CN101139388A - 抗肿瘤药物TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法 - Google Patents

抗肿瘤药物TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法 Download PDF

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魏东芝
马兴元
张海毅
李明华
郑文云
赵莉
刘清海
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Abstract

本发明提供了一种重组抗肿瘤蛋白新药TAT(m)－Survivin(T34A)的纯化复性方法，所述方法包括以下步骤：包涵体制备与洗涤，包涵体变性，蛋白复性，蛋白纯化，其特征在于，蛋白复性采用阴离子交换层析复性，蛋白纯化采用亲和层析纯化。采用本发明提供的分离纯化方法纯化TAT(m)－Survivin(T34A)，其复性及纯化工艺简便，纯化获得的产品纯度高，可提高产品得率，降低生产成本，因而易于产业化生产。

Description

抗肿瘤药物TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种抗肿瘤药物TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法。
背景技术
在申请号为200510026847.8的中国发明专利申请中，发明人构建了融合蛋白TAT(m)-Survivin(T34A)，并提供了该融合蛋白的发酵和纯化方法。该蛋白经大肠杆菌表达纯化后，能够有效导入靶细胞，进而杀伤靶细胞，对B-CAP-37和Hela细胞的生长具有显著抑制活性。因此，该重组蛋白药物，比基因治疗手段安全，直接，快速，易于产业化生产，具有进一步研发的价值和良好的产业化前景。
在200510026847.8号专利申请中，TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性采用的是SPSepharose离子交换层析和Superdex75分子排阻层析的方法，但是，在生产工艺从摇瓶到生物反应器的中试放大后发现，原纯化方法经第一步SP Sepharose离子交换层析后，蛋白纯度可达到84％，但经中试放大后，第一步SP Sepharose离子交换层析后蛋白纯度仅为48-52％，因此原纯化复性方法明显不再适用。
分析可能的原因，一方面，从摇瓶到发酵罐的放大过程中，目标蛋白表达量明显降低，而其他杂蛋白则随之增多，在形成包涵体的过程中，很多杂蛋白会和目的蛋白形成紧密颗粒，增加了包涵体洗涤的难度，因此采用同样的纯化方法可能得不到高纯度的目的蛋白；另一方面，在高密度发酵过程中，诱导前细胞状态的不同影响了包涵体的结构，采用同样的复性方法得到的包涵体复性收率可能也会有所差异。
因此，有必要对原有的复性纯化方法进行优化，以使复性及纯化工艺简便，纯化获得高纯度产品，并提高产品得率，降低生产成本，以适应TAT(m)-Survivin(T34A)的中试规模生产。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新的针对抗肿瘤药物TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法，以适应中试规模的TAT(m)-Survivin(T34A)的生产。
本发明的提供的纯化复性方法包括以下步骤：包涵体制备与洗涤，包涵体变性，蛋白复性，蛋白纯化，其中，蛋白复性采用阴离子交换层析复性，蛋白纯化采用亲和层析纯化。
根据本发明的一个优选的实施例，阴离子交换层析为DEAE层析柱层析。
根据本发明的一个更优选的实施例，亲和层析为肝素亲和层析柱层析。
根据本发明的一个更优选的实施例，在蛋白复性与蛋白纯化步骤之间还包括透析除盐步骤。
采用本发明提供的分离纯化方法纯化TAT(m)-Survivin(T34A)，其复性及纯化工艺简便，纯化获得的产品纯度高，可提高产品得率，降低生产成本，因而易于产业化生产。
附图说明
图1是实施例4的DEAE层析色谱图。
图2是实施例4的肝素亲和层析色谱图。
图3是蛋白电泳图谱，其中，图3A为实施例2发酵放大得到的蛋白在SP柱纯化后的电泳图谱；图3B为实施例4发酵放大得到的蛋白的电泳图谱，其中，泳道1为肝素亲和层析后蛋白电泳图谱，泳道2为实施例4的DEAE层析后蛋白电泳图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明的实施例中使用的溶液如下：
1、包涵体洗涤缓冲液配方如下：0.5-4M尿素，0.1-1M氯化钠，50-500mM巯基乙醇，0.1-1％Triton X-100。
2、DEAE层析柱洗涤尿素溶液配方如下：5-8M尿素，0.1-0.8M L-Arg，10-75％的甘油。
3、透析缓冲液配方如下：20mM Tris-HCl，pH7-9。
4、肝素亲和层析柱清洗缓冲液配方如下：20mM Tris-HCl，pH7-9。
本发明的实施例中使用的检测方法，如蛋白含量的检测方法和蛋白纯度检测方法参考申请号为200510026847.8中国发明专利申请，包涵体纯度检测方法如下：
将变性后的包涵体溶液，加2倍加样缓冲液，经煮沸、离心后，进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶4％，分离胶15％，考马斯亮蓝R250染色，利用Smartview(Bio-Rad)软件分析包涵体的纯度。
本发明的实施例中，所述包涵体纯度，为包涵体中目的蛋白含量。
实施例1、TAT(m)-Survivin(T34A)制备
按照申请号为200510026847.8中国专利申请中实施例1-4的方法，制备表达TAT(m)-Survivin(T34A)的工程菌，并在30L发酵罐中相应放大发酵，以制备含有TAT(m)-Survivin(T34A)的菌体，并检测目的蛋白纯度，结果如表4所示。
实施例2、TAT(m)-Survivin(T34A)分离纯化(对照实施例)
取实施例1中发酵获得的菌体3g，按照申请号为200510026847.8中国专利申请中实施例5的方法分离纯化，制备获得纯化后的TAT(m)-Survivin(T34A)，并检测包涵体纯度，蛋白含量，目的蛋白纯度，结果如表4所示，电泳结果如图3a所示。
实施例3-6：TAT(m)-Survivin(T34A)分离纯化
采用优化的TAT(m)-Survivin(T34A)分离纯化方法，纯化TAT(m)-Survivin(T34A)。
具体过程如下所示：
1、包涵体制备与洗涤
取实施例1中发酵获得的菌体g，在pH6-10的磷酸盐缓冲液中进行高压匀浆处理，得到粗包涵体，然后于pH6-10的包涵体洗涤缓冲液中洗涤3-6次，得到精制包涵体，并检测包涵体纯度，结果如表4所示。包涵体制备与洗涤的具体操作参数如表1所示。
表1、包涵体制备与洗涤
  实施例   磷酸盐缓冲液pH值   包涵体洗涤缓冲液pH值   包涵体洗涤缓冲液洗涤次数
  3   6   6   3
  4   10   10   4
5 7 7 5
  6   8   8   6
2、变性及复性
2.1包涵体变性
将步骤1中制备的精制包涵体，溶解在pH7-10的变性液(5-8M的尿素溶液)中，获得包涵体变性液，具体参数如表2所示。
2.2蛋白复性
在自动层析系统上，将步骤2.1中获得的包涵体变性液，以0.3-1.5ml/min的流速进样到DEAE层析柱上，上样量为1-10mg/ml柱体积，然后在0.3-1.5ml/min的流速下，用尿素溶液梯度冲洗DEAE层析柱(初始浓度为5-8M，终浓度为0M)，清洗10-70个柱体积，最后用氯化钠溶液进行梯度洗脱(初始浓度为1M，终浓度为0M)，收集洗脱峰，具体操作参数如表2所示。
表2、包涵体变性与复性
实施例 变性液中尿素浓度(M) pH 进样流速(ml/min) 上样量(mg/ml柱体积)   洗涤液中尿素浓度(M) 清洗体积(柱体积)
  3   5   7   0.5   2.5   5   70
  4   6   10   1   10   6   50
  5   7   8   0.3   1   7   10
  6   8   9   1.5   5   8   30
2.3、蛋白纯化
将步骤2.2中获得的复性蛋白溶液，在pH7-9的透析缓冲液中进行透析除盐(20-50倍体积，1-3次，每次5-10h)后，以0.5-5ml/min的流速进样到肝素亲和层析柱上，上样量为3-10mg/ml柱体积，以pH7-9的清洗缓冲液清洗，清洗体积为5-15个柱体积，最后用氯化钠溶液进行梯度洗脱(初始浓度为0.5M，终浓度为0M)，收集洗脱液，具体操作参数如表3所示。
表3、蛋白纯化
实施例 透析缓冲液pH   进样流速(ml/min)   上样量(mg/ml柱体积)   清洗体积(柱体积)
  3   8.5   1   3   5
  4   7   0.5   5   8
  5   9   5   8   15
  6   7.5   3   10   10
分别检测洗脱液中蛋白含量和目的蛋白纯度，检测结果如表4所示。
选取实施例4，将其DEAE层析色谱图、肝素亲和层析色谱图、肝素亲和层析后蛋白电泳图谱和DEAE层析后蛋白电泳图谱，分别于图1-3中展示。
表4、总蛋白含量和目的蛋白纯度检测结果
  包涵体纯度(％)   目的蛋白纯度(％)   总蛋白含量(mg)
  发酵液   32   ——
  实施例2纯化产品   36   51   31.7
  实施例3纯化产品   75   94   13.5
  实施例4纯化产品   72   96   12.9
  实施例5纯化产品   82   92   12.6
  实施例6纯化产品   76   93   11.8
通过实施例2与实施例3-6的结果比较，可见本发明具有以下优势：(1)得到的精制包涵体纯度较高，便利了后续的纯化过程；(2)DEAE柱上梯度复性工艺简单，复性条件温和，一步去除了大部分杂蛋白，达到了复性和纯化的集成作用；(3)利用肝素亲和层析柱特异性吸附效果得到高纯度的重组抗肿瘤药物。
综上所述，采用本发明提供的分离纯化工艺纯化TAT(m)-Survivin(T34A)，其复性及纯化工艺简便，纯化获得的产品纯度高，还可提高产品得率，降低生产成本，因而易于产业化生产。

Claims (13)

1.一种重组抗肿瘤蛋白新药TAT(m)-Survivin(T34A)的纯化复性方法，包括以下步骤：包涵体制备与洗涤，包涵体变性，蛋白复性，蛋白纯化，其特征在于，蛋白复性采用阴离子交换层析复性，蛋白纯化采用亲和层析纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包涵体制备采用pH6-10的缓冲液进行高压匀浆。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包涵体洗涤采用pH6-10的包涵体洗涤液洗涤，所述包涵体洗涤液为0.5-4 M尿素，0.1-1 M氯化钠，50-500 mM巯基乙醇，0.1-1％Triton X-100。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包涵体变性使用pH为7-10的5-8 M的尿素溶液变性。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析为DEAE层析柱层析。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DEAE层析柱以0.3-1.5ml/min的流速将变性液上样，上样量为1-10mg/ml柱体积，然后以尿素溶液进行梯度洗涤，洗脱梯度为起始浓度5-8M，终浓度0M，最后采用氯化钠进行梯度洗脱，梯度洗脱为起始浓度1M，终浓度0M，收集洗脱峰。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述尿素溶液洗涤10-70个柱体积。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析为肝素亲和层析柱层析。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肝素亲和层析柱0.5-5ml/min的流速将复性蛋白溶液上样，上样量为3-10mg/ml柱体积，然后以20mM Tris-HCl，pH7-9的清洗缓冲液清洗5-15个柱体积，再以氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度为初始浓度0.5M，终浓度0M，收集洗脱液。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，在蛋白复性与蛋白纯化步骤之间还包括透析除盐步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述透析除盐使用20-50倍透析液透析1-3次，每次5-10h。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述透析缓冲液20 mM Tris-HCl，pH 7-9。
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