CN102140487A - 制备重组人白细胞介素11的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方法包括：1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为：硫氧还蛋白-(His)₆-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)₆-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11；2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产物包含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11；和3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白和所述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得rhIL-11。利用本发明的方法可快速、简便、高效地纯化rhIL-11，从而大大提高回收率。

Description

制备重组人白细胞介素11的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种制备重组人白细胞介素11的方法。

背景技术

白细胞介素11(Interleukin-11，IL-11)首先由Harvard MedicalSchool的D.A.Willianms等人于1986年发现。IL-11是一种多功能的细胞因子，其最基本的功能在于造血调控作用。它能刺激人的造血红细胞和巨核细胞前体的分化并诱导巨核细胞的生成和成熟，最终导致血小板数量的增加。此外，它还具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性(Du X.X.，Williams D.A.，Blood，1997，89(11)：第3897-3908)。1990年Paul S.R.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：7512-7516)克隆到该细胞因子的cDNA，结果证明其cDNA序列与其它的细胞因子不同，命名为白细胞介素11。研究发现白细胞介素11可以明显促进骨髓内造血细胞增殖，因而具有促血小扳生成的作用。

白细胞介素-11由骨髓基质细胞产生，其分子量为23-24kDa，等电点(pI)为11.7，前体是含199个氨基酸的多肽，其中N端21个氨基酸是信号肽。成熟的IL-11含有178个氨基酸残基，没有二硫键和糖基化位点。IL-11主要作用于B细胞、巨核细胞和浆细胞瘤细胞，对于放/化疗患者、血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血、骨髓移植等造血功能障碍的治疗具有显著疗效，故IL-11具有广阔的应用前景。

由于IL-11的性能相当特殊，其基因编码区N端富含脯氨酸，不利于产物的正确折叠，等电点极高，因此IL-11较难实现在大肠杆菌中的非融合表达，常规的表达和复性都很困难。目前通常都是采用融合表达方法。硫氧还蛋白(Thioredoxin，下文有时简称为“Trx”)是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白，该蛋白也是目前常用的表达宿主(例如酵母菌或大肠杆菌)的内源蛋白。

国内对重组人白细胞介素11的研制起步于九十年代中期。军事医学科学院基础医学研究所苗继红等人(中国科学(B辑)，1995，25(6)：616-622)研究N末端缺失8个氨基酸的IL-11的表达活性。苏州医学院陈永珍等人(《中国免疫学杂志》，1997，13(3)：165-166，169)报道了IL-11的活性测定的改良方法。与此同时，国内一些科研单位和制药企业也展开了IL-11的研究工作。由于IL-11的cDNA结构的特殊性，IL-11不能在大肠杆菌中直接表达。又由于IL-11成熟蛋白前8个氨基酸中含有6个脯氨酸，内部脯氨酸含量也很高，对其在大肠杆菌中的表达及后处理可能影响很大。为了获得IL-11的有效表达，一种方法是对IL-11的N端氨基酸做缺失突变或增加氨基酸以避开G-C富含区，但这样可能影响IL-11的生物学活性及改变其免疫原性。另一方法是用融合蛋白的方法表达完整的IL-11的cDNA，然后再用专一切割剂将前导肽与IL-11切割开。目前美国Genetics Institute使用的是肠激酶，国内许多单位也采用这一切割剂。

张颖等(《生物工程学报》，2000，16(3)：353-356)报道了中国人IL-11的cDNA的克隆与序列测定，并与国外报道序列(Palu et al，PNAS，1990，87：7512)进行了比较。结果表明，中国人胚胎来源的IL-11的cDNA与文献报道序列高度同源，仅3个核苷酸有变化，氨基酸序列没有变化。将IL-11的cDNA插入到硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS中，在大肠杆菌菌株G1724中进行表达。pTRXFUS含有PL启动子，IL-11的cDNA插入到其trxA基因的3′端。合成的融合蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式存在，并可正确折叠，表现出全部生物学活性。

黄岩山等(《生物工程学报》，2001，17(3)：250-253)报道了人白细胞介素11在毕赤酵母中的表达与纯化的研究，作者依次采用SPSepharose FF、Phenyl Sepharose、Sephadex G25三种方法纯化，得到rhIL-11的纯度达98％。

但是至今还没有人只利用镍离子螯合亲和层析与CM阳离子层析两种层析方法简便地从Trx-rhIL-11融合蛋白来制备rhIL-11。

发明内容

本发明的目的是要提供一种制备重组人白细胞介素11的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方法包括：

1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为：

硫氧还蛋白-(His)₆-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)₆-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11；

2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产物包含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11；和

3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白和所述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得重组人白细胞介素11。

优选地，在所述步骤3)中使用洗脱液A、B和C进行所述梯度洗脱，其中所述洗脱液A为20～100mM Tris，pH7.0～8.5；所述洗脱液B为20～100mM Tris-HCl，0.1～1.0M NaCl，pH7.0～8.5；所述洗脱液C为20～100mM Tris-HCl，10～50mM咪唑，0.1～1.0M NaCl，pH7.0～8.5。

更优选地，所述洗脱液A为50mM Tris，pH8.0；所述洗脱液B为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0；所述洗脱液C为50mMTris-HCl，30mM咪唑，0.5M NaCl，pH8.0。

目前常规的纯化方法是使硫氧还蛋白吸附在层析柱上，同时将重组人白细胞介素11和其他杂质洗脱下来，然后进行进一步的纯化。与现有技术相比，本发明的方法将硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11共同吸附在层析柱上，首先使杂质洗脱，然后利用两者与层析柱的不同的结合性而将重组人白细胞介素11洗脱下来，从而方便快捷地达到纯化重组人白细胞介素11的目的。

在本发明中，所述重组人白细胞介素11优选具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。

另外，在所述步骤1)和2)之间还使用镍离子螯合亲和柱层析法利用洗脱液D、E和F对所述融合蛋白进行纯化，其中所述洗脱液D为50mM Tris，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0；所述洗脱液E为50mM Tris，pH8.0；所述洗脱液F为100mM Tris，100mM咪唑(其pH优选为8.0)。

为了在后续步骤中将IL-11从融合蛋白上释放下来，优选在编码IL-11的DNA序列的5’端引入编码蛋白水解酶识别位点核苷酸序列。所述蛋白水解酶可以为凝血酶、Kex2-600、脯氨酸内肽酶、肠激酶。肠激酶(EK酶)是优选的，因为该酶能够在识别位点的C末端水解融合蛋白。因此，更优选在编码肠激酶识别位点的核苷酸序列的后面直接跟着IL-11的编码序列，这样肠激酶可以将最终所需的IL-11完整、准确地释放出来。如果采用人工合成编码IL-11的DNA序列，为了便于克隆，在人工合成所述DNA序列时，还需要在该序列的5’端和3’端引入适当的限制性酶切位点。为了便于日后的纯化，可在融合蛋白的适当位置上插入便于纯化的序列，例如优选在所用Trx的N端或C端插入His-Tag。市售的载体pET32a(+)中不但具有Trx的基因，而且在该基因的下游还具有His-Tag和肠激酶切割识别位点。

优选地，所述酶切步骤包括：

a)配制反应液，其含有1mg/mL融合蛋白；20mM Tris-HCl，pH8.0；1体积％Tween 20；和

b)按1U肠激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入肠激酶，在18℃、44rpm下反应15h至18h。

在所述步骤3)后还优选使用阳离子交换柱层析法对所述重组人白细胞介素11进行纯化，其中所述阳离子交换介质为快流速CM琼脂糖凝胶，洗脱液为洗脱液G和H，所述洗脱液G为20mM NaCl，10mM PB，pH7.0；所述洗脱液H为300mM NaCl，10mM PB，pH7.0。

在本文中，术语“PB”(Phosphate Buffer)为磷酸盐缓冲液，其根据需要调节至合适的pH。本领域技术人员可以理解，“PB”前面的浓度是指磷酸盐的浓度，例如10mM PB是指磷酸盐在缓冲液中的浓度为10mM。

在本发明中，所述融合蛋白是将表达载体在宿主菌中表达而获得的，所述表达载体含有编码硫氧还蛋白-(His)₆-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)₆-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11的核苷酸序列。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

为了获得本发明的融合蛋白，优选先构建能够表达该融合蛋白的表达载体。该表达载体可以通过将编码IL-11的DNA序列插入到受启动子控制下的Trx基因的下游而构建完成。如背景技术部分所述，Trx是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白，该蛋白也是目前常用的IL-11表达宿主例如酵母或大肠杆菌的内源蛋白。该蛋白可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，Trx能与许多蛋白发生相互作用，增强融合蛋白的溶解性，从而减少了包涵体的形成(Thomas，J.G.等，Appl Biochem Biotechnol.66(3)：197-238)。在本发明中可以使用完整的Trx，也可以使用Trx的一部分或其突变体，所选取的部分或突变体具有与Trx相同或相似的空间结构和功能。

本发明的表达载体可以是酵母菌的表达载体，也可以是大肠杆菌的表达载体。所述的IL-11可以是完全人工合成的新DNA序列，也可以为已经公开的编码IL-11的DNA序列。为了将编码IL-11的DNA序列插入Trx基因的下游，优选使用已经含有所述Trx基因或其部分序列的克隆载体。这种载体也可通过购买得到。例如，pET32a(+)就是这样一种载体。pET32a(+)可以高效表达的Trx-Tag的多肽，外源基因插入其多克隆位点后，产生的融合蛋白含有可剪切的Trx-Tag和S-Tag序列，便于检测和纯化。

为了大量制备IL-11，需要将构建的重组表达载体转化适当宿主的感受态细胞，例如酵母细胞或大肠杆菌细胞，并在适当的培养基中进行发酵，以收获融合蛋白。在本发明的一个具体实施例中采用的宿主细胞是可市售得到的E.coli BL21(DE3)。该细胞的胞内和胞间周质蛋白酶均已失活，这样当进行外源蛋白的可溶性表达时，不容易被宿主菌的蛋白酶水解，因而可稳定存在。

为了在发酵期间进行有效的控制，通常建议可诱导型的表达载体。pET系列载体就是这样一类大肠杆菌表达载体。该载体是利用T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统构建的E.coli表达载体，即在E.coliBL21(DE3)或JM109(DE3)的染色体上整合了T7RNA聚合酶基因，而且受lac操纵子调控。所以，当用IPTG诱导时，导致T7RNA聚合酶的合成，从而诱导了pET载体上的目的基因的表达。T7噬菌体RNA/启动子具有很强的启动活性，而且在载体多克隆位点序列上游有强核蛋白体结合序列(rbs)，所以pET载体可以高效地表达外源蛋白。

所述的发酵培养基根据宿主的不同而异。在选用大肠杆菌为宿主、以pET系列载体为表达载体的情况下，发酵培养基可以为LB、TB、M9CA等，优选为TB培养基。发酵温度为30-40℃，优选为37℃；pH6.8-7.2，优选为pH7.0；溶氧DO≥30％，诱导用的IPTG终浓度为0.3-3.0mM，优选为1.0mM；诱导时间为3-5h，优选为3.5-4h。在上述适宜的条件下，可使发酵液浓度达到60g细菌湿重/L发酵液以上，目的融合蛋白表达量在30％以上。

临床前药效学试验、毒理学试验研究表明：本发明制备的rhIL-11皮下注射对血小板计数具有明显的升高作用，但对全红细胞计数、血红蛋白含量及红细胞压积、对白细胞计数未见明显影响。其安全剂量为50μg/kg/天。因此，本发明制备的rhIL-11用于人体治疗是安全有效的。

本发明将rhIL-11与亲水性的Trx一段序列融合，该融合蛋白在胞内以可溶形式表达，避免了工艺复杂且收率较低的包涵体复性步骤。融合蛋白含His-Tag，从而可以通过镍离子螯合亲和层析法快速、简便、高效地纯化，大大提高了回收率。Trx与rhIL-11间存在肠激酶切割位点，保证纯化的融合蛋白经肠激酶切割后可以释放完整的rhIL-11。采用肠激酶将表达出的融合蛋白酶解，并利用一系列的柱层析法将目的蛋白rhIL-11纯化出来，纯度可达到99％以上。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-IL-11的鉴定图谱。各泳道分别代表：M为DNA分子量标准(GeneRuler 1kb DNA Ladder Plus，fermentas)；1为以含合成DNA片段的pUC18为模板的PCR扩增产物；2为重组子pET-IL-11的PCR扩增产物；3为pET32a-Kpn I/EcoR I双酶切产物；4为重组子pET-IL-11的Kpn I/EcoR I双酶切产物；5为重组子pET-IL-11质粒；6为pET32a质粒。

图2为工程菌发酵表达的SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质分子量标准；1为诱导前的工程菌；2为工程菌诱导表达后的发酵菌。

图3为rhIL-11各步纯化样品的SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质分子量标准；1为经镍离子螯合亲和层析得到的融合蛋白；2为融合蛋白经EK酶作用后的酶切产物；3为酶切产物经镍离子螯合亲和层析后的目的蛋白；4为阳离子交换柱CM层析后得到的rhIL-11。

图4为rhIL-11的RP-HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1

表达rhIL-11的DNA序列的设计

本发明表达的人白细胞介素11的氨基酸序列与天然人白细胞介素11相比，缺失了N端的第一个氨基酸(即脯氨酸)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码该rhIL-11的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

根据SEQ ID NO：2中所列的IL-11编码序列，在3’端引入终止密码TAA，并在5’端引入肠激酶酶切识别位点的DNA编码序列GACGACGACGACAAG。将这样的DNA序列命名为序列3(见SEQID NO：3)，采用全基因合成的方式委托上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成该序列。为便于以后的亚克隆，将合成基因克隆到pUC18(Fermentas Life Science公司)上，用于该合成的DNA序列保存和进一步克隆。

重组质粒的构建

如无特别说明，以下分子克隆技术操作方法均参照下列文献进行：《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002)。DNA操作中所用的DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。DNA连接试剂盒购自NEB公司。DNA Marker、克隆载体pUC18、限制性内切酶、PCR相关试剂等购自Fermentas Life Science公司。表达载体pET32a(+)、大肠杆菌TOP10及BL21(DE3)均为Novagen公司产品，并且购自默克化工技术(上海)有限公司。克隆用大肠杆菌宿主为TOP10(基因型：F-，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，

80，lacZΔM15，ΔlacX74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG)，表达用大肠杆菌宿主为BL21(DE3)(基因型为：hsdS gal(λcIts857 ind1Sam7 nin5 lacUV5-T7 geneI)。BL21(DE3)带有T7RNA多聚酶基因，在IPTG的诱导下T7RNA多聚酶大量产生，因而开启了外源基因的表达，可使外源基因高效表达。LB培养基配方为：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl；LB琼脂糖平板配方为：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，2％琼脂糖。其中蛋白胨和酵母粉购自英国Oxid公司。

1.准备目的基因片段

合成rhIL-11基因的PCR扩增引物。为了便于进一步克隆，在上游引物P1中引入Kpn I酶切位点GGTACC，在下游引物P2中引入EcoR I酶切位点GAATTC。引物序列如下：

上游引物P1：5’ctgggtaccgacgacgacgacaaggggcc 3’

下游引物P2：5’tccgaattcttacagccgagtcttcagca 3’

以含有rhIL-11编码序列的pUC18质粒DNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，在1％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用凝胶DNA回收试剂盒回收该片段。用Kpn I/EcoR I双酶切该回收片段，纯化备用。

2.准备表达载体片段

用DNA抽提试剂盒提取pET32a(+)质粒DNA，用Kpn I/EcoRI双酶切，1％的琼脂糖凝胶电泳分离大片段，切下含有大片段的凝胶，用凝胶DNA回收试剂盒回收大片段，电泳验证后备用。

3.构建重组质粒pET-IL-11

将1、2准备好的DNA片段用T4DNA连接酶在16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有100μg/mlAmp的LB琼脂糖平板，37℃培养过夜。

4.重组子筛选

在转化菌平板上挑取阳性菌落，在5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中37℃培养过夜，用DNA抽提试剂盒提取质粒DNA。分别用Kpn I、EcoR I对所提取的DNA酶切，然后进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子，阳性重组质粒命名为pET-IL-11。进一步以P1、P2为引物，对pET-IL-11进行PCR验证。阳性重组质粒的鉴定结果见图1。

5.质粒pET-IL-11的序列测定：

将质粒pET-IL-11进行测序验证，测序结果证明构建的阳性重组质粒pET-IL-11中的rhIL-11 DNA序列及其插入位置与理论设计完全一致。

工程菌的诱导表达

用重组质粒pET-IL-11 DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到用于表达rhIL-11融合蛋白的基因工程菌。挑取菌落，在5ml含100μg/mlAmp的LB培养基中37℃培养过夜，以1％的体积转接于50ml含100μg/ml Amp的LB培养基中37℃培养，剩余菌液用15％甘油分装冻存。当培养至OD₆₀₀达到0.5时，加入IPTG到终浓度0.5mM进行诱导表达，4小时后取样进行SDS-PAGE电泳。与未诱导的对照相比，诱导后的重组子均有预期分子量36kDa左右的表达带。取阳性菌株以进一步进行表达实验，表达及传代稳定后，选此菌株作为工程菌，命名为BL21(DE3)-IL-11，置甘油中保存。工程菌中融合蛋白的表达量占全菌蛋白的30％以上。

工程菌BL21(DE3)-IL-11的发酵

取表达Trx-rhIL-11融合蛋白的工程菌BL21(DE3)-IL-11的甘油菌种(1mL/支)，接种到500mL的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下培养15hr。按7.5％的接种量将此种子液接入已灭菌的15L TB液体培养基中(30L B.Braun发酵罐)进行发酵，其中温度为37℃、pH7.0、DO₂≥30％。补料根据溶氧及pH变化进行反馈控制，营养物质缺乏时，溶氧上升，pH也上升，此时进行补料。培养至OD₆₀₀＝12时开始诱导表达，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导4h。在此条件下，最终菌体密度为31.7g细菌湿重/L发酵液，目的融合蛋白表达量32％(见图2)。

表1TB培养基配方

                                          

原料名称                          浓度

                                          

蛋白胨(蛋白胨)                    12g/L

酵母粉(酵母粉)                    24g/L

甘油                              8mL/L

磷酸氢二钾·3H₂O                  16.43g/L

磷酸二氢钾                        2.31g/L

磷酸氢二铵                        1g/L

TMS(见表2)                        3mL/L

                                           

表2TMS成份

                                                  

原料名称                          浓度

                                                  

三氯化铁·6H₂O                    0.162g/L

氯化锌·6H₂O                      0.0144g/L

氯化钴·6H₂O                      0.12g/L

钼酸钠·2H₂O                      0.012g/L

氯化钙·2H₂O                      0.006g/L

硫酸铜·5H₂O                      1.9g/L

硼酸                              0.5g/L

盐酸                              37mL/L

                                                  

表3补料培养基配方

                                                  

原料名称                          浓度

                                                  

葡萄糖                            200g/L

MgSO4·7H₂O                       11.4g/L

胰蛋白胨                          100g/L

酵母粉                            100g./L

                                                  

rhIL-11的纯化

采用连续流离心机(CEPA Z41，B.Braun公司，德国)收集上述制备的发酵菌体，用洗脱液D(50mM Tris，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0)悬浮，然后用APV-1000高压匀浆机(APV Co.丹麦)破菌，将胞内分泌的融合蛋白溶于洗脱液D中，在9000rpm下离心30min。取上清液依次采用以下方法对rhIL-11进行纯化：

1.镍离子螯合亲和层析

将高压匀浆破菌的上清液上于用洗脱液D平衡的镍离子螯合亲和层析(Chelating Sepharose Fast Flow，GE Healthcare)柱，先用洗脱液D洗涤后，再用洗脱液E(50mM Tris，pH8.0)充分洗涤，最后用洗脱液F(100mM Tris，100mM咪唑)洗脱融合蛋白，收集洗脱峰。在该纯化中，在破菌液和平衡洗脱液D中加入30mM咪唑，可以降低非特异性吸附，用不含盐的洗脱液E洗涤，可以除去大量色素等杂质。

2.融合蛋白的酶切

以洗脱液E为稀释洗脱液，超滤上述洗脱样，以除去咪唑，因为高浓度的咪唑会影响肠激酶的切割效率。配制酶切反应液，其组成如下：1mg/mL融合蛋白，20mM Tris-HCl(pH8.0)，1体积％Tween 20，肠激酶(按1U肠激酶切割7mg融合蛋白的比例加入肠激酶)。在18℃、44rpm转速下轻轻振摇15h～18h。

3.镍离子螯合亲和层析

将酶切后蛋白溶液过滤后上样于用洗脱液A(50mM Tris，pH8.0)平衡的镍离子螯合亲和层析柱。在实验中发现融合蛋白酶切后，其产物Trx及IL-11均能与镍离子螯合亲和层析柱结合，但二者与镍离子螯合亲和层析柱的结合力不一样。因此利用此性质，分步洗脱，可以很好地纯化rhIL-11。先用洗脱液A充分洗涤，再用洗脱液B(50mMTris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0)洗涤非特异性吸附蛋白，最后用洗脱液C(50mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.5M NaCl，pH8.0)洗脱，收集洗脱液C洗脱液，可得到纯度为95％以上的rhIL-11样品。可任选地，吸附在柱上的Trx等杂质可用含有1M咪唑的洗脱液洗脱。

根据常规的实验方法，酶切产物再一次上镍离子螯合亲和层析柱时，通常采用以下的步骤：将酶切后蛋白溶液过滤后上样于用洗脱液C(50mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.5M NaCl，pH8.0)平衡的镍离子螯合亲和层析柱。上样完毕，用洗脱液C充分洗涤，EK酶切割下来的rhIL-11在穿透液中，而EK酶切产生的带有His-tag的Trx以及未发生切割的融合蛋白则结合在层析柱上。本发明在采用此方法进行纯化时，得到rhIL-11样品纯度低于90％，因此纯化效果不理想。

4.阳离子交换柱层析

将洗脱液C洗脱的样品对预冷的洗脱液(10mM PB，pH7.0)充分透析后，上于经洗脱液(10mM PB，pH7.0)平衡的CM Sepharose FastFlow(GE Healthcare)层析柱。洗脱液(10mM PB，pH7.0)充分洗涤后，用洗脱液G(20mM NaCl，10mM PB，pH7.0)洗涤少量杂蛋白，再用洗脱液H(300mM NaCl，10mM PB，pH7.0)洗脱，得到纯度99％左右的rhIL-11。

用SDS-PAGE电泳分析各步纯化效果(见图3)。

实施例2rhIL-11冻干粉针

取上述制备的rhIL-11，按照下列配方制备冻干粉针。

表4冻干粉针配方

                                                

成分                          含量

                                                

rhIL-11                       1.00g

NaCl                          5.85g

Na₂HPO₄·12H₂O                2.187g

NaH₂PO₄·2H₂O                 0.608g

甘氨酸                        30g

加注射用水至                  1000ml

                                                 

将pH值调节为7.0，无菌过滤后分装成3ml/支西林瓶。然后冻干，制成冻干粉针剂，4℃保存。

实施例3rhIL-11的检定

1、SDS-PAGE纯度分析

采用SDS-PAGE系统(郭尧君，《蛋白质电泳实验技术》，科学出版社，1999)进行非还原型电泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描测定，rhIL-11纯度为98.90％(见图3中第5道)。

2、RP-HPLC纯度分析

层析柱为Delta-Pak C18 5μm 3.9×150(Waters Co.)，从洗脱液(在95体积％dH₂O和5体积％乙腈中的0.1体积％三氟乙酸(TFA))变化到洗脱液(在95体积％乙腈和5体积％dH₂O中的0.1体积％TFA)来进行线性梯度洗脱40min，流速1ml/min，在220nm处进行紫外检测。

分析结果表明，上述方法制备的rhIL-11的纯度为99.28％。RP-HPLC分析结果见图4和表5。

表5

序号	保留时间(分)	峰面积	峰面积％	峰高度
					1	1.100	10580	0.24	1288
2	18.283	8598	0.19	696
					3	18.888	4398938	99.28	149754
4	20.578	12571	0.28	1214

3、N末端氨基酸序列分析

用自动氨基酸序列分析仪测定上述制备的rhIL-11，肽链N末端15个氨基酸顺序，与天然的人IL-11第2-16位氨基酸序列一致，N末端15个氨基酸序列依次为：G-P-P-P-G-P-P-R-V-S-P-D-P-R-A，N末端氨基酸序列分析结果与理论序列完全相同，说明本发明制备的rhIL-11一级结构是正确的。

实施例4IL-11活性测定

采用细胞增殖法测定本发明制备的重组人白细胞介素-11活性，具体方法如下：

1)收集细胞

培养B9-11细胞株(购自苏州医学院，本公司保存)，取细胞一瓶，离心，收集细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640(Invitrogen公司)培养基洗细胞2～3次，加新鲜培养基重悬细胞，调整浓度至1.0～1.5×10⁵个/ml。

2)样品稀释

取96孔板，边缘孔每孔加入100μl培养基，保留B2～G2孔，其余孔每孔加入150μl培养基，将预先稀释至20IU/ml标准品(重组人白细胞介素-11国际活性参考品，购自NIBSC(即英国国家生物制品检定所))和0.2ng/ml的样品150μl分别加入到B2～G2孔，每个样本做双复孔，然后从2排依次取50μl作4×梯度稀释，共计10个浓度梯度，最后各稀释孔丢弃50μl，使所有孔样本都为100μl。

3)接种细胞

将重悬的细胞每孔接种100μl到稀释好的96孔培养板中，置细胞培养箱中培养72小时。

4)MTT处理

每孔加入5mg/ml的MTT(SIGMA公司)溶液20μl，在细胞培养箱中培养4.5小时。

5)酸化异丙醇溶解细胞

吸取培养上清150μl，每孔加入150μl酸化异丙醇混匀溶解细胞，检测OD_570/655值。

6)结果计算

以稀释倍数为横轴，以对应的OD_570/655为纵轴进行四参数回归运算，求出各自的半效剂量稀释倍数，并以下面公式计算活性。

结果表明其比活性不低于1.0×10⁷IU/mg，本发明制备的rhIL-11与WHO国际活性参考品具有相同的生物活性。

实施例5药效学试验

1.rhIL-11对正常动物全血细胞的作用

rhIL-11对3种正常动物全血细胞的结果表明，正常SD大鼠(购自中山大学实验动物中心)皮下注射rhIL-11给药14天，100μg/kg/天组对血小板计数具有明显的升高作用，但对全血红细胞计数、血红蛋白含量及红细胞压积，对白细胞计数未见明显影响，与国外对照品药效相当。正常Beagle犬(购自上海实验动物资源中心)皮下注射给药7天，rhIL-11使红细胞计数明显减少、血红蛋白含量减低，不影响红细胞压积；各组对血小板计数具明显升高作用。正常猕猴(上海实验动物资源中心)皮下注射给药7天，rhIL-11减少红细胞计数，对血小板计数具有明显的升高作用。

2.rhIL-11对小鼠电离辐射模型的作用

用Co⁶⁰-γ射线(剂量为5.0Gy，剂量率450伦/分)照射C57小鼠(中山大学实验动物中心)，造成血小板降低模型(血小板总数下降81.3％)。rhIL-11以三种剂量(10、150及300μg/kg/d)对模型小鼠进行治疗。实验结果表明，rhIL-11对小鼠辐射模型有明显的升血小板作用，用药7天后，各治疗组血小板计数均上升到正常范围，以300μg/kg/d效果最好。可明显提高小鼠辐射模型的血小板极低值，使脾脏系数和内源性CFU-S升高，并增加骨髓中和脾脏内的巨核细胞数量。

3.rhIL-11对大鼠环磷酰胺模型的作用

SD大鼠腹腔注射环磷酰胺，造成血小板减少模型(血小板总数下降55.3％)。rhIL-11以三种剂量(10、150及300μg/kg/d)对模型大鼠进行治疗。实验结果表明，rhIL-11对大鼠环磷酰胺模型有明显的升血小板作用，以300μg/kg/d效果最好，可明显提高大鼠化疗模型的血小板极低值，增加骨髓腔内的巨核细胞、早幼红、原红细胞和脾脏巨核细胞数量。同时有一定的升白细胞作用。用药后脾脏系数增大，出凝血时间缩短。

4.rhIL-11对猕猴环磷酰胺模型的作用

猕猴(上海实验动物资源中心)静脉注射环磷酰胺，造成血小板减少模型(血小板总数下降60.5％)。rhIL-11以三种剂量(50、100及150μg/kg/d)对猕猴进行治疗。试验结果表明，对照组血小板总数13天达最低(149×10⁹/L)，19日开始回升。实验期间对照组血小板计数低于正常范围低限(250×10⁹/L)持续8天。而同时，各给药组均在400×10⁹/L以上波动。明显高于模型组。同时还发现各组血小板凝集功能正常。可见，rhIL-11可以阻止猕猴环磷酰胺模型的血小板下降。本实验的三个剂量都有明显的效果。未发现rhIL-11对红细胞的影响。

体内实验揭示，当给予正常动物及骨髓抑制的动物时，rhIL-11是有血小板生成活性的。在正常动物模型中，rhIL-11突出表现为刺激巨核细胞及血细胞生成。在骨髓抑制及骨髓移植模型中，rhIL-11可持续促进血细胞恢复。同时还具有促进中性白细胞及红细胞恢复的作用。这些实验结果表明：rhIL-11是一种具有血小板生成活性的造血因子，临床上可用于多种原因(如化疗、放疗和骨髓移植)造成的血小板减少症。

序列表

<110>东莞太力生物工程有限公司

<120>制备重组人白细胞介素11的方法

<130>FI-091701-59：55

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>177

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>1

Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu

1               5                   10                  15

Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg

            20                  25                  30

Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His

        35                  40                  45

Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly

    50                  55                  60

Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu

65                  70                  75                  80

Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser

                85                  90                  95

Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp

            100                 105                 110

Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro

        115                 120                 125

Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser

    130                 135                 140

Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His

145                 150                 155                 160

Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg

                165                 170                 175

Leu

<210>2

<211>531

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>2

gggccaccac ctggcccccc tcgagtttcc ccagaccctc gggccgagct ggacagcacc     60

gtgctcctga cccgctctct cctggcggac acgcggcagc tggctgcaca gctgagggac    120

aaattcccag ctgacgggga ccacaacctg gattccctgc ccaccctggc catgagtgcg    180

ggggcactgg gagctctaca gctcccaggt gtgctgacaa ggctgcgagc ggacctactg    240

tcctacctgc ggcacgtgca gtggctgcgc cgggcaggtg gctcttccct gaagaccctg    300

gagcccgagc tgggcaccct gcaggcccga ctggaccggc tgctgcgccg gctgcagctc    360

ctgatgtccc gcctggccct gccccagcca cccccggacc cgccggcgcc cccgctggcg    420

cccccctcct cagcctgggg gggcatcagg gccgcccacg ccatcctggg ggggctgcac    480

ctgacacttg actgggccgt gaggggactg ctgctgctga agactcggct g             531

<210>3

<211>549

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>3

gacgacgacg acaaggggcc accacctggc ccccctcgag tttccccaga ccctcgggcc     60

gagctggaca gcaccgtgct cctgacccgc tctctcctgg cggacacgcg gcagctggct    120

gcacagctga gggacaaatt cccagctgac ggggaccaca acctggattc cctgcccacc    180

ctggccatga gtgcgggggc actgggagct ctacagctcc caggtgtgct gacaaggctg    240

cgagcggacc tactgtccta cctgcggcac gtgcagtggc tgcgccgggc aggtggctct    300

tccctgaaga ccctggagcc cgagctgggc accctgcagg cccgactgga ccggctgctg    360

cgccggctgc agctcctgat gtcccgcctg gccctgcccc agccaccccc ggacccgccg    420

gcgcccccgc tggcgccccc ctcctcagcc tgggggggca tcagggccgc ccacgccatc    480

ctgggggggc tgcacctgac acttgactgg gccgtgaggg gactgctgct gctgaagact    540

cggctgtaa                                                            549

Claims (10)

1.一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方法包括：

1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为：

硫氧还蛋白-(His)₆-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)₆-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11；

2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产物包含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11；和

3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白和所述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得重组人白细胞介素11。

2.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步骤3)中使用洗脱液A、B和C进行所述梯度洗脱，其中所述洗脱液A为20～100mM Tris，pH7.0～8.5；所述洗脱液B为20～100mM Tris-HCl，0.1～1.0M NaCl，pH7.0～8.5；所述洗脱液C为20～100mM Tris-HCl，10～50mM咪唑，0.1～1.0M NaCl，pH7.0～8.5。

3.根据权利要求2所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述洗脱液A为50mM Tris，pH8.0；所述洗脱液B为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0；所述洗脱液C为50mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.5M NaCl，pH8.0。

4.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述重组人白细胞介素11具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步骤1)和2)之间还使用镍离子螯合亲和柱层析法利用洗脱液D、E和F对所述融合蛋白进行纯化，其中所述洗脱液D为50mM Tris，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0；所述洗脱液E为50mM Tris，pH8.0；所述洗脱液F为100mM Tris，100mM咪唑。

6.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述蛋白水解酶识别位点为肠激酶识别位点。

7.根据权利要求6所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述酶切步骤包括：

a)配制反应液，其含有：1mg/mL的所述融合蛋白；20mM

Tris-HCl，pH8.0；1体积％Tween 20；和

b)按1U所述肠激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入所

述肠激酶，在18℃、44rpm下反应15h至18h。

8.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步骤3)后还使用阳离子交换柱层析法对所述重组人白细胞介素11进行纯化，其中所述阳离子交换介质为快流速CM琼脂糖凝胶，洗脱液为洗脱液G和H，所述洗脱液G为20mM NaCl，10mM PB，pH7.0；所述洗脱液H为300mM NaCl，10mM PB，pH7.0。

9.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述融合蛋白是将表达载体在宿主菌中表达而获得的，所述表达载体含有编码硫氧还蛋白-(His)₆-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)₆-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

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