CN101062949A

CN101062949A - 重组抗人IgE单克隆抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101062949A
Application number: CN 200710101487
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 候盛; 王海华; 钱卫珠
Original assignee: ZHONGXIN GUOJIAN PHARMACEUTICAL CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: Antibodies National Engineering Research Center
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2027-04-23
Also published as: CN101062949B

Abstract

本发明提供了一种重组抗人IgE单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该单克隆抗体的DNA分子，表达该单克隆抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明还公开了重组抗人IgE单克隆抗体在制备治疗I型超敏反应疾病的药物中的用途。

Description

重组抗人IgE单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，具体的说，涉及一种新的重组抗人IgE单克隆抗体及该单克隆抗体的制备方法和用途。

背景技术

超敏反应是指机体受某种抗原物质刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应，常表现为免疫反应性增高，多在机体再次接触相同抗原时发生。超敏反应与免疫应答本质上都是机体对某些抗原物质的特异性免疫应答，但前者主要表现为组织损伤和(或)生理功能紊乱，后者主要表现为生理性防御效应。目前将超敏反应、变态反应(allergy)和过敏反应(anaphylaxis)这几个含义近似的词互用，但多倾向于用超敏反应。

超敏反应的发生主要涉及两个方面的因素：一是抗原物质的刺激，二是机体的反应性。抗原物质的刺激是诱导机体发生超敏反应的先决条件，诱发超敏反应的抗原称为变应原(allergen)或过敏原(anaphylactogen)。它们可以是完全抗原，如异种血清、异体组织细胞、各种微生物、寄生虫及其代谢产物、植物花粉和动物皮毛等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺等药物，以及染料、生漆和多糖等低分子物质。这些变应原可通过不同的途径进入机体。此外，机体受微生物感染、电离辐射、烧伤等生物、理化因素影响而发生结构或组成改变的自身组织抗原，以及由于这些因素引起组织损伤而释放的自身隐蔽抗原，也可以成为变应原。抗原的刺激是发生超敏反应的重要因素，但针对同一种抗原的不同个体可表现出极不相同的结果，如有反应或无反应、反应较轻或反应严重、甚至达到致死程度。因此，超敏反应的发生除取决于变应原质和量及进入机体的途径外，尚与个体的遗传因素及机体的免疫反应性等因素密切相关。

超敏反应的分类方法很多，但目前大多采用Gell和Coombs(1963)的分类，即根据超敏反应发生的机制和临床特点分为I～IV四个型：①速发型超敏反应(I型)；②细胞毒型超敏反应(II型)；③免疫复合物型超敏反应(III型)；④迟发型超敏反应(IV型)。I、II、III型由抗体介导，可经血清被动转移给其它动物；IV型由T细胞介导，可经细胞转移。超敏反应所致免疫损伤的发生机制十分复杂，临床实践所见往往为混合型，仅以某一型损伤为主。

IgE是介导变应性应答(如广泛遭受的哮喘、食物过敏、I型超敏反应和家族性(familiar)窦炎)的免疫球蛋白家族中的一个成员。IgE由B细胞或B淋巴细胞分泌并表达在细胞表面。IgE通过其针对低亲和力IgE受体(称为FcsRII)的Fc区域结合B细胞(以及单核细胞、嗜酸性粒细胞和血小板)。在哺乳动物接触变应原时，携带对抗原特异性的、表面结合的IgE抗体的B细胞被“激活”并发育成分泌IgE的浆细胞。然后，产生的变应原特异性的IgE通过血液循环，通过高亲和力受体(也称为FCsRI)结合到组织中肥大细胞以及血液中的嗜碱性粒细胞的表面上。从而，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞对变应原致敏。随后与变应原的接触引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞的FcsRI交联，从而导致释放出引起临床超敏反应和过敏症状的组胺、白细胞三烯和血小板激活因子、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞趋化因子和细胞因子IL-3，IL-4，IL-5和GM-CSF a

最近，对I型超敏反应或过敏性超敏反应已经获得一种治疗方案，它试图阻断IgE与嗜碱性粒细胞以及肥大细胞上发现的高亲和力受体(FcsRI)结合，从而防止组胺和其它过敏性因子的释放而导致产生病理状态。

Xolair(Omalizumab)为基因重组抗人IgE单克隆抗体。该抗体分子量约为149kDa。Xolair抑制IgE与肥大细胞与嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体(FcεRI)结合。IgE与FcεRI阳性细胞结合的减少限制了介导过敏反应的物质的释放。Xolair治疗遗传性过敏症患者还可使嗜碱性粒细胞表面的FcεRI减少。Xolair上市后用于治疗哮喘病，并取得了一定的治疗效果，但是还有许多哮喘病人对Xolair的治疗表现为无反应性，因此，临床上急需一种特异性更强、亲和力更高的替代产品。

发明内容

本发明的需要解决的技术问题之一是提供一种重组抗人IgE单克隆抗体，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述重组抗人IgE单克隆抗体的DNA分子。

本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种表达载体。

本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种真核宿主细胞。

本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种上述单克隆抗体的用途。

本发明需要解决的第六个技术问题是提供一种该重组抗人IgE单克隆抗体的制备方法。

为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组抗人IgE单克隆抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。

在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。

本发明第五方面提供了一种重组抗人IgE单克隆抗体在制备治疗I型超敏反应疾病的药物中的用途。

本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

附图说明

图1：载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点。其中，HCMV pro为人巨细胞病毒主要早期启动子；Ck为人κ链恒定区基因；IgG1为人γ1链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。

图2：本发明所构建的pMG18(H+L)载体，含有重组抗IgE抗体重链全长和轻链全长基因。

图3：本发明抗体与对照抗体Xolair的抑制能力比较结果。

具体实施方式

本发明涉及一种重组抗人IgE单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。

本发明还提供了编码本发明重组抗FL单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

在获得编码本发明重组抗人IgE单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。

本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMG 18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具的开发》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的力一法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等，例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。

然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗人IgE单克隆抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明得到的抗体进行了抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合导致脱颗粒的功能学试验，实验结果表明，本发明的抗体与Xolair相比可以显著抑制I型超敏反应，从而可以用于制备治疗I型超敏反应疾病的药物，这里所述的I型超敏反应疾病包括但不限于过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性结膜炎、特异性皮炎和荨麻疹。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例1从抗体库中筛选IgE的抗体基因可变区

1)鼠源抗体库的构建

人IgE(8033细胞培养上清亲和层析获得)与弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀释后与人IgE显强阳性反应，取免疫后小鼠脾脏，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)：185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，构建鼠源抗体库。

2)筛选

将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。

12000rpm高速离心10分钟，将上清液转移至无菌的50毫升离心管中，保存备用。确保其滴度应在2×10¹¹以上。用纯化的IgE作为抗原，用常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3×10¹⁰噬菌体，37℃温育1小时。倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。

重复上段所述步骤4次。

将上述获得的细胞稀释至10⁵细胞/毫升后在加有O.1氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上培养，获得单克隆。

取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。

将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4度备用。

取96孔板10块，每孔中加入IgE(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。

加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H₂O₂，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。

根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。本试验结果共筛选出316个阳性克隆，根据其读数确定其中5个亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。

3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆

使上述5个克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，然后按照生产商说明书用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒(Wizard^Plus SV Minipreps DNAPurification System)纯化质粒DNA。

用XbaI和NheI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取426bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取387bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。

用XbaI和NheI限制性酶酶切表达载体pMG18。该表达载体的酶切图谱如图1所示。然后将上述重链可变区插入该表达载体的XbaI/NheI位点中。同样，利用HindIII和BsiWI限制性酶将抗体轻链可变区cDNA插入到pMG18载体的HindIII/BsiWI位点中，从而构建得到含有重组抗IgE抗体重链全长和轻链全长基因的表达载体pMG18(H+L)，如图2所示。

4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选

上述构建的带有抗体基因的表达载体分别转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒(lipofectamine 2000 transfection reagent，11668-027)，将上述纯化的质粒DNA转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。

转化的CHO细胞在HAT选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。

挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基上进行培养，对上清进行Western印迹试验，根据染色反应判断表达强度，挑选出12个表达强的克隆作为候选细胞株。

5)单克隆抗体的纯化

用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体，经SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究中。

实施例2 抗体基因在CHO细胞中的表达强度

将上述筛选得到的12个高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，如下所述用ELISA法测定抗体的表达量。将羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(鼠IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP一羊抗鼠IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。下表1中显示了上述筛选获得的12个候选克隆的表达量。

表1 候选克隆在CHO细胞中的表达量

细胞株编号	1A3	2B5	4C6	9B3	5E6	6F2	8G1	8H5	6B2	8E3	5H3	7D2	5F2
细胞株编号	1A3	2B5	4C6	9B3	5E6	6F2	8G1	8H5	6B2	8E3	5H3	7D2	5F2	表达量(微克/毫升)	165.4	152.6	152.9	286.4	168.9	153.8	302.3	251.4	233.1	152.9	273.2	146.8	139.3

从上表1可以看出，8G1，9B3和5H3具有很高的表达水平。

实施例3 抗IgE单克隆抗体基因的DNA测序

根据系谱，对上述获得的8G1细胞株的抗肿瘤坏死因子受体抗体基因进行DNA测序。结果如下：SEQ ID NO：3显示了其轻链可变区基因序列(5’到3’，387bp)其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中；SEQ ID NO：3显示了8G1重链可变区基因序列((5’，到3’，426bp)，其推测的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：2中。

实施例4 单克隆抗体亲和力研究

按以下方法对各克隆的细胞培养液进行纯化：10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，100Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是100mMTris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱，上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱液为20mM柠檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析，洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5，得纯品。

亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107：220)进行。结果表明，8G1，9B3和5H3三种单抗的亲和力分别达到5.6×10^-10，1.78×10^-10和8×10^-7，其中8G1的亲和力最佳。

实施例5 抗人IgE嵌合单克隆抗体抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合导致脱颗粒的功能学试验

1、试验原理

引起I型超敏反应的抗体主要是IgE。IgE的重要生物学特性是具有同种组织细胞亲嗜性，通过其Fc片段与自身或同种动物肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的相应受体(FcεRI)结合，而使机体处于致敏状态。参与I型超敏反应的主要细胞是肥大细胞和嗜碱性粒细胞。这两种细胞的表面有大量高亲和性IgE受体(FcεRI)，胞质内含有大量嗜碱性颗粒。细胞表面FcεRI与IgE的Fc片段结合后进入致敏状态。当致敏细胞以一定的方式再次接触相同变应原，或抗IgE抗体等介导细胞表面IgE发生桥联反应，即可激发细胞脱颗粒，释放生物活性介质。抗人IgE嵌合单克隆抗体可以阻断IgE与细胞表面FcεRI的结合，因而可抑制桥联反应的发生，从而阻断细胞脱颗粒。通过检测反应体系中组织胺的含量可以反映细胞发生脱颗粒的程度。

2、材料和试剂

2.1表达FcεRI的细胞，大鼠嗜碱性粒细胞(ATCC：CRL2256)稳定转染人FcεRI，细胞膜表面表达FcεRI(CRL2256-FcεRI)，(FITC-IgE染色为阳性)。Application ofHuman Fc eRI a-Chain-Transfected RBL-2H3 Cells for Estimaion of Active SerumIgE.Kayoko TAKAGI，Ryosuke NAKAMURA，Reiko TESHIMA，^*and Jun-ichiSAWADA.Biol.Pharm Bull.26(2)252-255(2003).

2.2人IgE，细胞系CRL-8033分泌表达。人IgE亲和层析柱，抗IgE抗体(8G1细胞株的表达产物经纯化获得)与商品化NHS活化树脂(GE公司：17-0906-01)交联获得。

2.3抗人IgE多克隆抗体(晶美生物)。

2.4组织胺检测试剂盒(Biosource，KHB1000)。

2.524孔细胞培养板(Nunc)。

2.6移液器，相应吸嘴。

3、方法

3.1对数生长期CRL2256-FcεRI细胞，0.25％胰蛋白酶消化，计数，PBS洗涤，用培养液调整细胞密度至1×10⁵/ml，接种入24孔细胞培养板，1ml/孔；

3.2完全培养液将IgE稀释至100μg/ml，将抗人IgE嵌合单克隆抗体稀释至lmg/ml，并将二者等体积混合；

3.3完全培养液将IgE稀释至100μg/ml，将对照品Xolair稀释至5mg/ml，并将二者等体积混合；

3.4完全培养液将IgE稀释至50μg/ml，以之为稀释液，10倍比序列稀释步骤2与3中的混合液，5个浓度梯度；

3.5将抗人IgE嵌合单克隆抗体稀释液加入24孔细胞培养板，1ml/孔，加入50μg/ml的IgE作为最强释放对照，加入1ml培养液作为最弱释放对照，各样品均设置复孔；

3.624孔细胞培养板置37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

3.7无血清培养液将抗人IgE多抗稀释至10μg/ml备用；

3.824孔细胞培养板将上清吸弃，加入上步骤的抗人IgE多抗，2ml/孔；

3.924孔细胞培养板置37℃，5％CO₂培养箱中培养20分钟；

3.10取每孔上清检测组织胺浓度。

4、结果见表2

表2 anti-IgE MAb抑制IgE与细胞表面FcεRI的结合导致脱颗粒的结果

样品浓度(μg/ml)	加入rh anti-IgE mAb后释放组胺浓度(ng/ml)
	加入rh anti-IgE mAb后释放组胺浓度(ng/ml)			孔1	孔2	均数
	500.0050.005.000.500.05培养液IgE	12.213.146.864.376.2	13.413.742.369.572.9	孔1	孔2	均数	12.813.444.666.974.6

样品浓度(μg/ml)	加入Xolair后释放组胺浓度(ng/ml)
	加入Xolair后释放组胺浓度(ng/ml)			孔1	孔2	均数
	2500.00250.0025.002.50.25培养液IgE	11.313.243.568.673.310.974.5	12.511.740.170.175.411.278.3	孔1	孔2	均数	11.912.541.869.474.411.176.4

5结论

重组抗IgE嵌合单克隆抗体可以抑制IgE与细胞表面FcεRI结合导致的脱颗粒，且其抑制能力为对照抗体Xolair的5倍，如图3所示。因此可以说明本发明所提供的IgE抗体可以显著抑制I型超敏反应。

序列表

<110>上海中信国健药业有限公司

<120>重组抗人IgE单克隆抗体及其制备方法和用途

<150>CN200610026068.2

<151>2006-04-26

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>129

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(129)

<223>轻链可变区氨基酸序列

<400>1

Met Val Ser Thr Pro Glu Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser

20 25 30

Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Ala Asp Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His

100 105 110

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Thr

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(142)

<223>重链可变区氨基酸序列

<400>2

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile

35 40 45

Thr Ser Ala Tyr Ser Trp Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Leu Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Ser Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Pro Ser Val Lys Gly Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser

85 90 95

Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Ala His Trp His Phe Ala

115 120 125

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

130 135 140

<210>3

<211>387

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(387)

<223>轻链可变区核苷酸序列

<400>3

atggtatcca cacctgagtt ccttgtattt ttgcttttct ggattccagc ctccagaggt 60

gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 120

ttctcctgca aggcttccca gagtgtggat tacgacgctg attggtatca gcaaagaaca 180

aatggttctc caaggcttct cataaagctc ctgatctacg gtgccagcta tctcgagtcc 240

aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 300

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa tcccacgagg acccttacac gttcggagct 360

gggaccaagc tggagctgaa acgtacg 387

<210>4

<211>426

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(426)

<223>重链可变区核苷酸序列

<400>4

atggctgtct tggggctgct cttctgcctg gtgacattcc caagctgtgt cctatcccag 60

gtgcagctga agCagtcagg acctggccta gtgcagccct cacagagcct gtccatcacc 120

tgcacagtct ctggctactc catcaccagc gcttatTcct ggaactgggt tcgccagtct 180

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggatcc attacttacg acggttcctc caactacaat 240

cccagcgtca aaggcagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 300

aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag aggaagtcac 360

tattttgccc attggcactt cgctgtctgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420

gctagc 426

Claims

1.一种重组抗人IgE单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

5.一种真核宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，它是CHO细胞。

7.权利要求1所述的抗体在制备治疗I型超敏反应疾病的药物中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中I型超敏反应疾病为过敏性哮喘。

9.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化真核宿主细胞；

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的真核宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述单克隆抗体。