CN103014101B - 一种干扰素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种干扰素的纯化方法,该方法包括以下步骤:a、选用工程菌做菌株进行发酵培养;b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤,得到精制包涵体;c、对精制包涵体进行复性,获得复性产物;d、对复性产物进行阴离子柱层析处理,得到阴离子柱层析产物;e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析,得到阳离子柱层析产物;f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物,再经过脱盐处理,得到干扰素。
Description
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种干扰素的纯化方法。本发明在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较,可以大幅度的提高干扰素的纯度、比活、稳定性。
背景技术:
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂,主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制乙肝病毒的复制;同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力,从而起到免疫调节作用,并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白),是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长,以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
干扰素根据抗原特异性和分钟结构的不同,分为α、β、γ等型别,而在一特定的干扰素型别内,再根据氨基酸序列或组成方面的差异,划分出不同的亚型,比如:HuIFN(人干扰素)α1、α2等。而在一特定的干扰素亚型内,根据个别氨基酸的变异,以a、b、c在亚型后面进行标记,比如:HuIFNα-1a, α-2a, α-2b等。
HuIFNα已经可以通过基因重组生物工程技术进行量产。但其纯化工艺经过多年研究始终难以解决其纯度问题,比活下降明显,如现有技术“重组人干扰素_2b的提取和纯化” 微生物学免疫学进展 2004 年第32 卷第 1 期采用离子交换层析柱DEAE sepharose(FF)A柱,柱形XK30/50,以及sephacryl100/50XK层析柱,S-100填料,经过两次层析得到,经过测定,其比活1.2×108IU/mg,蛋白纯度为95%。重组人a2b型干扰素的纯化与鉴定《生物工程学报》1994年 第1期 5 页 61-65页采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人a2b型干扰素进行了纯化,然后利用凝胶过滤高压液相层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和N端25个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定。表明一步纯化的重组人a2b达到95%,其比活性为2.54×108IU/mg。
本发明经过对不同纯化工艺的研究,筛选出一种纯化方法,本发明采用的技术方案是在纯化工艺中采用了阴离子柱层析,阳离子柱层析,反相填料柱层析三步分离纯化步骤。包括步骤:a、选用工程菌做菌株进行发酵培养;b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤,得到精制包涵体;c、对精制包涵体进行复性,获得复性产物;d、对复性产物进行阴离子柱层析处理,得到阴离子柱层析产物;e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析,得到阳离子柱层析产物;f、对阳离子柱层析产物进行精细分离,采用反相填料柱层析处理,得到重组人干扰素。
同现有技术相比较,采用本专利的反相填料精细分离,rhIFN电泳纯度由90%提高到98%,HPLC纯度由90%提高到98%,其比活由0.9×107IU/mg提高到3.5×108IU/mg。-30℃条件下稳定性由原有的3个月提高到12个月。可见,采用本发明的重组人干扰素的纯化工艺,可以大幅度的提高rhIFN的纯度、比活、稳定性。
发明内容:
本发明提供一种干扰素的纯化方法,该方法包括以下步骤:
a、选用工程菌做菌株进行发酵培养;
b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤,得到精制包涵体;
c、对精制包涵体进行复性,获得复性产物;
d、对复性产物进行阴离子柱层析处理,得到阴离子柱层析产物;
e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析,得到阳离子柱层析产物;
f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物,再经过脱盐处理,得到干扰素。
其中,所述干扰素选自:干扰素α-1a, 干扰素α-2a, 干扰素α-2b,优选的是干扰素α-2b。
其中步骤a-c属于现有技术,可以根据现有技术中的方法获得。
本发明所述的步骤d-f属于纯化步骤,属于本发明的技术方案,其中,优选的技术方案如下:
阴离子柱层析(XK50/30层析柱,Q sepharose FF填料)
使用平衡液(20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。
洗脱:使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰。
阳离子柱层析(XK50/30层析柱,CM Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积。
上样:上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始上样。上样结束后,换至平衡液中,平衡2-4个柱床体积,至记录笔回至基线。用预脱液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰,收集A280大于0.3的洗脱峰。
反相填料层析
采用C18高效液相色谱柱(WTARES PREPLC4000,WTARES C18柱,25mm*100mm*3),流动相A为6%乙腈,0.1%TFA(三氟乙酸),流动相B为30%乙腈,0.1%TFA(三氟乙酸),进行线性梯度洗脱,收集目标峰,采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA,即为纯化的rhIFN,取样检测。
经取样检测,经反相填料层析分离纯化的样品其电泳纯度与HPLC纯度均大于98%,经测定其比活可达到3.5×108IU/mg 。该样品在-30℃条件下放置12个月,该样品电泳纯度和活性均无显著性变化。稳定性可以保证12个月。其他质量控制项目均符合药典要求。采用本发明的的生产工艺,可以大幅度的提高rhIFN的纯度、比活、稳定性。
本发明的工艺方法是经过筛选获得的,筛选过程如下:
层析方式的选择:针对现有技术设计了5种层析方式,用这5种方式对复性溶液进行纯化,然后进行测定,实验结果如下:
经过检测发现,方式5效果最好。
具体实施方式:
以下对本发明予以进一步详尽说明。
实施例1
阴离子柱层析(XK50/30层析柱,Q sepharose FF填料)
使用平衡液(20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。
洗脱:使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰。
疏水柱层析(INdEX层析柱,Phenyl Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.8mol/L硫酸铵),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡2-4倍柱床体积,至流出液PH值为4.5-5.0结束。
样品预处理:在上步洗脱液中加入硫酸铵,调节硫酸铵终浓度为0.8mol/L,静置半小时以上,即为样品液。
上样:以30.0-49.9ml/min流速上样。上样结束后,用平衡缓冲液平衡1-2倍柱床体积。
洗脱:使用洗脱液(80mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.05M NaCl),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始洗脱,收集A280大于0.3洗脱峰。取样检测。
实施例2
阳离子柱层析(XK50/30层析柱,CM Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用冰醋酸调其PH值为4.5,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始上样。上样结束后,换至平衡液中,平衡2-4个柱床体积,至记录笔回至基线。用预脱液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰,收集A280大于0.3的洗脱峰。
疏水柱层析(INdEX层析柱,Phenyl Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.8mol/L硫酸铵),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡2-4倍柱床体积,至流出液PH值为4.5-5.0结束。
样品预处理:在上步洗脱液中加入硫酸铵,调节硫酸铵终浓度为0.8mol/L,静置半小时以上,即为样品液。
上样:以30.0-49.9ml/min流速上样。上样结束后,用平衡缓冲液平衡1-2倍柱床体积。
洗脱:使用洗脱液(80mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.05M NaCl),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始洗脱,收集A280大于0.3洗脱峰。取样检测。
实施例3
阴离子柱层析(XK50/30层析柱,Q sepharose FF填料)
使用平衡液(20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。
洗脱:使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰。
阳离子柱层析(XK50/30层析柱,CM Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积。
上样:上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始上样。上样结束后,换至平衡液中,平衡2-4个柱床体积,至记录笔回至基线。用预脱液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰,收集A280大于0.3的洗脱峰。
疏水柱层析(INdEX层析柱,Phenyl Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.8mol/L硫酸铵),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡2-4倍柱床体积,至流出液PH值为4.5-5.0结束。
样品预处理:在上步洗脱液中加入硫酸铵,调节硫酸铵终浓度为0.8mol/L,静置半小时以上,即为样品液。
上样:以30.0-49.9ml/min流速上样。上样结束后,用平衡缓冲液平衡1-2倍柱床体积。
洗脱:使用洗脱液(80mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.05M NaCl),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始洗脱,收集A280大于0.3洗脱峰。取样检测。
实施例4
阴离子柱层析(XK50/30层析柱,Q sepharose FF填料)
使用平衡液(20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。
洗脱:使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰。
反相填料层析
采用半制备型MKF-RP--M-255020250x5020102-13柱。配制洗脱液A为含50mmolNaCl和20mmol Tris-HCl 缓冲液(pH 8),洗脱液B为含50mmolNaCl溶液20mmol Tris-HCl 60%乙腈(pH 8)。先用洗脱液A洗脱,再用梯度洗脱15%-90%洗脱液B洗脱,10-55分钟收集样品峰。被收集的样品经低温蒸发,除去有机物质,然后透析浓缩,取样检测。
实施例5
阴离子柱层析(XK50/30层析柱,Q sepharose FF填料)
使用平衡液(20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液。
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。
洗脱:使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰。
阳离子柱层析(XK50/30层析柱,CM Sepharose FF填料)
平衡:使用平衡液(20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液),调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积。
上样:上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始上样。上样结束后,换至平衡液中,平衡2-4个柱床体积,至记录笔回至基线。用预脱液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液)进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰,收集A280大于0.3的洗脱峰。
反相填料层析
采用C18高效液相色谱柱(WTARES PREPLC4000,WTARES C18柱,25mm*100mm*3),流动相A为6%乙腈,0.1%TFA(三氟乙酸),流动相B为30%乙腈,0.1%TFA(三氟乙酸),进行线性梯度洗脱,收集目标峰,采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA,即为纯化的rhIFN,取样检测。
经取样检测,其电泳纯度与HPLC纯度均大于98%以上,经测定其比活可达到3.0×108IU/mg 。该样品在-30℃条件下放置12个月,该样品电泳纯度和比活均无显著性变化,其稳定性可以保证12个月。其他质量控制项目均符合药典要求。
Claims (1)
1.一种干扰素的纯化方法,该方法包括以下步骤:
a、选用工程菌做菌株进行发酵培养;
b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤,得到精制包涵体;
c、对精制包涵体进行复性,获得复性产物;
d、对复性产物进行阴离子柱层析处理,得到阴离子柱层析产物;
e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析,得到阳离子柱层析产物;
f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物,再经过脱盐处理,得到干扰素,
其中,所述干扰素为干扰素α-2b;
其中,所述对复性产物进行阴离子柱层析处理方法如下:
阴离子柱层析,XK50/30层析柱,Qsepharose FF填料
以20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液作为平衡液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积,
样品预处理:将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2,然后用注射用水将其体积稀释四倍,即为上样液,
上样:上样时泵流速为8.0-49.9ml/min,上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积,
洗脱:以20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液作为预洗液进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,洗脱2-4个柱床体积,然后将进液管换至洗脱液中,开始目标峰洗脱,收集OD280大于0.3洗脱峰;
其中,所述对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析,方法如下:
其中,所述洗脱液为20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL;
阳离子柱层析,XK50/30层析柱,CMSepharose FF填料
平衡:以20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液作为平衡液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,平衡8-10倍柱床体积,
上样:上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,开始上样,上样结束后,换至平衡液中,平衡2-4个柱床体积,至记录笔回至基线,用预脱液进行预洗,调节泵流速为30.0-49.9ml/min,至杂质峰洗下为止,换至洗脱液进行洗脱目的峰,收集A280大于0.3的洗脱峰;
其中,预脱液为20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液;
其中,洗脱液为50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液;
其中,所述采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物,方法如下:
反相填料层析
采用C18高效液相色谱柱,型号WTARES PREPLC4000,WTARES C18柱,25mm*100mm*3,流动相A为6%乙腈,0.1%三氟乙酸,流动相B为30%乙腈,0.1%三氟乙酸,进行线性梯度洗脱,收集目标峰,采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和三氟乙酸,即为纯化的rhIFN。
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