CN105924514A - 一种重组人白细胞介素-12的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组人白细胞介素‑12的纯化方法，所述方法包括：(1)采用深层过滤系统将含有重组人白细胞介素‑12的细胞培养液澄清过滤；(2)进行Q Sepharose HP纯化；(3)进行Phenyl Sepharose 6FF High sub纯化；(4)进行SP Sepharose HP纯化；(5)进行Superdex200纯化。本发明方法具有工艺简单，稳定性好，产品均一，生产成本低，环保，活性高的特点，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化方法。属于生物制药领域。
背景技术
白细胞介素12(IL-12)，又称细胞霉性淋巴细胞成熟因子(CLMF)或称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)，是一种主要由巨噬细胞和B细胞等产生的异二聚体细胞因子，能够提高NK细胞和T细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的应答能力，促进激活的NK细胞和T细胞的增殖，诱导IFN-γ等细胞因子的产生，促进Th1细胞的发育，上调多种细胞表面分子的表达，抑制IgE的合成。IL-12将在抗肿瘤、急性放射病、提高免疫力、抗肿瘤、肿瘤的放化疗和延迟生存期等方面病毒性疾病和寄生虫病的免疫治疗中起重要作用，目前，重组人白细胞介素IL-12(rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗过敏性哮喘的临床试验阶段。
IL-12是一种糖蛋白，由p40和p35两个亚单位经一对二硫键连接组成。其重链p40由306个氨基酸组成，分子量为34699Da，包含10个半胱氨基酸残基(3对分子内二硫键和1个分子间二硫键)和4个可能的N-端糖基化位点；轻链p35由197个氨基酸组成，分子量为22513Da，包含7个半胱氨基酸残基(2对分子内二硫键和1个分子间二硫键)和3个可能的N-端糖基化位点。p40在IL-12与受体结合时起关键作用，当两者的cDNA共转染时，才能得到有生物学活性的IL-12。
人重组白细胞介素12在原核细胞中难以表达出活性形式，因此目前将其在真核细胞中表达。例如中国专利申请CN01126923.5、CN00113786.7、CN01133631.5都涉及此类内容。
但是，通过各种分离手段从细胞培养物中纯化人重组白细胞介素12，是生产过程中非常重要的一环。
如美国专利US5853714利用四个柱层析和一次超滤工艺进行纯化，但分子筛层析所用的介质S-200Sephacryl HighResolution孔径太大，分离效果不理想。又如美国专利US6830751提到的纯化方法包括三个柱层析，它是在专利US5853714的基础上做了进一步的改进；中国专利公开CN1616489A包括三个柱层析和一次超滤工艺，该专利从离子交换层析图谱中看出杂蛋白峰比较高，影响离子交换剂的使用寿命，并且所用的洗脱液与平衡液种类繁多，整个过程显得很繁琐，难于工业应用。
另外，中国专利公开CN 101033254A公开了一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其包括将rhIL-12的细胞培养上清液经过滤、阳离子或阴离子交换层析、硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析和分子筛层析，进行硫酸铵沉淀时pH远离rhIL-12的等电点。但是，因为该方法采用硫酸铵沉淀的方法，需要将沉淀变性的rhIL-12蛋白质复性，这个过程中导致部分蛋白质不能完全复性，或者是丧失生物活性，导致效价的降低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了重组人白细胞介素的纯化方法，本发明具有工艺简单，稳定性好，产品均一，生产成本低，环保，活性高的特点，适用于工业化生产。
具体而言，本发明提供一种重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化方法，所述方法包括：
(1).采用深层过滤系统将含有rhIL-12的细胞培养液澄清过滤；
(2)进行Q Sepharose HP纯化；
(3)进行Phenyl Sepharose 6 FF High sub纯化；
(4)进行SP Sepharose HP纯化；
(5)进行Superdex200纯化；
作为含有rhIL-12的细胞培养液，可以采用本领域已知的表达体系如通过中国专利申请CN01126923.5、CN00113786.7、CN01133631.5等获得的细胞培养液。
在一个实施方式中，所述深层过滤系统为深层过滤器D0HC和深层过滤器A1HC的组合，其中使所述细胞培养液先后通过D0HC和A1HC。该步骤的主要作用是去除细胞，细胞碎片及宿主细胞DNA。
优选的是，在细胞培养液澄清过滤工艺中：
过滤样品压力控制：＜0.3MP
样品浊度控制：＜10UTF。
在一个实施方式中，所述Q Sepharose HP纯化包括用洗脱液进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 7.5-8.2，优选8.0。优选的是所述梯度洗脱包括：
I.5％～7％洗脱液，优选5％洗脱液洗脱15个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰；
II.22％～24％洗脱液，优选22％洗脱液洗脱10个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰，共收集2个洗脱峰；
III.100％洗脱液洗脱5个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰。
Q柱纯化的作用将目的蛋白rhIL-12全部捕获，因此该步骤为捕获工艺。
另外，步骤I还可以洗脱去除部分宿主细胞蛋白质(HCP)。
步骤II主要目的是洗脱P70，还可以去除是部分P40、部分宿主DNA、色素。
步骤III还可以洗脱杂蛋白、部分宿主DNA、内毒素。
还优选的是，在捕获工艺中所述Q Sepharose HP纯化的条件还包括：
柱压控制：柱前压＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜6.5ms/cm
在一个实施方式中，所述Phenyl Sepharose 6 FF High sub纯化包括用洗脱液和MQ水进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM PB，pH7.2。优选的是，所述梯度洗脱包括：
I.55％～60％洗脱液，优选55％洗脱液洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰；
II.100％洗脱液洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰；
III.MQ水洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰。
Phenyl Sepharose 6 FF High sub纯化是中度纯化工艺。
步骤I去除P40、部分宿主蛋白。
步骤II洗脱P70。
步骤III去除部分宿主蛋白。
还优选的是，在中度纯化工艺中，所述Phenyl Sepharose 6 FF High sub纯化的条件还包括：
柱前压控制：柱前压＜0.5MPa
上样样品硫酸铵浓度控制：0.95-1.1M
在一个实施方式中，所述SP Sepharose HP纯化包括用洗脱液进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM PB，1M NaCl，pH 5.8-6.2，优选pH6.0。优选的是，所述梯度洗脱包括：
I.20％～22％洗脱液，优选20％洗脱液洗脱10CV，流速15ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰，
II.100％洗脱液洗脱5CV，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集洗脱峰。
SP Sepharose HP纯化是深度纯化工艺。
步骤I去除部分宿主蛋白。
步骤II洗脱P70。
还优选的是，在深度纯化工艺中所述SP Sepharose HP纯化的条件还包括：
柱前压控制：＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜7.0ms/cm
在一个实施方式中，所述使用Superdex200进行纯化，其包括用pH7.2的PBS洗脱，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集峰组分。
Superdex200纯化是精细纯化工艺。
优选的是，在精细纯化工艺中所述Superdex200纯化的条件还包括
Superdex200填充柱柱效：＞10000
Superdex200填充柱对称性：0.7-1.3
柱前压控制：＜0.5MPa
需要说明的是，Q Sepharose HP柱、Phenyl Sepharose 6 FF High sub柱、SPSepharose HP柱和Superdex200柱都是商业上可获得的色谱柱，例如可购自GE(通用电气公司)，深层过滤器D0HC和深层过滤器A1HC也都是商业上可获得的，其可购自Merck Millipore。
本发明包含的纯化方法和步骤始终保持rhIL-12蛋白质处于液相环境中，rhIL-12蛋白质没有发生相变，充分的保留了rhIL-12的天然活性，经过NK细胞检测体外活性，以WHO rhIL-12作为标准品，比活可以达到6×106IU/mg以上。经过4个步骤的纯化，纯化得到的rhIL-12经过SEC-HPLC测定，纯度可以达到99％以上，经过ELSIA测定宿主细胞蛋白质含量小于0.05％，荧光法测定宿主DNA含量小于10ng/ug，凝胶法测定内毒素含量小于1.43EU/mg，各项指标都优于国家生物制品的检测标准，并且已经成功的应用于动物学实验。本发明采用的都是通用的GE公司的Pilot、Pure蛋白纯化仪和各种填料，具有工艺简单，稳定性好，产品均一，生产成本低，环保，活性高的特点，适用于工业化生产。
附图说明
图1.第一步纯化Q Sepharose HP图谱。峰1：目的蛋白rhIL-12；峰2，部分P40、色素、部分宿主DNA、部分宿主蛋白(HCP)；峰3：部分宿主细胞蛋白质(HCP)、部分宿主DNA，内毒素。第一步纯化去除掉主要的宿主细胞蛋白质,宿主DNA，内毒素。
图2第二步纯化Phenyl Sepharose 6 FF High sub图谱。峰1：部分宿主蛋白(HCP)和单体蛋白质p40亚基；峰2：目的蛋白质rhIL-12；峰3：宿主细胞蛋白质(HCP)。
图3：第三步纯化SP Sepharose HP图谱。主要去除掉宿主细胞蛋白质(HCP)，。
图4：第四步纯化Superdex200图谱：主要用于分离聚体。纯化后样品即为高纯度的rhIL-12蛋白原液。
图5：纯度检测SEC-HPLC图谱。显示结果：纯度接近100％。
图6：经纯化rhIL-12的非还原SDS-PAGE电泳图谱。显示结果：rhIL-12的分子量与理论值一致，并且纯化后没有杂带存在。
图7：rhIL-12蛋白质的体外活性图谱。标准品采用WHO rhIL-12的国际单位IU/mg,得到的rhIL-12的效价是8.356×106IU/mg.
具体实施方式
实施例1
收样及澄清过滤
1准备
1.1不锈钢桶：准备3个20L不锈钢桶，MQ水冲洗3遍，180℃，4-6h灭菌。
1.2硅胶管(silicone tubing)L/s 15：硅胶管5-7根，0.2M NaOH浸泡4h以上，自来水冲洗干净，再用MQ水洗3遍。121℃灭菌30min。
1.3滤器：①Millistak+HC Pod Depth Filter，D0HC media series 0.054m2，孔径0.5-10μm，承受压力0.2Mpa。
②Millistak+HC Pod Depth Filter，A1HC media series 0.027m2，孔径<0.5μm，承受压力0.2Mpa。
1.4PBS：配制PBS 10L，pH 7.2，过滤除菌。
2收样及澄清过滤
2.1润洗滤器：用硅胶管分别连接滤器进口、出口和排气口，D0HC滤器的出口端串联A1HC的进口端。用蠕动泵以300ml/min的速度将PBS通过滤膜润洗，排出气泡。
2.2收样过滤：连接发酵罐的出口端与D0HC的进口端，以200ml/min的速度将培养液流经滤膜，用一个20L不锈钢桶收集滤液。
2.3发酵罐内的培养液滤完后，用蠕动泵将2L PBS以200ml/min的速度冲出滤膜内残留的培养液。
第一步纯化(捕获工艺)
1准备
1.1仪器设备：AKTA Pilot，0.2M NaOH冲洗系统管道，并浸泡6h以上。
1.2凝胶及色谱柱：Q Sepharose HP，XK50/20，柱高13.5cm。用0.2M NaOH平衡色谱柱5CV，并浸泡6h以上。
1.3样品处理：样品与MQ水1:1稀释，并用1M Tris溶液，调pH值8.0，终体积约为15L。
2纯化流程
2.1AKTA系统平衡：以洗脱液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0)平衡系统5CV，冲洗系统中的NaOH，流速50ml/min；再以上样缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)平衡系统5CV；连接色谱柱，继续以上样缓冲液冲洗色谱柱5CV。
2.2上样：上样体积15L，上样流速50ml/min，温度4℃，设定色谱柱报警压0.5Mpa，设置空气感应报警，收集流穿液。
2.3平衡：上样结束后，继续以上样缓冲液平衡色谱柱，50ml/min，平衡5CV。
2.4洗脱：选用洗脱液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0)梯度洗脱：
I.5％洗脱液洗脱15CV，流速50ml/min，洗脱15CV，UV280>100mAU时，收集洗脱峰；
II.22％洗脱液洗脱10CV，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰(含目的蛋白)；
III.100％洗脱液洗脱5CV，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰。
2.5MQ水冲洗：用MQ水冲洗系统及色谱柱5CV，50ml/min。
3色谱柱再生：
先用6M盐酸胍冲洗色谱柱2CV去除杂蛋白，立即以超纯水冲洗5CV，再以0.3M柠檬酸冲洗5CV以去除色素等杂质。
4色谱柱保存：若色谱柱近期内使用，可与MQ水冲洗玩之后直接拆下于4℃冷库存放；若长久不用则以0.2M NaOH平衡5CV，然后换用0.05M NaOH平衡色谱柱5CV，以便长期保存。
其中，柱压控制：柱前压＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜6.5ms/cm
第二步纯化(中度纯化工艺)
1准备：
1.1仪器设备：AKTA Pilot，0.2M NaOH冲洗系统，并浸泡6h以上。
1.2凝胶填料及色谱柱：Phenyl Sepharose 6 FF High sub，XK26/40，柱高29cm。0.2M NaOH平衡5CV，并浸泡6h以上。
1.3样品处理：Q柱洗脱的目的主分与40mM PB,2M(NH4)2SO4,pH 7.21:1稀释。
2纯化流程
2.1系统平衡：以洗脱液(20mM PB，pH7.2)平衡系统5CV，冲洗系统中的NaOH，流速20ml/min；再以上样缓冲液(20mM PB，1M(NH4)2SO4，pH7.2)平衡系统5CV；连接色谱柱，继续以上样缓冲液冲洗色谱柱5CV。
2.2上样：上样流速20ml/min，室温，设置空气感应报警，收集流穿液。
2.3平衡：上样结束后，继续以上样缓冲液平衡色谱柱5CV，流速30ml/min。
2.4洗脱：用洗脱液(20mM PB，pH7.2)梯度洗脱
I.55％洗脱液洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰(含目的蛋白)；
II.100％洗脱液洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰；
III.MQ水洗脱5CV，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰。
3色谱柱在位清洗：
用30％的异丙醇洗4CV，立即用纯化水冲洗5CV；接着用70％乙醇冲洗5CV；再用纯化水冲洗5CV，用20％乙醇冲洗5CV；
4色谱柱保存：若色谱柱近期内使用，可与MQ水冲洗玩之后直接拆下于4℃冷库存放；若长久不用则以0.2M NaOH平衡约5CV，然后换用20％酒精平衡5CV，以便长期保存。
其中，柱前压控制：柱前压＜0.5MPa
第三步纯化(深度纯化工艺)
1准备：
1.1仪器设备：AKTA Pure 25，0.2M NaOH冲洗系统，并浸泡6h以上。
1.2凝胶及色谱柱：SP Sepharose HP，XK26/20，柱高10cm。0.2M NaOH平衡色谱柱，并浸泡6h以上。
1.3样品处理：超滤，置换缓冲液：20mM PB，pH6.0；
仪器Millipore Minipillcon孔径10kd，耐压0.2MPa
2纯化流程
2.1AKTA系统平衡：以洗脱液(20mM PB，1M NaCl，pH6.0)平衡系统5CV，冲洗系统中的NaOH，流速15ml/min；再以上样缓冲液(20mM PB，pH6.0)平衡系统5CV；连接色谱柱，继续以上样缓冲液冲洗色谱柱5CV。
2.2上样：上样流速10ml/min，室温，设定色谱柱报警压0.3Mpa，设置空气感应报警。
2.3平衡：以上样缓冲液平衡色谱柱5CV，流速15ml/min。
2.4洗脱：以洗脱液进行梯度洗脱
I.20％洗脱液洗脱10CV，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集洗脱峰，
II.100％洗脱液洗脱5CV，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集洗脱峰(含目的蛋白)，
2.5MQ水冲洗：用MQ水冲洗系统及色谱柱5CV，15ml/min。
3色谱柱在位清洗：
用纯化水冲洗5CV；然后用1M NaOH冲洗5CV，立即用纯化水冲洗5CV；接着用20％乙醇冲洗5CV；
4色谱柱保存：若色谱柱近期内使用，可直接拆下于4℃冷库存放；若长久不用则以0.2M NaOH在线清洗约5CV，然后换用0.05M NaOH平衡色谱柱，以便长期保存。
5结果分析
其中，柱前压控制：＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜7.0ms/cm
第四步Superdex200纯化(精细纯化工艺)
1.准备：
1.1AKTA系统：0.2M NaOH冲洗AKTA系统管道，并浸泡6h以上。
1.2凝胶及色谱柱：Superdex200，1.2L，44/100，柱高80cm。0.2M NaOH冲洗系统，并浸泡6h以上。
2纯化流程
2.1系统平衡：以PBS pH7.2平衡系统5CV，冲洗系统中的NaOH，流速15ml/min；连接色谱柱，继续冲洗色谱柱5CV。
2.2上样：上样体积30ml，流速15ml/min，室温，设置空气感应报警。
2.3PBS平衡：15ml/min，UV 280>100mAU时，收集峰组分。
2.4纯化水冲洗：用纯化水冲洗系统及色谱柱5CV，15ml/min。
3色谱柱在位清洗：
用纯化水冲洗5CV；然后用0.5M NaOH洗5CV，立即用纯化水冲洗5CV；接着用20％乙醇冲洗5CV；
4色谱柱保存：若色谱柱近期内使用，可直接拆下于4℃冷库存放；若长久不用则以0.2M NaOH在线清洗约5CV，然后换用0.05M NaOH平衡色谱柱，以便长期保存。
5结果分析
取最终的蛋白样品进行SEC-HPLC检测纯度达到99.5％，生物学活性分析接近WHO rhIL-12的生物学活性。
其中，Superdex200填充柱柱效：＞10000
Superdex200填充柱对称性：0.7-1.3
柱前压控制：＜0.5MPa。
实施例中各步骤分离蛋白的图谱参见图1～图7。
Claims (10)
1.一种重组人白细胞介素-12的纯化方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采用深层过滤系统将含有重组人白细胞介素-12的细胞培养液澄清过滤；
(2)进行Q Sepharose HP纯化；
(3)进行Phenyl Sepharose 6FF High sub纯化；
(4)进行SP Sepharose HP纯化；
(5)进行Superdex200纯化。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述深层过滤系统为深层过滤器D0HC和深层过滤器A1HC的组合，其中使所述细胞培养液先后通过D0HC和A1HC。
3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述Q Sepharose HP纯化包括用洗脱液进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 7.5-8.2，优选8.0。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱梯度包括：
I. 5％～7％洗脱液，优选5％洗脱液洗脱15个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰；
II. 22％～24％洗脱液，优选22％洗脱液洗脱10个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰；
III. 100％洗脱液洗脱5个柱体积，流速50ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰，
优选的是，所述Q Sepharose HP纯化的条件还包括：
柱压控制：柱前压＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜6.5ms/cm。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述Phenyl Sepharose 6 FF Highsub纯化包括用洗脱液和MQ水进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM PB，pH7.2。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括：
I. 55％～60％洗脱液，优选55％洗脱液洗脱5个柱体积，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰；
II. 100％洗脱液洗脱5个柱体积，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰；
III. MQ水洗脱5个柱体积，流速20ml/min，UV280>50mAU时，收集洗脱峰，优选的是，所述Phenyl Sepharose 6FF High sub纯化的条件还包括：
柱前压控制：柱前压＜0.5MPa
上样样品硫酸铵浓度控制：0.95-1.1M。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述SP Sepharose HP纯化包括用洗脱液进行梯度洗脱，所述洗脱液为20mM PB，1M NaCl，pH 5.8-6.2，优选pH 6.0。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括：
I. 20％～22％洗脱液，优选20％洗脱液洗脱10个柱体积，流速15ml/min，UV280>100mAU时，收集洗脱峰，
II. 100％洗脱液洗脱5个柱体积，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集洗脱峰，
优选的是所述SP Sepharose HP纯化的条件还包括：
柱前压控制：＜0.5MPa
上样样品电导控制：电导＜7.0ms/cm。
9.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述Superdex200纯化包括用pH7.2的PBS洗脱，流速15ml/min，UV 280>100mAU时，收集峰组分。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述Superdex200纯化的条件还包括
Superdex200填充柱柱效：＞10000
Superdex200填充柱对称性：0.7-1.3
柱前压控制：＜0.5MPa。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106565844A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-04-19 | 深圳万乐药业有限公司 | 深层过滤单克隆抗体细胞培养液的方法 |
| CN111239278A (zh) * | 2020-02-05 | 2020-06-05 | 康立泰药业有限公司 | 一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法及应用 |
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| US5853714A (en) * | 1995-03-27 | 1998-12-29 | Genetics Institute, Inc. | Method for purification of IL-12 |
| CN1616489A (zh) * | 2004-09-30 | 2005-05-18 | 中国科学技术大学 | 纯化重组人白细胞介素12的方法 |
| CN101033254A (zh) * | 2007-02-09 | 2007-09-12 | 广州市恺泰生物科技有限公司 | 一种纯化重组人白细胞介素12的方法 |
-
2016
- 2016-05-24 CN CN201610348825.1A patent/CN105924514A/zh active Pending
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| CN111239278A (zh) * | 2020-02-05 | 2020-06-05 | 康立泰药业有限公司 | 一种检测重组人白介素-12蛋白电荷变异体的方法及应用 |
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Address after: Room 6, building No. 368, Qingdao blue biomedical industry park, No. 266061 Hedong Road, high tech Zone, Shandong, Qingdao, China Applicant after: KANGLITAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Address before: 266001 Shandong Province, Qingdao city Zhongshan Road No. 8 Building 16 layer development Applicant before: QINGDAO KANGLITAI PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
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