CN1807646A - 重组人血清白蛋白－干扰素α2b 融合蛋白的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从表达重组人血清白蛋白－干扰素α2b融合蛋白的毕赤酵母发酵液中纯化rHSA－IFN α2b的生产方法，该方法将整合有人血清白蛋白－干扰素α2b融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌高密度发酵表达，随后将含有rHSA－IFN α2b的发酵液通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，大规模制备得到高纯度的药用重组人血清白蛋白－干扰素α2b融合蛋白蛋白。本发明操作简单、方便、省时、有利于大规模的工业生产。

Description

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物，具体说是从含有重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)基因的毕赤酵母高表达工程菌的发酵液中大规模纯化rHSA-IFNα2b的方法。

背景技术

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)是由α-干扰素(Interferon-alpha)和人血清蛋白(Albumin)利用基因融合技术融合而成的长效干扰素。与普通干扰素相比，rHSA-IFNα2b在人体内的平均半衰期要长30多倍，因而可减少干扰素治疗时注射次数，减轻病人治疗的痛苦。

干扰素(Interferon，IFN)是一类分泌性蛋白，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。目前干扰素已经被FDA批准应用于病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等多种疾病。由于干扰素半衰期短(在体内大约2-4小时)而治疗时间长(6-12月)，因而需要多次给药，(大约为1-2天一次)。

人血清白蛋白是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。研究表明将干扰素基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。与人血清白蛋白融合表达的干扰素，即rHSA-IFNα2b有比普通干扰素更长的半衰期(70-140小时)，从而可以大大减少干扰素治疗的给药次数(Blaire L.Osbor等，the journal ofpharmacology and experimental therapeutics，vol 303：540-548)。但是，如何大规模制备符合药用要求的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白一直未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种适合于工业生产的简便、快速、高收率地从含有rHSA-IFNα2b的毕赤酵母发酵液中纯化rHSA-IFNα2b的方法，大规模制备得到高纯度的药用rHSA-IFNα2b蛋白，从而满足临床要求。为了达到上述目的本发明采取下列措施：一种重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：

(1)整合有人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌发酵表达。

(2)随后将含有人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的发酵液通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到药用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白。

通过基因重组技术构建表达rHSA-IFNα2b毕赤酵母工程菌，按Invitrogen公司Pichia Fermentation Process Guidelines方法进行发酵生产，发酵结束后通过离心除去菌体，收集发酵上清，经亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，得到高纯度的药用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白。

本发明的有益效果是，

1)采用Blue亲和层析的方法可直接纯化发酵液，减少了发酵液的预处理的过程；

2)采用亲和层析的方法，可使一步纯化所得的rHSA-IFNα2b的纯度可达到85％以上；

3)采用亲和层析的方法，可去除大部分的内毒素和杂质为后续的纯化工作带来方便；

4)纯化的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业生产；

5)通过疏水层析的方法，使过亲和层析所得的rHSA-IFNα2b得以精纯化，经反相高效液相层析(HPLC-RP)检测，其纯度大于95％，生物学活性达到1.0×10⁶U/mg以上；

6)离子交换柱用于需要获得更高纯度的样品时。离子交换柱后的样品可以到97％以上的纯度；

7)通过凝胶层析可以改变疏水目标峰的缓冲体系，使所得目标峰可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失。

附图说明

图1是本发明的Blue-Sepharose亲和层析图；

图2是本发明的SOURCE PHE疏水层析图；

图3是本发明的SOURCE Q离子交换层析图；

图4是本发明的Sephadex G25 Coarse脱盐层析图；

具体实施方式

本发明设计了颜料亲和层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合来去除杂蛋白、内毒素、糖类等杂质，最终得到高纯度蛋白。

柱层析纯化首先采用Blue颜料亲和层析。因为表达上清的成分较杂，使用Blue亲和层析收集表达上清中的rHSA-IFNα2b具有较高的特异性，可以去除大部分的色素、热原质、核酸片段等非蛋白类杂质和杂蛋白。同时，亲和层析允许一定浓度的盐的存在，对发酵上清超滤浓缩后的盐浓度要求不高，非常适合发酵液的第一步柱层析收集。

Blue亲和层析可选用10-150mM Tris-HCl或磷酸缓冲液，pH的范围6.0-8.0，也可以在缓冲液中加入300mM以下的NaCl以增加吸附的特异性。洗脱缓冲液可以使用1.5M以上的NaCl或其他高盐溶液，也可以使用各种浓度的有机溶剂。

疏水柱选用各种PHE，ISO，ETH，butyl-，phenyl-或octyl基团的疏水填料，可选用20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液，pH范围在4.0-10.0，加入0.5-1.6mol/L(NH₄)₂SO₄或0.5-1.6mol/L Na₂SO₄的缓冲液为流动相A，以不含(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄的缓冲液为流动相B。将Blue柱目标峰用pH5.0-10.0，20-50mMTris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液稀释数倍，或在Blue目标峰中直接加入高浓度的(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄溶液至浓度为0.5-1.6mol/L(NH₄)₂SO₄或0.5-1.6mol/LNa₂SO₄，上样于疏水柱，然后以流动相A冲洗柱子，再以流动相B梯度进一步洗脱，收集目标峰。通过疏水层析可进一步去除可能存在的寡聚体、降解蛋白、色素等杂质，使目标峰中rHSA-IFNα2b的纯度可达到95％以上，这一步纯化的回收率在60％左右。

疏水层析后的样品可经Q或DEAE等阴离子交换柱进一步纯化。通过与疏水层析不同的分离机理，离子交换层析可使目标蛋白得到进一步的纯化。可以选用pH在6.0-9.0之间的20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液下过Q或DEAE柱。疏水层析后过离子交换柱这一步是可选的，因为疏水之后的样品通常可以达到95％以上的纯度，为了获得更高的纯度，可以选择使用离子交换层析。经过离子交换层析的样品通常可以达到97％以上的纯度。离子交换柱的收率在70％以上。

经疏水层析或离子交换层析后收集的目标峰，可直接上样于Sephacryl、Superdex或Sephadex等凝胶层析柱，进行脱盐。凝胶层析用先以5-10mM的磷酸缓冲液为流动相平衡，经此凝胶层析得到的目标蛋白rHSA-IFNα2b，此流动相将前述疏水层析或离子交换层析条件下的体系改换为5-10mM磷酸盐可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失，这步脱盐的回收率在95％以上。

整个纯化过程中，发酵离心后的样品可以直接使用Blue亲和柱收集，收集的目标蛋白加硫酸铵即可上疏水柱，疏水柱的洗脱电导较低，而且样品得到高度浓缩，因此几倍稀释后即能满足离子交换的要求，经离子交换的样品浓度高而体积小，刚好适合于脱盐层析。因此整个纯化组合相对比较合理。不需要其他的处理步骤，易于工业放大。纯化的总回收率在25％左右，产品最终纯度在97％以上。

以下实例将进一步说明本发明，但不仅限于这些实例。

实例1

一、表达rHSA-IFNα2b毕赤酵母工程菌的构建

1.HSA基因的克隆

按Genebank中HSA基因的编码序列合成引物

HSA1：5’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’，

HSA2：5’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’，

用于扩增包括信号肽在内的HSA全长编码序列，并在5’端加入了NspV酶切位点，并使其起始密码子前的序列与pHIL-D2载体AOX1启动子的Kozak序列一致。在3’端，去除了终止密码子，并在不改变氨基酸的条件下将最后一个氨基酸的密码子由TTA改为CTT，以在该处形成一个StuI的酶切位点。3’端还加入了编码GlyGlyGlyGlySer的接头序列及一个BamHI的酶切位点。PCR条件为：100μl反应体系中，加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的HSAl和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP10ul，10X反应缓冲液10μl，TaqplusI DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。

PCR产物用1％琼脂糖电泳纯化，用DNA片段回收试剂盒回收纯化约1.8kb的目标带。取纯化的HSA cDNA 6μl，加入1μl pGEM-T载化，8μl 2X缓冲液，1μl T4DNA连接酶，15℃反应过夜，转化JM109感受态细胞。转化菌辅于含X-gal、IPTG和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基，37℃培养过夜，用常规方法抽提质粒，用NSPV/BamHI酶切，电泳分析鉴定阳性克隆。

2 hIFNα2b cDNA的克隆

静脉抽取正常成年人血液5mL，肝素钠抗凝。将血液用1640培养基对倍稀释后，加入淋巴细胞分层液，2000r/min离心20min，吸取白细胞环，用含10％小牛血清的1640培养基洗细胞3次，将细胞数调整为1×10⁶/mL，加入终浓度60μg/mL的PHA和20U/ml rhIFNα2b，37℃，5％CO₂培养箱活化5h，收集细胞。用总RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)从细胞中提取总RNA用于反转录反应，并按照RT-PCR试剂盒(QIAGEN公司)的方法进行反转录反应，获得的反转录产物用作为PCR反应的模板。PCR所用的引物IFN1和IFN2用寡聚核苷酸合成仪合成。

IFN1：5’ATGGATCCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG 3’

IFN2：5’ATGAATTC TTA GGG CTG GGC AAG GTG GCG3’

用于扩增hIFN成熟肽编码基因，并在其5’-端和3’端分别加入了BamHI位点和EcoR I位点。并在3’-端EcoR I位点前加入了终止密码子。

PCR方法为：

100ul反应体系中加入1μl反转录产物，20μmol/L的IFN1、IFN2引物各3ul，2mmol/L的dNTP10μl，10X反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1.0分钟，循环35次。通过凝胶电泳分析，发现反应物显出一预期大小(0.5kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC19质粒上，形成pUC-IFNα2b。BamHI/EcoRI酶切鉴定，测序。取序列正确的克隆用于构建融合蛋白表达载体。

3 pD2-HSA/IFN载体构建

为了将HSA与IFN以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，我们选择pHIL-D2质粒(简称pD2，Invitrogen公司)作为载体。在该载体AOX启动子下游位点间插入HSA/IFN基因，因pD2载体上有两个NspV位点，为了方便操作，首先pD2载体用ClaI/Scal酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。pD3载体用NspV/EcoRI切，回收线性化载体，构建的pUC19-IFN用BamHI/EcoRI切，回收约0.5kb的含IFN cDNA的片段，构建的pGEMT-HSA用NspV/BamHI切，回收约1.8kb的含HSAcDNA的片段，将线性化pD3载体与含HSAcDNA，IFN cDNA的片段用T4连接酶催化连接，转化JM109，挑选阳性克隆，分别用NspV/EcoRI和NspV/BamHI酶切鉴定，获得阳性克隆JM109(pD3HSAGCSF)。pD3HSAGCSF质粒，用ClaI/ScaI切，电泳回收线性化的约6.3kb片段，pD2空载体用ClaI/ScaI切回收约4.2kb的片段。T4连接酶催化连接pD3HSAIFN的6.3kb片段与pD2的4.2kb片段，连接产物转化JM109后，辅于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，获得克隆JM109(pD2HAS-IFN)。经测序分析，NspV/EcoRI两个酶切位点间的序列应与序列表中序列一致。

4质粒转化

抽提pD2-HSA/IFN约10μg，用NotI酶切。线性化后用转化毕赤酵母GS115，铺于含山梨醇的RDB琼脂平皿，30℃培养4-7天。

5表达HSA/IFN的工程酵母的筛选

挑取His+克隆。接种至装有25mlBMGY培养基的300ml三角瓶，250转/分钟30℃培养48小时，加甲醇0.5％/24h，诱导培养4天，离心取上清，SDS-PAGE分析，筛选高表达菌株。

6诱导表达 取重组体单菌落接种于BMGY培养基中，30℃震荡培养过夜，A₆₀₀约为5.0。离心收集菌体，以BMMY培养基重悬菌体至A₆₀₀为2.0后诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为2％，72h后离心收集上清。

二、表达rHSA-IFNα2b毕赤酵母工程菌的发酵

筛选所得高表达菌株接种于YPD液体培养基摇瓶，30℃300rpm振荡培养至O.D.₆₀₀约20左右，进罐培养，接种量为1％-5％。发酵过程分二阶段，生长阶段以甘油为碳源，基础盐培养基，温度30℃，pH5.0，通气搅拌保证溶氧不低于40％饱和度，经过约18-24小时培养，当溶氧明显上升时表明培养基中的甘油耗尽，此时菌浓度O.D.₆₀₀约70左右，开始甘油补料，补料速度18ml/L/hr，补料4小时，此时菌浓度O.D.₆₀₀约140左右。结束补料，开始诱导表达。诱导表达阶段每隔24hr向发酵液中添加一次酵母粉和蛋白胨(分别为发酵初始体积的1％和2％，w/v，已灭菌)，控制甲醇补料速度使培养基中甲醇浓度为0.5-1％，诱导48-72小时放罐。离心收集发酵液上清。发酵上清液中rHSA-IFNα2b表达量经SDS-PAGE分析应不低于10mg/L。

三、rHSA-IFNα2b的亲和柱纯化

在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入1L的Blue-Sepharose填料，以PBS为流动相A，2M NaCl为流动相B。用流动相A平衡Blue亲和柱后，以200ml/min流速将离心后的发酵液上清含有34克rHSA-IFNα2b的发酵上清直接上BLUE-Sepharose柱，上完样后先以流动相A平衡柱子，将所有未结合在柱上的组分冲干净；再用100％的流动相B脱目标峰1(见图1)，目标峰1内rHSA-IFNα2b的蛋白总量为21.8克，因而过此柱的回收率为64.2％。

四、rHSA-IFNα2b的疏水柱纯化

在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入2L的SOURCE PHE疏水胶，流动相A为20mM pH 7.0加0.7mol/L(NH₄)₂SO₄，流动相B为20mM pH 7.0的PB缓冲液。先将亲和目标峰A用流动相A稀释3倍，然后再直接加入4mol/L的(NH₄)₂SO₄溶液至(NH₄)₂SO₄浓度为0.7mol/L左右，接着以100ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的SOURCE PHE疏水柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积(将未结合于柱上的杂质冲洗干净)，再用85％的流动相B洗脱，收集目标峰2(见图2)，经RP-HPLC分析此时所得目标峰2的纯度为95.2％，rHSA-IFNα2b蛋白总量为13.1克，此步纯化的回收率为60.4％。

五、rHSA-IFNα2b的离子交换柱纯化

在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入1L的SOURCE Q填料，流动相A为20mMPH 7.0，流动相B为20mM PH 7.0的PB缓冲液加1M NaCl。先将疏水目标峰2用流动相A稀释5倍，接着以100ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的SOURCE Q柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积，再用15％梯度洗脱可能的杂质，最后以25％的流动相B洗脱，收集目标峰3(见图3)。经过此步层析，rHSA-IFNα2b蛋白总量为9.2克，纯化的回收率为70.2％。

六、rHSA-IFNα2b的凝胶柱脱盐

在安玛西亚的XK 50/100L柱中装入2L的Sephadex G25 Coarse胶，离子交换目标峰3过Sephadex G25 Coarse柱脱盐，以5mM的磷酸缓冲液为平衡液，洗脱收集目标峰4，即为高纯度的rHSA-IFNα2b，可直接用于制剂的制备，不用再进行透析等处理(见图4)。经RP-HPLC分析，纯度大于95％。rHSA-IFNα2b蛋白总量为8.9g，因此过凝胶柱纯化的回收率为96.7％。测定rHSA-IFNα2b的体外活性(《中国生物制品规程》干扰素效价测定：细胞病变抑制法)，比活性为3.0×10⁶U/mg。

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)基因序列表

<110>杭州九源基因工程有限公司

<120>重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2343

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

accatgaagt gggtaacctt tatttccctt ctttttctct ttagctcggc ttattccagg     60

ggtgtgtttc gtcgagatgc acacaagagt gaggttgctc atcggtttaa agatttggga    120

gaagaaaatt tcaaagcctt ggtgttgatt gcctttgctc agtatcttca gcagtgtcca    180

tttgaagatc atgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaac atgtgttgct    240

gatgagtcag ctgaaaattg tgacaaatca cttcataccc tttttggaga caaattatgc    300

acagttgcaa ctcttcgtga aacctatggt gaaatggctg actgctgtgc aaaacaagaa    360

cctgagagaa atgaatgctt cttgcaacac aaagatgaca acccaaacct cccccgattg    420

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gtagctcgcc tgagccagag atttcccaaa gctgagtttg cagaagtttc caagttagtg    780

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aaggaatgct gtgaaaaacc tctgttggaa aaatcccact gcattgccga agtggaaaat    960

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cttttctcct gcttgaagga cagacatgac tttggatttc cccaggagga gtttggcaac   1980

cagttccaaa aggctgaaac catccctgtc ctccatgaga tgatccagca gatcttcaat   2040

ctcttcagca caaaggactc atctgctgct tgggatgaga ccctcctaga caaattctac   2100

actgaactct accagcagct gaatgacctg gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg   2160

acagagactc ccctgatgaa ggaggactcc attctggctg tgaggaaata cttccaaaga   2220

atcactctct atctgaaaga gaagaaatac agcccttgtg cctgggaggt tgtcagagca   2280

gaaatcatga gatctttttc tttgtcaaca aacttgcaag aaagtttaag aagtaaggaa   2340

taa                                                                 2343

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将整合有人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌发酵表达。

(2)随后将含有人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的发酵液通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到药用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白。

2、根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的的生产方法，其特征在于，按照该方法制备所得的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白纯度大于95％。

3、根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述亲和层析柱填料为以Cibacron Blue为结合基团的各种颜料亲和层析介质。

4、根据权利要求3所述的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述亲和层析柱填料为Blue-Sepharose 6 Fast Flow、Bluesepharose CL-6B、Affi-Gel Blue Gel或Blue-Sepharose 6 Fast Flow。

5、根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述疏水柱填料是以Butyl-、Phenyl-、Octyl-为结合基团的Sepharose、Macro-Prep、Poros填料或SOURCE PHE、ISO、ETH疏水填料。

6、根据权利要求5所述的重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生产方法，其特征在于，所提及疏水柱填料为SOURCE PHE。

7、根据权利要求1所述的方法，其等征在于所提及离子交换柱填料是以阴离子Q、DEAE结合基团的各种层析填料。

8、根据权利要求7所述的方法，其等征在于所提及离子交换柱填料是SOURCE Q。

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