CN103937828A - 一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 - Google Patents

一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 Download PDF

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王占伟
孙玉贤
武昱孜
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Abstract

本发明涉及兽用生物制药领域，公开了一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术。本发明的猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白制备技术，基本制备过程包括：根据GenBank已公布的猪干扰素α1（序列号DQ249000）基因序列及胸腺肽α1（序列号770552A）序列，合成扩增引物，融合扩增猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列，克隆并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-干扰素α1-胸腺肽α1融合蛋白，检测鉴定，分离纯化融合蛋白。该融合蛋白较好地保持了猪干扰素α1和胸腺肽α1各自的生物功能，具有一定的保护细胞免受病毒攻击的活性和促进细胞表面受体表达的活性，为猪干扰素α1和胸腺肽α1融合蛋白制剂的工业化生产提供了技术支撑。

Description

一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术
技术领域
本发明涉及兽用生物制药领域，特别是涉及一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术。
背景技术
干扰素（IFN）是细胞分泌的小肤，具有抗病毒，抗增生和免疫调节等广泛的生物学活性。与人干扰素（HuIFN）相似的猪干扰素（poIFN）也分为I型和Ⅱ型。猪干扰素α1（poIFNα1）属I型干扰素，具有广谱、高效抗病毒的功能，且具有毒副作用小、速效多能的特点，并对免疫系统起关键调节作用。种属特异性是干扰素的基本特性之一，但猪白细胞干扰素（PLeIFN，其主要成分为α干扰素）可在很多异种细胞上表现强的抗病毒活性。罗经等发现，它在人胚肺细胞和在仔猪肾原代细胞上有相同的抗病毒活性[罗经等,1980]。也曾有报道猪脾细胞干扰素（pSINF，主要成分为poIFN-α及poIFN-β）在人胚肺细胞及人胚肌皮细胞株上的抗病毒活性比在仔猪肾原代细胞上高17倍。胸腺肽（THY）是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肤激素，其主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1（THYα1），在不同种属间高度保守[Franco F l,et al,1992]。主要作为免疫调节剂使用，还具有增强NK细胞功能，促进CD3+、CD4+、CD8+细胞增生，抗CD3+诱发的细胞凋亡，抑制肿瘤生长等一系列生物功能[Bela B,et al,2000]，研究显示其在改善临床症状和降低死亡率方面具有明显的治疗效果。细胞因子融合蛋白的应用有可能减少细胞因子单独使用时的毒副作用[郁子扬,2004]。近几年研究证实，干扰素和胸腺肽联合应用具有协同促进T细胞生长、增殖、分化和激活NK细胞活性等功能，可增强机体的免疫能力[曲建慧等,2006；王淑彩等,2002]。
我国是世界养猪第一大国，同时也是猪病多而复杂的国家。猪的疾病，尤其是病毒性疾病严重地危害着我国畜牧业的持续发展，部分人畜共患病毒病还直接危害人类的健康。针对这一日趋严重的问题，迫切需要生产一种针对于猪的疾病，具有生物活性高，广谱抗病毒的药物，目前临床上治疗病毒性疾病主要应用高免血清，治疗药物比较单一。IFNα1和THYα1均具有广谱抗病毒作用，二者融合蛋白生物制剂的研制一方面可以简化生产工艺，显著降低生产成本;另一方面IFNα1和THYα1融合蛋白的联合应用能显著提高IFN和THY抗病毒的功效。本研究通过DNA重组技术构建猪IFNα1与THYα1融合基因表达载体，建立原核表达系统，分离纯化目的蛋白，为IFNα1和THYα1融合蛋白制剂的工业化生产提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于制备和分离纯化猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白。
为实现上述目的，本发明提供了一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，基本过程如下：根据GenBank已公布的猪干扰素α1（序列号DQ249000）基因序列及胸腺肽α1（序列号770552A）序列，合成扩增引物，融合扩增猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列，克隆并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）-干扰素α1-胸腺肽α1融合蛋白，检测鉴定，分离纯化融合蛋白。
进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列是通过过桥PCR融合扩增的，所述的过桥PCR是通过4条引物实现的，所述引物的序列分别为引物1：5’-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3’；引物2：5’-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3’；引物3：5’-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3’；引物4：5’-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3’。
进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列与载体连接克隆表达，所述载体是pMD18-T和pGEX4T。
进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列在LB液体培养基中用IPTG诱导表达，所述IPTG的浓度为0.5~5 mmol/L，所述的LB液体培养基含Ampr。
进一步的，所述的检测鉴定中使用的二抗是HRP-羊抗鼠IgG。
再进一步的，所述的融合蛋白分离纯化方法采用亲和柱层析法。
本发明的有益效果是：
（1）该融合蛋白制备技术的原料来源安全充足，生产成本低；制备过程简单，可操作性强，可进行大规模进行生产。
 （2）制备的融合蛋白安全、稳定、纯度高，较好地保持了IFNα1和和THYα1各自的生物功能，具有一定的保护细胞免受病毒攻击的活性和促进细胞表面受体表达的活性，为IFNα1和THYα1融合蛋白制剂的工业化生产提供了技术支撑。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中制备猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白过程中，诱导融合蛋白表达的IPTG的浓度为0.5 mmol/ L。
1.引物设计
查得GenBank已发表猪IFNα1（序列号DQ249000）成熟肽基因序列及THYα1（序列号770552A）蛋白序列,密码子偏爱性优化后,依据优化后的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计SOE-PCR引物，引物分别为：
引物1：5’-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3’；
引物2：5’-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3’；
引物3：5’-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3’；
引物4：5’-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3’。
同时在引物1和引物4中分别引入Nde I及Xho I酶切位点。
2.猪IFNα1-THYα1融合基因克隆载体的构建
利用含有优化后poIFNα1基因的质粒为模板，以引物1和引物2为引物进行PCR扩增，获得135 bp的poIFNα1-linker基因。再利用含有优化后THYα1基因的质粒为模板，以引物3和引物4为引物进行PCR扩增，获得519 bp的Linker-THYα1基因。将2次PCR的产物各取1μL混合作为模板，引物1和引物4为引物进行PCR扩增，得到615 bp的片段，回收目的片段并连接至pMD18-T Simple载体。转化感受态DH5A，涂布于Amp+平板，37℃培养过夜，挑取单菌落，扩大培养。提取重组克隆质粒，PCR及酶切鉴定，均得到615 bp的目的片段，送南京金思瑞公司进行测序，鉴定阳性的重组质粒命名为pMD18-T-IFNα1-THYα1。
3.猪IFNα1-THYα1融合基因表达载体的构建
将测序正确的pMD18-T-IFNα1-THYα1经Nde I及Xho I双酶切后,，回收目的基因，连接至pGEX4T-1原核表达载体，转化BL21(DE3) 感受态，提取重组质粒，PCR 鉴定得到615 bp的目的片段，双酶切鉴定也得到615 bp的目的片段，将阳性克隆名为pGEX4T-IFNα1-THYα1。
4.pGEX4T-IFNα1-THYα1在E.coli中的诱导表达及Western blot检测
以阳性BL21(DE3)菌株接种于含Ampr的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600为0.6~1.0时，用浓度为0.5mmol/L IPTG于37℃分别诱导培养4 h。离心1 mL培养液收集菌体。将菌体重悬于10%的SDS溶液中加等量的蛋白质电泳上样缓冲液，煮沸5 min后进行SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝R-250染色观察目的条带。将进行SDS-PAGE后的凝胶转至PVDF膜上，37℃封闭2 h，洗膜后加入鼠抗GST单抗于37℃温育2 h，洗膜后加HRP-羊抗鼠IgG于37℃温育1 h，洗去二抗后用DAB显色，结果分子量约为22.0 kD的融合蛋白成功表达，且为菌体内可溶性表达，蛋白存在于菌体裂解液上清中。
5. GST-IFNα1-THYα1目的蛋白分离纯化
收集诱导表达后的菌液，8000 r/min离心10 min收集菌体，按10 mL/g将菌体细胞重悬于pH 8.0的PBS缓冲液中，洗菌体1次，8000 r/min离心10 min收集菌体，按6 mL/g将菌体重悬于pH 8.0的PBS缓冲液中，冰浴中超声破菌。超声条件为：功率200 W，超声时间30 s，间隔时间60 s，全程工作时间为30 min。超声裂解液在4℃ 12000 r/min离心30 min，收集包涵体。每克包涵体加入约10 mL的洗涤缓冲液，而后4℃搅拌2 h，12000 r/min离心20 min后取上清和沉淀。沉淀重悬于2 mol/L 10 mL尿素中，于4℃ 12000 r/min离心10 min，收集沉淀，保留上清，用2 mol/L尿素再重悬沉淀于4℃ 12000 r/min离心10 min，收沉淀，保留上清，8 mol/L尿素于4℃溶解包涵体，2.5 h后，于4℃ 12000 r/min离心20 min，弃沉淀要上清。8 mol/L尿素溶解的包涵体离心上清按1:9（体积比）加复性液放于4℃复性20 h。4℃ 12000 r/min离心20 min收集上清加浓HCl调pH至5.3，4℃放置2 h，再加4 mol/L NaOH调pH至7.5，用2000 mL 10 mmol/L PBS（pH7.5）于4℃透析24 h，中间更换2次透析液。采用Walterson GST-Resin Kit，型号HG3022A GST的层析亲和柱，纯化得到了GST-IFNα1-THYα1融合蛋白。
6.IFNα1-THYα1目的蛋白纯化
取上步蛋白纯化液以5000 U/L终浓度的凝血酶4℃酶切24 h，经纯化获得IFNα1-THYα1目的蛋白，以碧云天BCA蛋白检测试剂盒测定目的蛋白含量，猪IFNα1-THYα1融合蛋白浓度约为105 mg/ L。将收集的猪IFNα1-THYα1融合蛋白洗脱液以PEG（Mr 6000）洗缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐剂，于4℃保存备用。
 实施例2
本实施例中制备猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白过程中，诱导融合蛋白表达的IPTG的浓度为1 mmol/ L。猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白制备技术与实施例1的相同。
结果纯化获得IFNα1-THYα1目的蛋白，以碧云天BCA蛋白检测试剂盒测定目的蛋白含量，猪IFNα1-THYα1融合蛋白浓度约为120 mg/ L。将收集的猪IFNα1-THYα1融合蛋白洗脱液以PEG（Mr 6000）洗缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐剂，于4℃保存备用。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京洲邦生物科技有限公司
 
<120>  一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术
 
<130>  参考文献：THY-a1，IFNa1
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  1
catatgtgcg atctgccgca gaccc                                           25
 
 
<210>  2
<211>  63
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  2
cgagccgccg ccgccgccgc gcgccgagcc gccgccgccc agattacggc tgctgctaaa     60
 
cgc                                                                   63
 
 
<210>  3
<211>  57
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  3
ggcggcggcg gctcggcgcg cggcggcggc ggcggctcgt cggatgcggc ggtggat        57
 
 
<210>  4
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  4
ctcgagtcat taattttccg cttcttcc                                        28
 
 

Claims (6)

1.一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，其特征在于制备的基本过程如下：根据GenBank已公布的猪干扰素α1（序列号DQ249000）基因序列及胸腺肽α1（序列号770552A）序列，合成扩增引物，融合扩增猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列，克隆并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-干扰素α1-胸腺肽α1融合蛋白，检测鉴定，分离纯化融合蛋白。
2.按权利要求1所述的猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，其特征在于：所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列是通过过桥PCR融合扩增的，所述的过桥PCR是通过4条引物实现的，所述引物的序列分别为引物1：5’-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3’；引物2：5’-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3’；引物3：5’-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3’； 引物4：5’-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3’。
3.按权利要求1所述的猪干扰素α1与胸腺肽融α1合蛋白的制备技术，其特征在于：所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列与载体连接克隆表达，所述载体是pMD18-T和pGEX4T。
4.按权利要求1或3所述的猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，其特征在于：所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列在LB液体培养基中用IPTG诱导表达，所述IPTG的浓度为0.5~5mmol/L，所述的LB液体培养基含Ampr。
5.按权利要求1所述的猪干扰素α1与胸腺肽融α1合蛋白的制备技术，其特征在于：所述的检测鉴定中使用的二抗是HRP-羊抗鼠IgG。
6.按权利要求1所述的猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，其特征在于：所述的融合蛋白分离纯化方法采用亲和柱层析法。
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