CN105154497A - 一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法，所述重组大肠杆菌专指已经整合有鸡白介素2表达基因的基因重组大肠杆菌。该表达系统所表达的鸡白介素2蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，但较高的表达量及后续的简易复性、纯化工艺，弥补了这一劣势，具有产量、复兴率及回收率高的优点，且生产周期短，成本低，为鸡白介素2的规模化生产奠定了良好的基础。本发明针对该表达系统的自身特性匹配了特定的工艺条件，通过对蛋白变性、复性以及纯化方法的创新设计使得利用该方法能够高效的表达鸡白介素2并能获得高纯度蛋白，具有突出的技术优势。

Description

一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

背景技术

白细胞介素-2(interleukin2，IL-2)是T细胞和自然杀伤性细胞(NK细胞)产生的糖蛋白，是动物体内一类重要的细胞因子，具有激活淋巴因子活化的杀伤细胞和自然杀伤细胞，刺激T辅佐细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子和促进细胞因子的繁殖，在机体的免疫应答中起重要作用。

人和许多哺乳动物IL-2的研究发展很快，已广泛应用于各种疾病的治疗和疫苗免疫，而鸡IL-2研究发展相对较慢，1997年，Sundick和Gill-Dixon通过构建cDNA文库的方法，首次从ConA活化的T淋巴细胞中获得了鸡的IL-2cDNA，为鸡IL-2的研究打开了局面。之后，国内的众多研究者则相继克隆出了固始鸡、萧山鸡、白羽乌骨鸡等十多个地方品种鸡的IL-2基因。目前，已实现了鸡IL-2基因借助大肠杆菌、酵母或真核细胞进行表达。在以上表达方式中，利用大肠杆菌作为表达载体稳定性较高、工艺易于控制，应用最为广泛，然而由于鸡白介素2表达基因存在较多的大肠杆菌稀有密码子，因此影响了产率。

针对此问题，诸多研究者尝试通过基因改造对表达体系进行改良，并取得了突出的成果，其中本申请人通过替换鸡白介素2天然表达基因中的大肠杆菌稀有密码子使得重组大肠杆菌对鸡白介素2的表达得到了显著的提升(CN104561021A)，然而由于基因重组后大肠杆菌与野生型相比其生理特性发生了变化，因此如果继续沿用野生型菌株的培养条件往往不能有效表达鸡白介素2蛋白；此外，应当针对鸡白介素2表达基因的特性匹配适宜的表达条件，从而提升重组大肠杆菌对鸡白介素2的表达效率。而且，对于表达产物的后续纯化也需要根据基因工程菌的特性、蛋白的特性进行具体设计。在上述技术问题层面，由于需要针对具体情况进行适应性研究，因此现有技术中尚缺乏一种针对性且高效的利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡白介素2表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因，以解决现有技术中利用重组大肠杆菌表达鸡白介素2产率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是提升以重组大肠杆菌所表达的鸡白介素2蛋白的纯化效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法，包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为0.8～1.0mmol/L，诱导温度为30～37℃，诱导表达时间为4～6小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

优选的，步骤2)所述变性缓冲液包括以下成分：45～55mMTris-HCl，7～9MUrea，8～12mMDTT，0.8～1.2mMEDTA。在此基础上可以进一步分别执行以下优选：调整所述变性缓冲液pH至7.8～8.2；变性缓冲液的加入量为8～12mL/g包涵体；变性条件为在2～6℃条件下变性22～26h。

优选的，步骤2)变性后，离心收集上清而后再向上清液中加入复性缓冲液复性。

优选的，步骤2)所述复性缓冲液包括以下成分：17～23mMTris-HCl，1.8～2.2MUrea，0.8～1.2mM胱氨酸，2.8～3.2mM半胱氨酸；在此基础上可以进一步分别执行以下优选：调整所述复性缓冲液pH至7.8～8.2；复性缓冲液的加入量满足以下条件：加入复性缓冲液总量后，溶液中蛋白浓度为0.08～0.12mg/mL；复性条件为：在2～6℃、搅拌条件下，加入所述复性缓冲液，复性22～26h，其中搅拌转速可以优选为200～300rpm，而加入方式可以优选为非一次性的加入，例如可以是分若干次加入。

优选的，复性后离心收集上清，对上清执行层析纯化。

优选的，步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以1.8～2.2倍柱体积的含有0.04～0.06MNaCl、18～22mMTris-HCl的溶液洗脱杂蛋白，该溶液pH可以优选为7.8～8.2；在此基础上可以进一步分别执行以下优选：所用层析填料为QSepharoseFastFlow；用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.4～0.6MNaCl，18～22mMTris-HCl，所述用于洗脱目的蛋白的溶液其pH可以优选为7.8～8.2。

优选的，所述重组大肠杆菌的鸡白介素2表达基因以pBV220、pET系列载体或pQE系列载体的任一种作为表达载体，进一步优选为pET-28a(+)表达载体。

优选的，所述重组大肠杆菌的菌种为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。

在以上任一技术方案基础上优选的，所述重组大肠杆菌中的鸡白介素2表达基因是在鸡白介素2天然表达基因的基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子，所得到的基因。

进一步优选的，其特征在于所述鸡白介素2表达基因，在其所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信号肽或利用表达载体上的信号肽，所述信号肽为pelB或ompT的其中一种、为pET表达载体所带、位于多克隆位点N端。

进一步优选的，所述鸡白介素2表达基因，在其末端具有标签蛋白，所述标签蛋白为His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。

进一步优选的，所述鸡白介素2表达基因的序列如SEQIDNO2所示。

本发明所述的重组大肠杆菌专指已经整合有鸡白介素2表达基因的基因重组大肠杆菌；上述鸡白介素2表达基因既可以是天然基因序列也可以是适当改良的、不影响所表达蛋白的核苷酸序列的人工基因序列；上述“整合有”是指该基因能够在该重组大肠杆菌中顺利表达，可以但不限于存在于质粒上或核区基因上。以上技术方案中所述的QSepharoseFastFlow层析填料是一种商品名，具体限定为由美国GE公司出品的型号为QSepharoseFastFlow的层析填料。在以上技术方案中，单位“M”和“mM”分别指“mol/L”和“mmol/L”，Urea指尿素，DTT是指二硫苏糖醇。

本发明提供的方法及基因专门针对原核表达系统，尤其是以大肠杆菌为宿主的表达系统，因此本发明的基因改造方法是在鸡白介素2天然表达基因的基础上将其中大肠杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡白介素2及其衍生蛋白的表达效率。在此基础上，本发明通过对鸡白介素2表达基因密码子的取代、添加或缺失实现了改造后基因所表达的蛋白具有鸡白介素2的生物活性。

本发明提供的序列如SEQIDNO2所示的基因与鸡白介素2天然表达基因的核苷酸数量均为366个，所表达的蛋白其氨基酸序列相同。利用该基因所表达的鸡白介素2蛋白虽在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，但较高的表达量及后续的简易复性、纯化工艺，弥补了这一劣势，具有产量、复兴率及回收率高的优点，且生产周期短，成本低，为鸡白介素2的规模化生产奠定了良好的基础。本发明针对该表达系统的自身特性匹配了特定的工艺条件，通过对蛋白变性、复性以及纯化方法的创新设计使得利用该方法能够高效的表达鸡白介素2并能获得高纯度蛋白，具有突出的技术优势。

附图说明

图1是鸡白介素2天然表达基因(ChIL-2-N)序列与本发明SEQIDNO2序列(ChIL-2-O)对比图；

图2是琼脂糖凝胶电泳检测ChIL-2-O基因的PCR扩增结果，其中M为Marker，L1为PCR产物电泳结果，L2为阴性对照。

图3是SDS-PAGE检测诱导后与未经诱导的ChIL-2蛋白在大肠杆菌中的表达结果，其中M为非预染蛋白Marker。

图4是SDS-PAGE检测ChIL-2蛋白的变复性结果，其中M为非预染蛋白Marker。

图5是SDS-PAGE检测ChIL-2蛋白的离子交换层析结果，其中M为非预染蛋白Marker，L1为上样流穿液，L2为平衡缓冲液洗涤的杂蛋白，L3为洗脱缓冲液洗脱的蛋白，L4为清洗柱子的洗脱物。

图6是ChIL-2蛋白促鸡外周血T淋巴细胞增殖的活性检测结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1.1

本实施例描述了本发明提供的天然的鸡白介素2(ChIL-2-N)基因与优化的鸡白介素2(ChIL-2-O)基因的获得方法。

根据GeneBank中AF483600.1的mRNA序列，在去除信号肽序列后，即为本发明提供的天然的鸡白介素2(ChIL-2-N)基因的核苷酸序列(SEQIDNO1所示)。

通过大肠杆菌(E.coli)密码子分析软件的分析，并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对天然的鸡白介素2(ChIL-2-N)基因进行了替换稀有密码子、调节GC含量等优化，即获得了优化的鸡白介素2(ChIL-2-O)基因(SEQIDNO2所示)，使其能够在大肠杆菌中高效表达。而后依照该序列进行人工合成。

实施例1.2

本实施例描述了含ChIL-2-O基因的重组质粒与工程菌的构建。

一、ChIL-2-O基因的扩增

根据上述ChIL-2-O基因序列，利用PrimerPremire软件设计引物，同时分别在引物的5’端引入NcoI酶切位点，3’端引入HindIII酶切位点：

上游引物(F1)：5’-CCATGGGTGCAAGCCTGAGCAGCG-3’(划线部分为NcoI酶切位点)；

下游引物(R1)：5’-AAGCTTTTATTTCTGCAGATAGCG-3’(划线部分为HindIII酶切位点)。

以合成的ChIL-2-O基因序列为模板，以F1和R1为引物进行PCR扩增，反应体系含模板1μg，上下游引物各1μM，总反应体系是50μL；反应条件为：94℃、5min；94℃、30sec，54℃、30sec，72℃、45sec，30个循环；72℃，10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图2所示，其中，M为Marker，L1为PCR产物的电泳结果，L2号为阴性对照，结果表明在380bp左右有清晰条带。

二、重组质粒及工程菌的构建

1.使用DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2.用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；

3.用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；

4.将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，即得到连接产物；

5.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定：1)菌落PCR使用引物为F1和R1，结果在380bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；2)酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶NcoI和HindIII，同时在380bp和5200bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；3)将以上检定结果都为阳性的重组质粒进行DNA测序。测序正确的即为目的重组质粒，命名为ChIL-2-pET28a(+)。

6.将重组质粒ChIL-2-pET28a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)，后筛选单菌落，并进行酶切验证。结果为阳性的菌落，即为目的重组工程菌，命名为的宿主菌为BL21(DE3)-ChIL-2-pET28a(+)。

实施例1.3

本实施例描述了重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2-pET28a(+)的诱导表达，及其表达的重组鸡白介素2(ChIL-2)的纯化。

一、重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2-pET28a(+)的诱导表达

1.将重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2-pET28a(+)接种于100mL含氨苄抗性(Amp⁺)的液体LB培养基中，在37℃、200rpm的摇床上震荡培养，至OD₆₀₀值为0.8时，添加诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，终浓度0.8mM)，180rpm继续诱导培养，诱导时间为5小时；同时设对照组，除不加诱导物IPTG外，其他操作相同。

2.分别取诱导和未诱导的发酵培养液各取5mL，8000-10000rpm离心20min收集菌体。然后加入500μLTris-HCl(PH8.0)重悬菌体，超声破碎后，14000g离心10min，分别收集上清与沉淀(沉淀依然使用500μLTris-HCl重悬)。

3.取以上4种样品各60μL，分别加入20μL4×蛋白上样缓冲液(含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μL进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图3所示，诱导后的菌体沉淀中在14kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符。

二、重组鸡白介素2(ChIL-2)包涵体的变复性

1.将诱导结束的发酵液，8000-10000rpm离心20min收集菌体；

2.用适量Tris-HCl(PH8.0)缓冲液重悬菌体，再次离心收集菌体；

3.按每克菌体加10mLTris-HCl(PH8.0)缓冲液重悬，超声(或高压均质等其他适宜方法)裂解菌体，裂解液在4℃、14000g离心30min，收集沉淀，即为包涵体；

4.Tris-HCl(PH8.0)缓冲液重悬包涵体，再次离心收集包涵体；

5.按每克包涵体加入约10mL的变性缓冲液，溶解沉淀并4℃变性24h，4℃、14000g离心，上清即为变性后的的ChIL-2-O蛋白溶液；

6.采用Bradford法测定蛋白浓度，按复性后蛋白终浓度为0.1mg/mL计算所需复性缓冲液按体积，24小时内分次缓慢加入ChIL-2-O蛋白变性液中，4℃，250rpm搅拌。复性结束后离心，收集上清，即为含有复性后ChIL-2-O蛋白的溶液(如图4所示)；

7.测定复性后溶液中的蛋白浓度，计算复性回收率，计算公式为：复性蛋白溶液浓度*体积/变性蛋白质量，结果显示重组蛋白的回收率可达70％；

表1包涵体变复性液配方

	成分
		变性缓冲液	50mM Tris-HCl，8M Urea，10mM DTT，1mM EDTA(pH 8.0)
复性缓冲液	20mM Tris-HCl，2M Urea，1mM胱氨酸，3mM半胱氨酸(pH 8.0)

三、重组鸡白介素2(ChIL-2)的纯化

1.使用足够体积的20mMTris-HCl(pH8.0)平衡层析柱后，即可开始上样；

2.使用2-3倍柱体积的Tris-HCl冲洗柱子，洗去杂蛋白。

5.使用2倍柱体积的0.05MNaCl(20mMTris-HCl，pH8.0)洗涤杂蛋白。

6.使用0.5MNaCl(20mMTris-HCl，pH8.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。

注意：洗脱峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。

7.使用1MNaCl(20mMTris-HCl，pH8.0)彻底洗净柱上蛋白。

8.纯化过程中每步需各取60μL的样品，分别加入20μL4×蛋白上样缓冲液(含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μL进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图5所示。结果显示：在经过洗涤杂蛋白后，使用0.5MNaCl(20mMTris-HCl，pH8.0)能够完全将的将目的蛋白(重组鸡白介素2，ChIL-2)洗脱，并且ChIL-2的纯度能够达到90％以上。

9.采用Bradford法测定纯化前后ChIL-2蛋白溶液的蛋白浓度，计算回收率回收率可达90％以上，同时还达到了很好的浓缩效果。

实施例1.4

本实施例描述了重组鸡白介素2(ChIL-2)鸡外周T淋巴细胞增殖的生物活性的测定。IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，因此IL-2可促鸡外周血淋巴细胞大量增殖，以此进行测定待检样品中IL-2的生物学活性水平。

1)取新鲜鸡抗凝血5mL，与Hank’s液按体积比1:1混匀后，轻轻加于10mL的细胞分离液之面上，以1500-2000rpm离心(半径15cm水平转子)15分钟，取乳白色环状淋巴细胞层放入含10mLHank’s液的离心管中，充分混匀后，以1500-2000rpm离心10-30分钟，将沉淀细胞反复洗2次即得所需细胞；

2)用RPIM1640细胞培养基重新悬起沉淀的细胞，调整细胞浓度至5×10⁶个/mL，并加入刀豆球蛋白A(ConA，终浓度5μg/mL)，于5％CO₂、42℃培养42小时；

3)离心收集外周血T淋巴细胞，用RPIM1640细胞培养基重悬，计数调整其浓度为5×10⁶个/mL，作为应答细胞；取无菌96孔板种板，实验孔每孔加入应答细胞50μL，调零孔不加细胞；

4)将ChIL-2蛋白样品适当稀释，使调整后蛋白浓度达到100ng/mL，然后用RPIM1640细胞培养基以2倍稀释法依次稀释，每孔加入50μL样品，每个稀释梯度做6个重复孔，5％CO₂、42℃培养36h；同时设置调零孔(不加细胞，以细胞培养基补其)和阴性对照孔(不加蛋白样品，以细胞培养基补其)；以可溶性表达获得的活性ChIL-2蛋白样品作为阳性对照，操作与样品组相同。

5)每孔加入MTS溶液30μL，继续培养3h后，置于低速震荡的摇床上震荡10min，酶标仪检测仪测定A₄₉₀值，结果如附图6所示。

从图中结果可以看出，复性后的ChIL-2蛋白具有很好的诱导鸡外周血T淋巴细胞增殖的能力，并且具有明显的浓度依赖性：即随着ChIL-2蛋白浓度的增加，其促进鸡外周血T淋巴细胞增殖的活性逐渐增强。另外，经过变复性工艺获得的ChIL-2蛋白，较可溶性表达的活性ChIL-2蛋白相近，进一步证明了变复性工艺的复性率非常高。判定标准为(实验孔OD₄₉₀值-调零孔OD₄₉₀值)/(阴性对照空OD₄₉₀值-调零孔OD₄₉₀值)≥1.4，为具有明显的促T淋巴细胞增殖活性。

实施例2

本实施例独立的描述了一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

该方法包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为0.9mmol/L，诱导温度为34℃，诱导表达时间为5小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

实施例3

本实施例独立的描述了一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

该方法包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为1.0mmol/L，诱导温度为37℃，诱导表达时间为6小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述变性缓冲液包括以下成分：55mMTris-HCl，9MUrea，12mMDTT，1.2mMEDTA。

变性缓冲液的加入量为12mL/g包涵体。

变性条件为：在6℃条件下变性26h。

步骤2)所述复性缓冲液包括以下成分：23mMTris-HCl，2.2MUrea，1.2mM胱氨酸，3.2mM半胱氨酸。

复性缓冲液的加入量满足以下条件：加入复性缓冲液总量后，溶液中蛋白浓度为0.12mg/mL。

复性条件为：在6℃、300rpm搅拌条件下，分多次加入所述复性缓冲液，复性26h。

步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以2.2倍柱体积的含有0.06MNaCl、22mMTris-HCl的溶液洗脱杂蛋白。

用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.6MNaCl，22mMTris-HCl。

所述重组大肠杆菌中鸡白介素2表达基因的序列如SEQIDNO2所示。

实施例4

本实施例独立的描述了一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为0.8mmol/L，诱导温度为30℃，诱导表达时间为4小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述变性缓冲液包括以下成分：45mMTris-HCl，7MUrea，8mMDTT，0.8mMEDTA。

变性缓冲液的加入量为8mL/g包涵体。

变性条件为：在2℃条件下变性22h。

步骤2)所述复性缓冲液包括以下成分：17mMTris-HCl，1.8MUrea，0.8mM胱氨酸，2.8mM半胱氨酸。

复性缓冲液的加入量满足以下条件：加入复性缓冲液总量后，溶液中蛋白浓度为0.08mg/mL。

复性条件为：在2℃、200rpm搅拌条件下，非一次性的加入所述复性缓冲液，复性22h。

步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以1.8倍柱体积的含有0.04MNaCl、18mMTris-HCl的溶液洗脱杂蛋白。

用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.4MNaCl，18mMTris-HCl。

所述重组大肠杆菌的菌种为大肠杆菌JM109。

实施例5

本实施例独立的描述了一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法。

包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为0.85mmol/L，诱导温度为32℃，诱导表达时间为4.5小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述变性缓冲液包括以下成分：48mMTris-HCl，7.5MUrea，9mMDTT，0.9mMEDTA。

变性缓冲液的加入量为8～12mL/g包涵体。

变性条件为：在2～6℃条件下变性22～26h。

步骤2)所述复性缓冲液包括以下成分：21mMTris-HCl，2.1MUrea，1.1mM胱氨酸，3.1mM半胱氨酸。

步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以2倍柱体积的含有0.05MNaCl、19mMTris-HCl的溶液洗脱杂蛋白。

所述重组大肠杆菌的菌种为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述重组大肠杆菌中的鸡白介素2表达基因是在鸡白介素2天然表达基因的基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子，所得到的基因。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>天津瑞普生物技术股份有限公司

<120>一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法

<160>6

<210>1

<211>366

<212>DNA

<213>鸡白介素2天然表达基因（ChIL-2-N）序列

<400>1

GCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACAT40

TAATAAAGGATTTAGAAATATTGGAAAATATCAAGAATAA80

GATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAG120

TGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGG160

TTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTGAAATTAA200

AGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAAAAGAAC240

CTCAAGAGTCTTACGGGTCTAAATCACACCGGAAGTGAAT280

GCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGA320

TTTTCTCCATGAACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAA360

AAATAA366

<210>2

<211>366

<212>DNA

<213>本发明改造后的鸡白介素2表达基因（ChIL-2-O）序列

<400>2

GCAAGCCTGAGCAGCGAAAAATGGAAAACCCTGCAGACCC40

TGATTAAAGATCTGGAAATTCTGGAAAACATTAAAAACAA80

AATTCATCTGGAACTGTATACCCCGACCGAAACCCAAGAA120

TGTACCCAGCAGACCCTGCAGTGTTATCTGGGTGAAGTTG160

TTACCCTGAAAAAAGAAACCGAAGATGACACCGAAATTAA200

AGAAGAATTTGTTACCGCCATCCAGAATATTGAAAAAAAT240

CTGAAAAGCCTGACCGGTCTGAATCATACAGGTAGCGAAT280

GTAAAATTTGCGAGGCCAATAACAAAAAAAAATTCCCGGA320

TTTCCTGCATGAACTGACCAATTTTGTTCGCTATCTGCAG360

AAATAA366

<210>3

<211>121

<212>PRT

<213>鸡白介素2氨基酸序列

<400>3

ASLSSEKWKTLQTLIKDLEILENIKNKIHLELYTPTETQE40

CTQQTLQCYLGEVVTLKKETEDDTEIKEEFVTAIQNIEKN80

LKSLTGLNHTGSECKICEANNKKKFPDFLHELTNFVRYLQ120

K121

<210>4

<211>121

<212>PRT

<213>本发明执行基因改造后所形成的表达系统实际表达的重组鸡白介素2氨基酸序列

<400>4

MGASLSSEKWKTLQTLIKDLEILENIKNKIHLELYTPTET40

QECTQQTLQCYLGEVVTLKKETEDDTEIKEEFVTAIQNIE80

KNLKSLTGLNHTGSECKICEANNKKKFPDFLHELTNFVRY120

LQK123

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>5

CCATGGGTGCAAGCCTGAGCAGCG24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>6

AAGCTTTTATTTCTGCAGATAGCG24

Claims (10)

1.一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导浓度为0.8～1.0mmol/L，诱导温度为30～37℃，诱导表达时间为4～6小时；

2)取步骤1)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而后再加入复性缓冲液进行稀释复性；

3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述变性缓冲液包括以下成分：45～55mMTris-HCl，7～9MUrea，8～12mMDTT，0.8～1.2mMEDTA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于变性缓冲液的加入量为8～12mL/g包涵体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于变性条件为：在2～6℃条件下变性22～26h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述复性缓冲液包括以下成分：17～23mMTris-HCl，1.8～2.2MUrea，0.8～1.2mM胱氨酸，2.8～3.2mM半胱氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于复性缓冲液的加入量满足以下条件：加入复性缓冲液总量后，溶液中蛋白浓度为0.08～0.12mg/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于复性条件为：在2～6℃、搅拌条件下，加入所述复性缓冲液，复性22～26h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以1.8～2.2倍柱体积的含有0.04～0.06MNaCl、18～22mMTris-HCl的溶液洗脱杂蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.4～0.6MNaCl，18～22mMTris-HCl。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌中鸡白介素2表达基因的序列如SEQIDNO2所示。