻的脱脂牛初乳室温解冻并升温至20℃-30℃，搅拌下缓慢加入等体积的2％ DMLDAB(二甲基十二烷基苄基溴化胺)水溶液，调节pH7.9-pH8.1，沉淀酪蛋白及各种无抗体活性的的初乳蛋白组分，将浑浊混合物加热至43℃-45℃，冷却至室温，沉淀15-20小时，离心18-25min除去沉淀，保留上清液；
3、上清液经强酸型树脂(Catex，Na+型)处理，去除过量的DMLDAB；在乳清中加入分析纯硫酸铵，使其饱和度达到35％，4℃静置12-13小时，在4℃下离心25-35min，保留沉淀；用原乳清液体积5％的PBS(磷酸盐缓冲液，pH6.8，0.01mol/L)溶解沉淀，将沉淀置入透析袋中，在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在(或者用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在)。然后冻干，得到IgG初步分离浓缩产物；
4、离子交换柱层析分离纯化：(1)离子交换柱填充及连接：填料采用DEAE Sepharose F.F(安法玛西亚，amersham pharmacia biotech)，将柱填料分别用蒸馏水、0.5mol/L NaOH溶液处理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到规格为45mmi.d.×200mm的离子交换柱管中，制成DEAE Sepharose F.F离子交换柱。将离子交换柱管部分安装到用生化培养箱改制的冷阱柱箱中(温控范围：2℃-50℃)，将梯度转换接头与P2000高效液相色谱泵连接(将泵的最小压力设置为“0”MPa)。用UV200紫外检测器检测，402色谱工作站记录绘图；
(2)、样品准备及上样洗脱：取2.0g IgG初步分离的样品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下对2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上样，上样后分别采用3种洗脱液进行分段洗脱(用TSP高效液相色谱系统的P2000二元梯度泵代替普通的梯度混合器)，第一阶段采用pH7.4，0.01mol/L的PBS洗脱；第1个峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS进行第二阶段洗脱；第2个峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脱至第3个峰流出，洗脱体积流速为300mL/h，分离过程中控制柱温为4℃；
5、凝胶过滤层析纯化：采用Sephacryl S-200 HR凝胶过滤填料(安法玛西亚，amersham pharmacia biotech)进行凝胶过滤层析，将填料在0.2MPa下填充到16mmi.d.×800mm凝胶过滤柱管中。填充后，用pH7.6，0.005mol/LPBS在4℃下平衡12h，体积流速为36mL/h。将DEAESepharose F.F分离得到的3个峰分别用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上样，洗脱液为pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脱体积流速为36mL/h。分离过程中控制柱温为4℃，根据组分的保留时间，用BS-100A型自动馏分收集器将3个峰收集并冻干。即获IgG纯品，IgG含量为90％以上。
Claims (4)
1、一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于其步骤为：(1)、将收集到的牛初乳过滤，利用离心机在30℃-50℃离心脱脂，将脱脂后的牛初乳在60℃-65℃巴氏消毒；(2)、加盐析物质沉淀去除酪蛋白及无抗体活性蛋白；(3)、乳清脱盐、除糖、盐析、透析：将去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的上清液经Catex，Na+型强酸型树脂处理，去除过量的盐析物质；在乳清中加入分析纯硫酸铵，使其饱和度达到35％，4℃静置12-13h，在4℃下离心25-35min，保留沉淀，用原乳清液体积5％的pH6.8，0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS溶解沉淀，将沉淀置入透析袋中，在4℃下对PBS透析至透析液中无NH+ 4存在，或用5000道尔顿的中空纤维膜超滤至无NH+ 4存在，冻干后得到IgG初步分离浓缩产物；(4)、用离子交换柱层析分离纯化；(5)、凝胶过滤层析纯化，即可得IgG纯品。
2、如权利要求1所述的一种提取、纯化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的去除酪蛋白及无抗体活性蛋白的方法中所用的盐析物质是二甲基十二烷基苄基溴化胺水溶液，其方法的步骤是：将脱脂消毒后的牛初乳在20℃-30℃下，搅拌缓慢加入等体积的2％的二甲基十二烷基苄基溴化胺水溶液，调节pH7.9-pH8.1，沉淀各种无抗体活性的的初乳蛋白组分，将浑浊混合物加热至43℃-45℃，冷却至室温，沉淀15-20小时，离心18-25min除去沉淀，保留上清液。
3、如权利要求1所述的一种提取纯化、牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的离子交换柱层析分离纯化的方法的步骤是：(1)离子交换柱填充及连接：填料采用DEAE Sepharose F.F(安法玛西亚，amersham pharmacia biotech)，将柱填料分别用蒸馏水、0.5mol/LNaOH溶液处理，然后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡，在0.3MPa下填充到规格为45mm i.d.×200mm的离子交换柱管中，制成DEAESepharose F.F离子交换柱。将离子交换柱管部分安装到用生化培养箱改制的冷阱柱箱中，温控范围：2℃-50℃，将梯度转换接头与P2000高效液相色谱泵连接，将泵的最小压力设置为“0”MPa，用UV200紫外检测器检测，402色谱工作站记录绘图；(2)、样品准备及上样洗脱：取2.0g IgG初步分离的样品，用pH7.4，0.01mol/L的PBS30mL溶解，置于透析袋中，然后在4℃下对2500mL的pH7.4，0.01mol/L的PBS透析24h后上样，上样后分别采用3种洗脱液进行分段洗脱，第一阶段采用pH7.4，0.01mol/L的PB洗脱；第1个峰流出后，再采用pH5.4，0.02mol/L的PBS进行第二阶段洗脱；第2个峰流出后，改用pH5.4，0.08mol/L的PBS洗脱至第3个峰流出，洗脱体积流速为300mL/h，分离过程中控制柱温为4℃。
4、如权利要求1所述的一种提取纯化牛初乳中的IgG的方法，其特征在于所述的凝胶过滤层析纯化的方法的步骤是：用SephacrylS-200 HR凝胶过滤填料(安法玛西亚，amersham pharmacia biotech)进行凝胶过滤层析，将填料在0.2MPa下填充到16mm i.d.×800mm凝胶过滤柱管中，填充后，用pH7.6，0.005mol/L PBS在4℃下平衡12h，体积流速为36mL/h，将DEAE Sepharose F.F分离得到的3个峰分别用pH7.6，0.005mol/L的PBS溶解并上样，洗脱液为pH7.6，0.005mol/L的PBS，洗脱体积流速为36mL/h，分离过程中控制柱温为4℃，根据组分的保留时间，用BS-100A型自动馏分收集器将3个峰收集并冻干即可得IgG纯品。
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