CN102660569A - 一种重组人IgE受体蛋白的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种重组人IgE受体蛋白的制备方法及应用，涉及生物工程领域和血液净化技术。其通过基因重组技术高表达与IgE有高结合力的受体FcεRIα-D2，纯化得到重组蛋白并将其作为一种吸附剂的配基，固定于固相载体上制备得的吸附剂可用于高亲和力结合IgE。本发明解决了血液净化技术去除IgE领域现有技术所存在的安全性低和成本较高的问题。在利用血液净化技术去除过敏反应病人血液中过量的IgE，治疗由IgE介导的过敏反应及IgE的纯化方面等方面有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种血液净化吸附剂配基——重组人IgE受体蛋白FcεRI α链的胞外二区(FcεRIα-D2)的表达制备，及其在血液净化领域和抗体纯化等方面的应用。
背景技术
变态反应有着极大的发病人群，正影响着超过世界总人口数的25％。其中I型变态反应(Allergic inflammation，Al)又称速发型过敏反应，是由IgE引起的一种免疫系统疾病，如临床常见的过敏性哮喘、过敏性荨麻疹、过敏性鼻炎和青霉素引起的过敏性休克等。
过敏反应发生机制是变应原经呼吸道、消化道粘膜和皮肤初次入侵过敏体质机体，刺激机体产生针对变应原的特异性IgE。该抗体Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上Fc受体(FcεR)结合，导致其致敏，当致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE再次接触并结合变应原时，会释放出一系列生物活性物质，导致呼吸道、消化道及皮肤发生过敏反应，危急时会出现过敏性休克，如不及时抢救则有生命危险。一系列研究发现：患者的过敏反应程度与IgE抗体浓度的升高密切相关，易发生急性过敏反应的人群相对于非过敏人群血液中IgE浓度高很多。过敏反应发生时，患者体内的IgE浓度达到正常值的10倍以上，尤其是致敏原特异性IgE的浓度可以达到正常值的1000倍左右。由于IgE与受体FcεR的结合是引发过敏反应的关键步骤，因此，清除过敏反应病人体内过量的IgE，阻断IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞受体FcεR的结合对有效缓解和治疗过敏反应疾病具有重要意义。
目前药物治疗是治疗过敏反应性疾病的主要方法，主要采用免疫抑制剂类药物。其中，皮质类固醇等激素类药物的主要功能是抑制肥大细胞产生介质，以阻断释放介质引起的过敏反应，激素类药物存在的共性问题是只能缓解症状，但不能治愈，且长期服用会破坏人体正常的内分泌系统，副作用很大。环孢菌素等免疫抑制剂类药物的主要功能是降低免疫细胞对过敏源的敏感度，从而减少IgE的产生，缓解急性过敏症状，由于该类药物是降低患者免疫细胞的功能，因此也不能长期服用，否则会产生头痛、肢体震颤、感觉障碍、中度视力障碍等一系列副作用。上述药物疗法对偶发性过敏反应治疗效果良好，但对需要长期服药的过敏性哮喘等慢性、顽固性过敏疾病治疗副作用很大，不仅不能治愈，且会产生药物依赖。目前对顽固性过敏疾病尚缺乏有效的治疗手段。
由于患者体内致敏原特异性IgE的长期存在是导致顽固性过敏症状不能有效改善的主要原因，因此，采用血液净化吸附剂选择性清除患者血液中的IgE，降低致敏原特异性IgE的滴度，对于缓解病情将会有很大帮助。IgE血液净化吸附剂的研究已经引起学术界的关注。早在20世纪80年代末期，日本学者Sato H就已开展了相关的研究工作(Specific removal of IgEby therapeutic immunoadsorption system[J].Journal of immunological methods.1989，118(2)；61-168.)，主要是采用玻璃微珠为固相载体，选择羊抗人IgE的IgG抗体为配基，每10g固相载体偶联325mg配基制备吸附柱，使用血液灌流的方式，3小时能使成年病人血液中的IgE从10000IU下降至3000IU，效果显著。该吸附剂的优势是：采用IgE的抗体为配基，能特异性识别血液中低丰度的IgE，对IgE的去除效果显著，且不损失血浆中的其它蛋白。存在的主要缺陷是：(1)IgE的抗体是通过免疫羊获得的血清多克隆抗体，血清中的含量低、纯化过程复杂，因此成本高，价格昂贵；(2)IgG的分子量大，达到150kDa，导致固定化的羊抗人IgG很容易脱落，外源蛋白进入患者体内会成为新的致敏原导致过敏反应加剧，为降低此风险，该作者在以上吸附柱下再串联一个以人IgE为配基的吸附柱，用于吸附脱落的IgG配基，这样就大大增加了吸附剂的应用成本，且吸附剂上偶联的IgE也存在脱落的问题，一旦脱落反而增加了患者血液中IgE的浓度。因此，该吸附剂虽然能有效去除IgE，但很难实际应用。为了克服上述免疫吸附剂的缺陷，巴西坎皮纳斯州立大学的学者Duarte I等(In vitroevaluation of biospecific and pseudobiospecific ligands aimed at extracorporeal treatment forimmunoglobulin E removal[J].Artificial organs.2006，30(8)：606-614)选择广谱性的生物配基，将其固定到琼脂：糖凝胶表面制成新型IgE吸附剂。文章考察了吸附剂对血液中总IgE和特异性IgE的去除效果。结果显示，以小扁豆凝集素为配基的琼脂糖凝胶对血浆中的总IgE和特异性IgE均具有较好的去除能力，体外模拟吸附治疗显示能去除总IgE的50％，但对IgG也具有很高的去除率(19％)。该吸附剂的优势是：在保证对IgE有较好的吸附效果的同时，采用小扁豆凝集素代替昂贵的抗体为配基，能大大降低吸附剂的成本。吸附剂存在的主要缺陷是：(1)吸附剂在对IgG也具有很高的去除率，对IgE的选择性吸附效果较差；(2)配基小扁豆凝集素是从扁豆中提取而来，分子量为46kDa，这种分子量较大的外源配基的脱落仍然会引起患者自身的免疫反应，阻碍了其在血液净化去除IgE领域的应用。为克服以上吸附剂存在的问题，所使用的配基需满足以下要求：(1)配基对IgE具有较好的结合能力，保证所制备的吸附剂对IgE有较好的去除能力；(2)配基对IgE具有良好的选择性，使得所制备的吸附剂不吸附或很少人体血液中的其他成分；(3)为杜绝配基脱落会造成患者自身免疫反应，就需配基来源于人体自身，且配基的分子量不宜过大。
从过敏反应发生机制可知，IgE与其受体FcεRI具有很强的结合能力，美国学者Garman等(Structure of the Fc fragment of human IgE bound to its high-affinity receptor FcεRIα[J].Nature.2000，406(6793)：259-266.)的研究显示，IgE的Fc段与FcεRI的α链的亲和力很高，达到Kd＝10-9～10-10M。因此，以人IgE的受体作为吸附剂的配基，能够特异性去除过敏反应病人血液中过量的IgE，显著降低血液中其它有益蛋白的损失，同时也能排除外源配基脱落造成的过敏反应，极大地降低副作用的发生几率，显著提高其安全性。
在人源FcεRI的α链与IgE活性作用位点的研究中，Mallamaci等利用仓鼠细胞(CHO)表达FcεRI的α链的不同区域，发现FcεRIα胞外二区(FcεRIα-D2)是与IgE结合的主要区域(Identification of sites on the human Fc epsilon RI alpha subunit which are involved in bindinghuman and rat IgE[J].Journal of Biological Chemistry.1993，268(29)：22076-22083)。LucaVangelista等人采用昆虫细胞Sf9表达人源FcεRI的α链的不同区域，进一步证实了FcεRIα-D2是与IgE结合的最小结构单元(The immunoglobulin-like modules Cε3 and α2 are the minimalunits necessary for human IgE-FcεRI interaction[J].J.Clin.Invest.1999，103：1571.)。Garman等人采用T.ni杆状病毒表达了全长的人源FcεRIα(含176位氨基酸)，研究其与IgE的活性作用位点，发现两个活性作用位点主要处于FcεRIα-D2(Structure of the Fc fragment of human IgEbound to its high-affinity receptor FcεRIα[J].Nature.2000，406(6793)：259-266.)。
从以上研究可以看出，FcεRIα-D2是与IgE结合的主要区域，为了制备以FcεRIα-D2为配基的特异性IgE吸附剂，首先必须批量制备FcεRIα-D2基因重组蛋白。在基因表达FcεRIα-D2的研究中，人们采用了动物细胞(CHO、昆虫Sf9)、杆状病毒及肠杆菌表达系统，但主要目的是研究其功能。动物细胞(CHO、昆虫Sf9)、杆状病毒均不适用于FcεRIα-D2的生产制备。以肠杆菌为宿主的原核表达系统因具有生产周期短、表达量高等优点适于小分子蛋白质的表达。Sandomenico等学者为了研究IgE与其受体的结合特点，将FcεRIα胞外二区氨基酸序列为84-170位基因重组到质粒pETMA11上，利用E.coli BL21(DE3)原核表达该蛋白，获得重组蛋白包涵体的表达量仅为5mg/L培养液，表达量很低，远不能满足生产制备要求(IgE-binding properties and selectivity of peptide mimics of the Fc□RI binding site[J].Molecularimmunology.2009，46(16)：3300-3309.)。
发明内容
为解决上述技术问题所采用的技术方案是：选择了受体与IgE结合的所有氨基酸位点基因序列(受体FcεRIα的87-173位氨基酸，即FcεRIα-D2)，并将其构建到具有T7强启动子的pET23a质粒(商品信息：Biovec，USA)上，以E.coli BL21(DE3)为宿主进行重组蛋白的高效表达，表达的重组蛋白分子量为13kDa，表达量达到150-200mg/L培养液。进一步进行基因重组蛋白FcεRIα-D2的分离纯化，纯度达到95％。然后将其作为配基，制备以该蛋白为功能基的IgE吸附剂，用于去除过敏反应病人血液中过量IgE。
本发明一方面在于：一种受体蛋白的重组表达质粒，其通过将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因片段连接入质粒pET 23a中制得。
本发明再利用上述重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到了重组菌株。
利用上述的重组菌株表达重组蛋白，其表达的方法包括如下步骤：将核苷酸序列为SEQID NO：1的基因片段连接入质粒pET 23a中；用该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达重组蛋白的重组菌株；培养该菌株，用诱导剂IPTG诱导重组蛋白的表达；将所得的胞内重组蛋白包涵体经初步纯化、变性和复性、分离纯化后制得重组蛋白。
具体的，上述的表达重组蛋白的方法，由于用诱导剂IPTG诱导表达的重组蛋白是以包涵体的形式存在，因此，需经过初步纯化的过程，上文所述的初步纯化是指：将发酵液离心所得细胞用裂解液37℃下裂解20min后，超声破碎，离心收集包涵体，清洗包涵体；其中，裂解液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、0.06M NaCl和0.2mg/mL溶菌酶
具体的，上述的表达重组蛋白的方法，其所述的变性方法为：包涵体用变性缓冲液室温下溶解过夜；其中，所述的变性缓冲液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、8M尿素、0.1M二硫苏糖醇和1mM乙二胺四乙酸。
具体的，上述的表达重组蛋白的方法，其所述的复性的方法为：使用截留分子量为3500的透析袋透析复性初浓度为1mg/mL的重组蛋白，用四种透析液以相对于蛋白溶液50倍体积分别透析24小时，这四种透析液pH为8.0，其组成中除了含有0.01M Tris-HCl、2.5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽之外，尿素浓度分别为4M、2M、1M和0M。经过透析复性后获得可溶性重组蛋白FcεRIα-D2。
具体的，上述的表达重组蛋白的方法，其所述的分离纯化的方法是以Superdex 75为填料的凝胶层析法。
本发明中上述方法制备的重组蛋白可以应用在抗体纯化、制备吸附介质、制备治疗过敏性疾病药物方面。
吸附剂的制备：以交联多糖、固相硅胶、玻璃微球等固相载体作为吸附剂的固相基质，以纯化的重组蛋白FcεRIα-D2为配基，通过化学偶联制备IgE吸附剂。
具体的，利用上述方法制备的重组蛋白，可以作为配基连接到固相载体基质琼脂糖凝胶Sepharose CL 4B上制成吸附剂，其中，制备吸附剂的配基键合量为0.4～4mg/mL胶，在本发明的具体实施例中的数据显示，其对过敏病人血液中IgE的去除率达到26％～32％。
本发明的有益效果：
本发明使用基因工程的方法高效表达与IgE有高结合力的受体FcεRIα-D2，将FcεRIα-D2作为一种吸附剂的配基，固定于固相载体上制备得的吸附剂可用于高亲和力结合IgE，去除过敏反应病人血液中过量的IgE。该吸附剂具有以下优势：(1)配基蛋白对IgE有很强的亲和力，能选择性地结合IgE，从而保证IgE的去除效果；(2)基因重组表达的配基蛋白序列为人体自身IgE受体蛋白序列，且分子量较小，仅为1.3kDa，能有效避免吸附剂在血液净化过程中，病人自身免疫反应的发生，保证了吸附剂应用的安全性；(3)使用原核表达技术高效表达配基蛋白，周期短，操作简便，相对早期使用的抗体配基，本发明大大降低了配基的制备成本。(4)重组蛋白FcεRIα-D2有着广泛的应用前景：利用其与IgE的高亲和力检测血液中IgE的含量，并应用于IgE的分离纯化；将其作为一种药物，竞争抑制剂人体内抑制IgE抗体的产生和IgE Fc-FcεR复合物的形成，缓解过敏反应病人病情。
附图说明
附图1是本发明构建的重组蛋白表达载体pET23a/FcεRIα-D2，图示是在载体pET23a中连入蛋白FcεRIα-D2基因。
附图2为构建的E coli BL21(DE3)-pET23a/FcεRIα-D2的全菌体SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白Marker(TaKaRa Code：D530S)，泳道2为诱导前菌体蛋白表达，泳道3为诱导后5小时菌体蛋白表达。
附图3为蛋白可溶性检测的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为诱导后的E coliBL21(DE3)-pET23a/FcεRIα-D2破碎后的上清，泳道2为诱导后的E coli BL21(DE3)-pET23a/FcεRIα-D2破碎后的沉淀。
附图4为重组蛋白纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白Marker，泳道2为复性未纯化的重组蛋白FcεRIα-D2，泳道3为纯化后的重组蛋白FcεRIα-D2。
附图5为纯化后重组蛋白FcεRIα-D2的HPLC结果(凝胶筛分柱为Waters Protein-Pak 125体积排阻色谱柱)，其中a峰为重组蛋白峰，b峰为杂蛋白峰。
附图6为复性纯化后重组蛋白FcεRIα-D2的非还原SDS-PAGE凝胶电泳结果。
具体实施方式
实施例1：pET23a/FcεR I α-D2重组质粒的构建与鉴定
(1)目的基因片段的PCR扩增
检索美国国立生物信息中心(NCBI)，获得人类FcεRI的完整基因序列(NCBI ReferenceSequence：NM 002001.3)，选取人类FcεRIα具有IgE亲和特性的D2结构域(FcεRIα的87-173位氨基酸)的基因序列。分别以EcoR I和Xho I为上游和下游酶切位点，并在C端添加了6×His标签，委托上海旭冠生物科技发展有限公司合成基因序列(SEQ ID NO：1)并将目的基因连接到pET 28a表达载体上，命名为pET 28a/FcεRIα-D2。
以pET 28a/FcεRIα-D2基因组DNA为模板，设计引物，并加入酶切位点。上游引物序列SEQ ID NO：2所示的序列，下游引物序列SEQ ID NO：3所示的序列：
上游引物(SEQ ID NO：2)为5’-GCGGATCCGAATTCATGTGGCTGCT-3’
划线序列为EcoR I(TaKaRa Code：D1040A)酶切位点；
下游引物(SEQ ID NO：3)为5’-GTGGTGGTGCTCGAGCGGTGC-3’
划线序列为Xho I(TaKaRa Code：D1094A)酶切位点。
反应条件如下：
①rTaq DNA聚合酶(5U/μL) 0.125μL
②dNTP Mixture(各2.5mM) 2μL
③pET 28a/FcεRIα-D2(50ng/μL) 1μL
④上游引物(50ng/μL)(SEQ ID NO：2) 1μL
⑤下游引物(50ng/μL)(SEQ ID NO：3) 1μL
⑥10×PCR buffer(Mg2+Plus) 2μL
⑦ddH2O 12.875μL
反应条件为：94℃预变性5min，再按如下参数循环30次：94℃变性30s，46.6℃退火30s，72℃延伸3min。最后一个循环72℃延伸10min。
(2)PCR产物纯化
采用TaKaRa有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒(TaKaRa Code：DV801A)纯化PCR产物。具体方法参考试剂盒说明书。
(3)连接反应
将纯化后的PCR产物和pET 23a分别用EcoR I和Xho I双酶切，1％DNA琼脂糖凝胶电泳后，使用TaKaRa有限公司生产的胶回收DNA试剂盒(TaKaRa Code：DV805A)纯化回收目的基因双酶切产物及质粒大片段，按5∶1的分子数，用T4连接酶(TaKaRa Code：D2011A)16℃连接过夜，反应体系如下：
①T4 DNALigase 1μL
②10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
③目的基因FcεRIα-D2(40ng/μL) 7μL
④pET 23a(50ng/μL) 1μL
(4)感受态细胞的制备
以E.coli BL21(DE3)为例：用无菌铂丝直接蘸取-80℃冻存的E.coli BL21(DE3)菌体，划线接种于LB固体培养基(含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和15g/L的琼脂粉。)平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种于100mL LB液体培养基(含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L NaCl。)中，37℃，300rpm振荡培养3小时，使菌体的OD600达0.2-0.4。再将1.25mL细菌培养液转入1.5mL离心管中，于冰上放置10min。4℃，4000g离心10min，弃上清，加入150μL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，合并两管溶液，置冰上10min。4℃，4000g离心10min，弃上清，加入100μL冰预冷的CaCl2-甘油溶液重悬细胞，即为感受态细胞，置于-80℃冰箱冻存备用。
(5)重组质粒的转化及其鉴定
取出一管E.coli DH5α感受态细胞，加入步骤(3)中所得连接后的DNA溶液(体积≤10μL，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，于冰上放置30min。将离心管放到预加温到42℃的水浴中，放置1min(热激时间要严格掌握)。迅速将离心管转移到冰浴中，冷却5min。加入900μL 37℃预热的LB液体培养基，混匀，转到37℃摇床上，200rpm孵育45min。取出100μL涂布到LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。
从上述LB固体培养基平板上挑取一株重组菌单菌落，接种于20mL LB液体培养基于恒温摇床中37℃，170rpm培养12小时，然后使用TaKaRa有限公司生产的DNA纯化/回收试剂盒(TaKaRa Code：DV801A)提取质粒DNA。提取的质粒DNA进行PCR和双酶切验证，均产生了300bp左右的条带，且效果较好，再将质粒委托TaKaRa公司进行核苷酸测序，并使用生物学软件ClustalX 1.81将测序结果与NCBI公布的蛋白FcεRIα-D2功能区核苷酸序列进行比对，结果证明目的基因SEQ ID NO：1已经连接入质粒pET23a中，将此重组质粒命名为pET23a/FcεRIα-D2，使用本实施例中重组质粒的转化方法，将重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)，取出100μL涂布到含有1mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。
实施例2：重组菌的摇瓶培养
挑取实施例1中LB固体培养基平板上含有重组质粒pET23a/FcεRIα-D2的E.coliBL21(DE3)单菌落，接种于20mL含有1mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于恒温摇床中37℃，170rpm培养过夜。按1％接种量将活化后的菌种接种于100mL含有1mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，170rpm培养3-4小时，待菌体OD600nm达到0.5-1时加入IPTG至终浓度为0.1mM，再继续培养5小时。SDS-PAGE电泳检测，结果如附图2中泳道3所示，重组菌在13kDa左右处有FcεRIα-D2表达，与理论分子量12950.19Da一致。对得到的重组菌进行目的蛋白的可溶性检测，具体方法为：取一定量的湿菌，加入5倍体积的裂解液(裂解液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、0.06M NaCl和0.2mg/mL溶菌酶)，摇匀后37℃恒温培养箱中放置15min，超声破碎10min左右，直至菌液无粘稠感。8000g离心5min，得到上清和沉淀，用与上清相同体积的水洗涤沉淀2次，然后将上清和用水重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果如附图3所示，重组蛋白分布在泳道2所示的菌体沉淀中，表明重组蛋白FcεRIα-D2形成了包涵体。
实施例3：重组蛋白FcεRIα-D2包涵体的复性及蛋白的分离纯化
(1)提取并初步纯化包涵体(人FcγR I受体胞外区基因的克隆，原核表达及纯化[J].细胞与分子免疫学杂志.2010，(002)：178-180.)：将所得的包涵体用清洗缓冲液清洗5次，再用重悬缓冲液清洗1次，得到经过初步纯化的含有重组蛋白FcεRIα-D2的包涵体。清洗缓冲液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.01M EDTA、2mM DTT和10％Triton-100；重悬缓冲液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.01M EDTA和2mM DTT。
(2)重组蛋白FcεRIα-D2的复性：对经过初步纯化的含有重组蛋白FcεRIα-D2的包涵体进行变性和复性。变性包涵体的方法为：用变性缓冲液(pH为8.0，含有8M尿素、0.01MTris-HCl、0.1M DTT和1mM EDTA)与包涵体以W/V＝1/10进行包涵体的溶解，溶解过程室温、过夜；复性蛋白的方法为：使用截留分子量为3500的透析袋透析复性初浓度为1mg/mL的重组蛋白，用四种透析液以相对于重组蛋白溶液50倍体积分别透析24小时。这四种透析液pH为8.0，其组成中除了含有0.01M Tris-HCl、2.5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽之外，尿素浓度分别为4M、2M、1M和0M。经过透析复性后获得可溶性重组蛋白FcεRIα-D2。
(3)重组蛋白FcεRIαα-D2的分离纯化：使用AKTA purifier 100蛋白纯化系统，使用以Superdex 75为填料的凝胶层析分离纯化复性后的重组蛋白FcεRIα-D2，采用紫外检测器在280nm波长下在线监测，用0.1M PBS缓冲液(pH为8.0，含有0.1M磷酸氢二钾-磷酸二氢钾和0.154MNaCl)平衡凝胶层析柱，以0.8mL/min的线性流速上样2mL复性后的蛋白质溶液，蛋白质溶液的初浓度为5mg/mL，纯化后获得的重组蛋白FcεRIα-D2利用SDS-PAGE和HPLC检测产物纯度，结果分别如附图4、5所示。使用生物学软件BandScan对附图4的SDS-PAGE电泳图进行灰度扫描，纯化后的重组蛋白纯度达95％左右；积分附图5中两个峰面积，计算重组蛋白峰(a峰)占峰总面积的95.12％。对纯化后的重组蛋白进行非还原SDS-PAGE，结果如附图6所示，复性纯化后所得蛋白均以单体形式存在，无明显多聚体，证明了蛋白的半胱氨酸没有形成链间二硫键。经5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)检测(具体方法见：Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，page164-165)自由巯基只占总巯基量的1.65％，重组蛋白中98.35％的半胱氨酸都形成了二硫键，由于本发明中的重组蛋白只含有两个半胱氨酸，因此重组蛋白已形成了正确的链内二硫键。因此，可以证明纯化得到的重组蛋白FcεRIαα-D2为构象正确的可溶性单体。
实施例4：以重组蛋白FcεRIα-D2为配基的吸附剂，对过敏反应病人血液中过量的IgE的吸附评价
将上述纯化的重组蛋白FcεRIα-D2偶联到Sepharose CL 4B上，具体方法如贾凌云等人专利CN 1367181A所述实施例1-4。制备的吸附介质用0.01M PBS缓冲液冲洗3次。评价方法为血液静态吸附(邳志前，抗体类吸附剂的合成过程优化及性能评价D.大连理工大学.2011)，具体方法为：称取吸附剂1mL加入到盛有1mL过敏反应病人血液的样品瓶中，37℃静态吸附2小时。以Sepharose CL 4B作为空白对照，平行做2次。抗体浓度采用免疫生化分析仪：SIEMENS：BN ProSpec(德国)测定。检测吸附前后血液样品中抗体的浓度，具体结果如表1所示。
表1吸附剂对血清中IgE的吸附效果。
实验通过控制连接反应加入蛋白的量(具体方法如贾凌云等人专利CN 1367181A所述实施例4)，共合成配基键合量分别为4、1.3、0.4mg/mL胶的吸附剂，并考察了对人血清中免疫球蛋白IgE和IgG的吸附效果，人血清中免疫球蛋白IgE和IgG的初始浓度分别为1080IU/mL和10.8mg/mL。
本发明吸附剂对过敏反应病人血液中的IgE均具有显著的去除效果和选择性去除能力。评价结果表明配基键合量在0.4～4mg/mL胶吸附剂的范围内对过敏病人血液中IgE的去除率达到26％～32％。其中，配基键合量为0.4mg/mL胶的低配基键合量吸附剂对IgE就已经有可观的吸附效果，其对IgE的去除量达到285IU，去除率为26.39％，对IgG的去除量为0.65mg，去除率仅为6.02％，本发明吸附剂对IgE的吸附显示出明显优势，有效证明了吸附剂对IgE的优先吸附性能和较好的选择性，且在此基础上提高配基键合量其吸附效果提高并不明显。因此在保证吸附剂应用效果的前提下提高配基利用率，得出了吸附剂较优的配基键合量范围为0.4～1mg/mL胶。
Claims (9)
1.一种受体蛋白的重组表达质粒，其特征在于，将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因片段连接入质粒pET 23a中。
2.利用权利要求1所述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌株。
3.利用权利要求2所述的重组菌株表达制备重组蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因片段连接入质粒pET 23a中；用该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，经过培养、筛选得到能够表达重组蛋白的重组菌株；培养该菌株，用诱导剂IPTG诱导重组蛋白的表达；将所得的胞内重组蛋白包涵体经初步纯化、变性和复性、分离纯化后制得重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的表达制备重组蛋白的方法，其特征在于：所述的初步纯化是将发酵液离心所得细胞用裂解液37℃下裂解20min后，超声破碎，离心收集包涵体，清洗包涵体；其中，裂解液pH为8.0，含有0.01M Tris-HCl、0.06M NaCl和02mg/mL溶菌酶。
5.根据权利要求3所述的表达制备重组蛋白的方法，其特征在于，所述的包涵体变性方法为：包涵体用变性缓冲液室温下溶解过夜；其中，所述的变性缓冲液pH为8.0，含有8M尿素、0.01M Tris-HCl、0.1M二硫苏糖醇和1mM乙二胺四乙酸。
6.根据权利要求3所述的表达制备重组蛋白的方法，其特征在于，所述的复性方法为：使用截留分子量为3500的透析袋透析复性初浓度为1mg/mL的重组蛋白，用四种透析液以相对于蛋白溶液50倍体积分别透析24小时，这四种透析液pH为8.0，其组成中除了含有0.01M Tris-HCl、2.5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽之外，尿素浓度分别为4M、2M、1M和0M。
7.根据权利要求3、4、5或6中任一项所述的表达制备重组蛋白的方法，其特征在于：所述的分离纯化的方法是以Superdex 75为填料的凝胶层析法。
8.利用权利要求3所述方法制备的重组蛋白可以应用在IgE抗体纯化、制备IgE吸附介质、制备治疗过敏性疾病药物。
9.将权利要求3所述方法制备的重组蛋白作为配基连接到固相载体基质Sepharose CL 4B上制成吸附剂，其中，制备吸附剂的配基键合量为0.4～4mg/mL胶。
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